DOUGLAS REIS ABDALLA
INFLUÊNCIA DA ATIVIDADE FÍSICA NO PERFIL DE CÉLULAS DA RESPOSTA
IMUNE E SÍNTESE DE CITOCINAS EM CAMUNDONGOS COM TUMOR DE
MAMA EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 7,12 -DIMETILBENZANTRACENO
UBERABA-MG
2011
DOUGLAS REIS ABDALLA
INFLUÊNCIA DA ATIVIDADE FÍSICA NO PERFIL DE CÉLULAS DA RESPOSTA
IMUNE E SÍNTESE DE CITOCINAS EM CAMUNDONGOS COM TUMOR DE
MAMA EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 7,12 -DIMETILBENZANTRACENO
Tese apresentada ao Curso de Pós
Graduaç ão em P atologia, área de
concentração P atologia Geral, da
Universidade Federal do Triângulo
Mineiro, como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre.
Orientadora: Profª. Drª. Márcia Antoniazi Michelin.
Co-Orientador: Prof. Dr. Eddie Fernando Cândido Murta.
UBERABA-MG
2011
DEDICATÓRIA
... À Deus, porque me deste saúde, paz e sabedoria para vencer meus desafios, por
me presentear com uma família maravilhosa, e a oportunidade de concretizar mais
uma etapa de minha caminhada...
... Meus pais José Maria e Maria Laura, por proporcionarem todos os meus sonhos,
me guiando e apoiando em todas as minhas vontades. Por pautarem o meu caráter
com Amor, Carinho, Atenção e Educação... Amo Vocês...
...Aos meus irmãos George e Michel, obrigado pelas permanentes orientações,
amizade, companheirismo... vocês são meus exemplos...
...Às minhas avós Jandira e Maria, Tia Dodora, grandes exemplos de vida, de
sabedoria e incentivo...
...Aos meus orientadores da graduação Leonardo César Carvalho e Dernival
Bertoncello, por ter ajudado na minha formação, durante a iniciação científica, as
orientações foram úteis durante a graduação, mas utilizo algumas até hoje...
...Aos meus orientadores professores Márcia Antoniazi Michelin e Eddie Fernando
Cândido Murta, por ter me dado a oportunidade de trilhar mais uma etapa da minha
caminhada... pelos
ensinamentos, pela
amizade, pela
depositada... por me fazerem ser uma pessoa melhor!!!
confiança
em mim
AGRADECIMENTOS
Aos professores do Curso de Pós-graduação em Patologia da Universidade Federal
do Triângulo Mineiro, por cada momento vivido durante as aulas, palavras de
incentivo, críticas construtivas, apoio na realização de experimentos.
Aos colegas do Curso de Pós-graduação e amigos do Laboratório do IPON, pela
amizade, companheirismo, em especial: André, Bruna, Cláudia, Cristianne, Letícia,
Pamela, Nelson, Taciano, Alessandra, Gustavo, Tânia, Izabelle, Ana Karina, Ana
Claudia, Aline e Mirian. E em quanto pude conviver no laboratório, meu irmão
George, minha maior fonte de inspiração para a pesquisa e docência.
Aos colegas de Iniciação Científica, pela oportunidade de dividir conheci mentos. Em
especial: Bruna, Lui z Maurício, Aline, Gisele.
Às secretárias do Curso de Pós-graduação em Patologia, Denise Terezinha Cardoso
Cunha e Nelma Aparecida Ferreira Salgado.
“Não estou aqui porque tudo deu certo,
mas o que deu errado não foi capaz de me parar.”
(Autor Desconhecido)
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................... 7
ABSTRACT ................................................................................................................................ 9
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... 11
LISTA DE GRÁFICOS ............................................................................................................. 12
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ 15
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ........................................................................... 16
1.
INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 17
1.1 CARCINOGÊNESE QUÍMICA INDUZIDA POR 7,12–DIMETIL–BENZANTRA-CENO
(DMBA) ..................................................................................................................................... 19
1.2 O SISTEMA IMUNE E TUMORES..................................................................................... 20
1.3 ATIVIDADE FÍSICA E O SISTEMA IMUNOLÓGICO ........................................................ 23
1.4 ATIVIDADE FÍSICA E CÂNCER ........................................................................................ 26
2.
JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE......................................................................................... 30
3.
OBJETIVO GERAL........................................................................................................... 31
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 31
4.
MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................ 32
4.1 ANIMAIS ............................................................................................................................. 32
4.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS.............................................................................................. 32
4.3 DESENHO EXPERIMENTAL ............................................................................................. 33
4.4 INDUÇÃO DOS TUMORES E PROTOCOLO DE TREINAMENTO ................................. 33
4.5 RETIRADA DO BAÇO COM OBTENÇÃO DE CÉLULAS ESPLÊNICAS E COLETA DE
MACRÓFAGOS PERITONEAIS .............................................................................................. 33
4.6 CITOMETRIA DE FLUXO DAS CÉLULAS ESPLÊNICAS E MACRÓFAGOS
PERITONEAIS.......................................................................................................................... 34
4.7 DETERMINAÇÕES DAS CONCENTRAÇÕES DAS CITOCINAS DE PADRÃO TH1, TH2
E TREG..................................................................................................................................... 36
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................... 37
5.
RESULTADOS.................................................................................................................. 38
5.1 CURVA DE SOBREVIDA DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS ...................................... 39
5.2 PERFIL DAS CÉLULAS IMUNOCOMPETENTES E EXPRESSÃO DE CITOCINAS 39
5.3 PRODUÇÃO DE CITOCINAS NO SOBRENADANTE DA CUL TURA DE CÉLULAS
ESPLÊNICAS........................................................................................................................... 43
5.3.1 IFN-γ ................................................................................................................................ 43
5.3.2 IL-2 ................................................................................................................................... 45
5.3.3 IL-4 ................................................................................................................................... 45
5.3.4 IL-10 ................................................................................................................................. 47
5.3.5 IL-12 ................................................................................................................................. 48
5.3.6 TGF- β ............................................................................................................................. 49
5.3.7 TNF-α............................................................................................................................... 50
5.4 PRODUÇÃO DE CITOCINAS NO SOBRENADANTE DA CULTURA DE
MACRÓFAGOS PERITONEAIS ............................................................................................ 52
5.4.1 IFN-γ ................................................................................................................................ 52
5.4.2 IL-4 ................................................................................................................................... 54
5.4.3 IL-10 ................................................................................................................................. 55
5.4.4 IL-12 ................................................................................................................................. 57
5.4.5 TGF-β .............................................................................................................................. 59
5.4.6 TNF-α .............................................................................................................................. 60
6.
DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 63
7.
CONCLUSÃO ................................................................................................................... 73
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 74
ANEXO ..................................................................................................................................... 86
1
2
RESUMO
3
4
Apesar do crescente interesse em estudos que relacionem o exercício e
5
promover efeitos benéficos na prevenção e no combate ao câncer, os estudos
6
existentes não foram capazes de elucidar os mecanismos pelos quais estes efeitos
7
ocorrem. Em relação à execução da atividade física nos quadros da doença
8
instalada, os mecanismos pelos quais o exercício influencia a luta contra o câncer
9
são explicados por hipóteses, a fim de explicá-las, este estudo visa investigar o perfil
10
das células da resposta imune e a síntese de citocinas por linfócitos e macrófagos,
11
na presença de tumor de mama e a interação com a atividade física. Para isso
12
utilizamos 56 Balb/c, fêmeas de 8 semanas de idade, virgem, a massa corporal entre
13
20 e 30g. 4 grupos foram divididos com n = 14: Controle - animais sem intervenção;
14
Treinado - os animais submetidos apenas ao treinamento físico, natação em água
15
30 ± 4 ° C por 45 minutos, 5 vezes por semana durante 8 semanas; Tumor - animais
16
sedentários que receberam doses de DMBA (1 mg/ml por semana durante 6
17
semanas) e Tumor Treinado - os animais submetidos à indução de tumores como o
18
grupo tumor e treinados de acordo com o protocolo acima. Após o período
19
experimental foram coletadas as células do baço e macrófagos peritoneias, e
20
colocados em cultura estimulada com LPS; os linfócitos CD3, CD4 e CD8, e os
21
macrófagos (CD14) juntamente com as citocinas IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12,
22
TGF-β e TNF-α foram avaliados por citometria de fluxo e ELISA. Os resultados,
23
demonstram que a prática de atividade física proporcionou aumento da
24
quantidade de linfócitos CD3, CD4 e CD8, e dos macrófagos (CD14) produtores
25
de IFN-γ, IL-2, IL-12 e TNF-α. E a quantidade de linfócitos e macrófagos
26
expressando IL-4, IL-10 e TGF-β foram menores. Ao contrário o grupo tumor
1
apresentou reduções das citocinas do perfil Th1 e aumento das citocinas do
2
perfil Th2 e Treg. Portanto, concluímos que a atividade física foi capaz de
3
promover reduções na incidência de desenvolvimento dos tumores, bem como
4
potencializou o sistema imune a po larizar um padrão de resposta do tipo Th1,
5
perfil antitumoral.
ABSTRACT
Despite growing interest in studies correlating exercise and promote beneficial
effects in preventing and fighting cancer, existing studies have not been able to
elucidate the mechanisms through which these effects occur. Regarding the
implementation of physical activity in frames installed the disease, the mechanisms
by which exercise influences the fight against cancer are explained by chance, in
order to explain hypotheses, this study aims to investigate the synthesis of cytokines
by lymphocytes in the presence of breast tumor and the interaction with physical
activity. For this we used 56 Balb/c, female, 8 weeks old, virgin, body mass between
20 and 30g. 4 groups were divided with n = 14: Control - animals without intervention
delay; Trained - Animals only subjected to physical training, swimming in water 30 ±
4 ° C for 45 minutes, 5 times per week for 8 weeks; Tumor - sedentary animals that
received doses of DMBA (1mg/ml weekly for 6 weeks) and Tumor Treined - Animals
that subjected to tumor induction as the group tumor and trained according to
protocol above. After the experimental period were collected from the spleen cells
and macrophages, and placed in culture stimulated with LPS, the CD3, CD4, CD8,
and macrophages (CD14) together with the cytokines IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12,
TGF-β and TNF-α were assessed by flow cytometry and ELISA. The results show
that physical activity provided to increase the amount of CD3, CD4, CD8, and
macrophages (CD14) producers of IFN-γ, IL-2, IL-12 and TNF-α. And the amount of
lymphocytes and macrophages expressing IL-4, IL-10 and TGF-β were lower. Unlike
the tumor group showed reductions in Th1 cytokines and increased Th2 cytokines
and Treg. Therefore characterizing that physical activity was able to promote
reductions in the incidence of tumor development and increased the immune system
to polarize a pattern of Th1 response, antitumor profile.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Divisão dos grupos experimentais.................................................................. 32
Tabela 2 - Marcações intra e extracelulares para as células do baço. ....................... 35
Tabela 3 - Marcações intra e extracelulares para os macrófagos peritoneais........... 36
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Representação da sobrevida dos grupos experimentais. ........................ 39
Gráfico 2 – (A) Representação da frequência de dupla marcação para CD3 +/TNF-α
e CD3+/IL-12. (B) Representação da intensidade de fluorescência para as citocinas
TNF-α e IL-12. ....................................................................................................................... 40
Gráfico 3 – (A) Representação da frequência de dupla marcação para CD4 + e as
citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-12. (B) Representação da frequência de dupla
marcação para CD4+/CD25+. (C) Representação da intensidade de fluorescência
para as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-12 e CD25+. ................................................... 41
Gráfico 4 – (A) Representação da frequência de dupla marcação para CD8 +/TNF-α.
(B) Representação da intensidade de fluorescência para a citocina TNF-α............... 42
Gráfico 5 – (A) Representação da frequência de dupla marcação para CD8 +/TNF-α.
(B) Representação da intensidade de fluorescência para a citocina TNF-α............... 43
Gráfico 6 – Representação da cinética da síntese de IFN-γ entre 24 e 48 horas de
cultura de células esplênicas. ** p= 0,0494; *** p<0,0001 e # p= 0,0075. ............ 43
Gráfico 7 – Representação da síntese de IFN-γ com 24 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 44
Gráfico 8 – Representação da síntese de IFN-γ com 48 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 44
Gráfico 9 – Representação da síntese de IL-2 com 48 horas de cultura de células
esplênicas. ............................................................................................................................ 45
Gráfico 10 – Representação da cinética da síntese de IL-4 entre 24 e 48 horas de
cultura de células esplênicas. *** p=0,0291 e # p= 0,0287. ...................................... 46
Gráfico 11 – Representação da síntese de IL-4 com 24 horas de cultura de células
esplênicas. ............................................................................................................................ 46
Gráfico 12 – Representação da síntese de IL-4 com 48 horas de cultura de células
esplênicas. ............................................................................................................................ 47
Gráfico 13 – Representação da cinética da síntese de IL-10 entre 24 e 48 horas de
cultura de células esplênicas. * p=0,05 e # p= 0,0146............................................... 47
Gráfico 14 – Representação da síntese de IL-10 com 24 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 48
Gráfico 15 – Representação da síntese de IL-10 com 48 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 48
Gráfico 16 – Representação da síntese de IL-12 com 48 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 49
Gráfico 17 – Representação da cinética da síntese de TGF-β entre 24 e 48 horas
de cultura de células esplênicas. ..................................................................................... 49
Gráfico 18 – Representação da síntese de TGF-β com 24 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 50
Gráfico 19 – Representação da síntese de TGF-β com 48 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 50
Gráfico 20 – Representação da cinética da síntese de TNF-α entre 24 e 48 horas
de cultura de células esplênicas. * p=0,0006; ** p=0,0001; *** p=0,0048 e # p=
0,0056. ................................................................................................................................... 51
Gráfico 21 – Representação da síntese de TNF-α com 24 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 51
Gráfico 22 – Representação da síntese de TNF-α com 48 horas de cultura de
células esplênicas. .............................................................................................................. 52
Gráfico 23 – Representação da cinética da síntese de IFN-γ entre 24 e 48 horas de
cultura de macrófagos peritoneais. * p=0,0029; ** p=0,0235; *** p=0,0312 e # p=
0,0138. ................................................................................................................................... 52
Gráfico 24 – Representação da síntese de IFN-γ com 24 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 53
Gráfico 25 – Representação da síntese de IFN-γ com 48 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 54
Gráfico 26 – Representação da cinética da síntese de IL-4 entre 24 e 48 horas de
cultura de macrófagos peritoneais. *** p=0,08 e # p= 0,07....................................... 54
Gráfico 27 – Representação da síntese de IL-4 com 24 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 55
Gráfico 28 – Representação da síntese de IL-4 com 48 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 55
Gráfico 29 – Representação da cinética da síntese de IL-10 entre 24 e 48 horas de
cultura de macrófagos peritoneais. * p=0,0366 e ** p= 0,0369. ............................... 56
Gráfico 30 – Representação da síntese de IL-10 com 24 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 56
Gráfico 31 – Representação da síntese de IL-10 com 48 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 57
Gráfico 32 – Representação da cinética da síntese de IL-12 entre 24 e 48 horas de
cultura de macrófagos peritoneais. *** p= 0,0034. ...................................................... 57
Gráfico 33 – Representação da síntese de IL-12 com 24 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 58
Gráfico 34 – Representação da síntese de IL-12 com 48 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 58
Gráfico 35 – Representação da cinética da síntese de TGF-β entre 24 e 48 horas
de cultura de macrófagos peritoneais. * p=0,0126; ** p= 0,0079; # p=0,0615. .... 59
Gráfico 36 – Representação da síntese de TGF-β com 24 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 59
Gráfico 37 – Representação da síntese de TGF-β com 48 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 60
Gráfico 38 – Representação da cinética da síntese de TNF-α entre 24 e 48 horas
de cultura de macrófagos peritoneais. * p=0,0005; ** p= 0,0296 e *** p= 0,0085.
................................................................................................................................................. 60
Gráfico 39 – Representação da síntese de TNF-α com 24 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 61
Gráfico 40 – Representação da síntese de TNF-α com 48 horas de cultura de
macrófagos peritoneais...................................................................................................... 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação do desenho experimental. ................................................... 33
Figura 2 - (A) massa tumoral de volume médio (B) aumento considerável desta
massa tumoral, e (C) volume final que o tumor apresentou até o término dos
experimentos. ........................................................................................................................ 38
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%
Porcentagem
°C
Grau Celsius
4NQO
4-quinolina1-óxido
APC
Célula apresentadora de antígeno
CD
Cluster diferentiation
CHP/MHC
Complexo/molécula de histocompatibilidade
CO2
Dióxido de carbono
DMBA
7,12-dimetilbenzantraceno
ELISA
Enzyme linked immunosorbent assay
EROs
Espécies reativas de oxigênio
HPA
Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
IFN-γ
Interferon gamma
IL-2
Interleucina 2
IL-4
Interleucina 4
IL-10
Interleucina 10
IL-12
Interleucina 12
kg
Quilograma
mg
Miligrama
ml
Mililitro
NK
Natural killer
nm
Nanômetro
TCR
Receptor de células T
TGF-β
Fator de crescimento tumoral beta
Th
Células T helper
TNF-α
Fator de necrose tumoral alpha
Treg
Células T regulatória
X2
Chi quadrado
17
1
2
1. INTRODUÇÃO
3
4
A Organização Mundial de Saúde calcula que o câncer seja responsável pela
5
morte anual de seis entre 11 milhões de indivíduos que possuem o diagnóstico
6
positivo de câncer (RENNIE; RUSTING, 1996; BACURAU; COSTA ROSA, 1997),
7
sendo estimado que a metade desses indivíduos apresente sobrevida inferior a
8
cinco anos depois de diagnosticada a doença. Não obstante da incidência de alguns
9
tipos de câncer apresentarem diminuição nos países em desenvolvimento, de forma
10
geral os casos de câncer têm aumentado consideravelmente nos últimos anos
11
(TRICHOPOULOS; LI; HUNTER, 1996, BACURAU; COSTA ROSA, 1997).
12
A palavra câncer se origina no grego karkinos e do latim cancer, significando
13
caranguejo. A relação simbólica com a doença deve-se ao fato da semelhança entre
14
as veias de um tumor e as pernas do animal, e também pela sua agressividade,
15
imprevisibilidade, invulnerabilidade e capacidade de aprisionamento (CUNHA, 1982;
16
DOUSSET, 1999).
17
A nomenclatura câncer foi utilizada por muito tempo como sinônimo apenas
18
para os diferentes tipos de neoplasias malignas. Entretanto, mais recentemente, tem
19
sido usado também para definir as neoplasias benignas (SPINOLA; MANZZO;
20
ROCHA, 2007).
21
Os processos de desenvolvimento do câncer ainda hoje não são totalmente
22
compreendidos, mas a grande parte das teorias utiliza um modelo com d uas etapas
23
básicas. A primeira etapa consistiria na alteração do material genético celular. A
24
segunda etapa sendo caracterizada pela divisão da célula alterada e transmissão de
25
seu material genético para células filhas (VIEIRA; MASSARIL, 2007).
26
Segundo Weinberg (1996), o câncer seria uma progressiva substituição de
27
um tipo celular normal por células alteradas. O crescimento da massa tumoral
28
estaria relacionada ao crescimento do tumor contraposto à lenta taxa de mortalidade
29
das células neoplásicas. Em algumas situações, estas células da massa tumoral
30
deslocam-se do local de origem, e difundem-se pela circulação, formando sítios de
31
células neoplásicas pelo organismo, denominando -se metástases. Massas tumorais
32
de origem metastática podem impedir a função de inúmeros órgãos, podendo
33
resultar em morte.
18
1
Este mesmo autor relembra que a palavra ―câncer‖ é um termo generalizado
2
que abrange mais de 100 formas da doença e, embora cada tipo de câncer tenha
3
aspectos particulares, causas básicas comuns parecem estar envolvidas no seu
4
desenvolvimento.
5
Inúmeros fatores são colocados como agentes potencialmente envolvidos na
6
iniciação e/ou desenvolvimento da doença. Tais fatores foram encontrados a partir
7
de observações em estudos epidemiológicos, capazes de identificar características
8
comuns no histórico de indivíduos portadores de câncer. Fatores como dieta, fumo,
9
contato com substâncias tóxicas, consumo de álcool, infecção por diferentes
10
patógenos, diversos tipos de radiação e poluição ambiental são considerados
11
importantes (TRICHOPOULOS; LI; HUNTER, 1996).
12
Dois fatores predisponentes e que podem ser controlados são o fumo e o
13
consumo de álcool, que se totalmente eliminados, talvez um terço dos cânceres
14
pudesse ser evitado (DOLL; PETO, 1981). Na busca de outros aspectos
15
modificáveis do comportamento do ser humano que potencialmente podem reduzir o
16
risco de desenvolver câncer, a atividade física surge como um candidato promissor.
17
A prática de exercício tem mostrado associação com inúmeros benefícios
18
para a saúde, incluindo a diminuição da incidência de doença cardíaca coronária
19
(BERLIN; COLDITZ, 1990), hipertensão (HAGBERG, 1990), diabetes mellitus não
20
insulina dependente (HELMRICH et al., 1991) e o aumento da longevidade
21
(PAFFENBARGER et al., 1993). Existe também uma associação entre atividade
22
física e menores taxas de ocorrência de câncer? Esta hipótese de que o exercício
23
pode reduzir risco de câncer não é algo novo, na verdade, no início do século XX,
24
Cherry (1922) observou que os homens envolvidos em ocupações fisicamente ativos
25
experimentaram taxas mais baixas de mortalidade por câncer do que homens
26
envolvidos em trabalhos menos árduos.
27
Considera-se que o sistema imunológico apresenta um papel fundamental na
28
defesa contra o câncer dada à capacidade desse sistema de reconhecer fatores
29
estranhos ao organismo, tais como células neoplásicas. Uma característica comum
30
entre os vários fatores relacionados ao desenvolvimento do câncer é que todos são
31
capazes de exercer influências sobre o sistema imunológico, provocando
32
imunossupressão. Vale ressaltar, porém, que muitos aspectos específicos dos
33
mecanismos através dos quais esses fatores contribuem para o estabelecimento do
34
câncer não são conhecidos (TRIC HOPOULOS; LI; HUNTER, 1996; BACURAU et
19
1
al., 2000). E os caminhos que o sistema imune adota frente à prática de atividade
2
física para prevenir e até mesmo combater o câncer, também não foram totalmente
3
elucidados.
4
5
6
7
1.1 CARCINOGÊNESE QUÍMICA INDUZIDA POR 7,12–DIMETIL–BENZANTRACENO (DMBA)
8
O estudioso Percival Pott foi o primeiro a observar que certas substâncias ou
9
agentes seriam responsáveis por provocar danos aos tecidos, o mesmo
10
correlacionou a ampla prevalência de casos de carcinoma epidermóide na pele do
11
escroto em trabalhadores que limpavam chaminés. A partir de então, outros
12
pesquisadores desviaram seus olhares para um aumento de neoplasias epiteliais,
13
principalmente em trabalhadores em íntimo contato com óleos lubrificantes ou
14
alcatrão. Tais observações levaram ao reconhecimento dos hidrocarbonetos
15
policíclicos aromáticos (HPA) como grupo de compostos oncogênicos (WOOLF,
16
1998; RODRIGUES; CAMARGO, 1999).
17
Os HPA se enquadram como grupo de substâncias químicas das mais
18
potentes no que pauta a oncogênese quimicamente induzida. Podem ser
19
provenientes de combustíveis fósseis e também como produtos de combustão
20
incompleta do carvão mineral, petróleo, tabaco, entre outros. Podem ocorrer em
21
alguns produtos alimentícios principalmente os defumados. Os principais exemplos
22
de HPA são o 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA), o metilcolantreno, o benzopireno
23
e o 4-quinolina1-óxido (4NQO). Estas substâncias são cancerígenas indiretas,
24
dependendo de sistemas enzimáticos para a sua ativação no organismo (SERPI,
25
2003; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
26
A ativação destes oncogênicos ocorre pelo sistema enzimático do citocromo
27
P-450, do compartimento microssômico hepático, por meio do receptor aril
28
hidrocarboneto, responsável por fazer o intermédio dos efeitos tóxicos, teratogênicos
29
e oncogênicos dos HPA, sendo responsável pela primeira etapa do metabolismo
30
destas substâncias (RODRIGUES; CAMARGO, 1999; IDE et al., 2004).
31
Odukoya; Shklar (1984), em seus estudos, suspeitaram que o DMBA seria
32
dependente de agente promotor, porém Fassoni et al. (1993) e Mainenti (2006)
33
evidenciaram que o DMBA seria um carcinógeno completo, responsável por todas
34
as fases do câncer, ou seja, iniciação, promoção e progressão. O DMBA é apontado
20
1
como sendo o HPA mais efetivos em carcinogênese de mama (SHKLAR, 1970; IDE
2
et al., 2004; MAINENT, 2006).
3
Os estudos que envolvem a carcinogênese em modelos animais, surgiram em
4
1918, por meio das pesquisas coordenadas por Yamagiwa e Ichikawa. Em seus
5
estudos Cook e seus colaboradores isolaram o 3,4-benzopireno do alcatrão, em
6
1932, possibilitando uma maior compreensão da interrelação agentes químicos e
7
neoplasias (SHKLAR, 1970).
8
O DMBA é um potente indutor de formação de tumor de mama em roedores.
9
Normalmente é administrado por via oral, por gavagem, misturado com óleo.
10
(RUSSO et al., 2005). A biotransformação do DMBA é feita no fígado e nas
11
glândulas mamárias. Desta forma, estudos que utilizam substâncias que alterem
12
significativamente a função hepática ou dietas com alto teor de gordura são
13
contraindicados a utilização de DMBA em sua metodologia, pois pode haver
14
alteração dos resultados.
15
Em roedores, os tumores induzidos quimicamente são hormônio-dependentes
16
(RUSSO et al., 2005), essa dependência é demonstrada, por exemplo, em ratas
17
Sprague-Dawley e com tumor induzido por DMBA que foram submetidas a
18
ooforectomia, os tumores regrediram em cerca de 70% a 80% (SOLLEVELD et al.,
19
1986; THOMPSON; SINGH, 2000). Após ocorrência de gestação e lactação, a
20
exposição ao DMBA reduz a suscetibilidade da glâ ndula mamária em formar tumor,
21
entretanto, gestação após a exposição facilitará a formação tumoral (RUSSO et al.,
22
2005).
23
24
1.2 O SISTEMA IMUNE E TUMORES
25
26
O sistema imunológico tem evoluído para conseguir identificar e eliminar
27
patógenos que podem causar danos ao organismo. Além disso, serve como
28
guardião contra transformação de células que podem levar ao câncer (SMYTH;
29
GODFREY; TRAPANI, 2001; SOGN, 1998).
30
As principais células do sistema imunológico de vigilância tumoral são os
31
linfócitos T, ou simplesmente células T, que são parte da resposta imunológica
32
adaptativa ou específica. Após o reconhecimento de um antígeno em uma célula
33
tumoral através do receptor de células T (TCR), são ativadas células T CD8, que
21
1
podem matar o tumor de células-alvo e, portanto, são chamadas células T
2
citotóxicos (CTL) (AGNEY; KRAMMER, 2002).
3
Um subgrupo de células T CD4, células T helper tipo 1 (Th1), auxiliam a
4
ativação de células T CD8. O outro subgrupo CD4, células Th2, estimula uma
5
resposta imune humoral e suprime o desenvolvimento de uma resposta Th1. Células
6
T CD4 também podem apresentar atividade citotóxica em algumas situações.
7
Células T CD4 e CD8 reconhecem antígenos por meio da apresentação de
8
peptídeos pelo complexo/molécula de histocompatibilidade (CHP/MHC) classe I ou
9
II, sendo apresentadoras para células T CD8 e T CD4, respectivamente (AGNEY;
10
KRAMMER, 2002).
11
E na resposta aos tumores há o perfil Treg (T reguladoras), vinculado à
12
imunossupressão, nos dias atuais, as funções das células Tregs têm incorporado
13
uma nova visão para a explicação das enfermidades imunológicas questionando o
14
paradigma Th1/Th2 e, consequentemente sua avaliação é considerada muito
15
promissora como opção terapêutica (DAMOISEAUX, 2006). Células Tregs CD4+
16
podem ser subdivididas em dois tipos principais: as naturais e as adaptativas
17
(nTregs e aTregs). O que distingue os dois tipos são as vias de desenvolvimento e
18
mecanismos de supressão diferentes (WING; FEHERVARI et al., 2006).
19
Numerosos
antígenos
tumorais
foram
identificados
que
podem
ser
20
reconhecidos por células T (BOON; VAN DER BRUGGEN, 1996; ROSENBERG,
21
2001; HOUGHTON; GOLD; BLACHERE, 2001;). Alguns desses antígenos são
22
expressos exclusivamente por tumores e assim são chamados antígenos tumor
23
específico. Estes antígenos podem surgir a partir de mutações ou translocações
24
gênica de células normais (por exemplo, β-catenina, cdk4, ras). As mutações podem
25
estar diretamente envolvidas na carcinogênese. Outro grupo de antígenos estão
26
associados a antígenos tumorais - que não só são expressas por células tumorais,
27
mas também são expressas por outras células do corpo. No câncer testicular, os
28
antígenos são expressos em uma variedade de tumores epiteliais, bem como no
29
testículo e tecido placentário (por exemplo, MAGE, BAGE, GAGE). No infiltrado
30
tumoral, linfócitos foram identificados em reações contra os antígenos presentes na
31
diferenciação de melanócitos normais bem como melanomas (por exemplo, MART-
32
1/Melan-A, tirosinase, gp100). A expressão de antígenos tumorais pode ser
33
heterogênea dentro de um tumor, e um único paciente pode desenvolver reações
22
1
imunes a vários antígenos (WORTZEL; PHILIPPS; SCHREIBER, 1983; LEE et al.,
2
1999).
3
Dois modelos diferentes para a resposta imunológica a tumores foram
4
propostos: o conceito de vigilância imunológica e o modelo de Perigo. De acordo
5
com o hipótese de vigilância imunológica, tumores expressam antígenos que são
6
considerados estranho pelo sistema imunológico, e uma das principais funções do
7
sistema imune é vistoriar o corpo para o desenvolvimento de tumores malignos e
8
para eliminar as células tumorais que vão surgindo (BURNET, 1970).
9
Para detectar o modelo de perigo, o sistema imune utiliza de células
10
apresentadoras de antígenos (APC), como sentinelas de danos nos tecidos. Na
11
presença de sinais de perigo, células APC tais como: células dendríticas e
12
macrófagos ativados, vão estimular a resposta dos linfócitos B e T. O modelo de
13
perigo propõe que células carcinogênicas não se apresentam como sendo perigosas
14
para o sistema imunológico, para que a resposta de células T a tumores não seja
15
iniciado (FUCHS; MATZINGER, 1996). Células Natural Killer (NK) do sistema imune
16
inato também desempenham um importante papel na vigilância imunológica dos
17
tumores (SOGN, 1998; SMYTH; GODFREY; TRAPANI, 2001). As células NK
18
eliminam células deficientes em MHC classe I de células deficientes, fenômeno este
19
que faz parte da hipótese da "auto eliminação" (WATZL; LONG, 2000; PARDOLL,
20
2001). A atividade das células NK é controlada por um balanço de sinais positivos e
21
negativos. O ajuste inibitório de receptores MHC classe I se dá por sinais de
22
ativação de blocos de moléculas. Duas famílias inibitórias de receptores foram
23
identificadas em humanos: inibição de receptores da imunoglobulina -like killer e
24
receptores da lectina-like CD94-NKG2. Receptores estimuladores compreendem
25
(por exemplo, CD16, CD94-NKG2C, receptores natural de citotoxicidade), presume-
26
se que vinculam constitutivamente na expressão de ligantes (MORETTA et al., 2000)
27
e receptoresNKG2d, que se vinculam às moléculas que são induzida pelo estresse
28
celular (BAUER et al. 1999; WU et al., 1999; CERWENKA et al., 2000). Ligantes
29
para receptores NKG2d são MHC classe I, relacionadas com cadeia (MIC) de
30
glicoproteínas, MICA e MICB em seres humanos e os antígenos de menores de
31
histocompatibilidade H60 e a indução precoce de ácido retinóico (Rae-1) estão
32
presentes em famílias de camundongos.
33
Outras células do sistema imune inato envolvido na imunidade contra tumores
34
são macrófagos e neutrófilos (ELGERT; ALLEVA; MULLINS, 1998; LOLLINI; FORNI,
23
1
1999; DI CARLO et al., 2001; BONNOTTE et al., 2001). Elas podem rejeitar tumores
2
pela eliminação direta de células neoplásicas, pela destruição de vasos e matriz
3
tumoral, e por inibição da angiogênese. Além disso, elas exibem antígenos tumorais
4
e podem estimular outras células imunitárias, como as CTLs, células NK, ou APC.
5
Em contraste, as células inflamatórias podem também contribuir para a progressão
6
tumoral pela produção de fator de crescimento tumoral beta (TGF-β) e estimulação
7
da angiogênese (LIN et al., 2001). Macrófagos e neutrófilos são recrutados para a
8
localização do tumor através da expressão de moléculas de aderência nas células
9
endoteliais e por proteínas quimiotáticas (AGNEY; KRAMMER, 2002).
10
11
1.3 ATIVIDADE FÍSICA E O SISTEMA IMUNOLÓGICO
12
13
A classificação do exercício físico leva em consideração a intensidade do
14
esforço como: leve, moderado e inte nso. Essa classificação está correlacionada com
15
a realização de alguns testes de esforço máximo para avaliar a concentração de
16
lactato no sangue, o consumo máximo de oxigênio, e a freqüência cardíaca máxima
17
(SILVEIRA; DENADAI, 2003).
18
O efeito do exercício físico sobre as células do sistema imunológico tem sido
19
bem estudado, diferentes tipos e cargas de esforço podem ter efeitos diferentes na
20
resposta imune. O exercício moderado parece beneficiar os mecanismos de defesa,
21
enquanto que o exercício intenso parece suprimi-los (NIESS et al., 1998; NIEMAN,
22
2000; LEANDRO et al., 2002; ANGELI et al., 2004; LAGRANHA, et al, 2004; DA
23
NOBREGA, 2005).
24
Em resposta a um exercício físico intenso ocorre neutrofilia, linfopenia e
25
monocitose. A redistribuição destas células no leito vascular em resposta ao
26
exercício parece ser mediada pela adrenalina e noradrenalina. A expressão de β-
27
receptores nas diferentes células do sistema imune pode fornecer a base molecular
28
para ação das catecolaminas. Todavia, a densidade de receptores adrenérgicos e a
29
eficiência do sistema de transdução AMPc diferem variando pela tipagem das
30
células imunocompetentes. Os neutrófilos e as células natural killer (NK) parecem
31
expressar maior número de receptores, sendo seguidos, decrescentemente, pelos
32
linfócitos T CD8+, linfócitos B e, finalmente, pelos linfócitos T CD4+ (BESEDOVSKY;
33
DEL REY, 1992; BLALOCK, 1994; PEDERSEN; HOFFMAN-GOETZ, 2000;
24
1
BESEDOVSKY; DEL REY, 2002; PITHON-CURI et al., 2002; GARCIA et al., 2003;
2
LAGRANHA et al., 2005).
3
O exercício físico extenuante pode induzir inibitoriamente muitos aspectos da
4
resposta imune, incluindo a atividade das células NK, a resposta proliferativa dos
5
linfócitos e a produção de anticorpos pelos plasmócitos.
6
comprometem a defesa contra agentes infecciosos e oncogênicos, bem como nos
7
processos alérgicos e auto-imune
8
HOFFMAN-GOETZ, 2000; JONSDOTTIR, 2002; ATANACKOVIC et al., 2004;
9
PERES; OTTON; CURI, 2005; DA NOBREGA, 2005).
Tais alterações
(PEDERSEN et al., 1988; PEDERSEN;
10
Gillis et al.(1979) observaram inibição na produção do fator de crescimento de
11
linfócitos T, IL-2, induzida pelo aumento do uso de glicocorticóides. Woods et
12
al.(1994) verificaram diminuição na produção de superóxido por macrófagos
13
peritoneais de ratos em resposta a exercícios físicos com carga intensa. Estes
14
estudos mantêm o conceito de imunossupressão induzida pelo estresse físico, pois,
15
conforme supracitado, os linfócitos e os macrófagos atuam, de forma determinante,
16
contra a carcinogênese e a auto-imunidade.
17
Porém, analisando em outra vertente, o exercício físico moderado parece
18
estar vinculado ao aumento da função de leucócitos. Vários estudos verificaram que
19
o exercício físico de intensidade moderada auxilia na quimiotaxia, degranulação,
20
fagocitose e atividade oxidativa dos neutrófilos uma hora após exercício físico a 60%
21
consumo máximo de oxigênio (NIEMAN, 2000; BACURAU et al., 2000; GLEESON;
22
PYNE, 2000).
23
Woods et al. (1994), apresentaram em seus estudos aumento da aderência,
24
produção de ânion superóxido, taxa de metabolismo do nitrogênio, atividade
25
citotóxica e a capacidade fagocítica de macrófagos quando da prática de atividade
26
física na intensidade moderada.
27
Pedersen e Tvede (1993) estudaram o comportamento da resposta das
28
populações linfocitárias em ciclistas durante uma hora de exercício físico e
29
verificaram aumento na atividade citolítica de células NK e da linfocina ativadora de
30
células NK (LAK). Em vista de tantos estudos que enaltecem a atividade física, há
31
estudos relatando que não ocorre alteração na concentração salivar de IgA e de IgE,
32
no soro, durante um exercício moderado (PETERS et al., 1993; MILLER, 1998;
33
BURY et al., 1998; LANCASTER et al., 2004). De fato, está bem estabelecido que o
34
exercício físico moderado está associado ao aumento da função imunológica e a
25
1
diminuição da suscetibilidade às doenças (DOS SANTOS CUNHA et al., 2004).
2
Perante tais evidências, é plausível estabelecer um elo entre a prática de atividades
3
físicas de intensidade moderada e as alterações ocorridas no sistema imunológico.
4
Mas em contrapartida, existe uma percepção de que atletas de alto nível têm
5
maiores riscos de adquirir infecções, como as infecções do trato respiratório superior
6
durante períodos de treinamento intenso e após competições exaustivas (NIEMAN,
7
2000; LANCASTER et al., 2004).
8
Bury et al.(1998) evidenciaram diminuição na proliferação de linfócitos T e na
9
função fagocítica de neutrófilos em jogadores de futebol em período de competição.
10
A justificativa simplista para essa imunossupressão, em resposta à carga intensa de
11
exercício físico, é o aumento do desgaste das funções do organismo com
12
exacerbada produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e incremento do
13
estresse oxidativo tecidual (ASCENSAO et al., 2003; ANGELI et al., 2004).
14
Lin e seus colaboradores (1993) verificaram que o aumento na ocorrência de
15
apoptose em timócitos está vinculada à elevação na produção de EROs em ratos
16
submetidos a dois dias de exercício físico extenuante, sendo que estes efeitos foram
17
amenizados pela administração prévia de antioxidante, hidroxianisol butilato.
18
Pedersen e Tvede (1993) assistiram ciclistas treinados por quatro anos
19
consecutivos e detectaram diminuição na incidência de infecções com conseqüente
20
aumento da função imunológica. Foi visto também que atletas não competitivos ou
21
indivíduos que aderiram à prática regular de exercício de intensidade leve a
22
moderada, comparativamente à população sedentária, apresentam maior proteção
23
contra infecções (ESCRIBANO et al., 2002; FU et al., 2003; HOFFMAN-GOETZ;
24
DUERRSTEIN, 2004; DAVIDSON; BURNETT; HOFFMAN-GOETZ, 2006).
25
Pastva e colaboradores (2004) demonstraram que treinamento de intensidade
26
moderada diminui a infiltração de leucócitos, a produção de citocinas, expressão de
27
moléculas de adesão e a remodulação estrutural nos pulmões de camundongos
28
asmáticos. A função de neutrófilos e a proliferação de linfócitos B não se alteraram
29
em estudos realizados com humanos treinados.
30
Em animais, foi observado aumento na função de macrófagos após um
31
programa de treinamento moderado. Woods et al. (2000) verificaram aumento na
32
função fagocítica de macrófagos peritoneais de ra tos após 12 semanas de natação.
33
26
1
1.4 ATIVIDADE FÍSICA E CÂNCER
2
3
Dados epidemiológicos remetem que a atividade física seja capaz de
4
proporcionar reduções nos índices de mortalidade, em destaque influenciando na
5
incidência e na melhora das condições de vida em indivíduos portadores de
6
neoplasias, tais relatos sugiram no início do século XX, porém ainda não elucidados
7
no que tangem aos mecanismos envolvidos em tais resultados (BLAIR et al., 1989;
8
UHLENBRUCK; ORDER, 1991; CANNON, 1993; LAPERRIERE et al., 1994).
9
Entre as muitas funções complexas do sistema imunológico humano é a
10
regulação da suscetibilidade ao câncer que está em destaque na atualidade. Assim,
11
se o exercício pode melhorar o sistema imunológico, é plausível que a atividade
12
física consiga reduzir o risco de câncer.
13
Os marcadores da função imunológica examinados incluíram susceptibilidade
14
à infecções respiratórias superiores e da função das células (por exemplo, células do
15
sistema monócito-macrófago e células natural killer), que servem como a primeira
16
linha de defesa do corpo contra o desenvolvimento e disseminação de câncer
17
(MACKINNON, 1989; ROITT et al, 1989; SHEPHARD, 1991).
18
As infecções respiratórias superiores tem sido estudada em função do
19
sistema imunológico humano
também ser responsável pela regulação da
20
susceptibilidade à esta infecção. A evidência disponível sugere que o aumento dos
21
níveis de atividade física, até um certo ponto, aumentam a função imunológica, além
22
deste nível a função do sistema imunológico apresenta diminuição das suas funções
23
(NIEMAN, 1994; PEDERSEN; ULLUM, 1994; WOODS; DAVIS, 1994). Este ponto de
24
corte é ainda incerto. Quantidades moderadas de atividade física (por exemplo,
25
caminhada) têm mostrado reduzir o risco de infecção respiratória superior ( NIEMAN,
26
1994), bem como aumentar a função das células do sistema monócito-macrófago
27
(WOODS; DAVIS, 1994) e NK células (PEDERSEN; ULLUM, 1994).
28
Bacurau et al.(2000) verificaram que macrófagos de animais treinados e com
29
tumor de Walker-256 apresentam aumento na atividade fagocítica. Verificou-se
30
elevação no índice de proliferação de linfócitos e no tempo de vida dos animais
31
treinados com tumor comparados aos animais sedentários com tumor. Leandro et al.
32
(2007) observaram aumento na função fagocítica de macrófagos alveolares de ratos
33
submetidos a seis semanas de natação (cinco dias/semana, 60 minutos/dia).
27
1
Em níveis mais intensos de exercício, no entanto, imunossupressão parece
2
ocorrer em seu lugar. Por exemplo, o seguinte tipo de maratona de corridas, os
3
corredores parecem ter maiores taxas de infecções do trato respiratório no período
4
de uma a duas semanas (NIEMAN, 1994). Além disso, atletas de elite (por exemplo,
5
os ciclistas) aumentaram a atividade das células NK em descanso, mas a função
6
deprimia após intensa atividade (PEDERSEN; ULLUM, 1994). Para resumir, então,
7
parece plausível para o exercício, pelo menos, em quantidades moderadas para
8
reduzir o risco de câncer, melhorando a função do sistema imunológico humano.
9
Por outro lado, para os cânceres do sistema reprodutivo, vários hormônios
10
são necessários para o seu desenvolvimento. Assim, se o exercício pode alterar os
11
níveis desses hormônios, o que representa outro mecanismo plausível para a
12
atividade física diminuir o risco de câncer. No sexo feminino, o estrogênio, bem
13
como a combinação de estrógeno e progesterona, estimula a proliferação celular na
14
mama e assim tem sido implicado no desenvolvimento do câncer de mama
15
(HENDERSON et al., 1993).
16
Estudos de atletas do sexo feminino têm mostrado que o treinamento pode
17
reduzir os níveis de estrogênio e progesterona (SHANGOLD, 1984). Além disso, em
18
mulheres jovens, o treinamento intenso também pode retardar o aparecimento da
19
menarca (WARREN, 1980), reduzindo assim a exposição de uma mulher a estes
20
hormônios. No sexo masculino, a testosterona parece ser importante
21
desenvolvimento do câncer da próstata (GITTES, 1991). Exercício intenso pode
22
reduzir níveis basais de testosterona, potencialmente reduzir o risco deste tipo de
23
câncer (LEE et al., 1992). Finalmente, o exercício pode influenciar o risco de câncer,
24
através do seu efeito na diminuição do peso corporal e redução da gordura corporal.
25
Para certos tipos de câncer, como câncer de cólon (LEW; GARFINKEL, 1979) e
26
câncer de mama (KELSEY; GAMMON, 1991), a obesidade está associada com o
27
aumento do risco.
no
28
Embora seja atraente postular que o exercício pode diminuir o risco de câncer
29
de mama como poucos fatores de risco modificáveis para a existêcia deste câncer,
30
os dados disponíveis não suportam consistentemente essa hipótese. Frisch et al.
31
(1985) descreveram pela primeira vez uma relação inversa entre atividade física e o
32
câncer de mama. Entraram em contato com 5.398 ex-alunas sobreviventes das
33
classes de 1925-1981 a partir de 10 faculdades e universidades, por meio de
34
questionário e pediu-lhes que informe se elas tinham desenvolvido câncer de mama.
28
1
Estas mulheres representavam 2.622 ex-atletas de instituições e foi colhida uma
2
amostra aleatória de não atletas. Um total de 69 tipos de câncer de mama tinham
3
desenvolvido entre essas alunas. Quando os investigadores compararam a
4
prevalência de câncer de mama entre atletas com não atletas, eles descobriram que
5
as não atletas apresentaram 1,9 vezes a mais de risco. Estudos subseqüentes não
6
conseguiram reproduzir consistentemente esses achados (LEE, 1994; PUKKALA et
7
al, 1993; ZHENG et al, 1993; BERNSTEIN et al, 1994; DORGAN et al, 1994).
8
Há hipóteses sobre os mecanismos de ação do sistema imune para explicar
9
os benefícios da atividade física, estando então vinculados ao aumento do gasto
10
energético. O excessivo gasto das fontes energéticas dificultaria o desenvolvimento
11
e retardaria o crescimento tumoral uma vez que o organismo ao consumir mais
12
substratos apresentaria uma vantagem contra o tumor na competição por nutrientes.
13
Porém, apesar de estudada esta teoria (SHEPARD, 1990), alguns pesquisadores
14
não acreditam que o principal efeito do exercício decorra deste mecanismo de gasto
15
de energia, um aspecto importante a ser observado é que nem todo tipo de exercício
16
parece apresentar efeitos benéficos em relação ao câncer (HOFFMAN-GOETZ;
17
WATSON, 1993; HOFFMAN-GOETZ, 1994), pois, embora se acredite que a prática
18
de exercícios de intensidade moderada seja positiva para o sistema imunológico, a
19
realização de exercícios de alta intensidade apresentaria efeitos opositores
20
(HOFFMAN-GOETZ, 1994; WOODS; DAVIS, 1994). Segundo estes mesmos
21
autores, a dificuldade no estabelecimento preciso da relação entre atividade física e
22
resistência ao câncer não é surpreendente, devido à extensa diversidade de tipos de
23
câncer e de seus processos de iniciação, progressão e metástase, assim como à
24
diversidade de alterações provocadas pela atividade física.
25
Woods e Davis (1994) mencionam que a maioria dos estudos recentes sobre
26
tumor e exercício tem enfatizado o número de leucócitos, proliferação de linfócitos,
27
atividade de células NK, síntese e concentração de imunoglobulinas. Poucos
28
estudos, no entanto, têm utilizado abordagens integradas, ou seja, associação dos
29
dados obtidos com alterações metabólicas e hormonais gerais que ocorrem no
30
organismo portador de neoplasia. Análises parciais e isoladas são comuns,
31
dificultando a compreensão da importância destes dados no contexto do
32
desenvolvimento neoplásico. Uma exceção nesse sentido é o estudo de Daneryd et
33
al. (1995), que investigaram os efeitos do exercício sobre vários aspectos do
34
organismo portador de neoplasia. As investigações tiveram um caráter integrativo,
29
1
correlacionando aspectos como o grau de infiltração de macrófagos em neoplasias e
2
a concentração plasmática de hormônios, assim como parâmetros relacionados ao
3
metabolismo muscular. Os autores observaram que a atividade física espontânea
4
apresenta efeitos benéficos para síntese protéica, reverte a diminuição na
5
concentração plasmática dos hormônios anabólicos (insulina e T3 reverso) e
6
promove a redução da concentração de cortisol (um importante indutor de
7
proteólise). Dessa forma, os autores concluíram que a atividade física é capaz de
8
conservar a massa muscular, apesar da presença do tumor em constante
9
competição com o organismo por nutrientes.
10
Mas à exceção de alguns estudos pouco se tem investigado sobre células
11
como macrófagos, fundamentais para o combate inicial contra o desenvolvimento
12
tumoral
13
comprometedora quando se admite que durante o combate ao desenvolvimento
14
tumoral, macrófagos são tão importantes quanto as células NK, ao contrário do que
15
se supunha até pouco tempo atrás (BRINES; HOFFMAN-GOETZ; PEDERSEN,
16
1996).
(WOODS;
DAVIS,
1994).
Essa
omissão
torna-se
ainda
mais
17
Dessa forma, analisando a literatura disponível, observa-se que as
18
interrelações entre o exercício e o câncer necessitam de maiores estudos para que
19
se obtenham idéias mais conclusivas a esse respeito. Nesse sentido faz-se
20
necessário e importante a realização de mais estudos que utilizem programas de
21
exercício com intensidade, duração e freqüência controladas. Além disso, tais
22
estudos devem ter como um de seus objetivos o uso de abordagens integrativas, ou
23
seja, deve-se verificar como o exercício modula diferentes aspectos imunológicos no
24
organismo portador de neoplasia. Com essa série de dados tornar-se-á mais fácil a
25
distinção dos efeitos do exercício sobre o desenvolvimento e prevenção do câncer.
30
1
2
2. JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE
3
4
Frente à casuística da oncologia, as mais variadas formas de tratamento são
5
empregadas visando à cura, na maior parte das vezes sem êxito, porém os cuidados
6
paliativos se fazem necessários porque o objetivo principal do tratamento é
7
proporcionar uma melhor qualidade de vida ao i ndivíduo com câncer.
8
Desta maneira, um dos meios de manter uma qualidade de vida satisfatória
9
seria a prática de exercícios com finalidade terapêutica, ou seja, a prática da
10
cinesioterapia, terapia por meio do movimento corporal. Segundo Demarzo et al.
11
(2008), modelos experimentais que foram previamente treinados e posteriormente
12
induzidos à carcinogênese, apresentaram um menor desenvolvimento tumoral.
13
Evidenciando que a prática de exercícios físicos pode minimizar o desenvolvimento
14
do tumor ou mesmo prevení-lo.
15
Para elucidar qual ou quais os mecanismos que o sistema imunológico utiliza
16
para minimizar o desenvolvimento tumoral e até mesmo utilizar para que ocorra um
17
efeito antitumoral relacionado à prática do exercício, justifica os interesses da
18
realização deste estudo.
19
20
31
1
2
3
3. OBJETIVO GERAL
4
Este estudo objetiva investigar a influência da atividade física aeróbica de leve
5
intensidade sobre a resposta imunológica decorrente do desenvolvimento do câncer.
6
7
8
9
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.
Analisar a influência da atividade física na resposta do sistema imune
10
contra tumores, através da avaliação de células imunes provenientes da cultura de
11
células esplênicas (CD 3 +, CD4+, CD8+ e CD14+).
12
2.
Analisar a influência da atividade física na resposta do sistema imune
13
antitumoral, através das alterações na síntese de citocinas provenientes da cultura
14
de células esplênicas (IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNF-α, TGF-β e CD25+).
15
3.
Analisar a influência da atividade física na reposta do sistema imune
16
antitumoral, através da análise das citocinas na cultura de macrófagos peritoneais
17
(IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNF-α e TGF-β).
18
19
32
1
2
4. MATERIAIS E MÉTODOS
3
4
4.1 ANIMAIS
5
6
Foram utilizados 56 camundongos fêmeas adultas da linhagem Balb/c, com 8
7
semanas, provenientes do Biotério do Instituto de Pesquisa em Oncologia - IPON.
8
Os animais ficaram mantidos em gaiolas plásticas separados em grupos, com
9
espaço adequado para acomodação, em ambiente claro/escuro, com temperatura
10
controlada (21±3°C), alimentação e água ad libitum. Após o período experimental os
11
animas foram eutanasiados com superdosagem de anestésicos, Cloridrato de
12
Ketamina (50mg/kg) e Xilazina (15mg/kg). Os restos mortais dos animais foram
13
descartados junto ao lixo biológico para incineração. Este estudo foi aprovado no
14
Comitê de Ética no uso de Animais – CEUA, da Universidade Federal do Triângulo
15
Mineiro, sob número de registro 160.
16
17
4.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS
18
Tabela 1 - Divisão dos grupos experimentais.
19
Admini stração de DMBA
(1mg/ml)
(45 min/ 5x por semana/ 8 semanas)
Controle
-
-
Treinado
-
+
Tumor
+
-
Tumor Treinado
+
+
O desenvolvimento dos experimentos procedeu-se em duas etapas, ou seja,
20
um experimento
21
confirmatório com a outra metade.
22
Treinamento
Grupos
utilizando
metade
dos
animais, e
posterior experimento
33
1
4.3 DESENHO EXPERIMENTAL
2
3
A figura 1 demonstra o desenho experimental, destacando a idade dos
4
animais no início das atividades, o período necessário para o aparecimento dos
5
tumores, e o intervalo de treinamento.
6
7
8
9
10
11
12
Figura 1 – Representação do desenho experimental.
* Período de desenvolviment o dos tumores apenas para os grupos tumor e tumor treinado, os demais
grupos seguiram o mesmo cronograma.
** Período de treinamento apenas para os grupos treinado e tumor treinado. Os demais grupos
permaneceram confinados nas gaiolas para cumprir o cronograma.
13
4.4 INDUÇÃO DOS TUMORES E PROTOCOLO DE TREINAMENTO
14
15
Os animais que foram submetidos à indução do tumor receberam doses de
16
DMBA (7,12- Dimetil-benzantraceno) na concentração de 1mg/mL via oral por
17
gavagem durante seis semanas.
18
O treinamento apresentou duração de oito semanas e freqüência de cinco
19
dias por semana. Após período de adaptação ao meio líquido (15 dias), os animais
20
dos grupos treinados realizaram programa de atividade física constituído de 45
21
minutos de natação. A temperatura da água foi mantida entre 30º a 35 °C e trocada
22
diariamente.
23
24
4.5 RETIRADA DO BAÇO COM OBTENÇÃO DE CÉLULAS ESPLÊNICAS E
25
COLETA DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS
26
27
Os animais dos diversos grupos experimentais tiveram os baços removidos e
28
realizado o lavado peritoneal após serem eutanasiados e necropsiados. Após a
29
homogeneização dos baços foram realizadas três lavagens por centrifugação das
30
células esplênicas e macrófagos peritoneais a 1200rpm por 10 min a 4ºC com RPMI
31
1640, estas foram contadas e ressuspensas em RPMI completo.
32
33
4.5.1 Cultura das células esplênicas e macrófagos peritoneais
34
1
A seguir estas células foram distribuídas em placas de 24 poços de fundo
2
plano em uma concentração de 1x10 6 células/poço em um volume de 1,0 ml e feito a
3
estimulação com LPS (10 μg/ml) nos poços pré-determinados, dose esta
4
previamente padronizada. Após 24h e 48h de incubação das referidas células a
5
37ºC e 5% de CO2, os sobrenadantes, obtidos em quadruplicatas, foram aliquotados
6
e armazenados a -80ºC.
7
8
4.6 CITOMETRIA DE FLUXO DAS CÉLULAS ESPLÊNICAS E MACRÓFAGOS
9
PERITONEAIS
10
11
Após a obtenção das células esplênicas e dos macrófagos peritoneais, as
12
mesmas foram colocadas em tubo cônicos de 50ml, adicionando-se uma solução de
13
lise (BD Biosciences - FACSTM Lysing Solution) na proporção 1:20 mL
14
(amostras:solução de lise). Após incubação à temperatura ambiente por 20 minutos,
15
o material foi centrifugado por 10 minutos, à temperatura de 4°C, em uma rotação de
16
1200 rpm. Após a centrifugação, desprezou-se o sobrenadante cuidadosamente,
17
conservando o precipitado de células. O excesso da solução de lise foi removido por
18
centrifugação lavando-se as células por 3 vezes com 30ml de PBS (solução salina
19
tamponada com fosfato) em cada lavagem, a 4°C e a velocidade de 1200g por 10
20
minutos. Adicionou-se 1 mL de PBS no precipitado de células, acrescentando 2 uL
21
da proteína transportadora inibitória (BD Golgistop TM) para cada 3 mL de solução
22
contendo as células esplênicas. Incubou-se por, no mínimo, 20 minutos a 4°C e,
23
posteriormente, as células foram lavadas por centrifugação com 30 mL PBS para
24
retirar o excesso de proteína.
25
Após a centrifugação, foi retirado o sobrenadante preservando-se apenas o
26
precipitado e então, as células foram ressuspensas em 1 mL de PBS. Em seguida, a
27
quantidade de células obtidas foi determinada por contagem em câmara de
28
Neubauer. A suspensão de células foi transferida para tubos de ensaio sendo,
29
primeiramente, realizada a marcação extracelular. Quatro tubos foram destinados
30
aos isotipos controles, dois para a marcação de macrófagos, dois para linfócitos
31
totais, cinco para linfócitos T auxiliares e um para linfócitos T citotóxicos,
32
demonstrado a planilha de tubos nas tabelas 2 e 3.
33
Os anticorpos utilizados para a marcação de membrana (extracelular) dos
34
isotipos controles foram: α-IgG1 APC, α-IgG2a Pe-Cy e α-IgG1 FITC. Para a
35
1
marcação de membrana dos macrófagos utilizou-se o anticorpo α-CD14 FITC, e
2
para os linfócitos T totais o α-CD3 FITC, linfócitos T auxiliares o α-CD4 Pe-Cy e α-
3
CD25 PE, e para linfócitos T citotóxicos o α-CD8 Alexa. Além desses, foi também
4
utilizado o anticorpo α-CD25 PE para a marcação de membrana dos linfócitos T
5
auxiliares. Após a primeira marcação, as células foram incubadas a 4°C por 30
6
minutos, no escuro. Em seguida, foi feita a lavagem das células com PBS para a
7
remoção do excesso de anticorpos. Posteriormente, as células foram incubadas
8
com solução de permeabilização e fixação (BD Cytofix/Cytoperm TM), a 4°C por 20
9
minutos, no escuro; para que fosse possível a marcação intracelular.
10
Para essa marcação, os anticorpos utilizados para os isotipos controles foram
11
o α-IgG1 FITC, α-IgG2b FITC e α-IgG1 PE. Para os macrófagos utilizaram-se os
12
anticorpos α-IL-12 PE e α-TNF- α PE; para os linfócitos totais CD3 o α-IL-12 PE e α-
13
TNF- α PE; para linfócitos T CD4 os anticorpos, α-IFN-γ FITC, α-TNF- α PE, α-IL-10
14
FITC e α-IL-12 PE. E para linfócitos T CD8 os anticorpos: α-TNF-α PE.
15
Após a marcação intracelular, as células foram novamente incubadas a 4°C
16
por 30 minutos, no escuro; e lavadas em solução tampão (BD Perm/WashTM Buffer)
17
para a remoção do excesso de marcadores. Finalmente, as células foram
18
ressuspensas em 500 uL de PBS para a leitura no citômetro BD FACSCalibur™.
Tabela 2 - Marcações intra e extracelulares para as células do baço.
Tubos
Descrição
Marcação
Extracelular
Marcação
Intracelular
Isotipo
Controle
1
Isotipo 1
α-IgG1 APC
α-IgG1 FITC
-
2
Isotipo 2
α-IgG2a Pe-Cy
α-IgG1 FITC
-
3
Isotipo 3
α-IgG2a Pe-Cy
α-IgG2b FITC
-
α-CD3 FITC
α-TNF-α PE
ISO1
5
α-CD3 FITC
α-IL-12 PE
ISO1
6
α-CD4 Pe-Cy
α-CD25 PE
ISO3
7
α-CD4 Pe-Cy
α-IFN-γ FITC
ISO2
α-CD4 Pe-Cy
α-TNF-α PE
ISO2
9
α-CD4 Pe-Cy
α-IL-10 FITC
ISO 3
10
α-CD4 Pe-Cy
α-IL-12 PE
ISO 2
α-CD8 ALEXA
α-TNF-α PE
ISO2
4
Linfócito T CD3
8
11
Linfócito T CD4
Linfócito T CD8
36
Tabela 3 - Marcações intra e extracelulares para os macrófagos peritoneais.
Tubos
1
Descrição
Isotipo 1
2
Marcação
Extracelular
Marcação
Intracelular
Isotipo
Controle
α-IgG1 FITC
α-IgG1 PE
-
α-CD14 FITC
α-IL-12 PE
ISO 1
α-CD14 FITC
α-TNF-α PE
ISO 1
Macrófago
3
1
2
4.7 DETERMINAÇÕES DAS CONCENTRAÇÕES DAS CITOCINAS DE PADRÃO
3
TH1, TH2 E TREG
4
5
Um Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) tipo sanduíche foi
6
realizado para quantificar as concentrações de IL-2, TNF- , IFN- , IL-12, IL-4, IL-10
7
e TGF-β no sobrenadante de células esplênicas e macrófagos peritoneais, obtidos
8
de camundongos normais e daqueles induzidos com a DMBA.
9
As citocinas: IFN-γ, IL-2, TNF-α e TGF-β presentes no sobrenadante de
10
células esplênicas e macrófagos peritoneais dos animais dos referidos grupos foram
11
dosadas por ELISA utilizando pares de anticorpos monoclonais comerciais
12
disponíveis da BD OptEIA TM. O procedimento foi realizado conforme protocolo
13
fornecido pelo fabricante. Placas de 96 poços, foram sensibilizadas com 100 µl de
14
anticorpos monoclonais específicos para a captura da citocina desejada diluída em
15
―coating buffer‖. Em cada placa foram adicionados 100µl de citocina padrão
16
recombinante seguindo diluições seriadas 1:2 em ―assay diluent‖ a partir das
17
concentrações iniciais indicadas. Às outras fileiras foram adicionados 100 µl/poço
18
dos sobrenadantes de células esplênicas ou macrófagos peritoneais. As placas
19
foram incubadas a temperatura ambiente por duas horas e lavadas por cinco vezes
20
com uma solução contendo PBS-Tween 20%. A seguir, foram adicionados 100
21
µl/poço do anticorpo detector da citocina a ser dosada. As placas foram incubadas
22
por 1 hora à temperatura ambiente e novamente lavadas por cinco vezes em PBS-T.
23
Após esta etapa, foram adicionadas 100 µl/poço de TMB Substrate Reagent Set (BD
24
OptEIATM) e após 30 minutos foram adicionados 50 µl/poço de ácido fosfórico 2N.
25
Após adição do ácido foi realizado a leitura da placa de ELISA através do leitor
37
1
automático Spectramax 384 Plus, sendo os resultados obtidos pela diferença entre as
2
absorbâncias 450 e 570nm.
3
A concentração de cada citocina do sobrenadante de células esplênicas e
4
macrófagos peritoneais dos animais dos referidos grupos foram dosadas em pg/ml
5
através da comparação com as absorbâncias obtidas da curva padrão da respectiva
6
citocina, sendo realizada simultaneamente.
7
8
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
9
10
Para a análise estatística, foi elaborado, um banco de dados relacional no
11
qual constam dados comuns aos grupos já mencionados e outros que foram
12
relacionados, individualmente, a cada animal que fez parte do experimento. As
13
diversas informações das variáveis obtidas do banco de dados, foram testadas para
14
verificar a distribuição normal. Quando a distribuição foi considerada normal, foram
15
utilizados testes paramétricos; na comparação entre 2 grupos, utilizou-se o teste ―t
16
de Student‖ e na comparação entre 3 ou mais grupos, foi utilizada a análise de
17
variância. Os resultados foram expressos em média
18
que a distribuição não foi Gaussiana foram utilizados os testes não paramétricos; na
19
comparação entre 2 grupos, utilizou-se o teste de ―Wilcoxon, Mann-Whitney‖ e na
20
comparação de 3 ou mais grupos, o teste de ―Kruskal-Wallis‖. Os resultados foram
21
expressos em mediana e valores máximo e mínimo. As proporções foram
22
comparadas
23
acompanhado do teste exato de ―Fisher‖. As diferenças observadas foram
24
consideradas significantes quando a probabilidade de rejeição da hipótese de
25
nulidade for menor que 0,05 (5%).
através
do
teste
do
X2
desvio padrão. Nos casos em
(qui-quadrado),
quando
necessário
38
1
2
5. RESULTADOS
3
4
No presente estudo, buscamos relacionar a influência da atividade física com
5
o desenvolvimento de tumores de mama experimentais, analisando pelo foco da
6
resposta imune, camundongos foram submetidos à indução de tumor pelo DMBA e
7
implementado a prática de natação no período de oito semanas, sendo avaliado o
8
perfil celular em culturas de baços e macrófagos peritoneais, associados à síntese
9
de citocinas.
10
A figura 2 ilustra o tumor gerado pela indução química pelo DMBA de tumor
11
de mama, é possível visualizar na figura 2A uma massa tumoral de volume médio,
12
mas na figura 2B é possível verificar um aumento considerável desta massa tumoral,
13
e em 2C o volume final que o tumor apresentou até o término dos experimentos. Os
14
desenvolvimentos dos tumores visualizáveis externamente só foi possível verificar
15
no grupo tumor sem treinamento. Nos animais que receberam o DMBA e foram
16
submetidos a atividade física não apresentaram formações tumorais externas.
17
18
19
20
Figura 2 - (A) massa tumoral de volume médio (B) aumento considerável desta massa tumoral, e (C)
volume final que o tumor apres entou até o término dos experimentos.
39
1
2
5.1 CURVA DE SOBREVIDA DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS
3
Avaliando o gráfico 1, observa-se a sobrevida dos grupos experimentais, onde
4
os grupos que praticaram atividade física ou tiveram tumor apresentaram baixas ao
5
longo do período experimental. O grupo treinado apresentou duas baixas por
6
afogamento. Bem como o grupo tumor treinado que obteve três baixas também por
7
afogamento. Já o grupo tumor obteve duas baixas por ação do tumor.
8
9
Gráfico 1 – Represent ação da sobrevida dos grupos experimentais.
10
11
12
13
5.2 PERFIL DAS CÉLULAS IMUNOCOMPETENTES E EXPRESSÃO DE
CITOCINAS
14
Ao realizar a tipagem celular das linhagens linfocitárias e dos monócitos,
15
podemos verificar no gráfico 2A, que os grupos que praticaram atividade física tanto
16
na presença ou ausência do carcinógeno apresentaram menores frequências para
17
as duplas marcações de CD3+/TNF-α e CD3+/IL-12. Tais reduções são de caráter
18
significativo, para ambas as marcações, quando comprado o grupo treinado com o
19
grupo controle (p<0,0001), e quando comparado o grupo tumor treinado com o grupo
20
tumor (p<0,0001). O grupo tumor apresentou as maiores frequências de dupla
21
marcação, comparando o grupo tumor com os grupos treinado e tumor treinado há
22
diferença estatística (p<0,0001). Quando avaliada a influência do tumor associada à
40
1
atividade física há aumento da frequência, pois comparando os grupos treinado com
2
tumor treinado evidencia-se diferença significativa neste aumento para TNF-α
3
(p<0,0116) e IL-12 (p<0,0001).
4
Em contra partida à frequência de dupla marcação, ao avaliar a intensidade
5
de fluorescência das citocinas TNF-α e IL-12, pode observar que a atividade física
6
proporciona aumento na síntese destas, tais evidências estão plotadas no gráfico
7
2B. Sugestivo então de que mesmo apresentando menos células duplamente
8
marcadas, as células dos grupos que praticaram atividade física são capazes de
9
produzir níveis superiores de citocinas.
10
11
12
+
+
Gráfico 2 – (A) Repres entação da frequência de dupla marcação para CD3 / TNF-α e CD3 /IL-12. (B)
Representação da intensidade de fluorescência para as citocinas TNF -α e IL-12.
13
Com relação à dupla marcação das células CD4 + com as citocinas IFN-γ,
14
TNF-α, IL-10 e IL-12, pode-se verificar pelo gráfico 3A, que os grupos submetidos ao
15
treinamento tendo a presença do tumor ou não, apresentaram menores frequências
16
para todas as marcações, pois quando comparados os grupos treinado e controle há
17
diminuição das frequências com diferenças significativas estatisticamente (p<0,01).
18
E comparando os grupos tumor e tumor treinado há também diferença estatística
19
(p<0,0001). Quando avaliada a influência do tumor associada à atividade física há
20
diminuição da frequência, pois comparando os grupos tumor com tumor treinado
21
evidencia-se diferença significativa nesta diminuição para todas as citocinas
22
(p<0,0001). Outra dupla marcação feita foi para CD4 + com o receptor de IL-2
23
(CD25+), gráfico 3B, houve aumento desta quando implementada a atividade física,
24
pois comparando os grupos controle e treinado houve diferença estatística
25
(p=0,008), ainda nesta marcação houve diminuição da frequência quando da
41
1
presença do tumor, tal diminuição foi estatisticamente significante comparando os
2
grupos tumor e tumor treinado com os demais grupos (p<0,0001).
3
Em consonância com a intensidade de fluorescência das citocinas quando
4
avaliado os linfócitos totais, CD3 +, ao avaliar a quantidade de citocinas sintetizadas
5
pelos CDs 4+ evidencia-se que animais quando submetidos ao treinamento com ou
6
sem a presença do tumor há maiores expressões das citocinas, IFN-γ, TNF-α e IL-
7
12, bem como do receptor de IL-2, e há diminuição da síntese de IL-10, como
8
demonstra o gráfico 3C.
9
10
11
12
Gráfico 3 – (A) Representação da frequência de dupla marc ação para CD4 e as citocinas IFN-γ,
+
+
TNF-α, IL-10 e IL-12. (B) Representação da frequência de dupla marcação para CD4 /CD25 . (C)
+
Representação da intensidade de fluorescência para as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-12 e CD25 .
13
Analisando a dupla marcação de CD8 + com TNF-α, gráfico 4A, pode-se notar
14
que os animais que praticaram atividade física com ou sem tumor apresentaram
15
menores
16
(p<0,0001), já os animais que apresentaram tumor e não treinaram apresentaram
17
frequências maiores que os demais grupos (p<0,0001). A síntese de TNF-α pelos
18
linfócitos citotóxicos, avaliada pela intensidade de fluorescência, evidencia que os
19
grupos treinado e tumor treinado apresentaram maiores sínteses que os demais
20
grupos, gráfico 4B.
+
frequências,
tais
diminuições
foram
estatisticamente
significante
42
1
2
3
Gráfico 4 – (A) Representação da frequência de dupla marcação para CD8 / TNF-α. (B)
Representação da intensidade de fluorescência para a citocina TNF-α.
4
5
Por fim, avaliando as duplas marcações para CD14 +/TNF-α e CD14+/IL-12,
6
gráfico 5A, observa-se que a prática de atividade física foi capaz de promover altas
7
frequências de CD14+/IL-12, pois comparando o grupo treinado com o grupo
8
controle evidencia-se aumento na dupla marcação com diferença estatística
9
(p<0,0001) e ao avaliar a presença do tumor, comparando o grupo tumor com o
10
grupo controle houve diminuição da frequência (p<0,0001). Porém ao submeter
11
animais com tumor ao tratamento foi possível restabelecer a frequência, pois
12
comparando os grupos tumor e tumor treinado houve aumento da frequência desta
13
dupla marcação significativamente (p<0,0001). E foi possível verificar que a síntese
14
de IL-12 pelos macrófagos este maior nos grupos treinados estando na presença ou
15
ausência de tumor, gráfico 5B. Já a dupla marcação de CD14 +/TNF-α, apresentou
16
comportamento inverso, quando verificado a influência da atividade física, houve
17
interferência do tumor, pois os animais treinados sem tumor reduziram a frequência
18
de dupla marcação, já os animais que tinham tumor e praticaram atividade física
19
apresentaram aumento significativo desta marcação (p<0,001). E a expressão desta
20
citocina também foi inversa, os animais que tinham tumor apresentaram menores
21
sínteses, já os animais treinados sem tumor aumentaram a síntese de TNF-α ao
22
comparar com o grupo controle, gráfico 5B.
+
43
1
2
3
Gráfico 5 – (A) Representação da frequência de dupla marcação para CD8 / TNF-α. (B)
Representação da intensidade de fluorescência para a citocina TNF-α.
4
5
6
7
5.3 PRODUÇÃO DE CITOCINAS NO SOBRENADANTE DA CULTURA DE
CÉLULAS ESPLÊNICAS
8
9
+
5.3.1 IFN-γ
10
A cinética da síntese de IFN-γ entre 24 e 48 horas de cultura evidencia
11
aumento nas concentrações em todos os grupos experimentais, sendo possível
12
esta análise no gráfico 6. Apresentando aumento significativo estatisticamente os
13
grupos treinado, tumor e tumor treinado.
14
15
16
Gráfico 6 – Representação da cinética da síntese de IFN-γ ent re 24 e 48 horas de cult ura de
células esplênicas. ** p= 0, 0494; *** p<0,0001 e # p= 0, 0075.
17
Comparando a síntese entre os grupos no período de 24 horas, gráfico 7,
18
pode-se evidenciar que o treinamento foi capaz de elevar a expressão desta
19
citocina, porém sem diferença estatística, porém a presença do tumor
20
proporcionou diminuição significativa quando comparado o grupo treinado com o
44
1
grupo tumor (p=0,0291), e quando avaliado o treinamento na presença do tumor
2
tem-se uma tendência de elevação , porém sem diferença estatística.
3
4
Gráfico 7 – Represent ação da síntese de IFN-γ c om 24 horas de c ult ura de c élulas es plênic as.
5
Após 48 horas de cultura a síntese de IFN-γ, mantém o perfil de
6
expressão, porém melhor caracterizada as alterações, visualizável no gráfico 8,
7
novamente a síntese no grupo treinado foi maior que no grupo cont role, mas com
8
48 horas esse aumento foi significativo (p=0,0204), e a presença do tumor por si
9
só foi capaz de elevar a síntese de IFN-γ em 48 horas de cultura (p=0,001), mas
10
a prática de atividade física potencializou a expressão de
IFN-γ, pois
11
comparando o grupo tumor treinado com o grupo tumor houve um aumento mais
12
intenso. Destacando que a atividade física foi capaz de estimular com mais
13
eficiência a síntese de IFN-γ, pois comparando o grupo treinado com o grupo
14
tumor, é possível verificar maiores conce ntrações no grupo treinado sendo este
15
aumento com tendência estatisticamente significativa (p= 0,09).
16
17
Gráfico 8 – Represent ação da síntese de IFN-γ c om 48 horas de c ult ura de c élulas es plênic as.
45
1
2
5.3.2 IL-2
3
A síntese de IL-2 foi detectável apenas em 48 horas de cultura, tendo os
4
grupos que foram treinados com maiores concentrações. Comparando o grupo
5
controle com os grupos treinado e tumor treinado, observando o gráfico 9, é
6
possível ver este aumento co m diferença estatística (p=0,0021 e p=0,0096,
7
respectivamente), e a presença do tumor faz com que ocorra aumento de IL-2 de
8
modo significativo (p=0,0357), porém a atividade física parece ser capaz de
9
aumentar a síntese de IL-2 mais eficazmente, pois comparando o grupo tumor
10
com os grupos treinado e tumor treinado obtêm -se tendências à diferenças
11
estatísticas (p=0,0567 e p=0,0989, respectivamente).
12
13
Gráfico 9 – Represent ação da síntese de IL-2 com 48 horas de c ult ura de c élulas esplênicas.
14
15
5.3.3 IL-4
16
A cinética de expressão de IL-4, gráfico 10, foi similar à do IFN-γ, entre 24
17
e 48 horas houve aumento da síntese, sendo estatisticamente significante nos
18
grupos tumor e tumor treinado.
19
A dosagem de IL-4 em 24 horas de cultura evidencia elevação das
20
concentrações quando da presença do tumor ou da implementação da atividade
21
física, gráfico 11. Sendo que na presença do tumor há uma maior síntese de IL -4
22
quando comparado o grupo tumor com o grupo controle, porém sem diferença
23
estatística, e na presença do tumor a atividade de física atenuou a expressão de
24
IL-4, mas sem diferença estatística.
46
1
2
3
Gráfico 10 – Representação da cinética da s íntese de IL-4 ent re 24 e 48 horas de cultura de
células esplênicas. *** p= 0,0291 e # p= 0, 0287.
4
5
Gráfico 11 – Representação da síntese de IL-4 c om 24 horas de c ultura de c élulas es plênic as.
6
Similarmente às concentrações de 24 horas de cultura, as expressões de
7
IL-4 com 48 horas de cultura evidencia elevação das concentrações na presença
8
do tumor ou da atividade física, gráfico 1 2, pois comparando os grupos controle
9
e treinado há diferença estatística (p=0,0431). Sendo que na presença do tumor
10
há uma maior síntese de IL -4 quando comparado o grupo tumor com o grupo
11
controle (p=0,0028), e na presença do tumor a atividade de física atenuou a
12
expressão de IL-4, mas novamente sem diferença estatística.
47
1
2
Gráfico 12 – Representação da síntese de IL-4 c om 48 horas de c ultura de c élulas es plênic as.
3
4
5
5.3.4 IL-10
6
Do mesmo modo que o IFN-γ e IL-4, a cinética da IL-10 entre 24 e 48
7
horas houve aumento da síntese, sendo estatisticamente significante nos grupos
8
controle e tumor treinado, gráfico 13.
9
10
11
Gráfico 13 – Representação da cinética da síntese de IL-10 ent re 24 e 48 horas de c ult ura de
células esplênicas. * p= 0,05 e # p= 0, 0146.
12
A síntese de IL-10 tanto em 24 como em 48 horas de cultura estimulada
13
com LPS, evidencia, que o tumor isolado ou associado à atividade física é capaz
14
de elevar a expressão desta citocina, pois comparando os grupos tumor e tumor
15
treinado com o grupo controle e treinado há diferença estatística, como ilustra m
16
os gráficos 14 e 15.
48
1
2
Gráfico 14 – Representação da síntese de IL-10 com 24 horas de c ult ura de c élulas esplênic as.
3
4
Gráfico 15 – Representação da síntese de IL-10 com 48 horas de c ult ura de c élulas esplênic as.
5
6
5.3.5 IL-12
7
Como à IL-2, a citocina IL-12 foi detectada apenas com 48 horas de
8
cultura das células esplênicas, evidenciando aumento nos grupos que praticaram
9
atividade física e diminuição na presença isolada do tumor. Comparando os
10
grupos controle e tumor há uma tendência a significância (p=0,0679), já
11
comparando o grupo tumor treina do com o grupo tumor obtém-se diferença
12
estatística significante, mostrando que na presença do tumor associando a
13
atividade física ocorre aumento da expressão de IL -12 (p=0,0229), os dados
14
estão expressos no gráfico 16.
49
1
2
3
4
Gráfico 16 – Representação da síntese de IL-12 com 48 horas de c ult ura de c élulas esplênic as.
5.3.6 TGF- β
5
A cinética de síntese de TGF -β apresentou-se variante, pois os grupos
6
controle e tumor treinado aumentaram a síntese, em contrapartida os grupos
7
treinado e tumor diminuíram as concentrações entre 24 e 4 horas de cultura,
8
porém tais oscilações não apresentaram diferença estatística, gráfico 17.
9
10
11
Gráfico 17 – Representação da cinética da sínt ese de TGF-β ent re 24 e 48 horas de cultura de
células esplênicas.
12
As concentrações em 24 horas de cultura, de TGF -β evidencia elevação
13
das concentrações na presença do tumor ou da atividade física, gráfico 18, pois
14
comparando os grupos controle e treinado há discreto aumento sem diferença
15
estatística. Sendo que na presença do tumor há uma maior síntese de TGF-β
16
quando comparado o grupo tumor com o grupo controle (p=0,021), e na
17
presença do tumor a atividade de física atenuou a expressão de TGF -β, mas
18
sem diferença estatística.
19
A síntese de TGF-β em 48 horas de cultura estimulada com LPS,
20
evidencia, que o tumor isolado ou associado à atividade física é capaz de elevar
50
1
a expressão desta citocina, pois comparando os grupos tumor com os grupos
2
controle e treinado há tendência a diferença estatística, já comparando os
3
grupos controle e treinado com o grupos tumor treinado há diferença estatística,
4
como ilustra o gráfico 19.
5
6
7
Gráfico 18 – Representação da síntese de TGF-β com 24 horas de c ult ura de c élulas esplênic as.
8
9
Gráfico 19 – Representação da síntese de TGF-β com 48 horas de c ult ura de c élulas esplênic as.
10
11
5.3.7 TNF-α
12
O gráfico 20, mostra a cinética da expressão de TNF-α entre 24 e 48 horas
13
de cultura de células esplênica estimuladas com LPS, apresentando aumento
14
das concentrações em todos os grupos com diferença estatística.
15
Comparando a síntese entre os grupos no período de 24 horas, gráfico 21,
16
pode-se evidenciar que o treinamento foi capaz de elevar a expressão desta
17
citocina, com diferença estatística (p=0,0451), a presença do tumor proporcionou
18
diminuição significativa quando comparado o grupo treinado com o grupo tumor
51
1
(p=0,0386), e quando avaliado o treinamento na presença do tumor tem -se uma
2
elevação significativa (p=0,0032).
3
4
5
Gráfico 20 – Representação da cinética da síntese de TNF-α ent re 24 e 48 horas de cultura de
células esplênicas. * p= 0,0006; ** p=0, 0001; *** p= 0, 0048 e # p= 0, 0056.
6
7
Gráfico 21 – Representação da síntese de TNF-α c om 24 horas de c ult ura de c élulas es plênicas .
8
9
Após 48 horas de cultura a síntese de TNF-α, mantém o perfil de
10
expressão, gráfico 22, novamente a síntese no grupo treinado foi maior que no
11
grupo controle, mas com 48 horas esse aumento não foi significativo, e a
12
presença do tumor por si só não foi capaz de elevar a síntese de TNF-α em 48
13
horas de cultura, mas a prática de atividade física potencializou a expressão de
14
TNF-α, pois comparando o grupo tumor treinado com o grupo tumor houve um
15
aumento mais intenso. Destacando que a atividade física foi capaz de estimular
16
com mais eficiência a síntese de TNF-α, pois comparando o grupo treinado com
17
o grupo tumor, é possível verificar maiores concentrações no grupo treinado
18
sendo este aumento sem significância estatística.
52
1
2
Gráfico 22 – Representação da síntese de TNF-α c om 48 horas de c ult ura de c élulas es plênicas .
3
4
5
6
5.4 PRODUÇÃO DE CITOCINAS NO SOBRENADANTE DA CULTURA DE
MACRÓFAGOS PERITONEAIS
7
8
5.4.1 IFN-γ
9
Ao contrário da cinética do IFN-γ sintetizado pelas células esplênicas, os
10
macrófagos peritoneais entre 24 e 48 horas de cultura apresentam decréscimo
11
das concentrações de IFN-γ em todos os grupos experimentais, havendo
12
diferença estatística em todos, conforme mostra o gráfico 23.
13
14
15
Gráfico 23 – Representação da cinética da s íntese de IFN-γ ent re 24 e 48 horas de c ult ura de
mac rófagos peritoneais. * p=0, 0029; ** p= 0, 0235; *** p=0,0312 e # p= 0, 0138.
16
Mesmo apresentando cinética contrária nos macrófagos peritoneais entre
17
24 e 48 horas, os grupos que praticaram atividade física em 24 horas de cultura
18
obtiveram maiores concentrações de IFN-γ quando comparados aos grupos
19
sedentários, gráfico 24, pois comparando o grupo controle como treinado houve
20
diferença estatística (p=0,0119) e comparando o grupo tumor com o grupo tumor
53
1
treinado também houve diferença estatística (p=0,0112). Mas a presença do
2
tumor de modo isolado foi capaz de aumentar a síntese de IFN-γ, pois
3
comparando o grupo controle com o grupo tumor há diferença estatística
4
(p=0,0464), porém a associação do tumor com a atividade física fez com que
5
houvesse maiores expressões, pois comparando o grupo controle com o grupo
6
tumor treinado houve uma maior diferença (p=0,0178).
7
8
9
Gráfico 24 – Representação da sínt ese de IFN-γ c om 24 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
10
O comportamento do IFN-γ com 48 horas de cultura permaneceu, os
11
grupos que praticaram atividade física apresentaram maiores concentrações
12
quando comparado aos demais grupos, gráfico 25. Sendo que comparando o
13
grupo controle com o grupo treinado há uma tendência á significância
14
(p=0,0558), e o efeito da prática física parece ser mais potente ao estimular a
15
produção de IFN-γ, pois comparando o grupo treinado com o grupo tumor, o
16
primeiro produziu mais IFN-γ, com tendência a significância (p=0,065). Essa
17
sugestão pode ser confirmada comparando o grupo tumor com o grupo tumor
18
treinado, onde o grupo que treinou apresentou maiores concentrações com
19
diferença estatística (p=0,0078).
54
1
2
3
4
5
Gráfico 25 – Representação da sínt ese de IFN-γ c om 48 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
5.4.2 IL-4
6
A cinética de expressão de IL -4, gráfico 26, nas culturas de macrófagos
7
peritoneais, mostrou-se oscilante entre os grupos, pois os grupos controle, tumor
8
e tumor treinado reduziram entre 24 e 48 horas, em contra partida o grupo
9
treinado obteve aumento das concentrações. Apenas os declínios dos grupos
10
tumor e tumor treinado apresentaram tendência para significância estatística
11
(p=0,08 e p=0,07, respectivamente).
12
13
14
Gráfico 26 – Representação da cinética da s íntese de IL-4 ent re 24 e 48 horas de cultura de
mac rófagos peritoneais. *** p=0, 08 e # p= 0, 07.
15
As dosagens de IL-4 com 24 horas de cultura comparando entre os
16
grupos, pode-se observar no gráfico 27, que o treinamento na ausência do tumor
17
proporcionou ligeira redução da expressão desta citocina. Em oposição, a
18
presença do tumor foi capaz de elevar as concentrações de IL -4, pois
19
comparando o grupo treinado com o grupo tumor há diferença estatística, e a
20
prática de atividade física proporcionou aumento ainda maior quando associado
55
1
ao tumor, comparando o grupo tumor treinado com os demais há diferenças
2
estatísticas (vs controle – p=0,021; vs treinado – p= 0,006; vs tumor – p=0,0021).
3
4
5
Gráfico 27 – Representação da s íntese de IL-4 c om 24 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
6
Com 48 horas de cultura, gráfico 28, as dosagens de IL-4 apresentaram
7
similaridade com as dosagens de 24 horas, alterando nas concentrações do
8
grupo treinado, pois o mesmo apresentou elevação da expressão de IL-4 (vs
9
controle – p=0,0085). Desta foram tanto a atividade física como a presença do
10
tumor e a associação de ambas, foram capazes de elevar os níveis de IL -4,
11
comparando com o grupo controle (vs tumor – p=0,0078; vs tumor treinado –
12
p=0,0239).
13
14
15
Gráfico 28 – Representação da s íntese de IL-4 c om 48 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
16
17
5.4.3 IL-10
18
A cinética das concentrações de IL-10, gráfico 29, entre 24 e 48 horas de
19
cultura de macrófagos peritoneais foram contrárias às culturas de células
20
esplênicas, houve decréscimo das expressões entre os dois períodos, sendo
56
1
significante a diminuição para os grupos controle e treinados, sugestivo de
2
interferência da presença do tumor.
3
4
5
Gráfico 29 – Representação da cinética da síntese de IL-10 ent re 24 e 48 horas de c ult ura de
mac rófagos peritoneais. * p=0, 0366 e ** p= 0, 0369.
6
No período de 24 horas, os níveis de IL -10 no grupo que praticou atividade
7
física foi ligeiramente menor que o grupo controle e significativamente menor
8
perante os grupos tumor (p=0,0254), confirmado pela comparação do grupo
9
tumor com o grupo controle (p=0,08), na presença do tumor a implementação da
10
atividade física foi capaz de atenuar a expressão de IL -10, pois comparando os
11
grupos tumor com tumor treinado a redução foi significativa estatisticamente
12
(p=0,0469), com forte tendência a retornar aos níveis controle, pois comparando
13
o grupo controle com o grupo tumor treinado não houve diferença estatística,
14
gráfico 30.
15
16
17
Gráfico 30 – Representação da s íntese de IL-10 com 24 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
18
Com 48 horas de estímulo os macrófagos mantiveram a síntese de IL-10,
19
gráfico 31, o grupo treinado continuou expressando menos IL -10 que os demais,
57
1
sendo estatisticamente significante comparado ao grupo tumor (p=0,0314). E na
2
presença do tumor a prática de atividade física continuou atenuando a síntese de
3
IL-10, comparando o grupo tumor com o grupo tumor treinado há diferença
4
estatística (p=0,0287).
5
6
7
Gráfico 31 – Representação da s íntese de IL-10 com 48 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
8
9
5.4.4 IL-12
10
Apresentando cinética similar às demais citocinas expressas pelos
11
macrófagos peritoneais, a síntese de IL-12 entre 24 e 48 horas comportou-se
12
com redução das concentrações entre o primeiro momento e o segundo, apenas
13
o grupo tumor que apresentou ligeiro aumento, e este com diferença significante.
14
Já os demais grupos evidenciaram reduções, porém sem diferença estatística,
15
dados estes plotados no gráfico 32.
16
17
18
Gráfico 32 – Representação da cinética da síntese de IL-12 ent re 24 e 48 horas de c ult ura de
mac rófagos peritoneais. *** p= 0, 0034.
19
Semelhantemente às demais citocinas do perfil Th1 a IL -12 em 24 horas
20
de cultura apresentou elevação dos níveis nos grupos que praticaram atividade
58
1
física e diminuição no grupo com apenas tumor, gráfico 33. É possível visualizar
2
estas alterações, quando comparamos os grupos controle e tumor, mostrando
3
que a administração do DMBA foi capaz de reduzir os níveis de IL -12 de modo
4
significativo (p=0,0310), que a atividade física foi eficiente ao reverter este
5
quadro, pois comparando os grupos treinado e tumor treinado com o grupo tumor
6
os aumentos de concentrações foram estatisticamente significante (p=0,0496 e
7
p=0,0420, respectivamente).
8
9
10
Gráfico 33 – Representação da s íntese de IL-12 com 24 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
11
O mesmo comportamento da IL -12 foi visto em 48 horas, os grupos que
12
foram submetidos à atividade física apresentaram maiores concentrações, mas
13
neste período de 48 horas o grupo tumor foi capaz de expressar mais IL-12 que
14
o grupo controle (p=0,0282), e as elevações das concentrações de IL -12 nos
15
grupos treinado e tumor treinado não foram significantes, apenas na comparação
16
do grupo tumor treinado com o grupo tumor houve uma tendência à significância
17
(p=0,0614), como mostra o gráfico 34.
18
19
20
Gráfico 34 – Representação da s íntese de IL-12 com 48 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
59
1
2
5.4.5 TGF-β
3
Novamente a cinética de expressão de citocinas pelos macrófagos
4
peritoneais foi de redução entre os períodos de 24 e 48 horas de estimulação em
5
cultura. Ocorrendo diferenças significativa nas reduções dos grupos controle e
6
treinado e tendência à significância no grupo tumor treinado, conforme o gráfico
7
35.
8
9
10
Gráfico 35 – Representação da cinética da sínt ese de TGF-β ent re 24 e 48 horas de cultura de
mac rófagos peritoneais. * p=0, 0126; ** p= 0, 0079; # p= 0, 0615.
11
Em consonância com as citocinas imunossupressoras, o TGF -β em 24
12
horas de cultura na presença isolada do tumor apresentou elevação da
13
concentração com significância estatística (p=0,0154), e quando os grupos foram
14
submetidos à prática de natação, tais índices reduziram, comparando os grupos
15
controle e treinado há redução significativa (p=0,0375), como também entre os
16
grupos tumor e tumor treinado (p=0,0453), bem como comparando os grupos
17
treinado e tumor (p=0,0062), dados expressos no gráfico 36.
18
19
20
Gráfico 36 – Representação da síntese de TGF-β c om 24 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
60
1
Seguindo o mesmo comportamento, o TGF -β com 48 horas de cultura,
2
apresentou aumento quando da presença isolada do tumor e diminuição das
3
concentrações nos grupos submetidos ao treinamento. Porém nenhuma das
4
comparações apresentou significância, há apenas um tendência significante
5
quando comparado a elevação da concentração de TGF-β entre os grupos
6
treinado e tumor (p=0,07), estes dados estão dispostos no gráfico 37.
7
8
9
Gráfico 37 – Representação da síntese de TGF-β c om 48 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
10
11
5.4.6 TNF-α
12
Novamente contrário à cinética das células esplênicas, as concentrações
13
de TNF-α entre 24 e 48 horas nas culturas dos macrófagos peritoneais,
14
evidenciam redução das expressões desta citocina, sendo as reduções
15
significativas para os grupos controle, treinado e tumor, conforme ilustra o
16
gráfico 38.
17
18
19
Gráfico 38 – Representação da cinética da síntese de TNF-α ent re 24 e 48 horas de cultura de
mac rófagos peritoneais. * p=0, 0005; ** p= 0, 0296 e *** p= 0, 0085.
61
1
2
Analisando isoladamente o período de 24 horas de estimulação pelo
3
gráfico 39, pode-se verificar que tanto a prática física quanto a presença do
4
tumor, foram capazes de elevar a expressão de TNF -α, porém a atividade física
5
foi a que mais potencializou a exp ressão, pois comparando o grupo controle com
6
os grupos treinado e tumor treinado apresentaram significância estatística
7
(p=0,0273 e p=0,0127, respectivamente). E comparando o grupo tumor com o
8
grupo tumor treinado houve também diferença significante (p=0,0417).
9
10
11
Gráfico 39 – Representação da síntese de TNF-α com 24 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
12
13
Com 48 horas de cultura, o comportamento das concentrações foram
14
semelhantes, tanto o tumor quanto a atividade física estimularam os macrófagos
15
a produzirem TNF-α, sendo a atividade física capaz de estimular com maior
16
intensidade, pois comparando os grupos treinado e tumor treinado as elevações
17
foram maiores e significantes (p=0.0126 e p=0,0046), após 48 horas a
18
associação do tumor com a prática de atividade física fez com que os níveis
19
fossem ainda maiores, visto que comparando os grupos treinado e tumor
20
treinado houve diferença estatística na elevação da concentração (p=0,0173),
21
conforme ilustra o gráfico 40.
62
1
2
3
Gráfico 40 – Representação da síntese de TNF-α com 48 horas de c ult ura de mac rófagos
peritoneais.
63
1
2
6. DISCUSSÃO
3
De acordo com Dimeo, Rumberger e Keul (1998), boa parte dos pacientes
4
com câncer cursa com perda de energia e restrição no desempenho físico.
5
Estima-se que esse problema afete até 70% dos acometidos com câncer que
6
fazem tratamento com quimioterapia e radioterapia, ou após cirurgia. Para
7
agravar ainda mais a situação, a fadiga pode fazer surgir outras doenças, tais
8
como a depressão, a esclerose múltipla e a artrite.
9
Para
os
pacientes
que
sentem
fadiga,
são
recomendados,
10
frequentemente, descanso e redução de atividades diárias. Entretanto, o
11
descando prolongado pode, em vez de melhorar o quadro clínico, perpetuar
12
ainda mais a fadiga, pois a inatividade física induz ao catabolismo muscular
13
intenso (DIMEO; RUMBERGER; KEUL, 1998).
14
Vários estudos tem destacado a ação da atividade física corroborando nos
15
diversos aspectos do câncer, seja na identificação de genes que possam
16
participar na prevenção do câncer, como por exemplo o trabalho de Buehlmeyer
17
e colaboradores (2008) que verificaram o primeiro gene relacionado a prevenção do
18
câncer de colón após a prática de atividade física.
19
Em vista de compreender as alterações nos mecanismos imunológicos
20
que o câncer proporciona e verificar até que ponto a prática de atividade física é
21
capaz de atenuar a progressão tumoral ou até mesmo participar na regressão
22
dos tumores, justifica o desenvolvimento deste estudo. Para que se possa
23
realizar uma investigação mais minuciosa a adoção do modelo experimental fez-
24
se necessário, desta forma para este estudo utilizou-se como cobaias
25
camundongos Balb/c fêmeas, e para a indução da carcinogênese utilizou-se um
26
dos carcinógenos mais tradicionais, o DMBA.
27
A justificativa de utilização deste modelo se embasa pelo fato de que
28
vários autores utilizaram o modelo animal, roedores, como fonte de estudo do
29
câncer, em específico neste estudo o de mama, o que contribui sobremaneira
30
para o entendimento de sua biologia e o desenvolvimento de novas estratégias
31
terapêuticas (CHEUNG et al., 2003; BARROS et al., 2004; RUSSO et al., 2005;
32
HAKKAK et al., 2007).
33
Sabe-se que os modelos de indução química em roedores sofrem
34
influência quanto à idade do animal, a dose do agente carcinogênico e o tipo de
64
1
alimentação (MANNI et al., 1982; RUSSO; RUSSO, 2004; ASSIS, 2006). Com
2
isso Lane et al. (1990) utilizaram para seus estudos camundongos Balb/c
3
fêmeas, virgens, entre 30 a 35 dias, ou seja 4 a 8 semanas, com peso
4
homogêneo. Esta faixa etária estaria relacionada à maior taxa proliferativa do
5
tecido mamário, correspondendo à maturidade sexual.
6
Outro aspecto que atualmente está sendo levado em consideração no
7
desenvolvimento do câncer é o estilo de vida (inatividade física, obesidade,
8
consumo de álcool, tabagismo, exposição a radiação ionizante), fatores
9
nutricionais (ingestão de carne vermelha e gordurosa, consumo de açúcar, baixo
10
consumo de vegetais e frutas), história familiar, fatores hormonal e reprodutivo,
11
fatores biológicos (infecções virais, hepatite B e C, leucemias virais), idade
12
avançada, ambiente ou agentes ocupacionais (asbestos, cromo, belírio e níquel)
13
(KRUK; ABOUL-ENEIN, 2006). Já foi mostrado que estes fatores, bem como a
14
prática de atividade física influenciam no aparecimento e desenvolvimento de
15
tumores.
16
Dentre estes fatores a atividade física vem se ndo um dos focos, pois os
17
benefícios tanto na prevenção como no tratamento de várias enfermidades estão
18
sendo comprovados (SPENCE et al., 2010). Sendo assim, a utilização da
19
atividade física neste estudo é justificada, porém não se sabe até que ponto a
20
mesma pode ajudar ou prejudicar paciente com câncer. Portanto, a investigação
21
feita foi de verificar quais caminhos o sistema imune antitumoral traça para
22
combater o tumor.
23
Haja visto que neste estudo os animais que praticaram atividade física e
24
receberam o DMBA, não apresentaram massas tumorais externas, já os animais
25
que receberam DMBA e não praticaram atividade física obtiveram uma
26
frequência de massas tumorais externas de 35%. Estes achados podem ser
27
observados nos estudo de Lane et al. (1991), onde os animais que praticaram
28
atividade física e realizaram uma dieta balanceada, apresentaram menores
29
frequências de tumores. Ao contrário dos nossos achados e dos obtidos por
30
Lane et al. (1991); Thompson et al. (1988), verificaram no entanto, ao invés de
31
retardar o desenvolvimento de tumores, a atividade física de esforço moderado
32
aumentou a incidência e número de tumores e os animais que receberam dieta de
33
baixo e alto teor de gordura e sedentários reduziram a incidência e números de
65
1
tumores. A composição corporal não foi alterada pelo regime de exercícios imposta,
2
embora estes animais pesavam mais do que o grupo sedentário.
3
Outro aspecto importante de associação com o desenvolvimento do câncer
4
são as relações do sistemas imune e endócrino, pois Sáez et al. (2007), verificaram
5
que ratos Sprague-Dawley que foram submetidos à indução de tumor de mama com
6
DMBA e que praticaram atividade física de alta intensidade apresentaram maiores
7
frequências de tumores estando relacionados a uma maior produção de prolactina e
8
adrenalina, e que a suplementação com melatonina atenuou a frequência de
9
desenvolvimento de câncer, mas não alterou o número de células NK.
10
É sabido que para ocorrer uma resposta imunológica antitumoral eficaz é
11
preciso que os componentes desta resposta caminhem de forma sinérgica, ou
12
seja, os componentes da resposta imune inata e adquirida precisam atuar em
13
conjunto. Sendo as células de maior destaque na resposta imune inata os
14
macrófagos, as células NK e as células dendríticas (DE VISSER; EICHTEN;
15
COUSSENS, 2006) e na resposta imune adquirida os linfócitos T e B
16
(CONSTANT; BOTTOMLY, 1997). Neste estudo buscou-se avaliar as atuações
17
dos macrófagos e dos linfócitos T, CD4 + e CD8 + .
18
Para tanto, a imunidade inata é dita como a ação do sistema imune à infecção
19
que ocorre quando os patógenos pela primeira vez entram em contato com o
20
organismo. As células do sistema imune inato possuem um diminuto repertório de
21
receptores, porém reconhecem uma variedade de patógenos, tornando isto possível
22
pelo fato de que estes receptores reconhecem padrões moleculares comuns
23
associados a patógenos (PAMPs), padrões moleculares estes que não são
24
expressos pelas células do hospedeiro, o que torna impróprio denominar a resposta
25
imune inata de inespecífica (MEDZHITOV; JANEWAY, 2000; ABBAS; LICHTMAN;
26
PILLAI, 2008).
27
Já a resposta imune adquirida é altamente específica aos patógenos e com
28
capacidade especializada de tornar-se mais eficiente a cada contato subseqüente.
29
Muitas infecções são detectadas pelo sistema imune inato e controladas
30
rapidamente, sendo importante inclusive na indução da resposta imune adquirida por
31
meio da expressão de citocinas e moléculas de adesão (MEDZHITOV; JANEWAY,
32
2000; ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008).
33
Sabe-se que durante a resposta imune contra tumores ocorrem intricados
34
equilíbrios entre a produção de citocinas, que pode ser decisiva para a progressão
66
1
ou regressão do tumor. As citocinas são uma complexa rede que controla a resposta
2
imune. As principais células envolvidas na produção de citocinas são os linfócitos T
3
auxiliares (CD4+). Eles foram primeiro classificados em Th1 e Th2 em consonância
4
com as citocinas secretadas (MASSMANN et al, 1986). As células Th1 secretam
5
citocinas envolvidas na ativação da resposta celular (IFN-γ e IL-2) enquanto as
6
células Th2 estão ligadas principalmente ao desenvolvimento de uma resposta
7
imune humoral (IL-4 e IL-10). Essa dicotomia foi aumentada quando a identificação
8
de
9
(JOSEFOWICZ; RUDENSKY, 2009) e Th17 (IL-17, IL-23) (PARK et al., 2005),
10
recentemente foram descritos os padrões Th9 (IL-9) e Th22 (IL-22) (VELDHOEN et
11
al., 2008; TRIFARI et al., 2009).
novas
linhagens
de
células
CD4
+,
os
subconjuntos
Treg
(TGF-β)
12
Neste estudo realizou-se a identificação e tipagem de linfócitos e monócitos,
13
por citometria de fluxo, sendo as frequências das marcações para CD3+, CD4+,
14
CD8+ e CD14+ associadas a algumas citocinas antitumorais (IFN-γ, TNF-α, e IL-12)
15
e prótumorais (IL-10). Foi demonstrado que a prática de atividade física reduz a
16
frequência destas duplas marcações, porém elevam a quantidade de citocinas
17
antitumorais produzidas por estas células e diminuem a produção de IL-10. Estes
18
achados vão de encontro com os estudos de Kumae e colaboradores (2009),
19
evidenciaram que sujeitos praticantes de corrida por um período de dois meses
20
obtiveram reduções nos números de linfócitos e manutenção de monócitos, e
21
redução nas expressões de IL-4, IL-10 e aumento nas sínteses de TNF-α.
22
Nielsen e Pedersen (1997) verificaram em cultura de linfócitos estimulada
23
com fitohemaglutinina (PHA) que indivíduos submetidos à prática de atividade física
24
apresentaram redução na frequência de linfócitos CD3 +. Nossos achados, quanto à
25
frequência de CD3+, também nortearam este comportamento, visto que os grupos
26
treinado e tumor treinado apresentaram reduções significativas comparados aos
27
grupos controle e tumor, este comportamento foi semelhante para os linfócitos T
28
CD4 e T CD8.
29
Hutnick e colaboradores (2005) com o objetivo de determinar se o
30
treinamento físico poderia aumentar a ativação dos linfócitos em pacientes com
31
câncer de mama após a quimioterapia, verificaram a ativação pela presença de
32
células T CD4+/CD69+, após estímulo de proliferação induzida por mitógenos e foi
33
realizada a detecção de níveis de citocinas produzidas pelos linfócitos. Utilizaram 28
34
pacientes com câncer de mama que participaram de um programa de exercícios de
67
1
6 meses, e foram comparados com 21 pacientes que não se exercitavam. Após a
2
quimioterapia, 3 e 6 meses mais depois do treinamento, os pacientes foram
3
submetidos à avaliação da aptidão e coleta de sangue. O programa de exercício
4
constou de treinamento de resistência e atividade aeróbica entre 60-75% da
5
capacidade funcional, três vezes por semana com um personal trainer. Por
6
citometria de fluxo quantificou-se o número de células CD4+/CD69+. Obtiveram que
7
os pacientes submetidos ao treinamento mostraram um aumento no consumo
8
máximo de oxigênio e força. Esse grupo também apresentou maior percentual de
9
células CD4+/CD69+ e os níveis de IL-6 e IFN-γ foram semelhantes nos dois grupos.
10
No estudo de Miles et al. (2003), associando os níveis de lactato com a
11
quantidade de linfócitos, concluíram que níveis elevados de lactato sanguíneo foram
12
associado com maior recrutamento de linfócitos T e B, e talvez NK, para a
13
circulação, mas não influenciam a resposta de proliferação de linfócitos T e B. Não
14
há evidências para apoiar a hipótese de que aumento de lactato no sangue pode ser
15
parte do mecanismo de aumentar a concentração de linfócitos na circulação. A
16
magnitude do exercício em induzir resposta imune celular aos exercícios de
17
resistência ocorreu após 3, mas não em seis meses de treinamento de resistência.
18
Isso pode ter sido devido às adaptações temporárias sistêmica à formação ou
19
possivelmente, a variação sazonal na capacidade de resposta imune a estresse.
20
Drela et al. (2004) avaliando as subpopulações de linfócitos (CD8 +), em
21
idosas que foram submetidas a um programa de treinamento realizado duas vezes
22
por semana, durante 50 minutos, por um período de 10 meses, obtiveram após o
23
programa de exercício diminuição da frequência de células T CD8 +. Dados estes que
24
vão de encontro com os obtidos em nosso estudo, pois os grupos treinados com ou
25
sem a presença do tumor apresentaram diminuição desta subpopulação.
26
Horohov et al. (1996), verificaram em cavalos treinados que os níveis de
27
receptores para IL-2 (CD25+), não alteraram com a prática de atividade física, porém
28
nossos resultados evidenciaram que seguindo o protocolo de treinamento citado na
29
metodologia os grupos treinados apresentaram maiores quantidade de CD25+ que
30
os grupos sedentário e tumor.
31
Dias e colaboradores (2007), mostraram em seu estudo que o treinamento
32
físico foi capaz de promover leucocitose e linfocitose em animais que praticaram
33
exercícios durante cinco e 15 minutos nas intensidades leve e moderada, obteve
34
aumentada contagem de linfócitos teciduais nos grupos treinados cinco minutos leve
68
1
bem como cinco e 15 minutos moderado, de forma geral, ao estímulo com
2
concavalina A não houve alteração na resposta proliferativa celular T, porém houve
3
diminuição na resposta celular B nos grupos treinados.
4
Na
procura
de
melhor
elucidar
o
comportamento
das
células
5
imunocompetentes no que tange a produção de citocinas, realizamos as dosagens
6
de citocinas nos sobrenadantes de culturas estimuladas com LPS, tais dosagens
7
procedeu-se em cultura de células esplênicas, podendo na sua maioria verificar o
8
comportamento dos linfócitos, e cultura de macrófagos peritoneais. Fazendo desta
9
forma uma análise das células participantes da resposta imune inata e adquiri da.
10
A resposta imune inata e adquirida apresenta diferença temporal de atuação,
11
sendo as células do sistema inato a produzir seus produtos mais precocemente, e as
12
células do sistema imune adquirido produzem mais tardiamente o que justificaria a
13
cinética de produção das citocinas pelas células esplênicas com maiores
14
concentrações em 48 horas, diferentemente dos macrófagos peritoneais que
15
apresentaram maiores produções em 24 horas, Wollenberg et al (1993), também
16
observaram que macrófagos peritoneais produziram maiores concentrações de
17
citocinas inflamatórias (TNF-α e IL-6) nas primeiras 24 horas.
18
Analisando as expressões das citocinas dos perfis Th1, Th2 e Treg nas
19
células esplênicas, pode-se observar que a prática de atividade física proporcionou
20
aumento em várias citocinas do perfil Th1 (IFN-γ, IL-2, IL-12 e TNF-α), o que
21
proporcionou nos grupos que foram submetidos à indução do tumor de mama, a não
22
formação de tumores externos. Já os animais do grupo tumor sem treinamento
23
apresentram aumento das citocinas do perfil Th2 e Treg, viabilizando o
24
desenvolvimento de massas tumores externas.
25
Em vista dos nossos resultados, há a confirmação dos mesmo baseados em
26
alguns estudos, pois Cox e colaboradores (2007), na respostas pós-exercício as
27
concentrações de IL-2, IL-4 e IL-12 foram pequenas e não substancialmente
28
diferente entre os grupos que praticaram atividade física e os sedentários. Porém as
29
concentrações de IL-8 e IL-10 foram mais baixas nos indivíduos submetidos ao
30
treinamento de corrida.
31
Kara e colaboradores (2011), avaliaram a associação do treinamento físico
32
com a suplementação de zinco em indivíduos praticante de luta e sedentários nas
33
expressões de IFN-γ, IL-2 e TNF-α, os autores observaram que no início do estudo,
34
não houve diferenças significativas dos parâmetros medidos entre os grupos de
69
1
estudo. No final do estudo, os níveis de TNF-α, IL-2 e IFN-γ foram significativamente
2
maiores no grupo que foi submetido ao treinamento física e receberam
3
suplementados com zinco em comparação com aqueles que não receberam
4
suplementação, independentemente da condição de atividade.
5
Akimoto e colocaboradores (2000) mostraram que as concentrações
6
plasmáticas de IL-12 aumentram significativamente, imediatamente após breve
7
período de exercício.
8
Dentre os nossos resultados há a dosagem de TGF-β, membro da família dos
9
reguladores de crescimento, que inclui três isoformas: TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3.
10
As concentrações desta citocinas nas culturas de células esplênicas e de
11
macrófagos peritoneais entre 24 e 48 horas apresentaram comportamentos
12
dicotômicos, pois as concentrações de TGF-β nas células do baço apresentaram
13
concentrações maiores nos grupos treinados e com tumor, porém em macrófagos
14
peritoneais os grupos treinados apresentaram valores menores que o grupo tumor.
15
A possível justificativa do comportamento do TGF-β está pautado que esta
16
citocina sobre algumas células depende da sua concentração: em baixa
17
concentração, estimula a produção de fator de crescimento derivado de plaqueta
18
(PDGF) e, portanto, indiretamente mitogênica, em concentração elevada é um
19
inibidor de crescimento devido à sua capacidade para reduzir expressão de
20
receptores para PDGF. TGF-β também regula o desenvolvimento embrionário, a
21
produção e degradação de colágeno e de angiogênese (BLOBE; SCHIEMANN;
22
LODISH, 2000).
23
E os dados referentes à influência do exercício físico nos níveis séricos de
24
PDGF e TGF-β são muito limitados. A maioria dos experimentos refere-se ao
25
aumento do mRNA para TGF-β e expressão do gene PDGF (BREEN et al., 1996;
26
O'CALLAGHAN et al., 2000; CONNOLLY et al., 2004). Nossos resultados estão de
27
acordo com o resultados da Hering et al (2000) e Czarkowska-Paczek et al. (2006),
28
no entanto, o protocolo de exercício foi diferente.
29
Um declínio na função imune e endócrina ocorre com o envelhecimento, e a
30
idade é um fator preditivo para alguns cânceres nos homens . No intuito de verificar a
31
influência da atividade física no sistema imunológico de homens idoso, Arai et al.
32
(2006) investigaram o impacto do treinamento de resistência a longo prazo sobre os
33
sistemas imunológico e sistema endócrino dos homens idosos. Verificaram que
34
idosos corredores apresentaram uma
resposta significativamente maior
na
70
1
proliferação de células T e produção de IL-2 que idosos sedentários. Produção de
2
IL-2
3
significativamente menores em idosos treinados do que seus pares sedentários.
4
Eles também mostraram significativamente menor produção de IL-3 em comparação
5
com idosos sedentários. Entretanto os níveis de IL-12 reduziram nos idosos
6
treinados. Desta forma pode-se sugerir que homens idosos altamente condicionados
7
parecem ter relativamente melhor preservação do sistema imune do que os homens
8
idosos sedentários. Treinamento de resistência de longo prazo tem o potencial de
9
desacelerar o declínio relativo à idade na função imunológica.
foi
semelhante
ao
de
adultos
jovens. A
concentração
de
IL-6
foi
10
Outro ponto interessante é a relação do estresse oxidativo e a resposta
11
imunológica, sabe-se que o estresse oxidativo prolongado é prejudicial para saúde,
12
no entanto, o estresse oxidativo transiente pode melhorar capacidade imunológica.
13
Desta forma Hurst et al. (2009), a fim de investigar a relação de estresse oxidativo e
14
atividade física examinaram se o exercício físico seria capaz de induzir aumento da
15
capacidade de geração de radicais oxidativo no plasma, para melhorar a resposta
16
imune a agentes patogênicos potenciais. Os resultados indicaram que o exercício
17
porvoca alterações nos parâmetros de plasma (por exemplo capacidade de gerar
18
oxidativo dependente ou independente de mediadores inflamatórios), a exposição ao
19
LPS bem como o estresse provocado pela atividade física são capazes de gerar
20
estresse oxidativo transitório importante para um sistema imune "saudável". E as
21
dosagem das concentrações de TNF-α e IL-10 foram similares aos do nosso estudo,
22
onde os grupos praticantes de atividade física apresentaram maiores concentrações
23
destas duas citocinas.
24
Os macrófagos são cada vez mais implicados como agentes essenciais na
25
defesa contra uma gama de patógenos microbianose tumores. A imunidade inata é
26
rapidamente acionada após a infecção, e isso resulta em restrição do crescimento
27
microbiano e tumoral.
28
Estudo de Kizaki e colaboradores (2008), utilizando dois grupos de
29
camundongos, sedentário e treinado, sendo o treinamento caracterizado como
30
moderado (50-75% do VO2máx) com 30 minutos de corrida em esteira a 18 m/min,
31
por 5 dias na semana durante 3 semanas. Após o período de treinamento realizaram
32
a retirada dos macrófagos peritoneais e submetaram à cultura estimulada com LPS,
33
e avaliaram a expressão de IFN-γ, IL-10, TNF-α e óxido nítrico (NO), observaram
34
que o grupo treinado apresentou maiores concentrações de IFN-γ, TNF-α e NO, e
71
1
redução de IL-10. E outra observação foi feita com relação à influência dos
2
receptores β adrenérgicos, porém a síntese das citocinas não está vinculado à
3
quantidade de receptores. Desta forma este estudo demonstrou que a adaptação de
4
macrófagos à prática de exercício moderado melhora a atividade microbicida e
5
capacidade de resposta do tipo Th1.
6
Estudo de Lu et al. (1999), verificaram que o efeito crônico da atividade física
7
acarreta na melhora da ação anti-tumoral de macrófagos, pois quando colocado os
8
macrófagos em cultura com IFN-γ e LPS, nos grupos treinados, independente da
9
idade dos animais, houve maiores números de macrófagos citolíticos. Este
10
comportamento também foi observado por Woods et al. (2000).
11
Bombarda et al. (2009), investigaram o efeito de uma sessão de exercício
12
abaixo do limiar anaeróbio sobre as funções de neutrófilos e monócitos circulantes
13
em ratos Wistar. A atividade funcional dos fagócitos circulantes foi avaliada por
14
ensaio de fagocitose de Saccharomyces cerevisiae e pelo teste de redução de
15
nitroazul de tetrazólio (NBT). Não observaram diferenças significativas no numero
16
total e diferencial de leucócitos entre os grupos. Entretanto, neutrófilos do grupo
17
submetido ao treinamento físico não apenas fagocitaram mais S. cerevisiae, como
18
também foram mais eficientes em reduzir NBT em relação aos controles. Sendo
19
assim, o exercício realizado com intensidade abaixo do limiar anaeróbio foi suficiente
20
para incrementar a atividade fagocítica e microbicida de neutrófilos em modelo
21
animal.
22
Portanto, a defesa do sistema imunológico contra patógenos intracelulares,
23
tumores, é mediada pela função das células T helper e macrófagos. A liberação
24
antecipada IFN-γ contribui para a diferenciação de T células para células Th1.
25
Assim, a produção inicial de IFN-γ, IL-2, IL-12 e TNF-α é importante para a geração
26
de imunidade adaptativa, bem como para defesas inatas contra as infecções. Pelo
27
contrário, a IL-4 e IL-10, tipos de citocinas Th2, e produção de TGF-β promovem
28
uma mudança Th1 para Th2 ou Treg, suprimindo a resistência antitumoral,
29
sugerindo que a baixa produção de IL-4, IL-10 e TGF-β, vistas nas células
30
esplênicas e macrófagos peritoneais de camundongos treinados poderão contribuir
31
para resposta imune do tipo Th1 contra tumores.
32
Contudo evidenciamos neste estudo que a prática regular de atividade física
33
pode ser alvo constante de pacientes com câncer, sendo adjuvante às terapias
34
convencionais, quimioterapia, radioterapia e cirurgia, bem como as novas terapias
72
1
como as imunoterapias, e destacamos que a atividade física não só reduziu a
2
incidência de tumores nos animais treinados como polarizou o padrão de resposta
3
imunológica para o perfil Th1, visto que as citocinas deste perfil foram
4
supraexpressas nos grupos treinados, e a atuação das células imune competentes
5
apresentaram-se potencializadas quando da prática de atividade física. Contudo,
6
existe a necessidade de mais estudos em que se padronizem melhores regimes de
7
treinamento, com frequências, intensidades e modalidades sejam aplicados, para
8
verificar até que ponto a atividade física seja benéfica, ou se caracterizado uma
9
atividade
10
extenuante
poderia
prejudicar o
desenvolvimento e agravo dos tumores.
sistema
imune
e
favorecer o
73
1
2
7. CONCLUSÃO
3
A partir dos resultados obtidos neste estudo, sobre a influência da
4
atividade física, natação, durante cinco dias por semana, com duração de 45
5
minutos por um período de oito semanas, em animais portadores de tumor de
6
mama na resposta imune, podemos concluir que :
7
1. A frequência de dupla marcação dos linfócitos CD3, CD4 e CD8, e dos
8
macrófagos (CD14) com as citocinas IFN-γ, IL-2, IL-12 e TNF-α,
9
reduziram nos grupos que praticaram atividade física, porém a
10
quantidade de fluorescência destas duplas marcações, ou seja, a
11
quantidade de citocinas produzidas foram maiores. E a quantidade de
12
linfócitos e macrófagos expressando IL -10 foi menor.
13
2. A concentração de citocinas do perfil Th1 nos sobrenadantes de cultura
14
de células esplênicas nos grupos treinados foram maiores que nos
15
demais, e a expressão de citocinas dos perfis Th2 e Treg foram
16
menores.
17
3. A dosagem das citocinas do padrão Th1 nos sobrenadantes de cultura
18
de macrófagos peritoneais nos grupos treinados com e sem tumor
19
apresentaram valores maiores que os grupos com tumor sem
20
treinamento, e as citocinas IL -10, IL-4 e TGF-β nos grupos treinados
21
foram menores que os demais.
22
Demonstrando assim, que a atividade física foi capaz de promover
23
reduções
na
incidência
de
desenvolvimento
dos
tumores,
bem
como
24
potencializou o sistema imune a polarizar um padrão de resposta do tipo Th1,
25
perfil antitumoral.
74
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
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