Professor Adjunto Doutor, Chefe do Setor de DST e Coordenador do Programa de Pós-graduação em
CÓD. 501153
Autor:
Mauro Romero Leal Passos
DST, Universidade Federal Fluminense - Niterói - RJ.
Colaboradores:
Renata de Queiroz Varella
Especialista em DST, Setor de DST, Universidade Federal Fluminense.
3
Referências Bibliográficas
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successful treatment with single dose azithromycin. CLAO J;
27(4):209-11, 2001.
Diagnóstico
Laboratorial
Diagnóstico Laboratorial
U
m médico experiente pode fazer o diagnóstico de
tracoma endêmico baseando-se na história clínica e
no exame físico do paciente. Entretanto, como muitas mulheres e homens infectados pela clamídia não podem ser distinguidos facilmente dos não infectados ou de outra infecção, o diagnóstico de infecção genital por clamídia está intimamente dependente de exames laboratoriais específicos.
Como já citamos em separata anterior, clinicamente o
reconhecimento de cervicite/uretrite/salpingite por clamídia depende de um alto índice de suspeição e exame clínico cuidadoso.
Por isso, a coleta, a armazenagem, o transporte, o processamento, a leitura e a interpretação dos exames laboratoriais são cruciais para um bom diagnóstico. Falhas, por
menor que sejam, em um destes itens, podem propiciar
falsos resultados. É importante dizer que, para o diagnóstico de infecção por Chlamydia trachomatis, deve-se ter em
mãos o conjunto adequado para coleta de material. Para
tanto, o clínico deve dispor de um razoável relacionamento com o pessoal do laboratório que o atende.
Os exames mais utilizados na prática médica são os
seguintes:
Coloração pela técnica de Giemsa
Como a clamídia é um patógeno de diminuto tamanho, não é possível observá-la como se analisa uma bactéria comum. Assim, pode-se, como nos casos de infecção
viral, apenas notar os efeitos citopáticos causados pelo
agressor em questão. No caso, é descrito como densas inclusões citoplasmáticas granulosas.
Visualização de corpúsculos de Gamma-Miyagawa contendo inúmeros corpúsculos reticulares, forma de replecação intracelular de clamídia, visualizada pela técnica de coloração citológica de Giema.
Citologia pelo Papanicolaou
A detecção de inclusões de clamídia intactas no
esfregaço é pouco sensível. Além disso, as alterações citológicas que acompanham a infecção cervical pela clamí-
dia são inespecíficas. Por isso, o exame de Papanicolaou
não deve ser usado como método de rastreio da infecção
por Chlamydia trachomatis. Entretanto, o achado suspeito
merece total consideração.
As alterações são as mesmas citadas na coloração pelo
Giemsa.
Histopatologia
É possível suspeitar de infecção clamidiana quando se
observam lesões inflamatórias crônicas e fibrocísticas com
granulações e formação de folículos. Nos casos de linfogranuloma venéreo ocorre, com freqüência, grande formação de abscessos esteliformes, mostrando ainda células
gigantes multinucleadas ocasionais.
A presença de folículos linfóides bem formados no
estroma cervical associa-se a uma cervicite mucopurulenta
por Chlamydia trachomatis.
Cultura de células
A Chlamydia trachomatis pode ser cultivada em cultura de tecido celular, utilizando linhagens de células Mc
Coy, HeLa 229 e BHK.
As amostras devem ser coletadas de material suspeito,
uretral ou endocervical, mais freqüentemente através de
zaragatoa (swab), mantidas em solução tampão e refrigeradas imediatamente (congelador). Depois são aquecidas e
homogeneizadas para serem inoculadas sobre a superfície
de fileiras confluentes de camadas de células susceptíveis.
Uma vez coletadas, as amostras devem ser refrigeradas com
gelo ou a 4°C e inoculadas na cultura de células dentro de
48 horas. Se tiverem de ser armazenadas por longos períodos, devem ser congeladas a -70°C.
O procedimento de cultivo padrão para Chlamydia
trachomatis é realizado em três dias de incubação. Após
esse período, as monocamadas devem ser coradas pelo iodo
ou pelo Giemsa, em que, nos casos positivos, será possível observar os corpúsculos de inclusão citoplasmáticos.
Verdadeiramente, o cultivo celular é o padrão ouro.
Entretanto, devido à necessidade de muito manuseio para
manutenção desses cultivos celulares, essa técnica ficou
restrita a metodologia de pesquisa. Hoje, na prática médica em nosso país, a cultura de clamídia em meio celular
não mais existe.
Detecção de antígenos de Chlamydia trachomatis
Imunofluorescência direta
Com o desenvolvimento de reagentes imunológicos específicos para componentes da membrana externa da clamídia, ficou possível e mais prático detectar a presença de
Chlamydia trachomatis sem o uso de cultivo celular. A
imunofluorescência direta aplica um ou mais anticorpos
poli/monoclonais conjugados com substâncias fluorescentes, como, por exemplo, fluoresceína.
Como já citado anteriormente, a técnica pode ser influenciada por problemas de coleta e fixação do material.
É sabido que materiais com pouca quantidade de células
epiteliais, bem como presença de sangue, fazem com que
os resultados sejam errados.
Por outro lado, essa técnica depende muito de interpretações do observador, que pode valorizar exageradamente um artefato ou desconsiderar uma infecção com
poucas partículas clamidianas. Outro complicador da técnica diz respeito ao potencial deletério para a saúde do
profissional que trabalha com imunofluorescência.
A
Notar que o algodão da zaragatoa deve penetrar no canal cervical em
movimentos rotatórios suaves, a fim de espremer as criptas
endocervicais e melhor recolher material para pesquisa de clamídia
(gonococo também). Normalmente, são conjuntos (kits) diferentes,
sendo necessárias duas ou mais coletas. A primeira amostra deve ser
para gonococo. Importante: não tocar o algodão na parede vaginal;
se for usada captura híbrida ou PCR, a coleta será única. O pus
endocervical não é um bom material para pesquisa da clamídia, pois
esta carece mais de células epitelias.
Detecção por métodos imunoenzimáticos
Ensaios imunoenzimáticos, EIA, ELISA (Enzyme liked
Immunosorbent assay) podem ser projetados para permitir a pesquisa de antígeno de clamídia em grande número
de amostras.
São menos sensíveis do que os métodos de cultura e
de biologia molecular. Todavia, incluem a possibilidade de
rastreamento em grandes populações e, por causa da natureza objetiva dos seus resultados, exclui vícios de interpretações pelo observador.
Estes testes podem dar reações cruzadas com bactérias
do trato gastrointestinal, que possuem polissacarídeos com
os mesmos determinantes antigênicos da clamídia.
Aceita-se a positividade desses testes para populações
de alto risco, como clientes de clínicas de DST.
Um teste de ELISA conjugado com leitura de fluorescência com tecnologia automatizada (Elfa-Vidas) oferece excelentes resultados e tem sido empregado de maneira muito satisfatória. Entretanto, o preço do equipamento, dos reagentes e componentes do conjunto, estão
quase que inviabilizados pela remuneração dos planos
de saúde.
Nas investigações de medicina legal, como abuso se-
B
C
(A) Deve-se ter o cuidado de usar material de tamanho proporcional ao local da coleta. (B) Em uretra (masculina ou feminina), recomendamos zaragatoa mais fina. (C) Notar que o algodão desaparece
completamente na uretra. Introduzir de 1 a 2 centímetros e fazer
leves movimentos semi-rotatórios.
xual de crianças e violência sexual, é mandatório o uso
da cultura celular. Atualmente, as técnicas de biologia
molecular, captura híbrida e PCR vêm ocupando papel
preponderante, uma vez que a técnica, a sensibilidade e
a especificidade são melhores e mais fáceis do que a
tradicional cultura em células de Mc Coy.
Outros imunoensaios para detecção de clamídia têm
sido empregados na prática médica, como radioimunoensaio, fluoroimunoensaio e o Dot-Blot teste. Todos,
como de hábito, empregam conjuntos de coleta e transporte próprios, e devem ser fornecidos pelo laboratório.
Detecção de anticorpos anti-clamídia
Trata-se de método de valor diagnóstico das infecções
profundas (complicadas), tais como: linfogranuloma venéreo (LGV), tracoma, endometrite, salpingite, periepatite,
síndrome de Reiter e pneumonia. Não é aplicada (e mesmo desaconselhada) em diagnóstico de infecções superficiais, como uretrite e cervicite.
Em casos de LGV, uma reação negativa (não reativa)
com certeza exclui este diagnóstico. Nas infecções do trato genital superior feminino (endometrite, salpingite) ou
masculino (orquiepididimite), além da periepatite e pneumonia, seu valor diagnóstico positivo passa a ter realce
quando a diluição for ³ 1:32. Isso porque títulos mais
baixos podem expressar apenas reações cruzadas.
Detecção de Chlamydia trachomatis por técnicas de
biologia molecular
A detecção de DNA amplificado (PCR=reação em cadeia por polimerase e LCR=reação em cadeia por ligase)
ou detecção de DNA e ampliação do sinal (captura híbrida) estão sendo apresentados como mais sensíveis do que
a cultura para diagnóstico de infecção uretral, em homens
e mulheres, e endocervical em mulheres, por clamídia.
Porém, houve relato de problemas com inibidores de Taqpolimerases (PCR) que podem existir em amostras
endocervicais. Isto leva a exames falso-negativos.
Estas técnicas biomoleculares promovem a detecção de
seqüências específicas de nucleotídeos de clamídia. As seqüências procuradas são aquelas presentes no plasmídeo
clamidiano comum, sendo encontrado em 7-10 cópias por
corpo elementar (forma infectiva). Na prática, esses exames
podem identificar até uma única partícula plasmidial.
Empresas fabricantes desses testes de biologia molecular
desenvolveram protocolos para uso em amostras de urina
(primeiro jato matinal ou após quatro horas sem urinar).
Em homens, o sedimento urinário tem eficácia igual ou
maior do que a obtida com esfregaços uretrais. Nas mulheres, o exame utilizando urina provavelmente é menos
sensível do que o exame ginecológico para coleta direta
de material endocervical. Todavia, a natureza não invasiva
do exame tende a tornar a urina um material bom para
grandes rastreios epidemiológicos. Entretanto, diante de
um exame de urina positivo para clamídia e/ou gonococo,
os exames clínicos, geral e genital, não devem ser postergados nem excluídos.
Pensando em evitar o rastreio com coleta de material
endocervical, há estudo que indica a coleta de material do
intróito vaginal.
Informações recentes dão conta de que foi encerrada
no Brasil a comercialização de teste diagnóstico com LCR.
A técnica de captura híbrida, no Brasil, pode ser mais
econômica, além de permitir, nos casos selecionados, a
pesquisa conjunta de clamídia, gonococo e HPV. Os conjuntos de coleta devem ser disponibilizados pelo laboratório, não permitindo improvisações.
Embora a documentação clássica de doença infecciosa
por clamídia seja com os testes específicos, um bom clínico ou deessetologista nunca esquece ou deixa de valorizar exames, a princípio chamados de inespecíficos, secundários ou acessórios, como:
a) Bacteriocopia pelo Gram de secreção uretral ou
endocervical, mostrando aumento do número de polimorfonuclear e ausência de diplococos Gram-negativos;
b) Velocidade de hemossedimentação (VHS) aumentada. Isso pode revelar atividade antiinflamatória. Com
certeza está aumentada em casos de infecção complicada
por clamídia. Já em casos de uretrites e cervicites, tal alteração não é evidente;
c) Proteína C reativa aumentada. Interpretação exatamente igual a VHS;
d) Hemograma com evidência de processo infeccioso
bacteriano. Interpretação também igual a VHS e proteína
C reativa.
Avaliação dos Métodos Laboratoriais (rever %)
Exame
Sensibilidade%
ELISA
70 – 80
Imunofluorescência
80 – 92
Sorologia
60 – 80
PCR, LCR, CH
> 95
Especificidade%
> 99
95-98
95
> 99
SENSIBILIDADE
Mede a capacidade de o exame detectar infecção quando ela está presente. É a preocupação máxima em relação
à população com alta prevalência da doença, como acontece nas clínicas de DST.
A sensibilidade mede a proporção de indivíduos com
exame positivo em relação a todos os pacientes infectados.
ESPECIFICIDADE
Mede a capacidade do teste em excluir corretamente a
infecção em indivíduo não-infectado. É a preocupação máxima no exame de populações com baixa prevalência da
doença, como acontece nas clínicas de planejamento familiar e clínicas particulares.
A especificidade mede a proporção de indivíduos
não-infectados com exame negativo.
Em foco - Diagnóstico Laboratorial é uma publicação periódica da PhOENIX Produções Editoriais, patrocinada por Farmoquímica. Jornalista
Responsável: José Antonio Mariano (Mtb: 22.273-SP). Tiragem: 20.000 exemplares. Endereço: Rua Gomes Freire, 439 – Cj. 6 – CEP 05075010 – São Paulo – SP. Tel.: (11) 3645-2171 – Fax: (11) 3831-8560 – E-mail: [email protected] – Nenhuma parte desta edição
pode ser reproduzida, gravada em sistema de armazenamento ou transmitida em forma alguma, por qualquer procedimento.
phx 0703
Diagnóstico Laboratorial
U
m médico experiente pode fazer o diagnóstico de
tracoma endêmico baseando-se na história clínica e
no exame físico do paciente. Entretanto, como muitas mulheres e homens infectados pela clamídia não podem ser distinguidos facilmente dos não infectados ou de outra infecção, o diagnóstico de infecção genital por clamídia está intimamente dependente de exames laboratoriais específicos.
Como já citamos em separata anterior, clinicamente o
reconhecimento de cervicite/uretrite/salpingite por clamídia depende de um alto índice de suspeição e exame clínico cuidadoso.
Por isso, a coleta, a armazenagem, o transporte, o processamento, a leitura e a interpretação dos exames laboratoriais são cruciais para um bom diagnóstico. Falhas, por
menor que sejam, em um destes itens, podem propiciar
falsos resultados. É importante dizer que, para o diagnóstico de infecção por Chlamydia trachomatis, deve-se ter em
mãos o conjunto adequado para coleta de material. Para
tanto, o clínico deve dispor de um razoável relacionamento com o pessoal do laboratório que o atende.
Os exames mais utilizados na prática médica são os
seguintes:
Coloração pela técnica de Giemsa
Como a clamídia é um patógeno de diminuto tamanho, não é possível observá-la como se analisa uma bactéria comum. Assim, pode-se, como nos casos de infecção
viral, apenas notar os efeitos citopáticos causados pelo
agressor em questão. No caso, é descrito como densas inclusões citoplasmáticas granulosas.
Visualização de corpúsculos de Gamma-Miyagawa contendo inúmeros corpúsculos reticulares, forma de replecação intracelular de clamídia, visualizada pela técnica de coloração citológica de Giema.
Citologia pelo Papanicolaou
A detecção de inclusões de clamídia intactas no
esfregaço é pouco sensível. Além disso, as alterações citológicas que acompanham a infecção cervical pela clamí-
dia são inespecíficas. Por isso, o exame de Papanicolaou
não deve ser usado como método de rastreio da infecção
por Chlamydia trachomatis. Entretanto, o achado suspeito
merece total consideração.
As alterações são as mesmas citadas na coloração pelo
Giemsa.
Histopatologia
É possível suspeitar de infecção clamidiana quando se
observam lesões inflamatórias crônicas e fibrocísticas com
granulações e formação de folículos. Nos casos de linfogranuloma venéreo ocorre, com freqüência, grande formação de abscessos esteliformes, mostrando ainda células
gigantes multinucleadas ocasionais.
A presença de folículos linfóides bem formados no
estroma cervical associa-se a uma cervicite mucopurulenta
por Chlamydia trachomatis.
Cultura de células
A Chlamydia trachomatis pode ser cultivada em cultura de tecido celular, utilizando linhagens de células Mc
Coy, HeLa 229 e BHK.
As amostras devem ser coletadas de material suspeito,
uretral ou endocervical, mais freqüentemente através de
zaragatoa (swab), mantidas em solução tampão e refrigeradas imediatamente (congelador). Depois são aquecidas e
homogeneizadas para serem inoculadas sobre a superfície
de fileiras confluentes de camadas de células susceptíveis.
Uma vez coletadas, as amostras devem ser refrigeradas com
gelo ou a 4°C e inoculadas na cultura de células dentro de
48 horas. Se tiverem de ser armazenadas por longos períodos, devem ser congeladas a -70°C.
O procedimento de cultivo padrão para Chlamydia
trachomatis é realizado em três dias de incubação. Após
esse período, as monocamadas devem ser coradas pelo iodo
ou pelo Giemsa, em que, nos casos positivos, será possível observar os corpúsculos de inclusão citoplasmáticos.
Verdadeiramente, o cultivo celular é o padrão ouro.
Entretanto, devido à necessidade de muito manuseio para
manutenção desses cultivos celulares, essa técnica ficou
restrita a metodologia de pesquisa. Hoje, na prática médica em nosso país, a cultura de clamídia em meio celular
não mais existe.
Detecção de antígenos de Chlamydia trachomatis
Imunofluorescência direta
Com o desenvolvimento de reagentes imunológicos específicos para componentes da membrana externa da clamídia, ficou possível e mais prático detectar a presença de
Chlamydia trachomatis sem o uso de cultivo celular. A
imunofluorescência direta aplica um ou mais anticorpos
poli/monoclonais conjugados com substâncias fluorescentes, como, por exemplo, fluoresceína.
Como já citado anteriormente, a técnica pode ser influenciada por problemas de coleta e fixação do material.
É sabido que materiais com pouca quantidade de células
epiteliais, bem como presença de sangue, fazem com que
os resultados sejam errados.
Por outro lado, essa técnica depende muito de interpretações do observador, que pode valorizar exageradamente um artefato ou desconsiderar uma infecção com
poucas partículas clamidianas. Outro complicador da técnica diz respeito ao potencial deletério para a saúde do
profissional que trabalha com imunofluorescência.
A
Notar que o algodão da zaragatoa deve penetrar no canal cervical em
movimentos rotatórios suaves, a fim de espremer as criptas
endocervicais e melhor recolher material para pesquisa de clamídia
(gonococo também). Normalmente, são conjuntos (kits) diferentes,
sendo necessárias duas ou mais coletas. A primeira amostra deve ser
para gonococo. Importante: não tocar o algodão na parede vaginal;
se for usada captura híbrida ou PCR, a coleta será única. O pus
endocervical não é um bom material para pesquisa da clamídia, pois
esta carece mais de células epitelias.
Detecção por métodos imunoenzimáticos
Ensaios imunoenzimáticos, EIA, ELISA (Enzyme liked
Immunosorbent assay) podem ser projetados para permitir a pesquisa de antígeno de clamídia em grande número
de amostras.
São menos sensíveis do que os métodos de cultura e
de biologia molecular. Todavia, incluem a possibilidade de
rastreamento em grandes populações e, por causa da natureza objetiva dos seus resultados, exclui vícios de interpretações pelo observador.
Estes testes podem dar reações cruzadas com bactérias
do trato gastrointestinal, que possuem polissacarídeos com
os mesmos determinantes antigênicos da clamídia.
Aceita-se a positividade desses testes para populações
de alto risco, como clientes de clínicas de DST.
Um teste de ELISA conjugado com leitura de fluorescência com tecnologia automatizada (Elfa-Vidas) oferece excelentes resultados e tem sido empregado de maneira muito satisfatória. Entretanto, o preço do equipamento, dos reagentes e componentes do conjunto, estão
quase que inviabilizados pela remuneração dos planos
de saúde.
Nas investigações de medicina legal, como abuso se-
B
C
(A) Deve-se ter o cuidado de usar material de tamanho proporcional ao local da coleta. (B) Em uretra (masculina ou feminina), recomendamos zaragatoa mais fina. (C) Notar que o algodão desaparece
completamente na uretra. Introduzir de 1 a 2 centímetros e fazer
leves movimentos semi-rotatórios.
xual de crianças e violência sexual, é mandatório o uso
da cultura celular. Atualmente, as técnicas de biologia
molecular, captura híbrida e PCR vêm ocupando papel
preponderante, uma vez que a técnica, a sensibilidade e
a especificidade são melhores e mais fáceis do que a
tradicional cultura em células de Mc Coy.
Outros imunoensaios para detecção de clamídia têm
sido empregados na prática médica, como radioimunoensaio, fluoroimunoensaio e o Dot-Blot teste. Todos,
como de hábito, empregam conjuntos de coleta e transporte próprios, e devem ser fornecidos pelo laboratório.
Detecção de anticorpos anti-clamídia
Trata-se de método de valor diagnóstico das infecções
profundas (complicadas), tais como: linfogranuloma venéreo (LGV), tracoma, endometrite, salpingite, periepatite,
síndrome de Reiter e pneumonia. Não é aplicada (e mesmo desaconselhada) em diagnóstico de infecções superficiais, como uretrite e cervicite.
Em casos de LGV, uma reação negativa (não reativa)
com certeza exclui este diagnóstico. Nas infecções do trato genital superior feminino (endometrite, salpingite) ou
masculino (orquiepididimite), além da periepatite e pneumonia, seu valor diagnóstico positivo passa a ter realce
quando a diluição for ³ 1:32. Isso porque títulos mais
baixos podem expressar apenas reações cruzadas.
Detecção de Chlamydia trachomatis por técnicas de
biologia molecular
A detecção de DNA amplificado (PCR=reação em cadeia por polimerase e LCR=reação em cadeia por ligase)
ou detecção de DNA e ampliação do sinal (captura híbrida) estão sendo apresentados como mais sensíveis do que
a cultura para diagnóstico de infecção uretral, em homens
e mulheres, e endocervical em mulheres, por clamídia.
Porém, houve relato de problemas com inibidores de Taqpolimerases (PCR) que podem existir em amostras
endocervicais. Isto leva a exames falso-negativos.
Estas técnicas biomoleculares promovem a detecção de
seqüências específicas de nucleotídeos de clamídia. As seqüências procuradas são aquelas presentes no plasmídeo
clamidiano comum, sendo encontrado em 7-10 cópias por
corpo elementar (forma infectiva). Na prática, esses exames
podem identificar até uma única partícula plasmidial.
Empresas fabricantes desses testes de biologia molecular
desenvolveram protocolos para uso em amostras de urina
(primeiro jato matinal ou após quatro horas sem urinar).
Em homens, o sedimento urinário tem eficácia igual ou
maior do que a obtida com esfregaços uretrais. Nas mulheres, o exame utilizando urina provavelmente é menos
sensível do que o exame ginecológico para coleta direta
de material endocervical. Todavia, a natureza não invasiva
do exame tende a tornar a urina um material bom para
grandes rastreios epidemiológicos. Entretanto, diante de
um exame de urina positivo para clamídia e/ou gonococo,
os exames clínicos, geral e genital, não devem ser postergados nem excluídos.
Pensando em evitar o rastreio com coleta de material
endocervical, há estudo que indica a coleta de material do
intróito vaginal.
Informações recentes dão conta de que foi encerrada
no Brasil a comercialização de teste diagnóstico com LCR.
A técnica de captura híbrida, no Brasil, pode ser mais
econômica, além de permitir, nos casos selecionados, a
pesquisa conjunta de clamídia, gonococo e HPV. Os conjuntos de coleta devem ser disponibilizados pelo laboratório, não permitindo improvisações.
Embora a documentação clássica de doença infecciosa
por clamídia seja com os testes específicos, um bom clínico ou deessetologista nunca esquece ou deixa de valorizar exames, a princípio chamados de inespecíficos, secundários ou acessórios, como:
a) Bacteriocopia pelo Gram de secreção uretral ou
endocervical, mostrando aumento do número de polimorfonuclear e ausência de diplococos Gram-negativos;
b) Velocidade de hemossedimentação (VHS) aumentada. Isso pode revelar atividade antiinflamatória. Com
certeza está aumentada em casos de infecção complicada
por clamídia. Já em casos de uretrites e cervicites, tal alteração não é evidente;
c) Proteína C reativa aumentada. Interpretação exatamente igual a VHS;
d) Hemograma com evidência de processo infeccioso
bacteriano. Interpretação também igual a VHS e proteína
C reativa.
Avaliação dos Métodos Laboratoriais (rever %)
Exame
Sensibilidade%
ELISA
70 – 80
Imunofluorescência
80 – 92
Sorologia
60 – 80
PCR, LCR, CH
> 95
Especificidade%
> 99
95-98
95
> 99
SENSIBILIDADE
Mede a capacidade de o exame detectar infecção quando ela está presente. É a preocupação máxima em relação
à população com alta prevalência da doença, como acontece nas clínicas de DST.
A sensibilidade mede a proporção de indivíduos com
exame positivo em relação a todos os pacientes infectados.
ESPECIFICIDADE
Mede a capacidade do teste em excluir corretamente a
infecção em indivíduo não-infectado. É a preocupação máxima no exame de populações com baixa prevalência da
doença, como acontece nas clínicas de planejamento familiar e clínicas particulares.
A especificidade mede a proporção de indivíduos
não-infectados com exame negativo.
Em foco - Diagnóstico Laboratorial é uma publicação periódica da PhOENIX Produções Editoriais, patrocinada por Farmoquímica. Jornalista
Responsável: José Antonio Mariano (Mtb: 22.273-SP). Tiragem: 20.000 exemplares. Endereço: Rua Gomes Freire, 439 – Cj. 6 – CEP 05075010 – São Paulo – SP. Tel.: (11) 3645-2171 – Fax: (11) 3831-8560 – E-mail: [email protected] – Nenhuma parte desta edição
pode ser reproduzida, gravada em sistema de armazenamento ou transmitida em forma alguma, por qualquer procedimento.
phx 0703
Diagnóstico Laboratorial
U
m médico experiente pode fazer o diagnóstico de
tracoma endêmico baseando-se na história clínica e
no exame físico do paciente. Entretanto, como muitas mulheres e homens infectados pela clamídia não podem ser distinguidos facilmente dos não infectados ou de outra infecção, o diagnóstico de infecção genital por clamídia está intimamente dependente de exames laboratoriais específicos.
Como já citamos em separata anterior, clinicamente o
reconhecimento de cervicite/uretrite/salpingite por clamídia depende de um alto índice de suspeição e exame clínico cuidadoso.
Por isso, a coleta, a armazenagem, o transporte, o processamento, a leitura e a interpretação dos exames laboratoriais são cruciais para um bom diagnóstico. Falhas, por
menor que sejam, em um destes itens, podem propiciar
falsos resultados. É importante dizer que, para o diagnóstico de infecção por Chlamydia trachomatis, deve-se ter em
mãos o conjunto adequado para coleta de material. Para
tanto, o clínico deve dispor de um razoável relacionamento com o pessoal do laboratório que o atende.
Os exames mais utilizados na prática médica são os
seguintes:
Coloração pela técnica de Giemsa
Como a clamídia é um patógeno de diminuto tamanho, não é possível observá-la como se analisa uma bactéria comum. Assim, pode-se, como nos casos de infecção
viral, apenas notar os efeitos citopáticos causados pelo
agressor em questão. No caso, é descrito como densas inclusões citoplasmáticas granulosas.
Visualização de corpúsculos de Gamma-Miyagawa contendo inúmeros corpúsculos reticulares, forma de replecação intracelular de clamídia, visualizada pela técnica de coloração citológica de Giema.
Citologia pelo Papanicolaou
A detecção de inclusões de clamídia intactas no
esfregaço é pouco sensível. Além disso, as alterações citológicas que acompanham a infecção cervical pela clamí-
dia são inespecíficas. Por isso, o exame de Papanicolaou
não deve ser usado como método de rastreio da infecção
por Chlamydia trachomatis. Entretanto, o achado suspeito
merece total consideração.
As alterações são as mesmas citadas na coloração pelo
Giemsa.
Histopatologia
É possível suspeitar de infecção clamidiana quando se
observam lesões inflamatórias crônicas e fibrocísticas com
granulações e formação de folículos. Nos casos de linfogranuloma venéreo ocorre, com freqüência, grande formação de abscessos esteliformes, mostrando ainda células
gigantes multinucleadas ocasionais.
A presença de folículos linfóides bem formados no
estroma cervical associa-se a uma cervicite mucopurulenta
por Chlamydia trachomatis.
Cultura de células
A Chlamydia trachomatis pode ser cultivada em cultura de tecido celular, utilizando linhagens de células Mc
Coy, HeLa 229 e BHK.
As amostras devem ser coletadas de material suspeito,
uretral ou endocervical, mais freqüentemente através de
zaragatoa (swab), mantidas em solução tampão e refrigeradas imediatamente (congelador). Depois são aquecidas e
homogeneizadas para serem inoculadas sobre a superfície
de fileiras confluentes de camadas de células susceptíveis.
Uma vez coletadas, as amostras devem ser refrigeradas com
gelo ou a 4°C e inoculadas na cultura de células dentro de
48 horas. Se tiverem de ser armazenadas por longos períodos, devem ser congeladas a -70°C.
O procedimento de cultivo padrão para Chlamydia
trachomatis é realizado em três dias de incubação. Após
esse período, as monocamadas devem ser coradas pelo iodo
ou pelo Giemsa, em que, nos casos positivos, será possível observar os corpúsculos de inclusão citoplasmáticos.
Verdadeiramente, o cultivo celular é o padrão ouro.
Entretanto, devido à necessidade de muito manuseio para
manutenção desses cultivos celulares, essa técnica ficou
restrita a metodologia de pesquisa. Hoje, na prática médica em nosso país, a cultura de clamídia em meio celular
não mais existe.
Detecção de antígenos de Chlamydia trachomatis
Imunofluorescência direta
Com o desenvolvimento de reagentes imunológicos específicos para componentes da membrana externa da clamídia, ficou possível e mais prático detectar a presença de
Chlamydia trachomatis sem o uso de cultivo celular. A
imunofluorescência direta aplica um ou mais anticorpos
poli/monoclonais conjugados com substâncias fluorescentes, como, por exemplo, fluoresceína.
Como já citado anteriormente, a técnica pode ser influenciada por problemas de coleta e fixação do material.
É sabido que materiais com pouca quantidade de células
epiteliais, bem como presença de sangue, fazem com que
os resultados sejam errados.
Por outro lado, essa técnica depende muito de interpretações do observador, que pode valorizar exageradamente um artefato ou desconsiderar uma infecção com
poucas partículas clamidianas. Outro complicador da técnica diz respeito ao potencial deletério para a saúde do
profissional que trabalha com imunofluorescência.
A
Notar que o algodão da zaragatoa deve penetrar no canal cervical em
movimentos rotatórios suaves, a fim de espremer as criptas
endocervicais e melhor recolher material para pesquisa de clamídia
(gonococo também). Normalmente, são conjuntos (kits) diferentes,
sendo necessárias duas ou mais coletas. A primeira amostra deve ser
para gonococo. Importante: não tocar o algodão na parede vaginal;
se for usada captura híbrida ou PCR, a coleta será única. O pus
endocervical não é um bom material para pesquisa da clamídia, pois
esta carece mais de células epitelias.
Detecção por métodos imunoenzimáticos
Ensaios imunoenzimáticos, EIA, ELISA (Enzyme liked
Immunosorbent assay) podem ser projetados para permitir a pesquisa de antígeno de clamídia em grande número
de amostras.
São menos sensíveis do que os métodos de cultura e
de biologia molecular. Todavia, incluem a possibilidade de
rastreamento em grandes populações e, por causa da natureza objetiva dos seus resultados, exclui vícios de interpretações pelo observador.
Estes testes podem dar reações cruzadas com bactérias
do trato gastrointestinal, que possuem polissacarídeos com
os mesmos determinantes antigênicos da clamídia.
Aceita-se a positividade desses testes para populações
de alto risco, como clientes de clínicas de DST.
Um teste de ELISA conjugado com leitura de fluorescência com tecnologia automatizada (Elfa-Vidas) oferece excelentes resultados e tem sido empregado de maneira muito satisfatória. Entretanto, o preço do equipamento, dos reagentes e componentes do conjunto, estão
quase que inviabilizados pela remuneração dos planos
de saúde.
Nas investigações de medicina legal, como abuso se-
B
C
(A) Deve-se ter o cuidado de usar material de tamanho proporcional ao local da coleta. (B) Em uretra (masculina ou feminina), recomendamos zaragatoa mais fina. (C) Notar que o algodão desaparece
completamente na uretra. Introduzir de 1 a 2 centímetros e fazer
leves movimentos semi-rotatórios.
xual de crianças e violência sexual, é mandatório o uso
da cultura celular. Atualmente, as técnicas de biologia
molecular, captura híbrida e PCR vêm ocupando papel
preponderante, uma vez que a técnica, a sensibilidade e
a especificidade são melhores e mais fáceis do que a
tradicional cultura em células de Mc Coy.
Outros imunoensaios para detecção de clamídia têm
sido empregados na prática médica, como radioimunoensaio, fluoroimunoensaio e o Dot-Blot teste. Todos,
como de hábito, empregam conjuntos de coleta e transporte próprios, e devem ser fornecidos pelo laboratório.
Detecção de anticorpos anti-clamídia
Trata-se de método de valor diagnóstico das infecções
profundas (complicadas), tais como: linfogranuloma venéreo (LGV), tracoma, endometrite, salpingite, periepatite,
síndrome de Reiter e pneumonia. Não é aplicada (e mesmo desaconselhada) em diagnóstico de infecções superficiais, como uretrite e cervicite.
Em casos de LGV, uma reação negativa (não reativa)
com certeza exclui este diagnóstico. Nas infecções do trato genital superior feminino (endometrite, salpingite) ou
masculino (orquiepididimite), além da periepatite e pneumonia, seu valor diagnóstico positivo passa a ter realce
quando a diluição for ³ 1:32. Isso porque títulos mais
baixos podem expressar apenas reações cruzadas.
Detecção de Chlamydia trachomatis por técnicas de
biologia molecular
A detecção de DNA amplificado (PCR=reação em cadeia por polimerase e LCR=reação em cadeia por ligase)
ou detecção de DNA e ampliação do sinal (captura híbrida) estão sendo apresentados como mais sensíveis do que
a cultura para diagnóstico de infecção uretral, em homens
e mulheres, e endocervical em mulheres, por clamídia.
Porém, houve relato de problemas com inibidores de Taqpolimerases (PCR) que podem existir em amostras
endocervicais. Isto leva a exames falso-negativos.
Estas técnicas biomoleculares promovem a detecção de
seqüências específicas de nucleotídeos de clamídia. As seqüências procuradas são aquelas presentes no plasmídeo
clamidiano comum, sendo encontrado em 7-10 cópias por
corpo elementar (forma infectiva). Na prática, esses exames
podem identificar até uma única partícula plasmidial.
Empresas fabricantes desses testes de biologia molecular
desenvolveram protocolos para uso em amostras de urina
(primeiro jato matinal ou após quatro horas sem urinar).
Em homens, o sedimento urinário tem eficácia igual ou
maior do que a obtida com esfregaços uretrais. Nas mulheres, o exame utilizando urina provavelmente é menos
sensível do que o exame ginecológico para coleta direta
de material endocervical. Todavia, a natureza não invasiva
do exame tende a tornar a urina um material bom para
grandes rastreios epidemiológicos. Entretanto, diante de
um exame de urina positivo para clamídia e/ou gonococo,
os exames clínicos, geral e genital, não devem ser postergados nem excluídos.
Pensando em evitar o rastreio com coleta de material
endocervical, há estudo que indica a coleta de material do
intróito vaginal.
Informações recentes dão conta de que foi encerrada
no Brasil a comercialização de teste diagnóstico com LCR.
A técnica de captura híbrida, no Brasil, pode ser mais
econômica, além de permitir, nos casos selecionados, a
pesquisa conjunta de clamídia, gonococo e HPV. Os conjuntos de coleta devem ser disponibilizados pelo laboratório, não permitindo improvisações.
Embora a documentação clássica de doença infecciosa
por clamídia seja com os testes específicos, um bom clínico ou deessetologista nunca esquece ou deixa de valorizar exames, a princípio chamados de inespecíficos, secundários ou acessórios, como:
a) Bacteriocopia pelo Gram de secreção uretral ou
endocervical, mostrando aumento do número de polimorfonuclear e ausência de diplococos Gram-negativos;
b) Velocidade de hemossedimentação (VHS) aumentada. Isso pode revelar atividade antiinflamatória. Com
certeza está aumentada em casos de infecção complicada
por clamídia. Já em casos de uretrites e cervicites, tal alteração não é evidente;
c) Proteína C reativa aumentada. Interpretação exatamente igual a VHS;
d) Hemograma com evidência de processo infeccioso
bacteriano. Interpretação também igual a VHS e proteína
C reativa.
Avaliação dos Métodos Laboratoriais (rever %)
Exame
Sensibilidade%
ELISA
70 – 80
Imunofluorescência
80 – 92
Sorologia
60 – 80
PCR, LCR, CH
> 95
Especificidade%
> 99
95-98
95
> 99
SENSIBILIDADE
Mede a capacidade de o exame detectar infecção quando ela está presente. É a preocupação máxima em relação
à população com alta prevalência da doença, como acontece nas clínicas de DST.
A sensibilidade mede a proporção de indivíduos com
exame positivo em relação a todos os pacientes infectados.
ESPECIFICIDADE
Mede a capacidade do teste em excluir corretamente a
infecção em indivíduo não-infectado. É a preocupação máxima no exame de populações com baixa prevalência da
doença, como acontece nas clínicas de planejamento familiar e clínicas particulares.
A especificidade mede a proporção de indivíduos
não-infectados com exame negativo.
Em foco - Diagnóstico Laboratorial é uma publicação periódica da PhOENIX Produções Editoriais, patrocinada por Farmoquímica. Jornalista
Responsável: José Antonio Mariano (Mtb: 22.273-SP). Tiragem: 20.000 exemplares. Endereço: Rua Gomes Freire, 439 – Cj. 6 – CEP 05075010 – São Paulo – SP. Tel.: (11) 3645-2171 – Fax: (11) 3831-8560 – E-mail: [email protected] – Nenhuma parte desta edição
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phx 0703
Professor Adjunto Doutor, Chefe do Setor de DST e Coordenador do Programa de Pós-graduação em
CÓD. 501153
Autor:
Mauro Romero Leal Passos
DST, Universidade Federal Fluminense - Niterói - RJ.
Colaboradores:
Renata de Queiroz Varella
Especialista em DST, Setor de DST, Universidade Federal Fluminense.
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Diagnóstico
Laboratorial