Evidenciação e quantificação de bacteriófagos
Introdução
Os vírus são seres vivos que possuem as estruturas macromoleculares simples e informação genética
suficiente para sua duplicação. Sua reprodução não ocorre quando se encontram livres ou em
presença de meios inanimados, como os meios de cultura para o crescimento de bactérias e fungos.
Eles dependem dos processos bioquímicos de uma célula hospedeira. No ambiente extracelular são
partículas biologicamente inertes e por isso, são considerados parasitas intracelulares obrigatórios.
Por não se multiplicarem em meios de cultura comuns, não formam colônias macroscópicas e são
invisíveis ao microscópio comum. A sua presença ou multiplicação só poderá ser revelada por meios
indiretos, isto é, observando-se os seus efeitos sobre um hospedeiro sensível, sendo este
exclusivamente uma célula viva, ou seja, uma bactéria ou um ser multicelular. Diretamente pode ser
visualizado por microscopia eletrônica.
Assim, técnicas de estudo dos vírus diferem profundamente daquelas para estudo das bactérias,
sendo estas bem mais complexas. Considerando a complexidade, representada pela necessidade da
manipulação de várias espécies animais (de difícil obtenção, custo elevado e maior rigor quanto às
técnicas assépticas), nos exercícios que se seguem não haverá a preocupação em se estudar cada
grupo de vírus e sim de familiarizar o estudante com técnicas básicas de crescimento e titulação de
vírus em alguns sistemas celulares.
Essas técnicas podem ser utilizadas em diferentes situações e é necessário que se faça um esforço no
sentido de perceber suas aplicações, considerando principalmente, a importância do caráter
profilático com o qual devem ser encaradas as infecções por vírus. As discussões devem focalizar além
da pesquisa de vírus ou anticorpos em material clínico com fins de diagnóstico, também a pesquisa de
vírus no ambiente (por exemplo, em água, alimentos ou em vetores). Os níveis de anticorpos
circulantes são pesquisados também no sentido de se avaliar o grau de imunidade da população (em
casos de vacinação) ou buscar evidências de circulação de determinado vírus nessa população.
Objetivos
Ao fim desta prática, você deverá estar apto a fazer a titulação de um vírus animal, através da lise do
hospedeiro (célula bacteriana).
Introdução aos vírus
1
Material







Tubos contendo 0,9 mL de caldo simples: 6/mesa
Bacteriófago diluído a 10-2: 1/mesa
Cultura jovem de E. coli: 1/mesa
Pipetadores de 100 microlitros: 1/mesa
Ponteiras: 20/mesa
Alça de Drigalski: 6/mesa
Meio de lisado em placas de Petri: 6/mesa.
Execução
1. Marcar os tubos com caldo simples (foto 1):
Tubos: 1(10-3); 2(10-4); 3(10-5); 4(10-6), 5(10-7) e C(controle).
Foto 1: Demarcação dos tubos com as diluições a serem realizadas em etapa seguinte
Introdução aos vírus
2
2. Marcar as placas de Petri, com meio de cultura, o no da diluição que será utilizada para a titulação
(10-3 por ex.), n° da mesa e turma (foto 2).
Foto 2: Placas de Petri marcadas com identificadores dos responsáveis pela prática, assim como com
as diluições realizadas
3. Fazer a diluição do fago (foto 3): Usando pipetador automático, adicionar ao primeiro tubo da série
(diluição 10-3) 0,1 mL do fago-estoque (previamente diluído a 10-2).
Foto 3: Realização da diluição do fago
Introdução aos vírus
3




Desprezar a ponteira.
Usando outra ponteira, misturar (aspirando e soprando lentamente, 3 a 4 vezes)
Transferir 0,1 mL ( da diluição 10-3) para o tubo seguinte (diluição 10-4).
Desprezar a ponteira.
4. Usando a mesma técnica, repetir a operação do item anterior para obter as diluições 10-5 a 10-7(foto
4).
 No final, desprezar 0,1 mL da diluição 10-7.
Foto 4: Realização da diluição do fago em 10-5 através de técnica descrita em passo anterior.
5. O último tubo C (controle) não recebe fago e servirá para observar o crescimento bacteriano.
6. Usando pipetador automático, acrescentar, a partir do tubo C (controle) até a diluição 10-3, 0,1 mL
da cultura jovem de E. coli B-4 (foto 5).
Introdução aos vírus
4
Foto 5: Tubo contendo cultura jovem de E. coli B-4 a ser utilizada nesta prática.
7. Imediatamente, usando pipetador automático, e iniciando pelo tubo de n° 5 (10-7), transferir 0,1 mL
da mistura para uma placa de Petri com meio de lisado, previamente marcada.
8. Repetir o mesmo com diluições 10-6, 10-5, 10-4 e 10-3, e C (controle).
A seguir, com auxílio de uma alça de Drigalski espalhar 0,1mL da mistura (fotos 6 e 7), a fim de cobrir
homogeneamente toda a superfície do meio. Isto é extremamente importante. Recolher as placas e
colocar na estufa a 37C.
Fotos 6 e 7: Alça de Drigalski estéril e sua utilização para cobrir de forma homogênea a superfície do
meio contido na placa de Petri.
Introdução aos vírus
5
Esquema 1: Execução da prática em questão, respeitando os passos já descritos.
Fago
d= 10-2
0,1mL
0,1mL
0.1mL
0,1mL
0,1mL
0,1mL
0,9 mL de
Caldo
simples
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
C
0,1mL de E. coli
Leitura e interpretação

Observar as placas inoculadas. A presença do vírus é indicada pelas áreas de lise bacteriana (ausência
de crescimento bacteriano) (foto 8).
Introdução aos vírus
6
Foto 8: Placa contendo áreas de lise bacteriana (indicadas pela seta branca), incluindo áreas de
confluência entre as áreas de lise.
Essas áreas denominadas zonas de lise são circulares e resultantes de diversos ciclos de multiplicação
de vírus, iniciados a partir de uma célula bacteriana infectada. Nas placas de baixa diluição, a presença
de colônias bacterianas nas áreas de lise confluente significa mutantes naturalmente resistentes à
ação lítica do fago. Comparar as placas com formação de zonas de lise com a placa controle (foto 9),
onde não há zonas de lise.
Foto 9: Placa controle onde não há zonas de lise. Repare a homogeneidade do meio.
Introdução aos vírus
7

O título do vírus por mL é igual ao número de zonas de lise contáveis (30 a 300), multiplicado por dez
(transformação de 0,1 ml em 1 ml) e multiplicado pelo inverso da diluição na qual foram contadas as
zonas de lise:
Título por mL = n x FC x 10* ,
Onde: n = número de zonas de lise contadas
FC = Fator de correção = 10
* = inverso da diluição do vírus empregada nesta placa
Resultados
No quadro abaixo, anotar o número de UFP no meio sólido, para cada uma das diluições do fago.
Anotar o número de mutantes isolados nos meios sólidos, nas placas de diluições 10-3 e 10-4. Calcular o
título de atividade lítica do fago por mL.
Diluições
N° de UFP no
meio sólido
N° de
mutantes
isolados
Dosagem do
fago
(Título/mL)
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
Controle
Introdução aos vírus
8