Workshop de Biologia Molecular
Biologia da Leucemia
Promielocítica Aguda
Eduardo M. Rego
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Universidade de São Paulo
Descrição e caracterização da LPA
Caracterização citogenética
• Golomb et al., 1976 – deleção parcial do cromossomo
17
• Rowley et al., 1977 – translocação recíproca e
balanceada entre os cromossomos 15 e 17
• Larson et al., 1984 – associação consistente entre a
t(15;17) com LPA
• Caracterização e clonagem dos pontos de quebra na
t(15;17)
–
–
–
–
De Thé et al., Nature( 1990)
1990); vol. 347: 558
Kakizuka et al., Cell (1991); vol. 66: 663
Borrow et al., Science (1990); vol. 249: 1577
Longo et al., J Exp Med (1990); vol. 172: 1571
Resposta à terapia baseada no uso do ATRA
• Huang et al., 1988 – resultados do tratamento
de 24 pacientes com LPA com monoterapia
com ATRA – 23 CR
• Degos L et al., Lancet. 1990; 336:1440-1441
• Warrell RP et al., New Engl J Med
1991;324:1385-1393.
Monoterapia com ATRA estava associada à elevada frequência de
recaídas que geralmente eram resistentes ao retratamento
Resposta ao tratamento baseado no uso de ATO
• Zhang et al., 1996 - tratamento com ATO
resultou em taxas de CR de 73% e 52% em 30
pacientes com LPA de novo e 42 em recaída,
respectivamente.
• Chen et al. Blood. 1996;88:1052-1061
• Soignet et al. J Clin Oncol. 2001;19:3852-3860.
Em doses subclínicas ATO induz diferenciação e em doses
farmacológicas induz apoptose
Definição da LPA
• Morfologia – blastos semelhantes a
promielócitos
• (Cito)genética – 98% o rearranjo PML/RARa
está presente
• Resposta a terapia com ATRA (diferenciação)
• Resposta a terapia com ATO (apoptose)
• Associação com distúrbios graves da
hemostasia
• Como a expressão da proteína de fusão
PML/RARa causa a leucemia promielocítica
aguda ?
Estrutura e domínios funcionais
A proteína híbrida PML-RARA retém a maior parte
dos domínios funcionais das proteínas parentais
RARα
RAR
α
B
RING
Transcriptional Activator AFAF-1
P
DNA Binding
C
Hinge Region
D
B1
B2
E
Coiled Coil
A
F
C
Transcriptional Activator AFAF-1
PML
Ligand Binding
Heterodimerization
Transcriptional Activator AFAF-2
N-Cor/SMTR Binding
Function Unknown
RARα -PML
RARα
RING
C
D
E
F
?
P
RING
B
P
Coiled CoilPML
B1
B2
C
Coiled Coil
B1
B2
C
PML
adaptado de Rego e Pandolfi. Seminars in Hematol (2001); vol. 38: 54.
Alterações citogenéticas da LPA
Alteração
citogenética
Fusion Gene
Frequency
t(15;17)(q22;q21)
PML/RARa
> 98%
t(11;17)(q23;q21)
PLZF/RARa
~ 1%
t(11;17)(q13;q21)
NuMA/RARa
< 1%
t(5;17)(q35;q21)
NPM/RARa
< 1%
Duplicação
intersticial 17q2117q21-q23
STAT5b/RARa
um caso
t(4;17)(q12;q21)
FIP1L1/RARa
um caso
17 (17q24 )
PRKAR1A/RARa
um caso
Brown et al. Frontiers in Bioscience 2009; 14: 1684-1707
Estrutura da PML/RARa e das variantes
Reviewed by Brown et al. Frontiers in Bioscience 2009; 14: 1684-1707
• Como a expressão da proteína de fusão
PML/RARa causa a leucemia promielocítica
aguda ?
Estrutura e domínios funcionais
Domínios que potencialmente interferem na via
retinóide estão conservados em todas as proteínas de
fusão detectadas em casos de LPA
Animais transgênicos expressando a PML/RARa
sob o controle da região promotora do gene da
catepsina G desenvolvem LPA
Modelo transgênico hCG-PML/RARa
Bone Marrow
Hemopoietic
precursors
Cell
death
Spleen
Self
Renewal
Commitment
Blood
Maturation
Birth
1 year old
100% develop myeloid hyperplasia
10-12% of leukemic mice
develop leukemia
Rego et al. Oncogene 2006; 25: 1974–1979
He et al. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 5302–5307
Paradigma da leucemogênese induzida pelo
bloqueio da diferenciação
Adaptado de Ablain and de Thé Blood 2011;117:5795-5802
Limitações ao “paradigma”
• Monoterapia com ATRA resulta em remissões
transitórias e para obtenção de sobrevida livre de
doença prolongada ATRA deve ser combinado
com quimioterapia
• In vivo, as concentrações de ATRA necessárias
para obter efeito terapêutico são muito
superiores àquelas capazes de reativar a
transcrição gênica e induzir diferenciação
• Em animais transgênicos, a introdução de uma
mutação na pos. S873 da PML/RARA (que é
essencial para a degradação da proteína pelo
ATRA) diminui a eficácia do tratamento com
ATRA, mas não impede a diferenciação
Limitações ao “paradigma”
• Multímeros PML/RARa/RXR são capazes de
ATIVAR a expressão de genes que não são
controlados pelos RAREs
• A lisina da posição 190 da porção PML é
essencial para a imortalização e para a
interação com a proteína DAXX
Modelos murinos de mutantes do RARA
Não desenvolveu leucemia
Apenas 1 de 85 animais de 6
linhagens desenvolveu leucemia
Não desenvolveu leucemia
Vários leucêmicos
Vetor hCG
Matsushita et al. J Exp Med (2006); vol. 203: 821
Novo modelo da leucemogênese induzida
pela PML/RARa
SUMO
DAXX
RXR
K190
N-COR
HDAC3
Immortalization
Transcription
repression
DNMT
Transcription
activation
Transcription
repression
Promoter without region RA responsive elements
Promoter wt region
RA responsive elements
Genes
associated
with
myeloid
differentiation
Estudo do efeito in vivo da inativação do PML
X
Pml -/-
PML-RARα
Descendência:
PML-RARa / Pml +/+
PML-RARa / Pml +/PML-RARa / Pml -/-
Rego et al. J Exp Med (2001); vol. 193: 521
Estudo do efeito in vivo da inativação do PML
Sobrevida livre de leucemia
A Inativação do PML diminui o período de latência e aumentou a
freqüência de leucemias no modelo transgênico
Dias
Rego et al. J Exp Med (2001); vol. 193: 521
PML interage com várias proteínas
Função celular
Atividade
Supressor tumoral
Regulação da
transcrição
Helicase de DNA
Apoptose
Modificação póstraducional
Resposta imune
Proteína que
Referências
interage com a PML
Guo et al. , Nat Cell Biol
P53
(2000); vol. 2: 730
CBP
Hoemme et al. Blood
BLM
Iniciador da
tradução
Regulador da
transcrição
Sinalização
citoplasma-núcleo
Ubiquitinação e
SUMOlação
eIF-4
(2008); vol. 111: 2887
Chee et al. J Virol (2003);
vol. 77: 7101
Daxx
Torii et al. Embo J (1999);
vol. 18: 6037
Smad2/3 (via TGFβ
β)
- PMLc
Ubc9
SUMO-1
Lin et al. Oncogene
(2005); vol. 24: 5693
Regulador da
transcrição
Sp100
Fuchsova et al J Cell Biol
(2002); vol. 158: 463
Seeler et al Oncogene
(2001); vol. 20: 7243
Sternsdorf et al. J Biol
Chem (1999); vol. 274:
12555
PML-RARA causa a desorganização dos
corpúsculos nucleares
• Como a expressão da proteína de fusão
PML/RARa causa a leucemia promielocítica
aguda ?
Por meio de interações proteína-DNA que causam
tanto perda como ganho-de-função
Por meio de interações proteína-proteína no
núcleo (homo e heterodímeros)
Por meio de interações proteína-proteína nos
corpúsculos nucleares
Por meio de um mecanismo indireto pela
desorganização dos corpúsculos nucleares
• Existe uma célula tronco leucêmica (ou célula
iniciadora da leucemia) no caso da leucemia
promielocítica aguda?
Células inciadoras da leucemia
• Lapidot et al. (1994) demonstrou que uma
subfração dos blastos de leucemia mielóide
aguda era capaz de propogar a doença num
modelo xenotransplante
• O fenótipo desta subfração subfração é
controverso (CD34+ CD38-)
• LICs são capazes de divisão assimétrica
• LICs são quiescentes e portanto protegidas de
estímulos genotóxicos
• Seriam responsáveis pela repopulação da massa
tumoral após o tratamento quimioterápico
Caracterização imunofenotípica da massa de
células leucêmicas no modelo transgênico
Camundongo selvagem
Selvagem vs transgênico leucêmico
Análise morfológica das frações
Análise da expressão de genes
“mielóides” nas subfrações
Myeloid subsets in the bone marrow of
murine model of APL
Isolamento das frações
transplante
Rtx
Camundongo
transgênico
leucêmico
Recipiente selvagem
HLA-compátivel irradiado
30 dias
Análise morfológica
e imunofenotípica
Somente células das frações 3 e 4 foram
capazes de causar leucemia nos recipientes
- Propriedade foi mantida em transplantes sequenciais
- Efeito “dose”-dependente
• Existe uma célula tronco leucêmica (ou célula
iniciadora da leucemia) no caso da leucemia
promielocítica aguda?
A células iniciadoras da leucemia promielocítica
aguda são parcialmente diferenciadas: CD34+
CD117+ CD16/32± Gr-1±
Bases moleculares da resposta ao tratamento
ATRA
ATO
PML/
RARA
Há sinergismo in vivo do ATRA e ATO ?
Sítios de Ação do ATRA e do As2O3
As2O3
K160- SUMO-Degradação
PML
As2O3 ATRA
K490 SUMO
D522 Caspase
RARα
α
Ativação das
Caspases
ATRA
AF2- SUG-1
Degradação
Mecanismo de ação do ATRA
ATRA
PROTEASES
Degradação da PML/RARa
Ligação ATRA ao domínio AF2
DEGRADAÇÃO
PROTEASSOMA 26S
(SUG2)
PML/R
ARA
DNA
Degradação da PML/RARa
Mecanismo de ação do ATO
Pontes disulfeto
PMl/PML
ROS
ATO
ATO
PML/R
ARA
PML/R
ARA
PML/R
ARA
cisteína
Reformação dos NBs
adição de SUMO –
ubiquitina UBC9
PML/R
ARA
adição de SUMO –
ubiquitina UBC9
Degradação da PML/RARa
Sinergismo ATRA + ATO
Rego et al., PNAS 2000; 97: 10173–10178
Combinação ATRA + Arsênico
Uso combinado de ATRA + ATO
• M.D. Anderson
• Duas coortes:
– n=47; ATRA (45 mg/m2/d) e ATO (0.15 mg/kg/d
começando no D10 do ATRA). Pacientes de alto
risco recebiam tb Gentuzimab (GO) 9 mg/m2 no
10 dia da indução)
– n=45; ATRA + ATO concomitantes a partir do D1
• Consolidação 4 ciclos de ATO, 1x/dia por
5d/sem por 4 semanas em meses alternados
+ ATRA quinze dias sim, quinze não, por um
total de 28 semanas após CR.
Ravandi et al., J Clin Oncol. 2009;27(4):504-10.
Uso combinado de ATRA + ATO
• Monitoramento por RT-PCR
– Se positivo: GO 9mg/m2 era administrato
junto com ATRA+ATO a cada 4-5 sems
• 70% dos 92 pacientes eram baixo risco
CR
Mortes na indução
Seguimento
Taxa de recaída
SG em 5 anos
98%
2
mediana: 25m (3-99)
6%
90%
Ravandi et al., J Clin Oncol. 2009;27(4):504-10.
Ravandi et al., J Clin Oncol. 2009;27(4):504-10.
Resultados de trials baseados em ATRA e
antracíclicos
• Há sinergismo in vivo entre ATRA e ATO?
Sim, as duas drogas causam a degradação da
PML/RARa. O tratamento com a combinação
ATO + ATRA resultou em um clearance mais
rápido das células leucêmicos no modelo
animal e em pacientes
• O uso combinado ATRA + ATO pode substituir
o tratamento padrão com ATRA e
quimioterapia?
•Não.
•Sim
•Ausência
de estudos randomizados
•Menor
cardiotoxicidade
(pacientes idosos)
•Seguimento
•Clearance
mais ainda
rápidoé curto
•Não taxa
houve
na mortalidade precoce
•Menor
demudança
mielosupressão
•O estudo do MD Anderson tb empregava G.O.
•e analisou pacientes de baixo risco
•Os estudos com ATRA + quimio tem resultados muito bons
e seguimento de > 10 anos
Obrigado.
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