UFSM
Tese de Doutorado
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM
RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS
ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS
Noelita Melo de Sousa
PPGMV
Santa Maria, RS, Brasil
2002
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM
RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS
ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS
por
Noelita Melo de Sousa
Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação
em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Fisiopatologia da
Reprodução, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como
requisito parcial para a obtenção do grau de
Doutor em Medicina Veterinária
PPGMV
Santa Maria, RS, Brasil
2002
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Tese de Doutorado
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM
RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPOTEÍNAS
ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS
elaborada por
Noelita Melo de Sousa
Como requisito parcial para a obtenção do grau de
Doutor em Medicina Veterinária
COMISSÃO EXAMINADORA:
__________________________
Dr. José Ricardo de Figueiredo
(Presidente/Orientador)
__________________________
Dr. Paulo Bayard Dias Gonçalves
___________________________
Dr. João Francisco C. de Oliveira
__________________________
Dr. José Carlos Ferrugem Moraes
___________________________
Dr. Carlos Fernando de Mello
Santa Maria, 26 de março de 2002
i
XXXX
Sousa, Noelita Melo.
Purificação,
caracterização
e
dosagem
radioimunológica
de
glicoproteínas associadas à gestação em zebuínos. Santa Maria: UFSM,
2002.
376 p. il.; 290 cm.
Tese (Doutorado) UFSM. CCR
1. Zebu – Reprodução. I. Título
CDD: XXX.XXXXX
© 2002
Todos os direitos autorais reservados a Noelita Melo de Sousa. A reprodução de partes
ou do todo deste trabalho só poderá ser feita com autorização por escrito do autor.
Endereço. Rua Guilherme Rocha, n. 1015, Bairro Centro, Fortaleza, CE, Brasil, CEP
60030-141. Fone/Fax (0xx) 85 2262138; End. Eletr. [email protected]
ii
Não tireis de vosso aprendizado
a conclusão de que sabeis tudo,
mas sim de que vos resta
infinitamente a saber.
(Pascal)
iii
A Deus,
A minha mãe, irmão e amigos
A Jean-Pierre
A Georgette
Dedico
iv
AGRADECIMENTOS
Ao Professor José Ricardo de Figueiredo, pelo apoio incondicional,
pelos inestimáveis conselhos e pela confiança em mim depositada ao longo
dos últimos anos.
Ao Professor Jean-François Beckers, co-promotor deste trabalho, pela
hospitalidade no Serviço de Fisiologia da Reprodução da Universidade de
Liège, Bélgica, e sem o qual não teria sido possível a execução deste
trabalho. A ele, minha mais profunda gratidão pelas críticas sempre
construtivas, pela sua paciência inesgotável e pelos valiosos conselhos
bioquímicos que revelaram em mim o interesse pelo estudo das proteínas
placentárias de ruminantes.
Ao Médico Veterinário Benoît Remy, inestimável amigo, pelos
ensinamentos das técnicas de cromatografia e eletroforese e pelos valiosos
conselhos durante a execução do presente trabalho.
Ao Dr. Jean Closset, do Serviço de Bioquímica do Centro Hospitalar
da Universidade de Liège, pela incansável participação nos seminários que
nos ajudaram a construir o presente projeto de tese.
Ao Dr. Paulo Bayard Dias Gonçalves, co-promotor deste trabalho,
pela sua amável acolhida na Universidade Federal de Santa Maria e pelos
conselhos judiciosos ao longo do doutorado. A ele, minha sincera gratidão
pelo constante encorajamento à realização da tese, em colaboração com a
Universidade de Liège.
Ao Dr. Jairo Pereira Neves, pelos valiosos conselhos em obstetrícia de
ruminantes e pela acolhida na Universidade Federal de Santa Maria.
Ao Dr. Rudi Weiblen, Coordenador do Programa de Pós-Graduação
v
em Medicina Veterinária, pelos constantes e valiosos conselhos que em
muito asseguraram minha estadia na Universidade de Liège.
À Dra. Margot Alves Nunes Dode, pela sua acolhida no Centro
Nacional de Pesquisa de Gado de Corte (CNPGC) de Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) e pelo seu inestimável auxílio nas
fases iniciais de execução do presente trabalho.
Ao Doutor Moussa Zongo, da Universidade de Ouagadogou (BurkinaFaso), pelos valiosa colaboração ao estudo da endocrinologia placentária
em zebuínos.
Aos Doutores Zladislaw Gajewski (Universidade de Agricultura de
Varsovia, Polônia), Alessandro Debenedetti (Universidade de Perúgia,
Itália), Hamidou Hamadou Tamboura (Centro de Pesquisas Agrárias e
Ambientais, Burkina-Faso), Fernando Moreira da Silva (Universidade dos
Açores, Portugal) e Luc Liégeois (Genes Difusion, Douai, França) pela
preciosa colaboração científica e ensinamentos a mim transmitidos.
A todos os amigos, funcionários, estudantes e estagiários do Serviço
de Fisiologia da Reprodução da Universidade de Liège, e em especial a
Bouchra El Amiri, Raja Fares, Nicole Gerardin-Otthiers, Bianca
Carstanjen, Aude-Marie Bestel, Astrid Rutten, Petry Calero, Salima
Charallah, Christine Poullet, Isabelle Moers, Henri Desbuleux, José Sulon,
Jean-Luc Pirson, Claude Ernotte, Zsolt Pérènyi, Aly Karen e Rogélio
Ledezma pela preciosa colaboração durante minha estadia em Liège e pelo
espírito de grupo com que sempre fui acolhida.
Aos colegas, professores e funcionários do Programa de PósGraduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal de Santa
Maria, e em especial a Aura Chaves Rosauro, Silvia Ferreira Carâmbula,
vi
Nilzane Beltrão, Marta Pasin, Patrícia Salla, Daniela dos Santos Brum,
Patrícia Feruzzi e Roselene Ecco, pela amizade e companheirismo que
sempre foram para mim um estímulo à continuação deste trabalho.
Aos colegas, pesquisadores e funcionários do Centro Nacional de
Pesquisa do Gado de Corte, e em especial a Norma Cléa Rodovalho,
Vanessa Gomes Ueno e Paulo Roberto Adona, pela valiosa colaboração na
coleta de placentas e de amostras sangüíneas.
À Coordenação do Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de estudo ao longo do curso.
Ao Fundo Nacional para a Pesquisa Científica e ao Ministério da
Agricultura (Bélgica) pelo suporte financeiro dado à realização do presente
trabalho experimental.
A todos que de uma maneira ou de outra, contribuíram para a
realização deste trabalho. É para mim um dever, mas sobretudo, uma honra
poder agradecer-lhes sinceramente.
vii
SUMÁRIO
Lista de Tabelas.....................…………………………………..…
01
Lista de Figuras…………...…………………………….……..…..
04
Lista de Siglas, Símbolos e Abreviaturas……………………..….
11
Lista de Anexos.………………………………………………..….
16
Lista de Apêndices……………………………………………..….
17
Resumo..……………………………………...………………..…...
19
Abstract..………………………………….…………………..…...
20
Résumé..............................................................................................
21
1. Introdução…….……………………………………….…..……
22
2. Revisão de Literatura……………………………………..……
27
2.1. O gado zebu………………………………................................
27
2.1.1. Origem e diferenças entre gado zebuíno e taurino..................
27
2.1.2. As raças zebuínas.....................................................................
30
2.2. Aspectos gerais da fisiologia reprodutiva de vacas de
origem zebuína............................................................................
32
2.2.1. Origem e desenvolvimento dos folículos ovarianos................
32
2.2.2. Aspectos gerais relacionados ao ciclo estral............................
34
2.2.3. Perfis hormonais durante a gestação........................................
38
2.3. Proteases aspárticas....................................................................
40
2.3.1. Terminologia............................................................................
40
2.3.2. Classificação das proteases......................................................
41
2.3.3. Estrutura das proteases aspárticas……………………...…….
45
2.3.4. Inibição das proteases aspárticas………….............................
47
viii
2.4. As proteínas placentárias............................................................
48
2.4.1. A placenta…………………………….…………..………….
48
2.4.1.1. Tipos de placenta………………………….......…………...
49
2.4.1.2. O placentoma………………………………..……………..
53
2.4.1.3. As células binucleadas………………………..……………
54
2.4.2. Proteínas placentárias………………………..……..………..
57
2.4.2.1. Gonadotrofinas coriônicas (CG)….……….………..……...
59
2.4.2.2. Interferons tau (IFNτ).……………………..…..…...……...
62
2.4.2.3. Fator precoce da gestação (EPF).………....…….…..…......
66
2.4.2.4. Hormônios lactogênios placentários (PL)....………..……..
67
2.4.2.5. Proteínas específicas ou associadas gestação (PAGs)..........
71
a) Família das PAGs bovinas..…..……………………..…..….........
72
b) Família das PAGs ovinas………………………………..…........
84
c) Família das PAGs caprinas…………………………..…..............
85
d) Outras PAGs…………….….………………………..…..............
86
e) Dosagens de PAG..…………..…………………………..............
87
f) Aspectos gerais relativos aos protocolos utilizados para o
isolamento bioquímico e identificação sorológica das PAGs........
94
3. Material e Metodologia...............................................................
101
3.1. Experimento 1 –
Isolamento de glicoproteínas associadas
à gestação.........................................………
101
3.1.1. Protocolo 1……………………………………………..…….
102
3.1.1.1. Determinação da imunorreatividade e da proteína total…...
102
3.1.1.2. Coleta de placentas………….…………...……..………….
102
3.1.1.3. Isolamento da PAG………….…….…………...…..………
103
ix
a) Extração de proteínas solúveis………….…………...…..………
103
b) Precipitação ácida…….……………………….……...…….........
104
c) Precipitações ao sulfato de amônia…….…….…….....………….
105
d) Cromatografia de troca de ânions………….………......………...
106
e) Cromatografia de troca de cátions……………….…..…...….…..
107
3.1.1.4. Caracterização da PAG……………………………..…...…
108
a) Eletroforeses monodimensionais em gel de poliacrilamida
em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D SDS-PAGE)…..…
108
b) Western Blot……………………………………………..…..…..
109
c) Focalização isoelétrica e eletroforese bidimensional em gel
de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio
(2-D SDS-PAGE)……….………………………………..……...
110
d) Análise da seqüência N-terminal…………...................................
111
3.1.2. Protocolo 2…...………….………………………………..….
112
3.1.2.1. Coleta de placentas…….…………………...………......….
112
3.1.2.2. Extração de proteínas solúveis….….………..……..………
113
3.1.2.3. Cromatografia de afinidade…….…………...……..………
114
3.1.2.4. Caracterização da PAG…………………………....……….
114
3.2. Experimento 2 –
Dosagens radioimunológicas da PAG
durante a gestação e período pós-parto
em fêmeas zebu………………………..….
115
3.2.1. Animais……………………………………………..………..
115
3.2.2. Amostras de sangue…………………………………..……...
115
3.2.3. Reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA…………..…...
116
3.2.4. Metodologia utilizada para as dosagens PAG-RIA.................
118
3.2.5. Características das dosagens PAG-RIA..................................
120
x
3.2.6. Análise estatística....................................................................
120
4. Resultados.....................................................................................
122
4.1. Experimento 1 –
Purificação de glicoproteínas associadas à
gestação.......................................……...…..
122
4.1.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias
de troca de íons (Protocolo 1)…………………………..……
122
4.1.2. Análise da sequência N-terminal das proteínas
imunoreativas isoladas com o auxílio de cromatografias
de troca de íons (Protocolo 1)..................................................
129
4.1.3. Caracterização da PAG identificada após a realização
de cromatografias de afinidade em gel de pepstatina
A-agarose (Protocolo 2)……...................................................
4.2. Experimento 2 –
131
Dosagens rádio-imunológicas da PAG
(PAG-RIA) durante a gestação e período
pós-parto em fêmeas zebu…………..…….
135
4.2.1. Características das dosagens PAG-RIA…...............…..……..
135
4.2.2. Perfis de PAG em vacas Azawak…..…………………..……
137
4.2.3. Perfil atípico de PAG.....................……………………..……
138
5. Discussão.......................................................................................
141
5.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de
troca de íons................................................................................
141
5.2. Caracterização da PAG identificada após a realização
de cromatografia de afinidade em gel de pepstatina
A-agarose....................................................................................
145
5.3. Dosagens radioimunológicas da PAG durante a gestação
e período pós-parto em fêmeas zebu..........................................
148
xi
6. Conclusão......................................................................................
154
7. Referências Bibliográficas...........................................................
155
xii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio
catalítico de diversas proteases aspárticas. Estão indicados (inclusos
em retângulos) os aminoácidos que diferem da seqüência normal
encontrada nos pepsinogênios A e C. Informações sobre as
seqüências de aminoácidos foram obtidas no banco de dados
GenBank...............................................................................................
45
TABELA 2 - Classificação das placentas em diferentes espécies
mamíferas.............................................................................................
50
TABELA 3 - Identificação de proteínas específicas ou associadas à
gestação em mamíferos euterianos.......................................................
73
TABELA 4 - Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio
catalítico de diversas PAGs. Estão indicados (inclusos em
retângulos) os aminoácidos que diferem da seqüência normal
encontrada em proteases enzimaticamente ativas tais como o
pepsinogênio. Informações sobre as seqüências de aminoácidos
foram obtidas do banco de dados GenBank.........................................
78
1
TABELA 5 - Seqüência N-terminal das principais formas de PAG
identificadas até o presente. Com exceção da boPAG-1, todas as
seqüências foram deduzidas a partir do ARN mensageiro ou do
ADN codificante obtidos por biologia molecular................................
81
TABELA 6 - Recuperação de proteínas imunoreativas à PAG e de
proteínas totais (PT) obtidas após diferentes etapas de extração e
precipitação..........................................................................................
122
TABELA 7 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de
proteínas totais (PT) mensuradas após eluição na coluna de
Sephadex A25......................................................................................
123
TABELA 8 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de
proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM
Cerâmica das frações DEAE 0 M e 0,02 M NaCl................................
124
TABELA 9 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de
proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM
Cerâmica das frações DEAE 0,04 M e 0,08 M NaCl...........................
125
TABELA 10 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de
proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM
Cerâmica das frações DEAE 0,16 M e 0,32 M NaCl...........................
126
TABELA 11 - Características eletroforéticas e identidade ao nível
de seqüência N-terminal das proteínas mais imunoreativas isoladas
pela cromatografia em resina CM cerâmica.........................................
129
TABELA 12 - Características dos sistemas RIA com e sem etapa de
pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI) utilizados para mensurar as
2
concentrações de PAG presentes em amostras de plasma de fêmeas
zebu gestantes...........................................................................................
135
TABELA 13 - Coeficientes de variação (CV) intra-ensaio e interensaio dos sistemas de dosagem com e sem etapa de pré-incubação
(RIA-PI e RIA-SPI)..................................................................................
136
3
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Árvore filogenética das principais espécies de Bovidae
identificadas até o presente. Entre parênteses constam o nome dado
à espécie domesticada. ✝Espécie extinta. Adaptado de PAYNE
(1991)...................................................................................................
28
FIGURA 2 - Representação esquemática das alterações das
concentrações hormonais durante o ciclo estral de bovinos.
Adaptado de PETERS & LAMMING (1983)......................................
36
FIGURA 3 - Concentração de 17-β-estradiol plasmático durante a
gestação em vacas zebuínas com gestações simples (-▼-▼-) e
gemelares (-▲-▲-). Adaptado de SHELTON & SUMMERS (1983)....
39
FIGURA 4 – Concentração plasmática de progesterona durante a
gestação em vacas zebuínas. Adaptado de MUKASA-MUGERWA
& TEGEGNE (1989)............................................................................
40
FIGURA 5 - Representação da distribuição de resíduos hidrófobos
ao nível do sítio catalítico do pepsinogênio suíno. As cadeias laterais
Asp e Glu estão representadas pela cor preta. Os resíduos
4
hidrófobos, assim como os resíduos Ser, Tre, Asn e Gln estão
representados pela cor cinza escura. Os resíduos situados fora do
centro catalítico estão representados pela cor cinza clara. Adaptado
de DUNN et al. (1995).........................................................................
46
FIGURA 6 - Placenta cotiledonária de bovinos no segundo trimestre
de gestação. Notar os cotilédones fetais em toda a extensão da
placenta................................................................................................
52
FIGURA 7 - Diagrama esquemático da migração das células
binucleadas em bovinos. 1) Células binucleadas no lado fetal; 2)
Contato com a junção microvilositária; 3) Fusão com células fetais,
dando origem a células trinucleadas de vida curta; 4) Exocitose dos
grânulos; 5) Células após exocitose, com citoplasma reduzido e
núcleo denso e 6) Células reabsorvidas pelo trofectoderme.
Adaptado de WOODING & WATHES (1980)...................................
56
FIGURA 8 - Micrografia eletrônica do placentoma de vacas no 150o
dia de gestação fixadas em araldite. Os grânulos secretórios foram
corados pelo ácido fosfotungstico. A interrupção da junção
microvilositária entre o trofoectoderma (T) e o epitélio uterino (U) é
indicada por flechas. A) Migração das células trofoblásticas
binucleadas em direção à junção microvilositária; B) Célula
binucleada logo após sua fusão com uma célula epitelial uterina
(indicada por asterisco); C) Célula trinucleada no epitélio uterino.
Adaptado de WOODING & BECKERS (1987)..................................
58
FIGURA 9 - Perfil das concentrações plasmáticas do hormônio
lactogênio placentário bovino dosado na circulação materna e fetal.
5
Adaptado de BECKERS et al. (1982)..................................................
70
FIGURA 10 - Seqüência de aminoácidos da boPAG-1 deduzida a
partir da seqüência em ADN por XIE et al. (1991). Estão indicados
as seqüências sinal, o propeptídeo, a extremidade N-terminal (20
aminoácidos) assim como a cadeia madura. As flechas indicam o
final do segmento sinal e do propeptídeo. Os sítios catalíticos
encontram-se circundados. Sítios potenciais de glicosilação são
indicados por asteriscos........................................................................
76
FIGURA 11 - A) Representação da estrutura cristalizada da boPAG1. B) Estrutura tridimensional atribuída à PAG acoplada à pepstatina
A (situada entre P3’ e P4’). Adaptado de GREEN et al.
(1998)...................................................................................................
77
FIGURA 12 - Filograma baseado na seqüência de aminoácidos
mostrando o relacionamento entre todas as PAGs clonadas até o
momento, assim como o de algumas proteinases aspárticas presentes
em mamíferos. Adaptado de GREEN et al. (2000)..............................
82
FIGURA 13 - Variação cronológica do ADN complementar das
PAGs em bovinos (boPAGs) e ovinos (ovPAGs) ao longo da
gestação. Adaptado de GREEN et al. (2000).......................................
83
FIGURA 14 - Expressão do ADN codificante para as PAGs bovinas
e ovinas identificadas até o presente. As PAGs expressas
predominantemente em células binucleadas correspondem a
proteínas estreitamente relacionadas. As PAGs expressas de modo
difuso no trofectoderme representam os mais antigos membros desta
família de proteases aspárticas. Adaptado de GREEN et al.
6
(2000)...................................................................................................
84
FIGURA 15 - Perfil das concentrações de PAG (média ± DP)
calculados no soro de 20 vacas coletadas do 20o dia de gestação ao
100o dia após o parto. Utilizou-se escala aritmética das
concentrações de PAG do 20o ao 220o dia de gestação (A) e escala
logarítmica do 40o dia antes do parto ao 80o dia após o parto (B).
Adaptado de ZOLI et al. (1992a).........................................................
89
FIGURA 16 - A) Schistosomus reflexus bovino; B) Concentrações
de boPAG-1 observadas no caso de Schistosomus reflexus (-▲-▲-)
e de gestações normais (-×-×-). Adaptado de ECTORS et al.
(1996a).................................................................................................
91
FIGURA 17 - Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-●-●-) e P4
(-▲-▲-) em 4 vacas nas quais o diagnóstico de gestação
inicialmente positivo (P) por ultrasonografia foi seguido de um
diagnóstico negativo (N) por ultrasonografia ou pela observação
direta da morte fetal (MF). Adaptado de SZENCI et al. (1998a)........
93
FIGURA 18 - Características da matriz associada à pepstatina A,
utilizada para a purificação de proteases aspárticas.............................
97
FIGURA 19 - Esquema de purificação (fracionamento) da PAG
extraída a partir de placentas zebuínas com o auxílio de
cromatografias de trocas de íons..........................................................
103
FIGURA 20 - Esquema de purificação da PAG extraída a partir de
placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de afinidade.......
113
FIGURA 21 - Perfis cromatográficos das frações DEAE 0 M a 0,32
7
M NaCl submetidas a FPLC em coluna CM cerâmica. A coluna (1 x
3 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de amônia a
10 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. As áreas
hachuradas indicam as frações mais imunoreativas de cada
cromatografia. As percentagens indicam a proporção entre PAG e
proteína total (PT)................................................................................
127
FIGURA 22 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12%) após
coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas
imunoreativas por meio de Western Blot com o uso do AS497 (antiboPAG67). As pistas 1, 2, 3, 4 and 5 correspondem aos piques mais
imunoreativos obtidos após cromatografia em resina CM cerâmica
das frações DEAE 0, 0,02, 0,04, 0,08 e 0,16 M NaCl. Vinte
microgramas de proteínas de cada pique foram carregadas. As
massas moleculares (x 10-3) estão indicadas nos lados esquerdo e
direito das Figuras 22A e 22B, respectivamente..................................
128
FIGURA 23 - 2-D SDS-PAGE do pique mais imunoreativo obtido
após cromatografia em resina CM Cerâmica da fração DEAE 0,32
M NaCl. As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas no lado
direito da figura. A escala de pH está indicada na parte superior do
gel. As setas indicam as diferentes isoformas (6,4, 6,3, 6,1 e 5,8) da
alfa-N-acetilgalactosaminidase............................................................
130
FIGURA 24 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina Aagarose. A extração das placentas coletadas entre 20 e 21 semanas
de gestação foi feita em pH ácido (KCl a 0,3 M, pH 5,0). A coluna
(1,6 x 4 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de sódio
8
50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A área
hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem indica
a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme determinado
por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT)....................................
131
FIGURE 25 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12%) após
coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas
imunoreativas por meio de Western Blot com o uso dos anti-soros
anti-boPAG67 (AS497), anti-caPAG55+62 (R706) and caPAG55+59
(R708). As pistas 1 e 2 correspondem aos piques mais
imunoreativos obtidos após cromatografia em pepstatina A-agarose
após extração em pH ácido e alcalino, respectivamente. Sessenta
microgramas das proteínas imunoreativas de cada pique foram
carregadas. As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas nos
lados esquerdo e direito das Figuras 25A e 25B, respectivamente......
132
FIGURA 26 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina Aagarose. A extração das placentas coletadas entre 10 e 11 semanas
de gestação foi feita em pH alcalino (tampão bicarbonato de amônia
a 0,05 M, pH 8,5). A coluna (1 x 4 cm) foi previamente equilibrada
em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o
gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais
imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e
proteína total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo
método de Lowry (PT).........................................................................
134
FIGURA 27 - Curvas padrão (média ± DP) da dosagem de PAG nos
sistemas de dosagem com etapa de pré-incubação (-▼-▼-) e sem
9
etapa de pré-incubação (-▲-▲-). Função B/B0 do logaritmo das
concentrações de PAG.........................................................................
136
FIGURA 28 - Concentrações plasmáticas de PAG (média ± DP)
durante a gestação e período pós-parto em 10 fêmeas zebu da raça
Azawak. A 40a semana de gestação corresponde à semana do parto
(0pp). Diferenças significantes entre as semanas de gestação estão
indicadas por asteriscos (*P<0,0001, **P<0,05).................................
138
FIGURA 29 - Curvas de regressão das concentrações plasmáticas de
PAG mensuradas entre a parturição e a 10a semana pós-parto. As
concentrações de PAG nas vacas Azawak que apresentaram
concentrações normais de PAG (n = 10) foram representadas por
círculos (●). As amostras da vaca zebu a qual apresentou altas
concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao final
da gestação foram representadas por quadrados (■)...........................
139
FIGURA 30 - Comparação dos perfis de PAG entre vacas Azawak
apresentando gestações normais (população homogênea) e a vaca
que apresentou altas concentrações de PAG durante a gestação e um
baixo BCS ao final da gestação............................................................
140
10
LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
aa
ADN
Ag°
Ag*
APP
:
:
:
:
:
AS
α-GalNAc
b ou bo
B
BACE
BCS
B0
BSA
c ou ca
°C
CATD
CATE
cf
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
aminoácido
ácido desoxirribonucléico
antígeno frio ou não-marcado
antígeno quente ou marcado
amyloid protein precursor ou proteína precursora de
amilóide
anti-soro
alfa n-acetilgalactosaminidase
bovino(a)
binding ou ligação
beta-secretase
escore de condição corporal
tubo branco ou sem PAG
albumina sérica bovina
caprino(a)
graus Celsius
catepsina D
catepsina E
conferir
11
CG
CHYM
cm
CM
CS
CV
d
DEAE
DP
DTT
e ou eq
EDTA
EPF
fe
FPLC
FSH
g
GLM
GH
h
125
I
IA
IFNτ
Ig
l
kDa
LH
M
mA
: chorionic gonadotrophin, gonadotrofina coriônica
ou hormônio coriônico somatomamotrófico
: quimosina
: centímetro
: carboximetil
: chorionic somatomammotrophin ou
somatomamotrofina coriônica
: coeficiente de variação
: dia, exceto quando se refere a dalton
: dietilaminoetano
: desvio padrão
: ditiotreitol
: equino(a)
: ácido etilenodiaminotetracético
: early pregnancy factor ou fator precoce da gestação
: felino
: fast flow liquid chromatography
: hormônio folículo estimulante
: grama, exceto quando se refere à aceleração
: General Linear Model
: hormônio do crescimento ou hormônio somatotrófico
: hora, exceto quando se refere à humano
: isótopo radioativo iodo 125
: inseminação artificial
: interferon tau
: imunoglobulina
: litro
: quilodalton
: hormônio luteinizante
: molar
: miliampéres
12
MAF
MF
mg
min
ml
mm
mM
MM
mt
µg
µl
µm
n
ng
NSB
N-terminal
o ou ov
p ou po
PAG
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
PAS
PAGE
PEP
PEPC
pg
PGE
PGF2α
pH
pI
PI
PL
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
fator ativador de macrófagos
mortalidade fetal
miligrama
minuto
mililitro
milímetro
milimolar
massa molecular
mitocondrial
micrograma
microlitro
micrômetro
número
nanograma
non-specific binding ou atividade não-específica
aminoterminal
ovino(a)
porcino(a)
pregnancy-associated glycoprotein ou glicoproteína
associada à gestação
ácido periódico de Schiff
eletroforese sobre gel de poliacrilamida
pepsinogênio
pepsinogênio C ou progastricsina
picograma
prostaglantina E
prostaglandina F2α
potencial hidrogeniônico
ponto isoelétrico
pré-incubação
placental lactogen ou hormônio lactogênio placentário
13
PMSF
PMSG
PRL
PSPA
PSPB
PSP-60
PT
PVDF
P4
RENI
RIA
S.A.
SAS
SBU-3
SBI
SDS
SF
SPI
TBS
Tc
Tris
ze
: fenil-metilsulfonilfluoridro
: pregnant mare’s serum gonadotrophin ou
gonadotrofina sérica da égua prenhe
: prolactina
: pregnancy-associated protein A ou alfa-fetoproteína
: pregnancy-associated protein B ou proteína específica
da gestação B
: pregnancy serum protein 60 ou proteína sérica da
gestação 60
: proteína total
: polivinilideno difluoridro
: progesterona
: renina
: radioimunoensaio
: sulfato de amônia
: Statistical Analysis System
: antígeno SBU-3
: soy bean trypsin
: dodecil sulfato de sódio
: serum free ou soro em PAG
: sem pré-incubação
: tampão tris salino
: total counting ou atividade total
: tris-hidroximetil aminometano
: zebra
14
Abreviação dos aminoácidos:
Código 1 letra
Código 3 letras
Aminoácido correspondente
A
Ala
: alanina
B
Asx
: aspartato ou asparagina
C
Cis
: cisteína
D
Asp
: aspartato ou ácido aspártico
E
Glu
: ácido glutâmico
F
Fen
: fenilalanina
G
Gli
: glicina
H
His
: histidina
I
Ile
: isoleucina
K
Lis
: lisina
L
Leu
: leucina
M
Met
: metionina
N
Asn
: asparagina
P
Pro
: prolina
Q
Gln
: glutamina ou glutamida
R
Arg
: arginina
S
Ser
: serina
T
Tre
: treonina
V
Val
: valina
W
Trp
: triptofano
Y
Tir
: tirosina
Z
Glx
: glutamato ou glutamina
15
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A – Dosagem da PAG por radioimunoensaio (RIA)........
201
ANEXO B - Método Lowry para a dosagem de proteínas..............
208
ANEXO C - Eletroforese monodimensional em gel de
poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D
PAGE SDS)………………………….…………………….............
210
ANEXO D – Técnica de Western Blot……………..…...…...........
214
ANEXO E – Isofocalização e eletroforese bidimendional (2-D
PAGE-SDS)………………………………….........……………....
218
16
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice 1 - Capítulo de Livro Publicado
SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. (2001)
Placental Proteins of Ruminants: biochemical, physiological and
zootechnical aspects. In: Renaville, R. e Burny, A. (eds.),
Biotechnology in Animal Husbandry, Ed. Kluwer Academic
Publishers, Hardbound, Netherlands, pp. 179-208. (Capítulo de
Livro)………………………………………….………………….
222
Apêndice 2 - Artigo Completo em Anais
SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R.; EL AMIRI, B.; BANGAMBOKO, H.; SZENCI, O. & BECKERS J.F. (2001) Chorioví
gonadotropin a specifický glykoprotein u březích přežvýkavcŭ
(Chorionic
gonadotropins
and
pregnancy-associated
glycoproteins in ruminants). 3rd Central European Buiatric
Congress, 24 e 25 de Maio, Moravian Highlands, República
Tcheca, p. 430-432. (Conferência)…………………..…………...
277
17
Apêndice 3 - Artigo de Revisão (submetido)
MOREIRA DA SILVA, F.; SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R.
& BECKERS, J.F. Proteínas placentais secretadas na circulação
materna: auxílio ao diagnóstico de gestação e ao estudo da
mortalidade embrionária em bovinos (Placental proteins secreted
in maternal circulation: useful indicators for both pregnancy
diagnosis and embryonic mortality in bovine species). (artigo de
revisão submetido à Revista Portuguesa de Zootecnia)………..
285
Apêndice 4 - Artigo Aceito
SOUSA, N.M.; REMY, B.; EL AMIRI, B.; BANGA-MBOKO,
H.; FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. Characterization of
Pregnancy-Associated Glycoproteins extracted from zebu (Bos
indicus) placentas removed at different gestational ages. (aceito
por Reproduction, Nutrition, Development)……...............…...
318
Apêndice 5 - Artigo Submetido
SOUSA, N.M.; ZONGO, M.; PITALA, W.; BOLY, H.;
SAWADOGO, L.; SANON, M.G.; FIGUEIREDO, J.R.;
GONÇALVES, P.B.D.; EL AMIRI, B.; PERÈNYI, Z. &
BECKERS,
J.F.
Pregnancy-Associated
Glycoprotein
concentrations during pregnancy and postpartum period in
Azawak zebu cattle. (submetido à Theriogenology)…………….
348
Apêndice 6 - Resumos e Outros………………..……………....
370
18
RESUMO
Tese de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE
GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃOEM ZEBUÍNOS
Autora: Noelita Melo de Sousa
Orientador: José Ricardo de Figueiredo
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 26 de março de 2002.
As glicoproteínas associadas à gestação (PAGs) constituem uma extensa família de proteases
aspárticas expressas na camada celular externa da placenta de artiodáctilos. Na primeira parte do
presente trabalho, dois procedimentos bioquímicos foram usados para caracterizar as PAGs
isoladas a partir de cotilédones fetais zebuínos (Bos indicus). O primeiro protocolo, usado para
isolar as PAGs de placentas coletadas no último trimestre de gestação, incluiu a extração de
proteínas em pH neutro, precipitação ácida, precipitações em sulfato de amônia, cromatografias
de troca de ânions e de cátions. O segundo protocolo, usado para isolar a PAG a partir de
placentas coletadas ao primeiro e segundo trimestres de gestação, incluiu a extração de proteínas
em pH ácido e alcalino, seguida por cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose.
O radioimunoensaio utilizado para a dosagem da PAG taurina foi empregado para monitorar a
imunoreatividade ao longo do procedimento de isolamento. As frações resultantes das
cromatografias de troca de cátions e de afinidade foram analisadas por eletroforese e Western
Blot, antes de serem transferidas à membranas de polivinilideno difluoridro para a determinação
da seqüência de aminoácidos N-terminal. Diferentes isoformas de PAG, com massas
moleculares de 51 a 69 kDa e pIs de 3,1 a 6,7, foram identificadas em placentas de zebuínos. As
proteínas imunoreativas resultantes da cromatografia de troca de cátions das frações DEAE 0 M
a 0,16 M NaCl revelaram a existência de uma única seqüência N-terminal (entre 10 a 25
aminoácidos de comprimento), a qual é idêntica à seqüência da boPAG-1. A mesma seqüência
(14 aminoácidos) foi encontrada após cromatografia de afinidade. Estes resultados indicaram a
expressão de uma única seqüência N-terminal de PAG em placentas de zebuínos coletadas em
diferentes estádios gestacionais. Na segunda parte do presente trabalho, dois sistemas
radioimunológicos foram usados para determinar as concentrações plasmáticas de PAG durante
a gestação e período pós-parto em vacas zebus da raça Azawak. Doze fêmeas diagnosticadas
como gestantes por palpação retal tiveram amostras de sangue coletadas a intervalos de 5 a 10
dias. As coletas foram feitas aproximadamente entre a 8a semana de gestação e a 10a semana
pós-parto. Uma vaca inicialmente diagnosticada como gestante mostrou concentrações de PAG
inferiores à sensibilidade do teste (<0,20 ng/ml) e não pariu. Outra vaca mostrou concentrações
de PAG anormalmente elevadas durante a gestação, sendo excluída do perfil normal de PAG.
As outras 10 vacas diagnosticadas como gestantes apresentaram perfis de PAG bastante
homogêneos. Nestes animais, as concentrações aumentaram progressivamente da 8a à 35a
semanas de gestação (de 6,0±4,2 ng/ml a 196,0±34,8 ng/ml), permanecendo relativamente
constantes até a 39a semana (210,8±74,8 ng/ml). Durante a última semana de gestação, as
concentrações de PAG aumentaram significativamente (P<0,0001), sendo alcançadas os mais
altos níveis (1.095,6±607,2 ng/ml). Após o parto, as concentrações de PAG diminuíram
significativamente (P<0,05) até a 2a semana pós-parto (384,4±85,6 ng/ml) e após lentamente até
a 10a semana. Estes resultados demonstraram que as concentrações plasmáticas de PAG em
zebuínos foram inferiores às previamente observadas em raças taurinas entre a 35a e a 39a
semanas de gestação.
19
ABSTRACT
Tese de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE
GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS
(Purification, Characterization and Radioimmunoassay of Pregnancy-Associated
Glycoproteins Isolated from Zebu Cattle)
Autora: Noelita Melo de Sousa
Orientador: José Ricardo de Figueiredo
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 26 de março de 2002.
The pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) constitute a large family of aspartic
proteinases expressed in the outer epithelial cell layer of the Artyodactyla placenta. In the first
part of the present work, two biochemical approaches were used to characterize PAGs isolated
from zebu (Bos indicus) fetal cotyledons. The first procedure, used to isolate PAG from zebu
placenta removed late in pregnancy, included extraction of proteins at neutral pH, acidic and
ammonium sulfate precipitations, anion and cation exchange chromatographies. The second
procedure, used to investigate PAG in placentas removed at early and mid gestational periods,
included protein extractions at acid or alkaline pH followed by pepstatin-A agarose affinity
chromatography. A bovine PAG radioimmunoassay was used to monitor the immunoreactivity
throughout the isolation procedures. The most immunoreactive fractions issued from cation
exchange and affinity chromatographies were analyzed by SDS-PAGE and Western Blot, before
transfer to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane for NH2-microsequence determination.
By use of SDS-PAGE and Western Blot, different isoforms of PAG with apparent molecular
masses from 51 to 69 kDa and isoeletric points varying from 3.1 to 6.7 were identified in
placentas from different gestational ages. After CM ceramic chromatography of all except 0.32
M NaCl DEAE fraction, the most immunoreactive proteins revealed N-terminal amino acid
sequences (10 to 25 aa long) which were 100% identical to bovine PAG-1. The same sequence
(14 aa long) was found after pepstatin-agarose affinity chromatography of proteins extracted
from placentas removed earlier in pregnancy. These results converged towards the expression of
one major N-terminal PAG amino acid sequence in zebu placentas at different gestational ages.
In the second part of this study, two specific RIA systems were developed then used to measure
plasmatic PAG concentrations during gestation and postpartum period in Azawak zebu cows.
Twelve females palpated per rectum and diagnosed as pregnant were bled at 5-10 days interval
approximately from Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). One zebu cow initially
diagnosed as pregnant showed PAG concentrations lower than the assay sensitivity (<0.20
ng/ml) and did not calve. Another cow showed abnormally high PAG concentrations during
gestation, being excluded from the general PAG profile. The 10 other zebu cows gave a very
homogeneous PAG profile. In these animals, concentrations increased progressively from Week 8
to Week 35 of gestation (from 6.0±4.2 to 196.0±34.8 ng/ml), remaining relatively constant until
Week 39 (210.8±74.8 ng/ml), when they increased sharply to reach their highest level
(1,095.6±607.2 ng/ml) at parturition. After delivery, PAG concentrations declined significantly
(P<0.05) till the Week 2 postpartum (348.4 ± 85.6 ng/ml) and slowly till the Week 10 postpartum.
These results revealed that PAG concentrations in zebu cattle were lower than those previously
described in taurine breeds between week 35 and 39 of gestation.
20
RESUME
Tese de Doutorado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE
GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS
(Purification, Caractérisation et Dosage Radioimmunologique des Protéines
Associées à la Gestation du Bétail Zébu)
Autora: Noelita Melo de Sousa
Orientador: José Ricardo de Figueiredo
Data e Local da Defesa: Santa Maria, 26 de março de 2002.
Les protéines associées à la gestation (PAGs) constituent une grande famille de protéinases
aspartiques exprimées dans les cellules épithéliales de la couche superficielle du placenta des
artiodactyles. Dans la première partie du présent travail, deux approches biochimiques ont été
utilisées pour caractériser les PAGs isolées à partir de cotylédons fœtaux recueillis à différents
stades gestationnels chez le zébu (Bos indicus). Le premier procédé impliquait des précipitations
acides et au sulfate d’ammonium et des chromatographies par échange d’anion et de cation
tandis que le second reposait sur l’utilisation d’une chromatographie d’affinité de pepstatine-A
agarose. Un dosage radioimmunologique était utilisé pour suivre l’immunoréactivité des
fractions au cours des différentes étapes de purification. Les fractions les plus immunoréactives
issues des chromatographies par échange d’ion et affinité ont été analysées par électrophorèse
en SDS et Western Blot avant transfert sur membrane de polyvinylidene difluoride (PVDF)
pour micro séquençage de la partie N-terminale. Différentes isoformes de PAG avec masses
moléculaires apparentes allant de 51 à 69 kDa et de points isoélectriques compris entre 3,1 et
6,7 ont été identifiées à partir des placentas recueillis aux différentes époques gestationnelles.
Après cromatographie par échange de cations, (fractions DEAE 0 M à 0,16 M NaCl) le
microséquençage de la partie N-terminale (10 à 25 acides aminés) a indiqué l’expression d’une
seule séquence N-terminale correspondant à celle décrite pour la PAG-1 de Bos taurus. La
même séquence (14 acides aminés) a été obtenue après microséquençage de la partie Nterminale des protéines issues de cromatographies d’affinité. Dans la seconde partie de cette
étude, deux systèmes de dosages radioimmunologiques spécifiques ont été développés et utilisés
pour mesurer les concentrations plasmatiques de protéines associées à la gestation durant la
gravidité et la période post partum chez les vaches Zébu Azawak. Douze femelles testées par
palpation rectale et diagnostiquées comme gestantes ont subi des saignées à intervalles de 5 à 10
jours approximativement à partir de la 8e semaine de gestation jusqu’à la 10e semaine post
partum. Une vache zébu diagnostiquée au départ comme gestante a montré des concentrations
inférieures à la sensibilité du dosage (<0,20 ng/ml) et n’a pas vêlé. Une autre vache a montré
des concentrations de PAG anormalement élevées durant la gestation, étant de ce fait
statistiquement exclue du profil général de la concentration de PAG au cours de la gestation.
Les dix autres vaches ont donné un profil très homogène. Chez ces animaux, les concentrations
augmentaient progressivement à partir de la 8e semaine jusqu’à la 35e semaine (de 6,0±4,2 à
196,0±34,8 ng/ml), restaient ensuite relativement constantes jusqu’à la 39e semaine (210,8±74,8
ng/ml) époque à laquelle elles augmentaient rapidement pour atteindre leur valeur la plus élevée
(1.095,6±607,2 ng/ml) au moment de la parturition. Après la délivrance, les concentrations de
PAG déclinaient significativement (P<0,05) jusqu’à la 2e semaine post partum. Globalement,
nos résultats ont montré que les concentrations de PAG chez les zébus étaient inférieurs à celles
des races taurines entre la 35e et 39e semaines de gestation.
21
1. INTRODUÇÃO
O gado zebu (Bos indicus) é uma importante fonte de proteína animal
em países em vias de desenvolvimento situados nos continentes africano e
americano (CUNNINGHAM, 1992). Quando comparado ao gado taurino
(Bos taurus), ele apresenta uma notável adaptação ao clima árido ou semiárido, sendo mais eficaz quanto à extração de nutrientes de forragens de
qualidade inferior (BARTLE et al., 1994) e mostrando uma notável
habilidade para suportar altas temperaturas (CARVALHO et al., 1995;
GAUGHAN et al., 1999). Algumas diferenças genéticas, bioquímicas e
reprodutivas entre gado zebuíno (identidade taxonômica 9915) e taurino
(identidade taxonômica 9913) já foram relatadas (QUEVAL et al., 1998;
BAKER & MANWELL, 1980; PINHEIRO et al., 1998). Entretanto,
devido à escassez de estudos realizados em zebuínos, a maior parte de suas
particularidades reprodutivas continua ainda por ser esclarecida.
Durante as últimas décadas, diversas equipes vêm realizando trabalhos
relacionados ao isolamento e à caracterização de hormônios e proteínas
sintetizados pela placenta de espécies ruminantes, o que resultou na
descoberta de numerosas famílias de proteínas, dentre as quais merecem ser
citados os interferons tau (IFNτ), os hormônios lactogênios placentários
(PL) e, mais recentemente, as glicoproteínas associadas à gestação (PAGs).
As PAGs, também conhecidas por diversos outros nomes como
proteína específica da gestação B (PSPB) (BUTLER et al., 1982), antígeno
SBU-3 (GOGOLIN-EWENS et al., 1986) e proteína sérica da gestação 60
kDa (PSP-60) (MIALON et al., 1993) foram inicialmente descritas como
antígenos placentários, detectáveis no sangue materno de bovinos logo
22
após o início da implantação (BUTLER et al., 1982). Elas foram
inicialmente purificadas a partir da placenta de raças taurinas (BUTLER et
al., 1982; CAMOUS et al., 1988; ZOLI et al., 1991), tendo sido
posteriormente isoladas a partir de placentas de ovinos (ZOLI et al., 1995;
XIE et al., 1997a), caprinos (GARBAYO et al., 1998) e cervídeos
(HUANG et al., 1999).
Até o presente, como resultado do uso de técnicas de biologia
molecular, foram identificados 21 ADNs codificantes para diferentes PAGs
em bovinos (XIE et al., 1991; XIE et al., 1994; XIE et al., 1997b; GREEN
et al., 2000). Entretanto, apesar desta multiplicidade de genes, somente
foram identificadas por procedimentos bioquímicos duas formas principais
de PAG: a PAG-1 bovina (boPAG-1 ou boPAG67) (BUTLER et al., 1982;
CAMOUS et al., 1988; ZOLI et al., 1991) e a PAG-2 bovina (boPAG-2). A
boPAG-1 foi purificada e inicialmente caracterizada em sua seqüência Nterminal por ZOLI et al. (1991). Ela foi identificada por XIE et al. (1991)
como um membro enzimaticamente inativo pertencente à família das
proteases aspárticas. A boPAG-2 não foi purificada até a homogeneidade,
tendo sido apenas identificada em tentativas de se purificar uma
gonadotrofina coriônica (CG), a partir de placentas de bovinos (BECKERS
et al., 1988).
No que se refere especificamente à boPAG-1, as metodologias
empregadas por BUTLER et al. (1982) e ZOLI et al. (1991) para a sua
purificação foram bastante similares, baseando-se inicialmente na produção
de anti-soros de primeira geração produzidos contra extratos placentários
de raças taurinas. Após a eliminação de proteínas já conhecidas, tais como
a albumina sérica (BSA), a hemoglobina, o hormônio lactogênio
23
placentário e as imunoglobulinas, estes anti-soros foram absorvidos contra
extratos de tecidos presentes em vacas não-gestantes, sendo usados para o
monitoramento das frações mais imunoreativas obtidas ao longo dos
protocolos de purificação.
O uso dos anti-soros de primeira geração produzidos por BUTLER et
al. (1982) em técnicas de imuno-eletroforese permitiu a identificação de
duas proteínas imunoreativas: a primeira correspondendo à alfafetoproteína e a segunda à uma proteína até então desconhecida,
denominada proteína específica da gestação (BUTLER et al., 1982).
Posteriormente, o uso de um anti-soro produzido de maneira semelhante
por ZOLI et al. (1991) permitiu o monitoramento das frações mais
imunoreativas obtidas ao longo do protocolo de purificação, tendo, neste
caso, sido caracterizada apenas a fração mais imunoreativa obtida ao final
do fracionamento de proteínas, a qual foi denominada de glicoproteína
associada à gestação ou PAG. Mais recentemente, a análise de um maior
número de frações imunoreativas mostrou a existência de diferentes formas
de PAGs em extratos cotiledonários de ovinos e caprinos (XIE et al.,
1997a; GARBAYO et al., 1998). Entretanto, até o presente, não foi feita
uma análise detalhada das frações imunoreativas presentes na placenta de
bovinos.
O isolamento de diferentes formas de PAGs em bovinos, ovinos e
caprinos
têm
possibilitado
o
desenvolvimento
de
dosagens
radioimunológicas, as quais têm permitido a caracterização do perfil desta
proteína durante a gestação em diversas espécies de ruminantes. Durante
gestações
normais,
as
concentrações
de
PAG
podem
diferir
consideravelmente entre as espécies e os períodos de gestação (ZOLI et al.,
24
1992a; RANILLA et al., 1994; SOUSA et al., 1999). Em uma mesma
espécie, elas podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre os quais
podem ser citados a raça da fêmea (MIALON et al., 1993; RANILLA et al.,
1994) e o estado nutricional materno (WALLACE et al., 1997a). As
concentrações de PAG parecem também diferir de acordo com o sistema
radioimunológico utilizado, diferença esta resultando provavelmente da
especificidade do anti-soro (GONZALEZ et al., 1999,2000).
Perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG já foram descritos em
taurinos (ZOLI et al., 1992a; DOBSON et al., 1993), em caprinos (SOUSA
et al., 1999; GONZÁLEZ et al., 2000) e em ovinos (RANILLA et al.,
1994; GAJEWSKI et al., 1999). Entretanto, ao nosso conhecimento, perfis
de PAG nunca foram descritos em fêmeas de origem zebuína.
Levando em consideração a ausência de informações sobre as
características bioquímicas da(s) PAG(s) existente(s) na placenta de raças
zebuínas, bem como a inexistência de dados sobre os perfis plasmáticos
desta proteína ao longo da gestação e período pós-parto neste taxa,
tornaram-se objetivos principais do presente trabalho:
1) Isolar e caracterizar, em termos de massa molecular, ponto
isoelétrico e seqüência N-terminal, as proteínas apresentando
imunoreatividade à PAG, extraídas a partir de cotilédones fetais de
fêmeas zebuínas. Para tal, foi utilizado um protocolo dito ‘clássico’
por ser baseado nos protocolos previamente utilizados em outras
espécies ruminantes (ZOLI et al., 1991; GARBAYO et al., 1998);
2) Testar um novo protocolo bioquímico, baseado no uso de
cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose, para o
isolamento da(s) PAG(s) presentes em extratos placentários
25
coletados em diferentes estados gestacionais (primeiro e segundo
trimestres de gestação);
3) Desenvolver um protocolo de dosagem RIA homólogo para a
mensuração das concentrações de PAG em raças zebuínas e
4) Traçar os perfis plasmáticos de PAG durante a gestação e período
pós-parto em fêmeas zebuínas da raça Azawak.
Antes de iniciar a descrição da parte experimental do presente estudo,
julgamos oportuno apresentar uma breve revisão de literatura sobre o gado
zebu, as proteases aspárticas e finalmente sobre as proteínas placentárias,
com enfoque especial às PAGs.
26
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O Gado zebu
A domesticação do gado bovino pode ser considerada como uma etapa
de grande importância para a evolução da sociedade tal como a
conhecemos. Diversas funções foram atribuídas aos bovinos domésticos
após sua domesticação, tendo os mesmos exercido, direta ou indiretamente,
um importante papel econômico, cultural e mesmo religioso, além de ter se
constituído em uma importante força de tração para as primeiras
comunidades agropastoris existentes durante o período Neolítico (PAYNE,
1991).
Existem dois tipos principais de gado doméstico: o gado zebu (Bos
indicus, classificado por alguns autores como Bos taurus indicus) e o gado
taurino (Bos taurus, também classificado como Bos taurus taurus). O gado
doméstico pertence à Tribo (grupo) Bovini, Família Bovidae, Ordem
Artyodactyla, a qual também inclui o bisão americano (Bison bison), o
bisão europeu (Bison bonasus), o bantengue (Bibos banteng), o gauro
(Bibos gaurus) e o iaque (Phoëphagus mutus) (FIGURA 1). Os gêneros
pertencentes à Tribo Bovini são estreitamente relacionados. Quando
cruzados entre si, eles podem produzir híbridos férteis, ou, em alguns
casos, machos híbridos estéreis.
2.1.1. Origem e diferenças entre gado zebuíno e taurino
Quanto à suas origens, praticamente todas as raças de gado doméstico
são consideradas como originárias do gado selvagem Ure-ox ou Auroque,
espécie Bos primigenius (GRIGSON, 1980), a qual evoluiu separadamente
27
nos continentes asiático, europeu e africano, dando origem às sub-espécies
Bos primigenius namadicus (Ásia), Bos primigenius primigenius (Europa)
e Bos primigenius opisthonomus (África do Norte). Ambas as sub-espécies
asiática e africana foram extintas há aproximadamente 2.000 anos,
enquanto que a espécie européia sobreviveu até o início do século XVII,
período no qual desapareceram os últimos exemplares de Ure-ox, mantidos
em condições naturais no centro da Polônia (SZAFER, 1968).
Classe Mammalia
Subclasse Ungulata
Ordem Artiodactyla
Subordem Ruminantia
Família Bovidae
Subfamília Caprinae
Subfamília Bovinae
Grupo Bubalina Grupo Syncerina
Grupo Bovini
Gênero
Bos
Espécie
B. primigenius
(auroque)
Gênero
Peöphagus
Gênero
Bibos
Espécie
B. javanicus
(bantín)
Espécie
B. gaurus
(gauro)
B. taurus
B. indicus B. banteng
B. frontalis
(gado taurino) (gado zebu) (vaca de Bali) (mitan ou gaial)
Espécie
B. sauveli
(couprei)
Gênero
Bison
Gênero
Bubalus
Gênero
Syncerus
Espécie
Espécie
Espécie
Espécie
Espécie
S. caffer
B. bubalis
P. mutus B. bonasus
B. bison
(bisão europeu)(bisão americano)(búfalo asiáticoi) (búfalo africano)
Grupo Caprina
Grupo Ovina
Gênero
Capra
Gênero
Ovies
Espécie
C. hircus
(cabra)
Espécie
O. aries
(ovelha)
P. gruniens
(iaque)
Interférteis, podendo ser considerados como sub-gêneros de Bos
FIGURA 1 -
Árvore filogenética das principais espécies de Bovidae identificadas
até o presente. Entre parênteses constam o nome da espécie em sua
forma selvagem e entre colchetes o nome dado à espécie domesticada.
✝
Espécie extinta. Adaptado de PAYNE (1991).
28
Conforme calculado por LOFTUS et al. (1994a,b) pelo uso de
marcadores genéticos, os taxas Bos indicus e Bos taurus divergiram entre si
de aproximadamente 200.000 a 1 milhão de anos (LOFTUS et al., 1994a).
Durante este longo período evolutivo, diversas mutações parecem ter
ocorrido, resultando na acumulação de diferenças protéicas e genéticas
entre ambos os tipos de gado.
As diferenças existentes quanto à freqüência alélica de proteínas
séricas ou de alozimas foram as primeiras a permitir a construção de
árvores filogenéticas nas quais foram comparadas diferentes raças de gado
de origem zebuína e taurina (BAKER & MANWELL, 1980).
A partir da década de 50, diversos trabalhos demonstraram uma alta
freqüência alélica da α-lactoalbumina A (BLUMBERG & TOMBS, 1958)
e da αs1-caseína C (BAKER & MANWELL, 1980) em raças zebuínas e sua
baixa freqüência ou inexistência em raças taurinas, assim como a ausência
das variantes zebuínas da hemoglobina C (BRAEND, 1972), albumina
sérica B (BAKER & MANWELL, 1980) e transferrinas B e F (QUEVAL
et al., 1998) em gado taurino.
Estudos genéticos sucederam os estudos bioquímicos realizados em
gado zebuíno. Uma das primeiras evidências da existência de diferenças
genéticas entre Bos indicus e Bos taurus foi obtida em 1968 por KIEFFER
& CARTWRIGHT através da cariotipagem e análise morfológica do
cromossomo Y. Conforme observado por estes autores, gado zebuíno é
caracterizado por possuir cromossomo Y acrocêntrico, enquanto que gado
taurino caracteriza-se por apresentá-lo com uma conformação submetacêntrica. Uma análise mais detalhada dos cromossomo Y demostrou a
existência de polimorfismos ao nível de fragmentos de seqüências de ADN
29
obtidas pelo uso de enzimas de restrição (BRADLEY et al., 1994),
confirmando a hipótese de que ambos os tipos de gado evoluíram
independentemente a partir de ancestrais distintos.
Recentemente, a comparação de seqüências correspondentes às
regiões variáveis do ADN mitocondrial (mtADN loop) (LOFTUS et al.,
1994a), assim como análise de fragmentos de mtADN obtidos pelo uso
ribonucleases demonstrou a existência de diferenças notáveis entre os
grupos de gado Indiano e Afro-Europeu, permitindo a distinção entre os
mesmos (LOFTUS et al., 1994b; BRADLEY et al., 1996).
Paralelamente, a realização de estudos populacionais que visavam a
determinação da origem de raças bovinas existentes nos continentes
Europeu, Asiático e Africano permitiu a demonstração de divergências na
distribuição de diversos microsatélites encontrados em ambos os gados
zebuíno e taurino (BRADLEY et al., 1994, 1996; MacHUGH et al., 1997).
A observação de polimorfismos ao nível de microsatélites também foi
observada em experimentos que visavam a caracterização específica de
genes tais como a prolactina (DIETZ et al., 1992), a capa-caseína
(LEVEZIEL et al., 1994), o hormônio do crescimento (LAGZIEL et al.,
1996) e o fator inibidor de leucemia (PIEDRAHITA et al., 1997).
2.1.2. As raças zebuínas
O continente Asiático contava, já em 1953, com aproximadamente
300 milhões de cabeças de gado, dos quais praticamente metade são
pertencentes às raças zebuínas Hariana, Sahiwal, Thaparker, Red Sindhin,
Ongole, Gyr e Kankrej, originárias da Índia e Paquistão (JOSHI &
PHILIPS, 1953). Um efetivo zebuíno de aproximadamente 20 milhões de
30
cabeças encontra-se localizado na África do Norte e Central, sendo as
principais raças “nativas” denominadas Fulani, Afrikander, Azawak,
Sokoto, Boran e Bororo (ABOGAYE, 1998). No Brasil, importações
realizadas entre 1813 e 1964 deram origem ao gado Nelore, Gir e Guzerá,
originários das raças asiáticas Ongole, Gyr e Kankrej. Essas mesmas raças
foram utilizadas para a formação do gado Brahman, a principal raça
zebuína existente nos Estados Unidos (BREEDS OF CATTLE, 2001).
Fêmeas
Nelore
têm
uma
vida
reprodutiva
bastante
longa,
apresentando uma boa habilidade maternal e uma baixa incidência de
distócia devido ao seu porte (450 a 550 kg) e à sua grande abertura pélvica
(BREEDS OF CATTLE, 2001). Por apresentar uma grande rusticidade,
uma excelente taxa de conversão alimentar e um temperamento
extremamente dócil, eles se adaptam facilmente ao sistema de criação
encontrados nas regiões Centro-Oeste e Sudeste do Brasil.
Ao contrário do gado zebu trazido às Américas, no qual tem sido
feitos investimentos em termos de melhoramento genético e de
caracterização dos índices produtivos e reprodutivos, o gado zebu criado no
continente Africano encontra-se pouco caracterizado, tanto em termos
produtivos quanto de performance reprodutiva, sendo o mesmo
tradicionalmente criado em pequenos rebanhos de propriedade familiar
(ABOGAYE, 1998).
A raça Azawak é uma das principais raças existentes no Burkina-Faso.
As fêmeas possuem uma notável rusticidade e resistência à altas
temperaturas e à carência alimentar, possuindo pesos médios de 250 a 300
kg na estação seca e de 300 a 400 kg na estação chuvosa (ZONGO, M.
comunicação pessoal). Apesar da importância econômica e social deste
31
gado para as pequenas comunidades agropastoris locais, dados sobre sua
fisiologia reprodutiva ao longo da gestação, especialmente em condições de
estresse térmico e de carência alimentar nunca foram investigados.
2.2.
Aspectos gerais da fisiologia reprodutiva de vacas de origem
zebuína
2.2.1. Origem e desenvolvimento dos folículos ovarianos
Na fêmea, a produção de gametas é o resultado da associação de dois
fenômenos que ocorrem no interior do ovário: a oogênese e a
foliculogênese. A oogênese pode ser definida como o conjunto de
processos que compreende o desenvolvimento e a diferenciação das células
germinativas primordiais da fêmea até a formação do oócito haplóide
fecundado. A foliculogênese corresponde ao processo de formação,
crescimento e maturação folicular. Ela inicia-se com a formação do folículo
primordial, culminando com o estádio de folículo pré-ovulatório, também
conhecido como folículo de De Graaf ou dominante (SAUMANDE, 1991).
A etapa final do desenvolvimento folicular é a ovulação. A ovulação
consiste na liberação do oócito pelo folículo ovariano. Nesta fase, as
células da granulosa do folículo pré-ovulatório hipertrofiam-se e separamse, perdendo seu arranjo colunar, enquanto que as células da teca tornam-se
vacuoladas e muito vascularizadas, dando ao folículo uma aparência
hiperêmica. Em zebuínos, a ovulação ocorre entre 26,2 e 30 horas após o
início do estro (PINHEIRO et al., 1998) resultando, assim como descrito
em taurinos, de uma série de alterações na estrutura da parede folicular
causadas pelo aumento na secreção do hormônio do hormônio luteinizante
(LH) pela hipófise (EVANS et al., 1994). Essas alterações consistem
32
basicamente na desintegração das células do ápice do folículo, o que
conduz à ruptura de sua parede (LEMAIRE, 1989).
A grande maioria dos folículos ovarianos não chega até a ovulação,
mas, ao contrário, degenera-se por meio de um processo denominado
atresia. A atresia reduz de maneira significativa o número de ovócitos
potencialmente ovuláveis, reduzindo consequentemente, a produção de
ovócitos viáveis durante a vida útil de um animal. Em bovinos, a ovulação
pode ser considerada como um evento raro uma vez que somente 1 folículo
em 1.000 chega ao estado pré-ovulatório (IRELAND, 1987).
Após a ovulação, é formado o corpo lúteo, estrutura responsável pela
síntese de diversos hormônios esteróides, dentre os quais merece ser
ressaltada a progesterona (P4). O corpo lúteo é formado pela continuidade
da maturação e desenvolvimento das células da granulosa e da teca
(SMITH, 1986). As células da teca interna e da granulosa remanescentes no
folículo após a ovulação darão origem a grandes e pequenas células
esteroidogênicas luteínicas (FIELDS & FIELDS, 1996). Durante a
luteinização, além de um aumento no diâmetro celular, são observadas
também diversas modificações na síntese de esteróides (WILTBANK &
NISWENDER, 1992). A produção de progesterona pode aumentar em até
10 vezes, devido ao aumento na quantidade das enzimas que participam nas
primeiras etapas da síntese de esteróides, enquanto que a síntese de
andrógenos e estrógenos diminui, devido à redução das enzimas que
participam das etapas finais da síntese de esteróides (RODGERS et al.,
1986).
Logo após a ovulação, o corpo lúteo formado é denominado cíclico,
podendo o mesmo sofrer regressão (luteólise), ou ser preservado ao longo
33
da gestação, formando assim o corpo lúteo da gestação ou “corpus luteum
verum”. Na maioria das espécies, a duração do corpo lúteo cíclico é breve,
variando de 12 a 21 dias. No caso do não estabelecimento de uma gestação
viável, o corpo lúteo regride por ação da luteolisina prostaglandina F2α
(PGF2α), iniciando-se um novo ciclo estral. Caso seja estabelecida a
gestação, um mecanismo de reconhecimento materno leva ao bloqueio da
luteólise, com a manutenção de um ou de vários corpos lúteos funcionais
ao longo do período gestacional.
Em diversas espécies, logo após a fecundação, o embrião produz
alguns “sinais”, os quais induzem a transformação do corpo lúteo cíclico
em gestacional. Dentre estes sinais associados ao reconhecimento materno
da gestação, podem ser citados as gonadotrofinas coriônicas, a substância
luteotrópica sintetizada pelas placentas das espécies humana e eqüina, e o
interferon tau, a proteína anti-luteolítica de ação parácrina produzida pelo
embrião de espécies ruminantes, o qual age no epitélio uterino para inibir a
liberação de PFG2α, assegurando, desta forma, a manutenção de um corpo
lúteo funcional.
As principais características dos hormônios e proteínas envolvidos no
reconhecimento materno da gestação, assim como de outras proteínas
sintetizadas pela placenta de mamíferos domésticos serão descritas no
seção sobre proteínas placentárias.
2.2.2. Aspectos gerais relacionados ao ciclo estral
O ciclo estral dos ruminantes pode ser caracterizado como um
conjunto de alterações comportamentais e de modificações morfológicas e
fisiológicas do aparelho genital, que se produzem com um ritmo regular e
34
contínuo, na ausência da gestação. Estas modificações estão diretamente
relacionadas ao funcionamento cíclico do ovário, sendo reguladas por
mecanismos
endócrinos
e
neuro-endócrinos,
principalmente
pelos
hormônios hipotalâmicos, gonadotrofinas e esteróides ovarianos.
O início da atividade cíclica ovariana em fêmeas zebuínas parece ser
influenciado por diversos fatores, dentre os quais o principal parece ser o
peso corporal (DOBSON & KAMONPATANA, 1986). Conforme
observado por PLASSE et al. (1968a), fêmeas zebuínas alcançam a
puberdade com uma maior percentagem de peso corporal, sendo mais
tardias do que fêmeas taurinas (14 a 24 meses versus 11 a 14 meses). Uma
alta incidência de estros silenciosos quando do primeiro ciclo estral
também foi reportada por PLASSE et al. (1968a) em novilhas da raça
Brahman.
Anatomicamente, o sistema reprodutivo de vacas de raças zebuínas é
menor do que o sistema reprodutivo de raças taurinas (MUKASAMUGERWA, 1989), sendo observado um menor volume ovariano
(ADEYEMO & HEATH, 1980) além de menores diâmetros tanto do
folículo dominante (FIGUEIREDO et al., 1997) quanto do corpo lúteo
(GALINA et al., 1987; FIGUEIREDO et al., 1997). Entretanto, apesar
destas diferenças, a dinâmica folicular de raças zebuínas parece ser
semelhante à observada em raças taurinas, sendo observadas de 2 a 3 ondas
foliculares durante o ciclo estral (FIGUEREDO et al., 1997).
A duração do ciclo estral em fêmeas zebuínas é comparável à duração
observada em fêmeas taurinas (21,5 ± 1,5 dias) (REKWOT et al., 2000)
(FIGURA 2), sendo a duração dos sinais de estro de aproximadamente 12,5
a 28 horas (DOBSON & KAMONPATANA, 1986). A ocorrência de ciclos
35
estrais curtos (11 a 17 dias) e longos (26 a 32 dias) foi relatada em 12,8 % e
38,5 % de fêmeas zebuínas pertencentes à raça Bunaji (REKWOT et al.,
2000). Uma maior proporção de ciclos longos (52 %) foi observada por
MUKASA-MUGERWA et al. (1991) em vacas Arsi utilizadas em
programas de inseminação artificial, sendo a mesma provavelmente devida
à uma inadequada detecção de estros nesta raça.
FIGURA 2 -
Representação esquemática das alterações das concentrações
hormonais durante o ciclo estral de bovinos. Adaptado de PETERS &
LAMMING (1983).
Conforme descrito por PINHEIRO et al. (1998) em fêmeas Nelore, a
ovulação ocorre aproximadamente 26 horas após o início do estro. Segundo
36
estes autores, nesta raça, o comportamento de estro é mais curto
comparativamente ao observado em fêmeas taurinas, havendo uma maior
incidência de estros durante a noite, o que dificulta sua detecção em
condições de campo.
Em fêmeas Brahman, o pique ovulatório de LH parece ocorrer mais
precocemente após o início dos sintomas de estro do que em raças mistas
ou em raças taurinas (2,1 ± 1,3, 3,0 ± 1,0 e 6,5 ± 1,8 horas nas raças
Brahman, 1/2 Brahman e 1/2 Hereford e Hereford, respectivamente)
(RANDEL & MOSELEY, 1977). Estudos realizados por RANDEL (1976)
demonstraram ainda intervalos de 18,5 ± 3,1 e 23,3 ± 2,1 horas entre o
pique ovulatório de LH e a ovulação, respectivamente, em vacas das raças
Brahman e Hereford.
Durante o período próximo ao estro, as concentrações de estrógenos
séricos totais são aproximadamente semelhantes em vacas Brahman,
Hereford e mistas (1/2 Brahman e 1/2 Hereford), sendo as mais altas
concentrações observadas respectivamente 24 horas, 8 horas e 16 horas
antes do estro (RANDEL, 1980). O aumento das concentrações de 17-βestradiol coincide com o declínio das concentrações de progesterona
ocorridas após a regressão do corpo lúteo.
Em fêmeas da raça Nelore, a luteólise ocorre aproximadamente entre
os dias 15 e 18 pós-ovulação por ação da PGF2α (FIGUEIREDO et al.,
1997). Apesar da inexistência de dados em zebuínos, tem sido suposto que,
assim como em outras espécies ruminantes, o estradiol secretado pelos
folículos em crescimento estimularia a síntese de receptores para a
ocitocina no endométrio uterino (MacCRACKEN et al., 1984). A ocitocina
produzida pelas células luteínicas ligar-se-ia então a receptores
37
endometriais, desencadeando a secreção de PGF2α pelo endométrio uterino
(COOKE & HOMEIDA, 1983). Entretanto, o modo exato pelo qual a
ocitocina mediaria a síntese de PGF2α pelo endométrio uterino ainda não
foi completamente elucidado.
2.2.3. Perfis hormonais durante a gestação
Conforme descrito por PLASSE et al. (1968b), raças zebuínas tendem
a apresentar gestações mais longas (291 a 295 dias) do que raças taurinas
(282 a 289 dias). Entretanto, conforme descrito pelos mesmos autores,
erros referentes à consideração de montas não-férteis como férteis
poderiam explicar o período gestacional mais longo observado neste taxa.
As concentrações de sulfato de estrona no leite de fêmeas zebuínas
permanecem indetectáveis durante os primeiros meses de gestação, assim
como observado em raças taurinas, aumentando exponencialmente durante
o 4o mês de gestação para atingir valores máximos (1.380,9 ± 164,7 pg/ml)
ao 8o mês de gestação (PRAKASH & MADAN, 1993).
Existem poucos relatos sobre os perfis de estradiol e de progesterona
ao longo da gestação de fêmeas de raças zebuínas. Segundo descrito por
SHELTON & SUMMERS (1983) em fêmeas Brahman, os níveis
plasmáticos de 17-β-estradiol em gestações simples são inferiores aos
observados em gestações múltiplas durante o último mês de gestação
(FIGURA 3).
No que diz respeito à progesterona (FIGURA 4), suas concentrações
permanecem elevadas a partir da 3a semana de gestação (SHELTON &
SUMMERS, 1983), sendo observada uma tendência ao aumento das
mesmas durante o último trimestre de gestação (MUKASA-MUGERWA &
38
TEGEGNE, 1989).
500
17-beta estradiol (pg/ml)
parto
400
300
200
100
0
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
Semanas antes do parto
FIGURA 3 -
Concentração de 17β-estradiol plasmático durante a gestação em vacas
zebuínas com gestações simples (-▼-▼-) e gemelares (-▲-▲-). Adaptado
de SHELTON & SUMMERS (1983).
Perfis sorológicos ou plasmáticos de hormônios ou proteínas
associadas à gestação têm sido descritos em diversas raças taurinas,
auxiliando a uma melhor compreensão da função placentária neste taxa.
Entretanto, ao nosso conhecimento, ainda não foram realizados estudos que
visavam sua descrição em vacas de raças zebuínas.
39
FIGURA 4 –
Concentração plasmática de progesterona durante a gestação em vacas
zebuínas. Adaptado de MUKASA-MUGERWA & TEGEGNE (1989).
2.3. Proteases Aspárticas
As proteínas associadas à gestação (PAGs), objeto de estudo do
presente trabalho, são membros da família das proteases aspárticas,
apresentando uma grande identidade entre sua seqüência de aminoácidos e
a seqüência do pepsinogênio (XIE et al., 1991). Será apresentada a seguir
uma breve descrição das principais características do grupo das proteases
aspárticas, ao qual pertencem as PAGs.
2.3.1. Terminologia
Os termos proteinase e protease são sinônimos. As proteases são
hidrolases que agem em ligações peptídicas de proteínas, diferenciado-se
40
das peptidases as quais agem apenas em cadeias peptídicas apresentando
um número limitado de aminoácidos. Este grupo de enzimas são de
fundamental importância para o remodelamento dos tecidos, em especial
daqueles que apresentam uma alta taxa de transformação, tais como a
placenta.
2.3.2. Classificação das Proteases
As proteases são classificadas de acordo com os grupos químicos
responsáveis por sua atividade catalítica. Elas agem por meio de quatro
mecanismos distintos, sendo por conseqüência divididas em quatro
principais classes: as serina proteases, as metaloproteases, as cisteína
proteases e as proteases aspárticas (IUPAC-IUB, 2002).
Do ponto de vista evolutivo, pode-se afirmar que cada uma das quatro
classes de proteases evoluiu a partir de uma molécula distinta, originando
sub-famílias de enzimas estreitamente relacionadas tanto do ponto de vista
de mecanismo catalítico quanto estrutural. Os membros de uma mesma
família podem ser facilmente reconhecidos pelas similaridades em suas
seqüências de aminoácidos, especialmente na região próxima ao seu centro
catalítico.
2.3.2.1. Serina proteases
Em mamíferos, a maioria das serina proteases são membros da
superfamília das quimotripsinas. Elas incluem enzimas digestivas (ex.:
quimotripsina e tripsina), lisossomais, fibrinolíticas (ex.: fator ativador do
plasminogênio e plasmina) assim como enzimas secretadas pelas células do
sistema imunológico (IUPAC-IUB, 2002).
41
2.3.2.2. Metaloproteases
As metaloproteases constituem a mais diversificada classe de
proteases. Elas incluem enzimas tais como as colagenases e as gelatinases,
estando envolvidas na degradação da matriz extracelular que ocorre durante
a morfogênese e a involução tissula Abreviação dos aminoácidos (IUPACIUB, 2002).
2.3.2.3. Cisteína proteases
Em mamíferos, existem dois principais grupos de cisteína proteases:
as enzimas lisossomais catepsinas B, C, H, L e S, e as calpaínas
citoplasmáticas. As catepsinas estão diretamente envolvidas na degradação
final das proteínas intra-celulares, enquanto que as calpaínas parecem estar
envolvidas tanto na ativação de fostatases e proteases intracelulares, quanto
no remodelamento do citoesqueleto, o que possibilita o transporte
intracelular de vesículas e a estabilização estrutural da estrutura celular
(IUPAC-IUB, 2002).
2.3.2.4. Proteases aspárticas
As proteases aspárticas foram as primeiras enzimas proteolíticas
identificadas em mamíferos. Elas possuem, em sua maioria, uma única
cadeia de aminoácidos, sendo dependentes da existência de dois ácidos
aspárticos em seu sítio catalítico (TABELA 1) para a realização de sua
atividade catalítica (DAVIES, 1990). Apesar de bastante estudado, o
mecanismo catalítico exato das proteases aspárticas ainda não foi
completamente elucidado (SZECSI, 1992).
Dentre as principais proteases aspárticas enzimaticamente ativas
42
existentes em mamíferos, podem ser citadas as catepsinas D e E, a renina, a
beta-secretase, a quimosina, a gastricsina e as pepsinas. As principais
características das proteases aspárticas serão descritas a seguir.
A catepsina D (CATD) é a principal protease presente nos lisossomos
de mamíferos. Ela possui uma cadeia madura de 345 a 358 aminoácidos de
comprimento, sendo constituída de uma cadeia leve e de uma pesada. Na
espécie Gallus gallus, a catepsina D é a principal enzima envolvida na
degradação de proteínas durante a formação do saco vitelino (SWISSPROT, 2002).
A catepsina (CATE) é uma protease aspártica intracelular com
atividade catalítica bastante semelhante à da CATD. Ela encontra-se
distribuída em células associadas ao sistema linfóide, possuindo uma única
cadeia de 338 a 343 aminoácidos de comprimento dependendo da espécie
(SWISS-PROT, 2002).
A renina (RENI) é uma protease altamente específica, cuja única
atividade
catalítica
consiste
em
clivar
a
ponte
Leu-Leu
do
angiotensinogênio, presente na circulação periférica. Essa clivagem dá
origem à angiotensina I, a qual, uma vez liberada, inicia a cascata de
reações que produzem uma elevação da pressão sangüínea e uma maior
retenção renal de sódio. A renina é sintetizada principalmente pelas células
justaglomerulares dos rins e pelas glândulas submandibulares, possuindo,
de acordo com a espécie, entre 331 e 361 aminoácidos de comprimento
(SWISS-PROT, 2002).
A beta-secretase (BACE) é a enzima responsável pela degradação da
proteína precursora de amilóide (APP). Ela é a única protease aspártica
associada a membranas conhecida até o momento, sendo expressa
43
exclusivamente no tecido cerebra (SWISS-PROT, 2002)l.
A quimosina, a pepsina e a gastrina são sintetizadas sob a forma de
zimogênios (proquimosina, pepsinogênio e progastricsina), os quais
possuem pro-peptídeos N-terminais de aproximadamente 50 aminoácidos
de comprimento. Estes pro-peptídeos são clivados quando da ativação dos
zimogênios em pH ácido. A proquimosina (CHYM) é sintetizada pela
mucosa do abomaso de ruminantes lactantes. Após ativada, ela hidrolisa a
caseína para formar a paracaseína. Existem diversas variantes de
proquimosina, sendo as mesmas compostas de formas de aproximadamente
323 aminoácidos. O pepsinogênio (PEP) é a principal protease produzida
pela região fúndica do estômago de mamíferos adultos. Ele é ativado pelo
ácido clorídrico presente no estômago do homem e de todas as espécies
conhecidas de mamíferos, sendo composta, dependendo da espécie, por
uma cadeia de 320 a 330 aminoácidos. A progastricsina, também conhecida
como pepsinogênio C (PEPC), é produzida em todas as regiões da mucosa
gástrica de mamíferos. Ela é mais específica do que a pepsina para a
clivagem de proteínas, tendo como principal substrato a hemoglobina
(SZECSI, 1992).
Mais recentemente, uma nova família de proteases aspárticas foi
identificada na placenta de mamíferos euterianos, sendo esta nova família
denominada de glicoproteína associada à gestação (PAG). Os membros da
família das PAGs podem ser considerados como cataliticamente inativos
em sua maioria, tendo sido identificadas algumas formas cuja seqüência de
aminoácidos ao nível de sítio catalítico poderia indicar uma possível
atividade enzimática. As principais características das PAGs serão
discutidas em detalhes na seção sobre proteínas de origem placentária.
44
2.3.3. Estrutura das proteases aspárticas
A análise cristalográfica de proteases aspárticas mostrou que estas
enzimas apresentam uma estrutura bilobulada, relativamente simétrica
(FIGURA 5), possuindo duas regiões aproximadamente similares em torno
de seus ácidos aspárticos situados no sítio catalítico (TANG et al., 1978;
GURUPRASAD et al., 1996). Conforme sugerido por TANG et al. (1978),
a existência de regiões topograficamente semelhantes no sítio catalítico
resultaria de uma duplicação de um gene ancestral, o qual fusionou-se
posteriormente originando cada um dos lobos desta proteína.
TABELA 1 -
Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio catalítico de diversas
proteases aspárticas. Estão indicados (inclusos em retângulos) os
aminoácidos que diferem da seqüência normal encontrada nos
pepsinogênios A e C. Informações sobre as seqüências de
aminoácidos foram obtidas no banco de dados GenBank.
Catalí-
Protease
Aspártica
Origem
Pepsinogênio A
Macaco
Sim
Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser
Progastricsina
Homem
Sim
Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser
Pepsinogênio F
Coelho
Sim
Leu Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser
Pepsinogênio F Camundongo
Sim
Leu Asp T Gli Ser Ser Met Asp Tre Gli Tre Ser
Proquimosina
Bovino
Sim
Fen Asp Tre Gli Ser Ser Leu Asp Tre Gli Tre Ser
Rato
Sim
Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser
Catepsina D
Homem
Sim
Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser
Catepsina E
Homem
Sim
Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser
Beta-secretase
Homem
Sim
Val Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Ser Gli Tre Tre
Renina
tica?
Extremidade
Amino-terminal
Extremidade
carboxi-terminal
O sítio catalítico das proteases aspárticas possui entre 20 e 30
angstrons de comprimento, podendo acomodar peptídeos de até 7 resíduos.
45
A interação entre o sítio catalítico das proteases aspárticas e o substrato é
favorecida pela formação de pontes de hidrogênio, sendo a especificidade o
resultado da ação das forças de atração ou de repulsão entre os aminoácidos
presentes no sítio catalítico e aqueles presentes nas cadeias laterais do
substrato (DUNN et al., 1995).
Resíduos hidrófobos
Cadeias laterais Asp e Glu
FIGURA 5 -
Representação da distribuição de resíduos hidrófobos ao nível do sítio
catalítico do pepsinogênio suíno. As cadeias laterais Asp e Glu estão
representadas pela cor preta. Os resíduos hidrófobos, assim como os
resíduos Ser, Tre, Asn e Gln estão representados pela cor cinza escura.
Os resíduos situados fora do centro catalítico estão representados pela
cor cinza clara. Adaptado de DUNN et al. (1995).
Diversas modificações pós-traducionais, tais como fosforilação e
glicosilação, já foram descritas para as proteases aspárticas (SZECSI,
1992). A pepsina porcina, por exemplo, é fosforilada no resíduo de Serina
68 (Ser68), enquanto que a pepsina bovina e a e a catepsina D porcina são
glicosiladas em resíduos de asparagina (Asp). Os mecanismos que
46
controlam as modificações pós-traducionais de uma dada proteína em uma
determinada espécie ainda não foram completamente elucidados.
2.3.4. Inibição das proteases aspárticas
As proteases aspárticas podem ser inibidas por substâncias
normalmente existentes na natureza (UMEZAWA et al., 1970), ou por
inibidores sintetizados pelo homem (SZEWCZUK et al., 1992).
A pepstatina A consiste em um inibidor de proteases aspárticas. Ela foi
inicialmente isolada como sendo uma substância produzida por
microorganismos do gênero Streptomyces spp., capaz de retardar o
crescimento
de
seus
competidores
diretos
por
fontes
nutritivas
(UMEZAWA et al., 1970). Posteriormente, a pepstatina A mostrou ser um
eficiente inibidor de proteases aspárticas como a pepsina, denominando-se,
por similaridade, pepstatina. Ela consiste em uma molécula de massa
molecular 686 daltons, possuindo em sua estrutura um aminoácido raro
chamado estatina, o qual corresponde ao ácido (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi6-metilheptanóico (MORISHIMA et al., 1972).
A pepstatina A pode ser isolada no filtrado de culturas de
Streptomyces testaceus, Streptomyces argenteolus e Streoptomyces
parvisporogenes através do uso de solventes orgânicos ou pela absorção
por carbono ativado UMEZAWA et al. (1970). Ela polimeriza-se
espontaneamente formando filamentos cristalinos (MOTHES et al., 1994)
cujo ponto de fusão situa-se entre 228° e 229°C (MORISHIMA et al.,
1970).
Diversos
estudos
demonstraram
que
a
pepstatina
inibe
especificamente, além da pepsina, outras proteases aspárticas tais como as
catepsinas D e E, a renina (MARCINISZYN et al., 1977), bem como
47
proteases presentes nos vírus da leucemia bovino e humano (KATOH et
al., 1987).
A interação entre a pepstatina A e a pepsina caracteriza-se pela
alteração da conformação da pepsina, resultante do posicionamento de um
dos oxigênios presentes na estatina entre os grupos carboxil situados entre
os ácidos aspárticos 32 e 215 (Asp32 e Asp215), posição normalmente
ocupada por uma molécula de água (FUJINAGA et al., 1995).
Por ser um inibidor reversível, a pepstatina pode ser considerada como
o substrato de escolha para a purificação de proteases aspárticas por meio
do uso de cromatografias de afinidade. Colunas de afinidade pepstatina A
agarose já foram usadas para o isolamento da renina (DZAU et al., 1979) e
da catepsina D (AFTING & BECKER, 1981), não existindo informações
precisas sobre seu uso para o isolamento de proteínas placentárias de
ruminantes.
2.4. As Proteínas Placentárias
2.4.1. A placenta
A placenta é um órgão transitório próprio aos mamíferos euterianos.
Ela é uma estrutura única e especializada, podendo ser definida como a
justaposição, ou fusão, das membranas fetais ao endométrio, permitindo a
realização das trocas fisiológicas necessárias entre mãe e feto. Sua
formação inicia-se no período embrionário, sendo observado, entretanto,
um processo contínuo de remodelação ao longo da gestação, o que assegura
uma perfeita adaptação das estruturas materna e fetal (BEACONSFIELD et
al., 1980).
O desenvolvimento fetal está relacionado com o desenvolvimento da
48
placenta dos pontos de vista anatômico, endocrinológico e metabólico. No
que diz respeito à função endócrina da placenta, esta inclui a síntese e
secreção de vários hormônios e proteínas tais como a progesterona, os
estrogêneos, as gonadotrofinas coriônicas, os hormônios lactogênios
placentários (também designados por somatomamotrofinas coriônicas), as
prolactinas, hormônios e fatores de crescimento, além de proteínas e
glicoproteínas específicas ou associadas à gestação. Estas substâncias
podem estar relacionadas ao estabelecimento da gestação, a manutenção do
corpo lúteo, a tolerância imunitária do embrião/feto pela mãe, o
metabolismo
materno
intermediário,
o
crescimento
fetal
e
o
desenvolvimento da glândula mamária.
2.4.1.1. Tipos de placenta
As placentas podem ser classificadas de acordo com diferentes
critérios, dentre os quais, os mais importantes relacionam-se com as
características da barreira materno-fetal (estrutura histológica), com o
padrão das vilosidades coriônicas (estrutura anatômica) e com o grau de
perda de tecido por ocasião do parto (TABELA 2).
a) Estrutura histológica
Apesar de algumas imperfeições, a classificação dos diferentes tipos
de placentas baseada na estrutura histológica ou, mais precisamente no
número de camadas histológicas que separam a circulação fetal da
circulação materna parece-nos ser a mais precisa. De acordo com este tipo
de classificação, as placentas podem ser divididas em quatro tipos, a saber:
epiteliocorial, sindesmocorial, endoteliocorial e hemocorial.
49
A placenta epiteliocorial é o tipo de placenta encontrada nos equídeos,
suínos e em alguns ruminantes. Este tipo caracteriza-se pela presença de 6
camadas histológicas interpostas entre as circulações materna e fetal. Os
componentes fetais encontrados neste tipo de placenta são o endotélio dos
capilares coriônicos, o tecido conjuntivo fetal e o trofoblasto. Os
componentes maternos consistem basicamente em três camadas: epitélio
uterino, tecido conjuntivo uterino e endotélio dos capilares maternos
(BJORKMAN, 1982). A placenta sinepiteliocorial é considerada por
diversos autores como o tipo de placenta característico de ovinos e de
algumas espécies de ruminantes selvagens. Ela caracteriza-se pela
formação de um sincício materno-fetal resultante da migração e fusão das
células coriônicas fetais com células do epitélio uterino (WOODING,
1992). Existem ainda dois tipos de placenta: endoteliocorial e hemocorial.
TABELA 2 -
Classificação das placentas em diferentes espécies mamíferas.
Classificação
Espécies
Barreiras
materno-fetais
Padrão das vilosidades
coriônicas
Perda de tecido materno
à parturição
Porca
Epiteliocorial
Difusa
Nenhuma (Não-deciduada)
Égua
Epiteliocorial Microcotiledonária difusa Nenhuma (Não-deciduada)
Vaca, cabra
Epiteliocorial
Cotiledonária
Nenhuma (Não-deciduada)
Ovelha
Sinepiteliocorial
Cotiledonária
Nenhuma (Não-deciduada)
Gata, cadela
Endoteliocorial
Zonária
Moderada (Deciduada)
Hemocorial
Discóide
Extensa (Deciduada)
Primatas
50
A placenta endoteliocorial é o tipo de placenta encontrada nos
carnívoros. Ela caracteriza-se pela exposição direta dos capilares maternos
ao trofoblasto. A placenta hemocorial é o tipo de placenta característico da
mulher, primatas e roedores. Ela caracteriza-se pelo contato direto entre o
sangue materno e o trofoblasto (BJORKMAN, 1982).
Conforme descrito por WOODING (1992), em bovinos, a placenta
situa-se entre os tipos epiteliocorial e sinepiteliocorial. Nesta espécie, ao
nível de microvilosidades, podem-se observar tanto a presença do epitélio
uterino intacto, quanto a formação de um híbrido feto-materno formado
pela migração e pela fusão das células binucleadas coriônicas com as
células do epitélio uterino.
b) Estrutura anatômica
Anatomicamente as placentas são classificadas de acordo com a
distribuição de vilosidades coriônicas na superfície do córion. De acordo
com essa classificação, as placentas podem ser difusas ou localizadas. A
placenta difusa é caracterizada pela distribuição uniforme de vilosidades na
superfície do córion. As placentas localizadas podem ser cotiledonárias
(ruminantes), zonárias (carnívoros) ou discóides (primatas e roedores).
A placenta dos ruminantes é do tipo cotiledonário (FIGURA 6). Neste
tipo de placenta, a fixação do embrião ocorre ao nível de um restrito
número de regiões arredondadas ou ovais, chamadas carúnculas. O número
de carúnculas varia segundo a espécie. Na vaca, são observados entre 70 e
150; na ovelha, entre 80 e 100 e, na cabra entre 160 e 180 (BJORKMAN,
1982). Apesar de pouco visíveis, as carúnculas podem ser identificadas em
fêmeas nulíparas por ocasião da puberdade, sendo entretanto muito mais
51
visíveis em multíparas. As áreas intercarunculares (áreas de aposição)
permanecem glandulares durante toda a gestação, sendo também chamadas
paraplacenta (BJORKMAN, 1982).
FIGURA 6 -
Placenta cotiledonária de bovinos no segundo trimestre de gestação.
Notar os cotilédones fetais em toda a extensão da placenta.
c) Perda de tecido por ocasião do parto
O tecido uterino encontra-se modificado em espécies que possuem
placentas endoteliocorial e hemocorial, ocorrendo o descolamento de
tecidos e hemorragia durante a parturição. As regiões uterinas desprendidas
durante este processo são chamadas decídua, sendo as espécies que
possuem estes tipos de placenta chamadas deciduadas. Em espécies que
possuem placenta epiteliocorial, ao contrário, a parturição é facilmente
52
completada devido à estrutura histológica envolvida. Nestas espécies, a
parturição envolve simplesmente a separação das duas partes apostas da
placenta, não havendo, portanto, perda de tecido materno. Como o tecido
uterino é preservado, as espécies que possuem este tipo de placenta
denomina-se adeciduadas (BJORKMAN, 1982).
2.4.1.2. O placentoma
O placentoma, estrutura de ligação materno-fetal de ruminantes, é
formado pela inserção das vilosidades coriônicas nas criptas das carúnculas
maternas. As carúnculas, verdadeiras projeções da mucosa uterina,
constituem-se em pedículos centrais de tecido conjuntivo uterino, os quais
ramificam-se progressivamente, formando uma extensa cadeia de criptas
que se expandem em toda a espessura da massa caruncular, dando ao tecido
uma aparência areolar (BJORKMAN, 1982). As vilosidades coriônicas
consistem em cones mesenquimatosos vasculares, circundados por células
trofoblásticas cubóides (KING et al., 1980) e por células gigantes
binucleadas (WOODING & WATHES, 1980). Elas aumentam a área da
junção materno-fetal ao penetrar profundamente nas criptas carunculares
(KING et al., 1980).
Na fase inicial de formação dos placentomas, a membrana coriônica
em expansão aproxima-se das regiões carunculares (KING et al., 1981).
Em seguida, as vilosidades coriônicas penetram nos canais pré-formados
das criptas carunculares, expandindo-se em toda a sua extensão até que
suas extremidades alcancem a base das carúnculas, onde uma densa
camada separa a massa caruncular do endométrio glandular ruminantes
(HRADECKY et al., 1988). São formadas assim as interdigitações
53
características dos placentomas de ruminantes.
O tamanho, formato e estrutura dos placentomas sofre uma série de
modificações no decorrer da gestação, sendo seu desenvolvimento
normalmente caracterizado pelo aumento em seu comprimento, diâmetro e
grau de ramificação das vilosidades coriônicas (KING et al., 1979). O
desenvolvimento dos primeiros placentomas no útero de fêmeas gestantes
ocorre na curvatura dorsal uterina, próximo à fixação ao mesométrio. Estes
placentomas são os maiores observados durante todo o decorrer da
gestação. Os menores e mais jovens placentomas situam-se nas
extremidades dos cornos uterinos (HRADECKY et al., 1988).
2.4.1.3. As células binucleadas
O elemento mais característico da placenta dos ruminantes é a
presença de células binucleadas no trofoblasto (WIMSATT, 1951). Estas
células inicialmente descritas por ASSHETON em 1906, têm sido objeto de
inúmeras investigações nas últimas cinco décadas (DRIEUX & THIERY,
1951; AMOROSO, 1952; WOODING & WHATHES, 1980; KLISCH et
al., 1999). As células binucleadas derivam das células coriônicas
mononucleadas por cariocinese sem subsequente citocinese. As células
mais jovens são localizadas profundamente na trofoderme e a sua
maturação é feita progressivamente quando de sua migração em direção à
superfície materna (WOODING, 1983). As primeiras células binucleadas
aparecem imediatamente antes da implantação (WANGO et al., 1990a),
podendo ser reconhecidas a partir de 14 dias após a fertilização nos ovinos
(WOODING, 1984) e a partir do dia 17-18 nos bovinos (KING et al., 1980;
WATHES & WOODING, 1980).
54
As células binucleadas representam 15-20 % do total da população
celular placentária (WOODING, 1983; WOODING et al., 1986; WANGO
et al., 1990b). Cerca de uma em sete migram em direção ao epitélio
uterino, fenômeno este observado ao longo de todo o período gestacional
(WOODING et al., 1996). A migração das células binucleadas representa
um papel importante na remodelação da estrutura da placenta, podendo
resultar na formação de células trinucleadas de vida curta em bovinos
(WOODING & BECKERS, 1987) (FIGURA 7) ou na formação de
extensas placas sinciciais em ovinos (WOODING, 1992).
FIGURA 7 -
Diagrama esquemático da migração das células binucleadas em
bovinos. 1) Células binucleadas no lado fetal; 2) Contato com a junção
microvilositária; 3) Fusão com células fetais, dando origem a células
trinucleadas de vida curta; 4) Exocitose dos grânulos; 5) Células após
exocitose, com citoplasma reduzido e núcleo denso e 6) Células
reabsorvidas pelo trofectoderme. Adaptado de WOODING &
WATHES (1980).
55
No que diz respeito à sua função endócrina, no início da década de 40
suspeitou-se que a presença de células especiais da placenta dos ruminantes
estaria relacionada à produção de hormônios essenciais à manutenção da
gestação. Nesta década foi provada pela primeira vez que vacas
permaneciam gestantes mesmo com atividade hipofisária reduzida, tendo
sido sugerido que as gonadotrofinas sintetizadas pela hipófise fossem
substituídas por hormônios produzidos num outro órgão qualquer. Em 1952
e 1954, respectivamente WEETH & HERMAN e BJÖRKMAN usando
micro-seções de cotilédones coradas com o ácido periódico de Schiff
(PAS), descreveram a presença de numerosas células trofoblásticas
contendo glicoproteínas. Cerca de 10 anos mais tarde, FOOTE &
KAUSHIK (1963) demonstraram a presença de atividade do tipo LH em
cotilédones bovinos. Estes estudos foram pioneiros neste campo, abrindo o
caminho para a futura identificação e caracterização de hormônios e
proteínas sintetizadas pela placenta dos ruminantes.
Atualmente é bem conhecido que as células binucleadas estão
diretamente envolvidas na produção de progesterona (WANGO et al.,
1991; WANGO et al., 1992; WOODING et al., 1996), prostaglandinas
(REIMERS
et
al.,
1985a),
hormônios
lactogênios
placentários
(VERSTEGEN et al., 1985; WOODING et al., 1992) e proteínas
específicas ou associadas à gestação (REIMERS et al., 1985b; GOGOLINEWENS et al., 1986; MORGAN et al., 1989; ZOLI et al., 1992b;
ATKINSON et al., 1993). Estas substâncias, antes de ser secretadas, são
armazenadas em grânulos densos (FIGURA 8), os quais podem ocupar
mais de 50 % do citoplasma das células binucleadas (LEE et al., 1986).
56
2.4.2. Proteínas Placentárias
Como órgão endócrino, a placenta sintetiza uma grande variedade de
substâncias biologicamente ativas, das quais a maior parte é de origem
protéica (BOHN, 1985). As substâncias produzidas pela placenta, na
maioria dos casos, são idênticas a produtos sintetizados pelos tecidos
normais de indivíduos adultos. Em outros casos, entretanto, estes
compostos são considerados como substâncias específicas à gestação, não
possuindo similares detectáveis em indivíduos não-gestantes (GORDON &
CHARD, 1979).
No que diz respeito à realização de pesquisas fundamentais sobre as
proteínas placentárias, diversas equipes têm investigado suas características
físico-químicas assim como suas funções no organismo materno. No que
diz respeito às suas funções, é sabido, por exemplo, que nos primatas e na
égua, uma gonadotrofina coriônica permite a manutenção do corpo lúteo
(ASCHHEIM, 1927), enquanto que nas espécies ruminantes, essa
manutenção é assegurada por um fator anti-luteolítico chamado interferon
tau (MARTAL et al., 1979). Além de fator anti-luteolítico, o interferon tau
funciona ainda como um fator estimulante da síntese da progesterona. Em
adição a estas ações, esta proteína parece também exercer uma função
importante, principalmente nas primeiras etapas da gestação, na tolerância
imunológica do embrião/feto pela mãe (FILLION et al., 1991; MARTAL
et al., 1997).
Num estado mais avançado da gestação, a placenta sintetiza as
proteínas associadas à gestação (ZOLI et al., 1992a), assim como
hormônios lactogênios placentários, os quais são responsáveis pela
estimulação da atividade mamogênica (FORSYTH, 1986), estando também
57
envolvidos, ao menos parcialmente, no crescimento fetal (CHENE et al.,
1988) e no metabolismo materno (FREEMARK et al., 1992).
FIGURA 8 -
Micrografia eletrônica do placentoma de vacas no 150o dia de gestação
fixadas em araldite. Os grânulos secretórios foram corados pelo ácido
fosfotungstico. A interrupção da junção microvilositária entre o
trofoectoderma (T) e o epitélio uterino (U) é indicada por flechas. A)
Migração das células trofoblásticas binucleadas em direção à junção
microvilositária; B) Célula binucleada logo após sua fusão com uma
célula epitelial uterina (indicada por asterisco); C) Célula trinucleada
no epitélio uterino. Adaptado de WOODING & BECKERS (1987).
58
Na prática, a partir do momento em que podem ser detectadas na
circulação materna, as proteínas placentárias constituem-se em um
excelente indicador do bem-estar da unidade feto-placentária, sendo
utilizadas correntemente em testes de diagnóstico de gestação e de estudo
da mortalidade embrionária.
2.4.2.1. Gonadotrofinas coriônicas (CG)
As espécies humana e eqüina, há muito tempo, são conhecidas como
produtoras, ao nível placentário, de hormônios gonadotróficos. Já em 1927,
ASCHHEIM relatou a presença de um fator gonadotrófico na urina da
mulher grávida, baseando neste fato o seu famoso método de detecção de
gravidez (ASCHHEIM & ZONDEK, 1928a,b). Dois anos mais tarde,
COLE & HART (1930) demonstraram a existência de uma atividade
gonadotrófica no soro de éguas gestantes. Devido à suas propriedades
gonadotróficas, a estas substâncias foram dados os nomes de gonadotrofina
coriônica humana (hCG) e gonadotrofina coriônica eqüina (eCG), também
conhecida por gonadotrofina sérica da égua prenhe (PMSG).
a) Gonadotrofina coriônica humana
O hCG é uma glicoproteína com uma massa molecular aparente de
38,4 kDa e pI situado entre 3,8 e 5,1. Ele é composto de duas subunidades
não-covalentemente ligadas (α e β). A subunidade α compreende uma
cadeia peptídica de 92 aminoácidos (BELLISARIO et al., 1973), possuindo
duas cadeias laterais de oligossacarídeos ligados aos resíduos 52 e 78 (Asn52 e Asn-78). Esta subunidade é similar às subunidades α do LH porcino,
ovino e humano. A subunidade β do hCG possui 145 aminoácidos
59
(CARLSEN et al., 1973), dos quais 115 são idênticos à subunidade β do
LH humano, possuindo ainda 30 aminoácidos adicionais localizados na
extremidade carboxiterminal da seqüência (LENTZ et al., 1984). A
subunidade β do hCG contém diversas cadeias laterais de carboidratos
ligadas tanto à serinas (Ser-118 ou Ser-119 e Ser-131) quanto à asparaginas
(Asn-13 e Asn-30) (RAMABHADRAN et al., 1984).
Na mulher, a síntese de hCG inicia-se aproximadamente no 8o dia
após o pique pré-ovulatório de LH (MISHELL et al., 1974), aumentando
continuamente durante os três primeiros meses de gestação, para em
seguida, decrescer e manter-se em baixos níveis até o parto. A meia-vida
do hCG, estimada em 8 horas, é consideravelmente superior àquela
estimada para o LH (12 a 50 minutos), o que se deve provavelmente à seu
alto conteúdo em ácido siálico (BOHN, 1985).
b) Gonadotrofina coriônica eqüina
O eCG ou PMSG é a gonadotrofina coriônica específica da égua. Ele
consiste em uma glicoproteína de massa molecular aparente de 45 kDa
(COMBARNOUS et al., 1981). Assim como o hCG, o eCG é composto
por duas subunidades (α e β), sendo a associação destas subunidades
essencial para a sua atividade biológica. Ele é secretado pelas células
trofoblásticas presentes nos cálices endometriais (ALLEN & MOOR, 1972)
a partir do 32o dia de gestação (WOODING et al., 2001), sendo seu pique
alcançado entre o 50o e 70o dias (MARTINUK et al., 1990). Ao contrário
do observado para o hCG, a secreção de eCG ocorre somente durante o
primeiro trimestre de gestação, não sendo o mesmo detectável próximo à
parturição.
60
c) Gonadotrofina coriônica em ruminantes
A existência de uma atividade do tipo LH em extratos cotiledonários
fetais de espécies ruminantes foi descrita durante anos por diversos grupos
de pesquisa (FOSTER, 1956; FOOTE & KAUSHIK, 1963; AILENBERG
& SHEMESH, 1983; BECKERS et al., 1988). Entretanto, apesar de
inúmeras tentativas, não foi possível isolar-se e caracterizar a seqüência de
aminoácidos N-terminal da(s) molécula(s) teoricamente responsável(is)
pela atividade gonadotrófica observada nestas espécies.
A questão da existência ou não de uma substância gonadotrófica na
placenta de bovinos somente foi parcialmente elucidada em 1994 por XIE
et al., os quais demonstraram que o ADN complementar correspondente à
«gonadotrofina coriônica» isolada em bovinos por BECKERS et al. (1988)
correspondia, na verdade, a uma nova forma de proteína associada à
gestação, pertencente à superfamília das proteases aspárticas, sendo a
mesma distinta das seqüências descritas para o hCG e eCG. Uma outra
resposta a esta questão foi dada por NILSON et al. (1991), os quais
demostraram que a expressão do gene codificante da subunidade α,
essencial à atividade luteotrópica do LH e das CGs, seria possível no tecido
hipofisário de todas as espécies de mamíferos, mas restrita às placentas de
eqüinos e primatas.
Com base em ambos argumentos, foi sugerido recentemente que a
atividade coriônica detectada previamente em extratos placentários de
bovinos pelo uso de radioreceptores do tipo LH, seria devida a uma
ativação não-específica dos receptores, e não à existência de gonadotrofinas
coriônicas nesta espécie (BECKERS et al., 1994). Uma ativação
inespecífica de receptores do tipo LH/hCG foi previamente demonstrada
61
para a quimotripsina, uma serina protease expressa no intestino de
mamíferos (WILLEY & LEINDENBERGER, 1989)
2.4.2.2. Interferons tau (IFNττ)
Nas espécies bovina, ovina e caprina, a transformação do corpo lúteo
cíclico em gestacional é induzida pela ação de um fator protéico sintetizado
pelo concepto próximo à sua implantação. Este fator, o qual foi
inicialmente denominado trofoblastina (MARTAL et al., 1979) ou proteína
trofoblástica (GODKIN et al., 1984), foi recentemente caracterizado como
pertencente a uma subclasse distinta da família do interferon alfa, ao qual
se designou interferon tau (IFNτ) (CHARPIGNY et al., 1988; ROBERTS
et al., 1992).
Os primeiros estudos que demonstraram a presença de um fator antiluteolítico produzido pelo concepto de ruminantes foram realizados por
MOOR & ROWSON (1966), os quais transferiram embriões ovinos de 14
a 16 dias a fêmeas não-gestantes antes do 12o dia do ciclo estral,
observando a manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual.
No ano seguinte, os mesmos autores homogeneizaram embriões ovinos de
14 a 16 dias e injetaram o homogenato no útero de ovelhas receptoras antes
do 12o dia do ciclo sexual, obtendo-se resultados idênticos, ou seja, a
manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual. Este fenômeno
não foi contudo observado quando os embriões usados tinham entre 21-23
dias de idade (ROWSON & MOOR, 1967).
O IFNτ, sinal de reconhecimento da gestação em espécies ruminantes,
consiste em um hormônio anti-luteolítico parácrino que age no epitélio
uterino para inibir a liberação de PGF2α, assegurando desta forma a
62
manutenção de um corpo lúteo funcional.
a) Interferon tau bovino
A existência de uma proteína produzida pelo trofoblasto de conceptos
bovinos capaz de prolongar a vida do corpo lúteo, foi descrita pela primeira
vez por NORTHEY & FRENCH em 1980. Eles injetaram o
homogeneizado de extratos de embriões bovinos de 17 a 19 dias à fêmeas
receptoras durante os primeiros 16 dias do ciclo estral, impedindo assim a
regressão do corpo lúteo.
O interferon tau bovino (bIFNτ) demonstrou ter atividade luteotrófica,
sendo capaz de estimular a síntese de progesterona em células luteínicas
(BEAL et al., 1981; HICKEY & HANSEL, 1987). Conforme revisado por
HANSEN et al. (1999), o IFNτ interage com receptores endometriais
provavelmente através dos receptores para o interferon do tipo I, inibindo a
expressão dos receptores para estradiol e prevenindo assim o aumento da
expressão de receptores para ocitocina estrógeno-dependentes. Esta
inibição, associada à ativação do inibidor da ciclo-oxigenase, resulta na
supressão da liberação pulsátil de PGF2α pelo útero assim como no
favorecimento da síntese de PGE (ASSELIN et al., 1997; XIAO et al.;
1999).
Duas formas de IFNτ bovino (bIFNτ-1 e bIFNτ-2) foram isoladas por
HELMER et al. (1987, 1988) a partir do cultivo de células trofoblásticas
provenientes de conceptos bovinos de 17 a 18 dias. Essas proteínas
possuíam massas moleculares de 22 e 24 kDa e pontos isoelétricos de 6,5 e
6,7, respectivamente. Conforme descrito por HELMER et al. (1988), a
forma de 24 kDa constitui-se em uma glicoproteína complexa, enquanto
63
que a forma de 22 kDa constitui-se em uma glicoproteína simples, rica em
manose. Recentemente, uma terceira classe de IFNτ bovino foi descrita em
conceptos de bovinos (bIFNτ-3), sendo a mesma expressa sob a forma de 5
variantes (LARSON et al., 2001).
Os interferons tau bovinos são exclusivamente expressos em células
mononucleadas do trofoblasto (MORGAN et al., 1993). Eles são os
principais produtos secretados pelo concepto bovino entre os dias 16 e 25
após a fecundação (HELMER et al., 1987), sendo constituídos de cadeias
de aminoácidos glicosiladas de 172 a 195 resíduos (IMAKAWA et al.,
1989; LARSON et al., 1999). Quando comparadas entre si, a seqüência de
aminoácidos do boIFNτ-1 apresenta uma identidade de 98,26 % com o
bIFNτ-2 e de 97,67 % com o bIFNτ-3. Apesar de serem um importante
produto de secreção, o interferon τ bovino é liberado localmente no lúmen
uterino, não podendo ser detectado na circulação periférica materna.
b) Interferon tau ovino
O interferon tau ovino (oIFNτ) foi purificado inicialmente por
GODKIN et al. (1982) a partir de blastocistos ovinos de 13 a 21 dias. Ele
possui uma massa molecular de 17 kDa e um ponto isoelétrico de 5,5,
sendo produzido pelas células trofoblásticas entre o 12o e o 21o dias de
gestação (MARTAL et al., 1979). Sua secreção máxima ocorre entre o 15o
e 16o dias de gestação, período que corresponde à implantação (ROBERTS
et al., 1992).
A administração de oIFNτ no útero de ovelhas entre o 10o e o 12o dias
do ciclo estral prolonga a vida do corpo lúteo em dias e até meses
(MARTAL et al., 1979; ELLINWOOD et al., 1979; HEYMAN et al.,
64
1984; HARIDON et al., 1995), sendo seu mecanismo de ação
provavelmente relacionado ao mecanismo previamente descrito em
bovinos.
Até o presente, foram identificados 11 genes codificantes para
diferentes IFNτ ovinos (oIFNτ-1 a oIFNτ-11) (IMAKAWA et al., 1987;
STEWART et al., 1989; KLEMANN et al., 1990; LEAMAN &
ROBERTS, 1992; NEPHEW et al., 1993), os quais codificam proteínas
com seqüências bastante similares, mas com diferentes atividades
biológicas e padrões de expressão (WINKELMAN et al., 1999).
c) Interferon tau caprino
A existência de uma proteína de massa molecular de 17 kDa, capaz de
prolongar a vida do corpo lúteo caprino foi verificada inicialmente por
GNATEK et al. (1989). Recentemente, uma outra forma de IFNτ caprino
(cIFNτ) de massa molecular 22-24 kDa foi purificada e sequenciada em sua
extremidade N-terminal, sendo ambas as formas correspondentes a uma
mesma seqüência de aminoácidos (GUILLOMOT et al., 1998). Segundo
descrito por LEAMAN & ROBERTS (1992), o caIFNτ é constituído por
uma seqüência de 195 aminoácidos, possuindo uma seqüência sinal de 23
aminoácidos e uma cadeia madura de 172 aminoácidos.
Conforme sugerido por GUILLOMOT et al. (1998), o cIFNτ é
expresso no 17o dia de gestação, não sendo entretanto detectado a partir do
18o dia de gestação, o que indicaria a existência de outros fatores
luteotróficos responsáveis pela manutenção do corpo lúteo nesta espécie.
65
2.4.2.3. Factor Precoce de Gestação (EPF)
Apesar da existência de um fator precoce produzido pelo embrião logo
após a
fecundação ser contestada por
alguns
especialistas em
endocrinologia placentária, julgamos necessária sua menção na presente
revisão sobre proteínas placentárias devido ao caráter histórico deste
estudo.
Os primeiro artigo descrevendo a existência de um fator precoce de
gestação (Early Pregnancy Factor ou EPF) foi publicado por MORTON et
al. em 1974. Este ‘fator’ foi descrito como uma substância detectável no
soro de camundongas prenhas durante as primeiras horas após a
fecundação. A detecção do EPF somente foi possível pela utilização do
teste da inibição de rosetas, uma técnica imunológica baseada na
capacidade de algumas substâncias em inibir o ataque de hemácias
provenientes de um animal, pelos linfócitos provenientes de um outro
indivíduo. Apesar de ser usado ainda hoje para a detecção do EPF (CRUZ
et al., 2001), este teste é bastante inespecífico, podendo ter seus resultados
alterados por outros fatores tais como a presença de substâncias imunosupressoras nas amostras a serem testadas.
Pelo uso do teste de inibição de roseta, foi possível a identificação do
EPF na circulação periférica materna das espécies murina (Mus musculus),
humana (Homo sapiens), ovina (Ovis aries), bovina (Bos taurus), porcina
(Sus scrofa), leporina (Oryctogalus cuniculus), eqüina (Equus caballus),
assim como em camundongos marsupiais (Sminthopsus macroura)
(MORTON et al., 1974,1977,1979; NANCARROW & WALLACE, 1980;
MORTON et al., 1983; SUEOKA et al., 1989; TAKAGI et al., 1998;
CRUZ et al., 2001).
66
Apesar da precocidade atribuída à detecção do EPF pelo teste de
inibição da roseta, a dificuldade na execução deste teste (KOCH et al.,
1983) e as relativamente baixas sensibilidade e especificidade obtidas pelo
uso deste método colocou em dúvida sua fiabilidade como método de
diagnóstico de gestação (CHAOUAT & MENU, 1993).
A questão da existência ou não de um fator precoce de gestação
produzido pelo embrião somente foi parcialmente esclarecida recentemente
por CAVAGNAGH & MORTON (1994) os quais caracterizaram o EPF
como sendo uma chaperonina 10. Segundo esses autores, a chaperonina 10
poderia ser a molécula responsável pela inibição da formação de rosetas, e
por conseqüência, possuidora de uma forte ação imunosupressora local
(MORTON et al., 1992; MORTON, 1998).
2.4.2.4. Hormônios lactogênios placentários (PL)
Os hormônios lactogênios placentários (PL), também conhecidos por
somatomamotrofinas coriônicas (CS), são hormônios protéicos possuidores
de uma conformação estrutural e funcional bastante semelhante à do
hormônio de crescimento e da prolactina.
A função dos hormônios lactogênios placentários varia de acordo com
a espécie. Em geral foi sugerido que estes hormônios influenciam a
mamogênese e a lactogênese (FORSYTH, 1986; BUTTLE et al., 1972), a
esteroidogênese ovariana (GLASER et al., 1984; TELLERIA et al., 1998)
e placentária (DEAYTON et al., 1993), o crescimento fetal (CHENE et al.,
1988), alterando ainda o metabolismo materno para se adaptar ao do feto,
contribuindo desta forma para o crescimento e desenvolvimento fetal
(FREEMARK et al., 1992).
67
a) Hormônio lactogênio placentário bovino
Estudos
relacionados
aos
hormônios
lactogênios
placentários
precederam os trabalhos envolvendo as proteínas específicas ou associadas
à gestação em ruminantes domésticos. Em bovinos, a atividade lactogênica
dos cotilédones foi primeiramente demonstrada por BUTTLE &
FORSYTH (1976). Este estudo pioneiro foi efetuado recorrendo ao uso de
uma co-cultura de células do tecido mamário de rata e de tecido
cotiledonário de vaca em diferentes estádios de gestação, durante um
período de 5 dias. Com este trabalho, foi obtida uma substância lactogênica
com atividade equivalente a cerca de 300 ng de prolactina bovina.
Purificações realizadas ao mesmo tempo a partir do uso de placentas
bovinas por várias equipes de investigação (BOLANDER & FELLOWS,
1976; BECKERS et al., 1980; MURTHY et al., 1982) permitiram a
identificação de uma proteína com atividade somatomamotrópica,
denominada mais tarde de somatomamotrofina coriônica bovina (bCS).
O hormônio lactogênio placentário bovino (bPL) existe em várias
isoformas com diferentes massas moleculares (32 a 34 kDa) e pontos
isoelétricos
(4,0
a
6,0)
(MURTHY et
al.,
1982). Ele
possui
aproximadamente 48 % de identidade com a prolactina (PRL) e 26 a 28 %
com o hormônio do crescimento (GH). Entretanto, como sugerido por
BECKERS (1983), nenhuma reação cruzada pôde ser observada entre esses
3 hormônios por radioimunoensaio.
O
bPL
é
produzido
pelas
células
coriônicas
binucleadas
(VERSTEGEN et al., 1985; KAPES et al., 1992), as quais secretam o
conteúdo de seus grânulos na circulação materna após sua migração e fusão
com células do epitélio endometrial (BECKERS, 1983). Em contraste com
68
outros hormônios lactogênios placentários, o PL é uma glicoproteína que
contém sítios cadeias laterais de carboidratos ligadas à asparagina
(SHIMOMURA & BREMEL, 1988; BYATT et al., 1987). Esta
composição glicoprotéica, característica também de outras proteínas
placentárias tais como a PAG pode resultar de um mecanismo póstraducional altamente desenvolvido existente nas células gigantes do
trofoblasto de bovinos.
O bPL é detectado na circulação materna a partir do quarto mês de
gestação (BECKERS, 1983) mas a sua concentração permanece inferior a 2
ng/ml durante a gestação (FIGURA 9). Na circulação periférica do feto a
concentração de bPL é mais elevada (5-25 ng/ml) e apresenta um declínio
com o avanço da gestação (BECKERS et al., 1982; BYATT et al., 1987).
Estas concentrações fetais superiores às maternas são bastante diferentes
das observadas para a PAG bovina, apesar da co-localização de ambas as
proteínas placentárias nas mesmas células.
b) Hormônio lactogênio placentário ovino
O hormônio lactogênio placentário ovino (oPL) é uma holoproteína de
massa molecular 22 kDa e pontos isoelétricos entre 6,8 e 8,8 (CHAN et al.,
1976), secretada pelas células binucleadas de ovelhas gestantes
(WOODING, 1981). Ele é sintetizado a partir do 16o dia de gestação
(REDDY & WATKINS, 1978), somente sendo detectado na circulação
periférica materna a partir do 48o dia de gestação. Seus níveis séricos
aumentam gradativamente para alcançar um pique entre o 131o e 141o dias
de gestação (CHAN et al., 1978).
69
FIGURA 9 -
Perfil das concentrações plasmáticas do hormônio lactogênio
placentário bovino dosado na circulação materna e fetal. Adaptado de
BECKERS et al. (1982).
O oPL possui uma cadeia de 198 aminoácidos, apresentando uma
identidade de 69 % com o bPL, de 52 % com o oPRL e de 28 % com o
oGH (COLOSI et al., 1989). Ele parece estar envolvido no metabolismo
intermediário
materno
e
no
desenvolvimento
mamário
e
fetal
(FREEMARK et al., 1992).
c) Hormônio lactogênio placentário caprino
O hormônio lactogênio placentário caprino (cPL) foi o primeiro
hormônio lactogênio placentário identificado em ruminantes (BUTTLE et
70
al., 1972), tendo sido purificado até a homogeneidade por CURRIE et al.
(1990). Ele é uma proteína de massa molecular 22,5 kDa e ponto
isoelétrico 8,35, sendo detectável na circulação periférica materna a partir
do 44o dia de gestação. As concentrações de cPL aumentam continuamente
durante a gestação até uma semana antes do parto (CARD et al., 1988).
Uma correlação positiva entre o número de fetos e a concentração
plasmática de cPL foi observada no terço final da gestação (HAYDEN et
al., 1979; HAYDEN et al., 1980; CARD et al., 1988).
2.4.2.5. Proteínas específicas ou associadas à gestação (PAGs)
Caracterizadas nos últimos 20 anos, as PAGs constituem uma grande
família de glicoproteínas expressas por células mononucleadas ou
binucleadas da placenta de espécies unguladas (GREEN et al., 2000;
GARBAYO et al., 2000). Elas apresentam um grau de identidade variável
entre suas seqüências de aminoácidos, possuindo uma identidade superior a
50 % com a seqüência da pepsina, catepsinas D e E e renina (XIE et al.,
1991), o que as classifica como pertencentes à superfamília das proteases
aspárticas (GURUPRASAD et al., 1996; HUGHES et al., 2000). Apesar da
forte identidade observada com enzimas cataliticamente ativas, a maior
parte das PAGs identificadas até o presente constituem-se em formas
enzimaticamente inativas. Isto se deve, provavelmente, à substituição de
alguns aminoácidos em regiões críticas de seus sítios catalíticos
(GURUPRASAD et al., 1996).
Diversas formas de PAG foram purificadas a partir da placenta das
taurinos (BUTLER et al., 1982; CAMOUS et al., 1988; ZOLI et al., 1991),
ovinos (ZOLI et al., 1995; XIE et al., 1997a), caprinos (GARBAYO et al.,
71
1998), e de cervídeos (HUANG et al., 1999), sendo possível verificar a
expressão de ADN codificantes para novos membros da família das PAGs
em placentas de suínos (SZAFRANSKA et al., 1995), zebras (GAN et al.,
1997), eqüinos (GREEN et al., 1998), felinos (GREEN et al., 1998) e
camundongos (CHEN et al., 2001). Após terem sido isoladas, algumas
proteínas da família das PAGs foram usadas para imunizar coelhos e o antisoro obtido permitiu o desenvolvimento de ensaios radioimunológicos
homólogos (ZOLI et al., 1992a) e heterólogos (RANILLA et al., 1994;
GONZALEZ et al., 1999) para a detecção de PAG no soro sangüíneo
(ZOLI et al., 1992a), plasma (PATEL et al., 1997) ou leite (GONZALEZ et
al., 2001) de diferentes espécies de mamíferos euterianos (TABELA 3). A
dosagem radioimunológica da PAG representa atualmente um ótimo
método de diagnóstico de gestação bem como de estudo da função do
trofoblasto, podendo auxiliar no manejo da reprodução bem como na
investigação dos diferentes aspectos patológicos que possam afetar a
gestação (ZARROUK et al., 1999a,b; DOBSON et al., 1993).
a) Família das PAGs bovinas (boPAGs)
As PAGs, também conhecidas por diversos outros nomes como
proteína específica da gestação B (PSPB) (BUTLER et al., 1982), antígeno
SBU-3 (GOGOLIN-EWENS et al., 1986) e proteína sérica da gestação 60
kDa (PSP-60) (MIALON et al., 1993) foram inicialmente descritas como
antígenos placentários, detectáveis no sangue materno do bovinos logo
após o início da implantação (BUTLER et al., 1982).
A metodologia empregada por ZOLI et al. (1991) para a purificação
da PAG foi bastante similar à metodologia previamente empregada por
72
TABELA 3 -
Identificação de proteínas específicas ou associadas à gestação em mamíferos
euterianos.
Espécie
Bovina (Bos taurus)
Suidaee
Felidae
Equidae
Cervidae
Bovidae
Ovina (Ovis aries)
Detecção na circulação
materna ou no leite
SASSER et al., 1986, 1989
HUMBLOT et al., 1988a,b
ZOLI et al., 1992a
DOBSON et al., 1993
MIALON et al., 1993
PATEL et al., 1997
RANILLA et al., 1994, 1997
GAJEWSKI et al., 1999
Caracterização bioquímica Identificação por biologia
molecular
BUTLER et al. 1982
XIE et al., 1991, 1994,
CAMOUS et al., 1988
1997b
ZOLI et al., 1991
GREEN et al., 2000
ATKINSON et al., 1993
ZOLI et al., 1995
WILLARD et al., 1995
XIE et al., 1997a
GARBAYO et al., 1998
Caprina (Capra hircus) HUMBLOT et al., 1990
FOLCH et al., 1993
SOUSA et al., 1999
GONZÁLEZ et al., 2000, 2001
BATALHA et al., 2001
Ibex espanhola
FERNÁNDEZ-ARIAS et al.,
(Capra pyrenaica)
1999
Cabrito montês
HOUSTON et al., 1986
(Oreamnos
americanus)
Boi almiscarado
ROWELL et al., 1989
(Ovibus moschatus)
Bisão americano
HAIGH et al., 1991
(Bison bison)
Búfalo asiático
DEBENEDETTI et al., 2001
(Bubalus bubalis)
Alce (Alces alces)
HAIGH et al., 1993
HUANG et al., 1999
HUANG et al., 2000
Veado nobre
HAIGH et al., 1988
HUANG et al., 1999
(Cervus elephus)
WILLARD et al., 1994b
HUANG et al., 2000
Veado orelhudo
WOOD et al., 1986
(Odocoileus hemionus)
Veado da cauda branca WOOD et al., 1986
(Odocoileus
OSBORN et al., 1996
virginianus)
Sika (Cervus nippon) WILLARD et al., 1994a
Gamo (Dama dama) WILLARD et al., 1994c
Rena
RUSSEL et al., 1998
(Rangifer tarandus)
ROPSTAD et al., 1999
Eqüina (Equus
caballus)
Zebra (Equus zebra)
Felina (Felis
domestica)
-
Porcina (Sus scrofa)
-
-
XIE et al., 1991, 1997a,b
GARBAYO et al., 2000
-
-
-
GAN et al., 1997
GREEN et al., 1999
GAN et al., 1997
GREEN et al., 1998
GAN et al., 1997
BAUMBACH et al., 1988 SZAFRANSKA et al.,
DORÉ et al., 1996
1995, 2001
73
BUTLER et al. em 1982. Resumidamente, após a produção de anti-soros
de primeira geração, obtidos pela imunização de coelhos contra extratos
placentários bovinos, estes foram imuno-adsorvidos contra as proteínas
majoritárias presentes em fêmeas não gestantes. O antisoro clarificado
assim obtido foi em seguida utilizado para o monitoramento das frações
mais imunoreativas ao longo do protocolo de purificação, o qual incluiu a
extração de proteínas solúveis, seguida de precipitações ácida e por sulfato
de amônia, gel filtrações e cromatografia de troca de íons.
O antisoro obtido por BUTLER et al. (1982) permitiu a purificação
parcial de dois antígenos: a proteína específica da gestação A (PSPA) e a
proteína específica da gestação B (PSPB). A PSPA foi identificada como
sendo uma alfa-fetoproteína, a qual é encontrada na circulação de fêmeas
não-gestantes, enquanto que a PSPB foi identificada como uma proteína
específica da placenta, expressa sob a forma de diferentes massas
moleculares (47 a 53 kDa) e pontos isoelétricos (4,0 a 4,4). Contrariamente
à diversidade de massas moleculares obtidas por BUTLER et al. (1982),
uma única proteína majoritária de massa molecular 67 kDa foi obtida por
ZOLI et al. (1991), apresentando a mesma 4 pontos isoelétricos.
Diferentes moléculas da família das PAGs foram identificadas e
denominadas de modo arbitrário até a presente data. As principais formas
isoladas por procedimentos bioquímicos ou por técnicas de biologia
molecular serão descritas a seguir.
➾boPAG-1
A boPAG67, também conhecida como boPAG-1, foi purificada por
ZOLI et al. em 1991 e caracterizada em toda a sua seqüência de
74
aminoácidos por XIE et al. em 1991 (FIGURA 10). Ela demonstrou ser
uma proteína ácida de 380 aminoácidos, de massa molecular 67 kDa, e com
quatro isoformas (I, II, III e IV) as quais diferem em pontos isoelétricos
(4,4; 4,6; 5,2 e 5,4). A quantidade de ácido siálico (2,12 %, 0,83 %, 0,64 %
e 0,29 %) de cada uma das isoformas está diretamente relacionada com
seus pontos isoelétricos e com sua imunoreatividade (ZOLI et al., 1991).
Estudos
imunocitoquímicos
permitiram
detectar
a
boPAG-1
predominantemente no citoplasma de células binucleadas presentes nos
tecidos dos cotilédones (ZOLI et al., 1992b). A presença de antígenos
imunologicamente idênticos à boPAG-1 foram também encontrados em
extratos de ovários e testículos (ZOLI et al., 1990), o que justifica o
adjetivo associadas e não específicas atribuídas à PAG.
O fato mais surpreendente da boPAG-1 após a sua purificação foi a
descoberta de que esta proteína pertence à uma família de enzimas
proteolíticas (XIE et al., 1995), as quais são conhecidas como proteases
aspárticas, possuindo uma grande identidade em aminoácidos com as
seqüências da pepsina, da catepsina D e da catepsina E (XIE et al., 1991).
A boPAG-1 conservou a estrutura bilobulada característica de todas as
proteases aspárticas caracterizadas até o presente em eucariotas (FIGURA
11). Ela possui uma fenda entre os lobos capaz de acomodar peptídeos de
até 7 aminoácidos de comprimento (GURUPRASAD et al., 1996).
Contudo, apesar de sua similaridade estrutural com outras proteases
aspárticas (GURUPRASAD et al., 1996), a maioria das PAGs são
consideradas como moléculas cataliticalmente inativas devido às mutações
em seu sítio ativo XIE et al. (1991) (TABELA 4).
75
1
11
Met Lis Trp Leu Val Leu Leu Gli Leu Val Ala Fen Ser Glu Cis Ile Val Lis Ile Pro
Sinal
21
Propeptídeo
31
Leu Arg Arg Leu Lis Tre Met Arg Asn Val Val Ser Gli Lis Asn Met Leu Asn Asn Fen
Propeptídeo
41
51
*
Leu Lis Glu His Ala Tir Ser Leu Ser Gln Ile Ser Fen Arg Gli Ser Asn Leu Tre Tre
Propeptídeo
Sequência N-terminal
61
71
*
His Pro Leu Arg Asn Ile Lis Asp Leu Val Tir Met Gli Asn Ile Tre Ile Gli Tre Pro
Sequência N-terminal
81
91
Pro Gln Glu Fen Gln Val Val Fen Asp Tre Ala Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Asp
Sítio catalítico
101
111
Fen Cis Tre Ser Pro Ala Cis Ser Tre His Val Arg Fen Arg His Leu Gln Ser Ser Tre
121
*
131
Fen Arg Leu Tre Asn Lis Tre Fen Arg Ile Tre Tir Gli Ser Gli Arg Met Lis Gli Val
141
151
Val Val His Asp Tre Val Arg Ile Gli Asn Leu Val Ser Tre Asp Gln Pro Fen Gli Leu
161
171
Ser Ile Glu Glu Tir Gli Fen Glu Gli Arg Ile Tir Asp Gli Val Leu Gli Leu Asn Tir
181
*
191
Pro Asn Ile Ser Fen Ser Gli Ala Ile Pro Ile Fen Asp Lis Leu Lis Asn Gln Arg Ala
201
211
Ile Ser Glu Pro Val Fen Ala Fen Tir Leu Ser Lis Asp Glu Arg Glu Gli Ser Val Val
221
231
Met Fen Gli Gli Val Asp His Arg Tir Tir Glu Gli Glu Leu Asn Trp Val Pro Leu Ile
241
251
Gln Ala Gli Asp Trp Ser Val His Met Asp Arg Ile Ser Ile Glu Arg Lis Ile
261
Ile Ala
271
Cis Ser Asp Gli Cis Lis Ala Leu Val Asp Tre Gli Tre Ser Asp Ile Val Gli Pro Arg
Sítio catalítico
281
291
Arg Leu Val Asn Asn Ile His Arg Leu Ile Gli Ala Ile Pro Arg Gli Ser Glu His Tir
301
311
Val Pro Cis Ser Glu Val Asn Tre Leu Pro Ser Ile Val Fen Tre Ile Asn Gli Ile Asn
321
331
Tir Pro Val Pro Gli Arg Ala Tir Ile Leu Lis Asp Asp Arg Gli Arg Cis Tir Tre Tre
341
351
Fen Gln Glu Asn Arg Val Ser Ser Ser Tre Glu Tre Trp Tir Leu Gli Asp Val Fen Leu
361
371
Arg Leu Tir Fen Ser Val Fen Asp Arg Gli Asn Asp Arg Ile Gli Leu Ala Arg Ala Val
FIGURA 10 -
Seqüência de aminoácidos da boPAG-1 deduzida a partir da
seqüência em ADN por XIE et al. (1991). Estão indicados as
seqüências sinal, o propeptídeo, a extremidade N-terminal (20
aminoácidos) assim como a cadeia madura. As flechas indicam o
final do segmento sinal e do propeptídeo. Os sítios catalíticos
encontram-se circundados. Sítios potenciais de glicosilação são
indicados por asteriscos.
76
A)
FIGURA 11 -
B)
A) Representação da estrutura cristalizada da boPAG-1. B) Estrutura
tridimensional atribuída à PAG acoplada à pepstatina A (situada entre
P3’ e P4’). Adaptado de GREEN et al. (1998).
Conforme discutido no seção sobre proteases aspárticas, a atividade
catalítica das proteases aspárticas é dependente da existência de dois
resíduos de ácido aspártico (Asp) os quais, apesar de situarem-se em lobos
opostos da proteína, encontram-se bastante próximos no interior do sítio
catalítico. Cada um destes resíduos é precedido de um aminoácido
hidrófobo (usualmente a fenilalalina – Fen) sendo seguido invariavelmente
de uma treonina (Tre) e de uma glicina (Gli) (DAVIES, 1990). A
conformação secundária, na qual uma segunda região altamente conservada
encontra-se em torno de cada Asp, também é requerida para a polarização
das pontes de hidrogênio da molécula de água que hidrolisa o substrato
(JAMES & SIELECKI, 1986).
Como demonstrado por XIE et al. (1991), a aparente ausência de
atividade proteolítica da boPAG-1 é devida à presença de alanina (Ala-76)
no local onde normalmente existe glicina (Gli-76). Esta mutação tem como
77
conseqüência o deslocamento da molécula catalítica da água da sua posição
simétrica normal, originando a inatividade desta proteína (DAVIES, 1990).
TABELA 4 -
Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio catalítico de diversas
PAGs. Estão indicados (inclusos em retângulos) os aminoácidos que
diferem da seqüência normal encontrada em proteases
enzimaticamente ativas tais como o pepsinogênio. Informações sobre
as seqüências de aminoácidos foram obtidas do banco de dados
GenBank.
Protease
Aspártica
Origem
Atividade
Proteolítica?
Pepsinogênio
Macaco
Sim
boPAG-1
Bovino Provavel/ não Fen Asp Tre Ala Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser
boPAG-2
Bovino Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Leu Asp Tre Gli Tre Ser
boPAG-8
Bovino Desconhecido Val Asp Tre Gli Trer Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser
ovPAG-1
Ovino Provavel. não Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Gli Tre Gli Tre Ser
poPAG-1
Suíno Provavel. não Fen Asp Tre Leu Ser Ser Leu Asp Ser Gli Ser Ala
poPAG-2
Suíno Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser
eqPAG-1
Eqüino Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser
zePAG
Zebra Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser
fePAG
Gato
Extremidade N-terminal
Extremidade C-terminal
Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser
Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ser Ile Asp Tre Gli Tre Ser
➾boPAG-2
Em 1994, XIE et al. caracterizaram a proteína coriônica anteriormente
isolada por BECKERS et al. (1988) como sendo um novo membro da
família das proteases aspárticas, ao qual foi dado o nome de boPAG-2
(BECKERS et al., 1994). Esta glicoproteína foi caracterizada como sendo
um polipeptídeo de 372 aminoácidos estruturalmente semelhante à boPAG-
78
1, à ovPAG-1 e à pepsina (com uma seqüência de 58 %, 58 % e 51 % dos
aminoácidos idênticos, respectivamente).
A classificação da suposta gonadotrofina coriônica de bovinos como
sendo uma protease foi surpreendente mas não a primeira observação de
similaridades entre hormônios placentários e proteases. De fato, WILLEY
& LEIDENBERGER (1989) foram os primeiros a demonstrar uma grande
identidade entre as seqüências de aminoácidos do hCG e da serina protease
quimotripsina. No mesmo estudo, eles também descreveram a redução da
ligação do hCG a seu receptor quando da adição de inibidores de proteases
tais como a ‘soy bean trypsin’ (SBI).
O ADN codificante para a boPAG-2 é detectado a partir do 17o dia de
gestação, coincidindo com o inicio da implantação (GREEN et al., 2000).
Entretanto, diferente da boPAG-1, a boPAG-2 ainda não foi purificada até
a homogeneidade, não podendo ser usada para o desenvolvimento de
dosagens radioimunológicas que permitam sua detecção na circulação
sangüínea materna.
Contrariamente ao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 tem um
centro catalítico com uma seqüência de aminoácidos idêntica a outras
proteases aspárticas ativas. Uma possível atividade proteolítica da boPAG2 necessita ser comprovada em futuros estudos.
➾boPAG-3 a boPAG-21
Até o presente, como resultado do uso de técnicas de biologia
molecular, foram identificados 21 ADNs codificantes para diferentes PAGs
em bovinos (XIE et al., 1991; XIE et al., 1994; XIE et al., 1997b; GREEN
et al., 2000). O primeiro ADN corresponde à boPAG67 previamente
79
purificada por ZOLI et al. (1991) e o segundo à proteína previamente
identificada por BECKERS et al., 1988 como sendo uma gonadotrofina
coriônica. Os demais ADNs foram identificados em tecidos placentários
apenas por técnicas de biologia molecular, não tendo os mesmos sido
encontrados sob a forma de proteínas maduras.
Os diferentes ADNs complementares identificados até o presente
diferem em pelo menos 5 % em sua seqüência de nucleotídeos,
codificando, em sua maioria, proteínas que diferem em ao menos um dos
20 aminoácidos de sua seqüência N-terminal (TABELA 5). Conforme
descrito por HUANG et al. (2000) e GREEN et al. (2000), as diferentes
PAGs identificadas em taurinos podem ser agrupadas em 3 principais
categorias: a categoria das PAGs do tipo 1 (boPAG-1, -3, -15, -19, -21,
etc.), a categoria das PAGs do tipo 2 (boPAG-2, -12 e –13) e categoria
intermediária entre as PAGs e as enzimas proteolíticas (boPAG-8)
(FIGURA 12).
Conforme descrito por GREEN et al. (2000), a expressão dos
diferentes clones de boPAG parece variar temporal e espacialmente, sendo
algumas formas expressas ao longo de toda a gestação (FIGURA 13), tal
como as boPAGs –8, -10 e -11, ou limitadas durante um determinado
período, tal como a boPAG-9. Evolutivamente, as PAGs expressas em
células binucleadas (FIGURA 14) parecem ser as formas mais recentes
resultantes da duplicação dos genes desta família de proteases aspárticas,
sendo estas formas as únicas passíveis de secreção na circulação periférica
materna. Quando calculadas por curvas de calibração baseadas nas
divergências de seqüências de nucleotídeos, pode ser estimado que o grupo
de PAGs expressas por células binucleadas diverge das expressas
80
difusamente no trofectoderme em aproximadamente 56 ± 6 milhões de anos
(HUGHES et al., 2000).
TABELA 5 -
Seqüência N-terminal das principais formas de PAG identificadas até
o presente. Com exceção da boPAG-1, todas as seqüências foram
deduzidas a partir do ARN mensageiro ou do ADN codificante
obtidos por biologia molecular.
Proteína
Códido de
Acesso
boPAG-1
boPAG-2
boPAG-4
boPAG-5
boPAG-6
boPAG-7
boPAG-8
boPAG-9
boPAG-10
boPAG-11
boPAG-12
boPAG-13
boPAG-14
boPAG-15
boPAG-16
boPAG-17
boPAG-18
boPAG-19
boPAG-20
boPAG-21
Q29432
Q28057
O46492
O46493
O46494
O46495
O46496
O46497
O46498
O46499
O46500
Q9TTW1
Q9TTW0
Q9TTV9
Q9TTV8
Q9TTV7
Q9TTV6
Q9TTV5
Q9TTV4
Q9TTV3
Seqüência N-terminal
1
11
R
N
R
R
R
R
P
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D
S
K
N
R
H
R
R
C
R
R
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V
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G
G
G
G
G
G
G
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G
G
G
G
G
G
G
G
A
G
G
Apesar do imenso interesse econômico que poderia resultar do
isolamento de formas de PAG expressas unicamente no início da gestação,
81
FIGURA 12 - Filograma baseado na seqüência de aminoácidos mostrando o
relacionamento entre todas as PAGs clonadas até o momento, assim
como o de algumas proteases aspárticas presentes em mamíferos.
Adaptado de GREEN et al. (2000).
82
FIGURA 13 -
Variação cronológica do ADN codificante para as PAGs em bovinos
(boPAGs) e ovinos (ovPAGs) ao longo da gestação. Adaptado de
GREEN et al. (2000).
com exceção das boPAG–1, ainda não foi possível purificar-se até a
homogeneidade as proteínas correspondente à estas novas moléculas, não
sendo as mesmas disponíveis para o desenvolvimento de novos testes
radioimunológicos.
83
FIGURA 14 -
Expressão dos ADNs codificantes para PAGs bovinas e ovinas
identificadas até o presente. As PAGs expressas predominantemente
em células binucleadas correspondem a proteínas estreitamente
relacionadas. As PAGs expressas de modo difuso no trofectoderme
representam os mais antigos membros desta família de proteases
aspárticas. Adaptado de GREEN et al. (2000).
b) Família das PAGs ovinas (ovPAGs)
A ovPAG-1 foi a primeira forma de PAG descrita na espécie ovina.
Ela foi isolada e parcialmente caracterizada por ZOLI et al. (1995), sendo
constituída por uma seqüência de 382 aminoácidos. A ovPAG-1
caracteriza-se por possuir massas moleculares variando de 43 a 67 kDa
(XIE et al., 1996), constituindo-se em uma forma enzimaticamente inativa,
tal como a boPAG-1 (XIE et al., 1991). Ela possui aproximadamente 73 %
de sua seqüência de aminoácidos semelhante à da boPAG-1 (XIE et al.,
1991), localizando-se ao nível de células binucleadas do trofoblasto (XIE et
al., 1991).
Uma outra forma de ovPAG, altamente presente em células
mononucleadas da placenta de ovelhas, foi descrita por NAGEL et al.
(1993), sendo esta forma denominada de ovPAG-2. Aparentemente a
84
ovPAG-2 é constituída por uma seqüência de 376 aminoácidos,
apresentando 60 % de sua seqüência semelhante à da ovPAG-1 (NAGEL et
al., 1993). Posteriormente, estudos desenvolvidos por XIE et al. (1997a)
em placentas de ovelhas ao 100o dia de gestação demonstraram a existência
de novas proteínas as quais diferem em massas moleculares (55 kDa, 60
kDa, 61 kDa e 65 kDa) e em seqüências N-terminais, sendo denominadas
respectivamente ovPAG55, ovPAG60, ovPAG61 e ovPAG65. Um número
superior de clones de ADN foram identificados em tecidos placentários,
sendo os mesmos denominados de ovPAG-3 a ovPAG-9 de acordo com a
ordem pela qual foram identificados (XIE et al., 1997a,b). Apenas 2 dos 7
novos clones (ovPAG-3 e ovPAG-7) mostraram ser capazes de codificar
polipeptídeos, sendo ambos expressos nos mesmos tipos de células
binucleadas.
c) Família das PAGs caprinas (caPAGs)
Recentemente, GARBAYO et al. (1998) descreveram mais três
formas de PAG em ruminantes, com diferentes seqüências de aminoácidos
e massas moleculares distintas (62 kDa, 59 kDa e 52 kDa). Estas novas
formas de PAG, purificadas na espécie caprina, foram denominadas
respectivamente de caPAG62, caPAG59 e caPAG55. Cada forma de caPAG
caracterizou-se por possuir diversas isoformas com pontos isoelétricos
distintos. Assim como observado em bovinos, em caprinos, a diferença
observada entre os pontos isoelétricos parece representar diferentes padrões
de glicosilação e/ou fosforilação da PAG.
Diversos clones de PAG diferindo em ao menos 5 % em sua seqüência
nucleotídica, são expressos nas placentas caprinas (caPAG-1 a caPAG-11).
85
Assim como o observado em taurinos e caprinos, a expressão desses clones
é regulada temporal (expressão ao longo de toda a gestação ou restrita a um
determinado
período)
e
espacialmente
(expressão
em
células
mononucleadas, binucleadas ou ambas) (GARBAYO et al., 2000).
d) Outras PAGs
Em suínos foram inicialmente descritas duas formas de PAGs: a
poPAG-1 e a poPAG-2. A poPAG-1 e a poPAG-2 são constituídas por
seqüências de 382 e 387 aminoácidos, respectivamente, sendo ambas
expressas difusamente ao nível de trofectoderma durante o período inicial
da gestação. As poPAGs possuem 63,9 % de identidade entre suas
seqüências de aminoácidos, apresentando, entretanto, apenas 50 % de
identidade
com
relação
às
PAGs
purificadas
em
ruminantes
(SZAFRANSKA et al., 1995). Novas formas de PAGs porcina foram
recentemente descritas por SZAFRANSKA et al. (2001), sendo as mesmas
denominadas poPAG-4, -5 e –6.
A existência de um único gene codificante para PAGs nas espécies
eqüina e felina (GREEN et al., 1998, 1999), em zebras (GAN et al., 1997)
e em camundongos (CHEN et al., 2001), em contraste com a existência de
uma grande diversidade dos mesmos nas espécies ruminantes, parece
sugerir que a duplicação de genes responsável pela diversidade de ADNs
codificantes nas espécies pertencentes à ordem Artyodactyla ocorreu
relativamente recentemente, após a especialização da células binucleadas
presentes na placenta de ruminantes (HUGHES et al., 2000). Segundo os
mesmos autores, uma seleção Darwiniana positiva ao nível dos
aminoácidos presentes nas regiões variáveis destas proteínas poderia
86
contribuir para uma diversidade na capacidade de ligação destas proteínas à
diferentes substratos, indicando diferentes especificidades funcionais das
PAGs.
e) Dosagens de PAG
Na prática, a produção de anticorpos específicos contra frações
altamente purificadas de PAG, PSPB ou PSP-60 bovinas tem permitido o
desenvolvimento de dosagens radioimunológicas homólogas altamente
sensíveis e específicas para taurinos (ZOLI et al., 1992a; PERENYI et al.,
2000). Neste tipo de dosagem, todos os reagentes são preparados a partir da
boPAG-1 purificada, não sendo observadas reações cruzadas com outras
proteínas plasmáticas ou com outras proteases aspárticas (PERENYI et al.,
2001). Posteriormente, a obtenção de proteínas semi-purificadas nas
espécies ovina (ZOLI et al., 1995; WILLARD et al., 1995) e caprina
(GARBAYO et al., 1998) possibilitaram a produção de anticorpos mais
específicos visando o desenvolvimento de dosagens em pequenos
ruminantes. Nestes tipos de dosagens (heterólogas), parte dos reagentes são
provenientes da espécie de origem (ovina ou caprina), enquanto que o
antígeno marcado é proveniente de taurinos (RANILLA et al., 1994;
SOUSA et al., 1999; GONZALEZ et al., 1999).
➾Dosagem da PAG durante gestações normais
Os perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG durante toda a gestação
foram descritos em taurinos (ZOLI et al., 1992a; DOBSON et al., 1993;
PATEL et al., 1997), em caprinos das raças Blanca-Celtibérica (BENITEZ
ORTIZ, 1992; FOLCH et al., 1993), Canindé (SOUSA et al., 1999),
87
Moxotó (SOUSA et al., 1999), Canária (GONZÁLEZ et al., 2000), Alpina
(BATALHA et al., 2001) e em ovinos das raças Assaf (RANILLA et al.,
1997), Churra (RANILLA et al., 1994), Merino (RANILLA et al., 1994) e
Berrichon (GAJEWSKI et al., 1999).
Durante
a
gestação,
as
concentrações
de
PAG
diferem
consideravelmente entre as espécies e períodos de gestação (ZOLI et al.,
1992a; RANILLA et al., 1994; SOUSA et al., 1999). Em uma mesma
espécie, elas podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre os quais
podem ser citados a raça da fêmea (MIALON et al., 1993; RANILLA et al.,
1994), o número de fetos (DOBSON et al., 1993; PATEL et al., 1997), o
genótipo fetal (GUILBAULT et al., 1991; WILLARD et al., 1995) e no caso
de transferência de embriões, a duração de cultivo in vitro dos embriões
(ECTORS et al., 1996a,b). As concentrações de PAG parecem também
diferir de acordo com o sistema radioimunológico utilizado, diferença esta
resultando provavelmente da especificidade do antisoro (GONZALEZ et al.,
1999,2000).
Em raças taurinas, a boPAG-1 (única forma de PAG bovina dosável
na circulação periférica materna) pode ser detectada na circulação materna
tão cedo quanto durante a implantação do trofoblasto nas paredes do útero.
Do princípio da gestação até a 35a semana, as concentrações de PAG
aumentam devagar e gradualmente, permanecendo inferiores a 250 ng/ml
(FIGURA 15). Entre a 35a semana e a última semana de gestação, as
concentrações aumentam rapidamente atingindo valores de 1 a 5 µg/ml
(ZOLI et al., 1992a; PATEL et al., 1997). Após o parto, os níveis de PAG
decrescem regularmente, sendo indetectáveis somente aos 100 dias pósparto (ZOLI et al., 1992a). O relativo longo tempo necessário para que a
88
boPAG-1 desapareça da circulação sangüínea materna pode ser explicado
pela elevada concentração presente no sangue materno no momento do
parto (ZOLI et al., 1992a), bem como a meia-vida desta glicoproteína a
qual foi estimada em 7,4 a 9 dias (KIRACOFE et al., 1993; ALI et al.,
1997).
FIGURA 15 - Perfil das concentrações de PAG (média ± DP) calculados no soro de
20 vacas coletadas do 20o dia de gestação ao 100o dia após o parto.
Utilizou-se escala aritmética das concentrações de PAG do 20o ao 220o
dia de gestação (A) e escala logarítmica do 40o dia antes do parto ao
80o dia após o parto (B). Adaptado de ZOLI et al. (1992a).
Em caprinos (BENITEZ ORTIZ, 1992; SOUSA et al., 1999;
GONZALEZ et al., 2000) e em ovinos (BENITEZ ORTIZ, 1992;
RANILLA et al., 1994), não foi observada tendência a um aumento
89
contínuo das concentrações de PAG ao longo da gestação. No que diz
respeito ao período pós-parto, em ambas as espécies foi verificado um
rápido decréscimo nas concentrações de PAG durante o primeiro mês pósparto (BENITEZ ORTIZ, 1992; RANILLA et al., 1994, 1997; SOUSA et
al., 1999).
Concentrações de PAG foram detectadas na circulação periférica de
15 a 20 % de touros e novilhas não prenhes (ZOLI et al., 1992a).
Concentrações de PAG também foram detectadas no soro de fetos bovinos,
tendo sido observada uma acentuada influência da idade sobre estas
concentrações (fetos jovens apresentam concentrações superiores a de fetos
mais velhos). Essas concentrações mais elevadas nos fetos jovens podem
ser devidas à uma maior concentração desta proteína em um menor volume
sangüíneo ou a uma migração mais intensa de células binucleadas no início
da gestação (ZOLI et al., 1992b).
➾Dosagem da PAG durante gestações anormais
Recentemente, DOBSON et al. (1993) assim como ECTORS et al.
(1996a) demonstraram que em programas de transferência nuclear, mesmo
se a maior parte dos bezerros apresentam pesos e tamanhos normais, alguns
deles podem apresentar anomalias morfológicas tais como edemas do
cordão umbilical com hipertrofia da placenta, as quais são responsáveis por
elevadas concentrações de boPAG-1 na circulação materna. A presença de
mal-formações fetais tais como Schistosomus reflexus (FIGURA 16A)
também parece estar associada com a utilização de técnicas de fecundação
in vitro e clonagem, sendo esta patologia igualmente responsável por
concentrações extremamente elevadas de proteínas placentárias (FIGURA
90
16B), as quais, em alguns casos, podem ultrapassar 10 µg/ml (ECTORS et
al., 1996b). Ao contrário, a verificação de um acentuado decréscimo nas
concentrações de PAG após monta natural, inseminação artificial,
fecundação in vitro ou clonagem podem constituir-se em um forte
indicativo de disfunção placentária ou de sofrimento fetal.
A)
14000
PAG (ng/ml)
12000
B)
10000
8000
6000
4000
2000
0
12
-10
-8
-6
-4
-2
0
Semanas antes do parto
FIGURA 16 - A) Schistosomus reflexus bovino; B) Concentrações de boPAG-1
observadas no caso de Schistosomus reflexus (-▲-▲-) e de gestações
normais (-×-×-). Adaptado de ECTORS et al. (1996a).
Em um estudo pioneiro realizado por ECTORS et al. (1996a), a
realização de dosagens de PAG em amostras coletadas semanalmente após
transferência de embriões produzidos in vitro permitiu o monitoramento de
mortes embrionárias e fetais em taurinos (ECTORS et al., 1996a). O
mesmo fenômeno de redução nas concentrações de PAG em caso de aborto
foi descrito por SEMAMBO et al. (1992) em vacas experimentalmente
infectadas por Actynomyces pyogenes, assim como em cabras de origem
91
norueguesa apresentando abortos de origem infecciosa ou de causa
desconhecida (ZARROUK et al., 1999a,b). Contudo, dadas às elevadas
variações nas concentrações da PAG no sangue materno, somente um
acentuado abaixamento ou desaparecimento total da PAG pode ser um
sinal efetivo da morte embrionária ou fetal no caso de gestações múltiplas e
simples, respectivamente.
Foi demonstrado ainda que a utilização paralela da ultrasonografia
(US) e da dosagem de hormônios tais como a P4 e a PAG pode revelar a
ocorrência de diversos problemas freqüentemente observados em condições
de campo, tais como a re-inseminação de fêmeas já prenhes ou a
administração de prostaglandina F2α no início de uma gestação viável
causando a morte do embrião ou do feto. Em ambos os casos, os quais
constituem-se em erros no manejo da reprodução, a identificação de
mortalidade embrionária ou fetal passaria despercebida sem o uso destas
técnicas, sendo considerada simplesmente como um retorno tardio ao ciclo
estral.
Em experimentos a campo, SZENCI et al. (1998a) descreveram
diversas situações (FIGURAS 17A, 17B, 17C e 17D) nas quais a dosagem
de proteínas específicas ou associadas à gestação e progesterona
demonstraram ser extremamente úteis quando associadas à técnica de
ultrasonografia. Merece ser citado particularmente o quadro no qual as
concentrações de PAG diminuem enquanto que as concentrações de
progesterona permanecem elevadas mesmo após a ocorrência de
mortalidade embrionária devido à persistência do corpo lúteo (FIGURA
17A); a situação na qual as concentrações de PAG mostram claramente que
a vaca tinha sido fecundada quando da primeira inseminação e que a
92
realização de uma segunda inseminação 21 dias mais tarde provocou
provavelmente uma contaminação do útero, resultando em mortalidade
fetal (FIGURA 17B); o quadro no qual a dosagem de PAG confirma a
ocorrência
de
mortalidade
embrionária
precoce
indicada
pela
ultrasonografia (FIGURA 17C), e por fim, a situação na qual as
concentrações de PAG demonstram uma vaca teria sido inseminada em um
curto período após o parto (concentrações decrescentes de PAG), e que
neste caso, provavelmente o ambiente uterino não estaria preparado para o
estabelecimento de uma nova gestação (FIGURA 17D).
A)
B)
C)
D)
FIGURA 17 - Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-●-●-) e P4 (-▲-▲-) em 4
vacas nas quais o diagnóstico de gestação inicialmente positivo (P) por
ultrasonografia foi seguido de um diagnóstico negativo (N) por
ultrasonografia ou pela observação direta da morte fetal (MF).
Adaptado de SZENCI et al. (1998a).
93
➾Dosagem da PAG para fins de diagnóstico de gestação
A detecção da PAG em amostras de soro ou de plasma é
correntemente usada como método de diagnóstico de gestação a partir dos
29-30 dias após a fecundação em raças taurinas (SASSER et al., 1986;
HUMBLOT et al., 1988a; SZENCI et al., 1998a,b, 2000a,b) e dos dias 2122 dias em ovinos (KAREN et al., 2001) e caprinos (GONZALEZ et al.,
1999). Em bovinos, os valores preditivos positivos da dosagem de PAG
para fins de diagnóstico de gestação variam de 72 % (dia 29 após
inseminação artificial) (SZENCI et al., 1998b) a 93 % (dia 45 após
inseminação artificial) (ZOLI et al., 1992a), enquanto que os valores
preditivos negativos variam de 95 % a 100 % (respectivamente aos dias 29
e 45 após inseminação artificial) (SZENCI et al., 1998b).
Além da alta precisão obtida, uma outra vantagem da utilização da
dosagem de PAG como método de diagnóstico de gestação diz respeito à
capacidade da PAG em poder conservar-se em níveis detectáveis por até 10
dias após a coleta de sangue (temperatura ambiente), o que abre excelentes
perspectivas em termos de sua utilização em condições de campo
(BISSON, 1992).
f) Aspectos gerais relativos aos protocolos utilizados para o isolamento
bioquímico e identificação sorológica das PAGs
Até o presente, os procedimentos bioquímicos foram os únicos a
fornecer os reagentes necessários ao desenvolvimento de dosagens RIA
para a PAG. Estas dosagens têm permitido a determinação dos perfis
sorológicos ou plasmáticos desta proteína ao longo da gestação e período
pós-parto,
constituindo-se
em
uma
importante
ferramenta
de
94
monitoramento da viabilidade placentária. Alguns dos principais aspectos
relativos aos procedimentos de purificação e dosagem da PAG utilizados
até o presente serão descritos a seguir.
➾Procedimento bioquímico correntemente utilizado para o isolamento
da PAG
Em geral, os protocolos bioquímicos utilizados em espécies
ruminantes foram baseados no mesmo princípio: a extração das proteínas
placentárias em tampão com pH neutro, seguida de seu fracionamento pelo
uso de diferentes técnicas, tais como precipitações por sulfato de amônia e
cromatografias de troca de íons. Etapas adicionais de precipitação ácida, de
cromatografia em gel de Sephadex G-75 ou de cromatografia em gel de
Blue-Sefarose têm sido realizadas em alguns dos protocolos (ZOLI et al.,
1991; XIE et al., 1997a; GARBAYO et al., 1998) com vistas a aumentar a
pureza final das proteínas a serem utilizadas para o desenvolvimento de
dosagens RIA.
Uma vez isoladas, as PAGs foram caracterizadas por diversos autores
quanto a suas massas moleculares, pontos isoelétricos e seqüências Nterminais (ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1997a; GARBAYO et al., 1998).
Conforme ressaltado por HUGHES et al. (2000), a comparação das
diferentes seqüências de aminoácidos das PAG identificadas até o presente
é de fundamental importância por fornecer o grau de identidade entre as
proteínas isoladas em diferentes espécies.
Em taurinos, primeira espécie na qual a PAG foi purificada, ao final
dos procedimentos de purificação, somente foi seqüenciada uma única
proteína, a qual correspondia a fração mais imunoreativa obtida (ZOLI et
95
al., 1991). O seqüenciamento desta proteína revelou a existência de uma
única seqüência, a qual é atualmente identificada como boPAG67 ou
boPAG-1.
Em trabalhos mais recentes XIE et al. (1997a) e GARBAYO et al.
(1998) demonstraram que nas espécies ovina e caprina, quando diversas
frações imunoreativas são analisadas, é possível identificar-se diversas
formas de PAG, heterogêneas tanto no que diz respeito a suas massas
moleculares e pontos isoelétricos, quanto no que diz respeito a suas
seqüências N-terminais (XIE et al., 1997a; GARBAYO et al., 1998).
Entretanto, até o presente, ainda não se sabe se a análise detalhada de um
maior número de frações imunoreativas extraídas a partir da placenta de
bovídeos confirmaria a expressão de uma única proteína ou resultaria na
caracterização de novas seqüências N-terminais de PAG.
➾Uso de cromatografias de afinidade para o isolamento da PAG
Conforme descrito na seção sobre as proteases aspárticas, diversos
membros pertencentes a esta família puderam ser isolados por meio do uso
de cromatografias de afinidade, com o uso da pepstatina-A como substrato
(FIGURA 18).
Segundo GURUPRASAD et al. (1996), apesar de cataliticamente
inativa, a PAG conservaria uma fenda capaz de acomodar peptídeos de até
7 resíduos de comprimento, podendo ligar-se reversivelmente à pepstatina
A, assim como os demais membros de sua família. Entretanto, apesar de
sugerido por diversos autores (GURUPRASAD et al., 1996; HUGUES et
al., 2000; GARBAYO et al., 2000), ao nosso conhecimento, nenhuma
publicação descreveu com precisão o isolamento de moléculas da família
96
da PAG pelo uso de cromatografia de afinidade empregando a pepstatina-A
como ligante.
FIGURA 18 - Características da matriz associada à pepstatina A, utilizada para a
purificação de proteases aspárticas.
➾Mensuração das concentrações periféricas maternas de PAG por
meio de dosagem RIA
O método radioimunológico, também conhecido como dosagem RIA,
foi inicialmente desenvolvido por YALLOW & BERSON (1960) para a
dosagem da insulina no plasma humano. Atualmente, este método é
comumente usado para a dosagem plasmática ou sorológica de diversos
hormônios e proteínas, dentre os quais a PAG.
Dentre os principais componentes de uma dosagem RIA para a PAG
(dosagem PAG-RIA) podemos citar o antígeno marcado com o isótopo
radioativo iodo 125 (PAG-I125), o antígeno frio ou não marcado (PAG não
marcada), e o anticorpo, também conhecido como anti-soro (AS), o qual
97
contém imunoglobulinas de coelhos produzidos contra a forma de PAG que
se deseja dosar. Participam ainda como reagentes da dosagem PAG-RIA o
soro de novilhas impúberes (serum-free) e o sistema de precipitação pelo
uso do segundo anticorpo, o qual contem imunoglobulinas de ovelha antiimunoglobulina de coelhos.
A
dosagem
PAG-RIA,
assim
como
as
demais
dosagens
radioimunológicas (CHARD, 1989), baseia-se em um mesmo princípio: a
competição entre ambos os antígenos marcado e não marcado por uma
determinada quantidade de anticorpos. Entretanto, apesar de aparentemente
simples, esta reação não se resume a uma simples diluição isotópica,
obedecendo a lei de ação de massas cujo detalhamento foge aos objetivos
da presente revisão de literatura.
Quanto à origem dos reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA,
podemos classificar os sistemas atualmente utilizados como homólogos ou
heterólogos. Em cervídeos (HUANG et al., 2000), assim como em caprinos
(GONZALEZ et al., 1999) e taurinos (ZOLI et al., 1992a), utiliza-se
sistemas de dosagens homólogos, nos quais os principais reagentes são
produzidos a partir da PAG purificada em uma mesma espécie. Entretanto,
na maioria das espécies, recorre-se ao uso de sistemas de dosagem
heterólogos, nos quais a PAG marcada é normalmente de origem taurina,
sendo o antígeno frio e/ou o antisoro produzidos a partir de PAGs semipurificadas em diferentes espécies (RANILLA et al., 1994; SOUSA et al.,
1999; GONZALEZ et al., 1999).
Dentre os principais parâmetros analisados das dosagens de PAG-RIA
podemos citar a especificidade, a sensibilidade e a precisão. A
especificidade da dosagem de PAG taurina foi investigada inicialmente por
98
ZOLI et al. (1991), os quais demonstraram a inexistência de reações
cruzadas entre a boPAG67 e o bPL, o bLH, o FSH de origem porcina e a
alfa-fetoproteína.
Mais
recentemente,
PERENYI
et
al.
(2001)
demonstraram ainda a inexistência de reações cruzadas entre a boPAG67 e
outros membros da família das proteases aspárticas, tais como a pepsina
porcina, a catepsina D, a quimosina e a renina.
No que se refere à sensibilidade, também conhecida como limite
mínimo de detecção, os sistemas de dosagem PAG-RIA taurino e caprino
demonstraram ser altamente sensíveis, detectando concentrações de PAG
tão baixas quanto 0,2 ng/ml (PERENYI et al., 2000). As melhores
sensibilidades são alcançadas quando é feita uma etapa de pré-incubação de
16 horas antes da adição do antígeno marcado (SOUSA et al., 1999;
GONZALEZ et al., 1999).
A precisão de um sistema de dosagens é determinada como o
coeficiente de variação (CV) das concentrações de PAG contidas em uma
mesma amostra quando esta é mensurada repetidamente em uma mesma
série de dosagens (CV intra-ensaio) ou sucessivamente em séries de
dosagens diferentes (CV inter-ensaio). A precisão da dosagem PAG-RIA já
foi calculada por diversos autores, variando de 6,9 a 11,6 % para o sistema
RIA homólogo de taurinos (ZOLI et al., 1992a) e de 3,3 a 13 % para os
sistemas heterólogos caprino e ovino (GONZALEZ et al., 1999; SOUSA et
al., 1999).
Conforme descrito por BATALHA et al. (2001), concentrações de
PAG mensuradas por RIA homólogos são inferiores às dosadas por
sistemas heterólogos, o que poderia indicar uma menor especificidade das
dosagens heterólogas. Entretanto, investigações complementares são
99
necessárias para confirmar esta hipótese.
Uma vez citados alguns dos principais aspectos relacionados ao
estudo das PAGs em ruminantes domésticos, serão apresentadas as
metodologias por nós adotadas para o estudo da PAG em raças zebuínas.
100
3. MATERIAL E METODOLOGIA
3.1. Experimento 1 –
Isolamento de glicoproteínas associadas à
gestação:
Dois protocolos foram utilizados para o isolamento de proteínas
associadas à gestação a partir da placenta de fêmeas zebuínas. O primeiro
protocolo baseou-se na extração das proteínas placentárias em tampão com
pH neutro, seguida de seu fracionamento pelo uso de diferentes técnicas,
tais como as precipitações ácida e por sulfato de amônia e cromatografias
de troca de ânions e de cátions. O segundo protocolo baseou-se na
utilização de cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose
para o enriquecimento dos extratos placentários em PAG.
Em ambos os protocolos, as proteínas resultantes do fracionamento
foram caracterizadas quando à sua massa molecular por meio de
eletroforeses monodimensionais, quanto à imunoreatividade por meio de
Western Blot com o uso dos anti-soros anti-boPAG67 (AS497) e anticaPAG55+62 (AS706) e anti-caPAG55+59 (AS708), e quanto ao ponto
isoelétrico por meio de eletroforeses bidimensionais. As proteínas
consideradas como imunoreativas foram então sequenciadas em sua
extremidade N-terminal (entre 10 e 25 aminoácidos), tendo suas seqüências
comparadas com as seqüências já existentes nos bancos de dados por meio
do uso do programa Fasta 3 do Instituto Europeu de Bioinformática (EBI,
2001). Os procedimentos metodológicos utilizados nos protocolos de
isolamento da PAG serão descritos a seguir.
101
3.1.1. Protocolo 1
3.1.1.1. Determinação da imunoreatividade e da proteína total
O radioimunoensaio (RIA) desenvolvido por ZOLI et al. (1992a) para
dosagem da PAG de origem taurina foi utilizado para detectar a
imunoreatividade do tipo PAG ao longo deste protocolo de purificação (cf.
Anexo A). Este RIA constituiu-se em um sistema semi-quantitativo de
mensuração das quantidades relativas de PAG presentes nas amostras
obtidas nas diferentes etapas de fracionamento protéico.
A determinação da quantidade total de proteína (TP) obtida nas
diferentes etapas foi feita pelo método previamente descrito por LOWRY
et al. (1951) (cf. Anexo B) com o uso da albumina séria bovina (BSA; ICN
Biomedicals Inc., Aurora, OH) como proteína de referência.
3.1.1.2. Coleta de placentas
Os úteros de 3 fêmeas zebuínas gestantes foram coletados em
abatedouro aproximadamente 10 a 30 minutos após o abate. O estágio de
gestação foi estimado com base no comprimento entre o côndilo occipital e
a última vértebra coccígea fetais. De acordo com o comprimento obtido (69
cm, 70 cm e 77 cm), foram estimados estágios gestacionais entre 30 e 31
semanas de gestação (último trimestre de gestação) (REXROAD et al.,
1974).
Logo após o abate, os cotilédones fetais foram imediatamente
dissecados e lavados com solução fisiológica de cloreto de sódio (NaCl) a
uma concentração de 0,9 %. Após transportados ao laboratório a uma
temperatura de aproximadamente 4°C, os cotilédones foram pesados e
identificados, sendo armazenados a –20°C até seu processamento A
102
FIGURA 19 esquematiza o fracionamento de proteínas realizado no
Protocolo 1.
Cotilédones fetais
Extração de proteínas em pH neutro
Isolamento
Precipitação ácida
Precipitação a 40-80 % de sulfato de amônia
Cromatografia de troca de ânions (Coluna DEAE Sephadex A25)
Caracterização
Cromatografia de troca de cations de todas as frações DEAE (Coluna CM Cerâmica)
Eletroforese monodimensional
(1-D SDS-PAGE)
Coloração Coomassie Blue
Western blot
Eletroforese bidimensional
(2-D SDS-PAGE)
Sequenciamento N-terminal
FIGURA 19 - Esquema de purificação (fracionamento) da PAG extraída a partir de
placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de trocas de íons.
3.1.1.3. Isolamento da PAG
a) Extração de proteínas solúveis
Aproximadamente 2.145,4 gramas de cotilédones fetais foram
descongelados e utilizados no presente protocolo. O descongelamento foi
feito a 4°C durante 24 horas. Após descongelados, os cotilédones foram
novamente lavados com solução fisiológica (5 litros de NaCl a 0,9 %, 4°C)
e pesados. Foi obtido um total de 1.921,5 gramas de cotilédones fetais.
Os cotilédones fetais foram inicialmente moídos com o auxílio de um
triturador de carne. Em seguida, o extrato cotiledonário foi finamente
103
homogeneizado em tampão fosfato de potássio a 0,01 M (KH2PO4; Merck)
contendo 0,10 M de cloreto de potássio (KCl, pH 7,6; Merck) tendo para
tal sido utilizado um mixer industrial Multipulver (Dusseldorf, Alemanha).
Foi utilizada uma proporção entre tampão e tecido de 3,5 : 1 (volume :
peso). No momento da homogeneização foram adicionados 0,001 mM de
leupeptina (Sigma, St. Louis, USA), 0,2 mM de fenil-metilsulfonilfluoreto
(PMSF; Sigma), 0,2 % de EDTA sódico (peso : volume; Sigma) e 0,02 %
de azida sódica (NaN3; peso : volume; Vel Inc., Leuven, Bélgica).
A primeira extração consistiu na homogeneização do extrato
placentário durante 2 horas a 4°C. A homogeneização foi feita pelo uso de
um agitador industrial do tipo vortex (Modelo 50 MHz; Kargh GMBH,
Hannover, Alemanha). Após centrifugação deste extrato a 27.000 g durante
1 hora, o sobrenadante foi mensurado e armazenado em um recipiente à
parte, tendo o sedimento sido novamente triturado em 4 litros do mesmo
tampão pelo uso de um mixer industrial. No momento da segunda
trituração, foram igualmente adicionados 0,001 mM de leupeptina, 0,2 mM
de PMSF, 0,2 % de EDTA sódico e 0,02 % de NaN3. Após uma segunda
homogeneização durante aproximadamente 16 horas, o segundo extrato
placentário foi centrifugado a 27.000 g por 1 hora, tendo o precipitado sido
eliminado. O segundo sobrenadante, assim como o primeiro, foi mensurado
quanto ao volume. Ambos os sobrenadantes foram misturados, tendo seu
pH sido ajustado a 7,6 pelo uso de 0,5 M de hidróxido de potássio (KOH;
Merck).
b) Precipitação ácida
Os sobrenadantes resultantes de primeira (7.940 ml) e da segunda
104
(3.890 ml) extrações foram misturados. O pH da solução final (11.830 ml)
foi ajustado a 4,5 pelo uso de ácido fosfórico a 0,5 N (H3PO4; Fluka). A
solução foi então deixada em repouso a 4°C durante 2 horas. Após este
período, a solução foi centrifugada a 27.000 g por 1 hora para a eliminação
do precipitado. O sobrenadante teve seu pH novamente ajustado para 7,6
pelo uso de hidróxido de potássio a 0,5 N (KOH; Merck).
c) Precipitações ao sulfato de amônia
Após a precipitação ácida, foram adicionadas 243,0 gramas de sulfato
de amônia (S.A.; Merck) por litro de sobrenadante (11,83 l), tendo sido
obtida uma taxa de saturação de 40 %. Após a dissolução completa do S.A.,
a solução foi deixada em repouso por 16 horas, tendo sido em seguida
centrifugada a 27.000 g por 1 hora para a separação entre as proteínas
precipitadas e não precipitadas.
Ao sobrenadante foi novamente adicionado S.A. até obter-se uma taxa
de saturação de 80 % (adição de 285,0 gramas de S.A. por litro de solução).
Após 16 horas de repouso, a solução foi novamente centrifugada a 27.000 g
durante 1 hora, tendo o sobrenadante sido descartado.
As proteínas precipitadas pela saturação 40-80 % de S.A., foram
ressuspendidas em 500 ml de tampão Tris-HCl 0,01 M (pH 7,6). Esta
suspensão foi exaustivamente dialisada contra um grande volume do
mesmo tampão (4 banhos de 20 litros trocados a 12 horas de intervalo).
Após o último banho de diálise, a solução contendo a fração 40-80 % de
S.A. foi centrifugada a 36.000 g durante 20 minutos, tendo o precipitado
sido eliminado e o sobrenadante mensurado e imediatamente depositado
sobre uma coluna contendo gel DEAE-Sephadex para a realização de
105
cromatografia de troca de ânions.
d) Cromatografia de troca de ânions
A quantidade de gel utilizada nesta cromatografia foi calculada a
partir da estimativa da quantidade total de proteínas presente na fração 4080 % de S.A.. Foi utilizada uma proporção de 4 mg de proteína por
mililitro de gel DEAE Sephadex A-25 (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suécia) hidratado. A coluna de DEAE Sephadex A-25 (14 cm x
18cm) foi previamente equilibrada em tampão Tris-HCl 0,01 M (pH 7,6).
A fração 40-80 % S.A. foi depositada sobre a coluna de DEAE
Sephadex a um fluxo de 2,5 ml por minuto. As proteínas não adsorvidas
foram eluídas pela lavagem com 10 litros de tampão Tris-HCl 0,01 M (pH
7,6). As proteínas adsorvidas ao gel foram fracionadas pelo uso de forças
iônicas crescentes, obtidas pela adição de concentrações crescentes (0,02
M, 0,04 M, 0,08 M, 0,16 M e 0,32 M) de cloreto de sódio (NaCl) ao
tampão Tris-HCl 0,01 M. A coluna foi lavada sucessivamente com 10 litros
de tampão contendo cada uma das concentrações em NaCl (0,02 M a 0,32
M NaCl).
Cada fração (0 M a 0,32 M NaCl) foi concentrada em cassetes de
concentração (Millipore, Dusseldorf, Alemanha) até um volume de
aproximadamente 1 litro, sendo em seguida concentrada até um volume de
200 ml em células de concentração Amicon (Amicon Ultrafiltraton System;
Danvers, MA).
Após concentradas, cada uma das frações foi dialisada contra um
volume total de 80 litros de tampão bicarbonato de amônia a 5 mM (4
banhos de 20 litros trocados a 12 horas de intervalo, pH 8,0). A
106
cromatografia em gel DEAE-Sephadex, assim como as diálises, foram
feitas a uma temperatura de 4°C.
Após o final da diálise de cada uma das frações, as mesmas foram
centrifugadas a 36.000 g durante 30 minutos. Os precipitados foram
eliminados e o sobrenadante correspondente a cada fração foi identificado e
liofilisado.
e) Cromatografia de troca de cátions
Cada uma das frações da DEAE (doravante chamadas DEAE 0 M,
DEAE 0,02 M, DEAE 0,04 M, DEAE 0,08 M, DEAE 0,16 M e DEAE 0,32
M NaCl) foi submetida separadamente a uma cromatografia de troca de
cátions em um Sistema Avançado de Purificação de Proteínas Waters 650
(Millipore Corp., Bedford, MA). A coluna utilizada (coluna CM Cerâmica
HyperD F; 1 cm x 3 cm; BioSepra, Cergy-Saint Christophe, França) foi
previamente equilibrada com tampão acetato de amônia 0,01 M (pH 5,0).
A cada cromatografia, 200 mg de proteína proveniente de uma das
diferentes frações de DEAE foram solubilisadas em 20 ml de tampão de
equilíbrio, sendo em seguida centrifugadas a 1.500 g durante 5 minutos
para a eliminação dos resíduos insolúveis.
Cada fração da DEAE foi injetada sobre a coluna CM cerâmica a um
fluxo constante de 0,5 ml por minuto. Após a diluição da fração não
adsorvida, um gradiente linear de NaCl (0 a 1,0 M) foi aplicado a um fluxo
constante de 2 ml/min. Frações de 1 ml foram coletadas separadamente.
As frações correspondentes a um mesmo pique de proteína (conforme
observado pela densidade óptica a 280 nm), foram misturadas, sendo
identificadas e dialisadas contra tampão bicarbonato de amônia 5 mM (pH
107
8,0).
Após o final das diálises, as proteínas de cada pique foram
centrifugadas e o sobrenadante liofilizado. Cada fração da CM cerâmica
(doneravante denominadas pique CM pique I, CM pique II, ... CM pique n)
foram analisadas quanto à quantidade total de proteína e quanto à
quantidade estimada de PAG.
3.1.1.4. Caracterização da PAG
a) Eletroforeses monodimensionais em gel de poliacrilamida em
presença de dodecil sulfato de sódio (1-D SDS-PAGE)
Eletroforeses monodimensionais foram utilizadas para analisar as
proteínas fracionadas durante o protocolo de purificação.
As eletroforeses monodimensionais foram realizadas de acordo com o
método descrito por LAEMMLI (1970) na presença e na ausência do
agente redutor mercaptoetanol (5 %). As proteínas contidas em cada pique
da coluna CM cerâmica foram diluídas na proporção de 1 µg para cada 1 µl
de Laemmli (cf. Anexo C), tendo sido desnaturadas pelo aquecimento a
uma temperatura de aproximadamente 100°C durante 5 minutos. Amostras
padrão com massas moleculares de 94 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1
kDa e 14,4 kDa (Kits de Calibração para Eletroforese LMW; Pharmacia)
foram corridas simultaneamente com as proteínas obtidas após as
cromatografias de troca de íons.
A análise das proteínas foi feita em sistemas verticais de eletroforese,
com capacidade de um gel cada. Os géis de poliacrilamida utilizados (20 x
10 x 0,25 cm) foram preparados de acordo com a fórmula descrita no
Anexo C. Amperagens de 20 mA foram aplicadas durante a migração das
108
proteínas no gel de compressão, sendo o tempo de migração de
aproximadamente 1 hora e 30 minutos. Durante a migração no gel de
separação, foram aplicadas amperagens constantes de 40 mA. O tempo de
migração no gel de separação foi de aproximadamente 6 horas.
Após o final da migração, as proteínas presentes em cada gel foram
coradas pela solução de Azul de Coomassie R 250 durante um mínimo de 1
hora, sendo descoloradas durante 6 a 12 horas. Os pesos moleculares das
bandas mais visíveis presentes nos géis foram estimados com base em uma
curva calculada a partir das massas moleculares das diferentes proteínas
padrão corridas simultaneamente com as amostras.
b) Western Blot
Uma vez caracterizadas quanto à suas massas moleculares aparentes,
as proteínas presentes em cada pique da coluna CM Cerâmica foram
analisadas quanto às suas imunoreatividades pelo uso da técnica de
Western Blot com o uso de 3 diferentes anti-soros: anti-boPAG67 (AS 497),
anti-caPAG55+62 (AS706) e anti-caPAG55+59 (AS708). Detalhes sobre os
reagentes e a técnica de Western Blot utilizada encontram-se descritos no
Anexo D.
Resumidamente, após o final da migração das proteínas em um gel de
poliacrilamida a 12 %, cada gel teve suas proteínas transferidas sobre uma
membrana de nitrocelulose (Hybond ECL, Pharmacia). A transferência foi
feita em um aparelho Multiphor II (Pharmacia) pela aplicação de uma
tensão constante de 24 volts durante uma hora, e de 36 volts durante
aproximadamente 12 horas.
Após a transferência, as proteínas foram visualizadas pela coloração
109
com a solução Vermelho de Ponceau S (Merck). Em seguida, as
membranas foram lavadas 3 vezes durante 10 minutos com o tampão Tris
salino (TBS) contendo 3 % de BSA (37°C). Após lavagem, as membranas
foram incubadas durante 3 horas a 37°C em uma solução contendo um dos
anti-soros anti-PAG (diluição a 1 : 200 em Tris contendo 1 % de BSA),
sendo posteriormente lavadas com tampão TBS contendo 1 % de BSA (3
lavagens de 10 minutos a 37°C).
Uma incubação com imunoglobulina de ovelha anti-imunoglobulina
de coelho acoplada à peroxidase (diluição a 1 : 2.000 em TBS contendo 1
% de BSA; HPR-POD, Chemicon International Inc., Temecula, CA) foi
feita durante 2 horas a 37°C e sob agitação. Após esta segunda incubação, a
membrana de nitrocelulose foi lavada em TBS sem BSA (4 lavagens de 10
minutos a 20°C). A identificação das proteínas imunoreativas às PAGs foi
feita após a incubação com as soluções de revelação durante um período de
aproximadamente 10 minutos.
c) Focalização isoelétrica e eletroforese bidimensional em gel de
poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (2-D SDSPAGE)
As proteínas presentes nos piques CM contendo bandas imunoreativas
à PAG foram submetidas a eletroforeses bidimensionais. A primeira
dimensão (isofocalização) foi feita em géis Immobiline DryStrip com pH
variando entre 3 e 10 (11 cm; Pharmacia). Os géis usados para
isofocalização foram hidratados com o tampão de reidratação (cf. Anexo E)
contendo 200 a 250 µg de proteínas a serem analisadas. A hidratação foi
feita durante 16 horas em um Immobiline DryStrip Reswelling Tray
110
(Pharmacia). A focalização foi feita em um aparelho FlatBed (FBE-3000;
Pharmacia) pela aplicação de tensões de 300 volts por 30 minutos, de 1.000
volts por 30 minutos, de 1.550 volts por 16 horas e de 1.850 volts por 1
hora. Como segunda dimensão foram feitas eletroforeses verticais em SDSPAGE,
conforme
anteriormente
descrito
para
as
eletroforeses
monodimensionais.
Após o final da migração no gel de separação, as proteínas foram
transferidas para membranas de polivinilideno difluoridro (PVDF; BioRad,
Richmond, CA) com o auxílio do Aparelho Multiphor II (Pharmacia). A
transferência foi feita pela aplicação de uma corrente constante de 12 volts
durante 45 minutos e de 36 volts durante 45 minutos. A visualização das
proteínas foi feita após a coloração das membranas em solução Azul de
Coomassie para PVDF durante 10 minutos, seguida pela descoloração
durante 20 a 30 minutos.
d) Análise da seqüência N-terminal
A análise da seqüência N-terminal de aminoácidos das proteínas
correspondentes às bandas imunoreativas identificadas pela técnica de
Western Blot foi feita pelo método da degradação automatizada de Edman
em sequenciador protéico de fase líquida (Procise 492 Applied Biosystems,
Foster City, CA). As seqüências obtidas foram comparadas com as
seqüências existentes nos bancos de dados SWISS-PROT, EMBL e
TrEMBL através do programa Fasta 3 (PEARSON && LIPMAN, 1988) do
Instituto Europeu de Bioinformática (EBI, 2001).
111
3.1.2. Protocolo 2
3.1.2.1. Coleta de placentas
Os úteros de 10 fêmeas zebuínas gestantes foram coletados em
abatedouro aproximadamente 10 a 30 minutos após o abate. Os estágios de
gestação foram estimados com base no comprimento entre o côndilo
occipital e a última vértebra coccígea de cada feto. De acordo com os
comprimentos obtidos, 7 placentas foram consideradas como pertencentes
ao primeiro trimestre de gestação (entre 10 e 11 semanas) e 3 placentas
foram consideradas como pertencentes ao segundo trimestre de gestação
(entre 20 e 21 semanas).
Assim como descrito no Protocolo 1, logo após o abate, os cotilédones
fetais foram imediatamente dissecados e lavados em solução de NaCl a 0,9
%, sendo em seguida transportados ao laboratório, pesados, identificados e
armazenados a –20°C até seu processamento A FIGURA 20 esquematiza a
metodologia utilizada no Protocolo 2.
3.1.2.2. Extração de proteínas solúveis
Aproximadamente 890 gramas e 553 gramas de cotilédones fetais
pertencentes ao segundo e primeiro trimestres de gestação foram moídos
separadamente com o auxílio de um triturador de carne. Em seguida, os
extratos cotiledonários foram finamente triturados com auxílio de um mixer
industrial respectivamente em solução de KCl a 0,3 M (pH 5,0; Merck) e
tampão bicarbonato de amônia a 0,05 M (pH 8,5; Vel). Foi utilizada uma
proporção entre tampão e tecido de 3,5:1 (volume : peso). No momento da
homogeneização foram adicionados 0,001 mM de leupeptina, 0,2 mM de
PMSF, 0,2 % de EDTA sódico e 0,02 % de azida sódica. A extração das
112
proteínas solúveis foi feita durante 4 horas, tendo para tal sido utilizado um
agitador industrial do tipo vortex. Após centrifugação destes extratos a
27.000 g durante 1 hora, os precipitados foram descartados e os
sobrenadantes foram concentrados até volumes de aproximadamente 250 a
500 ml. Ambos os sobrenadantes resultantes das extrações de proteínas em
meio alcalino e ácido foram carregados sobre colunas de Sephadex G-25
previamente calibradas e equilibradas com tampão acetato de sódio a 0,005
M (pH 5,2). As frações obtidas foram monitoradas por espectrometria
óptica a um comprimento de onda de 280 nm.
As frações ricas em proteína de cada uma das extrações ácida e
alcalina foram novamente misturadas e concentradas, tendo desta vez seus
volumes ajustados a respectivamente 1.000 e 60 ml.
Caracterização
Isolamento
Cotilédones fetais
Extração de proteínas em pH ácido
Extração de proteínas em pH alcalino
(placentas de 20-21 semanas de gestação)
(placentas de 10-11 semanas de gestação)
Cromatografia de afinidade
Cromatografia de afinidade
(gel de pepstatina A-agarose)
(gel de pepstatina A-agarose)
Eletroforese monodimensional
(1-D SDS-PAGE)
Coloração Coomassie Blue
Western blot
Eletroforese bidimensional
(2-D SDS-PAGE)
Sequenciamento N-terminal
FIGURA 20 - Esquema de purificação da PAG extraída a partir de placentas zebuínas
com o auxílio de cromatografias de afinidade.
113
3.1.2.3. Cromatografia de afinidade
Aproximadamente 40 e 20 ml (500 e 800 mg) dos extratos brutos
contendo as proteínas extraídas em meio ácido e alcalino foram depositadas
sobre colunas de pepstatina-A agarose (1 cm x 4 cm; Sigma, St Louis,
USA) previamente equilibradas com tampão acetato de sódio a 0,05 M (pH
5,2) em um Sistema Avançado de Purificação de Proteínas Waters 650
(Millipore Corp., Bedford, MA).
Após a eliminação das proteínas adsorvidas pela lavagem com o
tampão inicial, um gradiente linear (0-1 M NaCl) foi aplicado a um fluxo
constante de 0,5 ml/min. Em seguida, um gradiente de pH de 5 a 10 foi
aplicado a fim de liberar proteínas fortemente retidas pela afinidade à
pepstatina A.
Frações de 1 ml foram coletadas e monitoradas por espectrometria a
280 nm. Todas as frações pertencentes a um mesmo pique de proteína
foram misturadas, dialisadas contra tampão bicarbonato de amônia a 5 mM
(pH 8), centrifugadas a 36.000 g por 30 minutos e finalmente liofilizadas.
3.1.2.4. Caracterização da PAG
Assim como descrito no protocolo anterior, as proteínas presentes nos
diferentes piques das colunas de pepstatina A-agarose foram caracterizadas
quanto à massa molecular (1-D SDS-PAGE), quanto à imunoreatividade
(Western Blot) e quanto ao ponto isoelétrico (2-D SDS-PAGE). As
proteínas imunoreativas após Western Blot foram seqüenciadas em sua
extremidade N-terminal.
114
3.2. Experimento 2 – Dosagens radioimunológicas da PAG (PAG-RIA)
durante a gestação e período pós-parto em
fêmeas zebu
3.2.1. Animais
Os animais utilizados no presente estudo foram provenientes da zona
Sub-Saheliana do Burkina Faso (12°22’ de latitude Norte e 1°31’ e de
longitude Oeste). Esta região caracteriza-se por apresentar uma
precipitação anual média de 894 mm, com temperaturas mínimas variando
entre 8 e 20°C na estação chuvosa (Junho a Outubro) e de 26 a 39°C na
estação seca (Novembro a Maio).
Doze vacas zebu da raça Azawak, com idades variadas e, em sua
maioria múltiparas, foram diagnosticadas como gestantes por palpação
retal, sendo usadas no presente estudo. Todos os animais apresentavam
aparência clínica normal e escores de condição corporal (BCS) entre 4 e 5
no início do experimento. A condição corporal foi estimada de acordo com
uma escala a qual varia de 1 a 9 pontos (EVERSOLE et al., 2000).
As vacas Azawak foram criadas em um sistema semi-intensivo,
alimentando-se de pastagem nativa (savana, com predominância de
espécies arbustivas) e tendo livre acesso à água e à suplementação mineral.
Os animais pastavam aproximadamente durante 6 horas por dia, sendo
liberadas pela manhã e presas no curral a tarde
3.2.2. Amostras de sangue
As amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados a 5-10
dias de intervalo. As coletas foram feitas por punção da veia jugular,
aproximadamente da 8a semana de gestação até a 10a semana pós-parto
115
(pp). O plasma foi obtido por centrifugação imediata das amostras de
sangue (1.500 g durante 15 min), tendo sido estocado a –20°C até o
momento das dosagens.
3.2.3. Reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA
Os principais reagentes utilizados foram preparados com o uso de
PAG purificada a partir da placenta de zebuínos. Esta PAG foi utilizada
tanto como solução padrão (antígeno frio ou não marcado) quanto como
marcador (antígeno quente ou marcado).
3.2.3.1. Tampão da dosagem RIA
A solução estoque do tampão de dosagem (tampão Tris) foi
constituída de Tris a 25 mM, contendo MgCl2 a 10 mM e 0,1 mg/ml de
sulfato de neomicina. Esta solução teve seu pH ajustado a 7,5 pelo uso de
HCl (0,5 N). Pouco antes da realização das dosagens, foi adicionada uma
proporção de 1,0 grama de BSA por litro de tampão.
3.2.3.2. Antígeno marcado
A boPAG67 de origem zebuína obtida no Experimento 1 (DEAE 0,08
M, CM pique IX) foi marcada com o isótopo radioativo I125 pelo método da
cloramina T (GREENWOOD et al., 1963). Maiores detalhes sobre esta
técnica são fornecidas no Anexo A.
3.2.3.3. Curvas padrão
Dois sistemas de dosagem foram usados para medir as concentrações
periféricas maternas de PAG ao longo da gestação e período pós-parto em
116
fêmeas zebuínas.
O primeiro sistema, chamado sem pré-incubação (RIA-SPI), foi
utilizado para mensurar as mais altas concentrações de PAG observadas ao
longo da gestação e período pós-parto. Neste caso, a curva padrão possuía
pontos de diluição variando entre 0,8 e 100 ng/ml.
O segundo sistema de dosagem, denominado dosagem com etapa de
pré-incubação (RIA-PI) foi utilizado para mensurar as mais baixas
concentrações observadas durante o início da gestação e o final do período
pós-parto. Neste caso a curva padrão variava de 0,2 a 25 ng/ml.
A preparação purificada de PAG de origem zebuína foi inicialmente
diluída em tampão fosfato na proporção de 10 µg de proteína/100 ml de
tampão. Essa solução foi aliquotada, constituindo-se no primeiro ponto de
diluição da curva padrão usada no RIA-SPI.
3.2.3.4. Soro sem PAG
O soro ou plasma de novilhas impúberes foi coletado e testado
diversas vezes para comprovar a ausência de PAG nestas amostras. Estas
amostras de soro ou plasma comprovadamente sem PAG (serum free ou
SF) foram aliquotadas, sendo adicionadas às curvas padrão para diminuir a
influência das proteínas do plasma sangüíneo sobre as concentrações de
PAG obtidas pelas dosagens RIA.
3.2.3.5. Anti-soro
O anti-soro (AS), também conhecido como primeiro anticorpo, foi
produzido em coelhos segundo o protocolo descrito por VAITUKAITIS et
al. (1971) com algumas modificações (cf. Anexo A). Três diferentes
117
preparações de PAG (DEAE 0,08 M, CM pique IX; pique imunoreativo
reativo da pepstatina-A agarose obtido de extratos cotiledonários extraídos
em KCl e DEAE 0,04 M, CM pique XI) foram utilizadas para imunizar
coelhos (782, 785 e 786).
Os anti-soros foram testados quanto ao título de anticorpos presentes e
quanto à ligação não-específica do mesmo (non-specific binding ou NSB).
A diluição ideal de cada anti-soro foi considerada como sendo aquela na
qual 30 % da PAG marcada foi ligada ao anticorpos presentes na ausência
da PAG não marcada (tubo branco contendo 0 ng de PAG/ml ou B0). Para a
realização das dosagens ao longo da gestação e período pós-parto foi
escolhido o AS782, o qual mostrou ter títulos de anticorpos ideais a uma
diluição de 1:150.000, com NSB inferiores a 1 %.
3.2.3.6. Sistema de precipitação
A separação entre as frações radioativas livre e conjugada foi feita
pela adição de um sistema precipitante o qual contém um segundo
anticorpo dirigido contra imunoglobulinas de coelhos. Este sistema
precipitante é composto basicamente por uma mistura de imunoglobulina de
ovelha anti-IgG de coelho (0,83 % volume : volume), de soro normal de
coelho (0,17 % volume : volume), de polietileno glicol 6000 (20 mg/ml; Vel),
de celulose microcristalina (0,05 mg/ml; Merck) e de BSA (2 mg/ml; ICN
Biochemicals) diluídos em tampão Tris-HCl (pH 7,5).
3.2.4. Metodologia utilizada para as dosagens PAG-RIA
As amostras de sangue foram primeiramente dosadas no sistema RIASPI. Resumidamente, 0,1 ml de cada amostra a ser dosada ou de cada ponto
118
de diluição da curva padrão foram aliquotadas em duplicata em tubos de
poliestireno, tendo essas amostras sido diluídas respectivamente com 0,1 e
0,2 ml de tampão Tris-BSA. Nos tubos correspondentes ao branco (B0) e ao
NSB, a amostra da curva padrão é substituída por 0,1 ml de tampão.
Para diminuir a interferência das proteínas do plasma, 0,1 ml de
plasma sem PAG (SF) foram adicionados a todos os pontos de diluição da
curva padrão, aos tubos NSB e B0. Em seguida, 0,1 ml de
125
I-PAG
(aproximadamente 28.000 cpm) e 0,1 ml de AS782 foram adicionados a
todos os tubos exceto os tubos NSB, nos quais o anti-soro foi substituído
por 0,1 ml de tampão Tris-BSA. Os tubos correspondentes à radioatividade
total (Tc) receberam 0,1 ml de 125I-PAG cada.
Uma vez adicionados, todos os reagentes foram incubados durante
aproximadamente 16 horas a uma temperatura de 20°C. No dia seguinte,
1,0 ml do sistema de precipitação foi adicionado a todos os tubos exceto os
Tc, tendo sido feita uma curta incubação de 30 minutos à temperatura
ambiente. As frações contendo as PAGs marcadas livre e ligada ao
anticorpo foram separadas por centrifugação (1.500 g x 20 min) após a
lavagem com 2 ml de Tris-BSA. O sobrenadante foi aspirado e o
precipitado foi lavado uma segunda vez com 2 ml de Tris-BSA. Após
aspiração do segundo sobrenadante, foi feita a contagem da radioatividade
dos precipitados dos tubos da curva padrão e das amostras de plasma. A
contagem foi feita durante 2 minutos em um contador de radioatividade
MultiGamma (LKB Wallac 1261; Turku, Finlândia).
A taxa de ligação entre a PAG-I125 e o AS782 foi considerada como
100 % no tubo considerado como branco (B0), o qual contém 0 ng PAG/ml.
As amostras de plasma contendo concentrações de PAG inferiores à
119
80 % de ligação entre a amostra padrão mais diluída e o ponto
correspondente a B0 (B/B0 < 80 %) foram dosadas em um sistema RIA-PI.
Neste sistema, uma etapa adicional de 16 horas de incubação foi feita antes
da adição da PAG marcada. No dia seguinte, a PAG marcada foi
adicionada e uma segunda etapa de incubação de 4 horas foi feita antes da
adição do sistema precipitante.
As amostras de plasma contendo concentrações de PAG superiores a
20 % de ligação entre a amostra padrão mais concentrada e o ponto
correspondente a B0 (B/B0 > 20 %) foram diluídas na proporção 1/10 e
1/50, sendo novamente dosadas no RIA-SPI.
3.2.5. Características das dosagens PAG-RIA
Os limites mínimos de detecção (LMD) de ambos os RIA foram
determinados como sendo a média subtraída de duas vezes o desvio padrão
de 20 replicatas do amostra B0.
Quatro amostras contendo concentrações diferentes de PAG foram
usadas para calcular os coeficientes de variação intra-ensaio e inter-ensaio
de ambos os sistemas (RODBARD et al., 1974).
3.2.6. Análise estatística
As concentrações de PAG durante a gestação e período pós-parto
foram apresentadas como média ± desvio padrão (média ± DP). As
concentrações de PAG obtidas em uma fêmea Azawak (ZSand) foram
consideradas como anormais pelo teste de comparação de médias
(DAGNIELE, 1975), tendo sido excluídas da análise estatística.
O efeito da semana sobre as concentrações de PAG foi testado contra
120
os erros residuais usando-se para tal as opções STDERR e PDIFF do
Procedimento GLM do SAS (User´s Guide, 2002).
A meia vida da PAG foi calculada conforme previamente descrito por
KLINDT et al. (1979).
121
4. RESULTADOS
4.1. Experimento 1 – Purificação e caracterização de glicoproteínas
associadas à gestação
4.1.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de troca de
íons (Protocolo 1)
Conforme mostrado na TABELA 6, as proteínas imunoreativas à PAG
representaram 0,93 % do total de proteínas solúveis extraídas de placentas
de vacas zebu coletadas entre a 30a e 31a semanas de gestação.
Aproximadamente 87,89 % das proteínas imunoreativas presentes no
extrato inicial (extrato bruto) permaneceram no sobrenadante após sua
acidificação a pH 4,5. Após precipitações em sulfato de amônia a 0-40 %
de saturação e a 40-80 % de saturação, as proteínas imunoreativas
representavam respectivamente 0,23 % e 91,15 % das proteínas
imunoreativas inicialmente presentes no extrato bruto.
TABELA 6 -
Recuperação de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais
(PT) obtidas após diferentes etapas de extração e precipitação.
Etapa analisada
PAGa (mg)
PTb (mg)
Proporção
PAG:PT
Extração bruta
334,5
35.924
0,93 %
Precipitação ácida
294,0
20.236
1,45 %
Fração 0-40 % S.A.
0,76
173
0,44 %
Fração 40-80 % S.A.
304,9
3.855
7,91 %
a
Quantidade de PAG estimada por RIA.
b
Proteína total (PT) calculada pelo método de Lowry.
122
Como pode ser visto na TABELA 7, as proteínas contidas na fração
40-80 % S.A. foram eluídas da coluna DEAE equilibrada em tampão TrisHCl (pH 7,6) principalmente quando foram atingidas as concentrações
correspondentes a 0,04 M, 0,08M e 0,16 M de NaCl (17,64 %, 45,96 % e
20,56 % do total de proteínas imunoreativas obtidas após a cromatografia).
Estas frações, assim como as frações DEAE menos imunoreativas foram
em seguida submetidas a cromatografia de troca de cátions em resina CM
cerâmica.
TABELA 7 -
Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais
(PT) mensuradas após eluição na coluna de Sephadex A25.
PAGa (mg)
TPb (mg)
Proporção
PAG:PT
0 M NaCl
8,33
282,7
2,95 %
0,02 M NaCl
5,63
114,6
4,91 %
0,04 M NaCl
30,74
176,3
17,44 %
0,08 M NaCl
80,07
292,9
27, 34%
0,16 M NaCl
35,78
666,0
5,37 %
0,32 M NaCl
7,49
292,4
2,56 %
Fração DEAE
a
Quantidade de PAG estimada por RIA.
b
Proteína total (PT) calculada pelo peso após liofilização.
Como pode ser visto nas TABELAS 8, 9 e 10, após cada
cromatografia em coluna CM, foram observados entre 10 e 20 piques de
proteínas. Os perfis cromatográficos destas cromatografias encontram-se
descritos em maiores detalhes na FIGURA 21.
123
TABELA 8 -
Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais
(PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações
DEAE 0 M e 0,02 M NaCl.
DEAE 0 M
DEAE 0,02 M
a
b
Pique Concen- Concen- PAG
PT
Propor- Concen- Concen- PAGa
PTb Proportração tração
(mg)
(mg)
ção
tração tração
(mg)
(mg)
ção
inicial de final de
PAG:PT inicial de final de
PAG:PT
NaCl
NaCl
(%)
NaCl
NaCl
(%)
(M)
(M)
(M)
(M)
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
a
0
0,04
0,08
0,09
0,12
0,14
0,17
0,18
0,22
0,27
0,33
0,38
0,46
-
0,04
0,08
0,09
0,12
0,14
0,17
0,18
0,22
0,27
0,33
0,38
0,46
0,65
-
0,1995
0,0002
0
0,0183
0,0494
0,1588
0,1944
0,3876
0,6677
1,1947
0,9876
0,1017
0,0118
-
87,9
0,1
0,1
1,0
0,5
1,0
1,0
1,8
2,8
2,9
3,7
17,7
15,6
-
0,23
0,20
0
1,83
9,88
15,88
19,44
21,53
23,85
41,20
26,69
0,57
0,08
-
0
0
0
0
0,08
0,13
0,26
0,33
0,36
0,38
0,39
0,41
0,42
0,46
0
0
0
0,08
0,13
0,26
0,33
0,36
0,38
0,39
0,41
0,42
0,46
0,48
0
0
0
0
0
0
0
0,0184
0,1879
0,7552
0,8932
0,6386
0,0143
0,0034
5,5
2,4
2,4
2,5
1,0
4,0
5,6
10,4
4,8
3,8
3,9
15,2
5,8
3,1
0
0
0
0
0
0
0
0,18
3,91
19,87
22,90
4,20
0,25
0,11
Calculado por PAG-RIA.
b
Calculado pelo peso após liofilização.
Quando calculada a proporção entre a quantidade estimada de PAG
obtida por RIA e a quantidade de proteína total (PT) presentes em cada
pique das diferentes cromatografias em resina CM cerâmica, foram
observados piques únicos de PAG.
Os piques CM mais imunoreativos foram obtidos após cromatografia
das frações DEAE 0,04 e 0,08 M de NaCl, tendo sido eluídos por
concentrações de NaCl situadas entre 0,14 e 0,18 M. Os piques CM
apresentando menor imunoreatividade foram obtidos após cromatografia
124
das frações DEAE 0 M, 0,02 M, 0,16 M e 0,32 M de NaCl, tendo sido
eluídos por concentrações de NaCl situadas entre 0,21 e 0,41 M.
TABELA 9 -
Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais
(PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações
DEAE 0,04 M e 0,08 M NaCl.
DEAE 0,04 M
DEAE 0,08 M
a
b
Pique Concen- Concen- PAG
PT
Propor- Concen- Concen- PAGa
PTb Proportração tração
(mg)
(mg)
ção
tração tração
(mg)
(mg)
ção
inicial de final de
PAG:PT inicial de final de
PAG:PT
NaCl
NaCl
(%)
NaCl
NaCl
(%)
(M)
(M)
(M)
(M)
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
a
0
0
0
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,14
0,16
0,18
0,24
0,26
0,35
0,37
0,44
0,46
0,48
0,51
0
0
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,14
0,16
0,18
0,24
0,26
0,35
0,37
0,44
0,46
0,48
0,51
0,58
0
0
0
0
0
0
0
0
0,0017
2,5081
12,7215
5,0146
0,2799
0,2967
0,0201
0,0338
0,0060
0,0058
0,0058
0,0038
0
7,9
2,5
1,2
1,8
4,4
1,9
2,8
6,8
8,6
10,7
15,3
3,2
16,6
1,5
7,6
0,8
0,7
0,6
0,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0,03
29,16
> 100
32,78
8,75
1,79
1,34
0,45
0,75
0,82
0,97
0,76
0
0
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,11
0,14
0,17
0,19
0,22
0,24
0,27
0,32
0,37
0,56
-
0
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,11
0,14
0,17
0,19
0,22
0,24
0,27
0,32
0,37
0,56
0,67
-
0,0033
0,0012
0,0190
0,0045
0,0026
0,0016
0,0483
7,9478
20,9184
3,0624
0,7722
0,7226
0,3240
0,2288
0,0970
0,1009
0,0108
-
16,5
1,6
4,4
0,7
2,2
1,5
1,6
13,6
19,5
8,0
5,2
5,9
5,3
14,9
9,6
8,9
1,3
-
0,02
0,08
0,43
0,64
0,12
0,11
3,02
58,44
> 100
38,28
14,85
12,25
6,11
1,54
1,01
1,13
0,83
-
Calculado por PAG-RIA.
b
Calculado pelo peso após liofilização.
125
TABELA 10 -
Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais
(PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações
DEAE 0,16 M e 0,32 M NaCl.
DEAE 0,16 M
DEAE 0,32 M
a
b
Pique Concen- Concen- PAG
PT
Propor- Concen- Concen- PAGa
PTb Proportração tração
tração tração
(mg)
(mg)
ção
(mg)
(mg)
ção
inicial de final de
PAG:PT inicial de final de
PAG:PT
NaCl
NaCl
(%)
NaCl
NaCl
(%)
(M)
(M)
(M)
(M)
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
a
0
0
0,02
0,04
0,08
0,12
0,19
0,23
0,30
0,32
0,36
0,39
0,44
0
0,02
0,04
0,08
0,12
0,19
0,23
0,30
0,32
0,36
0,39
0,44
0,52
0,0052
0,0067
0,0029
0,0024
0,0064
0,0035
0,0026
2,825
1,3308
0,2567
0,0443
0,0336
0,0115
29,0
6,1
2,4
1,7
4,0
2,9
1,6
9,6
18,8
38,7
13,1
4,4
1,7
0,02
0,11
0,12
0,14
0,16
0,12
0,16
29,43
7,08
0,66
0,34
0,76
0,68
0
0
0,21
0,27
0,30
0,35
0,40
0,44
0,49
0,60
-
0
0,21
0,27
0,30
0,35
0,40
0,44
0,49
0,60
0,85
-
0,7821
0,2736
0,1936
0,0398
0,0358
0,0081
0,0031
0,0032
0,0017
0,0022
-
126,1
0,7
0,3
0,2
0,6
1,0
1,2
1,2
0,5
0
-
0,62
39,08
64,55
19,90
5,97
0,81
0,26
0,27
0,34
0
-
Calculado por PAG-RIA.
b
Calculado pelo peso após liofilização.
Após cromatografia em resina CM cerâmica, as proteínas existentes
no pique mais imunoreativo de cada cromatografia foram analisadas quanto
a suas massas moleculares, a suas imunoreatividades com o uso de 3 antisoros de origens distintas e quanto a seus pontos isoelétricos. A FIGURA
22 mostra a análise eletroforética (1-D SDS-PAGE e Western Blot) das
proteínas presentes no pique mais imunoreativo de diferentes CM
cerâmicas realizadas. As massas moleculares calculadas para as bandas
mais imunoreativas, assim como seus respectivos pontos isoelétricos
calculados por 2-D SDS-PAGE estão descritos na TABELA 11.
126
22,9 %
41,2 %
> 100 %
> 100 %
29,4 %
64,6 %
FIGURA 21 -
Perfis cromatográficos das frações DEAE 0 M a 0,32 M NaCl
submetidas a FPLC em coluna CM cerâmica. A coluna (1 x 3 cm)
foi previamente equilibrada em tampão acetato de amônia a 10
mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. As áreas
hachuradas indicam as frações mais imunoreativas de cada
cromatografia. As percentagens indicam a proporção entre PAG e
proteína total (PT).
127
FIGURA 22 -
A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12 %) após coloração por
Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas imunoreativas por meio
de Western Blot com o uso do AS497 (anti-boPAG67). As pistas 1, 2,
3, 4 and 5 correspondem aos piques mais imunoreativos obtidos após
cromatografia em resina CM cerâmica das frações DEAE 0, 0,02,
0,04, 0,08 e 0,16 M NaCl. Vinte microgramas de proteínas de cada
pique foram carregadas. As massas moleculares (x 10-3) estão
indicadas nos lados esquerdo e direito das Figuras 22A e 22B,
respectivamente.
A banda mais intensamente corada de cada pique CM revelou-se
imunoreativa após Western Blot com o uso de anti-soro anti-boPAG67
(AS497). Uma imunoreatividade semelhante foi observada após Western
Blot com o uso dos anti-soros anti-caPAG55+62 (AS706) e anti-caPAG55+59
(AS708). A redução com o agente redutor mercaptoetanol não afetou a
massa molecular das proteínas imunoreativas.
128
4.1.2. Análise da seqüência N-terminal das proteínas imunoreativas
isoladas com o auxílio de cromatografias de troca de íons
(Protocolo 2)
Após transferidos sob membrana de PVDF, os spots correspondentes
às bandas imunoreativas detectadas por Western Blot foram seqüenciados
em sua porção N-terminal. Os quatro spots correspondentes à fração DEAE
0,08 M NaCl, CM pique IX foram seqüenciadas, revelando a seqüência
Arg-Gli-Ser-A?n-Leu-Tre-Tre-His-Pro-Leu-Arg-Asn-Ile-Lis-A?n-Leu-ValTir-Met-Gli-Asn-Ile-Tre -Ile-Gli, a qual corresponde à extremidade Nterminal da boPAG-1 (código de acesso SWISS-PROT Q29432). A mesma
seqüência foi verificada em um dos spots da fração DEAE 0,04 M NaCl,
CM pique XI. Esta seqüência foi depositada no banco de dados SWISSPROT, tendo recebido o código de acesso P83126.
TABELA 11 -
Fração
DEAE de
origem
Características eletroforéticas e identidade ao nível de seqüência Nterminal das proteínas mais imunoreativas isoladas pela cromatografia
em resina CM cerâmica.
MM das principais bandas coradasa pIs das proteínas
imunoreativasb
Coomassie Blue Western Blot
Identidade ao nível
de seqüência de aa
N-terminal
0 M NaCl
51 kDa
50 kDa
6,4, 6,6, 6,7
boPAG-1 (10 aa)
0,02 M NaCl
62 kDa
56 kDa
5,2, 5,5
boPAG-1 (10 aa)
0,04 M NaCl
66 kDa
67 kDa
5,1, 5,2, 5,4
boPAG-1 (25 aa)
0,08 M NaCl
67 kDa
71 kDa
5,0, 5,1, 5,2, 5,3
boPAG-1 (25 aa)
0,16 M NaCl
67 kDa
60 kDa
67 kDa
-
4,4, 5,0, 5,5, 6,0
-
boPAG-1 (10 aa)
-
0,32 M NaCl
62 kDa
62 kDa
5,8, 6,1, 6,3, 6,4 α-N-acetil-galactosaminidase (12 aa)
a
Massas moleculares (MM) foram estimadas por 1-D PAGE-SDS.
Pontos isoelétricos (pIs) foram estimados por 2-D PAGE-SDS.
b
129
O
microseqüenciamento
N-terminal
(10
aa)
das
proteínas
imunoreativas provenientes dos piques CM das frações DEAE 0 M, 0,02 M
e 0,16 M NaCl também revelaram 100 % de identidade com a seqüência Nterminal da boPAG-1.
Apesar da alta imunoreatividade detectada após RIA de um dos piques
CM da fração DEAE 0,32 M NaCl (62,55 %), o microseqüenciamento da
proteína mais imunoreativa (FIGURA 23) revelou a seqüência Leu-GluAsp-Gli-Leu-Leu-Arg-Lis-Pro-Pro-Met-Gli, a qual apresenta uma alta
identidade
(91,65
%)
com
a
alfa-N-acetilgalactosaminidase
de
camundongos (código de acesso SWISS-PROT O88620). A seqüência da
proteína correspondente à galactosaminidase, isolada a partir da placenta de
zebuínos, foi depositada no banco de dados SWISS-PROT, tendo recebido
o código de acesso P83127.
FIGURA 23 - 2-D SDS-PAGE do pique mais imunoreativo obtido após
cromatografia em resina CM Cerâmica da fração DEAE 0,32 M NaCl.
As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas no lado direito da
figura. A escala de pH está indicada na parte superior do gel. As setas
indicam as diferentes isoformas (6,4, 6,3, 6,1 e 5,8) da alfa-Nacetilgalactosaminidase.
130
4.1.3.
Caracterização da PAG identificada após a realização de
cromatografias de afinidade em gel de pepstatina A-agarose
(Protocolo 2)
4.1.3.1. Extração ácida
Conforme estimado por RIA, as proteínas reativas à PAG
representavam 0,61 % (73,73 mg) das proteínas extraídas em pH ácido. O
pique imunoreativo obtido após cromatografia em gel de pepstatina Aagarose foi eluído a concentrações de NaCl situadas entre 0,14 e 0,43
(FIGURA 24). Este pique apresentou uma proporção de 15,74 % entre a
quantidade estimada de PAG (mensurada por RIA) e a quantidade de PT
(mensurada
pelo
método
de
Lowry).
Conforme
observado
por
espectrometria (comprimento de onda de 280 nm), após a aplicação do
gradiente de pH, nenhum pique protéico foi observado.
15,7 %
FIGURA 24 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A-agarose. A extração
das placentas coletadas entre 20 e 21 semanas de gestação foi feita em
pH ácido (KCl a 0,3 M, pH 5,0). A coluna (1,6 x 4 cm) foi previamente
equilibrada em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra
indica o gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais
imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e proteína
total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo método de
Lowry (PT).
131
Uma única banda protéica foi observada após 1-D SDS-PAGE do
pique imunoreativo (FIGURA 25A, pista 1). A realização de 2-D SDSPAGE com uma maior quantidade de proteínas provenientes deste pique
(200 µg) revelou a existência de três spots, o primeiro correspondendo a
uma massa molecular de 67 kDa, e os dois outros correspondendo a uma
massa molecular de 84 kDa (pI 4,4 e 5,4).
FIGURA 25 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12 %) após coloração por
Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas imunoreativas por meio
de Western Blot com o uso dos anti-soros anti-boPAG67 (AS497), anticaPAG55+62 (AS706) and caPAG55+59 (AS708). As pistas 1 e 2
correspondem aos piques mais imunoreativos obtidos após
cromatografia em pepstatina A-agarose após extração em pH ácido e
alcalino, respectivamente. Sessenta microgramas das proteínas
imunoreativas de cada pique foram carregadas. As massas moleculares
(x 10-3) estão indicadas nos lados esquerdo e direito das Figuras 25A e
25B, respectivamente.
132
O microseqüenciamento da extremidade N-terminal (14 aa) do spot de
67 kDa revelou 100 % de identidade com a seqüência da boPAG-1. Os
spots de 84 kDa tiveram o seqüenciamento bloqueado ao 1o e 6o ciclos (pI
de 4,4 e 5,4, respectivamente). O seqüenciamento do spot correspondente
ao pI 4,4 revelou a seqüência Ala-Val-Asp-Gli-Gli-His, a qual não
corresponde a nenhum membro da família das PAGs.
4.1.3.2. Extração alcalina
Conforme estimado por RIA, as proteínas imunoreativas à PAG
representavam 1,81 % (43,57 mg) das proteínas extraídas em pH alcalino.
Após cromatografia em coluna de pepstatina A-agarose, as proteínas
extraídas em pH alcalino foram fracionadas em diversos piques (FIGURA
26), o mais reativo deles tendo sido eluído a concentrações de NaCl
situadas entre 0,19 e 0,42 M. Nenhuma proteína foi eluída após a aplicação
do gradiente de pH.
A análise eletroforética (1-D SDS-PAGE) do pique imunoreativo
revelou a existência de uma banda protéica mais fortemente corada com
uma massa molecular aparente de 69 kDa, e de diversas bandas mais
fracamente coradas, cujas massas moleculares variaram entre 20 kDa e 84
kDa (FIGURA 25A, pista 2). Após Western Blot, duas bandas
imunoreativas foram reveladas. Essas bandas apresentavam massas
moleculares aparentes de 69 e 84 kDa (FIGURA 25B, pistas 2).
Após análise por 2-D SDS-PAGE, foram visualizadas três variantes
isoelétricas correspondentes à massa molecular de 69 kDa (pI 3,1, 3,3 e
6,18). O microseqüenciamento N-terminal de um destes spots (14 aa)
revelou 100 % de identidade com a seqüência da boPAG-1.
133
3,3 %
FIGURA 26 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A-agarose. A extração
das placentas coletadas entre 10 e 11 semanas de gestação foi feita em
pH alcalino (tampão bicarbonato de amônia a 0,05 M, pH 8,5). A
coluna (1,6 x 4 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de
sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A
área hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem
indica a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme
determinado por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT).
Apesar de altamente reativa após Western Blot com o uso de antisoros de origem bovina e caprina, a proteína 84 kDa revelou a seqüência
Asp-Lis-Asn-Ala-Tir-Gli-Ile-Asp-Leu-Ile-Leu, a qual apresenta 77,78 % de
identidade com a metaloproteinase alcalina (código de acesso GenBank
AAK22731) identificada no genoma do Caulobacter crescentus. A
seqüência da proteína correspondente à metaloproteinase, isolada a partir
da placenta de zebuínos, foi depositada no banco de dados SWISS-PROT,
tendo recebido o código de acesso P83128.
134
4.2. Experimento 2 - Dosagens radioimunológicas da PAG (PAG-RIA)
durante a gestação e período pós-parto em
fêmeas zebu
4.2.1. Características das dosagens PAG-RIA
As TABELAS 12 e 13 resumem algumas das principais características
dos sistemas RIA homólogos usados para mensurar as concentrações
plasmáticas de PAG no plasma de fêmeas zebuínas.
TABELA 12 -
Sistema
Características dos sistemas RIA com e sem etapa de pré-incubação
(RIA-PI e RIA-SPI) utilizados para mensurar as concentrações de
PAG presentes em amostras de plasma de fêmeas zebu gestantes.
Limite mínimo de Ligação não- B0/T
detecção (ng/ml) específica (%) (%)a
Dose estimada (ng/ml) a B/B0b
20 %
50 %
80 %
RIA-PI
0,20
< 1,0
23
7,83
2,47
0,76
RIA-SPI
1,11
< 1,0
28
114,34
26,67
6,24
a
B0/T =
b
B/B0 =
Quantidade de PAG marcada no tubo B0
Quantidade total de PAG marcada adicionada.
Quantidade de PAG marcada na curva padrão
Quantidade de PAG marcada no tubo B0.
Na presença de excesso de anticorpos, 83,6 % da PAG marcada foi
ligada. O deslocamento das curvas padrão foi altamente reproduzível,
variando de 90,7 ± 2,0 % a 12,5 ± 1,1 % (n = 10) de ligação no sistema
RIA-PI, e de 92,2 ± 1,2 % a 6,4 ± 1,0 % (n = 10) no sistema RIA-PI
(FIGURA 27).
135
TABELA 13 -
Coeficientes de variação (CV) intra-ensaio e inter-ensaio dos sistemas
de dosagem com e sem etapa de pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI).
Intra-ensaio
Inter-ensaio
Concentração de
PAGa (ng/ml)
CV (%)
Concentração de
PAGa (ng/ml)
CV (%)
Amostra 1
1,49 ± 0,11
7,4
1,62 ± 0,15
9,4
Amostra 2
3,24 ± 0,11
3,5
3,37 ± 0,05
1,6
Amostra 3
12,73 ± 0,63
4,9
12,01 ± 0,57
4,8
Amostra 2
3,09 ± 0,34
11,1
3,11 ± 0,43
13,8
Amostra 3
11,73 ± 0,76
6,5
11,99 ± 0,74
6,1
Amostra 4
60,22 ± 4,81
8,0
53,04 ± 6,06
11,4
RIA-PI
RIA-SPI
(média ± DP)
a
100
B/Bo xx 100
100
B/Bo
80
60
40
20
0
0,1
1
10
100
PAG
PAG(ng/mL)
ng/ml
FIGURA 27 - Curvas padrão (média ± DP) da dosagem de PAG nos sistemas de
dosagem com etapa de pré-incubação (-▼-▼-) e sem etapa de préincubação (-▲-▲-). Função B/B0 do logaritmo das concentrações de
PAG.
136
4.2.2. Perfis de PAG em vacas Azawak
Uma das 12 vacas Azawak inicialmente diagnosticadas como
gestantes por palpação retal mostrou concentrações de PAG inferiores ao
limite mínimo de detecção (< 0,2 ng/ml) e não pariu.
Dez vacas Azawak tiveram gestações simples, parindo um total de 3
bezerros machos e 7 fêmeas. Uma outra fêmea zebu deu cria a uma fêmea
emaciada. Esta fêmea apresentou concentrações de PAG extremamente
elevadas ao longo da gestação, tendo suas concentrações excluídas do perfil
geral. Clinicamente, esta vaca caracterizou-se por apresentar um declínio
de sua condição corporal, a qual passou de 4-5 no início da gestação, à 1-2
no terço final.
A FIGURA 28 mostra o perfil de PAG durante a gestação e período
pós-parto em 10 vacas zebuínas da raça Azawak. As concentrações médias
semanais de PAG variaram significativamente entre os animais (P<0,0001)
e períodos de gestação (P<0,0005). Entretanto, diferenças significativas
entre as diferentes semanas de gestação somente foram verificadas uma
semana antes do parto.
As concentrações médias de PAG aumentaram progressivamente da 8a
à 35a semanas de gestação (de 6,0 ± 4,2 ng/ml a 196,0 ± 34,8 ng/ml). Em
seguida, as concentrações permaneceram relativamente constantes até a 39a
semana (210,8 ± 74,8 ng/ml), alcançando seus mais altos níveis (1.095,6 ±
607,8 ng/ml) na semana do parto (40a semana).
Após
o
parto,
as
concentrações
de
PAG
decresceram
significativamente (P<0,05), sendo os mais baixos níveis (5,1 ± 5,2 ng/ml)
alcançados na 10a semana pós-parto.
137
2000
PAG (ng/ml)
parto
↓
1500
*
1000
*
500
**
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
5pp 10pp 15pp
Semanas de gestaçao e pos-parto
FIGURA 28 - Concentrações plasmáticas de PAG (média ± DP) durante a gestação
e período pós-parto em 10 fêmeas zebu da raça Azawak. A 40a
semana de gestação corresponde à semana do parto (0pp). Diferenças
significantes entre as semanas de gestação estão indicadas por
asteriscos (*P<0.0001, **P<0.05).
Após o parto foi calculada uma meia-vida de 10,1 dias para a PAG.
Quando estimado pela equação de regressão (FIGURA 29), seria
necessário um período de aproximadamente 14 semanas para que as
concentrações de PAG se tornassem indetectáveis (< 0,2 ng/ml).
4.2.3. Perfil atípico de PAG
A FIGURA 30 mostra o perfil de PAG durante a gestação e período
pós-parto em uma fêmea zebu Azawak apresentando concentrações de
PAG aproximadamente 3,5 vezes superior a média obtida para a raça. Da
10a semana da gestação até o parto, foi obtida uma média semanal de 227,6
138
ng de PAG/ml, enquanto que a média semanal obtida nas outras 10 fêmeas
gestantes foi de aproximadamente 64,1 ng de PAG/ml.
8
Ln PAG (ng/ml)
Vaca apresentando concentrações elevadas de PAG
Y = -0,5165x + 7,67758
7
6
5
4
População homogênea
3
Y = -0,5095x + 7,42951
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Semanas apos o parto
FIGURA 29 - Curvas de regressão das concentrações plasmáticas de PAG
mensuradas entre a parturição e a 10a semana pós-parto. As
concentrações de PAG nas vacas Azawak que apresentaram
concentrações normais de PAG (n = 10) foram representadas por
círculos (●). As amostras da vaca zebu a qual apresentou altas
concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao final da
gestação foram representadas por quadrados (■).
A meia-vida da PAG estimada para esta vaca foi de aproximadamente
9,2 dias. Assim como o calculado para o restante da raça, seria necessário
um período de 14 semanas para que as concentrações de PAG se tornassem
indetectáveis (< 0,2 ng/ml).
139
PAG (ng/ml)
1000
População homogênea
800
Vaca apresentando concentrações
elevadas de PAG
600
400
200
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40 5pp 10pp15pp
Semanas antes e apos a gestaçao
FIGURA 30 - Comparação dos perfis de PAG entre vacas Azawak apresentando
gestações normais (população homogênea) e a vaca que apresentou
altas concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao
final da gestação.
140
5. DISCUSSÃO
5.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de troca de
íons
O uso de protocolos de purificação com diversas etapas de
fracionamento já permitiu o isolamento de diversas formas de PAG a partir
da placenta de vacas de raças taurinas (BUTLER et al., 1982; CAMOUS et
al., 1988; ZOLI et al., 1991), de cabras (GARBAYO et al., 1998), de
ovelhas (WILLARD et al., 1995; XIE et al., 1997a) e de cervídeos
(HUANG et al., 1999). Estas formas de PAG foram caracterizadas
principalmente quanto à suas massas moleculares e pontos isoelétricos,
tendo algumas delas sido caracterizadas também quanto a suas seqüências
N-terminais.
Na primeira parte do presente estudo, um protocolo de purificação
incluindo precipitação ácida, precipitações em sulfato de amônia e
cromatografias de troca de íons foi utilizado para purificar glicoproteínas
associadas à gestação extraídas a partir de placentas de fêmeas zebuínas.
Considerada por alguns autores como desnecessária (HUANG et al.,
1999), a realização da precipitação mostrou ser uma etapa de grande
utilidade ao isolamento da PAG. Ela permitiu a eliminação de mais de 40
% (16 g) das proteínas solúveis presentes no extrato placentário bruto, com
uma perda mínima de proteínas imunoreativas à PAG (recuperação de 88
% da imunoreatividade inicial).
Não se sabe ao certo se a precipitação ácida seria responsável pela
eliminação de algumas formas de PAG. Entretanto, a utilização desta etapa
no protocolo de purificação utilizado na espécie caprina não interferiu no
141
isolamento de 3 novas formas de PAG, as quais possuíam diferentes
massas moleculares, cada qual constituída por diversas isoformas
(GARBAYO et al., 1998).
Como
demonstrado
por
diversos
autores,
a
realização
de
cromatografias de troca de íons tem demonstrado ser bastante efetiva para a
separação de diferentes formas de PAG extraídas a partir de placentas de
cabras (GARBAYO et al., 1998), de ovelhas (WILLARD et al., 1995; XIE
et al., 1997a) e de cervídeos (HUANG et al., 1999). Na espécie caprina,
por exemplo, após cromatografia em coluna DEAE Celulose, as proteínas
imunoreativas foram igualmente eluídas pelas concentrações de 0,04 e 0,08
M de NaCl. O fracionamento posterior de ambas as frações demonstrou a
existência de uma PAG de massa molecular 55 kDa (caPAG55) nas duas
frações DEAE, assim como a existência de PAGs distintas com massas
moleculares 59 kDa (caPAG59) e 62 kDa (caPAG62), respectivamente nas
frações 0,04 e 0,08 M NaCl.
Na espécie ovina, a associação entre as cromatografias de troca de
ânions e de cátions levou à caracterização de 4 PAGs: a ovPAG55, a
ovPAG60, a ovPAG61 e a ovPAG65 (XIE et al., 1997a). Cada uma destas
proteínas demonstrou ser possuidora de uma seqüência N-terminal distinta,
apresentando, entretanto, uma alta identidade com os demais membros da
família das proteases aspárticas.
Em vistas de se investigar a possível existência de diferentes formas
de PAG na placenta de zebuínos, todas as frações DEAE foram
sistematicamente submetidas a cromatografia de troca de cátions em coluna
CM cerâmica, sendo as proteínas presentes nos piques mais imunoreativos
analisadas por SDS-PAGE e Western Blot com o uso de anti-soros
142
produzidos contra diferentes formas de PAGs. Se levarmos em
consideração as diferentes massas moleculares (51 a 67 kDa) e pontos
isoelétricos (3,1 a 6,7) encontrados no presente trabalho, nossos resultados
confirmam uma grande heterogeneidade de formas de PAGs presentes nos
extratos placentários de zebuínos. Considerando-se especificamente as
seqüências N-terminais obtidas, nosso primeiro protocolo não revelou a
existência de diferentes formas de PAG eluídas em diferentes condições
iônicas. De fato, todas as proteínas da família das PAGs bovinas
purificadas até o presente (boPAG67, bPSPB, PSP-60) apresentaram a
mesma seqüência N-terminal, tendo estas seqüências sido obtidas por meio
de microseqüenciamento (CAMOUS et al., 1988) ou deduzidas a partir da
seqüência de DNA (XIE et al., 1991; LYNCH et al., 1992).
Existem ao menos três possíveis explicações para a aparente
discrepância entre os resultados obtidos por técnicas bioquímicas e de
biologia molecular, a qual permitiu a identificação de 21 ADNs
codificantes para diferentes PAGs em bovinos (XIE et al., 1991; XIE et al.,
1994; XIE et al., 1997a,b; GREEN et al., 2000). A primeira seria a de que,
apesar dos ADNs codificantes para diferentes PAGs poderem ser
transcritos e traduzidos sob a forma de proteínas, estas poderiam ser
rapidamente degradadas, não acumulando em quantidades suficientes, de
forma a poder ser identificadas por técnicas bioquímicas. A segunda
explicação seria a de que, em bovinos, algumas formas de PAG teriam o
seqüenciamento N-terminal bloqueado. Neste caso, apenas proteínas
majoritárias não bloqueadas poderiam ser identificadas pela degradação de
Edman. A terceira explicação seria a de que algumas das PAGs
identificadas por biologia molecular poderiam ser ligadas à membranas via
143
ácidos graxos, sendo consequentemente dificilmente extraíveis pelos
procedimentos utilizados no Protocolo 1. Entretanto esta hipótese parece
ser bastante improvável devido ao fato de que os ADNs codificantes para
PAGs identificados até o presente parecem codificar proteínas com uma
estrutura bastante próxima à do pepsinogênio (GURUPRASAD et al.,
1996), o qual não é originalmente ligado à membranas.
De acordo com XIE et al. (1991), a presença de cadeias laterais de
carboidratos seria responsável, ao menos parcialmente, pelas diferenças
observadas nas massas moleculares das PAGs. Um outro fator que poderia
estar implicado na diferença de suas massas moleculares seria a existência
de fragmentos de PAG os quais poderiam constituir-se nas formas de
menor massa molecular observadas por eletroforese.
Segundo sugerido por ZOLI et al. (1991), os diferentes graus de
glicosilação parecem estar também implicados na heterogeneidade dos
pontos isoelétricos observados para a boPAG67. No que concerne à
seqüência N-terminal, de forma semelhante ao observado em taurinos
(ZOLI et al., 1991), ovinos (XIE et al., 1997a) e caprinos (GARBAYO et
al., 1998), a PAG extraída da placenta de raças zebuínas falhou em dar
sinais no 4o ciclo o que indica a presença de uma cadeia de carboidratos
ligada às Asp 4.
Apesar da alta imunoreatividade observada na fração DEAE 0,32 M
CM pique III, o seqüenciamento de sua proteína majoritária (62 kDa)
mostrou mais de 75 % de identidade com a seqüência N-terminal da alfaN-acetilgalactosaminidase (α-GalNAc), uma exoglicosidase lisossomal
sintetizada em diversos tecidos das espécies humana (WANG et al., 1990),
murina (HERRMANN et al., 1998) e de galináceos (DAVIS et al., 1993).
144
A α-GalNAc não é estruturalmente, nem enzimaticamente, relacionada às
proteinases aspárticas lisossomais tais como a catepsina D. Entretanto, uma
expressão anormal de ambas parece estar diretamente relacionada a
condições patológicas tais como o câncer (YAMAMOTO et al., 1997;
VIGNESWARAN et al., 2000) e doenças neurológicas distróficas ou
degenerativas (LADROR et al., 1994; WOLFE et al., 1995).
A forma humana da α-GalNAc também foi acidentalmente
identificada como sendo uma das cinco bandas protéicas majoritárias
resultantes de procedimentos de purificação das sialidases placentárias
(TSUJI et al., 1989). Conforme descrito por SWEELEY et al. (1983), na
espécie humana, α-GalNAc parece ser sintetizada como um precursor
glicosilado de 65 kDa, o qual é processado a uma forma madura de 48 kDa.
Devido ao fato de ser diretamente responsável pela imunosupressão por um
mecanismo que envolve a deglicosilação do precursor do fator ativador de
macrófagos (MAF) em pacientes cancerosos (YAMAMOTO et al., 1997),
poderia ser sugerido que a forma placentária da α-GalNAc poderia estar, de
alguma forma, envolvida com o mecanismo de imunoregulação ao nível de
interface
materno-fetal.
Entretanto,
estudos
complementares
são
necessários para comprovar esta hipótese.
5.2. Caracterização da PAG identificada após a realização de
cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose
O estudo comparativo entre as estruturas tridimensionais das PAGs
bovinas e do pepsinogênio porcino demonstrou que as PAGs teriam
conservado a estrutura bilobulada característica das proteases aspárticas,
possuindo uma fenda entre os dois lobos capaz de acomodar peptídeos de
145
até sete aminoácidos de comprimento (GURUPRASAD et al., 1996).
Como conseqüência, tem sido sugerido que proteínas da família das PAGs
poderiam ser purificadas pelo uso de cromatografia de afinidade com o uso
de gel de pepstatina A-agarose (GURUPRASAD et al., 1996; GARBAYO
et al., 2000).
A pepstatina A é um inibidor extremamente potente das proteases
aspárticas (MARCINISZYN et al., 1977). Ela se liga reversivelmente a
pepsina, a renina e a catepsina D, tendo por isso sido usado como ligante
para a realização de cromatografias de afinidade para purificação destas
enzimas (DZAU et al., 1979; AFTING & BECKER, 1981).
Na segunda parte do presente estudo, um protocolo de purificação
baseado na utilização da coluna de afinidade com gel de pepstatina agarose
foi testada para o isolamento da PAG a partir de placentas de fêmeas
zebuínas coletadas durante o primeiro e segundo trimestres de gestação.
Algumas formas de PAG, diferentes quanto a suas massas moleculares
e pontos isoelétricos, puderam ser identificadas após cromatografia de
afinidade com o uso de gel de pepstatina A agarose. Quando extratos de
placentas coletadas no segundo trimestre de gestação foram extraídas em
pH ácido, o uso de gel de pepstatina A-agarose permitiu o enriquecimento
do mesmo por um fator de 25,8 (proporção PAG : PT de 15,74 % após a
cromatografia versus 0,61 % antes da cromatografia). Uma menor eficácia
foi observada após cromatografia de afinidade dos extratos placentários
coletados durante o primeiro trimestre de gestação e extraídos em pH
alcalino (proporção PAG:PT de 3,26 % após a cromatografia versus 1,81 %
antes da cromatografia). Esta baixa eficiência obtida com o isolamento da
PAG a partir de extratos placentários coletados durante o primeiro trimestre
146
de gestação parece ser devida principalmente à alta viscosidade do mesmo,
o que poderia ter tornado difícil uma adequada interação entre a pepstatina
A e a PAG.
Em ambas as cromatografias de afinidade, a fração contendo a PAG
foi eluída antes que fosse atingida uma alta concentração em NaCl,
indicando uma fraca interação entre a PAG e a pepstatina A. Este achado é
consistente com a teoria de que a substituição de uma Tir89 e de uma
Leu220 (numeração de acordo com a seqüência do pepsinogênio porcino)
por resíduos de Asp resultaria em uma fraca interação entre a boPAG67 e o
inibidor pepstatina (GURUPRASAD et al., 1996).
Após cromatografia de afinidade, o extrato de placentas coletadas nos
dois primeiros trimestres de gestação revelaram a existência de uma única
proteína imunoreativa de 67 a 69 kDa de massa molecular aparente. Esta
proteínas possuíam, assim como as proteínas isoladas no primeiro
protocolo, seqüências N-terminais 100 % idênticas às da proteína
previamente isolada e partir da placenta de raças taurinas.
Como pôde ser observado na FIGURA 25 (pista 2), uma outra
proteína com massa molecular de 84 kDa altamente imunoreativa a antisoros anti-PAG bovina e caprina foi identificada após a cromatografia de
afinidade. O seqüenciamento desta proteína revelou 77,78 % de identidade
com a seqüência N-terminal de uma metaloproteinase alcalina previamente
identificada no genoma do Caulobacter crescentus (NIERMAN et al.,
2001). Três principais possibilidades poderiam ser sugeridas para a
identificação desta proteína em extratos placentários de raças zebuínas. A
primeira seria a ocorrência de proliferação bacteriana durante o
procedimento de purificação. A segunda possibilidade seria a de que ambas
147
as classes de proteínas possuiriam alguns epitopes em comum, podendo ser
reconhecidas como resultado de reações cruzadas dos anti-soros policlonais
utilizados. A terceira possibilidade seria a expressão natural desta
metaloproteinase em extratos placentários de zebuínos. Investigações
complementares estão sendo realizadas no sentido de investigar a
possibilidade da ocorrência de reações cruzadas entre ambas as classes de
proteínas.
5.3. Dosagens radioimunológicas da PAG durante a gestação e período
pós-parto em fêmeas zebu
Durante gestações normais, as concentrações de PAG podem diferir
consideravelmente entre as espécies e os períodos de gestação (ZOLI et al.,
1992a; RANILLA et al., 1994; SOUSA et al., 1999). Em uma mesma
espécie, elas podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre os quais
podem ser citados a raça da fêmea (MIALON et al., 1993; RANILLA et al.,
1994), o número de fetos (DOBSON et al., 1993; PATEL et al., 1997), o
genótipo fetal (GUILBAULT et al., 1991; WILLARD et al., 1995), o estado
nutricional da fêmea (WALLACE et al., 1997a) e no caso de transferência de
embriões, a duração de cultivo in vitro dos embriões (ECTORS et al.,
1996a,b). As concentrações de PAG parecem também diferir de acordo com
o
sistema
radioimunológico
utilizado,
diferença
esta
resultando
provavelmente da especificidade do antisoro (GONZALEZ et al.,
1999,2000).
Perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG já foram descritos em
taurinos (ZOLI et al., 1992a; DOBSON et al., 1993; PATEL et al., 1997),
em caprinos das raças Blanca-Celtibérica (BENITEZ ORTIZ, 1992;
148
FOLCH et al., 1993), Canindé (SOUSA et al., 1999), Moxotó (SOUSA et
al., 1999), Canária (GONZÁLEZ et al., 2000), Alpina (BATALHA et al.,
2001) e em ovinos das raças Assaf (RANILLA et al., 1997), Churra
(RANILLA et al., 1994), Merino (RANILLA et al., 1994) e Berrichon
(GAJEWSKI et al., 1999). Entretanto, ao nosso conhecimento, perfis de
PAG nunca foram descritos em fêmeas de origem zebuína.
Na última parte do presente trabalho, foi descrito o perfil plasmático
de PAG durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebuínas
gestantes
pertencentes
à
raça
Azawak.
Algumas
das
principais
características dos sistemas homólogos desenvolvidos para a dosagem da
PAG em raças zebuínas também foram descritos.
Os sistemas radioimunológicos desenvolvidos a partir do uso da PAG
purificada a partir da placenta de fêmeas zebuínas mostraram ser bastante
precisos para a mensuração da PAG na circulação periférica materna. Os
coeficientes de variação obtidos tanto para o sistema RIA com préincubação (RIA-PI) quanto para o sistema de dosagem sem etapa de préincubação (RIA-SPI) foram bastante baixos (1,6 a 13,8 %). Eles foram
comparáveis aos resultados obtidos por ZOLI et al. (1992a) para a dosagem
da PAG de origem taurina (6,9 a 11,6 %) e por GONZALEZ et al. (1999)
para a dosagem da PAG caprina (6,9 a 11,6 %). Um outro importante
aspecto observado foi o de que quando uma mesma amostra foi dosada por
ambos os sistemas (PI e SPI), as concentrações de PAG permaneceram
constantes, mesmo se dosadas nas regiões menos sensíveis das curvas
padrão (B/B0 inferior a 80 % de ligação ou superior a 20 % de ligação).
No que se refere à aplicação prática dos sistemas RIA aqui descritos,
enquanto que o sistema RIA-PI mostrou ser adequado à dosagem da PAG
149
durante o início da gestação (concentrações entre 0,8 e 7,8 ng/ml), o
sistema RIA-SPI mostrou ser capaz de detectar concentrações tão altas
quanto 100 ng/ml, sendo mais adequado ao monitoramento das
concentrações de PAG ao longo da gestação e reduzindo a necessidade da
diluição das amostras durante a maior parte da gestação.
No que diz respeito à comparação dos perfis de PAG em animais de
raças zebuína e taurina (ZOLI et al., 1992a; PATEL et al., 1997), em
ambos os taxas foi observado um lento aumento destas concentrações entre
a 8a e a 35a semanas de gestação, período durante o qual as concentrações
de PAG permaneceram inferiores a 200 ng/ml. Entretanto, enquanto que
em zebuínos as concentrações de PAG permaneceram em níveis
relativamente constantes da 35a à 39a semanas de gestação (196,0 ± 34,8
ng/ml a 210,8 ± 74,8 ng/ml), em raças taurinas este período correspondeu a
um rápido aumento das concentrações de PAG (158,9 ± 60,2 a 1.551,9 ±
589,7 ng/ml) (ZOLI et al., 1992a). Ainda não se sabe se as concentrações
relativamente constantes de PAG observadas na raça Azawak resultam do
uso de uma PAG purificada a partir da placenta de zebuínos ou a diferenças
inerentes à própria raça. Entretanto, a primeira hipótese parece menos
provável devido ao fato de que quando diferentes amostras plasmáticas
foram dosadas em ambos os sistemas taurino e zebuíno, nenhuma diferença
foi observada nas concentrações de PAG.
As concentrações de PAG observadas no período próximo ao parto
foram inferiores em fêmeas zebuínas (1.095 ng/ml) do que o observado
previamente por ZOLI et al. (1992a) e PATEL et al. (1997) em fêmeas de
raças taurinas (1.352,8 a 2.462,4 ng/ml). Essas concentrações de PAG
aparentemente mais baixas em zebuínos podem ser devidas a diversos
150
fatores, dentre os quais podemos citar o fluxo sangüíneo placentário e a
massa da placenta. Existem poucas informações sobre o efeito do fluxo
sangüíneo placentário sobre as concentrações de hormônios e/ou proteínas
de origem placentária (NEWNHAM et al., 1986). Entretanto, devido ao
fato de que os fluxos sangüíneos uterino e placentário parecem ser menores
em raças zebuínas do que em raças taurinas (FERREL, 1991), esta hipótese
deve ser levada em consideração como uma das possíveis causas dos níveis
inferiores de PAG observados no presente estudo.
Diversos autores reportaram o efeito da massa placentária sobre as
concentrações de PAG (DOBSON et al., 1993; MIALON et al., 1993;
PATEL et al., 1997). Conforme descrito por MIALON et al. (1993),
próximo ao parto, as concentrações de PSP-60 são significativamente
inferiores em raças taurinas que portam bezerros de menor porte (ex.: raça
Holandesa e Normanda) do que naquelas que portam bezerros maiores (ex.:
raça Charolesa). Segundo esses autores, estas diferenças de concentração
são provavelmente devidas à diferenças de massa placentária, o que
refletiria indiretamente o número total de células binucleadas produtoras de
hormônios e proteínas placentárias. No presente estudo, a massa placentária
e o peso dos bezerros não puderem ser obtidos logo após o parto.
Entretanto, devido ao fato de que vacas Azawak possuem pesos médios
situados entre 300 e 410 kg (PAYNE, 1970), pode-se supor que a massa
placentária nesta raça seria inferior àquela estipulada para raças taurinas,
explicando parcialmente os menores níveis plasmáticos de PAG
observados ao final da gestação.
No que diz respeito ao período pós-parto, o período estimado para que
as concentrações plasmáticas de PAG se tornem inferiores ao limite
151
mínimo de detecção do sistema RIA-PI (< 0,2 ng/ml) foi de
aproximadamente 14 semanas. Este período foi comparável aos períodos
estimados por ZOLI et al. (1992a) e por MIALON et al. (1993) em raças
taurinas (11 a 17 semanas), sendo entretanto, bastante superior ao tempo
estimado por KIRAKOFE et al. (1993) em raças taurinas de corte
histerectomizadas (10 semanas) ou não (12 semanas).
O tempo relativamente longo necessário para que sejam alcançados
níveis indetectáveis de PAG parece ser devido principalmente à longa
meia-vida desta glicoproteína. A meia vida da PAG calculada no presente
trabalho (9,2 a 10,1 dias) foi maior do que a previamente descrita em
taurinos (7,0 a 8,8 dias) (SASSER et al., 1986; SEMAMBO et al., 1992;
ALI et al., 1997). Uma vez que a meia-vida das glicoproteínas é
diretamente influenciada pela presença de cadeias laterais de carboidratos e
de ácido siálico (RAFFERTY et al., 1995), pode-se supor que um padrão
diferente de glicosilação poderia estar envolvido com as diferenças de
meia-vida observadas.
Durante o presente estudo, uma vaca zebu Azawak apresentou um
baixo escore de condição corporal (BCS 1 a 2) associado a altas
concentrações de PAG durante o final da gestação. Esta vaca foi fecundada
no início da estação de chuvas (Julho), parindo no final da estação seca
(Abril), momento no qual a vegetação da savana apresentava-se escassa e
de má qualidade. A associação entre uma grave carência protéica e/ou
energética e a massa placentária total já foram descritas tanto na espécie
humana (LUMEY, 1998) quanto na espécie ovina (WALLACE et al.,
1997b). Uma associação entre altos níveis energéticos na dieta, redução da
massa placentária e baixas concentrações de PSPB durante a gestação foi
152
recentemente descrita por WALLACE et al. (1997a) na espécie ovina. Estes
achados parecem indicar conjuntamente que, em alguns casos, um consumo
insuficiente de alimentos poderia estar associado com um aumento
compensatório da massa placentária com o objetivo de que seja assegurado
suporte nutricional necessário ao desenvolvimento do feto. Um outro fator
que poderia contribuir para as altas concentrações de PAG observadas ao
final da gestação da vaca ZSand seria uma reduzida taxa de clearance desta
proteína na circulação materna. Entretanto, devido ao fato de que a meia-vida
da PAG foi menor neste animal (9,2 dias) do que nos demais (10,1 dias), esta
explicação parece improvável.
153
6. CONCLUSÃO
− Diferentes formas de PAG, com massas moleculares variando de 51 a
69 kDa e pontos isoelétricos variando de 3,1 a 6,7 podem ser
identificadas na placenta de zebuínos pelo uso de técnicas como
cromatografia de troca de íons ou cromatografia de afinidade,
associadas ao uso das técnicas de eletroforese monodimensional (1-D
SDS PAGE), eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE) e de
Western Blot.
− O microsequenciamento da extremidade N-terminal de diversas
proteínas identificadas na placenta de zebuínos (10 a 25 aminoácidos)
revelou a existência de uma única seqüência de PAG, a qual é idêntica à
seqüência previamente descrita no taxa Bos taurus.
− Além da PAG, outras proteínas imunoreativas à PAG podem ser
identificadas na placenta de zebuínos. Dentre estas, podem ser citadas
alfa-N-acetilgalactosaminidases e metaloproteinases alcalinas.
− As concentrações plasmáticas de PAG em gado zebu aumentam
lentamente até a 39a semana de gestação, permanecendo inferiores a 250
ng/ml. Uma semana antes do parto, elas aumentam significativamente,
ultrapassando 1.000 ng/ml.
154
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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199
ANEXOS
200
ANEXO A – Dosagem da PAG por radioimunoensaio (RIA)
1. Reagentes
- Tubos de poliestireno de dimensões 13 x 70 mm;
- Reagentes de qualidade analítica.
1.1. Tampão utilizado
1.1.1. Tampão Tris (solução estoque)
3,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano, C4H11NO3 (Merck)
2,0 g de Cloreto de magnésio, MgCl2 (Merck)
0,1 g de Nitrato de sódio, NaN3 (Vel)
- Todos os reagentes são misturados em 800 ml de H2O deionizada.
- Após dissolução completa dos reagentes, o pH da solução é ajustado à
7,5 com o uso de HCl 1,0 N (Merck).
- Uma vez ajustado o pH, o volume da solução é completado a 1.000 ml,
e a solução pode ser armazenada a 4°C.
1.1.2. Tampão Tris-BSA (solução pronta para uso)
- Antes de iniciar-se uma dosagem radioimunológica, é adicionada 1 g de
BSA (ICN Biochemicals) por litro de solução estoque de Tris, sendo
este tampão conservado a 4°C.
1.2. Antígeno frio ou não marcado (Ag°)
- A PAG purificada e liofilizada é dissolvida em tampão fosfato 0,5 M
(pH 7,5) na proporção de 10 µg/100 ml, sendo feitas alíquotas de 1
201
ml/tubo. Essa solução estoque contitui-se no primeiro ponto de diluição
da curva padrão no sistema de dosagem sem pré-incubação (SPI), ou
seja, corresponde ao ponto 100 ng/ml. A partir deste ponto, são feitas
diluições na proporção de 500 µl da diluição precedente + 500 µl de
tampão, da maneira a obter-se os seguintes pontos de diluição:
Sistema radioimunológico
Sem pré-incubação (SPI)
Com pré-incubação (PI)
Diluição 1 →
100 ng/ml
Diluição 1 →
25 ng/ml
Diluição 2 →
50 ng/ml
Diluição 2 →
12,5 ng/ml
Diluição 3 →
25 ng/ml
Diluição 3 →
6,25 ng/ml
Diluição 4 →
12,5 ng/ml
Diluição 4 →
3,13 ng/ml
Diluição 5 →
6,25 ng/ml
Diluição 5 →
1,56 ng/ml
Diluição 6 →
3,13 ng/ml
Diluição 6 →
0,78 ng/ml
Diluição 7 →
1,56 ng/ml
Diluição 7 →
0,39 ng/ml
Diluição 8 →
0,78 ng/ml
Diluição 8 →
0,20 ng/ml
1.3. Antígeno quente ou marcado (Ag* ou 125I-PAG)
- A PAG utilizada no presente trabalho foi marcada pela técnica da
Cloramina T (GREENWOOD et al., 1963). Resumidamente, em um tubo
de poliestireno (8 x 40 mm) contendo 10 µg de PAG liofilizada diluída
em 10 µg de tampão fosfato 0,5 M (pH 7,5), são adicionados 10 µl de 125INa (correspondente a 1 mCu; Pharmacia) e 10 µl de uma solução de
Cloramina T (Sigma) diluída a 1 mg/ml em H2O destilada. O tubo é
agitado durante 50 a 60 segundos, sendo adicionados logo em seguida
10 µl de uma solução de 30 mg/ml de metabisulfito de sódio (Sigma)
202
diluído em de H2O destilada.
- Após uma última agitação, a solução é depositada sobre uma coluna de
Sephadex G-75 (1 x 35 cm; Pharmacia) previamente equilibrada com
tampão Tris-HCl contendo 1 % de BSA. A coluna é lavada com 30 ml
do mesmo tampão, sendo coletadas frações de 1 ml cada.
- Para a escolha da fração radioativa a ser utilizada, 50 µl de cada fração
são diluidos em 950 µl de tampão de dosagens, sendo mensurada a
radioatividade de 50 µl de cada diluição.
- A fração radioativa apresentando a maior percentagem de B0/T
associada à menor radioatividade não específica (NSB) é diluída de
formas a obter-se entre 28.000 e 30.000 cpm/100 µl de Ag*.
1.4. Soro sem PAG
- O soro sem PAG (serum free ou SF) é obtido de novilhas impúberes,
por meio de punção da veia jugular. Uma vez coletado, o soro é deixado
em repouso por aproximadamente 12 horas, sendo em seguida separado
do
coágulo
sanguíneo,
centrifugado
e
testado
em
RIA.
Se
comprovadamente negativo em duas dosagens consecutivas de PAG, o
soro é alíquotado a 2,5 ml/tubo, sendo congelado e armazenado como
solução estoque.
1.5. Primeiro anticorpo
- Para a produção do primeiro anticorpo, utiliza-se o protocolo de
VAITUKAITIS et al. (1971) com algumas modificações.
- As frações liofilizadas de PAG são inicialmente diluídas em tampão
fosfato na proporção de 250 µg de proteína diluída para cada 500 µl de
203
tampão. Aproximadamente 500 µl de adjuvante completo de Freund
(GibCo BRL; Grand Island, NY, USA) são utilizados na primeira
imunização, sendo o mesmo substituído pelo adjuvante incompleto de
Freund (GibCo) a partir da segunda imunização.
- Ao total, são feitas 8 imunizações a intervalos de duas semanas. A
coleta de sangue é feita a intervalos regulares de 10 dias, sendo a
primeira coleta feita 30 dias após a primeira imunização.
- O soro sanguíneo (anti-soro) é obtido após a retração do coágulo
sanguíneo (por aproximadamente 12 horas), sendo centrifugado,
identificado e aliquotado na proporção de 1 ml/tubo.
- O nível de anticorpos de cada coleta é então mensurado por meio de
diluições seriadas do anti-soro, como mostrado a seguir:
100 µl de soro puro + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA
100 µl de soro diluído a 1/10 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA
100 µl de soro diluído a 1/100 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA
100 µl de soro diluído a 1/1.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA
100 µl de soro diluído a 1/10.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA
100 µl de soro diluído a 1/100.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA
100 µl de soro diluído a 1/1.000.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA
- A diluição ideal é considerada como aquela na qual são obtidos 30 % de
ligação entre o antígeno marcado e o anticorpo.
1.6. Segundo anticorpo
- Imunoglobulinas anti-IgG de coelhos, produzidas em ovinos são utilizadas
para precipitar o primeiro anti-soro, constituindo-se no segundo anti-soro.
O sistema de precipitação pelo uso do segundo anti-soro é composto por
204
uma mistura de imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho (0,83 %
volume/volume), de soro normal de coelho (0,17 % volume/volume), de
polietileno glicol 6000 (20 mg/ml; Vel), de celulose microcristalina (0,05
mg/ml; Merck) e de BSA (2 mg/ml; ICN Biochemicals) diluídos em
tampão Tris-HCl, pH 7.5.
2. Metodologia
- Todos os tubos são dosados em duplicata.
- As incubações são feitas à temperatura ambiente (20°C).
2.1. Sistema sem pré-incubação
- No primeiro dia da dosagem RIA-SPI, são adicionados 100 µl de
tampão Tris-BSA a todos os tubos da curva padrão ou aos tubos
correspondentes às amostras a serem dosadas, assim como 200 µl de
tampão ao tubo ‘zero PAG’ (B0) e 300 µl ao tubo NSB (atividade nãoespecífica).
- Em seguida, são adicionados 100 µl de cada ponto de diluição da curva
padrão e 100 µl de amostra a ser dosada. No caso de dosagens de
amostras sanguíneas, são adicionados 100 µl de soro testado sem PAG
(SF) a todos os pontos de diluição da curva padrão. No caso de
dosagens de amostras resultantes de protocolos de purificação, esses
100 µl são substituídos por 100 µl de tampão.
- Em seguida, são adicionados a todos os tubos 100 µl de Ag* contendo
28.000 a 30.000 cpm.
- Por fim, são adicionados 100 µl de anti-soro diluídos de forma a obterse 25 a 30 % de ligação entre o Ag* e o anti-soro (B0/T).
205
- Uma vez adicionados todos os reagentes (conferir tabela abaixo), os
tubos são agitados no vortex e deixados em repouso durante
aproximadamente 16 horas.
Tubos
Atividade Atividade não- Amostra Ponto de diluição Amostra a
total (Tc) específica
padrão sem da curva padrão ser dosada
(STD)
(UKN)
(NSB)
Ag° (B0)
300 µl
200 µl
100 µl
100 µl
Reagentes
Tampão
Ag°
-
-
-
100 µl
100 µl
Soro sem PAG
-
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Anti-soro
-
-
100 µl
100 µl
100 µl
(b)
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
(a)
Ag*
Total
100 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
Substituído por 100 µl de tampão no caso de dosagens ao longo dos protocolos de
purificação de proteínas.
(b)
Adicionado no segundo dia no caso de dosagens com pré-incubação
(a)
- No dia seguinte, são adicionados a todos os tubos (exceto Tc) 1 ml do
sistema de precipitação contendo o segundo anticorpo. Após uma
incubação adicional de 30 minutos, são adicionados 2 ml de tampão
Tris-BSA por tubo, sendo as frações de Ag° e Ag* separadas por meio
de centrifugação a 1.500 g durante 20 minutos. O sobrenadante é então
aspirado, e uma segunda lavagem e centrifugação são feitas. Após a
aspiração do segundo sobrenadante, é feita a contagem da
radioatividade do precipitado por meio de um contador de
radioatividade gama (Multigamma Counter LKB Wallac 1261; Turku,
Finlândia).
206
2.2. Sistema com pré-incubação
- No primeiro dia da dosagem RIA-PI, com exceção do Ag*, são
adicionados todos os reagentes previamente detalhados no sistema SPI.
- No segundo dia, após aproximadamente 16 horas de pré-incubação, são
adicionados 100 µl de Ag* a todos os tubos. Uma segunda incubação
com duração mínima de 4 horas é então realizada antes da adição de 1
ml do sistema de precipitação contendo o segundo anticorpo. O restante
do procedimento é similar ao descrito previamente para o sistema sem
pré-incubação.
207
ANEXO B - Método LOWRY para a dosagem de proteínas
1. Reagentes
- Solução A: Solução de 0,1 N de NaOH contendo 2 % de Na2CO3
(Merck).
- Solução B: Solução de Tartrato de Sódio (Merck) a 1 %.
- Solução C: Adicionar 50 mg de Sulfato de Cobre (CuSO4; Sigma) à
10 ml da Solução B. Preparar imediatamente antes do uso.
- Solução D: Solução final para a dosagem de proteínas: 50 ml da
Solução A + 1 ml da solução B.
- Reagente de Folin-Ciocalteu (Merck).
- Solução padrão de 1 mg de BSA/ml de H2O destilada.
2. Metodologia
A estimativa da concentração de proteínas presentes nas frações
obtidas ao longo do processo de purificação da PAG foi feita pelo método
de LOWRY et al. (1951).
- Curva padrão: preparar em duplicata as seguintes diluições:
1/1 = 1000 µg de BSA/ml
1/2 = 500 µg de BSA/ml
1/4 = 250 µg de BSA/ml
1/8 = 125 µg de BSA/ml
- B0: preparar em quadruplicata os tubos considerados como ‘zero BSA’
da curva padrão.
- Amostras:
diluir as amostras a serem dosadas de acordo com a
quantidade estimada de proteína (ex.: 1/1, 1/2, 1/4, 1/8,
1/16, 1/32).
208
- Adicionar em cada tubo:
-
200 µl de cada diluição da curva padrão ou da amostra a ser dosada.
-
Nos pontos zero da curva padrão (pontos B0) devem ser adicionados
200 µl de H2O destilada ou do tampão nos quais as amostras
encontram-se diluídas.
- 200 µl de H2O destilada.
- 2 ml da solução D.
- Agitar no vortex e deixar incubar durante 10 minutos.
- Adicionar 200 µl de Folin.
- Vortexar e deixar incubar a abrigo da luz durante 30 minutos.
- Ler em cuvetas de vidro a 550 nm de densidade óptica ou em cuvetas de
quartz a 260 ou 280 nm de densidade óptica.
209
ANEXO C - Eletroforese monodimendional em gel de poliacrilamida
em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D PAGE
SDS)
1. Reagentes
1.1. Preparação das soluções estoque
- Tampão Tris 0,5 M (pH 6,8) (Conservar a 4°C)
6,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano (Pharmacia)
60,0 ml de H2O destilada
Ajustar a pH 6,8 com HCl (Merck) e após ajustar o volume a 100 ml
com H2O destilada.
- Tampão Tris 1,5 M (pH 8,8) (Conservar a 4°C)
27,23 g de Tris
80 ml de H2O destilada
Ajustar a pH 8,8 com HCl e após ajustar o volume a 150 ml com H2O
destilada.
- Solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Merck) (Conservar a T°
ambiente.)
20,0 g de SDS (Merck)
200,0 ml de H2O destilada.
- Solução de acrilamida (30 %T, 2.67 % C) (Conservar a 4°C)
29,2 g de acrilamida (Pharmacia)
0,8 g de Metileno-bisacrilamida (Pharmacia)
Ajustar a 100 ml com H2O destilada.
210
- Solução azul de bromofenol a 0,8 % (Conservar a T° ambiente)
32,0 mg de azul de bromofenol (Bromophenol blue; Sigma)
4,0 ml de H2O destilada
- Solução de Laemmli (Conservar a –20°C)
1,0 ml de tampão Tris 0,5 M (pH 6,8)
0,8 ml de glicerol
2,0 ml de solução de SDS a 10 %
0,4 ml de mercaptoetanol (Sigma)*
0,4 ml de azul de bromofenol a 0,8 %
3,4 ml de H2O destilada
*Substituir por 0,4 ml de H2O destilada quando não for necessária a ação
do agente redutor mercaptoetanol.
- Tampão de eletroforese (10 vezes concentrado) (Conservar a 4°C)
60,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano
288,0 g de glicina
20,0 g de SDS
1.000 ml de H2O destilada
Agitar e ajustar a 2.000 ml com H2O destilada.
Antes do uso, diluir 200 ml de tampão em 1.800 ml de H2O destilada.
- Solução descolorante para azul de Coomassie (T° ambiente)
100,0 ml de ácido acético
400,0 ml de metanol
500,0 ml de H2O destilada
211
- Colorante azul de Coomasie (Conservar a T° ambiente)
250,0 ml de metanol (Merck)
1,0 g de Azul de Coomassie (Merck)
39,0 ml de ácido acético (Merck)
500,0 ml de H2O destilada
1.2. Preparação dos géis
- Gel de agarose
500,0 mg de agarose (Bio-Rad)
50,0 ml de H2O deionizada
- Gel de separação a 12 %
Reagente
H2O destilada
Tampão Tris 1,5 M (pH 8,8)
Solução de SDS a 10 %
Acrilamida (30 % T, 2.67 % C)
Persulfato* a 12,5 %
Temed
Volume total
Quantidade/volume
16,75 ml
12,5 ml
500 µl
20 ml
250 µl
25 µl
50 ml
Preparar imediatamente antes do uso. *Produto Pharmacia
- Gel de compressão
Reagente
H2O destilada
Tampão Tris 0,5 M (pH 6,8)
Solução de SDS a 10 %
Acrilamida (30 % T, 2.67 % C)
Persulfato 12,5 %
Temed
Volume total
Quantidade/volume
6,1 ml
2,5 ml
100 µl
1,3 ml
100 µl
20 µl
10 ml
Preparar imediatamente antes do uso.
212
2. Metodologia
- Os dois primeiros géis (gel de agarose e gel de separação) são
preparados no mesmo dia sendo versados entre as duas paredes da cuva
em um sistema de eletroforese vertical.
- No segundo dia, após a polimerização do terceiro gel (gel de
compressão), as pistas a serem utilizadas são identificadas, sendo
adicionado logo em seguida o tampão de eletroforese.
- Em cada pista, são depositados 6 µl de proteínas de calibração ou 20 a
30 µl de proteínas a serem analisadas, segundo protocolo préestabelecido.
- Uma vez conectadas ao sistema de resfriamento, as cuvas são
inicialmente submetidas a uma amperagem de 20 mA (migração no gel
de compressão) e em seguida a uma amperagem de 40 mA (migração do
gel de separação).
- Após o final da migração, o gel poder ser corado pelo Azul de
Coomassie (mínimo de 1 hora) e descolorado (mínimo de 4 horas), para
a visualização de proteínas, ou utilizado para a realização da técnica de
Western Blot, a qual permite a visualização de proteínas imuno-reativas
pelo uso de diferentes anti-soros.
213
ANEXO D – Técnica de Western Blot
1. Reagentes
1.1. Soluções estoque
- TBS a 0 % de BSA (Conservar a 4°C)
12,1 g de Tris (hidroximetil)-aminometano
45,0 g de NaCl
Ajustar a 5.000 ml com H2O destilada
- Ajustar o pH a 7,6 com o uso de HCl antes da adição do NaCl.
- Conservar a 4°C.
- TBS contendo 1 % de BSA (solução de lavagem)
Adicionar 10,0 g de BSA por litro de TBS a 0 % BSA (conservar a
4°C).
- TBS contendo 3 % de BSA (solução de saturação)
Adicionar 30,0 g de BSA por litro de TBS a 0 % BSA (conservar a
4°C).
- Tampão anodo (Conservar a 4°C)
3,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano
14,0 g de glicina
500,0 ml de H2O destilada
Agitar e ajustar a 900 ml com H2O destilada.
100,0 ml de metanol
214
- Tampão catodo (Conservar a 4°C)
3,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano
14,0 g de glicina
1,0 g de SDS
Agitar e ajustar a 1.000 ml com H2O destilada.
- Preparação do primeiro anti-soro
200 µl de anti-soro puro
15,0 ml de TBS contendo 1 % de BSA
4,8 ml de soro normal sem PAG (SF)
- Preparação do segundo anti-soro
50 µl de imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho acoplada à
peroxidase (POD-HR; Merck)
100 ml de TBS contendo 1 % de BSA
- Solução corante Rouge Ponceau
0,2 g de Rouge Ponceau S (Sigma)
10 ml de ácido acético
190 ml de H2O2 destilada
- Soluções de revelação (a serem preparadas imediatamente antes do uso)
Solution A (Mantida a 4°C)
100 ml de TBS a 0 % BSA
100 µl de H2O2 (Sigma)
215
Solution B (Mantida a 4°C)
20 ml de Metanol
60 mg de Cloronaftol
2. Metodologia
2.1. Transferência das proteínas sobre membrana de nitrocelulose
- Cerca de 15 folhas de papel eletrodo Novablot (Pharmacia) são
embebidas em tampão catodo durante um mínimo de 30 minutos.
- Cerca de 15 folhas de papel eletrodo Novablot (Pharmacia), assim como
uma membrana de nitrocelulose, são embebidas em tampão anodo
durante um mínimo de 30 minutos.
- Após o final da migração da 1-D SDS-PAGE (conferir Anexo C), os
papeis eletrodo, assim como a membrana de celulose e o gel, são
colocados delicadamente entre as duas placas do aparelho de
transferência Multiphor II (Pharmacia), conforme indicado na figura a
seguir:
Eletrodo (-)
Papéis eletrodo embebidos em tampão catodo
Gel
Membrana de nitrocelulose
Papéis eletrodo embebidos em tampão anodo
Eletrodo (+)
- A transferência das proteínas sobre a membrana de nitrocelulose é feita
pela aplicação de uma tensão elétrica de 24 volts durante 1 hora seguida
de 36 volts durante 16 horas.
- Após o final da transferência, a membrana é corada durante 10 minutos
com a solução de Rouge Ponceau S. As bandas correspondentes à cada
216
proteína são marcadas com o auxílio de um objeto perfurante.
2.2. Revelação das protéinas imunoreativas
- A membrana de nitrocelulose é inicialmente incubada (sob agitação) em
uma solução de TBS contendo 3 % de BSA (a 37°C).
- Em seguida, é feita uma incubação durante 3 horas em 20 ml de antisoro saturado (a 37°C, sob agitação).
- A membrana de nitrocelulose é lavada por 3 banhos de TBS contendo 1
% de BSA (10 minutos cada, a 37°C).
- Uma segunda incubação de 2 horas é feita com o segundo anti-soro
(imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho acoplada à peroxidase) (a
37°C, sob agitação).
- Finalmente, 4 lavagens (10 minutos, a 20°C) são feitas com TBS sem
BSA.
- A proteínas imuno-reativas contidas na membrana são reveladas pelo
uso das Soluções A e B, as quais são misturadas imediatamente antes da
revelação.
217
ANEXO E – Isofocalização e eletroforese bidimendional (2-D PAGESDS)
1. Soluções estoque
- Tampão de reidratação dos strips contendo o gel de isofocalização
9,9 g de uréia (Pharmacia)
3,8 g de tio-uréia (Pharmacia)
125 µl de triton X 100 (Pharmacia)
500 µl de tampão IPG 3-10 (Bio-Rad)
20 ml de H2O destilada
Alguns grânulos de bromofenol
- Agitar e ajustar a 25 ml com H2O destilada
- Adicionar 2,8 mg de DTT/ml de solução imediatamente antes do uso.
- Assim como o DTT, as amostras de proteína devem ser adicionadas
imediatamente antes do uso. Para um strip de 11 cm com uma gama de
pH variando de 3 a 10 é recomendado um volume final (amostra +
tampão de reidratação) de 200 µl.
- Conservar a –20°C.
- Tampão de lavagem dos strips após a isofocalização:
26,8 ml de tampão Tris 1,5 M (pH 8,8)
288,3 g de uréia
276,0 ml de glicerol (Merck)
16,0 g de SDS
Alguns grânulos de bromofenol
600 ml de H2O destilada
218
- Agitar e ajustar a 800 ml com H2O destilada
- Adicionar 100,0 mg de DTT/10 ml de solução imediatamente antes do
uso.
- Conservar a –20°C.
- Solução de seladora de agarose
450 ml de H2O destilada
50 ml de tampão de eletroforese (10 x concentrado)
2,5 g de agarose
Alguns grânulos de bromofenol
- Esquentar sob agitação após a adição de todos os ingredientes e estocar
em alíquotas de 30 ml.
- Conservar a T° ambiente.
- Corante para PVDF (Conservar a T° ambiente)
2 g de Azul de Coomassie
100 ml de Metanol
100 ml de H2O destilada
Alguns grânulos de DTT
- Solução descolorante para PVDF (Conservar a T° ambiente)
600 ml de Metanol
400 ml de H2O destilada
Alguns grânulos de DTT
2. Metodologia
- A primeira dimensão é feita em Immobiline Drystrips de 11 cm com pH
219
variando de 3 a 10 (Pharmacia) ou de 3 a 6 (Bio-Rad), sendo seguida
por uma SDS-PAGE a 12 %, conforme descrito no Anexo C.
- A hidratação dos strips é feita durante 16 horas em um Immobiline
DryStrip Reswelling Tray (Pharmacia), sendo a mesma seguida pela
eletro-focalisação das proteínas.
- A eletro-focalisação (separação das proteínas de acordo com o ponto
isoelétrico) é feita pela aplicação de uma corrente de 300 V por 30
minutos, de 1.000 V por 30 minutos, de 1.550 V por 16 horas e de 1.850
V por 1 hora em um aparelho Flat Bed (FBE-3000, Pharmacia).
- A fim de evitar-se a oxidação das proteínas transferidas, são adicionadas
pequenas quantidades de DTT em todos os tampões.
- Após a eletro-focalização, aplica-se o strip sobre o gel de separação de
uma eletroforese monodimensional clássica, obtendo-se desta forma a
separação das proteínas de acordo com sua massa molecular.
- A preparação dos papéis eletrodo para a transferência das proteínas
sobre a membrana de 0,2 µm de polivinilideno difluoridro (PVDF; BioRad, Richmond, CA) é semelhante à preparação descrita na técnica de
Western blot (Anexo C). Entretanto, devido à natureza hidrófoba da
membrana PVDF, faz-se necessária a utilização de um banho de
metanol antes que a mesma seja embebida no tampão anodo. A
disposição dos papéis eletrodo, do gel e da membrana são mostradas a
seguir:
220
Eletrodo (-)
Papéis eletrodo embebidos em tampão catodo + DTT
Gel
Membrana de PVDF
Papéis eletrodo embebidos em tampão anodo + DTT
Eletrodo (+)
- A transferência das proteínas sobre a membrana de PVDF é feita pela
aplicação de uma tensão elétrica de 12 volts durante 45 minutos seguida
de 36 volts durante igualmente 45 minutos.
- Após o final da migração, a membrana é lavada 3 vezes em H2O
destilada contendo DTT, corada durante 15 minutos com a solução
corante para PVDF, descolorada durante 30 minutos, e finalmente
lavada 2 vezes com H2O destilada sem DTT.
Por fim, cada membrana é secada pelo uso de gás nitrogênio sendo
identificada e enviada ao microsequenciamento de proteínas.
221
Apêndice 1
SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. (2001) Placental
Proteins of Ruminants: biochemical, physiological and zootechnical aspects.
In: Renaville, R. e Burny, A. (eds.), Biotechnology in Animal Husbandry, Ed.
Kluwer Academic Publishers, Hardbound, Netherlands, pp. 179-208.
222
Placental Proteins in Ruminants.
Biochemical, physiological and zootechnical aspects
SOUSA, N.M1., FIGUEIREDO, J.R.1 & BECKERS, J.-F.2
1
Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Brazil
2
Physiology of Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of
Liège, Belgium
Abstract
During the last decade, investigations were carried out by several
research groups in order to characterize proteins or glycoproteins
synthesized in the ruminant placenta. Recently, as results of this research, a
large
family
of
pregnancy-associated
glycoproteins
(PAGs)
was
discovered. Using molecular biology techniques, they were found to be
members of the superfamily of the aspartic proteinases which also contains
pepsinogen, chymosin, renin, beta-secretase, cathepsin D and E etc.
Synthesized in the mono and/or binucleate cells of the trophoblast, some
forms of PAG seem lacking of proteinase activity. It is likely they are
synthesized together with molecules involved in the tissue remodeling of
the placenta. Their release in large quantities into the maternal blood
circulation results in measurable plasma concentrations.
Thanks to international collaborative studies, we have shown that
PAG levels are a good indicator of feto-placental weel-being and that sharp
223
decreases in PAG levels occur just before pregnancy failure in cows and in
goats. In some countries, the PAG assay is available for Doctors in
Veterinary Medicine in the regional laboratories responsible for animal
health including immunodiagnosis for brucellosis, IBR, BVD, CAEV,
VISNA-MEDI etc.
1. Introduction
Placenta is a polyvalent organic system with a vital biological role for
the perpetuation of the eutherian mammals. Fetal development is related to
that of the placenta from the anatomical, genetic and metabolic points of
view. As far as metabolism is concerned, endocrine function is particularly
important. The endocrine function of the mammalian placenta includes
various hormones: progesterone, oestrogens, chorionic gonadotropins,
placental lactogens, also designed “chorionic somatomammotropins”,
prolactins, growth hormones and a series of growth factors, proteins and
glycoproteins interfering with the establishment of pregnancy, corpus
luteum maintenance, immunotolerance of the conceptus by the mother,
intermediate maternal metabolism, fetal growth and mammary growth.
The study of the endocrine function of the ruminant placenta will be
discussed below. Emphasis will be given to pregnancy-associated (specific)
proteins, but information related to other polypeptide hormones will be
freely utilized in order to develop our comparative understanding of the
structure, function and release in maternal circulation of the placental
proteins.
224
2. The Placenta
The placenta plays an essential role in both establishment and
maintenance of pregnancy as well as in fetal development, working as a
respiratory, nutritional, epurative, endocrine and immunological organ. The
placenta is not only barrier, as it was thought before, but it has a real active
and selective exchanger role which is developed in harmony with other
systems.
The topography and structure of the placenta vary according to the
species and depend on the behavior of the egg which, at the time of its
attachment, either remains in the uterine lumen or implants interstially in
the uterine mucosa.
Various classifications have been proposed though the most widely
used, despite some imperfections, is the classification based on the
histological structure, or, more precisely, the number of histological layers
separating the maternal and fetal blood. Four types of placenta may be
distinguished histologically: the epitheliochorial placenta (Equidae,
Suidae), the synepitheliochorial placenta (ruminants), the endotheliochorial
placenta (carnivores) and the haemochorial placenta (human, primates and
rodents).
The uterine connective tissue is modified in both endothelial and
haemochorial placentas and tearing of the uterine tissues accompanied by
bleeding occurs during parturition. The uterine regions shed in this way are
said to be deciduous and the species with these types of placenta are called
deciduates.
The mature ruminant placenta is neither entirely syndesmochorial with
225
no uterine epithelium, nor epitheliochorial with two apposed cell layers
whose the only anatomical interaction observed is the presence of
interdigitated microvilli. The uterine epithelium persists but is modified to
a variable degree into a hybrid fetomaternal syncytium formed by the
migration and fusion of the fetal chorionic binucleate cells with those of the
uterine epithelium (WOODING, 1992).
2.1. Binucleate cells
The most characteristic element of the ruminant placenta is the
presence of binucleate cells or diplokaryocytes in the trophectoderm
(WIMSATT, 1951). First described by ASSHETON in 1906, these cells
have been the subject of numerous investigations over the last 5 decades
(DRIEUX and THIERY, 1951; AMOROSO, 1952; WOODING and
WATHES, 1980; KLISCH et al., 1999).
Binucleate cells derive from chorionic mononucleate cells by
karyokinesis without subsequent cytokinesis. The youngest cells are
located deep in the trophectoderm and maturation takes place progressively
as they rise to the maternal surface (WOODING, 1983).
Young binucleate cells have a small volume of dense ribosome-filled
cytoplasm, which, after cytoplasmic re-organization to a spherical or oval
cell, has no contact with either the basement membrane or the atypical
trophectodermal tight junction. As the binucleate cells increase in size it
develops an extensive array of rough endoplasmic reticulum and a large
Golgi body. The latter produces a considerable number of characteristic
granules that contain numerous protein and glycoprotein constituents
226
(WOODING, 1992).
The first binucleate cells appear just before implantation (WANGO et
al., 1990a). They can be recognized from day 14 after fertilization in the
ovine trophectoderm (WOODING, 1984) and from day 16-17 in the
bovine.
The binucleate cells represent 15-20% of the total population within
the mature placenta (WOODING, 1983; WANGO et al., 1990b). Of these,
about one in seven are migrating towards the uterine epithelium at any time
of gestation (WOODING et al., 1986). The migration of binucleate cells
plays an important role in the remodeling of placental structure and leads to
a reaction with the uterine cells: the formation of a hybrid fetomaternal
tissue in the ewe and goat (the syncytium plaques) and the maternal giant
cells in the cow (the trinucleate cells) (WOODING, 1984; WOODING and
BECKERS, 1987).
Trinucleate cells are short-lived structures, which, after exocitosis, are
resorbed by the trophectoderm (WOODING and WATHES, 1980).
Contrary to the ewe, in which binucleate cell migration is essential to
support the enormous growth in area of the fetomaternal interface layer as
the placentome develops (WOODING et al., 1981), in cow placentomes the
binucleate cell migration has no barrier or structural role (WOODING and
WATHES, 1980).
Special cells of the ruminant placenta were suspected as responsible
for an important endocrine function during gestation as early as 1940. In
this decade, it was observed for the fist time a reduction in the pituitary
gonadotropic activity in the pregnant cow and suggested that the corpus
227
luteum was replaced by additional luteotropic substances produced
elsewhere.
Using
microsections
of
cotyledons
and
staining
for
carbohydrates like periodic acid-Schiff (PAS), WEETH and HERMAN
(1952) and BJÖRKMAN (1954) described the presence of numerous
trophoblastic cells containing glycoproteins. About 10 years later, FOOTE
and KAUSHIK (1963) demonstrated the presence of a LH-like activity in
the cotyledons. They used the bioassay of PARLOW (1961) in order to
identify this LH-like activity. These studies were pioneers in this field: they
opened the way for further identification and characterization of placental
hormones and proteins in the ruminant species.
Binucleate cells are directly involved in the production of
progesterone (WANGO et al., 1991; WANGO et al., 1992; WOODING et
al., 1996), prostaglandins (REIMERS et al., 1985b), placental lactogen
hormones (VERSTEGEN et al., 1985; WOODING et al., 1992) and
pregnancy-associated (specific) glycoproteins (REIMERS et al., 1985a;
GOGOLIN-EWENS et al., 1986; MORGAN et al., 1989; ZOLI et al.,
1992a; ATKINSON et al., 1993). These secretory products are stored in
dense granules which occupy more than 50% of the cytoplasm (LEE et al.,
1986) and deliver their content directly in the maternal system after
binucleate cell migration (WOODING, 1984).
3. Placental Proteins
Proteins secreted by the placenta, when detected in the peripheral
circulation of the mother, can be useful indicators of both pregnancy and
feto-trophoblast well-being. Despite many attempts to investigate the
228
physiological functions of the placental proteins, the exact biofunction of
most of them (e.g. pregnancy-associated glycoprotein) are still not known.
In ruminant species, interferon tau allows the maintenance of the
corpus luteum aging as an antiluteolytic factor (MARTAL et al., 1979). In
primates this role in corpus luteum maintenance is played by the chorionic
gonadotropin
(ASCHHEIM, 1927). This glycoprotein
acts as a
luteotropine-like hormone having also an important role in progesterone
synthesis stimulation. The interferon tau, in addition to its antiluteolytic
function also has an important role in the first steps of immunotolerance of
the conceptus by the mother (FILLION et al., 1991; MARTAL et al.,
1997).
Later in pregnancy placenta produces a placental lactogen hormone,
responsible for the stimulation of the mammogenic activity (FORSYTH,
1986). This hormone is also involved, at least partially, in the fetal growth
(CHENE et al., 1988) and in the long term changes of the maternal
metabolism (FREEMARK et al., 1992).
The main groups of polypeptide placental proteins and their relevant
aspects are discussed below.
3.1. Pregnancy-Associated Glycoproteins (PAGs)
Characterized in the last 20 years (BUTLER et al., 1982; BECKERS
et al., 1988a,b; ZOLI et al., 1991, XIE et al., 1991), the pregnancyassociated glycoproteins (PAGs) constitute a large family of glycoproteins
expressed
specifically
(chorion/trophectoderm)
in
of
the
the
outer
placenta
epithelial
of
cell
ungulate
layer
species
229
(GURUPRASAD et al., 1996; XIE et al., 1997b). They are members of the
aspartic proteinase gene family having greatest sequence identity with
pepsinogens (GREEN et al., 1998a).
By using biochemical procedures, some molecules of the PAG family
were isolated from cotyledons of cow (ZOLI et al., 1991), ewe (ZOLI et
al., 1995; XIE et al., 1997a) and goat (GARBAYO et al., 1998). These
molecules were used to immunize rabbits and the antisera obtained allowed
the development of homologous and heterologous radioimmunoassay
systems (ZOLI et al., 1992b; RANILLA et al., 1994; GONZÁLEZ et al.,
1999).
In veterinary practice, the measurement of the PAG concentrations in
maternal blood is useful for both pregnancy confirmation and follow-up of
the trophoblastic function. The first aspect can help breeders in the
management of reproduction, while the second concerns more specifically
clinicians and researchers in their investigation to establish differential
diagnosis of pathologies affecting pregnancy (ZARROUK et al., 1999a,b).
Screening of placental libraries with nucleic acid probes has identified
additional cDNA that are very abundant and code for polypeptides related
but structurally (amino acid sequence) distinct from PAGs isolated by
biochemical procedures. Some of these molecules have sequences of amino
acids that are consistent with their being potentially functional proteinases
(ROBERTS et al., 1995). It remains to be determined whether the PAGs
expressed in the ungulate placenta are catalytically active and, even if they
are, whether their physiological function is that of proteinases.
230
3.1.1. Historical Overview of PAGs and Related Proteins Isolated by
Biochemical Procedures
The PAGs, also known under a variety of other names including
pregnancy-specific protein B (BUTLER et al., 1982; LYNCH et al., 1992)
and pregnancy-specific protein 60 (MIALON et al., 1993), were first
described as placental antigens of cattle placenta that were also present in
the blood serum of the mother soon after implantation.
The methodology employed for bovine PAG purification by ZOLI et
al. (1991) was similar to that previously described by BUTLER et al.
(1982). Briefly, an antiserum was first generated against placental extracts
from which antibodies against common maternal antigens had been
removed (or neutralized) by immunoadsorption. This reagent was then used
to follow the immunoreactive fractions throughout the isolation procedure
(a series of extractions of soluble proteins, acid and ammonium sulfate
precipitations, gel filtration and ion exchange chromatographies).
The cleared antisera obtained by Sasser and coworkers (BUTLER et
al., 1982) allowed the partial purification of two antigens; pregnancyspecific protein A (PSP-A) and pregnancy-specific protein B (PSP-B).
PSP-A was identified as α-fetoprotein, which is not strictly limited to
pregnancy; PSP-B represented a novel antigen. Subsequent biochemical
analysis indicated that PSP-B probably represented a mixture of related
proteins since multiple molecular weight forms (47 000-90 000) and
isoeletric variants (pI 3.7-4.4) were reported (BUTLER et al., 1982).
Alternatively to the results obtained by BUTLER et al. (1982), the use
of antisera raised against specific antigens of fetal cotyledons by ZOLI et
231
al. (1991) resulted in the purification of one major placental protein: the
bovine pregnancy-associated glycoprotein 1 (boPAG-1).
3.1.1.1. The bovine PAG family: after the isolation of ZOLI et al. (1991)
and the first characterization of XIE et al. (1991), different PAG molecules
were identified justifying an arbitrary numbered nomenclature adopted till
now.
3.1.1.1.1. boPAG-1: The bovine PAG (bPAG) purified by ZOLI et al.
(1991), later designed boPAG-1 (XIE et al., 1994; XIE et al., 1995), was
shown to be an acidic glycoprotein with 67 000 molecular weight. Four
isoforms (I, II, II and IV) with different isoeletric points (4.4, 4.6, 5.2 and
5.4) were detected in this initial preparation. The pI were closely related to
the amount of sialic acid of each isoform (2.12%; 0.83%, 0.64% and
0.29%,
respectively).
Moreover,
pI,
sialic
acid
content
and
immunoreactivity were closely related, with the most basic form being the
most
immunoreactive
(ZOLI
et al., 1991). Immunocytochemical
investigations allowed the localization of boPAG-1 predominantly in the
cytoplasm of large binucleate cells present in the fetal cotyledonary tissue
(ZOLI et al., 1992a). The presence of antigens immunologically similar to
boPAG-1 has also been demonstrated in testicular and ovarian extracts
(ZOLI et al., 1990b,c), justifying the adjective “associated” and not
“specific” given to this glycoprotein.
The most surprising feature of boPAG-1, revealed by Roberts and
coworkers soon after its purification (XIE et al., 1991), was the fact that
this protein belongs to a family of proteolytic enzymes known as aspartic
232
proteinases, with more than 50% amino acid sequence identity to pepsin,
cathepsin D and cathepsin E.
The boPAG-1 has the bilobed structure typical of all known
eukaryotic aspartic proteinases and possesses a cleft between the two lobes
capable of accommodating peptides up to 7 amino acid long (XIE et al.,
1997b). However, despite its structural similarity with other active aspartic
proteinases, this molecule is considered as catalytically inactive because of
key mutations close to the active site (Table 1) (XIE et al., 1991).
Catalytic activity of aspartic proteinases is dependent upon two
conserved aspartic acid residues (Asp) that are in close contiguity in the
center of the substract-binding cleft, even if they are localized in opposite
lobes of the molecule. Each of these residues is preceded by a hydrophobic
amino acid (usually phenylalanine - Phe) and followed by invariant
threonine (Thr) and glycine (Gly) (DAVIES, 1990). A twofold symmetry,
with a second conserved region centering around each aspartic acid is also
required to polarize the bound water molecule which hydrolyses the scissile
bond of the substract (JAMES and SIELECKI, 1986).
As demonstrated by XIE et al. (1991), the apparent lack of proteolytic
activity of boPAG-1 is due to the presence of an alanin (Ala-76) in place of
a normally invariant glycine (Gly-76) residue in the Phe-Asp-Thr-Gly-SerSer sequence (N-terminal lobe). This mutation has as consequence a subtle
change in the placement of the catalytic water molecule from its normal
symmetric position (DAVIES, 1990), rendering this protein catalytically
inactive.
233
TABLE 1 -
Alignment at the active site residues found in a variety of aspartic
proteinases. The open boxes denote amino acid substitutions. Data for
aspartic proteinase sequences are obtained in the GenBank database.
Specie
Proteolytic
Activity ?
Pepsinogen A
Monkey
Yes
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser
Progastricsin
Human
Yes
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser
Pepsinogen F
Rabbit
Yes
Leu Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser
Chymosin
Bovine
Yes
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Leu Asp Thr Gly Thr Ser
Rat
Yes
Phe Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser
Cathepsin D
Human
Yes
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser
Cathepsin E
Human
Yes
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser
Beta-secretase
Human
Yes
Val Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Ser Gly Thr Thr
boPAG-1
Bovine
boPAG-2
Bovine
ovPAG-1
Ovine
Aspartic
Proteinase
Renin
NH2-terminus
COOH-terminus
Probably no Phe Asp Thr Ala Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser
Unknown
Phe Asp Thr Gly Ser Ala Leu Asp Thr Gly Thr Ser
Probably no Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Gly Thr Gly Thr Ser
poPAG-1
Porcine Probably no Phe Asp Thr Leu Ser Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala
poPAG-2
Porcine
Unknown
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser
eqPAG-1
Equine
Unknown
Phe Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser
➡ PAG and PSPB radioimmunoassays
In practice, antisera raised in rabbits against pregnancy-associated
(specific)
proteins
have
allowed
the
development
of
specific
radioimmunoassays for bovine PAG and PSP-B (SASSER et al., 1986;
HUMBLOT et al., 1988a,b; SASSER et al., 1989; ZOLI et al., 1992b).
Higher PAG concentrations are observed in maternal than in fetal serum,
suggesting that this glycoprotein is delivered preferentially in the maternal
234
system (ZOLI et al., 1992b).
PAG can be detected in maternal circulation at around the time when
the trophoblast forms definitive attachment to the uterine walls. In early
and mid gestation, concentrations increase slowly and gradually (Figure 1).
Around parturition concentrations increase rapidly to reach peak values of
1 to 5 µg/ml only few days before delivery (Figure 2) (ZOLI et al., 1992b;
PATEL et al., 1997). Concentrations decrease steadily in the postpartum
period reaching undetectable levels only by day 100 postpartum (ZOLI et
al., 1992b). Detectable levels of boPAG-1 have been also found in about
20% of unbred heifers and non-pregnant cows and 15% of bull sera (ZOLI
et al., 1992b). The relatively long time needed for boPAG-1 to be cleared
from maternal circulation can be explained by the very high concentrations
present in maternal blood at parturition and by a long half-life of this
glycoprotein, estimated to be 7.4 to 9 days (KIRACOFE et al., 1993; ALI
et al., 1997).
35
35
PAG (ng/ml)
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
55
00
3
4
5
6
77
88
99
10
10
11
11
12
12
Weeks
FIGURA 1 -
PAG profiles (mean ± S.E.M) during early pregnancy in heifers
embryo transferred with either single (-▼-▼-) or multiple (-▲-▲-)
gestations. Adapted from ECTORS et al. (1996a).
235
3000
3000
PAG (ng/ml)
2500
2500
2000
2000
1500
1500
1000
1000
500
500
00
26
-11
27
-10
28
-9
29
-8
30
-7
31
-6
32
-5
33
-4
34
-3
35
-2
36
-1
0
Weeks bef ore parturition
FIGURA 2 -
PAG profiles (mean ± S.E.M) in heifers embryo transferred with either
single (-▼-▼-) or multiple (-▲-▲-) gestations during the last 11 weeks
before parturition. Adapted from ECTORS et al. (1996a).
PAG detection in serum or plasma samples is currently used as a
specific serological method for pregnancy diagnosis in cattle from days 28
(SZENCI et al., 1998a,b) to 30 (SASSER et al., 1986; HUMBLOT et al.,
1988a) after breeding.
Investigations realized in peripartum clearly demonstrated the positive
influence of both maternal environment and fetal genotype (sex and race)
on peripheral blood concentrations of boPAG-1. In fact, PAG
concentrations were found to be more elevated in maternal circulation of
the intra-species crossbreeds than in inter-species ones (GUILBAULT et
al., 1991). Moreover, ECTORS and coworkers (1996) showed that in
nuclear transfer programs, even if the majority of calves are of normal size,
some of them can present morphological abnormalities like edema of the
umbilical cord with placental hypertrophy, responsible for higher
concentrations of PAG in maternal blood. In the same way, abnormally
236
high PAG concentrations in maternal circulation can indicate the presence
of a abnormal amount of trophoblast tissues, as observed in hydatiform
molar pregnancy (Figures 3A and 3B) (ECTORS et al., 1996b).
After IVF or cloning, the PAG follow-up in plasma samples collected
weekly was able to monitor embryonic and fetal deaths (ECTORS et al.,
1996a). However, due to the large variations of PAG concentrations in
maternal blood, only a marked decrease (or disappearance) in plasma
concentrations of this protein can be a no controversial predictive sign of
embryonic or fetal death (SZENCI et al., 1999).
3.1.1.1.2. boPAG-2: in 1994, Xie et al. identified the poorly
characterized bovine chorionic gonadotropin isolated by BECKERS et al.
(1988a) as a new member of the aspartic proteinase family: the boPAG-2
(BECKERS et al., 1994).
The classification of the LH-like factor of the bovine placenta as a
proteinase was surprising but not the first observation on similarities
between placental hormones and proteinases. In fact, previous studies
developed by WILLEY and LEINDENBERGER (1989) had already
demonstrated a high analogy between primary sequences of human
chorionic gonadotropin (hCG) and the serine proteinase chymotrypsin. In
that study it was also observed that proteinaceous proteinase inhibitors like
soy bean trypsin (SBI) are capable to neutralize the agonistic activity of
hCG and to reduce the binding of hCG to its receptor and to its specific
antisera.
The boPAG-2 was characterized by XIE et al. (1994) as a polypeptide
237
of 372 amino acids long, structurally related to boPAG-1, ovPAG-1 and
pepsin (58%, 58% and 51% amino acid sequence identity, respectively).
Unlike boPAG-1, boPAG-2 has a catalytic center with the amino acid
consensus sequence of other active aspartic proteinases. However, it
remains unclear whether boPAG-2 has a proteolytic activity.
Expression of boPAG-2 mRNA is detected as early as 17-19 days of
pregnancy, coinciding with the beginning of implantation. Its mRNA is
expressed in fetal placenta but not in other fetal organs, and is localized in
both mononucleate and binucleate cells. Interestingly, boPAG-2 is
synthesized by placental explants as a 70 000 molecular weight isoform
that is processed to smaller molecules (XIE et al., 1996).
A)
14000
B)
P A G (n g /m l)
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
-1 1 -1 0
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
W e e ks b e fo re p a rtu ritio n
FIGURE 3 - A) Hydatiform molar pregnancy; B) Abnormally high PAG
concentrations observed in hydatiform molar pregnancy (-▲-▲-) versus
normal gestations (-×-×-). Adapted from ECTORS et al., 1996(a).
3.1.1.2. The ovine PAG family: the identification of antigen(s)
immunologically related to boPAG-1 (bPSP-B) in the peripheral circulation
238
of pregnant ewes (RUDER et al., 1988) has led to the isolation and partial
purification of pregnancy-associated glycoproteins in ewes (ZOLI et al.,
1990a; ZOLI et al., 1995; WILLARD et al., 1995).
3.1.1.2.1. ovPAG-1: The ovine PAG, later designated ovPAG-1, was
initially identified as a molecule close to the boPAG-1, containing 382
amino acids (XIE et al., 1991). Parallel to the cDNA characterization,
several attempts were developed in order to purify the ovine PAG starting
from fetal cotyledons. In comparison to bovine PAG, the ovine PAG was
more difficult to purify and only semi-purified preparations were made
available (ZOLI et al., 1990a, ZOLI et al., 1995; WILLARD et al., 1995).
The ovPAG-1 showed multiple molecular weight isoforms (43 000-67 000)
with different pI ranging from 4.06 to 4.65 (WILLARD et al., 1995).
Molecular cloning studies have shown the ovPAG-1, like boPAG-1,
belongs to the aspartic proteinase family showing 73% amino acid
sequence identity with this protein (XIE et al., 1991). As observed for
boPAG-1, it seems that ovPAG-1 is a catalytically inactive form of aspartic
proteinase secreted by binucleate cells of the trophoblast (XIE et al., 1991).
In this case, the lack of enzymatic activity results from the mutation of the
catalytically essential aspartic acid within the C-terminal lobe (Asp-257) to
one glycine (Gly-257) (XIE et al., 1991). A comparable change in pepsin,
where the active site Asp-32 of the first lobe is replaced by alanine (a Asp32-Ala mutation) abolishes all activity, even though the molecule is still
capable of binding pepstatin A (a potent inhibitor of aspartic proteinases)
with high affinity (LIN et al., 1989).
Time-course studies of placental explants recently showed that
ovPAG-1 is first detectable as a precursor with high molecular weight (67
239
000-70 000), which is gradually processed to smaller products (XIE et al.,
1996). The basis of the variety of molecular weight forms remains to be
elucidated, but the differences seem likely to be due to some unusual form
of posttranslational modification introduced in the binucleate cells (XIE et
al., 1996; GREEN et al., 1998a).
➡ PAG and PSPB radioimmunoassays
The development of heterologous radioimmunoassays for ovPAG-1
and oPSP-B has allowed its detection in maternal blood 3 weeks
(WILLARD et al., 1995) to 4 weeks (RANILLA et al., 1994) after
breeding. The PAG-RIA is based on the utilization of boPAG-1 as tracer
and standard, and antisera raised in rabbits immunized against a preparation
of ovine PAGs (ZOLI et al., 1995; WILLARD et al., 1995).
PAG profiles in pregnant ewes (Figure 4) (RANILLA et al., 1994;
RANILLA et al., 1997a; GAJEWSKI et al., 1999) appeared to be quite
different than those obtained in cattle (ZOLI et al., 1992b). In Churra and
Merino ewes, for example, after a first period of high concentrations
around day 60, the concentrations decrease until day 90 and increase again
to remain elevated and stable until parturition (RANILLA et al., 1994).
After parturition, the rate of decline in PAG concentrations is faster in
ewes (4 weeks) than in cows (about 14 weeks), with no correlation being
observed between this rate and the interval to first ovulation (RANILLA et
al., 1997b).
3.1.1.2.2. Others ovPAGs: an additional member of PAG family
(ovPAG-2) was isolated from cDNA library prepared from day 13 whole
conceptuses (NAGEL et al., 1993; GURUPRASAD et al., 1996). This
240
protein is expressed in both mononucleate and binucleate cells of the
placenta (NAGEL et al., 1993).
700
PAG (ng/ml)
600
Parturition
500
400
300
200
100
0
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
Weeks
FIGURE 4 - PAG profiles during gestation and postpartum periods in Berrichon
ewes. Adapted from GAJEWSKI et al., 1999.
Several other different PAGs have been recently purified from ovine
placental conditioned media by using a series of chromatography
precedures (XIE et al., 1997a). Amino-terminal sequencing of four of the
purified products revealed that three of them were novel and that each of
them had been processed by removal of the pro-peptide within what
appeared to be a consensus sequence between the pro-peptide and the
mature molecule. None of these purified molecules demonstrated any
enzymatic activity in a standard proteinase assay with denatured
haemoglobin (XIE et al., 1997a).
Another subset of PAGs was identified in extracts of sheep placenta
by ATKINSON et al. (1993) who used the monoclonal antibody against
241
SBU-3 developed by GOGOLIN-EWENS et al. (1986). The three proteins
affinity-purified with the SBU-3 antibody had molecular weights of 57 000,
62 000 and 69 000, showing partial amino acid sequence homology to the
ovPAG-1, boPAG-1 and rabbit pepsinogen F (ATKINSON et al., 1993).
3.1.1.3. The caprine PAG family: three different PAGs were isolated and
partially characterized from goat placenta (GARBAYO et al., 1998). These
proteins differed in amino acid sequence and apparent molecular weight
(55 000, 59 000 and 62 000) showing several isoforms with different pI:
caPAG55 (pI: 5.3, 5.1, 4.9), caPAG59 (pI: 6.2, 5.9, 5.6) and caPAG62 (pI:
5.1, 4.8).
Caprine PAGs showed high sequence homology to each other (60% to
73% residues identical) and a high sequence identity (from 30% to 81%
between the first 27 amino acids sequenced) with proteins of the aspartic
proteinase family like boPAG-1, ovPAG-1, boPAG-2, SBU-3 and rabbit
pepsinogen F (GARBAYO et al., 1998).
➡ PAG and PSPB radioimmunoassays
The use of two semi-purified preparations (one containing the
caPAG55 and caPAG59 forms, and the other containing the caPAG55 and
caPAG62) allowed the development of an accurate system for pregnancy
diagnosis in goats (GONZÁLEZ et al., 1999). PAG concentrations are
significantly higher in pregnant than in non-pregnant females as early as 21
days after artificial insemination (GONZÁLEZ et al., 1999).
During gestation, PAG concentrations reach maximal levels in week
8, decrease between weeks 12 and 14 and remain relatively constant until
242
parturition (Figure 5) (FOLCH et al., 1993; GONZÁLEZ et al., 2000a).
After parturition, concentrations decrease rapidly reaching lower levels at
the 4th week postpartum (SOUSA et al., 1999).
500
500
PAG (ng/ml)
400
400
Parturition
300
300
200
200
100
100
00
3
3
5
5
7
7
9
9
11
11
13
13
15
15
17
17
19
19
21
21
23
23
25
25
27
27
Weeks
FIGURE 5 - PAG profiles (mean ± S.E.M) during gestation and postpartum periods
in Blanca-Celtiberica goats with either single (-▼-▼-) or multiple (-▲▲-) gestations. Adapted from Folch et al., 1993.
As observed in cattle (GUILBAULT et al., 1991; PATEL et al.,
1997), both number and genotype of fetus can influence PAG
concentrations over gestation. From days 21-24 and throughout gestation,
twin bearing goats have higher PAG (or PSP-B) concentrations than goats
bearing one fetus (HUMBLOT et al., 1990; SOUSA et al., 1999;
GONZÁLEZ et al., 2000a,b). PAG levels in maternal circulation of interspecific pregnancies (spanish ibex embryos transferred to domestic goats)
are also higher (about ten times) when compared to that found in normal
intra-specific gestations (FERNÁNDEZ-ARIAS et al., 1999).
Sequential measurement of PAG in goats also allows for the
determination of the onset of the disturbance of trophoblastic activity
243
associated with the death of a fetus (ZARROUK et al., 1999a,b). As
demonstrated by ZARROUK et al. (1999a), in goats carrying a single fetus,
PAG levels fall under the positive pregnancy threshold when the
trophoblast died, while in goats carrying 2 or 3 fetuses, analysis of the
profiles clearly shows marked drops in concentration that could indicate
placental distress at different times. Therefore, systematic application of
this test in herds with a high rate of pregnancy failure could help to
pinpoint phenomena which might be implicated in triggering these events.
3.1.2. Molecular Studies of New PAG Related Molecules
By cloning expressed genes from ovine and bovine placental cDNA
libraries, by Southern genomic blotting, by screening genomic libraries,
and by using PCR to amplify portions of PAG genes from genomic DNA,
it was recently estimated that cattle, sheep and most probably all ruminant
Artiodactyla possesses many, possibly 100 or more, PAG genes, many of
them being placentally expressed (XIE et al., 1997b; GREEN et al., 1998a;
GARBAYO et al., 1999; GREEN et al., 2000). New members of the PAG
family gene family have also been found to be expressed in the porcine
(BAUMBACH et al., 1988; BAUMBACH et al., 1990a; SZAFRANSKA
et al., 1995; DORÉ et al., 1996), equine (GREEN, et al., 1998b; GREEN et
al., 1999), carnivora (GAN et al., 1997) and zebra (GREEN et al., 1994;
GREEN et al., 1999) placentas, showing that PAGs are not restricted to
ruminant species.
The equine PAG (eqPAG-1) is expressed in the placenta of the horse
and zebra and secreted from cultured placental tissues as both a processed
244
(mature) and unprocessed (zymogen) form (GREEN et al., 1999). The
processed form is an active proteinase and may, therefore, be the horse
homologue of pepsinogen F (XIE et al., 1997b).
In porcine species, two different PAG cDNAs have been found: the
poPAG-1 and poPAG-2. They share 64% homology sequence to each
other, and about 50% amino acid sequence identity with the PAGs of
ruminants. Interestingly, poPAG-1 has amino acid substitutions within its
catalytic center that together were likely to render it enzymatically inactive,
whereas poPAG-1 retained sequences identical to pepsin in these regions
(SZAFRANSKA et al., 1995). They seem occupy an intermediate position
between the enzymatically functional aspartic proteinases and the PAGs
from cattle and sheep (XIE et al., 1997b).
3.1.3. Identification of Pregnancy-Associated (Specific) Proteins in Wild
Ruminants
Serologically similar antigens to PAG or PSP-B (Table 2) have been
found in maternal circulation of wild ruminants like mule deer (WOOD de
et al., 1986), white-tailed deer (WOOD et al., 1986; OSBORN et al.,
1996), mountain goats (HOUSTON et al., 1986), red deer (HAIGH et al.,
1988), musk-oxen (ROWELL et al., 1989), bison (HAIGH et al., 1991),
moose (HAIGH et al., 1993), sika deer (WILLARD et al., 1994a;
WILLARD et al., 1996), elk (WILLARD et al., 1994b), fallow deer
(WILLARD et al., 1994c; WILLARD et al., 1998; WILLARD et al., 1999)
and reindeer (RUSSEL et al., 1998; ROPSTAT et al., 1999).
245
TABLE 2 -
Family
Pregnancy-associated glycoproteins and related molecules belonging to
the aspartic proteinases family.
Specie
Detection in maternal
blood or milk*
Proteic Biochemical
Characterization
cDNA clonage
Bovidae Bovine
(Bos taurus)
SASSER et al., 1986,1989 BUTLER et al. 1982
XIE et al., 1991,1994
HUMBLOT et al.,
ZOLI et al., 1991
1988a,b
ZOLI et al., 1992
Ovine
RANILLA et al.,
ATKINSON et al., 1993 XIE et al., 1991,1997b
(Ovis aries)
1994,1997a
ZOLI et al., 1995
GAJEWSKI et al., 1999 WILLARD et al., 1995
XIE et al., 1997a,b
Caprine
HUMBLOT et al., 1990 GARBAYO et al., 1998 GARBAYO et al., 1999
(Capra hircus)
FOLCH et al., 1993
SOUSA et al., 1999
GONZALEZ et al.,
2000a,b*
Spanish ibex
FERNANDEZ-ARIAS et (Capra pyrenaica) al., 1999
Montain goat
HOUSTON et al., 1986 (Oreamnos
americanus)
Musk oxen
ROWELL et al., 1989
(Ovibus moschatus)
Bison
HAIGH et al., 1991
(Bison bison)
HAIGH et al., 1993
HUANG et al., 1999,
Cervidae Moose
(Alces alces)
2000
Elk
HAIGH et al., 1988
HUANG et al., 1999,
(Cervus elephus)
WILLARD et al., 1994b 2000
Mule deer
WOOD et al., 1986
(Odocoileus
hemionus)
White-tailed deer WOOD et al., 1986
(Odocoileus
OSBORN et al., 1996
virginianus)
Sika deer
WILLARD et al., 1994a (Cervus nippon)
Fallow deer
WILLARD et al., 1994c (Dama dama)
Rein deer
RUSSEL et al., 1998
(Rangifer tarandus) ROPSTAT et al., 1999
GREEN et al., 1994,
Equidae Horse
(Equus caballus)
1998b
Zebra
GAN et al., 1997
(Equus zebra)
GREEN et al., 1998
GAN et al., 1997
Felidae Cat
(Felis domestica)
Pig
BAUMBACH et al., 1988 SZAFRANSKA et al.,
Suidae
(Sus scrofa)
DORE et al., 1996
1995
246
The recent isolation and characterization of new forms of pregnancyassociated (specific) proteins from elk and moose placenta (HUANG et al.,
1999) allowed the development of a more specific radioimmunoassay to
quantify this protein in maternal serum of wild species (HUANG et al.,
2000).
3.2. Placental Lactogens (PL)
Placental
lactogens
(PL),
also
known
as
chorionic
somatomammotropins (CS), are proteinaceous hormones of placental
origin that share structural and functional homology to growth hormone
(GH) and prolactin (PRL).
The function of PL varies according the species. In general it has been
suggested that PL influences mammogenesis and lactogenesis (FORSYTH,
1986), ovarian (GLASER et al., 1984; TELLERIA et al., 1998) and
placental steroidogenesis (DEAYTON et al., 1993), fetal growth (CHENE
et al., 1988) and that it alters the maternal metabolism to accommodate the
growth and development of the fetus (FREEMARK et al., 1992).
3.2.1.
Human
Placental
Lactogen
(hPL)
or
Human
Chorionic
somatomammotropins (hCS) (see MARTAL and CÉDART, 1993
for review)
The human placental lactogen (hPL), later called human chorionic
somatomammotropin (hCS), is a non glycosylated single chain protein that
contains 191 amino acids and two intra disulfide bonds. Its molecular
weight is about 22 300, but polymeric forms with higher molecular weights
247
have also been described. hPL is secreted by the syncytiotrophoblast cells
of the placenta, however the mechanisms by which this hormone is
released in the maternal circulation have not been totally elucidated.
Quantitatively, hPL is one of the most important soluble proteins of
the human placenta, corresponding to approximately 10% of the total
proteins. Its production rate is very high varying between 0.3 and 1 g/day at
term. Human PL is detected in the placenta 5 to 10 days after implantation
and in peripheral blood 3 to 4 weeks later. The level increases in the
maternal serum as pregnancy progresses and the rate of secretion is related
to the placental weight. As the half-life of hPL is very short (10-30 min), its
assay gives an estimation of the placental activity at the time of collection.
Human PL is a regulator of lipids, carbohydrates and proteins
metabolism. It increases the general metabolism of the adipose tissue
provoking either lipolysis or lipogenesis depending on the circumstances.
In pregnant women, it acts as an insulin antagonist and may be responsible
for the diabetic acidosis observed during pregnancy.
3.2.2.
Bovine
Placental
Lactogen
(bPL)
or
Bovine
Chorionic
Somatomammotropin (bCS)
Studies on placental lactogens hormones preceded those of PAG in
domestic ruminants. In bovine species, for example, the lactogenic activity
of cotyledons was first demonstrated by BUTTLE and FORSYTH in 1976
by use of a 5 day co-culture of mouse mammary tissue and cow
cotyledonary tissue at different stages of pregnancy. These authors
obtained a lactogenic substance with about 300 ng of equivalent bovine
248
PRL (bPRL). In parallel studies, starting from bovine placenta, several
research groups (BOLANDER and FELLOWS, 1976; BECKERS et al.,
1980) identified and purified a protein with a somatomammotropic activity.
The purified bPL exists in multiple isoforms (Mr 32 000 to 34 000)
with at least five isoeletric variants ranging from 4 to 6 (MURTHY et al.,
1982). Bovine PL shares 48 to 50% sequence homology with PRL and 26
to 28% with GH. However, by use of radioimmunoassay (BECKERS,
1983) it was demonstrated that there is no cross reaction between bPL, PRL
or GH.
Bovine PL is produced by chorionic binucleate cells (DUELLO et al.,
1985; MILOSAVLJENIC et al., 1989; KAPPES et al; 1992) which seem to
deliver their product to the maternal circulation by migrating to and fusing
with endometrial epithelium. It co-localizes in the same cells with other
proteins like SBU-3 antigen and boPAG-1 (WOODING, 1992). In contrast
to other placental lactogens, bPL is a glycoprotein containing both N-linked
and O-linked oligosaccharides (SHIMOMURA and BREMEL, 1988;
BYATT et al., 1990). This glycoproteic composition characteristic of
placental proteins like bPL, boPAG-1 and SBU-3 can result of a highly
developed posttranslational mechanism expressed in bovine giant
trophoblastic cells (GOGOLIN-EWENS et al., 1986).
Bovine PL is detectable in maternal circulation by the 4th month of
gestation, but its concentration remains lower than 1-2 ng/ml through
gestation. In the peripheral circulation of the fetus, bPL concentrations are
higher (about 5 to 25 ng/ml) and shows a decline with advancing
gestational age (BECKERS et al., 1982; BYATT et al., 1987). These ratios
of fetal and maternal bPL concentrations are quite different of those
249
observed for boPAG-1, despite the co-localization of both placental
proteins in the same cells.
In cattle, the mammary growth seems to be, at least partially,
controlled by hormones of placental origin like bPL. Both calf birth weight
and placental mass are positively correlated with milk production during
subsequent lactation (ERB et al., 1980; COLLIER et al., 1982).
Interestingly, endometrium, corpus luteum as well as maternal and
fetal liver contain mRNA encoding the bGH and bPRL receptors (bGHR
and bPRLR) (SCOTT et al., 1992). Specific binding sites for bPL, with
little affinity for bGH and bPRL, have also been identified in endometrium
(GALOSY et al., 1991; KESSLER et al., 1991).
Recent evidence (SCOTT et al., 1992) indicates that bPL competes
with equal affinity with bPRL for a recombinant bPRLR (rbPRLR).
Diversely, bPL seems to bind the bGHR in a 1:1 stoichiometry rather than
1:2 stoichiometry reported for bGH (STATEN et al., 1993).
It is possible that, in some adult tissues (e.g. liver and corpus luteum),
bPL may exert its actions through either the bGH or bPRL receptors. This
action was supposed to be exerted either by a heterodimer of bPRLR and
bGHR monomers, or through a heterodimer of either one monomer of the
bPRLR of bGHR and a unique receptor monomer (ANTHONY et al.,
1995).
3.2.3.
Ovine
Placental
Lactogen
(oPL)
or
Ovine
Chorionic
Somatomammotropin (oCS)
Ovine placental lactogen (oPL) was studied and purified by
250
HANDWERGER et al. (1974), MARTAL and DJIANE (1975) and CHAN
et al. (1976). However, due to the fact that the amino terminal residue of
oPL was blocked, the full sequence of ovine PL was not elucidated until
quite recently (COLOSI et al., 1989; WARREN et al. 1990). Although the
primary structure of oPL and bPL are similar in 67%, oPL has a molecular
weight of 22 000 and no potential N-linked glycosylation sites (CHAN et
al., 1976). The degree of amino acid sequence homology between of oPL
and PRL is higher than that to GH (49% and 28%, respectively). So, it is
not surprising to observe that oPL can demonstrate a higher lactogenic than
somatogenic activity.
Binding sites for oPL have been identified in fetal ovine liver
approximately at day 70 of gestation and increase in number through
pregnancy to reach a peak 3 to 7 days before parturition (FREEMARK et
al., 1986). These sites are also found in maternal liver during gestation as
well as in neonatal liver for more than 1 week postpartum. FREEMARK
and coworkers (1990) demonstrated a decreased binding of oPL to fetal
liver during maternal fasting, and later (FREEMARK et al., 1992) they
suggest that oPL receptor may be either a variant or a shortened form of
somatotropin receptor.
In trophoblastic tissue oPL is detectable at day 16-17 of gestation
(Reddy and Watkins, 1978). In maternal blood, oPL can be detected at day
40 to 50 of gestation and peaks during the last trimester of pregnancy
(CHAN et al., 1978). These values are positively correlated to fetal
number, milk yield and placental mass. Ovine PL fetal concentrations
decline from mid gestation until 1 to 2 weeks before parturition. Although
fetal sera concentration and total fetal weight were not correlated (KAPPES
251
et al., 1992), the entry rate of oPL into fetal vasculature increases with
advancing gestation age (SCHOKNECHT et al., 1992).
Biological activities of oPL have been observed in ovarian
steroidogenesis, maternal intermediary metabolism, mammary and fetal
growth. ANTHONY et al. (1995) suggest that oPL acts through a
structurally distinct receptor within fetus, influencing the fetal production
of one or more insulin growth factors (IGFs) and playing an important role
in fetal growth regulation.
The factors that regulate secretion of oPL are still poorly understood
but it is clear that oPL is not regulated by the same way in the fetal and
maternal compartments, and nutritional factors seem to be involved
(BYATT et al., 1992). A better knowledge about PL hormones probably
will help to understand the metabolic way of trouble occurring in late
pregnancy, in postnatal development and milk production.
3.2.4. Caprine Placental Lactogen (cPL) or Caprine Chorionic
Somatomammotropin (cCS)
Caprine placental lactogen (cPL) was the first placental lactogen
described in ruminants (BUTTLE et al., 1972). Several studies described
the presence of prolactin-like and growth hormone-like activities in the
blood of pregnant goats and several research groups (BECKA et al., 1977;
NUGENT and HAYDEN, 1987) tried to purify this protein. Early nineties,
cPL has been purified to homogeneity (CURRIE et al., 1990).
Caprine PL has a molecular weight of 22 000 and an isoeletric point
of 8.35. Despite its purification, the primary amino acid sequence of cPL
252
was not determined. Based on the close phylogenic relationship between
caprine and ovine species, it is likely that oPL and cPL have a high
percentage of amino acid sequence similarity to each other. Also by
similarity, it seems that cPL, like oPL, is a non-glycosylated form of
placental lactogen (BYATT et al., 1992).
Caprine PL is detected from day 44 of pregnancy in jugular plasma
(CURRIE et al., 1990) and can be used as a late pregnancy diagnosis from
the day 60th (SARDAJANA et al., 1988). The level of cPL increases during
pregnancy. Maximal concentrations are observed from mid to late
pregnancy, followed by a gradual decline through the last week of gestation
(CARD et al., 1988). Caprine PL concentrations are undetectable as early
as 18 h postpartum (CURRIE et al., 1990). As observed for PAG, cPL
concentrations are higher in multiple than in single gestations (CURRIE et
al., 1990) and are directly related with the total weight of placentomes and
with the total fetal weight.
Placental lactogen seems to have a significant role in the control of
normal mammary development and function in goats. Milk yield is related
with the weekly mean of PL between week 11 and term (HAYDEN et al.,
1979). The increase in secretion of PL coincides with the onset of rapid
lobule alveolar development of the mammary gland.
3.3. Proteins Associated with the Embryonic Signal
In some species, even before implantation, the embryo produces some
“signals” which are recognized by the mother and induce an inhibition of
luteolysis and the transformation of a cyclic corpus luteum into a
253
pregnancy corpus luteum. Among these signals, it can be mentioned the
chorionic gonadotropin (CG), a luteotropic factor produced by the human
and equine placentas, and the interferon tau (IFNτ), the antiluteolytic factor
responsible for the rescue of the corpus luteum in ruminant species, and
probably, at least partially in porcine and equine species.
3.3.1.
The Chorionic Gonadotropins (CG) (see LEYMARIE and
MARTAL, 1993 and DERIVAUX et al., 1988 for review)
Human and equine species have long been known to display a
placental gonadotropic activity. As early as 1927, ASCHHEIM reported the
presence of a gonadotropic factor in the urine of pregnant woman and
during the following year they based their famous method for the early
diagnosis of pregnancy on this finding (ASCHHEIM and ZONDEK,
1928a,b). Due to its properties, this gonadotropic factor was later called
human chorionic gonadotropin (hCG). Three years later, COLE and HART
(1930) showed the existence of a gonadotropic activity in the serum of
pregnant mares. This pregnant mare serum gonadotropin (PMSG), after a
better characterization, was called equine chorionic gonadotropin (eCG).
3.3.1.1. Human Chorionic Gonadotropin (hCG): the human chorionic
gonadotropin (hCG) is a glycoprotein with a molecular weight of 38 400
and isoeletric points varying from 3.8 to 5.1. In early gestation, the
synthesis of hCG increased in parallel with the trophoblastic activity.
The hCG is secreted by the trophoblast as soon as the blastocyst
leaves its zona pellucida. It is first found in the maternal blood from day 8-
254
12 after fertilization, to achieve maximal concentrations during the first
trimester of pregnancy. Afterwards, the levels decrease, but are still
detectable till parturition.
Structurally, the hCG is composed by two subunits: alpha and beta.
The alpha subunit comprises a peptide chain of 92 amino acids with 2
oligosaccharide chains attached at residues 52 and 78 (Asn-52 and Asn-78).
This alpha subunit is similar to the alpha subunits of human, ovine and
porcine LH. The beta hCG subunit is very similar to the beta subunit of
human LH. It comprises 145 amino acids long, of those, 115 identical to
the beta subunit of LH, with an additional fragment (30 amino acids) in the
carboxy terminal side. The beta subunit contains several additional
carbohydrate chains linked to the serines (Ser-118 or Ser-119 and Ser-131)
and to the asparagines (Asn-13 and Asn-30). Due to its high content in
sialic acid, the half life of hCG (about 8 hours) is much longer then that of
LH, estimated to be only 12 to 50 min. The biological activity of hCG is
rapidly abolished by hydrolysis with trypsin or chymotrypsin.
Human CG produces an effect on luteal cells of LH type which
involves the same receptors as the hypophyseal gonadotropin. However, its
action is more sustained since the hCG receptor complex is internalized 50
times more slowly than the LH receptor complex.
3.3.1.2. Equine Chorionic Gonadotropin (eCG): the equine chorionic
gonadotropin (eCG), also known as PMSG, is specific to the mare. It
represents the main luteotropic factor responsible for progesterone ovarian
secretion until the placenta becomes able to carry out this progestagens
255
secretion.
The eCG is synthesized by the endometrial cups which are composed
by typical trophoblastic cells with one or two nuclei. These cells release the
eCG only during the first trimester of pregnancy (between 45 and 130 days
of gestation). Initial eCG secretion coincides with the formation of the
secondary corpus luteum in the ovaries.
Equine CG is a glycoprotein with an apparent molecular weight
between 45 000 and 64 000. Like hCG, eCG is composed by subunits alpha
and beta. Its plasmatic half-life (about 6 days) is due to its high sialic acid
content (10 to 13.5%) and to the length of its carbohydrate chains. Contrary
to the hCG, eCG was not detected in urine of pregnant females.
The activity of this hormone presents analogies with that of the
hypophyseal gonadotropin FSH. It can be therefore used in hormonal
control programs when a FSH-like activity is required.
3.3.2. Interferon Tau (IFNτ)
In domestic ruminants, ovarian production of progesterone is required
for about 55 days in ewes, for at least 165-180 days in cattle
(ESTERGREEN et al., 1967) and till the end of pregnancy in goats. In
these species, rescue of the corpus luteum occurs before implantation
(around day 15 to 22 after fertilization) and appears to be initiated by the
release of a proteinaceous factor present in the pre-implantation conceptus.
This factor, initially called trophoblastin (MARTAL et al., 1979) or ovine
trophoblast protein-1 (GODKIN et al., 1984), was recently officially
designated as a distinct subclass of the interferon alpha (IFNα) family: the
256
IFN tau (IFNτ) (CHARPIGNY et al., 1988).
The first studies that demonstrated the presence of an antiluteolytic
factor produced by the conceptus were realized by MOOR and ROWSON
(1966), who transferred 14-16 days old ovine embryos to ewes during the
estrus cycle, before the 12th day, and observed the maintenance of the
corpus luteum and the interruption of the cycle. The following year, the
same authors homogenized 14-16 day ovine embryos and injected the
homogenate into the uterus before the 12th day of the cycle. The same
results were obtained: maintenance of the corpus luteum and interruption of
the estrous cycle. This phenomenon was not observed if the homogenates
were obtained from 21-23 day embryos.
NORTHEY and FRENCH (1980) and Humblot and DALLA PORTA
(1984) carried out similar experiments in the cow. They transferred 15-17
days old embryos or their homogenates to recipients during the first 16
days of the estrous cycle obtaining the maintenance of the corpus luteum.
3.3.2.1. Bovine interferon tau (boIFNτ): the boIFNτ is a glycoprotein with
approximately 172 amino acids, produced by mononucleate cells of the
trophectoderm (MORGAN et al., 1993). It is the major secretory product
produced by day 16-25 cow conceptus. When analyzed by two-dimensional
gel electrophoresis, the boIFNτ fells into two major molecular weight
classes (22 000 and 24 000) with isoeletric points between 6.5 and 6.7
(HELMER et al., 1988a,b). The 24 000 molecular weight form is complex
in nature whereas the 22 000 form is a single high-mannose type
glycoprotein, indicating that these products undergoes differential
257
posttranslational glycosylations (HELMER et al., 1988b). The entire cDNA
sequence of the boIFNτ shared 79% identity with bovine interferon alpha II
(IFNα II) (IMAKAWA et al., 1989).
IFNτ is produced by the trophectoderm during the phase of
trophoblast elongation. It alters uterine release of PGF2α which results in
rescue of the corpus luteum and continued release of progesterone. The
mechanism of action of IFNτ includes inhibition of oestradiol receptors,
consequent reduction in oxytocin receptors, activation of a cyclooxygenase
inhibitor, and a shift in the prostaglandins to favour PGE2 over PGF2α
which also induces several endometrial proteins that may be critical for
surviving of the developing embryo (HANSEN et al., 1999).
3.3.2.2. Ovine interferon tau (ovIFNτ): in ewes, ovIFNτ is produced
transiently and when introduced into the non-pregnant female uterus,
extends corpus luteum life only for a short period of few days in most
ewes, although a functional corpus luteum can persists much longer in
others (MARTAL et al., 1979; GODKIN et al., 1982).
MARTAL et al. (1979) were the first to suggest that the antiluteolytic
factor produced by the ovine conceptus was a termolabile protein of
trophoblastic origin. This protein contains 172 amino acids (IMAKAWA et
al., 1987; ROBERTS et al., 1991) and presents a molecular weight of 20
000 (GODKIN et al., 1982). Its mRNA is expressed during a relatively
short period (11 to 22 days) (CHARLIER et al., 1989) that corresponds
closely to the time at which the embryo acts to extend luteal lifespan. The
highest level of mRNA expression was observed on the 22nd of pregnancy
258
(HANSEN et al., 1988). There is a greater structural identity between ovine
and bovine IFNτ (85%) than between this protein and the closest
homologous IFN omega (70%) (CHARLIER et al., 1991).
Like boIFNτ, the ovIFNτ bind receptors on the uterine endometrim
(Bazer, 1989) and seems to suppress transcription of the estrogen and
oxytocin receptors genes to block pulsatile release of PGF2α (GODKIN et
al., 1997).
3.3.2.3. Caprine interferon tau (caIFNτ): IFNτ molecules has also been
identified in caprine species (GNATEK et al., 1989). Two classes of
protein (17 000 and 22 000-24 000) (GUILLOMOT et al., 1998), each with
different isoeletric points, were identified from goat conceptus culture
medium (BAUMBACH et al., 1990b). The goat IFNτ is present in the
trophoblastic cells as early as day 14 and until day 17. However, by day 18,
as implantation proceeded, goat IFNτ is no longer detected suggesting that,
in this specie, other factors need to be present by day 18 to take over a role
in the maintenance of luteal function (GUILLOMOT et al., 1998).
3.3.3. Early Pregnancy Factor (EPF)
Early-pregnancy factor was first discovered in the early stages of
gestation by use of the rosette inhibition test (MORTON et al., 1979).
Despite several attemps, the use of this assay is not yet reliable as a current
pregnancy diagnosis test in animal species (TAKAGI et al., 1998).
Recently, it was observed that approximately 70% of the amino acid
259
sequence of EPF are identical to that of rat chaperonin 10, a member of the
highly conserved heat-shock family. Investigations with the latter
confirmed that chaperonin 10 is the moiety in pregnancy serum which
initiates response in the EPF bioassay (CAVANAGH and MORTON,
1994). As well as being a monitor of the presence of a viable embryo
(SHU-XIN and ZHEN-QUN, 1993), it is necessary for embryonic survival.
In this capacity it acts as both an immunosuppresant and growth factor
(MORTON et al., 1992; MORTON, 1998).
4. Acknowledgements
This review is part of a study supported by the following grants. The
investigations realized in Belgium were funded by FNRS and IRSIA grants
to J.-F. Beckers. N.M. Sousa is supported by a grant from CAPES. We also
thank the NIH Bettesda USA for gift of hormones.
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276
Apêndice 2
SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R., EL AMIRI, B., BANGA-MBOKO, H.,
SZENCI, O. & BECKERS J.F. (2001) Chorioví gonadotropin a specifický
glykoprotein u březích přežvýkavcŭ (Chorionic gonadotropins and
pregnancy-associated glycoproteins in ruminants). 3rd Central European
Buiatric Congress, 24 et 25 Mai, Moravian Highlands, Czech Republic,
p.430-432.
277
Chorionic Gonadotropins and Pregnancy-Associated Glycoproteins in
Ruminants
SOUSA, N.M.1, FIGUEIREDO, J.R.1, EL AMIRI, B.2, BANGA-MBOKO,
H.2, SZENCI, O.3 & BECKERS, J.F.2
1
Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Brazil
2
Physiology of Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of
Liège, Belgium
3
Department of Obstetrics and Reproduction, University of Veterinary
Science, Hungary
1. Introduction
In the genital tract of the female, a developing embryo induces the
transformation of the cyclic corpus luteum into a pregnancy corpus luteum.
In ruminants, the mechanism of maternal recognition of pregnancy
involves an interferon tau synthesized in the external layers of the
trophoblast. This molecule interacts with the endometrium to inhibit the
PGF2α synthesis and/or release.
In almost all mammalian species, the progesterone secretion by the
corpus luteum is rescued by the placenta. In ewes, for example,
progesterone synthesis is assumed by the placenta around day 50 after
fertilization. If an early embryonic mortality occurs, a return to estrus can
be observed around days 40 to 50 after fertilization.
278
In the bovine species, the corpus luteum is necessary for pregnancy
maintenance till day 200 after fertilization. Afterwards, the production of
progesterone by the placenta is sufficient to maintain the pregnancy. In cow
suffering of embryonic or fetal mortality, the return of estrus occurs in an
unpredictable delay varying largely between different individuals.
In goat, the corpus luteum is necessary for the whole pregnancy and
after embryonic mortality, it survives often for a long period,
approximately the length of a normal gestation (150 to 155 days). This
characteristic explains the syndrome known as pseudopregnancy and/or
hydrometra.
The maternal recognition of pregnancy in non-ruminant species
involves another mechanism. In primates and in horses, the placenta
synthesizes a two-subunit glycoprotein closely related to the pituitary
follitropin (FSH) and lutropin (LH). These chorionic gonadotropins were
discovered in 1927 (ASCHHEIM) in human and in 1930 (COLE and
HART) in mare, being named hCG and eCG, respectively. hCG and eCG
could be demonstrated by various biological, immunological, immunoelectrophoretic and radio-immunological techniques, as well as by
inhibition of latex agglutination and hemagglutination.
After this discovery, there were many attempts in order to identify an
equivalent of the choriogonadotropin in other animal species (FOSTER,
1956). However, after the elucidation of the principal molecular
mechanisms of interferon tau in the maintenance of the corpus luteum in
ovine and bovine species, the scientific interest of the question on the
existence of a chorionic gonadotropin in ruminants was decreased.
279
2. Does the Ruminant Placenta Secrete Gonadotrophic Substances ?
As early as 1940, NALBANDOV and CASIDA observed a reduction
in the pituitary gonadotrophic activity in the pregnant cow and suggested
that the corpus luteum was replaced by additional luteotrophic substances
produced elsewhere. Approximately 10 years later, WEETH and
HERMAN
(1952)
and
BJÖRKMAN
(1954)
found
that
bovine
trophoblastic cells contain glycoproteins.
In the sixties, using extracts of fetal and maternal cotyledons and
Parlow’s test (depletion of ascorbic acid), FOOTE and KAUSHIK (1963)
demonstrated the presence of a LH-like activity. In 1967, testing extracts of
fetal cotyledons, Lunen and Foote obtained a significant response with the
ventral prostate test and Parlow’s test (PARLOW, 1961) and suggested that
a LH-like substance was present in the bovine placenta (bovine chorionic
gonadotropin or bCG).
More recently, AILENBERG and SHEMESH (1983) working on
cotyledons collected during the first three months of pregnancy (20 to 100
days) looked for a gonadotrophic-like substance capable to stimulate the
progesterone production in bovine granulosa cells culture. For this purpose,
they used a radio-receptor method on Leydic cells according to the
technique previously described by RAMACHANDRAN and SAIRAM
(1975). They isolated a thermolabile substance with an apparent molecular
mass of 60 000 daltons and with a biological activity related to that of bLH,
that they considered to be a true bovine chorionic hormone. This hormone
could have a special importance in the cow, as in this species, the corpus
luteum is required for the maintenance of gestation throughout most of this
process (at least for 200 days).
280
BECKERS et al. (1987) continued to study this question by using the
radioreceptor assay method with membrane receptors and by looking for a
luteotrophic activity in fetal cotyledonary extracts and in all the fractions
obtained during biochemical purification procedures. The membrane
receptors were prepared from corpora lutea after tissue homogenization
followed by centrifugation. After several successive purification steps (90
000 times purification), in 1987 they isolated a substance with an activity
400 times greater than that isolated by AILENBERG and SHEMESH
(1983). The molecular mass was 30 000 daltons. This hormone could not
be confounded with hypophyseal LH as there was no arc of precipitation
between purified bCG and anti-bLH antiserum following radial
immunodiffusion in agar gel. However, this purified hormone was closely
related to pituitary LH as the anti-bCG serum tested presented a crossreaction with this substance.
Similarly to previous observations in the bovine species, it was
observed that homogenates of 13 to 15 days old sheep embryos prolonged
the life of the corpus luteum. GODKIN et al. (1978) showed that these
homogenates stimulate progesterone production by cultured luteal cells,
and one year later, LACROIX and MARTAL (1979) were able to
demonstrate a luteotrophic factor of placental origin by use of a
radiocompetitive binding method with corpus luteum membrane receptors.
The secretion of this ‘luteotrophic factor’ seemed to be very low in early
pregnancy. As the non-regression of the cyclic corpus luteum and its
transformation into a pregnancy corpus luteum did not appear to increase
its concentration, another anti-luteolytic substance was suspected to be
involved in this mechanism. This factor was later described as
281
trophoblastin or interferon tau.
3. bCG as an Aspartic Protease Family Member: the PAG-2
The question on the existence of a gonadotrophic substance in
ruminant placenta was partly solved by the study of XIE et al. (1994), who
showed that the cDNA sequence corresponding to the bCG molecule was
closely related to those of the aspartic proteinase family.
This finding was highly surprising however, previous investigations
have shown that chymotrypsinogen, a serine proteinase, can bind to the
LH/hCG receptor and activate it (WILLEY and LEINDENBERGER,
1989).
4. The Lack of Expression of the Gonadotropin α-Subunit in
Ruminant Placenta
One other answer to this important question could be given by the
investigation described by NILSON et al. (1991). These authors showed
that the expression of the glycoprotein hormone α-subunit gene occurs in
the pituitary of all mammals, but exclusively in placenta from primates and
horses.
In humans, two different elements, termed upstream regulatory
element (URE) and cAMP response element (CRE), are required for
placenta-specific expression of the α-subunit gene. The URE binds a
protein unique to placenta whereas the CRE binds a ubiquitous protein.
Comparative analysis of the promoter-regulatory region of the α-
282
subunit gene in some mammalian species indicates that a functional URE
has been retained and suggests a potential for its specific expression in
ruminant placenta. Indirect evidence also indicates that the URE binding
protein has been conserved, even in placenta from mammals that fail to
express the α-subunit gene. The lack of expression of the α-subunit gene in
placenta of rodents and cattle can be traced as a single nucleotide mutation
that renders the CRE-like sequence of these genes incapable of binding the
protein that confers responsiveness to cAMP.
Indirectly, this study comforts the hypothesis of a certain luteotropinlike activity of the ruminant pregnancy-associated glycoprotein II (boPAG2). However, the biochemical difficulty to isolate this molecule from
placenta extracts did not allow the development of physiological studies
and keep this question unsolved.
In conclusion, the endocrine activity of the ruminant placenta and the
reciprocal relationships between the sources of hormones during gestation
remain to be described in details. The discovery of prostaglandins,
interferons
tau
and
more
recently
of
the
pregnancy-associated
glycoproteins family gave probably main parts of this puzzle.
5. References
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284
Apêndice 3
MOREIRA DA SILVA, F., SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R. &
BECKERS, J.F. Proteínas placentais secretadas na circulação materna:
auxílio ao diagnóstico de gestação e ao estudo da mortalidade embrionária
em bovinos. (Submetido à Revista Portuguesa de Zootecnia)
285
Proteínas placentais secretadas na circulação materna: auxílio ao
diagnóstico de gestação e ao estudo da mortalidade embrionária em
bovinos
MOREIRA DA SILVA, F.1, SOUSA, N.M.2, FIGUEIREDO, J.R.2 &
BECKERS, J.F.3
1
Departamento de Ciências Agrárias, Universidade dos Açores, Portugal
2
Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa
Maria, Brasil
3
Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Liège, Bélgica
Resumo
Durante as últimas décadas, várias equipas de investigação têm
envidado esforços para caracterizar proteínas ou glicoproteínas produzidas
pela placenta dos ruminantes, a qual resultou na descoberta de uma grande
família de glicoproteínas associadas à gestação (PAGs) expressas na
placenta de bovinos, ovinos e caprinos. Recorrendo a técnicas de biologia
molecular, as PAGs foram identificadas como pertencendo à superfamília
das proteinases asparticas, da qual também fazem parte os pepsinogênios, a
renina, as catepsinas D e E, entre outras. Um vez que as PAGs são
produzidas em largas quantidades pelas células binucleadas do trofoblasto,
os seus níveis são facilmente detectáveis na circulação materna a partir do
início da gestação. No presente trabalho, além de serem caracterizados os
principais aspectos fisiológicos e bioquímicos das PAGs bovinas, será
286
demonstrada que a determinação dos níveis de PAGs são um óptimo
instrumento de trabalho para o diagnóstico da gestação, servindo ainda
como indicador do bem estar do feto e do estado sanitário da placenta.
Informações relativas a outras proteínas placentais serão discutidas
comparativamente às informações disponíveis sobre as PAGs.
Placental proteins secreted in maternal circulation: useful indicators
for both pregnancy diagnosis and embryonic mortality in bovine
species
Summary
During the last decades, several research groups developed
investigations in order to characterize proteins or glycoproteins synthesized
by ruminant placenta. As result of these investigations, a large family of
pregnancy-associated glycoproteins was identified in bovine ovine and
caprine placenta. By using molecular biology techniques, it was
demonstrated that they are members of the aspartic proteinase superfamily,
in which they co-exist with pepsinogens, renin, cathepsin D and E, etc. Due
to their secretion in large amounts by the trophoblastic binucleated cells,
bovine PAGs are detectable in maternal circulation soon after implantation.
In the present work, in addition to the physiological and biochemical
characterization of bovine PAGs, it will be showed how the measurement
of PAG concentrations in maternal blood is useful for both pregnancy
confirmation and follow-up of the fetus-placental well-being. Available
information related to other placental proteins will be also discussed.
287
1. Introdução
A placenta é um sistema orgânico polivalente com uma função
fisiológica
vital
na
perpetuidade
da
mamíferos
euterianos:
o
desenvolvimento fetal está relacionado com o desenvolvimento da placenta
do ponto de vista anatómico, genético e metabólico. No que diz respeito à
função endócrina dos mamíferos, esta inclui várias hormonas tais como a
progesterona, estrogéneos, gonadotrofinas coriónicas, lactogénes placentais
(também designados por somatomamotrofinas), prolactinas, hormonas e
factores de crescimento, além de proteínas e glicoproteínas específicas ou
associadas à gestação, as quais interferem com o estabelecimento da
gestação a manutenção do corpo lúteo, a tolerância imunitária do
embrião/feto pela mãe, o metabolismo materno intermédio, o crescimento
fetal e o desenvolvimento da glândula mamária.
O estudo da função endócrina da placenta dos bovinos será discutida
no presente trabalho. As proteínas associadas à gestação, bem como o seu
relacionamento com outras hormonas peptídicas serão usadas como termos
de comparação para compreensão da sua estrutura, função e produção das
proteínas placentais.
2. A Placenta
A placenta desempenha um papel essencial no estabelecimento e
manutenção da gravidez bem como no desenvolvimento fetal, funcionando
como um órgão respiratório, nutricional, endócrino e imunológico.
Contrariamente ao que se acreditou durante muitos anos, a placenta não
representa somente uma barreira mãe/filho, possuindo efectivamente um
papel activo e selectivo de trocas entre a mãe e o feto, o qual evolui em
288
harmonia com outros sistemas. A estrutura da placenta varia de acordo com
as espécies, e dela depende o comportamento do embrião na altura da
nidação, quer esta seja nos tecidos de lúmen uterino ou então apenas na
mucosa uterina.
Apesar de algumas imperfeições, a classificação dos diferentes tipos
de placentas baseada na estrutura histológica ou, mais precisamente no
número de camadas histológicas que separam o feto do sangue materno
parece-nos ser a mais precisa. Neste tipo de classificação, os diferentes
tipos de placentas são divididos em quatro grupos: placentas epitéliocoriais
(ex. equinos e suínos), placentas sindesmocoriais (ex. ruminantes),
placentas endotéliocoriais (ex. carnívoros) e finalmente placentas
hemacoriais (ex. primatas e roedores). O grau de ligação entre o epitélio
uterino e a placenta é praticamente nulo nas placentas epitéliocoriais, sendo
máximo nas placentas hemacoriais, onde o tecido uterino é modificado e
rompido pelos tecidos da placenta, sendo este fenómeno responsável pelo
sangramento que ocorre durante o parto. Quanto aos bovinos, a placenta
situa-se entre dois tipos, não sendo completamente sindesmocorial nem
epitéliocorial. Nesta espécie existe a presença de microvilosidades nas
quais o epitélio uterino persiste mas é modificado num híbrido fetomaterno formado pela migração e pela fusão das células binucleadas do
corion fetal com as do epitélio uterino (WOODING, 1992).
2.1. Células binucleadas
O elemento mais característico da placenta dos ruminantes é a
presença de células binucleadas no trofoblasto (WIMSATT, 1951). Estas
células primordialmente descritas por ASSHETON em 1906, têm sido
289
objecto de inúmeras investigações através das últimas cinco décadas
(DRIEUX e THIERY, 1951; AMOROSO, 1952; WOODING e
WHATHES, 1980; KLISCH et al., 1999). As células binucleadas derivam
das células coriónicas mononucleadas por cariocinese sem subsequente
citocinese. As células mais jovens são localizadas profundamente na
trofoderme e a sua maturação é feita progressivamente quando do seu
aparecimento na superfície materna (WOODING, 1983). As primeiras
células binucleadas aparecem imediatamente antes da implantação
(WANGO et al., 1990a), podendo ser reconhecidas a partir de 14 dias após
a fertilização nos ovinos (WOODING, 1984) e a partir do dia 17-18 nos
bovinos (WATHES e WOODING, 1980).
Após o desenvolvimento da placenta, as células binucleadas
representam
15-20%
do
total
da
população
celular
placentária
(WOODING, 1983; WOODING et al., 1986; WANGO et al., 1990b) das
quais cerca de uma em sete migram em direcção ao epitélio uterino, em
qualquer altura de gestação (WOODING et al., 1996). A migração das
células binucleadas representa um papel importante na remodelação da
estrutura da placenta, induzindo uma reacção com as células uterinas o que
pode resultar na formação de células trinucleadas de vida curta em bovinos
(WOODING e BECKERS, 1987) ou na formação de extensas placas
sinciciais em ovinos (WOODING, 1992).
No que diz respeito à sua função endócrina, na década de 40
suspeitou-se que a presença de células especiais da placenta dos ruminantes
estaria relacionada com a produção de hormonas essenciais à manutenção
da gestação. Nesta década foi provada pela primeira vez a redução da
actividade gonadotrófica da pituitária na vaca gestante, sugerindo-se que o
290
corpo lúteo fosse substituído por substâncias luteotróficas produzidas num
outro órgão qualquer. Em 1952 e 1954, respectivamente WEETH e
HERMAN e BJÖRKMAN usando micro-secções de cotilédones corados
com “periodic acid Schiff (PAS)”, descreveram a presença de numerosas
células trofoblásticas contendo glicoproteínas. Cerca de 10 anos mais tarde,
FOOTE e KAUSHIK (1963) demonstraram a presença de actividade LH
nos cotilédones. Estes estudos foram pioneiros neste campo, abrindo o
caminho para a futura identificação e caracterização de hormonas e
proteínas sintetizadas pela placenta dos ruminantes.
Actualmente é bem conhecido que as células binucleadas estão
directamente envolvidas na produção de progesterona (WANGO et al.,
1991; WANGO et aI., 1992; WOODING et al., 1996), prostaglandinas
(REIMERS
et
al.,
1985b),
hormonas
placentárias
lactogénicas
(VERSTEGEN et al., 1985; WOODING et al., 1992) e glicoproteínas
específicas ou associadas à gestação (REIMERS et al., 1985a; GOGOLINEWENS et al., 1986; MORGAN et al., 1989; ZOLI et al., 1992a;
ATKINSON et al., 1993). Estes produtos antes de serem secretados são
armazenados em grânulos densos, os quais ocupam mais de 50% do
citoplasma (LEE et al., 1986) e os quais libertam o seu conteúdo
directamente no sistema materno após a migração das células binucleadas
(WOODING, 1984).
3. Proteínas placentais
As proteínas secretadas pela placenta, após o momento em que podem
ser doseadas na circulação sanguínea materna, apresentam-se como um
óptimo indicador de gestação bem como do estado sanitário da unidade
291
feto-placentária. Contudo, apesar de muita investigação ter sida
desenvolvida sobre as funções fisiológicas destas proteínas placentais, a
exacta função da maior parte delas contínua ainda desconhecida.
É sabido, por exemplo, que nas espécies ruminantes, o interferon tau
permite a manutenção do corpo lúteo funcionando como um agente antiluteolítico (MARTAL et al., 1979), enquanto que nos primatas, esta
manutenção é assegurada pela gonadotrofina coriônica (ASCHHEIM,
1927). Além de factor anti-luteolítico, o interferon tau funciona ainda como
um factor estimulante na síntese da progesterona. Em adição a estas acções,
esta glicoproteína parece também exercer uma função importante,
principalmente nas primeiras etapas da gestação, na tolerância imunitária
do embrião/feto pela mãe (FILLION et al., 1991; MARTAL et al., 1997).
Num estado mais avançado da gestação, a placenta produz a hormona
lactogéne placental, a qual é responsável pela estimulação da actividade
mamogénica (FORSYTH, 1986), estando também envolvida, pelo menos
parcialmente, no crescimento fetal (Chene et al., 1988) e no metabolismo
materno (Freemark et al., 1992).
Os maiores grupos das proteínas placentais e os seus aspectos mais
relevantes, são discutidos a seguir.
3.1. Proteínas associadas à gestação (PAGs)
As PAGs, conhecidas com uma enorme variedade de nomes os quais
incluem “Pregnancy-Specific Protein B” (PSPB) (BUTLER et al., 1982;
LYNCH et al., 1992) e “Pregnancy-Specific Protein 60” (CAMOUS et al.,
1988; MIALON et al., 1993) foram primeiramente descritas como
antígenes placentais da placenta de bovinos, os quais estavam presentes no
292
soro sanguíneo da mãe a partir do primeiro mês de gestação. Nos últimos
20 anos, Butler, Beckers, Zoli e Xie e colaboradores (BUTLER et al. 1982;
BECKERS et al., 1988b; ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1991) identificaram
uma longa variedade desta família de glicoproteínas produzidas
especificamente pela camada celular externa da placenta das espécies
unguladas (ZOLI et al., 1992a; GREEN et al., 2000).
Usando procedimentos bioquímicos, algumas moléculas da família
das PAGs foram isoladas a partir de cotilédones de vaca (ZOLI et al.,
1991), da ovelha (ZOLI et al., 1995, XIE et al., 1997a) e da cabra
(GARBAYO et al., 1998). Após terem sido isoladas, estas moléculas foram
usadas para imunizar coelhos e o anti-soro obtido permitiu o
desenvolvimento de ensaios radio-imunológicos para a detecção de PAG
no soro sanguíneo das diferentes espécies (ZOLI et al., 1992b; RANILLA
et al., 1994; GONZALEZ et al., 1999).
O doseamento das concentrações de PAG representa actualmente um
óptimo método de diagnóstico de gestação bem como de estudo da função
do trofoblasto, podendo ajudar no maneio da reprodução bem como nos
aspectos clínicos e de investigação para determinar diferentes aspectos
patológicos que possam afectar a gestação (ZARROUK et al., 1999a,b).
3.1.1. Família das PAGs bovinas (boPAGs)
a) A boPAG-1
Após terem sido isoladas por ZOLI e colaboradores em 1991, e após a
primeira caracterização por XIE e colaboradores em 1991, diferentes
moléculas da família das PAGs foram identificadas e denominadas dum
modo arbitrário até à presente data.
293
A boPAG purificada por ZOLI et al. em 1991 e que posteriormente
passou e designar-se de boPAG-1 (XIE et al., 1995) demonstrou ser uma
proteína acídica com um peso molecular de 67 000, existindo quatro
isoformas (I, II, III e IV) com diferentes pontos isoeléctricos (4,4; 4,6; 5,2 e
5,4). O ponto isoeléctrico está directamente relacionado com a quantidade
de ácido siálico existente em cada isoforma (2,12%, 0,83%, 0,64% e
0,29%, respectivamente). Estudos imunoquímicos permitiram detectar a
boPAG-1 predominantemente no citoplasma de células binucleadas
presentes nos tecidos dos cotilédones (ZOLI et al., 1992a). A presença de
antígenes imunologicalmente idênticos à boPAG-1 foram também
encontrados em extractos de ovários e testículos (ZOLI et al., 1990), o que
justifica o adjectivo “associadas” e não “específicas” que são dadas a esta
glicoproteína.
O facto mais surpreendente da boPAG-1 após a sua purificação foi a
descoberta de que esta proteína pertence à uma família de enzimas
proteolíticas, as quais são conhecidas como proteinases aspárticas,
possuindo uma grande identidade em aminoácidos com as sequências da
pepsina, da quimosina, da catepsina D e E, da renina, da napsina e da
memapsina. Contudo, apesar de sua similaridade estrutural com outras
proteinases aspárticas (GURUPRASAD et al., 1996; XIE et al., 1997b),
esta molécula é considerada como cataliticalmente inactiva. XIE e
colaboradores (1991) demonstraram que a falta aparente da actividade
proteolítica da boPAG-1 é devida à presença de alanina (Ala-76) no local
onde normalmente existe glicina (Gly-76). Esta mutação tem como
consequência uma mudança do local da molécula catalítica da água da sua
posição simétrica normal, originando a inactividade catalítica desta
294
proteína (DAVIES, 1990).
b) A boPAG-2
Em 1994, XIE e colaboradores identificaram uma proteína coriônica
anteriormente isolada por BECKERS e a sua equipa (1988a) como sendo
um novo membro da família das proteinases aspárticas, à quaI foi dado o
nome de boPAG-2 (BECKERS et al., 1994). Esta glicoproteína foi
caracterizada
como
sendo
um
polipéptido
de
372
aminoácidos
estruturalmente semelhante à boPAG-1, à ovPAG-1 e à pepsina (com uma
sequência
de
58%,
58%
e
51%
dos
aminoácidos
idênticos,
respectivamente).
O ADN complementar da boPAG-2 é detectado a partir dos 17 dias de
gestação,
coincidindo
com
o
inicio
da
implantação.
Contudo,
contrariamenteao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 ainda não foi
purificada até à homogeneidade, não podendo ser usada para o
desenvolvimento de dosagens radio-imunológicas que permitam a sua
detecção na circulação sanguínea materna.
Contrariamente ao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 tem um
centro catalítico com uma sequência de aminoácidos idêntica a outras
proteinases aspárticas activas. Uma possível actividade proteolítica da
boPAG-2 continua, contudo, ainda por esclarecer.
c) Outras boPAGs
Até ao presente, como resultado do uso de técnicas de biologia
molecular, foram identificados 21 ADNs codificantes para diferentes PAGs
na espécie bovina (XIE et al., 1991; XIE et al., 1994; XIE et al., 1997b;
295
GREEN et al., 2000). Estas moléculas diferem em ao menos 5% em sua
sequência de nucleotídeos, sendo expressas em células mononucleadas,
binucleadas ou mesmo em ambas. Entretanto, com excepção das boPAGs –
1 e –2, ainda não foi possível isolar a maioria destas proteínas a partir de
placentas, não sendo as mesmas identificáveis na circulação periférica
sanguínea.
3.1.2. Ensaios radio-imunológicos para dosear a boPAG-1
a) Doseamento de PAG durante a gestação normal
Na prática, o anti-soro produzido em coelhos contra a boPAG-1,
PSPB ou PSP-60 tem permitido o desenvolvimento de ensaios radioimunológicos específicos para dosear estas proteínas no sangue de vacas
(SASSER et al., 1986; HUMBLOT et al., 1988ab; SASSER et al., 1989;
ZOLI et al., 1992b; MIALON et al., 1993; SKINNER et al., 1996). Uma
vez que as concentrações de PAG são mais elevadas no soro da mãe que no
do feto (ZOLI et al., 1992b), pode concluir-se que esta glicoproteína é
libertada preferencialmente no sistema materno em detrimento do do feto.
Na circulação materna, a PAG pode ser detectada ao mesmo tempo
que o trofoblasto estabelece ligações definitivas com as paredes do útero.
Desde o início da gestação até uma semana antes do parto, as
concentrações aumentam devagar e gradualmente (Figura 1). Durante o
período do parto as concentrações aumentam rapidamente atingindo
valores de 1 à 5 µg/ml alguns dias antes do parto (ZOLI et al., 1992b;
PATEL et al., 1997) (Figura 1),. As concentrações baixam após o parto,
atingindo níveis basais, indetectáveis cerca de 100 dias pós-parto (ZOLI et
aI., 1992b). O relativo longo tempo necessitado pela boPAG-1 para
296
desaparecer da circulação sanguínea materna pode ser explicada pela
elevada concentração presente no sangue matemo na altura do parto, bem
como a longa vida-média desta glicoproteína a qual está estimada em 7,4 a
9 dias (KIRACOFE et al., 1993; ALI et al., 1997). Investigações realizadas
durante o periparto demonstraram ainda a influência do ambiente maternal
e do genótipo fetal (sexo e raça) nas concentrações periféricas de boPAG-1.
De facto, as concentrações de PAG são mais elevadas na circulação
materna em cruzamentos de raças que em raças puras (GUIBAULT et al.,
1991).
Figura 1. Perfil das concentrações de PAG (média ± desvio padrão) calculados no soro
de 20 vacas coletadas do dia 20 de gestação ao dia 100 pós-parto. A remarcar
a escala aritmética das concentrações de PAG do dia 20 ao dia 220 de
gestação e a escala logarítmica do dia –40 antes do parto ao dia 80 pós-parto.
Adaptado de ZOLI et al., 1992b.
A detecção da PAG em amostras de soro ou de plasma é
correntemente usada como método para diagnósticos de gestação em
bovinos a partir dos 29-30 dias após a fecundação (SASSER et al., 1986;
297
HUMBLOT et al., 1988a; SZENCI et al., 1998a,b, 2000a,b). Os valores
preditivos positivos do doseamento de PAG para fins de diagnóstico de
gestação variam de 72% (dia 29 após inseminação artificial; SZENCI et al.,
1998b) a 93% (dia 45 após inseminação artificial; ZOLI et al., 1992b),
enquanto que os valores preditivos negativos variam de 95% a 100%
(respectivamente aos dias 29 e 45 após inseminação artificial; SZENCI et
al., 1998b).
b) Doseamento de PAG durante gestações anormais
Recentemente, ECTORS e colaboradores (1996a) demonstraram que
em programas de transferência nuclear, mesmo se a maior parte dos
bezerros apresentam pesos e tamanhos normais. Em 1999 Horta
demonstrou existir um maior crescimento do feto durante a gestação,
quando os vitelos resultam a partir de embriões produzidos in vitro. Além
do aumento do peso alguns bezerros podem apresentar anomalias
morfológicas tais como edemas do cordão umbilical com hipertrofia da
placenta, as quais são responsáveis por elevadas concentrações de boPAG1 na circulação materna. Em alguns casos, estas concentrações podem
atingir entre 9 µg a 12,35 µg/ml (ECTORS et al., 1996b).
Consequentemente, concentrações anormalmente elevadas de boPAG-1 na
circulação materna podem poderão ser um importante indício da presença
de quantidades anormais de tecidos do trofoblasto.
No caso contrário, a observação de um acentuado decréscimo nas
concentrações de boPAG-1 após monta natural, inseminação artificial,
fecundação in vitro ou clonagem podem são um forte indicativo de
disfunção placentária ou sofrimento fetal. Num estudo pioneiro, o
298
doseamento de concentrações de boPAG-1 em amostras colectadas
semanalmente após transferência de embriões produzidos in vitro permitiu
a detecção de mortes embrionárias e fetais na espécie bovina (ECTORS et
al., 1996a). O mesmo fenómeno de redução nas concentrações de PAG em
caso de abortamentos de origem infecciosa e não infecciosa foi descrito por
ZARROUK et al. (1999a,b) em cabras de origem norueguesa. Contudo,
dadas as elevadas variações nas concentrações da PAG no sangue materno,
somente uma acentuado decréscimo ou desaparecimento total da PAG pode
ser um sinal efectivo da morte embrionária ou fetal no caso de gestações
múltiplas e simples, respectivamente.
Foi demonstrada ainda que a utilização paralela da ultrasonografia
(US) e do doseamento de hormonas como a progesterona (P4) e a boPAG-1
pode revelar a ocorrência de diversos problemas frequentemente
observados em condições de campo, tais como a re-inseminação de fêmeas
já grávidas ou a administração de prostaglandina F2α no início de uma
gestação viável causando a morte do embrião ou do feto. Em ambos os
casos, os quais se traduzem em erros no maneio da reprodução, a
identificação de mortalidade embrionária ou fetal passaria despercebida
sem o uso destas técnicas, sendo considerada simplesmente como um
retorno tardio em cio.
SZENCI e colaboradores (1998a) descreveram diversas situações nas
quais o doseamento de proteínas associadas à gestação e progesterona
demonstraram ser extremamente úteis quando associadas a técnica de US.
Merecem ser citados particularmente o caso da vaca no 3129 (Figura 2), no
qual as concentrações de PAG diminuem enquanto que as concentrações de
progesterona permanecem elevadas mesmo após a ocorrência de
299
mortalidade embrionária devido à persistência do corpo lúteo; a vaca no
3369, no qual as concentrações de PAG mostram claramente que a vaca
tinha sido fecundada quando da primeira fecundação e que a realização de
uma segunda inseminação 21 dias mais tarde provocou provavelmente uma
contaminação do útero, resultando em mortalidade fetal; a vaca no 3570, na
qual o doseamento de PAG confirma a ocorrência de mortalidade
embrionária precoce indicada pela US, e por fim, o caso da vaca no 3004,
no qual as concentrações de PAG demonstram que esta vaca teria sido
inseminada num curto período após o parto (concentrações decrescentes de
PAG), e que neste caso, provavelmente o ambiente uterino não estaria
preparado para o estabelecimento de uma nova gestação.
Figura 2. Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-•-•-) e progesterona (-▲-▲-) em
4 vacas nas quais o diagnóstico de gestação inicialmente positivo (P) por
ultrasonografia foi seguido de um diagnóstico negativo (N) por
ultrasonografia ou pela observação direta da morte fetal (MF). A vaca no
3369 foi re-inseminada (I.A.) no 20o dia após a primeira inseminação.
Adaptado de SZENCI et al., 1998a.
300
3.2. Lactogénes placentais
As
lactogénes
placentais,
também
conhecidas
por
somatomamotrofinas coriónicas, são hormonas proteinaceas de origem
placental com uma parte estrutural e funcional idênticas às hormonas de
crescimento e à prolactina.
A função das hormonas lactogénes placentais varia de acordo com as
diferentes espécies. Em geral foi sugerido que estas hormonas influenciam
a mamogénese e a lactogénese (FORSYTH, 1986; BUTTLE et al., 1972),
as esteroidogéneses ovariana (GLASER et al., 1984; TELLERIA et al.,
1998) e placentária (Deayton et al., 1993), o crescimento fetal (CHENE et
al., 1988), alterando ainda o metabolismo maternal para acomodar o do
feto, contribuindo para o seu crescimento e desenvolvimento (FREEMARK
et aI., 1992).
3.2.1. Lactogéne placental bovina ou somatomamotrofina coniónica
bovina (bCS)
Estudos efectuados em hormonas placentais precederam os estudos
feitos sobre as PAGs nos ruminantes domésticos. Na espécie bovina, a
actividade lactogénica dos cotilédones foi primeiramente demonstrada por
BUTTLE e FORSYTH (1976). Este estudo pioneiro foi efectuado
recorrendo ao uso de uma co-cultura de células do tecido mamário de rata e
de tecido cotiledonar de vaca em diferentes estágios de gestação, durante
um período de 5 dias. Com este trabalho, foi obtida uma substância
lactogénica com actividade equivalente à cerca de 300 ng da actividade da
prolactina bovina. Purificações realizadas ao mesmo tempo a partir do uso
de placentas bovinas por várias equipas de investigação (BOLANDER e
301
FELLOWS, 1976; BECKERS et al., 1980; MURTHY et al., 1982)
permitiram
a
identificação
de
uma
proteína
com
actividade
somatomamotrópica, denominada mais tarde de hormona lactogène
placental (bPL) ou somatomamotrofina coniónica bovina (bCS).
A
bPL
é
produzida
pelas
células
coriónicas
binucleadas
(VERSTEGEN et al., 1985; KAPES et al., 1992), as quais libertam os seus
productos para a circulação materna após sua migração e fusionamento
com células do epitélio endometrial (BECKERS, 1983). Em contraste com
outras lactogénes placentais, a PL bovina é uma glicoproteína que contém
n-ligandos e o-ligandos oligosacarídeos (SHIMOMURA e BREMEL,
1988; BYATT et al., 1987). Esta composição glicoproteica, característica
também de outras proteínas placentais tais como a boPAG pode resultar
dum mecanismo post translacional altamente desenvolvido o qual foi
identificado existir nas células gigantes do trofoblasto de bovinos
(GOGOLIN-EWENS et al., 1986).
A PL bovina é detectada na circulação materna a partir do quarto mês
de gestação (BECKERS, 1983) mas a sua concentração permanece inferior
a 2 ng/ml durante a gestação (Figura 3). Na circulação periférica do feto a
concentração de bPL é mais elevada (5-25 ng/mI) apresentando um
declínio com o avanço da gestação (BECKERS et al., 1982; BYATT et al.,
1987). Estas concentrações fetais vs maternais de bPL são bastante
diferentes das observadas para a boPAG-1, apesar da co-localização de
ambas as proteínas placentais nas mesmas células.
Nos bovinos o crescimento da glândula mamária parece ser, pelo
menos parcialmente controlada por hormonas de origem placental, tais
como a bPL. O crescimento do bezerro e o peso da placenta estão
302
positivamente relacionados com a produção de leite na Iactação seguinte
(ERB et aI., 1980; COLLIER et al., 1982).
Figura 3. Perfil das concentrações plasmáticas da hormona lactogéne placental bovina
doseada em vacas e em fetos. Adaptado de BECKERS et al., 1982.
3.3. Proteínas associadas ao sinal embrionário
Em algumas espécies, mesmo antes da implantação, o embrião produz
alguns “sinais” os quais são reconhecidos pela mãe inibindo a luteolise e
induzindo a transformação do corpo lúteo cíclico num corpo lúteo
gravídico. Dentro destes sinais, pode ser referida a gonadotrofina coriónica
(GC), um factor luteotrófico produzido pelas placentas dos humanos e dos
equinos, e o interferon tau, bem como o factor anti-luteolítico responsável
pela permanência do corpo lúteo nas espécies ruminantes.
303
3.3.1. Gonadotrofina coriónica (GC)
As espécies humana e equina são conhecidas, desde há muito tempo,
como produtoras, ao nível placentário, de hormonas gonadotróficas. Já em
1927, ASCHHEIM relatou a presença dum factor gonadotrófico na urina da
mulher grávida, baseando neste facto o seu famoso método de detecção de
gravidez (ASCHHEIM e ZONDEK, 1928a,b). Dadas as suas propriedades,
este factor gonadotrófico foi mais tarde chamado de gonadotrofina
coriónica humana (hCG). Dois anos mais tarde, COLE e HART (1930)
demonstraram existir actividade gonadotrófica no soro de éguas gestantes.
Esta gonadotrofina, vulgarmente conhecida por PMSG, após uma melhor
caracterização passou a ser denominada de gonadotrofina coriónica equina
(eCG).
Uma substância possuidora de uma actividade do tipo LH foi isolada
pela primeira vez a partir de extractos cotiledonários fetais bovinos por
FOOTE e KAUSHIK (1963). A partir desta época, numerosas equipas
(AILENBERG e SHEMESH, 1983; BECKERS et al., 1988a) tentaram
purificar e caracterizar um equivalente da gonadototrofina coriônica na
espécie bovina. Em especial, foi parcialmente purificada uma substância
com grande actividade LH, e a qual não apresentou reacções cruzadas com
anti-soro anti-LH bovino (BECKERS et al., 1988a). Entretanto, apesar das
numerosas tentativas feitas durante várias décadas, não foi possível isolar e
caracterizar (sequência de aminoácidos) a molécula teoricamente
responsável pela actividade gonadotrópica observada na placenta de fêmeas
bovinas.
A questão da existência ou não de uma substância gonadotrófica na
placenta de bovinos somente foi parcialmente elucidada em 1994 por XIE e
304
colaboradores, os quais demonstraram que o ADN complementar
correspondente à “gonadotrofina coriônica” isolada em bovinos por
BECKERS e colaboradores (1988a) correspondia, na verdade, a uma nova
forma de protease aspártica pertencente a família das PAGs (boPAG-2).
Uma outra resposta a esta questão foi dada por NILSON e colaboradores
(1991), os quais mostraram que a expressão de genes codantes para a subunidade alfa, essencial à atividade luteotrópica do LH e das GCs, seria
possível no tecido hipofisário de todas as espécies de mamíferos, mas
restrita às placentas de equinos e primatas. Com base em ambos
argumentos, pode ser deduzido que actividade coriónica previamente
detectada em extractos placentários de bovinos pelo uso de dosagens
baseadas em radio-receptores (LH) seria devida a uma activação nãoespecífica de receptores LH, e não à existência de gonadotrofinas
coriônicas nesta espécie.
3.3.2. Interferon tau
Nos ruminantes domésticos, a produção ovárica de progesterona é
requerida durante cerca de 55 dias nas ovelhas sendo este período pelo
menos 165-180 dias nos bovinos (ESTERGREEN et al., 1967). Nos
caprinos a progesterona ovárica é produzida até ao final da gestação. Nestas
espécies, a transformação do corpo lúteo ciclico em gravídico parece ser
induzida pela acção de um factor proteináceo sintetizado pelo concepto
próximo à sua implantação. Este factor a que primeiramente se denominou
trofoblastina (MARTAL et al., 1979) ou proteína trofoblástica (GODKIN
et al., 1984) foi recentemente designado como uma subclasse distinta da
família do interferon alfa ao qual se designou interferon tau (CHARPIGNY
305
et al., 1988).
Os primeiros estudos que demonstraram a presença dum factor antiluteolítico produzido pelo concepto de ruminantes foram realizados por
MOOR e ROWSON (1966), os quais transferiram embriões de ovino com
14-16 dias a fêmeas não-gestantes antes do 12o dia do ciclo sexual,
observando a manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual.
No ano seguinte, os mesmos autores homogeneizaram embriões de ovinos
com 14-16 dias e injectaram o homogeneizado no útero antes do 12° dia do
ciclo sexual, obtendo-se resultados idênticos: a manutenção do corpo lúteo
e a interrupção do ciclo sexual. Este fenómeno não foi contudo observado
quando os embriões usados tinham entre 21-23 dias de idade.
NORTHEY e FRENCH (1980) bem como HUMBLOT e DALLA
PORTA (1984) fizeram experiências idênticas na vaca. Transferiram
embriões entre 15-17 dias de idade ou os seus homogeneizados para
recipientes durante os primeiros 16 dias do ciclo sexual obtendo a
manutenção do corpo lúteo.
O interferon tau é o principal produto secretado pelo concepto bovino
entre os dias 16 e 25 pós-fecundação, alterando a libertação uterina de
PGF2α, o que resulta na manutenção do corpo lúteo responsável pela síntese
de progesterona no início da gestação. O mecanismo de ação do interferon
tau inclui a inibição dos receptores para estradiol com uma consequente
redução dos receptores para oxitocina, a activação do inibidor da ciclooxigenase e o favorecimento da síntese de PGE em detrimento da síntese
de PGF2α (HANSEN et al., 1999). Apesar de ser um importante produto de
secreção, esta molécula é libertada localmente no lúmen uterino, não
podendo ser detectada na circulação periférica materna.
306
3.3.3. Factor precoce de gestação (EPF)
O factor precoce de gestação foi primeiramente descoberto nos
primeiros estágios de gestação por Morton e colaboradores em 1974.
Colocado em evidência pelo teste de inibição da roseta, o EPF foi
considerado como sendo um importante factor imunosupressor responsável
pela tolerância imunológica do concepto pelo sistema imunológico
materno.
Recentemente
CAVAGNAGH
e
MORTON
(1994)
caracterizaram o EPF como sendo na verdade uma chaperonina 10, a qual
poderia ser a molécula responsável pela inibição da formação de rosetas, e
por consequência, possuidora de uma forte acção imunosupressora local
(MORTON et al., 1992; MORTON, 1998). Apesar da precocidade
atribuída ao aparecimento do EPF, a utilização do teste de inibição da
roseta para fins de diagnóstico de gestação em diversas espécies não tem
sido considerada como fiável (CHAOUAT e MENU, 1993).
4. Agradecimentos
Este trabalho representa parte de estudos financiados pela FNRS e
IRSIA belgas (J.F. Beckers). A fundação Luso-Americana para o
desenvolvimento (Projecto 858/2000) financiam parcialmente os trabalhos
de F. Moreira da Silva (Portugal) desenvolvidos neste domínio. A autora
N.M. Sousa é financiada pela CAPES brasileira.
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d’une glycoprotéine associée à la gestation chez la brebis. Ann. Méd. Vét., 139: 177184.
317
Apêndice 4
SOUSA, N.M., REMY, B., EL AMIRI, B., FIGUEIREDO, J.R., BANGAMBOKO, H., GONÇALVES, P.B.D. & BECKERS, J.F. Characterization of
Pregnancy-Associated Glycoproteins extracted from zebu (Bos indicus)
placentas removed at different gestational ages. (submetido à Reproduction,
Nutrition, Development)
318
Characterization of Pregnancy-Associated Glycoproteins Extracted
from Zebu (Bos indicus) Placentas Removed at Different Gestational
Periods
SOUSA, N.M.1, REMY, B.2, EL AMIRI, B.2, FIGUEIREDO, J.R.1,
BANGA-MBOKO, H.2 GONÇALVES, P.B.D.1 & BECKERS, J.F.2
1
Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Brazil
2
Physiology of Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of
Liège, Belgium
Abstract
The pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) constitute a large family
of aspartic proteinases expressed in the outer epithelial cell layer of the
Artyodactyla placenta. In the present work, two biochemical approaches
were used to characterize PAGs isolated from Bos indicus fetal cotyledons.
The first procedure, used to isolate PAG from zebu placenta removed late
in pregnancy, included extraction of proteins at neutral pH, acidic and
ammonium
sulfate
precipitations,
anion
and
cation
exchange
chromatographies. The second procedure, used to investigate PAG in
placentas removed at early and mid gestational periods, included protein
extractions at acid or alkaline pH followed by pepstatin-agarose affinity
chromatography. A bovine PAG radioimmunoassay was used to monitor
the immunoreactivity throughout the isolation procedures. The most
immunoreactive fractions issued from cation exchange and affinity
319
chromatographies were analyzed by SDS-PAGE and Western blot, before
transfer to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane for NH2microsequence determination. In the first protocol, PAG was mainly eluted
at NaCl concentrations of 0.04, 0.08 and 0.16 M in DEAE-Sephadex
column. After CM ceramic chromatography of all except 0.32 M NaCl
DEAE fraction, the most immunoreactive proteins revealed N-terminal
amino acid sequences (10 to 25 aa long) which were 100% identical to
bovine PAG-1. The same sequence (14 aa long) was found after pepstatinagarose affinity chromatography of proteins extracted from placentas
removed earlier in pregnancy. These results converged towards the
expression of one major N-terminal PAG amino acid sequence in zebu
placentas at different gestational ages.
Key words: pregnancy, trophoblast, placenta, reproductive technology
Caractérisation des protéines associées à la gestation extraites du
placenta de zébu recueilli à différentes périodes gestationnelles
Résumé - Dans le présent travail, deux approches biochimiques ont été
utilisées pour caractériser les PAGs isolées à partir de cotylédons fœtaux
recueillis à différents stades gestationnels chez le zébu (Bos indicus). Le
premier procédé impliquait des précipitations acides et au sulfate
d’ammonium et des chromatographies par échange d’anion et de cation
tandis que le second reposait sur l’utilisation d’une chromatographie
d’affinité de pepstatine-agarose. Un dosage radioimmunolgique était utilisé
pour suivre l’immunoréactivité des fractions au cours des différentes étapes
de purification. Les fractions les plus immunoréactives issues des
320
chromatographies par échange d’ion et affinité ont été analysés par
électrophorèse en SDS et Western Blot avant transfert sur membrane de
polyvinylidene difluoride (PVDF) pour micro séquençage de la partie Nterminale. Par comparaison des électrophorèse en SDS et Western Blot,
différents isoformes de masses moléculaires apparentes allant de 51 à 69
kDa et de points isoélectriques compris entre 4,4 et 6,7 ont été identifiées à
partir des placentas recueillis aux différentes époques gestationnelles. Le
micro séquençage de la partie N-terminal (10 à 25 acides aminés) indique
l’expression d’une seule séquence N terminal correspondant à celle décrite
pour la PAG-1 de Bos taurus.
protéines associées à la gestation / purification / zébu / placenta / micro
séquençage N-terminal
1. Introduction
Recently, a polymorphic family of placenta-expressed proteins has
been discovered in ruminant species. These pregnancy-associated
glycoproteins (PAGs), also known as pregnancy-specific protein B (PSPB)
(BUTLER et al., 1982) and pregnancy serum protein (PSP-60) (CAMOUS
et al., 1988), constitute a large family of aspartic proteinases, showing a
greatest sequence identity with pepsinogens (XIE et al., 1991). PAGs are
synthesized by mono and/or binucleate trophoblastic cells, some of them
being released in maternal circulation during almost the whole pregnancy
period (SASSER et al., 1986; ZOLI et al., 1992; MIALON et al., 1993). In
veterinary practice, the measurement of the PAG concentrations in
maternal blood is useful for both pregnancy confirmation and follow-up of
321
the trophoblastic function. The first aspect can help breeders in the
management of reproduction, while the second concerns more specifically
clinicians and researchers in their investigation to establish differential
diagnosis of pathologies affecting pregnancy (SOUSA et al., 2001).
Two approaches have been used for PAG characterization in ruminant
placentas: biochemistry and molecular biology. Biochemical procedures
allowed the isolation of different PAG molecules, heterogeneous in
molecular weight and charge (BUTLER et al., 1982; XIE et al., 1997a;
GARBAYO et al., 1998). Further characterization of these molecules by
means of NH2-terminal amino acid sequencing revealed the existence of
one PAG in cows (boPAG67), four in ewes (ovPAG55, ovPAG60, ovPAG61
and ovPAG65) and three in goats (caPAG55, caPAG59 and caPAG62) (ZOLI
et al., 1991; XIE et al., 1997a; GARBAYO et al., 1998). By use of
molecular biology techniques, a larger variety of PAG cDNAs has been
identified in bovine (boPAG-1 to –21), ovine (ovPAG-1 to –9) and caprine
placental libraries (caPAG-1 to –11) (XIE et al., 1997a,b; GREEN et al.,
2000; GARBAYO et al., 2000). As described by GREEN et al. (2000),
these PAG cDNAs appear to be differentially expressed in early, mid and
late gestational periods. However, in spite of several attempts in order to
purify the different PAG molecules identified by nucleotidic sequencing,
only two PAGs (boPAG67 and ovPAG65) could be successfully shown by
both approaches (ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1997a).
In this paper we describe the isolation, characterization and Nterminal microsequencing of PAG molecules extracted from zebu placenta
removed at different gestational ages. The biochemical protocol previously
described for PAG isolation in ruminant species was used to purify and
322
characterize PAG extracted from placentas removed late in pregnancy. In
placentas
removed
earlier
in
pregnancy,
a
pepstatin
affinity
chromatography was used for the first time in order to enrich the
preparations in PAG molecules before N-terminal microsequencing of
immunoreactive proteins.
2. Materials and Methods
2.1. Assays for total protein and PAG-immunoreactivity
Total protein (TP) concentrations of all the fractions were determined
by using the method of LOWRY et al. (1951) with bovine serum albumin
(BSA; ICN Biochemicals Inc., Aurora, OH) as standard. The estimation of
PAG concentrations in each purification step was determined by a bovine
PAG-1 radioimmunoassay (boPAG-1 RIA; ZOLI et al., 1992). Pure
boPAG-1 (ZOLI et al., 1991) was used as tracer and standard, and antibody
(R497) against boPAG-1 was used for binding at a final dilution of 1:300
000.
2.2. Collection of cotyledons
Uteri were collected from pregnant zebu (Bos indicus) females within
5-30 min of slaughter. Fetal cotyledons were immediately dissected away
from caruncular tissue, washed with 0.9% NaCl, and stored at –20°C until
use. The stage of pregnancy was estimated by measurement of fetal crownrump length. According to gestational age, placentas were classified as
early (10-11 wk), middle (20-21 wk) or late placentas (30-31 wk). Figure 1
shows schematically the protocols of fractionation of proteins extracted
323
from zebu placentas.
2.3. Protocol 1
2.3.1. Protein Extraction
Approximately 1 920 g of fetal cotyledons from late placentas were
thawed, finely minced, and homogenized (7 X 2 min) with a hand mixer in
10 mM potassium phosphate buffer (KH2PO4 + KCl, 100 mmol, pH 7.6)
with a ratio of buffer to tissue of 3.5:1 (v/w). Leupeptin (0.001 mmol),
PMSF (0.2 mmol), sodium EDTA (0.2% w/v) and NaN3 (0.02% w/v) were
added at the time of homogenization. The homogenate was stirred at 4°C
for 2 hours, then it was centrifuged at 27 000 X g for 1 h. The pellet
obtained after the first centrifugation was homogenized in 4 liters of the
same buffer (10 mM potassium phosphate), gently stirred overnight, and
centrifuged at 27 000 X g for 1 h. The second supernatant, as the first, was
retained and the pellet was discarded.
2.3.2. Acid Precipitation
Supernatants from the first and second extractions were collected
together. The supernatant solution (35 924 mg of protein) was adjusted to
pH 4.5 with 1 M H3PO4, stirred for 5 min and then allowed to precipitate at
4°C for 2 hours. Afterwards, the sample was centrifuged at 27 000 X g for
1 h, and the pellet was discarded. Its pH was readjusted to 7.6 with 1 M
KOH.
324
Fetal cotyledons
Protocol 1
Protocol 2
Protein extraction at neutral pH
Protein extraction at acid or alkaline pH
Isolation
Acid precipitation
40-80% AS precipitation
DEAE Sephadex A25
Pepstatin-agarose affinity chromatography
Characterization
CM Ceramic of all DEAE fractions
One-dimensional SDS-PAGE
Coomassie Blue staining
Western blot
Two-dimensional SDS-PAGE
FIGURE 1-
N-terminal amino acid
sequencing
Schematic outline of PAG purification from zebu placentas removed in
late (Protocol 1), middle or early (Protocol 2) gestational periods.
2.3.3. Ammonium Sulfate Precipitations
The proteins (20 236 mg) were precipitated by ammonium sulfate
(AS) at 40% saturation for 16 h. After centrifugation (27 000 X g for 1 h),
ammonium sulfate was added to the supernatant to achieve 80% saturation.
After an overnight precipitation, the solution was centrifuged at 27 000 X g
for 1 h 30 min. The pellet (3 855 mg of protein) was resuspended in 500 ml
of Tris-HCl buffer (10 mmol, pH 7.6), extensively dialyzed against the
same buffer (48 h) and centrifuged (36 000 X g for 30 min) to eliminate
325
insoluble proteins.
2.3.4. Anion-Exchange Chromatography
The fraction isolated by 40-80%-saturated ammonium sulfate was
loaded on a 14 X 18-cm diethylaminoethyl (DEAE) Sephadex A25
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) column which had
previously been equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6). Five
steps of increasing ionic-strength buffer (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 and 0.32 M
NaCl) were used for the elution of the column. All the fractions from
DEAE-Sephadex
chromatography
were
concentrated
(Amicon
Ultrafiltraton System; Danvers, MA) to a final volume of 200 ml,
extensively dialyzed against 5 mM ammonium bicarbonate (pH 8) and
lyophilized.
2.3.5. Cation-Exchange FPLC
Approximately 200 mg from each DEAE step was chromatographed
separately on a 1 X 3-cm CM Ceramic HyperD F column (BioSepra,
Cergy-Saint Christophe, France) previously equilibrated in 10 mM
ammonium acetate (pH 5.2). After elution of the unbound proteins, a linear
salt gradient (0-0.5 M NaCl) was applied at a flow rate of 1.5 ml/min.
Fractions of 3 ml were collected and monitored by UV absorption at 280
nm. Fractions of each peak were pooled, extensively dialyzed (36-48 h)
against 5 mM ammonium bicarbonate (pH 8), centrifuged at 36 000 X g for
30 min and lyophilized.
326
2.4. Protocol 2
2.4.1. Protein Extraction
Fetal cotyledons from early (553 g) and middle (890 g) gestational
ages were thawed, finely minced, and homogenized (7 X 2 min) with a
hand mixer in 50 mM ammonium bicarbonate buffer (pH 8.5) or 300 mM
KCl solution (pH 5), respectively. The ratio of buffer to tissue was 3.5:1
(v/w). Leupeptin (0.001 mmol), PMSF (0.2 mmol), sodium EDTA (0.2%
w/v) and NaN3 (0.02% w/v) were added at the time of homogenization. The
homogenates were stirred at 4°C for 4 hours, then they were centrifuged at
27 000 X g for 1 h and the pellets were discarded. The supernatant
solutions containing soluble proteins (2 405 and 12 096 mg, respectively)
were exchanged into 5 mM sodium acetate buffer (pH 5.2) by means of
Sephadex G-25 filtration (Pharmacia) and concentrated by ultrafiltration to
60 and 1 000 ml, respectively.
2.4.2. Affinity Column Chromatography
Approximately 800 and 500 mg (20 and 40 ml) of crude extract
placental proteins from early and middle gestational ages were loaded
separately on a 1 x 4-cm pepstatin-agarose column (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO) previously equilibrated with 50 mM sodium acetate (pH
5.2). After loading, the column was washed with the equilibration buffer
until the optical density (OD) at 280 nm decreased below to 0.05. After the
application of a linear salt gradient (0 to 1 M NaCl) to elute the weakly
bound proteins, a linear pH gradient (5.2-10) was applied at a flow rate of
0.5 ml/min. Fractions of 1.0 ml were collected and monitored by
327
spectrophotometry at 280 nm. Fractions from a same peak were pooled,
extensively dialyzed (36-48 h) against 5 mM ammonium bicarbonate (pH
8), centrifuged at 36 000 X g for 30 min and lyophilized.
2.5. Gel electrophoresis
One-dimensional
sodium
dodecyl
sulfate-polyacrylamide
gel
electrophoresis (SDS-PAGE) were carried out with and without
mercaptoethanol (5%) on a vertical cell system. Slab gels (12%
acrylamide) were run at 20 mA during the migration in the stacking gel and
at 40 mA (6h) in the separating gel (20 X 10 X 0.2 cm). Molecular weight
standards (LMW Electrophoresis Calibration Kit; Pharmacia) were run
simultaneously. Proteins were either visualized after Coomassie Brilliant
Blue R250 (Merck, Darmstad, Germany) staining or transferred onto a
nitrocellulose membrane (Hybond ECL, Pharmacia) for Western blotting.
Two-dimensional gel electrophoresis were performed by using pH 310 Immobiline Drystrips (11 cm, Pharmacia) for the first dimension,
followed by SDS-PAGE (12%) in the second dimension. After an
overnight hydration in a Immobiline DryStrip Reswelling Tray
(Pharmacia), focusing was carried out at 300 V for 30 min, 1 000 V for 30
min, 1 550 V for 16 h min and then at 1 850 V for 1 h in a Flat Bed
Apparatus (FBE-3000, Pharmacia). Proteins were transferred to 0.2 µm
polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes (Bio-Rad, Richmond, CA)
on a 2117 Multiphor II Apparatus (Pharmacia). Transfer was carried out at
constant voltages (12 V for 45 min and 36 V for 45 min).
328
2.6. Immunoblotting of transferred proteins
Proteins in the slab gel were transferred onto nitrocellulose membrane
immediately after one-dimensional SDS-PAGE, essentially as described by
TOWBIN et al. (1979). Transfer was carried out at a constant current of 24
mA for 1 h and then at 36 mA overnight (Multiphor II Apparatus;
Pharmacia). After protein visualization with Ponceau S (Merck),
nitrocellulose membranes were washed with Trisbuffered saline (TBS, pH
7.6) containing 3% BSA (3 X 10 min at 37°C), and then incubated
separately (3 h at 37°C) with three different rabbit antisera raised against
bovine (boPAG-1; R497) or caprine PAGs (anti-caPAG55+62 and
caPAG55+59; R706 and R708, respectively). Antisera were used at a dilution
of 1:200 in a mixture of PAG-serum free and TBS containing 1% BSA
(24:75 v/v). After incubation, the membranes were washed with TBS
containing 1% BSA (3 X 10 min at 37°C) and incubated (2 h at 37°C) with
sheep anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HPR-POD; Chemicon
International Incorporation, Temecula, CA) diluted at 1:2 000 in TBS
containing 1% BSA. After the second incubation, nitrocellulose paper was
washed with TBS (4 X 10 min at 20°C) and the peroxidase substrate (100
ml TBS, 100 µl H2O2, 20 ml methanol and 60 mg chloronaphthol; 15 min
at 0°C) was added to visualize the antigen-antibody complexes.
2.7. NH2-terminal microsequence analysis
The NH2-terminal amino acid (aa) sequences of the blotted proteins
were determined by the Edman degradation method on a pulse liquid-phase
protein sequencer (Procise 492 Applied Biosystems, Foster City, CA). The
329
sequences obtained were compared to known protein sequences in the
Swiss-Prot, Trembl and TremblNew data banks by the Fasta 3 search
program (PEARSON and LIPMAN, 1988).
3. Results
3.1. Isolation and characterization of PAG extracted from zebu
placenta collected in late pregnancy
As determined by RIA, PAG-like proteins represented approximately
0.93% of the total soluble proteins extracted from 30-31-wk zebu
placentas. Immunoreactive proteins (334.5 mg) were extracted from fetal
cotyledons by homogenization treatment and remained in the supernatant
after pH acidification (294.0 mg). After ammonium sulfate precipitation at
0%-40% and 40%-80% saturation, immunoreactive proteins represented
0.44% (0.76 mg) and 7.91% (304.91 mg) of the total soluble proteins,
respectively. As shown in Table 1, the 40%-80% ammonium sulfate
fraction bound quantitatively to the DEAE column at pH 7.6.
Immunoreactive proteins were mainly eluted at NaCl concentrations of
0.04, 0.08 and 0.16 M (17.64%, 45.96% and 20.56% of total DEAE PAGlike activity, respectively). Despite the relatively low PAG:TP ratio of the
other DEAE steps, all the fractions were treated by cation exchange
chromatography.
Fast protein liquid chromatography (FPLC) profiles on CM ceramic
column were shown in Figure 2. One single immunoreactive peak was
observed for all DEAE fractions loaded. A major peak of PAG (eluted at
NaCl concentrations of 0.14 to 0.18 mol) was observed for both 0.04 and
330
0.08 M NaCl DEAE fractions. Minor reactive peaks (eluted at NaCl
concentrations of 0.21 to 0.41 mol) were observed for the other steps of
DEAE. The molecular weight and isoeletric points of the highly
immunoreactive proteins from CM ceramic chromatographies are described
in Table 2.
TABLE 1 -
Quantity of immunoreactive PAG and total protein (TP) of the
fractions eluted from the DEAE-Sephadex A25.
DEAE fraction
(NaCl
concentration)
PAGa (mg)
TPb (mg)
PAG:TP ratio
0M
8.33
282.7
2.95%
0.02 M
5.63
114.6
4.91%
0.04 M
30.74
176.3
17.44%
0.08 M
80.07
292.9
27.34%
0.16 M
35.78
666.0
5.37%
292.4
2.56%
0.32 M
7.49
Determined by boPAG-1 RIA
a
b
Determined by Lowry method as BSA equivalent.
CM ceramic highly immunoreactive peaks from all DEAE fractions
gave several stained bands after SDS-PAGE (Figure 3A). The major band
of each peak was immunoreactive by Western blotting analysis with the use
of anti-boPAG-1 antiserum (R497; Figure 3B). A similar reactivity was
observed when using anti-caPAG55+62 (R706) and anti-caPAG55+59 (R708)
331
antisera (data not shown). Reduction with β-mercaptoethanol had no effect
on apparent molecular masses of major-stained bands (data not shown).
Non-absorbed
0.02 M
22.9
41.2
0.04 M
>100%
0.08 M
>100%
0.16 M
0.32 M
29.4
64.6%
FIGURE 2 - FPLC CM ceramic chromatography profiles of all DEAE fractions (0,
0.02, 0.04, 0.08, 0.16 and 0.32 M NaCl). The column (1 x 3 cm) was
previously equilibrated in 10 mM ammonium acetate buffer, pH 5.2.
The black lines indicate the salt gradients and the stippled areas indicate
the most immunoreactive fractions. Percentages indicated by arrows
give the PAG:total protein ratio, as determined by RIA (PAG) and
Lowry (TP).
332
TABLE - 2
DEAE
fraction
origin
Electrophoretic characteristics and N-terminal microsequence identities of
the highly immunoreactive proteins isolated after CM ceramic
chromatography of DEAE fractions.
MW of major stained bands*
Coomassie
Blue
Western
Blot
pIs of major
reactive
proteins**
Identity at the
N-terminal aa sequence
0M
51 kDa
50 kDa
6.4, 6.6, 6.7
boPAG-1 (10 aa)
0.02 M
62 kDa
56 kDa
5.2, 5.5
boPAG-1 (10 aa)
0.04 M
66 kDa
67 kDa
5.1, 5.2, 5.4
boPAG-1 (25 aa)
0.08 M
67 kDa
71 kDa
5.0, 5.1, 5.2, 5.3
boPAG-1 (25 aa)
0.16 M
67 kDa
60 kDa
67 kDa
-
4.4, 5.0, 5.5, 6.0
5.8, 6.1, 6.3, 6.4
boPAG-1 (10 aa)
-
α-N-acetylgalactosaminidase (12 aa)
*Molecular weights (MW) were estimated after one-dimensional SDS-PAGE.
**Isoeletric points (pIs) were estimated after two-dimensional SDS-PAGE.
0.32 M
62 kDa
62 kDa
3.2. N-terminal amino acid sequence analysis of immunoreactive
proteins extracted from zebu placenta collected late in pregnancy
The major-stained SDS-PAGE proteins corresponding to the
immunoreactive Western Blot bands had their amino-terminal sequences
determined. After CM ceramic chromatography of 0.04 and 0.08 M NaCl
DEAE
fractions,
the
immunoreactive
bands
revealed
the
RGSXLTTHPLRNIKDLVYMG amino acid sequence, corresponding to
the amino terminus of boPAG-1 (Swiss-Prot database accession number
Q29432). N-terminal microsequencing (10 aa) of immunoreacive bands
from 0, 0.02 and 0.16 M NaCl DEAE fractions also revealed 100%
sequence identity with boPAG-1.
333
FIGURE 3 - A) Coomassie Blue-stained SDS-PAGE (12%); B) Western-Blot
analysis with antiserum anti-boPAG-1 (R497). Lanes 1, 2, 3, 4 and 5
correspond to the most immunoreactive peaks from CM ceramic
chromatography of 0, 0.02, 0.04, 0.08 and 0.16 M NaCl DEAE
fractions. Twenty micrograms of each CM ceramic peak were loaded on
each lane. Molecular weights (x 10-3) are indicated on the left and right
sides of the figure.
Two-dimensional gel electrophoresis analysis showed that each
immunoreactive band was composed by several proteins with different
isoeletric points (Table 2). Microsequencing of the N-terminus (20 aa) of
the four major spots corresponding to the immunoreactive 67 kDa band
from the 0.08M NaCl fraction (data not shown) confirmed the presence of a
single amino acid sequence.
Despite a relatively high PAG:TP ratio (65.55%) observed for the
most immunoreactive peak obtained after CM ceramic chromatography of
0.32 M DEAE fraction, N-terminal microsequence of the 62 kDa protein
(Figure 4) revealed the LENGLLRKPPMG sequence, which has high
334
sequence identity (91.7 %) with murine alpha-N-acetylgalactosaminidase
(Swiss-Prot database accession number O88620).
FIGURE 4 - Two-dimmensional electrophoresis of the most immunoreactive peak
from CM ceramic chromatography of 0.32 M NaCl DEAE fraction.
Molecular weights (x 10-3) are indicated in the right side. The pH scale
is indicated at the top of the gel. Arrows indicate the different charged
isoforms (6.4, 6.3, 6.1 and 5.8) of alpha-N-acetylgalactosaminidase.
3.3. Characterization of PAG isolated by means of pepstatin-agarose
affinity chromatography
As estimated by RIA, PAG-like proteins represented approximately
1.81% (43.57 mg) and 0.61% (73.73 mg) of total proteins extracted from
10-11 wk and 20-21 wk gestational age zebu placenta at alkaline (pH 8.5)
and acid (pH 5) conditions, respectively. Crude extracts from 10-11 wk old
zebu placenta gave several peaks after chromatography on a pepstatinagarose column (Figure 5). The most immunoreactive peak showed a low
PAG:TP ratio (3.26%), being eluted at NaCl concentrations of 0.19 to 0.42
335
mol. After pH gradient application (5.2-10) no proteins were eluted. SDSPAGE analysis revealed the presence of a single major stained protein with
apparent molecular masse of 69 kDa and several weak stained bands
ranging from 20 to 84 kDa (Figure 6A, lane 2). After Western Blot, major
immunoreactive bands were observed at 69 kDa and 84 kDa (Figure 6B,
lanes 2). Analyzed in two-dimensional electrophoresis the 69 kDa protein
gave 3 isoeletric variants with pIs of 3.1, 3.3 and 6.18. Microsequencing of
the 14 N-terminal aa of this protein showed 100% identity with the
boPAG-1. Despite the high immunoreactivity observed with use of bovine
R497 and caprine R706 and R708 antisera, the 84 kDa protein revealed the
DKNAYGIDLIL sequence, which shows 77.78% identity with the alkaline
metalloproteinase (GenBank database accession number AAK22731)
identified in the Caulobacter crescentus genome.
10-11 wk
20-21 wk
3.3%
15.7%
FIGURE 5 - Pepstatin-agarose chromatographic elution profiles of proteins extracted
from placentas removed at 10-11 wk and 20-21 wk of gestation. The
column (1 x 3 cm) was previously equilibrated with 50 mM sodium
acetate (pH 5.2). The black lines indicate the salt gradients and the
stippled areas indicate the most immunoreactive fractions. Percentages
indicated by arrows give the PAG:total protein ratio, as determined by
RIA (PAG) and Lowry (TP).
336
FIGURE 6 - A) Coomassie Blue-stained SDS-PAGE (12%); B) Western-Blot
analysis with antiserum anti-boPAG-1 (R497), anti-caPAG55+62 (R706)
and caPAG55+59 (R708). Lanes 1 and 2 correspond to the most
immunoreactive peaks from pepstatin-agarose affinity chromatography
of proteins extracted from of placentas removed at 20-21 wk and 10-11
wk of gestation. Sixty micrograms of each immunoreactive peak were
loaded on each lane. Molecular weights (x 10-3) are indicated on the left
and right sides of the figure.
4. Discussion
In the last two decades, the biochemical isolation of pregnancyassociated or specific proteins constituted a fundamental step for the
development of specific RIA systems applicable for pregnancy diagnosis in
ruminant species. By means of multiple step purification procedures,
several PAG molecules differing in molecular masses and charges were
isolated from placentas of cows (BUTLER et al., 1982; CAMOUS et al.,
1988; ZOLI et al., 1991), ewes (WILLARD et al., 1995; XIE et al., 1997a),
goats (GARBAYO et al., 1998), moose and elk (HUANG et al., 1999),
some of them being characterized at their N-terminal amino acid sequence.
337
However, at our knowledge, no publication was made on placental proteins
extracted from zebu placentas.
In the first part of this study, a protocol including extraction of soluble
proteins, acid and ammonium sulfate precipitations and ion exchange
chromatographies was used to purify PAG molecules extracted from zebu
placentas collected at the third trimester of pregnancy. Considered by some
authors as unnecessary (HUANG et al., 1999), acid precipitation
constituted a critical step for PAG purification in zebu taxa. It allowed the
elimination of more than 40% (approximately 16 g) of total crude extract
soluble proteins with an optimal recovery of immunoreactive proteins
(approximately 294 mg, corresponding to 88% of the initial PAG
immunoreactivity). If the pH treatment is responsible for elimination of
some PAG isoforms extracted from ruminant placenta is not known.
Nevertheless, the utilization of a similar purification protocol including
acid precipitation in caprine species allowed the isolation of three distinct
PAGs with different molecular masses, each containing several isoforms
(GARBAYO et al., 1998).
As recently described, ion exchange chromatography has been proved
to be very effective for separation of different PAG molecules extracted
from goat and sheep placental tissues. In caprine species for example, after
DEAE chromatography, immunoreactive proteins were equally apportioned
between the 0.04 M and 0.08 M NaCl fractions. Further fractionation of
these steps revealed the presence of a common 55 kDa protein, as well as
the presence of distinct PAG molecules with masses of 59 kDa and 62 kDa,
eluted respectively at 0.04 and 0.08 M NaCl (GARBAYO et al., 1998). In
ovine species, association of anion and cation exchange chromatographies
338
allowed the characterization of four distinct PAG molecules: ovPAG55,
ovPAG60, ovPAG61 and ovPAG65 (XIE et al., 1997a). Each of these
proteins had a distinct NH2-terminal amino acid sequence and a high amino
acid identity with other members of aspartic proteinase family. In the light
of these findings, in the first protocol, all DEAE fractions were
systematically purified by CM ceramic chromatography and analyzed by
SDS-PAGE and Western Blot. Microsequencing of the 51, 62 and 67 kDa
immunoreactive
proteins
from CM
ceramic
peaks
revealed
the
RGSXLTTHPL (0, 0.02 and 0.16 M NaCl DEAE fractions) or
RGSXLTTHPLRNIKDLVYMG (0.04 and 0.08 M NaCl DEAE fractions)
N-terminal amino acid sequences, which were identical to the N-terminus
of the boPAG-1 (Swiss-Prot database accession number Q29432).
Surprisingly, only one PAG N-terminal microsequence was identified in
zebu placenta, despite the recent finding that probably all ruminant
Artyodactyla possess possibly 100 or more PAG genes, many of which
being placentally expressed (XIE et al., 1997b).
In fact, till now, all PAG or PSPB related proteins isolated from
bovine fetal cotyledons by different research groups shared the same Nterminal microsequence (CAMOUS et al., 1988; ZOLI et al., 1991;
LYNCH et al., 1992). There seem to be at least three possible explanations
for this apparent reduced variability of PAG expression in bovine
placentas. The first is that, although some of the recently characterized
PAG cDNAs (XIE et al., 1997b; GREEN et al., 2000) could be transcribed
and translated into PAG molecules, these proteins are rapidly degraded and
thus could not accumulate at detectable levels. The second is that, in bovine
species, some of the PAG molecules could be N-terminally blocked. In this
339
case, only co-purified non-blocked immunoreactive proteins could be
identified after Edman degradation. The third explanation is that some
PAGs could be linked to membranes via fatty acid linkages, being
consequently more difficult to extract by conventional procedures. The
latter explanation seems more unlikely because bovine PAG cDNAs code
for relatively well-conserved pepsinogen-like structure (GURUPRASAD et
al., 1996), which is not originally linked to membranes.
According to XIE et al. (1991), the presence of N-linked carbohydrate
chains accounts, at least partially, for discrepancies in molecular masses
observed after SDS-PAGE. As previously suggested by ZOLI et al. (1991),
different degrees of glycosilation are also involved in the heterogeneity of
isoeletric point estimated for boPAG-1. Concerning N-terminal amino
sequencing, similarly to the previous observations made in taurine, ovine
and caprine species (ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1997a; GARBAYO et
al., 1998), Edman sequencing of PAGs extracted from zebu placenta failed
to give any signal on cycle 4, indicating the presence of a N-glycosilated
asparagine.
Although a high RIA immunoreactivity was observed for one CM
ceramic peak from the 0.32 M NaCl DEAE fraction (64.55% PAG:TP
ratio), N-terminal sequencing of its major protein (62 kDa) showed more
than 75% identity with the alpha-N-acetylgalactosaminidase (α-GalNAc), a
lysosomal exoglycosidase synthesized in various tissues of murine
(HERRMANN et al., 1998), chicken (DAVIS et al., 1993) and human
species (WANG et al., 1990). The α-GalNAc is not structurally neither
enzymatically related to the lysosomal aspartic proteinase cathepsin D.
Nevertheless, an abnormal expression of both of them seems to be directly
340
related to pathological conditions like cancer (YAMAMOTO et al., 1997;
VIGNESWARAN
et
al.,
2000)
and
neurological
dystrophic
or
degenerative diseases (LADROR et al., 1994; WOLFE et al., 1995). The
human α-GalNAc was also accidentally found as one of the five major
bands during purification of placental sialidases (TSUJI et al., 1989). In
this species, α-GalNAc seemed to be synthesized as a 65 kDa glycosylated
precursor, which is processed to a mature 48 kDa isoform (SWEELEY et
al., 1983). Directly responsible for immunosuppression by a mechanism
that involves the deglycosilation of the precursor of macrophage activating
factor (MAF) in cancer patients (YAMAMOTO et al., 1997), it can be
hypothesized that this protein could also play an important role on the local
immunology regulation at the foeto-maternal interface.
According to comparative molecular modeling studies, PAGs have
retained the well-known bilobed structure of aspartic proteinases, and a
peptide binding cleft between the two lobes capable of accommodating
peptides up to 7 amino acids (GURUPRASAD et al., 1996). Thus, it has
been hypothesized that they could be purified by use of pepstatin-agarose
affinity chromatography (GURUPRASAD et al., 1996). Pepstatin A is an
extremely powerful inhibitor of aspartic proteinases (MARCINISZYN et
al., 1977). It binds reversibly to the active center of pepsin, renin and
cathepsin D, being widely used as ligant in affinity chromatography
protocols for isolation of these enzymes (DZAU et al., 1979; AFTING and
BECKER, 1981). In the present work, PAG molecules have been
successfully identified after pepstatin affinity chromatography of
cotyledonary extracts from placentas collected in the first and second
trimesters of gestation. When crude extracts from 20-21 wk old zebu
341
placentas were loaded, PAG concentration was enriched by a factor of 25.8
(15.74% PAG:TP ratio after the column procedure vs 0.61% PAG:TP ratio
in crude extract). A lower efficacy was observed after affinity
chromatography of 10-11 wk old zebu placenta (PAG:TP ratio 3.26% vs
1.81%). In this case, the lower efficacy was probably due to the higher
viscosity of crude extracts, which could make difficult an ideal pepstatin APAG interaction. PAG molecules were eluted before a high ionic strength
was attempted, indicating a weaker interaction of PAG with pepstatin A
substract. This observation is consistent with theoretical binding studies of
PAG molecules which suggested that the substitution of Tyr189 and
Leu220 (porcine pepsinogen numbering) by Asp residues in boPAG-1
molecule are likely to induce a weaker binding to pepstatin A
(GURUPRASAD et al., 1996).
After affinity chromatography, extract of placenta removed at both
gestational ages revealed the presence of a 67 kDa immunoreactive protein,
which was 100% identical to boPAG-1 (14 aa long). As observed in Figure
6B (lanes 2), another protein with an apparent molecular weight of 84 kDa
and showing a high immunoreactivity with 3 antisera (R497, R706 and
R708) was observed after extraction of 10-11 wk old zebu placentas. Its
microsequencing revealed 77.78% amino acid sequence identity to alkaline
metalloproteinase (GenBank database accession number AAK22731),
which was previously identified in the Caulobacter crescentus genome by
NIERMAN et al. (2001). Two possibilities can be argued to explain the
presence of this metalloproteinase in our preparation: first, a bacterial
proliferation during the first steps of purification; second, the specific
expression of this type of metalloproteinase in zebu placenta. It was
342
interestingly that all the 3 antisera recognized this protein. The
characterization of the epitope(s) responsible for this cross-reaction are
worthy of further investigations.
In summary, this investigation is the first on the pregnancy-associated
glycoproteins in Bos indicus placenta. By use of SDS-PAGE and Western
Blot, different isoforms of PAG with apparent molecular weights from 51
to 69 kDa and isoeletric points varying from 4.4 to 6.7 were identified in
placentas from different gestational ages. N-terminal microsequencing
indicates the expression of one single PAG amino acid sequence in Bos
indicus placenta. However, our data are to be considered carefully because
it is not excluded that some important differences exist in the hypervariable
D-loop region of the molecule. In addition to PAG molecules, two other
immunoreactive enzymes showing high N-terminal amino acid identity
with alpha-N-acetylgalactosaminidase and alkaline metalloproteinase were
identified for the first time in zebu placenta extracts.
5. Acknowledgments
The authors thank Dr. M.A.N. Dode for assistance with zebu placenta
collection, Mrs. N. Gérardin-Otthiers (University of Liège) and Dr. R.
Wattiez (University of Mons-Hainaut) for peptide sequence analyses, Dr.
E. McNamara, Department of General Human Biochemistry and Pathology
(Ulg) for carefully reading the manuscript and Mr. C. Ernotte for editorial
assistance. Supported by a scholarship from Brazilian Coordination of
Training of Higher Educate Graduate (CAPES/Brazil) to N.M.S. and by
grants from F.N.R.S. and Belgium Ministry of Agriculture to J.F.B.
343
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347
Apêndice 5
SOUSA, N.M., ZONGO, M., PITALA, W., BOLY, H., RUTTEN A., DODE,
M.A.N., SANON, M.G., FIGUEIREDO, J.R., EL AMIRI, B., PERÈNYI, ZS
& BECKERS, J.F. Homologous redioimmunoassay system for PregnancyAssociated Glycoprotein measurement in zebu plasma. (submetido à
Theriogenology)
348
Pregnancy-Associated Glycoprotein Concentrations During Pregnancy
and Postpartum Period in Azawak Zebu Cattle
SOUSA, N.M.1, ZONGO, M.2, PITALA, W.2, BOLY, H.2, SAWADOGO,
L.2, SANON, M.2, FIGUEIREDO, J.R.1, SULON, J.3, GONÇALVES,
P.B.1, EL AMIRI, B.3, PERÈNYI, Z.3 & BECKERS, J.F.3
1
Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria,
Brazil.
2
UFR/SVT, Ouagadougou University, 03 BP 7021, Ouagadougou 03,
Burkina Faso.
3
Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, B-4000, Belgium.
Abstract
Specific RIA systems were developed then used to measure
pregnancy-associated glycoprotein (PAG) concentrations during gestation
and postpartum period in Azawak zebu cows. Twelve females palpated per
rectum and diagnosed as pregnant were bled at 5-10 days interval
approximately from Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). One
zebu
cow (Z15) initially diagnosed
as pregnant showed PAG
concentrations lower than the assay sensitivity (<0.20 ng/ml) and did not
calve. Another cow (ZSand) showed abnormally high PAG concentrations
during gestation, being excluded from the general PAG profile. The 10 other
zebu cows gave a very homogeneous PAG profile. In these animals,
concentrations increased progressively from Week 8 to Week 35 of gestation
(from 6.0 ± 4.2 to 196.0 ± 34.8 ng/ml), remaining relatively constant until
349
Week 39 (210.8 ± 74.8 ng/ml), when they increased sharply to reach their
highest level (1,095.6 ± 607.2 ng/ml) at parturition. After delivery, PAG
concentrations declined significantly (P<0.05) till the Week 2 postpartum
(348.4 ± 85.6 ng/ml) and slowly till the Week 10 postpartum. Our results
revealed that PAG pattern in zebu cattle was similar to those of taurine breeds
during the first two trimesters of pregnancy, but differed in the peripartum
period.
Key words: Azawak zebu, PAG, RIA, gestation, postpartum
1. Introduction
Zebu (Bos indicus) cattle is an important source of animal protein in
Africa and South America developing countries (CUNNINGHAM, 1992).
When compared with taurine (Bos taurus) cattle, they present some notable
arid-adaptive characteristics. They are more effective in extracting nutrients
from low quality roughages (BARTLE et al., 1994), having also a
remarkable ability to tolerate high temperatures (CARVALHO et al., 1995;
GAUGHAN et al., 1999). Reproductive differences between taurine and
zebu cattle have also been reported (CHENOWETH, 1994). Zebu females
are generally considered to take longer to achieve puberty (PLASSE et al.,
1968a) and to have longer gestation lengths (PLASSE et al., 1968b). Some
breeds appear to produce calves lighter at birth, being less vulnerable to
calving difficulty and losses (DOWLING, 1979). However, because of the
few investigations carried out in this taxa, most of their reproductive
characteristics remain unknown.
In the last two decades, a highly polymorphic family of placentaexpressed proteins has been discovered in ruminant species. These
350
pregnancy-associated glycoproteins (PAGs), also known as pregnancyspecific protein B (PSPB) (BUTLER et al., 1982), SBU-3 antigen
(GOGOLIN-EWENS, 1986) and 60-kDa pregnancy serum protein (PSP60) (CAMOUS et al., 1988), constitute a large family of aspartic
proteinases, showing a greatest sequence identity with pepsinogens (XIE et
al., 1991). They are synthesized by mono and/or binucleate cells of the
trophectoderm (GREEN et al., 2000), some of them being released in the
maternal circulation soon after implantation (ZOLI et al., 1992).
By using biochemical procedures, several molecules of the PAG
family were isolated from cotyledons of ewes (ZOLI et al., 1995; XIE et
al., 1997), goats (GARBAYO et al., 1998), taurine (BUTLER et al., 1982;
ZOLI et al., 1991) and zebu cattle (SOUSA et al., 2001). Some of these
molecules were used to immunize rabbits and the antisera obtained allowed
the development of homologous (ZOLI et al., 1992) and heterologous
(RANILLA et al., 1994; GONZÁLEZ et al., 1999) RIA systems for PAG
measurements in serum (ZOLI et al., 1992), plasma (PATEL et al., 1997)
or milk samples (GONZÁLEZ et al., 2001).
During gestation, PAG concentrations differ largely between species
and the period of pregnancy (ZOLI et al., 1992; RANILLA et al., 1994;
SOUSA et al., 1999). In a same species, they can be influenced by several
other aspects like the breed of the female (MIALON et al., 1993; RANILLA
et al., 1994), the foetal number (DOBSON et al., 1993; PATEL et al., 1997),
the fetal genotype (GUILBAULT et al., 1991; WILLARD et al., 1995) and
after embryo transfer, by the length of the period of embryo culture in vitro
(ECTORS et al., 1996). PAG concentrations seems also differ according to
the RIA system, this difference being probably due to the specificity of the
351
antisera (GONZALEZ et al., 1999; GONZALEZ et al. 2000).
Although
there
is
a
relatively
abundant
literature
on
the
characterization of PAG profiles during gestation in domestic (ZOLI et al.,
1992, RANILLA et al., 1994, SOUSA et al., 1999) and wild ruminant
species (HAIGH et al., 1991; WILLARD et al., 1994; WILLARD et al.,
1999), at our knowledge, there is no report on the plasmatic profiles of this
protein in zebu cattle. The objectives of this study where therefore (i) to
develop homologous RIA systems for PAG measurement in the plasma of
pregnant zebu females, and (ii) to characterize the time-related profile of
changes in peripheral concentrations of PAG throughout gestation and
postpartum period in the Azawak zebu breed.
2. Materials and Methods
2.1. Animals and Samples
This study was carried out in the Sudan-Sahelian zone of BurkinaFaso (12°22’N, 1°31’W). Mean annual precipitation is 894 mm. Mean
monthly minimum and maximum temperatures range from 8 to 20°C in the
wet season (June to October) and from 26 to 39°C in the dry season
(November to May). Twelve Azawak zebu cows of mixed age and parity
were palpated per rectum and diagnosed as pregnant, being selected for this
study. All were clinically normal and with good body condition scores
(BCS 4 to 5) at the beginning of the experiment (July 1998). The BCS was
determined using a 9-point scale, as previously described by EVERSOLE
et al. (2000). The females were bred in a semi-intensive system, grazing
typical vegetation (savanna) and having free access to water and mineral
blocks. The animals were bled at 5-10 days interval approximately from
352
Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). Heparinized blood
samples (5 ml) were collected from the jugular vein. The plasma was
removed by centrifugation (1,500 x g for 15 min) immediately after
collection and stored at –20°C until assayed for PAG. Sex of offspring was
recorded at birth.
2.2. PAG Radioimmunoassays
A pure preparation of zebu PAG (SOUSA et al., 2001) was used as
standard and tracer. A rabbit antiserum (R782) raised against the same
preparation was used as the first antibody at an initial dilution of 1:150,000.
The double antibody precipitation system was composed by a mixture of
sheep anti-rabbit immunoglolobulin (0.83% v:v), normal rabbit serum
(0.17% v:v), polyethylene glycol 6000 (20 mg/ml; Vel, Leuven, Belgium),
cellulose microcrystalline (0.05 mg/ml; Merck, Darmstad, Germany) and
BSA (2 mg/ml; ICN Biochemicals Inc., Aurora, OH) diluted in Tris buffer
(25 mM Tris, 10 mM MgCl2 and 0.1 mg/ml neomycin sulfate; pH 7.5). Pure
stock zebu PAG (lyophilized powder) was diluted with assay buffer (Tris
containing 1 mg/ml BSA) to give standard curves ranging from 0.2 to 25
ng/ml in a preincubated system and from 0.8 to 100 ng/ml in a nonpreincubated system. The radiolabelled
125
I-PAG was prepared according to
the chloramine T method (GREENWOOD et al., 1963). The first antibody
was raised in rabbits as described elsewhere (ZOLI et al., 1992).
Plasma samples were firstly assayed in the non-preincubated system.
Briefly, 0.1 ml of each sample or appropriated standard dilution were
aliquoted into duplicate assay tubes and diluted respectively with 0.1 ml and
0.2 ml of Tris-BSA buffer. To minimize nonspecific interference of plasma
353
proteins, 0.1 ml of PAG-free plasma was added to all standard tubes.
Thereafter, 0.1 ml of radiolabelled 125I-PAG (28,000 counts per min) and 0.1
ml of the diluted antiserum (R782; 1:150,000) were added and the tubes were
incubated overnight at room temperature. The following day, the double
antibody precipitation system (1.0 ml) was added to all except total count
tubes (T) and a further 30 min incubation was made at room temperature.
Bound (B) and free PAG were separated by centrifugation (1,500 g x 20 min)
after 2 washes with 2 ml of Tris-BSA buffer. The supernatants were
discarded and the radioactivity of the pellet was determined using a
Multigamma Counter (LKB Wallac 1261; Turku, Finland) with a counting
efficiency of 75%. The binding ratio of the radiolabelled
125
I-PAG to the
antiserum was considered as 100% in the zero standard (B0) assay tube.
Samples with lower PAG concentrations than the estimated standard
dose at which the percentage B/B0 was 80% (ED-80) (Table 1) were
reassayed in a preincubated system in which an incubation step of 16 h (at
room temperature) was made before the addition of the radiolabelled PAG.
The next day,
125
I-PAG was added and a further 4 h incubation was made
before the addition of the double antibody precipitation system.
TABLE 1 -
Characteristics of the preincubated and non-preincubated RIA systems
used for PAG measurement in zebu plasma samples.
System
Minimum Non-specific B0/T Estimated dose (ng/ml) at B/B0
detection limit binding (%) (%)
20%
50%
80%
(ng/ml)
Preincubated
0.20
<1
23
7.83
2.47
0.76
Non-preincubated
1.11
<1
28
114.34
26.67
6.24
B0/T = Tracer bound in the zero standard / total tracer added.
B/B0 = Tracer bound / tracer bound in the zero standard.
354
Samples with higher concentrations than the estimated standard dose at
which the percentage B/B0 was 20% (ED-20) (Table 1) were diluted (1/10 or
1/50) and reassayed without preincubation.
2.3. PAG Assay Validation
The minimal detection limits (MDL) of both RIA systems (Table 1)
were determined as the mean concentration minus twice the standard
deviation of 20 replicates of the zero standard. Four plasma samples with
known PAG concentrations (Table 2) were used to calculate intra-assay
and inter-assay variations in both systems (RODBARD et al., 1974).
TABLE 2 -
Intra and inter-assay coefficients of variation of preincubated and nonpreincubated PAG-RIA systems.
Intra-assay
Inter-assay
PAG concentrationa
(ng/ml)
CV (%)
PAG concentrationa
(ng/ml)
CV (%)
Sample 1
1.49 ± 0.11
7.4
1.62 ± 0.15
9.4
Sample 2
3.24 ± 0.11
3.5
3.37 ± 0.05
1.6
Sample 3
12.73 ± 0.63
4.9
12.01 ± 0.57
4.8
Sample 2
3.09 ± 0.34
11.1
3.11 ± 0.43
13.8
Sample 3
11.73 ± 0.76
6.5
11.99 ± 0.74
6.1
Sample 4
60.22 ± 4.81
8.0
53.04 ± 6.06
11.4
Preincubated
Non-preincubated
(mean ± SD)
a
355
2.4. Data Analysis
Data are presented as mean ± standard deviation (mean ± SD). PAG
concentrations from one pregnant Azawak female (Z Sand) were considered
as abnormal after a test of comparison of means (DAGNELIE, 1975), being
excluded from further statistical analysis. PAG concentrations during
gestation and postpartum period were analyzed as a split-plot design model
where the week of pregnancy was the main-plot treatment. The main effect of
the week on PAG concentrations was tested against residual error using the
STDERR and PDIFF statements of the GLM Procedure in SAS (SAS, 2000).
Half-life for PAG was calculated as previously described by KLINDT et al.
(1979).
3. Results
3.1. PAG Assay Validation
Tables 1 and 2 summarize the characteristics of the homologous RIA
systems used to measure plasmatic PAG concentrations in zebu plasma. In
the presence of excess antibody, 83.6% of labeled zebu PAG was bound.
The displacement of standard inhibition curves was highly repeatable
ranging from 90.7 ± 2.0% to 12.5 ± 1.1% of binding in the nonpreincubated system (n=10) and from 92.2 ± 1.2% to 6.4 ± 1.0% (n=10) in
the preincubated system (Figure 1).
3.2. PAG Profiles
One of the twelve Azawak zebu cows palpated per rectum and
initially diagnosed as pregnant (Z15) showed PAG concentrations lower
than the assay sensitivity (<0.2 ng/ml) and did not calve. Ten Azawak zebu
356
females gave birth to single normal calves (3 males and 7 females).
Another zebu cow (ZSand) gave birth to an emaciated female and showed
abnormally high PAG concentrations during gestation, having their data
excluded from the general PAG profile. Clinically, this cow presented a very
low body condition score at the end of gestation (BCS 1 to 2).
100
B/Bo x 100
80
60
40
20
0
0,1
1
10
100
PAG(ng/mL)
ng/mL
PAG
Figure 1.
Standard curves (mean ± SD) for PAG in the preincubated (-▼-▼-) and
non-preincubated (-▲-▲-) RIA systems (B/B0 function of Log PAG
concentrations).
Figure 2 shows the PAG profile during gestation and postpartum
period in 10 Azawak zebu cows. Mean weekly PAG concentration varied
significantly among the animals (P<0.0001) and the periods of pregnancy
(P<0.0005). However, the time-related variation on PAG concentration was
significant only at the end of gestation.
The mean PAG concentration increased progressively from the Week
8 to the Week 35 of gestation (from 6.0 ± 4.2 ng/ml to 196.0 ± 34.8 ng/ml).
357
Thereafter, PAG concentrations remained relatively constant until Week 39
(210.8 ± 74.8 ng/ml), then they increased significantly reaching their
highest level (1,095.6 ± 607.2 ng/ml) at parturition (Week 40). After
delivery, plasma PAG concentrations declined significantly (P<0.05) till
the Week 2 postpartum (348.4 ± 85.6 ng/ml). Afterwards, PAG
concentrations decreased slowly reaching the lowest levels (5.1 ± 5.2
ng/ml) at the Week 10 postpartum.
2000
PAG (ng/mL)
parturition
↓
1500
*
1000
*
500
**
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
5pp 10pp 15pp
Weeks after fertilization and parturition
FIGURE 2 - PAG concentrations (mean ± SD) during gestation and postpartum
period in plasma of 10 Azawak zebu cows. Week 40 of gestation
corresponds to the Week 0 postpartum (0pp). Significant differences
between weeks of gestation are indicated by asterisks (*P<0.0001,
**P<0.05).
358
The half-life of PAG calculated after parturition was 10.1 days. When
estimated by regression equation (Figure 3), a period of 14 weeks would be
required to reach undetectable PAG concentrations (<0.2 ng/ml) in
maternal bloodstream.
8
Ln PAG (ng/mL)
7
Cow ZSand
y = -0.5165x + 7.67758
6
5
4
Homogeneous population
y = -0.5095x + 7.42951
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Weeks postpartum
FIGURE 3 - Plasmatic PAG concentrations and regression curves calculated for PAG
from parturition (Week 0) to the Week 10 postpartum. Azawak zebu
cows that presented clinically normal ongoing gestations (n=10) were
represented by dots (●). The zebu cow presenting higher PAG levels
during pregnancy with low BCS at the end of gestation (ZSand) was
represented by squares (■).
3.3. Atypical PAG Profile
The PAG profile during gestation and postpartum period in the Azawak
zebu cow (ZSand) presenting high PAG concentrations during pregnancy is
given in Figure 4. From Week 10 till parturition, mean weekly concentrations
359
(227.6 ng/ml) were approximately 3.5 times higher than that calculated for
the other 10 females (64.1 ng/ml). The estimated PAG half-life in this cow
was 9.2 days and the clearance rate after parturition was similar to that
observed after normal gestations (14 weeks).
PAG (ng/mL)
Homogeneous
population
1000
800
ZSand
600
400
200
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40 5pp 10pp 15pp
Weeks before and after parturition
FIGURE 4 - PAG profile of Azawak zebu cows presenting clinically normal
gestations (homogeneous population) and PAG profile of the individual
cow having presented an extremely low BCS at the end of gestation
(ZSand). Week 40 of gestation corresponds to the Week 0 postpartum
(0pp).
4. Discussion
In this study we describe for the first time the plasmatic profiles of
PAG concentrations throughout gestation and postpartum period in zebu
females. The characteristics of two homologous RIA systems developed for
PAG measurement in peripheral circulation of zebu females were also
360
examined.
Our data showed that both preincubated and non-preincubated
homologous RIA systems developed with the use of a purified preparation of
zebu PAG (SOUSA et al., 2001) were very precise for measuring PAG
concentrations in maternal bloodstream. Intra-assay and inter-assay
coefficients of variation were relatively low (1.6 to 13.8%), being
comparable to those calculated by ZOLI et al. (1992) for the boPAG-1 RIA
(6.9 to 11.6%), and by GONZALEZ et al. (1999) for homologous and
heterologous caprine RIA systems (5.5 to 10.1%). In addition, when a same
sample was measured by both systems, PAG concentrations remained
almost the same even if presenting percentage B/B0 ratios lower than 80%
or higher than 20%. Regarding their practical application in laboratory
routine, while the preincubated system showed to be suitable to measure
lower PAG concentrations (0.8 to 7.8 ng/ml; Table 1), as observed in early
pregnancy, the non-preincubated system proved to be able to detect a larger
range of concentrations (6.2 to 114.3 ng/ml; Table 1), being very usefull for
the follow-up of PAG levels during gestation.
In both zebu and taurine taxa (ZOLI et al., 1992; PATEL et al., 1997),
PAG concentrations increased slowly from Week 8 to the Week 35 of
gestation, remaining lower than 200 ng/ml. However, while in zebu
females PAG levels remained relatively constant from Week 35 to the last
week of gestation (196.0 ± 34.8 ng/ml to 210.8 ± 74.8 ng/ml), in taurine
breeds this period corresponded to a rapid increase on PAG concentrations
(158.9 ± 60.2 ng/ml to 1,551.9 ± 589.7 ng/ml) (ZOLI et al., 1992). If the
relatively constant PAG concentrations measured in this study result from
the use of a zebu PAG preparation in our RIA systems or from genetic
361
differences between these two clades of cattle it is not known. However,
the first hypothesis is more unlikely because when different plasmatic
samples recovered at early, mid or late gestational periods were measured
by both taurine and zebu homologous RIA systems (data not shown), no
differences were found on PAG concentrations.
At parturition, zebu females reached lower PAG concentrations than
taurine cows (1,095.6 ng/ml in zebu versus 1,352.8 ng/ml to 2,462.4 ng/ml
in taurine cows) (ZOLI et al., 1992; PATEL et al., 1997). Differences on
PAG concentrations next to the parturition may be due to a variety of
factors, such as the placenta blood flow at late gestation and the placenta
mass. There is currently little information about the effect of placental
blood flow on the maternal concentration of placenta-specific hormones
(NEWNHAM et al. 1986). Nevertheless, because uterine and umbilical
blood flows were found to be smaller in zebu than in taurine breeds
(FERRELL, 1991), this hypothesis must be taken into consideration to
explain some differences on PAG concentrations.
Several authors reported an effect of placental mass on PAG
concentrations (DOBSON et al., 1993; MIALON et al., 1993; PATEL et
al., 1997). As described by MIALON et al. (1993), PSP-60 concentrations
at calving are significantly lower in taurine breeds that gave birth to small
calves (e.g. Holstein and Normande) than in those that calved larger calves
(e.g. Charolais), this difference being probably due to the differences in
placental masses and consequently in the total number of binucleate cells.
In our study, placenta mass and calf birth weights could not be recorded at
parturition. However, because liveweight of Azawak cows are considered
to varies between 300 to 410 kg (PAYNE, 1970), it can be supposed that
362
placental mass in this breed is smaller than those recorded in european
taurine breeds, justifying the lower PAG levels observed at parturition.
With regard to the postpartum period, the time expected for PAG to be
undetectable in maternal bloodstream of zebu females (14 weeks) was in
the range of those previously described by ZOLI et al. (1992) and
MIALON et al. (1993) for taurine cows (average of 11 to 17 weeks), but
longer than those estimated by KIRAKOFE et al. (1993) for postpartum
beef cows (12 weeks) and for hysterectomised beef cows (10 weeks). This
relatively long clearance rate of PAG observed in postpartum zebu cows
seems to be more likely due to the long half-life of the molecule than to the
concentrations reached at parturition, as previously argued by ZOLI et al.
(1991). PAG half-lives were consistently longer in zebu (9.2 to 10.1 days)
than in taurine cattle (7.0 to 8.8 days) (SASSER et al., 1986; SEMAMBO et
al., 1992; ALI et al., 1997). As the half-lives of glycoproteins are directly
influenced by the presence of N-linked carbohydrate and sialic acid chains on
their structures (RAFFERTY et al., 1995), it can be hypothesed that different
glycosilation patterns exist on PAG molecules extracted from zebu placentas.
However, further studies are needed to confirm this hypothesis.
During the course of this study, one Azawak cow (ZSand) presented a
very low BCS (1 to 2) and higher PAG concentrations during the last two
trimesters of pregnancy. This cow was fecundated early in the wet season
(July) and calved late in the dry season (April), when savanna typical
vegetation is scarce and with bad quality. An association between severe
energy or protein underfeeding and an increase in placental size has been well
characterized in both human (LUMEY, 1998) and ovine species (WALLACE
et al., 1997a). Furthermore, an opposite association, i.e. between higher
363
energetic levels, reduced placental size and lower peripheral PSPB
concentrations during gestation was recently demonstrated in ovine species
(WALLACE et al., 1997b). These findings support the assumption that, in
some conditions, an inadequate food intake by pregnant zebu cows could be
associated with a compensatory placental hypertrophy to assure the survival
of a developing fetus. Another contributing factor for the higher PAG levels
observed in the ZSand cow could be a reduced metabolic clearance of PAG
in the maternal circulation. However, because the PAG half-life was smaller
in this animal (9.2 days) than in the others (10.1 days), this association seems
to be improbable.
To conclude, our results indicate that plasma PAG concentrations in
zebu cattle were similar to concentrations of taurine breeds during the first
two trimesters of pregnancy, but differ in the peripartum period. In addition,
our data support the assumption that, in extreme conditions, the nutrition
status of the mother could be reflected as a sharp on peripheral concentration
of placental proteins. Better adapted to severe energy and protein
underfeeding, zebu cattle could constitute an excellent model for the
investigation of the consequences of nutritional status of the mother on the
placental synthesis of hormones and pregnancy-associated proteins.
5. Acknowledgments
This work was supported by grants from CIUF-SPA/Burkina Faso,
FNRS and Belgian Ministry of Agriculture. N.M. Sousa was supported by a
fellowship from the Brazilian Coordination of Training of Higher Educate
Graduate (CAPES/Brazil). The authors are grateful to Dr. M.A.N. for
providing the facilities. Authors thank Mrs. R. Fares for her secretariat
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assistance.
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• Artigos Submetidos
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