TATIANA DE ARRUDA CAMPOS BRASIL DE SOUZA
Clonagem e Caracterização do gene
Calmodulina de Phytomonas serpens
LONDRINA
2006
ii
TATIANA DE ARRUDA CAMPOS BRASIL DE SOUZA
Clonagem e Caracterização do gene
Calmodulina de Phytomonas serpens
Dissertação apresentada ao curso de PósGraduação
em
Microbiologia
da
Universidade Estadual de Londrina, como
requisito final à obtenção do título de
Mestre.
Orientadora: Profª
Yamada Ogatta.
LONDRINA
2006
Drª
Sueli
Fumie
iii
TATIANA DE ARRUDA CAMPOS BRASIL DE SOUZA
Clonagem e Caracterização do gene
Calmodulina de Phytomonas serpens
Banca Examinadora:
Profª Drª Sueli Fumie Yamada Ogatta.
Universidade Estadual de Londrina
Prof Dr Celso Vataru Nakamura.
Universidade Estadual de Maringá
Prof Dr Marco Aurélio Krieger
Instituto de Biologia Molecular
Londrina, 23 de fevereiro de 2006.
iv
“Para mim é preciso lutar sempre para viver a vida em plenitude e não pactuar com o
que é cômodo. Enquanto eu tiver perguntas e não houver respostas, continuarei a
pesquisar”.
"Eu não sei o que eu posso parecer ao mundo, mas no que concerne a mim eu
pareço ter sido apenas um menino brincando às margens do oceano, e me
distraindo em ocasionalmente achar uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais
bonita que as comuns, enquanto o grande oceano da verdade permanece ainda a
ser descoberto."
Isaac Newton
v
Dedico:
Aos meus pais Sérgio e Tereza Cristina,
Às minhas irmãs: Rafaela e Talita.
Por vocês, para vocês e sempre com
vocês.
Pelo amor incondicional, por valorizarem o
que eu sou, os meus sentimentos, os
meus sonhos e os meus ideais. Por
compreenderem a minha ausência e as
minhas renuncias. Que eu sempre saiba
retribuir tudo o que eu recebo de vocês!
vi
Agradecimentos
A Deus, que nunca me abandonou. Sei que estou em débito.
A minha Orientadora, Dra. Sueli Fumie Yamada Ogatta, por ter sido a
pesquisadora que me ensinou a metodologia, o ser humano que me mostrou o
exemplo de conduta e a amiga que esteve presente em todos os momentos. “Não
há modo de ensinar, mais forte e suave de que o exemplo: convence sem debate,
todas as dúvidas, desata e corta caladamente todas as desculpas” (Pe Manuel
Bernardes). Você é meu exemplo, tem a minha admiração, o meu respeito e minha
eterna gratidão.
Ao Dra. Shiduca Itow Jankevicius, pelo incentivo, carinho, pela oportunidade de
estagiar em seu laboratório, possibilitando o surgimento da minha grande “paixão“
pela microbiologia.
Á minha grande amiga Viviane Krominski Graça de Souza, que sempre esteve
presente nestes últimos 4 (quatro) anos. Obrigada por TUDO: pela paciência,
incentivo, convivência, confiança, grandes ensinamentos e principalmente pela
amizade. A distância traz a saudade, mas nunca o esquecimento.
Ao Dr. Marco Aurélio Krieger, pela correção desta dissertação, pela disponibilidade
de seu laboratório para a realização de alguns experimentos e colaboração para
realização deste trabalho.
Ao Dr. Celso Vataru Nakamura pela correção desta dissertação, pela importância
na minha formação intelectual como docente do curso de pós graduação e pelo
auxílio no desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores do curso de Pós Graduação em Microbiologia: Dr. Benedito Prado
Dias Filho, Dr. Carlos Mitihiko Nozawa, Dr. Eiko Nakagawa Itano, Dr. Galdino
Andrade Filho, Dra. Halha Ostrensky Saridakis, Dra. Jacinta Sanchez Pelayo,
Dra. Márcia Cristina Furlaneto, Dra. Marco Antonio Nogueira, Dra. Mariangela
Hungria da Cunha, Dra. Rosa Elisa Carvalho Linhares, Dr. Sérgio Suzart dos
Santos. Todos se mostraram importantes para minha formação intelectual.
Ao Dr. Phileno Pinge Filho, pelo apoio, amizade, e ajuda na realização deste
trabalho.
A Viviane Monteiro Góes pela atenção, disponibilidade e ajuda nos ensaios de
hibridação.
vii
Ao Paulo Lorca pelo auxílio no seqüenciamento do gene estudado.
Aos meus Avós: Olavo de Arruda Campos, Alminda Perez Bêra e Maria de
Lourdes Brasil Mendes de Souza, e ao meu padrinho: José Roberto Brasil de
Souza, pelo apoio, carinho e torcida. Eu amo vocês.
Ao Duque, pelo companheirismo.
Aos meus colegas do curso de pós-graduação: Adriana Knob, Ariane Saito,
Denise Scoaris, Evelyn Carignano, Flávia Spago, Gisele Lovato, Márcia
Magalhães Mata, Raíssa Pedroso, e em especial aos meus grandes amigos do
lado B:, Fabrício José Benati, Jesiane Batista da Silva , Lígia Carla Faccin,
Narjara do Carmo Oliveira e Sérgio Paulo Dejato da Rocha pelo apoio nos
momentos difíceis e pelas grandes alegrias .Vocês estarão sempre comigo.
Aos funcionários do Departamento de Microbiologia: João Alexandre Lopes,
Marinalva Moreira dos Santos, Rosilda Alvarenga, que sempre se mostraram
dispostos a ajudar.
Aos meus amigos: Angélica Martins Batista, Ediel Clementino da Costa, Érika
Izumi, Fabio Francisco Hidalgo, Fernando César Bizerra, Graziela Navarro,
Janaina Ferro, Luciana Furlaneto Maia, Natalia Botelho de Souza, Paulo
Roberto Ceridório Corrêa, Rita de Cássia Pontello Rampazzo, Sergio Luiz
Prolo, Vanessa Di Raimo, pelo companheirismo, pela amizade, por sempre
estarem dispostos a ajudar e formar uma equipe unida, pelos momentos alegres e
divertidíssimos no laboratório e por torcerem por mim. Conviver com vocês foi um
privilégio.
Á família Bulgacov: Yara, Sergio, Tatiana e Tamara, pela hospedagem, pelos
momentos agradáveis em Curitiba, pela amizade, por tudo sempre.
À Universidade Estadual de Londrina, a quem devo minha formação intelectual e
científica.
À CNPQ, pela bolsa de pesquisa concedida.
A todos os meus familiares e amigos, que torcem pelo meu sucesso.
viii
Souza, T.A.C.B. Clonagem e caracterização do gene calmodulina de
Phytomonas serpens. Dissertação de Mestrado do curso de Pós Graduação em
Microbiologia da Universidade Estadual de Londrina, 2006.
Resumo
Espécies do gênero Phytomonas, família Trypanosomatidae, podem parasitar o
floema, tubos laticíferos, frutos e sementes de algumas famílias de plantas com
ampla distribuição geográfica e importância econômica. Calmodulina é uma proteína
ligante de cálcio ubíqua que pode regular a atividade de várias proteínas. Em P.
serpens nenhuma informação relevante sobre essa proteína foi descrita até o
momento. Nesse estudo, um fragmento de DNA de aproximadamente 450 pb,
correspondendo à região codificante de calmodulina de P. serpens 15T foi clonado e
sequenciado. A seqüência nucleotídica desse fragmento mostrou similaridade com a
seqüência de calmodulina de vários organismos. O gene camP codifica um
polipeptídeo acídico (pI 4,0) com uma massa molecular estimada de 16,8 kDa.
Análises do tipo Southern blot, utilizando cromossomas de P. serpens separados
através da eletroforese em campo de pulsos alternados indicaram que esse gene
está presente em uma banda cromossômica de alta massa molecular. Análises do
tipo Northern blot de RNA total e RNA poliA+ detectaram dois transcritos. Além disso,
anticorpos policlonalis contra a proteína recombinante reconheceram uma proteína
com massa molecular estimada de 17 kDa no extrato de formas promastigotas em
fase de crescimento exponencial. E foi mostrado que CAMP recombinante apresenta
atividade de proteína ligante de cálcio.
Palavras-chave: Calmodulina, Proteína ligante de cálcio, Phytomonas serpens.
ix
Abstract
Species of the Phytomonas genus, in Trypanosomatidae family, can parasitize
phloem, laticiferous tubes, fruits and seeds of some plants families with a wide
geographic distribution and great economic importance. Calmodulin is an universal
Ca2+-binding protein which can regulate the activity of various proteins and in P.
serpens no relevant information about this protein has been yet described. In this
study, a 450 bp DNA fragment corresponding the coding sequence of calmodulin of
P. serpens 15T (camP) was cloned and sequenced. The nucleotide sequence of this
fragment showed similarity to calmodulin gene of various organisms. camP encodes
an acidic polypeptide (pI 4.0) with an estimated molecular weight of 16.8 kDa.
Southern blot analysis, using P. serpens chromosomes separated by pulsed-field gel
electrophoresis, indicated that this gene is present on high molecular mass
chromosomes Northern blot analyses using total and poliA+ RNA fractions of the
flagellate detected two transcripts. In addition, we raised a polyclonal antiserum
against the recombinant protein and the antibodies recognized a protein with
estimated molecular weight of 17 kDa in log-phase promastigotes extracts. And it
was demonstrated that recombinant CAMP retained its calcium-binding capacity.
Key words: Calmodulin, Calcium-binding protein, Phytomonas serpens.
x
Sumário
1. Introdução ....................................................................... 1
1.1.
Família Trypanosomatidae.......................................... 1
1.2.
Phytomonas sp............................................................ 3
1.2.1. Caracterização biológica ............................................. 3
1.2.2. Caracterização molecular............................................ 9
1.3.
Doença de Chagas...................................................... 13
1.4.
Proteínas ligantes de cálcio ........................................ 18
2. Referências Bibliográficas............................................. 27
3. Artigo ............................................................................... 42
xi
Lista de Figuras
Figura 1: Morfologia dos tripanosomatídeos. A. Promastigota; B. Coanomastigota;
C. Amastigota; D. Opistomastigota; E. Epimastigota; F. Tripomastigota; 1. Flagelo; 2.
Bolsa Flagelar; 3. Cinetoplasto; 4. Núcleo; 5. Membrana ondulante.................... 2
Figura 2: Representação esquemática do ciclo biológico de P. serpens. No inseto,
formas promastigotas colonizam o trato digestivo, atravessam a barreira intestinal e
atingem as glândulas salivares através da hemolinfa. Essas formas são inoculadas
em frutos maduros através da saliva no momento da picada. n: núcleo; c:
cinetoplasto .......................................................................................................... 6
Figura 3: Processamento do RNAm de tripanosomatídeos. (a) Representação
esquemática de um transcrito policistrônico contendo os sítios de reconhecimento
para trans-splicing (AG), poliadenilação (A) e o trato de polipirimidina (pir). (b)
Reação de trans-splicing e poliadenilação. A seqüência do spliced leader (SL) está
presente no transcrito SL-RNA (em azul) O diagrama em verde representa a
maquinaria envolvida nos processos. (c) Produtos da reação de processamento. O
SL e a cauda poli-A (A-A-A) estão representados nas extremidades 5’ e 3’ do RNAm,
respectivamente. A região em vermelho representa a seqüência codificante do
RNAm e está flanqueada por seqüências não traduzidas (5’ UTR e 3’ UTR) ...... 11
Figura 4: Representação esquemática da estrutura tridimensional de CaM. As setas
indicam os motivos EF hand nos domínios globulares da proteína e em verde, os
íons cálcio. A estrutura foi determinada através de difração de raios X e preparada
com o programa MOLMOL. Fonte: Bouché et al., 2005....................................... 20
Figura 5: Diagrama simplificado de sinalização celular. PDE: cAMP fosfodiesterase;
PIK: fosfotidilinositol quinase; PIPLC: fosfatidilinositídio fosfolipase C; PKA: proteina
quinase dependente de cAMP; Ptdlns: fosfatidilinositol; SH2, região 2 homóloga a
SRC. Setas pontilhadas e caixas verdes escuros indicam componentes ausentes.
Setas contínuas e caixas verdes claro indicam componentes e conexões
conhecidas. Fonte: adaptado de PARSONS; RUBEN (2000) .............................. 22
xii
Lista de Tabelas
Tabela 1: Gêneros da família Tripanosomatidae. As linhas descontínuas
representam estágios relatados, mas não confirmados. Fonte: McGhee; Cosgrove
(1980), com modificações .................................................................................... 4
Tabela 2 – Espécies definidas do gênero Phytomonas ...................................... 5
Tabela 3: Detecção e isolamento de tripanosomatídeos de plantas.................... 7
Tabela 4: Características das infecções causadas por Phytomonas sp .............. 8
Tabela 5: Classificação das RNAs polimerases de eucariotos de acordo com a
resposta a α-amanitina e especificidade da transcrição (revisto por PALENCHAR;
BELLOFATTO, 2006) ........................................................................................... 12
Tabela 6: Proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos de Trypanosoma cruzi
com potencial clínico e epidemiológico ................................................................ 16
Tabela 7: Moléculas potencialmente envolvidas em mecanismos de transdução de
sinal em tripanosomatídeos. Fonte: PARSONS; RUBEN, 2000........................... 21
Tabela 8: Exemplos de proteínas ligantes de cálcio em protozoários parasitas .. 23
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Família Trypanosomatidae
A família Trypanosomatidae pertence à ordem Kinetoplastidae, e compreende
organismos
unicelulares
e
uniflagelados
caracterizados
pela
presença
do
cinetoplasto, uma região especializada da mitocôndria rica em DNA, denominado kDNA, (LEVINE et al., 1980). Além disso, a presença de uma invaginação da
membrana plasmática localizada na base do flagelo, denominada bolsa flagelar, é
uma característica morfológica distinta dos tripanosomatídeos. Essa organela tem
sido associada à atividade de endocitose e secreção de proteínas (revisto por
LANDFEAR; IGNATUSHCHENKO, 2001).
Esses protozoários são parasitas de animais invertebrados ou vertebrados e
vegetais (VICKERMAN; PRESTON, 1976). Algumas espécies de tripanosomatídeos
são agentes etiológicos de doenças que acometem animais vertebrados, inclusive o
homem, como a doença de Chagas e leishmaniose. Outras espécies parasitam
plantas de grande interesse econômico.
O ciclo de desenvolvimento desses microrganismos pode ocorrer em apenas
um hospedeiro (monoxênico) ou alternar-se entre um invertebrado e um vertebrado
ou planta (heteroxênico). Os tripanosomatídeos heteroxênicos são transmitidos por
insetos, porém, em contraste aos fortes efeitos que provocam em hospedeiros
vertebrados ou vegetais, na maioria das associações não afetam o seu vetor
(MOLYNEAUX; STILES, 1991).
A localização do cinetoplasto em relação ao núcleo, bem como a presença ou
ausência de membrana ondulante são as principais características que definem
morfologicamente os diversos estágios evolutivos dos tripanosomatídeos (HOARE;
WALLACE, 1966). As morfologias estáveis encontradas em tripanosomatídeos são
(Figura 1):
o
Promastigota: forma alongada com cinetoplasto anterior ao núcleo; o
flagelo torna-se livre através da porção anterior da célula.
2
o
Coanomastigota: estágio peculiar, geralmente com cinetoplasto
antenuclear. O flagelo surgindo de um reservatório com formato de funil e emergindo
no final da extremidade anterior do corpo (restrito ao gênero Crithidia).
o
Amastigota: forma arredondada ou oval, com flagelo que não se
exterioriza.
o
Epimastigota: forma alongada com cinetoplasto justanuclear e anterior
ao núcleo; possui pequena membrana ondulante lateralmente .
o
Opistomastigota: estágio "tripanomórfico", representado (somente no
gênero Herpetomonas) por formas alongadas com cinetoplasto pós-nuclear. O
flagelo atravessa o corpo e emerge no final da extremidade anterior.
o
Tripomastigota: forma alongada com cinetoplasto posterior ao núcleo;
o flagelo forma uma extensa membrana ondulante e torna-se livre na porção anterior
da célula.
Figura 1: Morfologia dos tripanosomatídeos. A. Promastigota; B. Coanomastigota; C.
Amastigota; D. Opistomastigota; E. Epimastigota; F. Tripomastigota; 1. Flagelo; 2. Bolsa
Flagelar; 3. Cinetoplasto; 4. Núcleo; 5. Membrana ondulante.
3
A combinação entre a morfologia e os hospedeiros (planta ou vertebrados)
pode ser utilizada como critério preliminar para identificação dos tripanosomatídeos
(Tabela 1). Os padrões morfológicos, tais como opistomastigotas e coanomastigotas
podem ser úteis em identificar espécies dos gêneros Herpetomonas e Crithidia,
respectivamente.
No
entanto,
Phytomonas,
Leptomonas,
e
Herpetomonas
compartilham formas promastigotas indistinguíveis. Nesse sentido, vários outros
critérios foram propostos para a identificação desses protozoários, como marcadores
moleculares (CAMARGO, 1999), enzimas do ciclo ornitina-arginina (BATISTOTI et
al., 2001) entre outros.
1.2. Phytomonas sp
1.2.1. Caracterização biológica
O
gênero
Phytomonas
foi
inicialmente
proposto
para
classificar
tripanosomatídeos isolados dos tubos lactíferos de plantas (DONOVAN, 1909).
Posteriormente, essa denominação passou a ser utilizada para os isolados de
diferentes partes do tecido vegetal.
Espécies do gênero Phytomonas (Tabela 2) são parasitas do floema, dos tubo
lactíferos, frutos ou sementes de algumas famílias de plantas com ampla distribuição
geográfica e de grande importância econômica (Tabela 3). Entretanto, somente os
tripanosomatídeos encontrados no floema de algumas plantas como, coqueiro
(PARTHASARATHY & SLOBBE, 1978), palmeiras (DOLLET; LOPES, 1978),
cafeeiro (STAHEL, 1931) e mandioca (VAINSTEIN et al., 1984) causam
fitopatologias fatais (Tabela 4).
4
Tabela 1: Gêneros da família Tripanosomatidae. As linhas descontínuas representam estágios
relatados mas não confirmados. Fonte: McGhee; Cosgrove (1980), com modificações.
Gênero
Morfologia
Hospedeiro
Invertebrado
Blastocrithidia
Vertebrado
Outro
Amastigota
(Laird, 1959)
Epimastigota
Crithidia
(Léger, 1902)
Coanomastigota
Endotrypanum
(Mesnil & Brimont,
1908)
Promastigota
Herpetomonas
(Kent, 1880)
Promastigota
Epimastigota
Tripomastigota
Opistomastigota
Leishmania
(Ross, 1903)
Promastigota
Amastigota
Promastigota
Leptomonas
(Kent, 1880)
Promastigota
Phytomonas
(Donovan, 1909)
Promastigota
Promastigota
(Planta)
Promastigota
(Solo)
Proleptomonas
(Woodcok, 1913)
Rhyncoidomonas
(Patton, 1910)
Tripomastigota
Trypanosoma
(Gruby, 1843)
Epimastigota
Amastigota
Tripomastigota
5
Tabela 2 – Espécies definidas do gênero Phytomonas
Espécie
Local de isolamento
Phytomonas serpens
Frutos
Phytomonas sp.
Látex
Phytomonas françai
Mandioca
Phytomonas staheli
Coqueiros e palmeiras
Formas promastigotas do parasita podem ser transmitidas por insetos
fitófagos infectados pertencentes às famílias Coreidae, Lygaeidae, Pyrrhocoridae e
Pentatomidae (BATISTOTI et al., 2001) através da saliva no momento da picada.
Esses flagelados colonizam o trato digestivo dos insetos, atravessam a barreira
intestinal e atingem as glândulas salivares através da hemolinfa. No vegetal, são
encontradas formas promastigotas e raramente formas amastigotas (Figura 2)
(JANKEVICIUS et al., 1989). Além disso, tripanosomatídeos de tubos lactíferos
foram transmitidos mecanicamente de tubo capilar para a planta hospedeira
(DOLLET, 2001).
Os tripanosomatídeos de plantas formam três grupos distintos de acordo com
o local de infecção na planta e o tipo de cultivo axênico (DOLLET, 2001):
1.
Floema: os parasitas estão sempre associados com síndromes
patológicas e são de difícil cultivo axênico;
2.
Tubos lactíferos: os tripanosomatídeos geralmente não causam doenças
e podem ser cultivados in vitro com relativa facilidade;
3.
Frutos ou sementes: os tripanosomatídeos permanecem concentrados
ao redor do ponto de inoculação, são facilmente cultivados em cultura axênica, onde
se multiplicam rapidamente.
6
Figura 2: Representação esquemática do ciclo biológico de P. serpens. No inseto, formas
promastigotas colonizam o trato digestivo, atravessam a barreira intestinal e atingem as
glândulas salivares através da hemolinfa. Essas formas são inoculadas em frutos maduros
através da saliva no momento da picada. n: núcleo; c: cinetoplasto.
O isolamento de formas promastigotas a partir de plantas e insetos fitófagos
não é um critério suficiente para classificação no gênero Phytomonas, uma vez que
essa forma evolutiva pode ser encontrada em outros gêneros como Herpetomonas e
Leptomonas
que
também
podem
ser
isolados
dos
mesmos
hospedeiros
(CAMARGO, 1999). Além disso, o isolamento de outros tripanosomatídeos em
plantas tem sido relatado na literatura (CONCHON et al., 1989; CAMARGO, 1999;
CATARINO et al., 2001).
Vários critérios têm sido utilizados para classificar os tripanosomatídeos
isolados de plantas, entre eles: reatividade com anticorpo monoclonal (TEIXEIRA;
CAMARGO,
1989),
atividade
enzimática
(UTTARO;
SANCHEZ-MORENO;
OPPERDOES, 1997), perfil enzimático do ciclo da uréia (CATARINO et al., 2001),
fingerprinting de kDNA (FERNANDEZ-BECERRA et al., 1996), utilização da
seqüência do mini exon ou spliced leader em reações de hibridação de DNA
genômico (TEIXEIRA et al., 1996) e amplificação em cadeia pela polimerase
(STURM; FERNANDES; CAMPBELL, 1995; SERRANO et al., 1999), homologia de
seqüência com RNA ribossomal 5S (MARCHÉ et al., 1995; DOLLET et al., 2000).
7
Tabela 3: Detecção e isolamento de tripanosomatídeos de plantas
Hospedeiro
Referências
Amora (Morus sp)
CAVAZZANA et al., 1993
Bergamota (Citrus bergamia)
CONCHON et al., 1989
Café (Coffea arábica)
STAHEL, 1931; FELTS, 1981
Caruru (Amaranthus retroflexus)
SÁNCHEZ-MORENO et al., 1998
Cherimolia (Annona cherimolia)
SÁNCHEZ-MORENO et al., 1995
Coqueiro
PARTHASARATHY et al., 1976
Espécies de Euphorbia
JANKEVICIUS et al., 1982; ATTIAS; DE
SOUZA, 1986; FIORINI et al., 1993
Feijão guandu (Cajanus flavus)
CAVAZZANA et al., 1993
Jiló (Solanum gilo)
FIORINI et al., 1986
Laranja (Citrus aurantium)
FIORINI et al., 1990; CARRARA et al., 1992
Leguminosas
ITOW-JANKEVICIUS et al., 1987
Maçã (Malus sp)
CAVAZZANA et al., 1995
Mandioca (Manihot palmata; M. esculenta)
ARAGÃO, 1927; VAINSTEIN et al., 1984
Manga (Mangifera indica)
SÁNCHEZ-MORENO et al., 1998
Milho (Zea mays)
ITOW-JANKEVICIUS et al., 1993
Palmeira
DOLLET et al., 1977
Romã (Punica granatum)
CATARINO et al., 1991
Tangerina (Citrus reticulata)
CONCHON et al., 1989
Tomate (Solanum lycopersicum)
GIBBS, 1957; FIORINI et al., 1986; 1993;
JANKEVICIUS et al., 1987; SÁNCHEZMORENO et al., 1995
Trifolium glomeratum
SÁNCHEZ-MORENO et al., 1998
Urucum (Bixa orellana)
ALMEIDA et al., 1990
Uva (Vitis vinifera)
CARRARA et al., 1992
8
Tabela 4: Características das infecções causadas por Phytomonas sp.
Patologia
Hospedeiro
Características
Murcha do café ou
Necrose do floema do
cafeeiro
Café
Infecção aguda e crônica
caracterizada
pelo
amarelamento das folhas
Hartrot
Coqueiro
Amarelamento e queda total ou
parcial das folhas.
Chochamento da raiz
Mandioca
Desenvolvimento
pobre
do
sistema radicular e clorose das
partes
aéreas.
Perda
significativa no teor de amido.
Marchitez sorpressiva
Palmeira
Murchamento pela presença de
parasitas nas placas crivadas do
floema de palmas.
Durante o crescimento exponencial, espécies do gênero Phytomonas utilizam
preferencialmente glicose como fonte de carbono e energia (CHAMOUNT et al.,
1994). E como em outros tripanosomatídeos, esse substrato é degradado através da
via de Embden-Meyerhof, na qual as primeiras reações ocorrem em uma organela
denominada glicossoma (SANCHEZ-MORENO et al., 1992). A mitocôndria de
Phytomonas sp não contém um ciclo de Krebs funcional (SANCHEZ-MORENO et
al., 1992; CHAMOUNT et al., 1994) e genes que codificam citocromo c oxidase e
redutase não foram detectados nos maxicírculos do kDNA (MASLOV et al., 1999;
NAWATHEAN; MASLOV, 2000). Contudo, o consumo de oxigênio é inibido por ácido
salicil hidroxâmico (SHAM) mostrando a presença de uma ubiquinol-oxigênio
oxiredutase, também conhecida como terminal oxidase alternativa (SANCHEZMORENO et al., 1992; VAN HELLEMOND et al., 1998).
Phytomonas, juntamente com espécies dos gêneros Herpetomonas, Crithidia,
Blastocrithidia e Leptomonas são denominados tripanosomatídeos inferiores
(DOLLET, 1994). E esses organismos constituem-se em modelos experimentais
úteis que auxiliam na compreensão da biologia, fisiologia e relação parasita
hospedeiro de espécies patogênicas ao homem.
9
1.2.2. Caracterização molecular
Os tripanosomatídeos apresentam características peculiares em relação a
organização e expressão do seu genoma, que está contido no núcleo e na
mitocôndria.
Em células eucarióticas os genes geralmente, são formados por seqüências
alternadas de exons (região codificadora) e introns. A transcrição gênica inicia-se em
regiões específicas (promotor) localizadas a montante a região codificante e
estende-se até a região terminadora ajusante. Os transcritos primários (pré-RNAs)
são processados pela reação de cis-splicing, que remove as seqüências de introns,
ligando os exons adjacentes, simultaneamente. Em genes nucleares que codificam
para proteínas, o pré-RNAm é adicionalmente processado através da adição de um
resíduo de metil guanosina trifosfato (m7Gppp – “cap”) ao primeiro nucleotídeo do
transcrito e em seguida uma cauda poli A é inserida, via poliadenilação, em uma
região específica da extremidade 3’ (ALBERTS et al., 2002).
O genoma dos tripanosomatídeos é organizado em longas unidades
policistrônicas, contendo várias cópias em tandem do mesmo gene, ou genes cujas
funções são relacionadas ou não, e separados por regiões intergênicas curtas. Com
poucas exceções, esses genes não contêm intron (BRINGAUD et al., 1998; revisto
por PAYS, 2005). Após a transcrição, os pré-RNAs mensageiros policistrônicos são
processados através de duas reações de clivagem, uma associada ao trans-splicing
e outra a poliadenilação, que ocorrem na região intergênica e originam RNAm
monocistrônicos (Figura 3).
O processamento da extremidade 5’ do RNAm ocorre através da reação de
trans-splicing. Esse mecanismo envolve a transferência de uma seqüência contendo
cerca de 39 nucleotídeos denominada spliced leader (SL) ou mini-exon presente na
extremidade 5’ do SL-RNA, um transcrito contendo 100 nucleotídeos para
Phytomonas sp (NUNES et al., 1995). Como no cis-splicing, o dinucleotídeo AG, o
qual é precedido por um motivo rico em polipirimidina (com cerca de 8 a 25
nucleotídeos), é o sítio aceptor do trans-splicing (HUANG; VAN DER PLOEG, 1991;
revisto por LIANG et al., 2003).
O mini-exon contém uma modificação na extremidade 5’, com propriedades
similares ao “cap” encontrado no RNAm de outros eucariotos, e consiste de um
resíduo de 7-metilguanosina seguido pela metilação dos quatro nucleotídeos
10
seguintes
(“cap4”:
trimetiladenosina-p-2’-
m7GpppAmAmCmUm
O-
metil
-
-adenosina
7-metil-guanosina-ppp-N6,N6,2’-O-p-2’-O-metilcitosina-p-N3,
2’-O-
dimetiluridina) (PERRY et al, 1987).
A adição da cauda poliadenilada é essencial para processamento completo do
RNAm. Em tripanosomatídeos esse processo está acoplado ao trans-splicing
(LEBOWITZ et al., 1993; MATTHEWS et al, 1994) e não há uma seqüência sinal
consenso conhecida para poliadenilação. Evidências sugerem que a reação ocorra
dentro de uma região curta localizada a montante (cerca de 100 a 400 nucleotídeos)
do motivo de polipirimidinas (MATTHEWS et al., 1994). Em T. brucei na maioria dos
RNAm, a poliadenilação ocorre em uma posição contendo um ou mais resíduos de
adenina localizada entre 80 a 140 nucleotídeos do motivo de polipirimidina (BENZ et
al., 2005).
As três polimerases clássicas de eucariotos, classificadas de acordo com a
resposta a droga α-amanitina já foram identificadas em tripanosomatídeos (HODO;
HATCHER, 1986; revisto por PALENCHAR; BELLOFATTO, 2006). A Tabela 5
mostra algumas características associadas às enzimas. Entretanto, poucos
promotores de genes que codificam proteínas foram identificados até o momento.
Gilinger & Bellofatto (2001) mostraram que a transcrição de genes de SL-RNA de
Leptomonas seymouri é dependente de uma RNA polimerase II. Entretanto, vários
resultados mostram que a RNA polimerase I e promotores ribossomais podem ser
usados para transcrever genes que codificam proteínas em tripanosomatídeos
(RUDENKO et al., 1991; ZOMERDIJK et al., 1991; OTSU et al., 1993; TYLERCROSS et al., 1995; BIEBINGER; CLAYTON, 1996; MARTINEZ-CALVILLO et al.,
1997; DOWNEY; DONELSON, 1999; GUNZL et al., 2003).
11
Região intergênica
a
gene 1
A
pir
b
AG
SL
gene 1
c
A
pir
AAA
gene 2
GU
AG
GU
pir
gene 2
AG
AAA
5’UTR
3’UTR
AAA
Figura 3: Processamento do RNAm de tripanosomatídeos. (a) Representação esquemática
de um transcrito policistrônico contendo os sítios de reconhecimento para trans-splicing
(AG), poliadenilação (A) e o trato de polipirimidina (pir). (b) Reação de trans-splicing e
poliadenilação. A seqüência do spliced leader (SL) está presente no transcrito SL-RNA (em
azul) O diagrama em verde representa a maquinaria envolvida nos processos. (c) Produtos
da reação de processamento. O SL e a cauda poli-A (A-A-A) estão representados nas
extremidades 5’ e 3’ do RNAm, respectivamente. A região em vermelho representa a
seqüência codificante do RNAm e está flanqueada por seqüências não traduzidas (5’ UTR e
3’ UTR).
12
Tabela 5: Classificação das RNAs polimerases de eucariotos de acordo com a resposta
a α-amanitina e especificidade da transcrição (revisto por PALENCHAR; BELLOFATTO,
2006).
Enzima
Produto da transcrição
Eucariotos
RNA polimerase I
RNAr (18S, 28S)
Resposta a α-amanitina
Tripanosomatídeos
RNAr (5.8S,18S,
28S)
Resistente
VSG-RNAm
PARP-RNAm
RNA polimerase II
RNAm
RNAm
RNAsn
SL-RNA
RNA polimerase III RNAsn
RNAsn
RNAsc
RNAt
RNAt
RNAr (5S)
Sensível
Moderadamente
Resistente
RNAr (5S)
RNA: ácido ribonucléico; RNAr: RNA ribossomal; RNAm: RNA mensageiro; RNAsn: pequenos
RNAs nucleares (RNA small nuclear); RNAsc: pequenos RNAs citoplasmáticos (small
cytoplasmic); RNAt: RNA transportador; SL-RNA: spliced leader RNA; VSG: glicoproteína
variante de superfície (variant surface glycoprotein); PARP: prociclinas (procyclic acidid
repetitive protein); S: Svedberg
O kDNA representa cerca de 30% do total de DNA de Phytomonas sp (RIOU
et al., 1987) e é constituído por moléculas organizadas em mini (1,45 kb) e
maxicírculos (31kb) concatenados (MASLOV et al., 1998).
Os maxicírculos da maioria dos tripanosomatídeos apresentam os genes
responsáveis pela atividade mitocondrial da célula (SHAPIRO & ENGLUND, 1995).
Genes que codificam para várias subunidades de NADH desidrogenase, subunidade
6 de ATPase, RNA ribossomais e várias proteínas de função desconhecidas estão
presentes e são ativamente transcritos. Contudo, como mencionado anteriormente,
os genes que codificam para citocromo c oxidase e redutase estão ausentes dos
maxicírculos de Phytomonas (MASLOV et al., 1999; NAWATHEAN; MASLOV,
13
2000). Alguns pré-RNAm originados a partir dessas moléculas são modificados
através de um mecanismo pós-transcricional denominado edição do RNA
(NAWATHEAN; MASLOV, 2000). Em tripanosomatídeos esse mecanismo envolve a
inserção e, com menor freqüência, a deleção de uridinas em uma determinada
posição nos transcritos primários. A especificidade desse processo é controlada por
pequenos RNA guias que são codificados pelos minicírculos (STUART et al, 1997).
Dessa forma, pode ocorrer a correção da fase de leitura, ou mesmo a criação de
uma fase de leitura completa, garantindo a produção de uma proteína funcional
(SHAW et al., 1988).
Os estudos sobre a biologia molecular de Phytomonas sp têm sido
direcionado para taxonomia e identificação das espécies (MARCHÉ et al., 1995;
STURM; FERNANDES; CAMPBELL, 1995; FERNANDEZ-BECERRA et al., 1996;
TEIXEIRA et al., 1996; HOLLAR; MASLOV, 1997; SERRANO et al., 1999; DOLLET
et al., 2000). Dessa forma, poucos genes desses tripanosomatídeos têm sido
caracterizados até o momento. Recentemente, Pappas et al., (2005) obtiveram 2190
seqüências nucleotídicas a partir de uma biblioteca de cDNA de P. serpens 10T
isolada de tomate. Essas seqüências resultaram em 697 grupamentos sendo 452
singletons (seqüências únicas) e 245 contigs (múltiplas seqüências) que foram
categorizadas de acordo com a função baseando-se no banco de dados KOG
(eukaryotic orthologous groups). Assim, cerca de 39,6% das seqüências geradas
mostraram similaridade às proteínas que participam do processo de tradução e
biogênese, bem como na formação dos ribossomas.
1.3. Doença de Chagas
T. cruzi, um tripanosomatídeo heteroxênico, é o agente etiológico da Doença
de Chagas (CHAGAS, 1909). O parasita pode ser naturalmente transmitido ao
homem através de excretas do inseto hematófago infectado (vetor), que pertence à
família Reduviidae, subfamília Triatominae (GARCIA; AZAMBUJA, 1991). Outras
vias de transmissão são transfusão sangüínea, e com menos freqüência via
transmissão congênita, acidentes de laboratório, transplante de órgãos e via oral
(SCHMUÑIS, 2000).
14
Durante o ciclo de vida, o parasita sofre alterações morfológicas,
ultraestruturais, funcionais e bioquímicas que resultam na diferenciação em duas
formas replicativas, epimastigota e amastigota, e uma forma não replicativa e
infectiva, os tripomastigotas. No hospedeiro vertebrado os parasitos encontram-se
como tripomastigotas (no sangue) ou amastigotas (no interior das células de
diversos tecidos), enquanto nos insetos (e também em cultivo acelular) encontramse no tubo digestivo principalmente como epimastigotas ou tripomastigotas
metacíclicos (revisto por TYLER; ENGMAN, 2001).
A Doença de Chagas caracteriza-se pela existência de uma fase aguda,
pouco sintomática e na qual a parasitemia patente é comumente observada. Os
casos não tratados geralmente evoluem para a fase crônica, onde a carga
parasitária é controlada sem que o microrganismo seja eliminado. Nessa fase, cerca
de 30% dos indivíduos infectados desenvolvem patologias que podem se manifestar
por insuficiência cardíaca, distúrbios do ritmo e da condução cardíaca ou dilatação
do trato digestivo (CUNHA-NETO, 1999). Esses sinais clínicos podem estar
associados com a destruição extensiva de neurônios parassimpáticos e do plexo
entérico, assim como a degeneração do músculo cardíaco (BRENNER, 1980;
TAKLE; SNARY, 1993).
Duas hipóteses são propostas para justificar a patogenia na infecção crônica
pelo T. cruzi. A primeira defende que a persistência do parasita em locais
específicos do hospedeiro infectado resulta em uma reatividade inflamatória crônica.
A segunda, que a infecção pelo T. cruzi promove uma resposta inflamatória onde os
alvos são os tecidos do hospedeiro e que a permanência in situ do parasita não é
necessária para desencadear lesão tecidual (TARLETON, 2001).
O papel exato do sistema imune do hospedeiro na patogênese da doença
ainda não é compreendido inteiramente. Entretanto, a sua importância na proteção à
infecção parasitária é sustentada pela evidência, ao menos em modelos
experimentais, de que uma deficiência em respostas imunes celular e/ou humoral a
esses parasitas contribuem para o progresso da doença (GRIMALDI; TRESH, 1993;
TAKLE; SNARY;1993)
Segundo a Organização Mundial da Saúde, a doença de Chagas e
leishmanioses continuam como problemas de saúde pública, particularmente na
15
América Latina (GRISARD, 2000; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002).
Apesar da importância sócio-econômica dessas doenças infecciosas, os esforços
dirigidos para a descoberta de novas substâncias antitripanosomas e/ou vacinas são
insuficientes (ENGERS, 1996; CROFT, 1997).
Os fármacos atualmente em uso para a doença de Chagas (nifurtimox e
benzonidazol) foram desenvolvidos há diversas décadas, apresentam efeitos
colaterais sérios e baixa atividade em pacientes imunodeprimidos. Esses fármacos
são ativos e indicados na fase aguda da doença (revisto por CROFT et al., 2005),
embora o benzonidazol tenha sido eficaz no tratamento de crianças no ínício da fase
crônica (SOSA ESTANI et al., 1998). Além disso, a existência de cepas naturalmente
resistentes ou que apresentam suscetibilidade variada aos fármacos (FILARDI;
BRENER, 1987; MURTA; ROMANHA, 1998) indicam a necessidade urgente para o
desenvolvimento de novas substâncias eficazes, baratas e seguras para o
tratamento da doença de Chagas.
O diagnóstico da doença de Chagas pode ser realizado através da deteccão
direta do parasita (microscopia ótica) ou seu DNA (reação em cadeia pela
polimerase - PCR) em amostras de sangue do hospedeiro vertebrado; e da detecção
indireta através: do xenodiagnóstico, hemocultura e ensaios sorológicos. Contudo,
os métodos mais comumente utilizados envolvem a detecção de anticorpos anti-T.
cruzi através de reações sorológicas, tais como fixação de complemento,
hemaglutinação, ensaios de imunofluorescência, imunoprecipitação e reações
imunoenzimáticas (SAEZ-ALQUEZAR, 1997; RABELLO, 1999).
Atualmente, a maioria dos testes sorológicos comercialmente disponíveis no
Brasil utiliza extratos totais dos parasitas ou frações subcelulares como preparações
de antígenos. Nos últimos anos, diversos pesquisadores têm caracterizado
antígenos específicos de T. cruzi e vários estudos estão mostrando o potencial
desses antígenos para diagnóstico tanto na forma de proteínas recombinantes
quando como peptídeos sintéticos (Tabela 6).
16
Tabela 6: Proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos de Trypanosoma cruzi
com potencial clínico e epidemiológico.
Antígeno
Tamanho
Diagnóstico/Epidemiológico
1F8
24
Infecções crônicas/controle de
cura
A13
230
Infecções crônicas e agudas
FRASCH et al, 1991
Ag1
205
Infecções crônicas
FRASCH et al, 1991
Ag13
85
Infecções crônicas e agudas
Ag2
85
Infecções crônicas
FRASCH et al, 1991
Ag30
180-225
Infecções crônicas
FRASCH et al, 1991
Ag36
85
Infecções crônicas e agudas
FRASCH et al, 1991
B12
200-230
Infecções crônicas
GRUBER; ZINGALES, 1993
B13
116 -140
Infecções crônicas
GRUBER; ZINGALES, 1993;
UMEZAWA et al., 1999
CRA
225
Infecções crônicas
FRASCH et al, 1991
CRA/FRA
Referências
FRASCH
et
al,
UMEZAWA et al., 1999
FRASCH
et
al,
UMEZAWA et al., 1999
1991;
1991;
Infecções crônicas/ banco de
sangue
KRIEGER et al., 1992; GOMES
et al., 2001; SILVA et al., 2002
cy-hsp 70
70
Infecções crônicas/controle de
cura
FRASCH et al, 1991; KRAUTZ
et al, 1998
FCaBP
24
Infecções crônicas/controle de
cura
FRASCH et al, 1991
FL-160
160
Infecções crônicas/controle de
cura
CENTRON et al, 1992
FRA
>300
Infecções crônicas
FRASCH et al , 1991
H49
>300
Infecções crônicas
COTRIM
et
al
UMEZAWA et al., 1999
JL5
38
Formas clínicas cardíacas
JL7
>170
Infecções crônicas
FRASCH
et
al,
UMEZAWA et al., 1999
1991;
JL8
>170
Infecções crônicas
FRASCH
et
al,
UMEZAWA et al., 1999
1991;
JL9
110
Infecções crônicas e agudas
FRASCH et al, 1991
Infecções crônicas e agudas
FRASCH et al, 1991
KRAUTZ et al, 1998
MAP
1995;
FRASCH et al, 1991
mt-hsp 70
70
Infecções crônicas/controle de
cura
SA85-1
85
Infecções crônicas
SAPA
105-205
Infecções congênitas e agudas
FRASCH et al, 1991
srp-hsp
78
78
Infecções crônicas/controle de
cura
KRAUTZ et al, 1998
CENTRON et al, 1992
17
Continuação da Tabela 6
Tc-24
24
Infecções crônicas/controle de
cura
KRAUTZ et al, 1995
Tc-28
24
Infecções crônicas/controle de
cura
ABATE et al, 1993
Tc-40
38-100
Infecções crônicas
LESENECHAL, 1997
Tc46
46
Infecções crônicas
PEREIRA et al., 2000
Tc58
58
Infecções crônicas
PEREIRA et al., 2000
TcD
260
Infecções crônicas e agudas
TcE
35
Infecções crônicas
HOUGHTON et al, 1999
TCR26
150 - 200
Infecções crônicas
FRASCH et al, 1991
TCR39
82
Infecções crônicas
FRASCH et al, 1991
BURNS et al, 1992
CRA: antígeno citoplasmático repetitivo; cy-hsp70: proteína de choque térmico citoplasmática de 70
kDa; FCaBP: proteína flagelar ligante de cálcio; FL-160: proteína flagelar de superfície de 160 kDa;
FRA: antígeno flagelar repetitivo; grp-hsp78: proteína de choque térmico do retículo endoplasmático
de 78 kDa; MAP: proteína associada ao microtúbulo; mt-hsp70: proteína de choque térmico
mitocondrial de 70 kDa; SAPA: antígeno shed acute-phase antigen; SA85-1.1: proteína de superfície
de 85 kDa; TCNA: Trypanosoma cruzi neuraminidase; TS: trans-sialidase; Tc: Trypanosoma cruzi
Os
ensaios
imunológicos
são
bastante
sensíveis,
mas
não
são
suficientemente específicos. Isso ocorre, principalmente, porque as preparações de
antígenos empregadas atualmente são derivadas dos extratos do parasita e contêm
epitopos que podem ser detectados por anticorpos do soro de pacientes com
infecções por outros tripanosomatídeos e bactérias.
A inclusão de antígenos recombinantes e de peptídeos sintéticos para o
diagnóstico sorológico da infecção por T. cruzi foi um avanço claro em relação à
especificidade. Aliado a isso, com o uso de associações de antígenos
recombinantes, ou de peptídeos sintéticos ou de antígenos multi-epitopos houve um
aumento
da
sensibilidade
desses
testes.
Todos
os
produtos
descritos,
comercialmente disponíveis ou não, têm uma especificidade mais elevada que os
testes convencionais, e vários deles requerem menos etapas, portanto, são mais
rápidos. Entretanto, é recomendado o uso de uma dessas ferramentas em paralelo
com um dos testes convencionais, obtendo assim, a especificidade desejada (obtido
por um antígeno recombinante) e a sensibilidade requerida (obtido pelas
preparações antigênicas cruas) (DA SILVEIRA et al, 2001).
18
A relação antigênica entre T. cruzi e tripanosomatídeos inferiores tem sido
relatado por vários autores (VATTUONE; YANOVSKY, 1971; SOUZA et al., 1974;
SANTOS et al., 1975; DE SOUZA et al., 1980; LOPES et al., 1981; MONTEÓN et al.,
1997). Recentemente, Breganó et al., (2003) observaram que camundongos BALB/c
imunizados com P. serpens e posteriormente desafiados com T. cruzi obtinham
proteção parcial, com aumento de sobrevida e parasitemia diminuída. Essa proteção
foi dependente da produção de óxido nítrico e foi capaz de reduzir o número de
amastigotas no coração dos camundongos infectados. Além disso, a imunização
com P. serpens não foi capaz de gerar qualquer tipo de reação inflamatória no tecido
cardíaco, como ocorre com a inoculação de proteínas isoladas do T. cruzi (PINGEFILHO et al., 2005).
A presença de antígenos comuns entre T. cruzi e P. serpens tinha sido
mostrada anteriormente com a utilização de soros de pacientes chagásicos por
Graça e Jankevicius (2002). E recentemente, Santos et al., (2006) mostraram que
anticorpos policlonais contra cruzipaína de T. cruzi reconhecem, no extrato protéico
de P. serpens 9T, dois polipeptídeos de aproximadamente 38 e 40 kDa, sendo este
caracterizado como uma cisteína peptidase.
Dessa forma, a ocorrência de relação antigênica entre T. cruzi e P. serpens,
aliado ao fato de que esses parasitas de vegetais não se desenvolvem a 37 oC
(GUTHER et al., 1988), multiplicam-se rapidamente e são facilmente cultivados in
vitro (DOLLET, 1984), são lisados pelo sistema complemento e induzem uma
resposta imune específica (CARRARA; JANKEVICIUS, 1994) implica em vários
aspectos de interesse prático, tais como: obtenção e utilização de antígenos de
microrganismos inócuos ao homem para diagnóstico imunológico da doença de
Chagas, bem como o desenvolvimento de novas estratégias de imunização contra a
infecção pelo T. cruzi.
1.4. Proteínas ligantes de cálcio
As células são constantemente expostas a diferentes estímulos ambientais.
Respostas a esses sinais são mediadas por vias de sinalização que coordenam
19
diferentes processos envolvidos no crescimento, diferenciação e funcionamento
celular. Os componentes desses mecanismos de sinalização podem ser agrupados
em moléculas sinalizadoras extracelulares e seus respectivos receptores na
superfície celular; moléculas sinalizadoras intracelulares que distribuem o sinal para
moléculas efetoras responsáveis pelo processamento específico do estímulo
recebido. Em eucariotos, esses circuitos regulatórios envolvem a atividade de
proteínas quinases e fosfatases, proteínas que se ligam ao GTP (GTP-binding
proteins) e mensageiros secundários (ALBERTS et al., 2002).
O íon cálcio (Ca2+) intracelular possui um papel crucial como mensageiro no
controle de uma variedade de funções celulares em eucariotos, incluindo contração
muscular, secreção de moléculas, divisão e diferenciação celular, transporte de
sódio e potássio.
A concentração intracelular de Ca2+ de diferentes organismos é bastante
baixa quando comparada com o meio extracelular. Prolongado aumento intracelular
desse íon pode causar efeitos deletérios, tais como morte celular programada
(TRUMP; BEREZESKY, 1995). Assim, a concentração intracelular desse cátion é
controlada pela atividade de canais de cálcio, ATPases dependentes de Ca2+
presentes na membrana plasmática ou em membranas de organelas, tais como
mitocôndria, retículo endoplasmático e complexo de Golgi (CLAPHAN et al, 1995;
MORENO; DOCAMPO, 2003).
Uma vez no interior da célula, íons Ca2+ podem interagir com proteínas
ligadoras de cálcio ou serem seqüestrados para dentro de organelas, como retículo
endoplasmático e mitocôndria. Elevações transientes de cálcio citosólico são
sinalizadas através de proteínas moduladoras de cálcio (ROBERTS et al, 1992),
dentre as quais a calmodulina (CaM) é a melhor caracterizada.
CaM é uma molécula sensora de cálcio multifuncional, que participa de
diversos processos celulares, modulando a atividade de diferentes proteínas (LI et
al., 2004). Além de ser encontrada em diferentes organismos, é a mais abundante
proteína envolvida nos processos mediados por íons Ca2+. A estrutura básica de
CaM (Figura 4) é composta por dois domínios globulares conectados por uma
extensa α-hélice. Cada domínio globular contém dois motivos EF hand que se ligam
ao íon cálcio. Esses motivos consistem em cerca de 29 aminoácidos arranjados em
20
uma estrutura do tipo hélice-alça-hélice e são bastante conservados entre plantas e
animais (NATALIE et al., 1989). A porção α-hélice entre os domínios globulares pode
estar envolvida em interações da calmodulina com outras moléculas (BABU et al,
1985).
N- terminal
C- terminal
Figura 4: Representação esquemática da estrutura tridimensional de CaM. As setas
indicam os motivos EF hand nos domínios globulares da proteína e em verde, os
íons cálcio. A estrutura foi determinada através de difração de raios X e preparada
com o programa MOLMOL. Fonte: Bouché et al., 2005
As proteínas que compõem a família das EF hands podem ser
funcionalmente divididas em dois grandes grupos: moléculas sinalizadoras e
moléculas transportadoras/tamponantes.
As proteínas sinalizadoras, após a ligação de íons cálcio, sofrem mudanças
conformacionais resultando na ligação ou ativação de diferentes proteínas e nesse
grupo encontramos a CaM. Várias moléculas alvo de CaM foram caracterizadas em
eucariotos, entre elas quinases e fosfatases, proteínas do sistema de transporte de
cálcio, proteínas estruturais e fatores transcricionais (ARAZI et al., 1995). A
fosforilação de proteínas mediada por CaM é um dos principais mecanismos pelo
21
qual células eucarióticas traduzem sinais extracelulares em respostas intracelulares
(TAKEZAWA et al., 1996).
Diferentes classes de importantes moléculas associadas aos mecanismos de
transdução de sinais encontradas em eucariotos superiores estão ausentes em
tripanosomatídeos, tais como: receptores serpentina, proteínas G heterotriméricas,
domínios de interação do tipo SH2 e SH3, vários tipos de receptores catalíticos e
fatores transcricionais. Entre as moléculas envolvidas nas interações específicas
com ligantes extracelulares, apenas receptores catalíticos do tipo adenilato ciclase
foram encontrados nesses parasitas. Além disso, várias classes de proteínas
quinases e fosfatases também foram detectadas no genoma de T. brucei, T. cruzi e
L. major (EL-SAYED et al., 2005) (Figura 5 e Tabela 7). Contudo, pouco é sabido a
respeito de moléculas sinalizadoras extracelulares capazes de modificar o
comportamento desses parasitas.
Tabela 7: Moléculas potencialmente envolvidas em mecanismos de transdução de
sinal em tripanosomatídeos. Fonte: PARSONS; RUBEN, 2000.
Moléculas
Função
Reguladores e efetores modulados por cAMP
Diferenciação celular
Reguladores e efetores modulados por Ca2+
Invasão das células do hospedeiro
Morte celular
Inositol fosfato e fosfatidilinositol fosfato
Via desconhecida
Domínios PH
Via desconhecida
Quinases da fase de mitose e reguladores
Controle do ciclo celular
Proteína-quinases estágio-específicas
Via desconhecida
Alvos de proteínas quinases (fosfoproteínas)
Via desconhecida
Fosfatases
Controle do ciclo celular
Proteínas de choque térmico
Diferenciação celular
Chaperoninas
22
Canais
de Ca2+
PtdIns
Adenilato
ciclase
Receptor
serpentina
Receptor
catalítico
Receptor
ligante
MB
ProteínaG
trimérica
PIK
PIPLC
PDE
Domínio
PH
cAMP
Ca
2+
Domínios
SH2, SH3
RAS
PKA
InsP
Quinases
solúveis
CaBPs
Estoque
intracelular Ca2+
Quinaseassociada
ao receptor
Fatores
transcricionais
Fosfoproteínas
Núcleo
Fosfatases
Figura 5: Diagrama simplificado de sinalização celular. PDE: cAMP fosfodiesterase; PIK:
fosfotidilinositol quinase; PIPLC: fosfatidilinositídio fosfolipase C; PKA: proteina quinase
dependente de cAMP; Ptdlns: fosfatidilinositol; SH2, região 2 homóloga a SRC. Setas
pontilhadas e caixas verdes escuro indicam componentes ausentes. Setas contínuas e
caixas verdes claro indicam componentes e conexões conhecidas. Fonte: adaptado de
PARSONS; RUBEN (2000).
Os íons Ca2+ também são utilizados como a principal molécula sinalizadora
em uma variedade de protozoários parasitas como T. cruzi, T. brucei, Leishmania
spp., Plasmodium spp, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Entamoeba
histolytica, Giardia lamblia e Trichomonas vaginalis (MORENO; DOCAMPO, 2003).
23
Em tripanosomatídeos sistemas de transporte de cálcio, tais como canais de
cálcio e ATPases dependentes de Ca2+ estão presentes nas membranas, plasmática
e mitocondrial, e retículo endoplasmático. Além disso, esses protozoários
apresentam uma organela altamente especializada contendo cálcio, polifosfatos e
outros cátions, denominada acidocalcissoma. O armazenamento de cálcio em
compartimentos é de grande importância para a propagação de sinais em
tripanosomatídeos parasitas, já que o citoplasma do hospedeiro vertebrado possui
baixos níveis desse íon (revisto por DOCAMPO, MORENO, 1999; MIRANDA et al.,
2005).
Esses
íons
desempenham
um
papel
regulatório
importante
em
tripanosomatídeos, tais como coordenação dos eventos do ciclo celular de T. brucei
(WU et al., 1994), diferenciação celular de L. donovani (MORROW et al., 1981),
movimento flagelar em C. oncopelti (HOLWILL; MCGREGOR, 1975), transporte de
cálcio em membrana mitocondrial (DOCAMPO; VERCESI 1989), e atividades de
cAMP fosfodiesterase dependente de calmodulina e cálcio (TÉLLEZ-IÑÓN et al.,
1985), proteína kinase (PKC) (GÓMEZ et al., 1989) e ATPase (Ca2+-Mg2+) (BENAIM
et al., 1991). E em T. cruzi, a elevação de Ca2+ intracelular é importante durante a
multiplicação e diferenciação celular (LAMMEL et al., 1996) e requerida para invasão
das células do hospedeiro pelas formas infectivas (MORENO et al., 1994;
DOCAMPO; MORENO, 1996).
Proteínas ligantes de Ca2+ têm sido detectadas em tripanosomatídeos
(Tabela 8) (ENGMAN et al., 1989; LEE et al., 1990; CHUNG; SWINDLE, 1990;
OGUETA et al., 1994; WU et al., 1994; PORCEL et al., 1996; FLAWIÁ et al., 1997;
MALDONADO et al., 1997; BENAIM et al., 1998; FERREIRA et al., 2004). Muitas
dessas proteínas têm sido localizadas no flagelo, uma organela importante nos
mecanismos de sinalização celular mediados por Ca2+ nesses organismos
(ENGMAN et al., 1989; WU et al., 1994; PORCEL et al., 1996; MALDONADO et al.,
1997; GODSEL; RIDGLEY et al., 2000; BUCHANAN et al., 2005).
Uma proteína ligante de Ca2+ (FCaBP – “flagellar calcium-binding protein”) foi
detectada no flagelo de T. cruzi (ENGMAN et al., 1989) e de outros
tripanosomatídeos (PORCEL et al., 1996; MALDONADO et al., 1997). A proteína de
T. cruzi apresenta uma massa molecular estimada de 24 kDa (ENGMAN et al.,
24
1989), é altamente imunogênica e tem sido utilizada como antígeno para reações de
imunodiagnóstico (GODSEL et al., 1995) e controle de cura da doença de Chagas
(KRAUTZ et al., 1995).
Tabela 8: Exemplos de proteínas ligantes de cálcio em protozoários parasitas.
Protozoa
Nome
Número de Acesso*
CaM
M96551
Sinalização celular
FcaBP
D87512
Desconhecida
Calreticulina
AF107115
Armazenamento de cálcio/
imunógeno/ processamento de
glicoproteínas
Leishmania
major
CaM
AL445944
Sinalização celular
L. donovani
Calreticulina
U49191
Armazenamento de cálcio
CaM
X56511
Sinalização celular
Calflagina
U06644
Desconhecida
T. brucei
gambiense
CaM
K02944
Sinalização celular
P. falciparum
CaM
AE014950
Sinalização celular
T. gondii
CaM
Y06376
Sinalização celular
C. parvum
CaM
AQ842812*
Sinalização celular
EhCaBP
M84155
Grainina 1 e 2
AF085196/AF082530
G. lamblia
CaM
AF359239
Sinalização Celular
T. vaginalis
CaM
U38756
Sinalização Celular
T. cruzi
T. brucei
E. histolytica
Função
Desconhecida/citoplasmática
* Seqüência depositada no banco de dados GenBank. Fonte: MORENO; DOCAMPO, 2003.
Como em outros organismos, várias dessas proteínas ligantes de Ca2+ podem
modular a atividade de outras proteínas, entre elas encontra-se a calmodulina
(CHUNG; SWINDLE, 1990; OGUETA et al., 1994; FLAWIÁ et al., 1997; BENAIM et
25
al., 1998). A concentração intracelular de CaM em tripanosomatídeos é bastante
alta, variando entre 5 μM e 20 μM nas espécies de Leishmania e Trypanosoma
analisadas (KAUR; RUBEN, 1994; BENAIM, 1996; BENAIM et al., 1998).
Em T. brucei foram descritos três genes, denominados A, B e C, que
codificam para CaM. Eles estão distribuídos em dois loci, contendo três e quatro
unidades, e são ativamente transcritos gerando um RNAm de aproximadamente 0,8
kb (TSCHUDI et al., 1985; TSCHUDI; ULLU, 1988). Em T. cruzi foram descritas duas
famílias de calmodulina, CalA (5 genes) e CalB (3 genes), cujos genes geram
transcritos de aproximadamente 1,6 e 1,1 kb. Como em T. brucei, esses genes estão
presentes em dois loci no genoma do parasita e cada locus contém representantes,
em tandem e alternados, de cada família (CHUNG; SWINDLE, 1990).
A análise da seqüência de aminoácidos mostrou uma única substituição na
posição 109 entre CaM de T. cruzi (presença de um resíduo de valina) e T. brucei
(presença de um resíduo de isoleucina) (CHUNG; SWINDLE, 1990). Entretanto,
quando comparada com a seqüência de CaM bovina, TcCaM e TbCaM apresentam
18 e 19 substituições de aminoácidos, respectivamente (BENAIM et al., 1998).
Sítios de fosforilação também foram detectados na seqüência de CaM dos
tripanosomatídeos e esses se constituem de nove resíduos de serina e nove
treoninas (TSCHUDI et al, 1985; CHUNG; SWINDLE, 1990). Dessa forma, o padrão
de fosforilação de CaM desses parasitas difere daquele obtido para CaM bovina, que
contém 4 resíduos de serina e 12 resíduos de treonina. Essas diferenças sugerem
que CaM pode contribuir para interações moleculares ou vias de sinalização distintas
no parasita (BENAIM et al., 1998).
Como mencionado em outros eucariotos, efeitos mediados por CaM são
realizados principalmente através da ativação de quinases multifuncionais que
fosforilam substratos distintos. Nesse sentido, OGUETTA et al, 1994 descreveram a
presença de uma proteína quinase dependente de calmodulina em formas
epimatigotas de T. cruzi. Essa proteína estava presente em frações do axonema,
sugerindo um papel importante no movimento flagelar.
Ridgley et al., (2000) mostraram a presença de CaM no flagelo de T. brucei e
também sugerem uma função no movimento flagelar do parasita. Além dessa
importância, CaM também pode estar envolvida na diferenciação celular uma vez
26
que proteínas ligadoras de calmodulina são expressas diferencialmente durante as
formas evolutivas do T. cruzi presentes no hospedeiro vertebrado (ORR et al, 1992).
Nesse sentido, Lammel et al., (1996) mostraram que a incubação de formas
epimastigotas de T. cruzi com homogenato intestinal de Triatoma infestans induz a
um aumento na concentração intracelular de Ca2+. Esse aumento não foi afetado
pela presença de (EGTA) no meio de incubação, contudo a depleção extracelular de
íons Ca2+ promoveu inibição do crescimento de formas epimastigotas. Por sua vez,
inibidores de calmodulina foram capazes de bloquear a metaciclogênese do parasita.
E finalmente, clomipramina, um fármaco com atividade antidepressiva, antitripanotiona redutase e anti-calmodulina foi capaz de aumentar a sobrevida de
camundongos Swiss infectados com T. cruzi (RIVAROLA et al., 2005).
Como
mencionado
anteriormente,
os
protozoários
da
família
Trypanosomatidae possuem uma relação antigênica entre si. Dentre diversas
proteínas de P. serpens que podem estar envolvidas nesta relação antigênica, foi
verificada, através de uma análise proteômica, a presença de uma proteína com
similaridade a calmodulina de alguns organismos, dentre eles Phytophtora infestans,
T. cruzi e T. brucei. Até o momento, não há relato na literatura a respeito de CaM em
Phytomonas sp. Dessa forma, a caracterização do gene que codifica para
calmodulina em P. serpens pode fornecer subsídios para o melhor entendimento da
fisiologia do parasita. Além disso, pode ser útil na investigação dos mecanismos
envolvidos na proteção conferida por P. serpens à infecção causada pelo T. cruzi,
detectada em estudos anteriores. E assim, permitirá a realização de estudos que
conduzam a produção de antígenos úteis para o desenvolvimento de testes
diagnósticos e imunoprofilaxia.
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Cloning and characterization of calmodulin gene of Phytomonas serpens, a
tomato parasite
Tatiana de Arruda Campos Brasil de Souzaa, Viviane Krominski Graça-de Souzaa, Paulo
Roberto Ceridório Corrêaa, Viviane Monteiro-Góesb, Phileno Pinge-Filhoc, Samuel
Goldenbergb, Marco Aurélio Kriegerb and Sueli Fumie Yamada-Ogattaa,*
a
Departamento de Microbiologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de
Londrina, Rodovia Celso Garcia Cid s/n, Campus Universitário, Londrina, Paraná, CEP
86051-990, Brazil
b
Instituto de Biologia Molecular do Paraná, Curitiba, Paraná, Fundação Instituto Oswaldo
Cruz, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
c
Departamento de Ciências Patológicas, Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brazil
* Corresponding author. Tel: +55-43-3371-4297; fax: +55-43-3371-4192.
E-mail address: [email protected] (S.F. Yamada-Ogatta)
43
Abstract
Species of the genus Phytomonas, in the family Trypanosomatidae, can parasitize the phloem,
laticiferous tubes, fruits and seeds of some plant families with a wide geographic distribution
and of great economic importance. Calmodulin is a universal Ca2+-binding protein which can
regulate the activity of various proteins, and in P. serpens no relevant information about this
protein has yet been described. In this study, a 450-bp DNA fragment corresponding to the
coding sequence of calmodulin of P. serpens 15T (camP) was cloned and sequenced. The
nucleotide sequence of this fragment showed similarity to the calmodulin gene of various
organisms. camP encodes an acidic polypeptide (pI 4.0) with an estimated molecular weight
of 16.8 kD. Southern blot analysis, using P. serpens chromosomes separated by pulsed-field
gel electrophoresis, indicated that this gene is present on two different chromosomes.
Northern blot analyses using total and polyA+ RNA fractions of the flagellate detected two
transcripts. In addition, we raised a polyclonal antiserum against the recombinant protein, and
the antibodies recognized a protein with an estimated molecular weight of 17 kD in log-phase
promastigote extracts. It was also demonstrated that recombinant CAMP retains its calciumbinding capacity.
Keywords: Phytomonas serpens, Calmodulin, Calcium-binding protein.
44
1. Introduction
The family Trypanosomatidae is composed of obligatory parasitic species of a wide
range of animals, plants and insects [47]. Members of this family are causative agents of
important vector-borne human diseases, such as Chagas’ disease (American trypanosomiasis),
sleeping sickness (African trypanosomiasis) and leishmaniasis.
The genus Phytomonas has been arbitrarily proposed to include all plant
trypanosomatids [16]. Promastigote forms of these flagellates have been found in the phloem
of trees, tubes of laticiferous plants, mature fruits and seeds of several families of plants with
a wide geographic distribution. In fruits and laticiferous plants, they apparently are harmless
organisms, but phloem-restricted isolates can cause lethal diseases in plants of great economic
importance, such as coconut, oil palm, coffee and cassava [9]. These flagellates are
transmitted to their plant hosts by the saliva of phytophagous hemipterans during feeding
[21,24].
Calcium íons (Ca2+) are used as signaling molecules in a diverse range of eukaryotic
cells, including members of the family Trypanosomatidae, such as T. cruzi, T. brucei and
Leishmania spp. [31]. Cell viability requires perfect functioning of the mechanisms involved
in the control of Ca2+ homeostasis, and the disruption of these can lead to cell death [45].
Increased intracellular Ca2+ concentration in various parasitic protozoa is known to be
involved in the invasion of host cells, which is crucial for maintaining their life cycles
[10,28,29,32]. In addition, Ca2+ signaling is thought to be involved in T. cruzi growth and
differentiation [26]. In these parasites, responses to changes in intracellular levels of Ca2+ are
modulated by calcium–binding proteins.
Several
Ca2+-binding
proteins
have
been
reported
in
trypanosomatids
[4,12,18,30,34,37,46,48], and various are located in the flagellum of the parasite
[8,18,30,37,48], an important organelle with many functions such as motility, chemotaxis,
nutrition and cell signaling. The activity of these proteins can be divided in two major groups
including proteins with direct Ca2+ activation enzyme activity [14] or those that can modulate
the activity of other proteins [34,38]. In the latter group, calmodulin, a universal Ca2+-binding
protein which can regulate the activity of various proteins, is the best studied.
Although several Ca2+-binding proteins have been detected in trypanosomatids, very
little is known about the function of most proteins. In addition, in P. serpens no relevant
information about calmodulin has yet been described. Until this study, Maldonado et al. [30]
detected by Southern blot analysis the homolog genes of 24-kD flagellar Ca2+-binding
45
proteins of T. cruzi in genomes of other trypanosmatids, including P. serpens. In addition, the
sequencing of expressed sequence tags (ESTs) from P. serpens 10T showed the presence of
EST with similarity to calmodulin of T. cruzi [35]. Taking these findings into consideration,
we decided to clone the orthologous gene in P. serpens 15T, and we describe here the
characterization of the calmodulin gene (named calmP) of this plant flagellate. The function
of the protein remains to be elucidated.
2. Materials and Methods
2.1. Reagents
The reagents used in this study were obtained from the following companies.
Applied Biosystems (Foster City, USA): Big Dye® Terminator v.3.1 Cycle
Sequencing Kit. Difco (New Jersey, USA): D-glucose, KCl, NaCl, peptone, tryptone, and
yeast extract. Invitrogen-Gibco (N.Y, USA): AccuPrime Taq DNA polymerase, BenchMark
Protein Ladder, boric acid, dNTPs, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG), mouse monoclonal anti-His, Nick Translation System,
oligonucleotide primers, Tris base, and 0.24-9.5 kb RNA Ladder. Promega (Wisconsin,
USA): phosphatase alkaline-conjugated anti-human IgG, and RQ1 DNase. Qiagen Inc.
(Valencia, USA): Oligotex mRNA kit, pQE30 expression vector, and RNAeasy mini kit.
Sigma Chemical Co. (St Louis, USA): agarose, Calcon, ethidium bromide, Freud’s
complete adjuvant, hemin, nitroblue tetrazolium, phosphatase alkaline–conjugated anti-mouse
IgG, Pulse Marker, and 5-bromo-4chloro-3-indozyl phosphate. Stratagene (La Jolla, USA):
pBluescript® II KS+.
2.2. Microorganism
P. serpens 15 T was isolated from Solanum lycopersicum in Londrina, Paraná, Brazil
[23]. Promastigote forms of the flagellate were maintained at 28 oC in GYPMI medium [21].
Escherichia coli TOP10F’ (Invitrogen-Gibco) was used as the host for subcloning and
plasmid purification. E. coli M15 (Qiagen Inc.) was used for expression and purification of
recombinant CaMP.
2.3. Nucleic acid isolation and analysis
Genomic DNA and total RNA were extracted from log-phase promastigote cultures (1
x 1010 cells/ml). Total RNA fraction was prepared using the RNAeasy mini kit and was
treated with RQ1 DNAse (RNase free) for 1 h. PolyA+ mRNA was extracted by using an
46
Oligotex mRNA kit. Northern blot analysis (5-10 μg RNA per slot) was performed with
denaturing agarose gels [27]. Total DNA was extracted following procedures described
previously [20]. Total chromosomal DNA (1 x 107 flagellates) was separated by pulsed-field
gel electrophoresis (running conditions: pulses of 90 s and 150 s for 50 h at 150 V) in a LKB
2015 Pusaphor System apparatus (GE Healthcare Life Sciences) with 1.2% agarose gels and
0.5X TBE buffer. The coding region of camP was radiolabeled (32P) by nick translation using
Nick Translation System. Nucleic acids were blotted onto Hybond N membranes (GE
Healthcare Life Sciences) and hybridized for 12 h with the probe under high stringency
conditions, as described elsewhere [40].
2.4. Cloning and sequencing of calmP gene
Calmodulin coding sequence was amplified by PCR using AccuPrime Taq
polymerase, total DNA from P. serpens 15T and the oligonucleotide primers CAMPF (5’–
CGCGGATCCATGGCTGATCAGCTCTCTAAC-3’)
and
CAMPR
(5’-
CGCAAGCTTCTACTTGCTCATCATCATCTT-3’). These oligonucleotides were designed
based on the calmodulin coding sequence of P. serpens strain 10T (GenBank/EMBL
databases acession number: GI:58333643). In addition, EcoRI and HindIII restriction sites
were added at the 5’ and 3’ ends of the PCR product, respectively. The amplified gene
sequence was inserted into the EcoRI/HindIII sites of pBluescript® II KS+. The insert was
sequenced with 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, USA) using Big
Dye® Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit. Sequence analysis was performed with
the University of Wisconsin GCG software package [15]. Search for homologies in the
GenBank/EMBL databases was carried out with the Blast algorithm [1]. The deduced amino
acid sequence was analyzed using Pfam database - Protein families database of alignments
and HMMs [3].
2.5. Expression of calmP in E. coli and protein purification
The coding region of calmP cloned in pBluescript KS+ vector was digested with
EcoRI and HindIII, and the resulting fragment was inserted into pQE30 expression vector.
Positive clones were selected by PCR and transformed in E. coli M15 strain. Expression was
induced by adding IPTG to a final concentration of 1.0 mM to log-phase cultures incubated at
37 oC. The protein was purified on a Ni2+-nitrilotriacetic acid column with the Qiaexpressionist procedure (Qiagen Inc.), under non denaturing conditions, following the
47
manufacturer’s instructions. The concentration of the recombinant protein was determined by
the Bradford assay [6].
2.6. Calcium binding assay
The recombinant protein was incubated with 0.1 M CaCl2 at 28 oC for 30 min, and the
solution was loaded onto a Ni2+-nitrilotriacetic acid column. The concentration of Ca2+ ion in
the effluent was assayed by complex-forming titrations using Calcon as indicator. The CaCl2
solution, under the same conditions except for the addition of recombinant protein, was used
as control. This assay was carried out in duplicate on two different occasions.
2.7. Production of immune sera and Western blot analysis
Balb/c mice were inoculated weekly with 10 μg of recombinant CALMP in Freud’s
complete adjuvant. The animals received 4 weekly intradermic inoculations, and serum was
obtained after 1 week the last boost. For immunoblotting, P. serpens 15T protein extracts
were prepared by resuspension of the washed flagellates (final concentrations of 1 x 108) in
SDS-PAGE sample buffer [25]. Parasite protein extracts and purified recombinant CAMP
were separated by electrophoresis in 15% SDS-polyacrylamide gels and electrotransferred
onto Hybond-C membranes (GE Healthcare Life Sciences) according to standard procedures
[44]. The membranes were blocked by incubation in 5% skim milk powder in PBS (150 mM
NaCl, 10 mM Tris–HCl, pH 8.0) containing 0.05% Tween-20. The blots were probed using 1:
5,000 dilution of mouse monoclonal anti-His and 1: 40 dilution of mouse polyclonal antirecombinant protein. Bound antibodies were detected with 1: 7,000 dilution of phosphatase
alkaline–conjugated anti-mouse IgG and developed with 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl
phosphate and nitroblue tetrazolium.
3. Results and Discussion
3.1. Cloning and sequence analysis of calmP gene of P. serpens 15T
The PCR-product obtained from genomic DNA of P. serpens 15T was approximately
450 bp (data not shown). The nucleotide sequence of this fragment showed similarity to the
calmodulin gene of various organisms, including T. brucei and T. cruzi. These results indicate
that the cloned PCR product corresponds to the open reading frame of calmodulin from P.
serpens 15T, so we named it calmP. The nucleotide sequence of this gene was deposited at
the GenBank under acession number DQ503481.
48
Calmodulin, a highly conserved and ubiquitous Ca2+-binding protein, is the most
prominent Ca2+ transducer in eukaryotes, regulating the activity of several proteins with
diverse functions [11]. This protein has been identified in several trypanosomatids
[4,12,19,34,46], and has been shown to have a role in cellular differentiation and motility
[26,34,38].
Overall, calmodulin is a small acidic protein (16 to 18 kD) with two globular domains
connected with a long flexible helix. Each globular domain contains two or more helix-loophelix motifs (EF hand) intimately linked, and each motif binds a single molecule of Ca2+.
There are two primary classes of EF hand protein: the sensor proteins which transduce Ca2+
signals and the buffering/transport proteins which participate in Ca2+ homeostasis. In the
sensor proteins, like calmodulin, ion-binding induces an open conformational change
resulting in the exposure of hydrophobic patches which interact with target proteins. On the
other hand, members of the second class remain in a tight conformation upon Ca2+-binding
[33].
The sequence of calmP encodes a putative acidic polypeptide (pI 4.0) with an
estimated molecular weight of 16.8 kD. As shown in Fig. 1A, four EF hand motifs were found
in the deduced amino acid sequence of the polypeptide encoded by calmP gene. The
alignment of various calmodulin sequences (Fig. 1B) showed that the P. serpens 15T encoded
polypeptide displayed high amino acid identity to homolog proteins of P. serpens 10T
(96.7%) [35], T. cruzi CL strain (96%) [17] and L. major (95%) [22]. CALMP contains 5
amino acid substitution, as compared with the homologous protein from P. serpens 10T, and
these can be attributed to strain polymorphism of the nucleotide sequences.
The NetPhos 2.0 server [5] found nine potential phosphorylation sites in CALMP,
including six serine (S), two threonine (T) and one tyrosine (Y) amino acid residues.
Calmodulin amino acid sequence of T. cruzi contains nine serine residues which can be the
sites for protein-serine/threonine kinase mediated phosphorylation [4]. Calmodulin
phosphorylation is known to affect protein function induced by a conformational change [42].
However, more investigations are needed to demonstrate whether this protein can be
phosphorylated and how it affects the physiology of P. serpens. A search in the "DAS" Transmembrane Prediction server [13] showed no membrane-targeted signal, suggesting a
cytoplasmic localization. Also, no other particular features on analysis of the amino acid
sequence of CALMP were identified.
3.2. Genomic localization of CaMP and analysis of calmP transcript
49
By using pulsed-field gel electrophoresis it is possible to separate intact chromosomes
of trypanosomatids species, which lack of condensed chromosomes during cell division.
These species have highly plastic genomes with considerable size variation of chromosomal
bands [2]. Southern blot analysis of chromosomal DNA of P. serpens 15T showed that camP
gene is located on a high molecular mass chromosomal band (Fig. 2).
In order to investigate whether camP is transcribed, we carried out a Northern blot
analysis with total RNA and polyA+ RNA fractions of the exponentially growing
promastigotes. Two transcripts of around 1.0 kb and 2.0 kb were found in both RNA fractions
(Fig. 3). These results suggest that there are two families of calmodulin gene as is the case for
other Trypanosomatidae members. The genome of T. cruzi possesses two families of
calmodulin genes, CalA (five units) and CalB (three units), also localized in two
chromosomes. Each calmodulin locus consists of alternating tandem arrays of CalA and CalB
genes, and two transcripts can also be detected in polyA+ RNA fractions [12]. In T. brucei,
calmodulin is encoded by a small family of tandemly repeated genes consisting of three to
four units localized in two chromosomal loci. All members of this family are actively
expressed [46].
Another possible explanation for these findings is likely that the higher-molecularweight RNA possesses larger untranslated regions. As we know, the trypanosomatid genome
is organized into long polycistronic units and post-transcriptionally modified to produce
mature mRNA. Despite their common primary transcription, individual genes can show
different expression patterns, and the untranslated regions of their mRNA molecules are
thought to be involved in this regulation [43].
3.3. Expression of calmP in P. serpens 15T
We also investigated whether calmP is translated in P. serpens. Beforehand, we
expressed calmP in E. coli using pQE30 vector. The resulting construction was used to
produce recombinant protein containing a six-histidine tail at the amino-terminal end. This
feature is used to purify the protein by chromatography on nickel columns. A small quantity
of CALMP partitioned to the soluble fraction of the bacterial lysate after sonication, and was
then purified under non-denaturing conditions. The recombinant protein was confirmed by
Western blot analysis using anti-His monoclonal antibodies (data not shown). The
50
recombinant CALMP was used as antigen to obtain polyclonal antisera and in Ca2+-binding
assay.
The capacity of CALMP to bind to Ca2+ was determined by a complex-forming
titration method. This assay is based on the ability of EDTA to form a complex with Ca2+
present in the solution, and the calculated concentration of CALMP-ligated calcium was
found to be 0.95 M per mg of protein.
The polyclonal antiserum raised against recombinant protein was used to determine
whether mRNA encoding CALMP was translated. Western blot analysis of log-phase
promastigotes with this antiserum recognized a protein with an estimated molecular weight of
17 kD, corresponding to the expected molecular weight of CALMP (Fig. 4).
In this study we showed that CALMP displays high similarity in amino acid sequence
to calmodulin from T. cruzi, suggesting that both share similar functions. As mentioned, the
homolog proteins in other trypanosomatids are thought to be involved in many relevant
functions, such as cell differentiation and motility [34,38]. Calmodulin inhibitors, such as
clomipramine, have trypanocidal effects and are able to prevent the development of the
chronic phase in mice infected with T. cruzi [39]. In addition, it was demonstrated that
antigens of P. serpens were strongly recognized by human sera from patient with Chagas´
disease and induced protective immunity in Balb/c mice [7]. This protection could be
dependent upon enhanced nitric oxide production during the acute phase of T. cruzi infection
[36]. Moreover, recently, anti-cruzipain polyclonal antibodies were shown to recognise two
polypeptides of P. serpens [41]. Therefore, the occurrence of a biochemical pathway common
to both trypanosomatids can be exploited to detect relevant targets for chemotherapy and
immunoprophylaxis of the diseases caused by these parasites. On the other hand, there is no
effective chemotherapy against Phytomonas sp diseases, and calmodulin could be used as a
target for new developments in this area, although much work is needed to confirm this. In
view of this, we can use P. serpens as a biological model because it is a non-pathogenic
trypanosomatid and is more readily cultivated in axenic conditions. Further studies are
warranted to understand the biological significance of this protein, and such investigations
are currently underway in our laboratory.
Acknowledgement
We thank Paulo Rodrigo Claure Arauco for help in camP nucleotide sequencing. We
also thank Dr. Albert Leyva for reading this manuscript. This work was supported by grants
from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
51
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Pronex-Fundação
Araucária and Pro-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação (PROPPG) of Universidade
Estadual de Londrina (UEL). This work is part of T.A.C.B.S. M.Sc. manuscript.
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57
A
1
M A D Q L S
N E Q I
S E F
K E A F S L F D K D G D
26
G T I
T G K E L G T V M R S L G Q N P T E A E L Q
51
Y R I
N E V D Q D G S G T V D F P E F L T L M A R
75
K M Q D S D S E E E I
K E A F R V F D K D G N G F
101
I
S
126
I
R E A D V D G D G Q I
A A E L R H V M T N L G E K L G E E E V D E M
N Y E E F V K M M M S K .
B
30
51 52
64
118 119
... G....................Y R...........V............................G E... P. serpens 15T
... T....................DM...........V............................ T D... P. serpens 10T
... T....................DM........... I............................ T D... T. cruzi
Fig. 1. (A) Deduced amino acid sequence of P. serpens 15T CAMP. Boxes indicate the
putative EF-hand Ca2+-binding loop. The potential phosphorylation sites are highlighted in
bold. The underlined residues indicate the amino acids differences between CAMP and the
homolog proteins of P. serpens 10T and T.cruzi, and are showed in (B).
58
Fig. 2. Genomic localization of the gene encoding CAMP of P. serpens 15T. Pulsed-field gel
electrophoresis of P. serpens 15T chromosomes blotted onto nylon membranes and
hybridized with the specific probe. Size markers are Saccharomyces cerevisiae chromosomes
(Pulse Marker) and are indicated in kb at the left.
59
a
b
9,49
7,46
4,40
2,37
1,35
0,24
Fig. 3. Northern blot analysis of RNA extracted from promastigotes forms of P. serpens 15T.
(a) 5 μg/ml of poliA+ and (b) 10 μg/ml of total RNA fractions were separated in agarose gel
containing formaldehyde, blotted onto nylon membranes, and hybridized with the specific
probe. The positions of RNA Ladder size standards are indicated in kb at the left.
60
Fig. 4. Western blot analysis of P. serpens 15T CAMP. E. coli M15 extracts from uninduced
cells (a), purified recombinant protein (b), and crude extract of promastigotes forms of P.
serpens 15T (c) were subjected to SDS-PAGE, electrotransfered onto nitrocellulose
membranes and incubated with the polyclonal antiserum (1:40) raised against the recombinant
protein. The arrow indicates the calmodulin protein. Positions of molecular mass standards
(BenchMark Protein Ladder) in kD are shown at the left.