CITOMETRIA DE
FLUXO
Aplicações práticas
Patrícia Cisneiros dos Santos
Bióloga- UCSAL
Mestranda do curso de Imunologia-UFBa
PRINCÍPIOS BÁSICOS DE
CITOMETRIA DE FLUXO
CITO
Célula
METRIA
Medida
FLUXO
Movimento
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
ANTICORPOS MONOCLONAIS
ANTICORPOS MONOCLONAIS
CITÔMETRO DE FLUXO
CITÔMETRO DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
SISTEMA ÓTICO
SISTEMA ELETRÔNICO
 SISTEMA FLUIDO:
INTRODUZ E ALINHA AS
PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO
 SISTEMA ÓPTICO:
GERA E COLETA OS
SINAIS DE LUZ.
 SISTEMA ELETRÔNICO:
CONVERTE OS
SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS
ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS
PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.
SISTEMA FLUIDO
CÂMARA DE FLUXO
FOCO DO LASER
CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA
FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH”
LOW DIFFERENTIAL PRESSURE
HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE
High Sample
Pressure
60µl/min
Low Sample
Pressure
12µl/min
Laminar
Flow
Sheath
Sheath
Sample
Laminar
Flow
Sheath
Sample
Sheath
SISTEMA ÓPTICO
SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES
PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.
A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A
DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA
PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE
DO LASER.
UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS
DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA
LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.
SISTEMA ÓTICO
FL1
530/30
FACSCalibur
SSC
FL2
FL4
488/10
585/42
90/10 Beam Splitter
661/16
DM 560SP
DM 640LP
670LP
Half Mirror
Fluorescence
Collection Lens
FL3
Beam Combiner
488 nm
Blue Laser
.
Red Diode Laser
~635 nm
Flow
Flow
Cell
Cell
488/10
Focusing
Lens
FSC Diode
Filtros Ópticos – coletar sinais de luz
Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu
número é deixado passar e menor que seu número é refletido.
Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu
número é deixado passar e acima de seu número é refletido.
Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda
específico.
Longpass
460
500
540
Shortpass
460
500
Bandpass
540
460
500
540
Filtro
LP 500
SP 500
BP500/30
Detector – célula
fotoelétrica
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
SISTEMA ELETRÔNICO
 CONVERTE
OS SINAIS ÓPTICOS EM
SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS,
DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM
ANALISADOS NO COMPUTADOR.
SISTEMA ELETRÔNICO
A medida proveniente de cada detector é
denominada Parâmetro
• Parâmetro 1
• Parâmetro 2
• Parâmetro 3
• Parâmetro 4
• Parâmetro 5
FSC
SSC
FL1
FL2
FL3
FLUORESCÊNCIA
O que é a fluorescência ?
Comprimento de onda gerado pela excitação dos
fluorocromos, após atingir a absorção máxima da
luz do laser
Fluoresceína
 = 480 nm
O
H
O
 = 530 nm
CO2H
Luz Incidente de
maior energía
Fluorocromo
Luz Fluorescente emitida
de menor energia e maior
comprimento de onda
FLUORESCÊNCIAS

O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta
luz de comprimento de onda  530 nm, que
corresponde à luz verde.

O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta
luz de comprimento de onda  570 nm, o que
corresponde à luz laranja.

O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta
luz de comprimento de onda  650 nm, o que
corresponde à luz vermelha.
SISTEMA ELETRÔNICO
DISPERSÃO
VOLUME (FS)
BLASTOS
POLIMORFONUCLEARES
MONÓCITOS
LINFÓCITOS
DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS
400
600
Neutrófilos
200
Monócitos
Linfócitos
0
Side Scatter
800
1000
DISPERSÃO:
0
200
400
600
800
Forward Light Scatter
1000
Visão dos dados coletados
•DOT PLOT: FSC x SSC
FL1 x FL2
1000
1000
400
600
CD4 PE
800
800
600
400
200
200
0
0
0
Side Scatter
e
0
200
400
600
800 1000
Forward Light Scatter
200
400
600
CD3 FITC
800
1000
ALGUNS MARCADORES
CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos
timócitos.
CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo
auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas
CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica.
CD19- presente em mais de 95% das células B.
CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do
tecido linfóide e sangue periférico.
CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo
apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.
CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou
granulócitos.
LEUCEMIAS
CD3
CD10
CD3
CD7
CD2
CD7
HLA DR
CD20
CD2
CD 42a
CD3
CD19
CD 61
CD7
CD5
CD19
CD19
CD56
CD33
CD22
CD13
CD23
CD14
CD26
CD34
CD5
Leucemias mielóides
Leucemias Linfociticas ou
Enfermidade residual mínima
Linfomas e Mielomas
APLICAÇÕES CLÍNICAS
- Análise da subpopulação linfocítica
- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas
- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo
- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas
- Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima
- Análise de reticulócitos
- Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna
- Detecção de anticorpos antiplaquetários
- Análise do conteúdo de DNA
- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)
- Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão
linfocitária
OBRIGADA A TODOS!
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