ENSAIO REAL TRIPLEX PARA HBV E DENGUE, VISANDO AMPLIAÇÃO DE ALVOS DO KIT NAT HIV/HCV BIO‐MANGUINHOS
Antonio G. P. Ferreira GPRED/VDTEC/Bio‐Manguinhos/Fiocruz OBJETIVO
ainda mais
AMPLIAR A SEGURAÇA TRANSFUSIONAL NO BRASIL ATRAVÉS DA INCORPORAÇÃO DA DETECÇÃO DO VÍRUS DA HEPATITE B (HBV) E DENGUE NO KIT NAT HIV/HCV BRASILEIRO. ATUALMENTE, PARA TRIAGEM DE DOADORES DE SANGUE NO BRASIL, SÃO REALIZADOS TESTES NAT PARA HIV E HCV. Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
JANELA IMUNOLÓGICA DETECÇÃO DE ANTÍGENOS OU ÁCIDOS NUCLÉICOS
HIV
HCV
HBV
Dengue
Ampliação da Segurança Transfusional
Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
REGIÕES ALVO NO GENOMA
•
Busca de sequências em banco de dados •
Alinhamento de sequências (Bioedit, Clustalw...)
•
Identificaçãp de sequências conservadas com aproximadamente 100 bases
HBV região S
Dengue 3’NCR
Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
SEQUENCIA DE OLIGOS E SONDAS HBV E DENGUE
Definição melhor alvo – sequência de sonda e oligonucleotídeos.
Baseado no desempenho de amplificação, definição de fluorescência (FAM ou VIC)?
Nome
Den G Den G 1
Den G T
Den G T1
Den G T2
Den G T3
Den G T4
HBV
HBV 1
HBV 2
Bases
20
15
28
14
19
17
16
18
19
20
Tm°C Fluorescência
Quencher
61,2
48,2
68,0
40,2
60,0
54,0
47,2
54,8
56,9
59,2
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
6FAM/VIC/JUN
NFQ
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
6FAM/VIC/JUN
MGB NFQ
Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
PADRONIZAÇÃO DA REAÇÃO
Matriz de testes:
Enzima
Transcriptase Reversa
Tampão de Reação
Sondas 10 µM ???
• TaqDNA polimerase
• MgCl2
• dNTPs
Primer
15-25 µM ???
UNG
ENSAIO MULTIPLEX DISCRIMINATÓRIO
HCV
FAM
VIC
FAM
VIC
HCV e/ou
HBV
HIV e/ou
Dengue
PC
Dye3
CI
HIV
Dye3
HBV
Dengue
•
•
•
CI
5 reações moleculares específicas
1 Calibrador Interno
Agrupar os 4 patógenos ‐ alvos em duplas
Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
PROVA DE CONCEITO PARA DETECÇÃO DE HBV E DENGUE
Dengue
HBV
CI
ENSAIO REAL TRIPLEX DESCRIMINATÓRIO Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
PRÓXIMAS ETAPAS
• Padronização final
• Preparo de Lotes Piloto • Avaliação de Desempenho (interna e junto a Hemorede)
• Estudo de Estabilidade
• Relatório Técnico • Submissão Registro junto a ANVISA
• Oferta de Novo Produto Derivado do Kit NAT Brasileiro APLICAÇÃO PRÁTICA
PADRONIZAÇÃO DENGUE/HBV
•
Ampliação Kit NAT HIV/HCV Brasileiro
•
Novo Produto ‐ FLEX NAT
•
Incorporação Dengue e HBV
•
Modelo Flexível para até 24 reações
•
Aumento da Segurança Transfusional
•
Abertura de pool e rotinas reduzidas
•
Manutenção da alta capacidade de
•
Plataforma Compacta e Flexível
processamento
Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
KIT NAT HIV/HCV AMPLIADO COM DENGUE/HBV
KIT NAT HIV/HCV BRASILEIRO ‐ MODELO ATUAL
Módulo de
Controles
Módulo de
Extração
Módulo de Amplificação
HIV/HCV/PC (20uL RNA)
(50uL RNA)
SOBRAM 30uL RNA
AMPLIAÇÃO KIT NAT HIV/HCV BRASILEIRO
Módulo de
Controles
Módulo de
Extração
(50uL RNA)
Módulo de Amplificação
HIV/HBV/PC (20uL RNA)
Módulo de Amplificação
Dengue/HBV/PC (20uL RNA)
Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
Benefícios Expressivos com a Obtenção do Kit NAT Brasileiro, Investimentos em DT e Novos Produtos
Ampliação do Acesso a
Diagnósticos
Econômia de divisas
Produtos estratégicos
com custo acessível
Capacitação
tecnológica em C&T e
Inovação em Saúde
Ampliação das
ações de Saúde
Pública Diagnóstico
precose para
salvar vidas
Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz
“ Devemos usar o passado como trampolim e não como sofá. ” Baseado em Harold Macmillan
Obrigado!
Antonio Ferreira
[email protected]
Antonio Ferreira,
Bio‐Manguinhos/Fiocruz