UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
FABIANO FERNANDES DA SILVA
EFEITOS DE DIFERENTES INTENSIDADES DE NATAÇÃO SOBRE A
COMPOSIÇÃO TECIDUAL ÓSSEA: UM ESTUDO DA ESPECTROSCOPIA
RAMAN
São José dos Campos, SP
2009
FABIANO FERNANDES DA SILVA
EFEITOS DE DIFERENTES INTENSIDADES DE NATAÇÃO SOBRE A
COMPOSIÇÃO TECIDUAL ÓSSEA: UM ESTUDO DA ESPECTROSCOPIA RAMAN
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Biomédica da Universidade do Vale do Paraíba,
como complementação dos créditos necessários
para obtenção do grau de Mestre em Engenharia
Biomédica.
Orientadores: Prof. Dr. Landulfo Silveira Jr. e
Prof. Dr. Wellington Ribeiro
São José dos Campos, SP
2009
S58e
da
Silva,FabianoFernandes
óssea:
tecidual
sobrea composição
intensidades
de natação
Efeitosde diferentes
da Silva;Orientadores:
Raman/ FabianoFernandes
Umestudoda Espectroscopia
* SãoJosédosCampos,
Ribeiro.
Silveira
Jr.,Prof.Dr.Wellington
Prof.Dr.Landulfo
2009.
1 discolaser:color.
em
Dissertaçãode Mestradoapresentadaao Programade PÓs-Graduação
como
do
Paraíba,
do
Vale
Engenharia Biomédica da Universidade
paraobtençãodo títulode Mestreem
dos créditosnecessários
complementação
Biomédica.
Engenharia
1.Analiseespectral2. Natação3. Ossos/ fisiologia4. Ramanespectroscopia
lll.Título
Orient.
Wellington,
ll. Ribeiro,
Jr.,Landulfo,
Orient.
l. Silveira
CDU:543.42:612
para fins acadêmicose científicos,
a reprodução
total ou
Autorizoexclusivamente
eletrônica
por processosfotocopiadores
ou transmissão
parcialdestadissertação,
desdeque citadaa fonte.
do a
Assinatura
Data:da defesa
s4lszlroo,
FABIANO FERNANDESDA SILVA
..EFEITOS DE DIFERENTESINTBNSIDADESDE NATAçÃO SOnnr A COMPOSTÇÃO
RAMAN,,
TECIDUAL ÓSSNA:UM ESTUDODA ESPECTROSCOPIA
grau de Mestre ern Engenharia
Dissertaçãoaprovadacomo requisitoparcial à obtençãodo
em EngeúariaBiomédica,do Institutode Pesquisa
Biomédica,do Programade Pós-Graduação
SãoJosédosCampos,SP,pelaseguinte
do Vale do Paraiba,
daUniversidade
e Desenvolvimento
bancaexaminadora:
Prof. Dr. \ilELLINGTON
RIBEIRO (LINIVAP
Prof.Dr. LANDULFO SILVEIRA JUNIOR
Prof.Dr. FRANCISCO NAVARRO (UGF
da Costa
Prof. Dra. SandraMariaFonseca
Diretordo IP&D - UniVaP
SãoJosédosCampos,04 defevereirode 2009'
Dedicatória
Primeiramente, dedico este trabalho às três pessoas mais importantes da minha
vida, as quais estiveram sempre do meu lado, nos momentos difíceis e alegres desta
caminhada: Meu Pai Joaquim Coelho da Silva, minha Mãe Maria Aparecida
Fernandes da Silva e minha esposa Jaqueline Pieroni Kawatake.
Dedico também, à minha sobrinha Ana Luiza Fernandes da Silva, por ser a alegria
de nossa família.
Dedico a José Carlos Freire (in memóriam), meu tio, em agradecimento por ter
participado da minha vida e da minha educação.
Agradecimentos
A Deus, pelo dom da vida. Pela luz, pela força e pelo pão de cada dia...
Aos Meus Pais, por todo incentivo dado em busca de minha formação acadêmica...
por terem se privado de buscar suas próprias conquistas, em prol das minhas.
Ao amor da minha vida, Jaqueline Pieroni Kawatake, por toda paciência nos
momentos de minha ausência em que buscava o conhecimento.
A meu amigo Renato, sem o qual não conseguiria jamais ter finalizado este trabalho.
Ao Prof. Dr. Landulfo Silveira Jr, indispensável em todos os momentos decisivos do
trabalho, me mostrando o verdadeiro sentido da palavra “Professor”.
Ao Prof. Dr.Wellington Ribeiro por ter me ajudado muito no cumprimento desta
etapa, a qual considero a mais importante da minha vida até o momento.
A Prof. Dra. Maricília, pela compreensão e ajuda.
Aos Professores Miguel Angel e Júlio Cézar, da Unesp de São José dos Campos,
pela disponibilidade e pela atenção dedicada na conclusão do trabalho.
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão deste
trabalho.
Algumas pessoas me dizem que tenho
sorte… mas na verdade, sei que, quanto
mais me esforço, mais sorte tenho
(Jack Niclaus)
Efeitos de diferentes intensidades de natação sobre a composição tecidual óssea:
Um estudo da Espectroscopia Raman
Resumo
A carga mecânica gerada através da atividade física tem um importante papel
no desenvolvimento ósseo. Entretanto, o efeito da natação sobre os resíduos ósseos
é controverso. Neste estudo, a espectroscopia Raman foi utilizada para prover as
informações sobre os efeitos das diferentes intensidades da natação sobre a
composição tecidual óssea do fosfato apatita (960 cm-1), carbonato apatita (1170 cm1
) representando o componente mineral e a matriz de colágeno (amida I, 1660 cm-1).
Neste estudo os animais (18 camundongos fêmeas Swiss Webster) foram divididos
em três grupos (n = 6 por grupo): Sedentário (SED): animais sem exercícios;
protocolo de natação com intensidade igual a 40% (NAT-40) e a 80% (NAT-80) da
carga máxima. O treinamento teve duração de seis semanas. Após o período de
treinamento o fêmur direito de cada animal foi retirado. Portanto, as amostras foram
analisadas através da espectroscopia Raman dispersiva, adquirida da diáfise medial
e lateral do fêmur, num total de 36 espectros. Os achados foram comparados com a
avaliação radiográfica da densidade óptica óssea. A densidade mineral do osso
cortical foi avaliada através da densidade óptica digital usando raio-x de imagem
digital e comparado com as intensidades Raman. As análises evidenciaram que as
concentrações de mineral em ambos os grupos NAT-40 e NAT-80 foram menores
que do grupo SED (-45% e -50% respectivamente). Estes resultados foram similares
aos encontrados na densidade óptica mineral. Também, uma alta razão carbonatofosfato foi geralmente associada com as baixas razões de fosfato e carbonato-amida
I, e vice versa nos grupos NAT-40 e NAT-80 quando comparados ao grupo SED,
indicando altos níveis de remodelamento ósseo nos grupos exercitados. O estudo
indicou que a natação intensa pode ser deletéria para a condição óssea em adultos,
modelo com animais saudáveis e a espectroscopia Raman pode ser um método
viável para uma avaliação não invasiva ou minimamente invasiva da composição
tecidual óssea.
Palavras-chave: Espectroscopia Raman, mineralização óssea, atividade física,
qualidade óssea
Effects of different swimming exercise intensities on bone tissue compositional:
Raman spectroscopy study
Abstract
The mechanical loading generated by physical activity plays an important role
in bone development. However, the effect of swimming exercise on bone remains
controversial. In this study, Raman spectroscopy was used to provide information
about the effects of different swimming exercise intensities on bone tissue
composition of phosphate apatite (960 cm-1), carbonate apatite (1170 cm-1)
representing the mineral content and collagen matrix (amide I, 1660 cm-1). In this
study the animals (18 Swiss Webster female) were divided in three groups (n = 6 per
group): Sedentary (SED): non-exercised animals; swimming protocol with an intensity
equal to 40% (PT-40) and to 80% (PT-80) of the maximum load. The training
duration was six weeks. After the training regimen the right femur of each animal was
harvested. Therefore, the specimens were assessment by dispersive Raman
spectroscopy, acquired in the medial and lateral diaphyse of the femur, in a total of
36 spectra, and the findings were compared to the radiographic assessment of bone
optical density. The cortical bone mineral density was evaluated as digital optical
density using X-ray digital image and compared to Raman intensities. The analysis
evidenced that the mineral concentrations in both PT-40 and PT-80 groups were
lower than the SED group (-45% and -50% respectively). These findings were similar
to the ones found through bone optical density. Also, a high carbonate-phosphate
ratio was generally associated with a low phosphate and carbonate-amide I ratio, and
vice versa in the PT-40 and PT-80 groups than those of the SED mice, indicates
higher bone remodeling in the exercised groups. The study indicated that intense
swimming exercise may be deleterious for bone status in an adult, healthy animal
model and the Raman spectroscopy could be a feasible method for non-invasive or
minimally invasive assessment of bone tissue composition.
Keywords: Raman spectroscopy, bone mineralization, physical activity, bone quality.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. O Sistema RANK / RANKL / OPG. ....................................................................20
Figura 2 - Esboço de transições de elétrons para obtenção de componentes stokes e
anti-stokes...............................................................................................................................31
Figura 3 - Diagrama de blocos ilustrando o sistema de espectroscopia Raman de
bancada...................................................................................................................................32
Figura 4 - Característica do CHA analisado pela espectroscopia Raman (958 cm1
,fosfato). .................................................................................................................................33
Figura 5 - Pontos de referência utilizados para a aquisição dos espectros Raman...38
Figura 6 - Comparação das médias e desvios-padrão do peso corporal.....................39
Figura 7 - Espectros Raman da diáfise óssea.. ................................................................40
Figura 8 - Vetores do componente principal PC1 e PC2 para os sítios da diáfise
medial e lateral. ......................................................................................................................41
Figura 9 - Média da intensidade e desvio padrão para os valores dos componentes
principais PC1 e PC2 dos sítios da diáfise medial e lateral.. .........................................42
Figura 10 - Razão entre a) carbonato/fosfato (1070/960 cm-1); b) fosfato/proteína
(960/1660 cm-1) e c) carbonato/proteína (1070/1660 cm-1) para os sítios da diáfise
medial e lateral........ ............................................................... Erro! Indicador não definido.
Figura 11 - Média da densidade óptica cortical dos grupos SED e treinados.............44
Figura 12 - a) Relação entre os valores de PC1 e a razão fosfato/proteína com a
densidade óptica óssea; b) relação entre a razão carbonato/fosfato com a densidade
óptica óssea............................................................................................................................44
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
PMO - Proteínas Morfogênicas Ósseas
DMO – Densidade Mineral Óssea
DEXA - Absorciometria de Raios-X de Dupla Energia
ER – Espectroscopia Raman
GH - Hormônio de crescimento
IGF-1 - Fator de Crescimento Insulínico I
ARF – Sequencia Ativação-Reabsorção-Formação
UMO - Unidades Metabólicas Ósseas
RANKL - Receptor de NFĸB
OPG - Receptor Osteoprotegerina
M-CSF - Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos
IL-1 - Interleucina 1 (IL-1)
IL-6 - Interleucina 6 (IL-6)
TNF ω - Fator de Necrose Tumoral ω
PGE2 - Prostaglandina E2
TGF β – Fator de Crescimento β
PTH - Paratormônio
HT - Hormônios Tireoidianos
UMB - Unidade Multicelular Básica
IR – Espectroscopia de Infravermelho
CHA – Carbonato de Hidroxiapatita
SED - Animais sedentários não submetidos ao protocolo de natação
NAT-40 – Animais submetidos ao protocolo de natação cuja intensidade
correspondia a 40% da carga máxima
NAT-80 - Animais submetidos ao protocolo de natação cuja intensidade
correspondia a 80% da carga máxima
TCM – Teste de carga máxima
DM – Diáfise medial
DL – Diáfise lateral
PCA - Análise do componente principal
Dpd - Deoxipiridinolina urinária
UA – Unidade Arbitrária
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................13
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................16
2.1 Fisiologia e Fisiopatologia Óssea.............................................................................16
2.2 Exercício Físico e Metabolismo Ósseo ...................................................................25
2.3 Sistema Raman como ferramenta da avaliação óssea ........................................30
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................................35
3.1 Modelo Experimetal ....................................................................................................35
3.2 Protocolo de Natação .................................................................................................35
3.3 Retirada das Amostras...............................................................................................36
3.4 Densidade Óptica........................................................................................................36
3.5 O Sistema Raman.......................................................................................................37
4 RESULTADOS....................................................................................................................39
4.1 Peso Corporal ..............................................................................................................39
4.2 Análise dos Espectros Raman..................................................................................39
4.3 Densidade Óptica Óssea Digital...............................................................................43
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................................45
6 CONCLUSÕES...................................................................................................................49
REFERÊNCIAS......................................................................................................................50
ANEXO A: CEP ......................................................................................................................59
ANEXO B: ARTIGO SUBMETIDO......................................................................................60
13
1 INTRODUÇÃO
Tem sido amplamente reportado na literatura biomédica que a sobrecarga
mecânica gerada pela atividade física desempenha um papel importante no
desenvolvimento ósseo [1-5]. O treinamento físico aumenta o osso cortical e a
atividade osteoindutora devido ao aumento nas proteínas morfogênicas ósseas
(PMO), as quais reduzem a reabsorção óssea e aumentam a síntese óssea [6].
Dessa forma a atividade física poderia ser considerada uma estratégia para redução
do risco de osteoporose, a qual é caracterizada através da diminuição da massa
óssea e degeneração da microarquitetura óssea direcionando à uma maior
fragilidade óssea e riscos de fraturas [7,8].
Em estudos humanos e animais, a densidade mineral óssea (DMO) é utilizada
como um indicador que reflete o desenvolvimento e as propriedades mecânicas
ósseas [9, 10]. O treinamento de resistência e a atividade física com pesos são
alguns meios para melhorar a DMO [11]. Por outro lado, estudos anteriores têm
relatado a imponderabilidade esquelética de nadadores devido à ausência de um
efeito benéfico sobre a DMO ou ainda levando à perda óssea [9, 12, 13]. No entanto,
a prescrição de atividades aquáticas tem sido tradicionalmente adotada como um
instrumento preventivo de saúde óssea em idosos [14, 15]. Particularmente, a
sobrecarga de treinamento e exercícios compulsivos induz a perda óssea [16, 17].
Treinamentos de natação por períodos prolongados em ratos levam a diminuição da
DMO com a estimulação da reabsorção óssea [10], e em ratos hipertensos que
induz a osteoporose espontânea e pode causar hipofosfatemia e osteopenia [12].
Diferentes estudos têm sido usados para avaliar a densidade óssea. Exames
radiográficos são considerados como ferramentas importantes na análise clínica
porque são não-invasivas e podem ser facilmente realizadas. Taba et al [18] mostrou
um método radiográfico para acessar a densidade óssea baseado na análise de
níveis de cinza usando imagens de software, e concluiu que este método mostrou
resultados similares aos achados histológicos. A composição óssea pode ser
acessada pela técnica de absorciometria de Raios-X de dupla energia (DEXA), que
provê uma medida do valor quantitativo de minerais apresentados [19]. Sendo o
osso um componente material, técnicas de raio-x dependem somente da absorção
14
da fase mineral, enquanto a fase orgânica (primariamente colágeno I) continua
essencialmente invisível (transparente), apesar da qualidade do osso ser conhecida
como criticamente dependente nas duas fases [20]. Porém, existe uma necessidade
clara de uma técnica que, além de medir a fase mineral óssea, também medirá a
qualidade e quantidade do colágeno ósseo.
A espectroscopia Raman (ER) é um instrumento óptico, que poderia permitir
informações precisas no componente químico de amostras orgânicas e inorgânicas,
permitindo uma análise de forma menos invasiva e não destrutiva, qualitativa e
quantitativamente [21,22]. Tem sido considerada eficaz para avaliar os tecidos a
nível molecular, e tem sido usado em várias aplicações de diagnóstico não-invasivo
de amostras biológicas como detectar toxicitividade de diferentes doses de
poluentes em bactérias [23], aterosclerose em artérias coronárias e carótidas [24,
25], câncer de pele humano basocelular [26], identificação de lactato sanguíneo [27],
osteoindução em implantes biomateriais [28], várias doenças ósseas [29] síntese
óssea e a osteointegração após a recuperação [30, 31], e avaliação da
microestrutura do osso cortical humano (osteon) [32]. Dessa forma a ER tem sido
aceita por muitos autores como uma ferramenta viável para o estudo de
mineralização óssea [33, 34] e emerge como um complemento importante de
métodos tradicionais para detecção, quantificação e amostras de variações locais na
estrutura molecular da matriz óssea [29].
Muitos trabalhos têm proposto o uso da ER para obter a mineralização da
matriz orgânica para acessar a qualidade do osso [29, 33-35]. Ao menos dois
diferentes aspectos do componente mineral do osso afetado são propriedades
mecânicas: o grau de remodelação e densidade mineral óssea (razões das fases
mineral e matriz) e o grau de cristalização do conteúdo mineral (relacionado à
qualidade mineral e razão carbonato/fosfato) [29, 36]. A composição química do
tecido ósseo pode ser acessada pelas razões entre as bandas do espectro Raman
de interesse, exemplo, osso trabecular femoral teve uma alta razão mineral/matriz
em mulheres com fraturas ao invés de mulheres sem fraturas, enquanto biópsias da
crista ilíaca revelaram uma maior razão carbonato/fosfato no osso cortical de uma
mulher que tinha sustentado a fratura [37]. Também, ossos de pacientes
osteoporóticas pós menopausa foi achado uma menor razão mineral/matriz e uma
maior razão carbonato/fosfato quando comparada com pacientes normais [38]. A
cristalização, um fator importante da qualidade óssea, pode ser associada com a
15
razão carbonato/fosfato e indica a extensa incorporação de carbonato na
hidroxiapatita [34].
O objetivo deste estudo foi de usar a ER dispersiva próxima ao infravermelho,
para avaliar a composição tecidual óssea do fosfato apatita (cerca de 903-991 cm-1),
carbonato apatita (cerca de 1046-1110 cm-1) representando o conteúdo mineral e
matriz colágeno amida I (cerca de 1620-1680 cm-1) em camundongos nadadores
treinados (durante seis semanas) comparado a animais sedentários. A informação
espectral que foi gerada pela ER dispersiva foi depois comparada à avaliação
radiográfica de densidade óssea para poder validar a técnica Raman como uma
possível ferramenta na análise da mineralização e quantificação óssea e para deixar
claro os efeitos das diferentes intensidades da natação no metabolismo ósseo de
camundongos jovens saudáveis.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Fisiologia e Fisiopatologia Óssea
O tecido ósseo constitui um dos maiores sistemas do organismo, constituído
de uma matriz mineralizada e uma fração celular muito ativa. Entre suas funções,
destaca-se: servir de sustento e proteção para as partes moles, ser suporte
muscular e base dos movimentos, assim como constituir um grande reservatório de
íons como o cálcio, que se liberam de forma controlada, de acordo com as
necessidades do momento. Por último, serve de armazenamento ativo da medula
óssea, interagindo com as células precursoras da hematopoiesis [39]. Sua estrutura
morfológica é diretamente responsável pela sustentação do tecido muscular estriado
esquelético, conferindo-lhe um importante sistema de alavancas que amplia as
forças geradas durante a contração muscular [40].
A matriz óssea, constituída por elementos inorgânicos e orgânicos, confere
respectivamente ao osso as características de rigidez e flexibildade. Com relação a
porção inorgânica, os íons mais encontrados são o fosfato e o cálcio, embora íons
de bicarbonato, magnésio, potássio, sódio e citrato sejam também encontrados mas
em pequena quantidade. O cálcio e o fosfato formam cristais de hidroxiapatita (Ca10
(PO4)6 (OH)2) que possuem uma capa de hidratação, a qual facilita a troca de íons
entre o cristal e o líquido interticial. A porção orgânica da matriz é formada de fibras
colágenas tipo I (95%) e por pequena quantidade de proteoglicanas e glicoproteínas.
Todos os ossos são recobertos, tanto na superfície interna como na externa,
por camadas de tecido contendo células osteogênicas – endósteo nas superfícies
internas e periósteo nas superfícies externas. O endósteo é geralmente constituído
por uma camada de células osteogênicas achatadas revestindo as cavidades do
osso esponjoso, o canal medular, os canais de Havers e os canais de Volkmann. A
camada mais superficial do periósteo contém principalmente fibras colágenas e
fibroblastos. As fibras de Sharpey são feixes de fibras colágenas do periósteo que
penetram no tecido ósseo e prendem firmemente o periósteo ao osso [40].
17
Derivado de células mesenquimais do tecido conjuntivo, o tecido ósseo é
traduzido por sua natureza metabolicamente ativa e constituído por três tipos
celulares: os osteoblastos, os osteócitos e os osteoclastos [41].
Os osteoblastos são as células responsáveis pela síntese da porção orgânica
da matriz óssea, que se polimeriza para formar fibras colágenas, estruturais
resistentes dessa matriz. Após o processo de polimerização protéica, ocorre a
precipitação de sais de cálcio nos interstícios da matriz, formando assim, a estrutura
que conhecemos como osso [42].
À medida que a matriz óssea é sintetizada, os osteoblastos ficam envoltos por
ela e passam a ser chamados osteócitos. Estes se comunicam entre si por
canalículos, onde flui um líquido nutritivo fornecido pela circulação óssea. Os
osteócitos também têm função nutritiva no tecido ósseo e são os responsáveis pela
síntese e reabsorção óssea periosteocitárias [43]. Embora essas células apresentem
pequena atividade sintética, são essenciais para manter a viabilidade do tecido
ósseo e reabsorver a matriz e os minerais do osso pela osteólise osteocítica,
processo especialmente importante para manter constantes as concentrações de
cálcio extracelulares.
Já os osteoclastos são células móveis, gigantes e multinucleadas, localizadas
em quase todas as cavidades dos ossos, que apresentam atividade fagocitária e
possuem como principal função a reabsorção óssea por meio de enzimas. Estas
células secretam para a matriz óssea, prótons H+ e colagenases que digerem a
matriz orgânica e dissolvem os cristais de sais de cálcio, liberando-os para o meio
extracelular [42, 44].
Por ser um tecido multifuncional, o tecido ósseo é responsivo a uma
variedade de estímulos e as atividades celulares do tecido ósseo normal são
sincronizadas através de comunicação intracelular, regulação hormonal e estímulos
mecânicos, especialmente representados pelo exercício ou atividade física [45].
Alterações na massa óssea foram assumidas como secundárias para mudar o
balanço entre reabsorção e formação óssea, processos geralmente associados a
processos de qualificação, ao longo da vida. Assim, durante a infância e a
adolescência existe uma elevada reabsorção óssea, todavia com uma formação do
osso maior, resultando em um aumento da massa esquelética. Esta situação
anabólica leva ao pico máximo de massa óssea, aproximadamente na terceira
década, a partir da qual, habitualmente, a reabsorção do osso supera a formação. A
18
partir daí se inicia uma perda gradual da massa óssea que é variável dependendo
da presença de distúrbios metabólicos, uso de substâncias tóxicas e especialmente
hábitos de vida relacionados à ingestão de cálcio e prática de exercícios físicos [39].
Os mecanismos patogênicos relacionados a uma baixa massa óssea são:
a) Falha ao atingir um pico ótimo de massa óssea: aspecto, em parte
condicionado geneticamente, sobre o qual influi diversos fatores
ambientais como estilo de vida, dieta, atividade física, etc., durante a
etapa do crescimento ósseo.
b) Aumento da reabsorção óssea: mecanismo implicado na maioria dos
pacientes com osteoporose.
c) Aspectos
hormonais
típicos
da
idade:
déficit
de
estrogênios,
hiperparatiroidismo secundário.
d) Formação óssea inadequada: causada pela reabsorção excessiva ou por
alteração da regulação osteoblástica.
O esqueleto humano está formado por 85% de osso cortical e 15% de osso
esponjoso, sendo este último o mais dependente das mudanças hormonais do
período puberal, com mediação de hormônios sexuais e possivelmente de hormônio
de crescimento (GH) e seu mediador, o fator de crescimento insulínico I (IGF-1) [39].
O IGF-1 é um polipeptídeo presente na circulação sanguínea, produzido
principalmente no fígado, mediado por receptores hepáticos de GH e em outros
tecidos, como o ósseo. No esqueleto, o IGF-1 assume funções importantes, como a
diferenciação, maturação e recrutamento de osteoblastos [46].
Existem algumas diferenças na conclusão do pico de massa óssea com
relação ao gênero e o tipo de osso do indivíduo. Alguns determinantes vão
influenciar nas diferenças individuais que se analisa nos estudos populacionais:
a) Genética – em estudos populacionais realizados, 75% da variação no pico
de massa óssea são atribuídos à genética.
b) Etnia – os estudos epidemiológicos têm demonstrado que a incidência de
fraturas é muito menor em pessoas da etnia negra do que os caucásicos.
c) Exercício Físico e Cálcio Dietético.
d) Situação Hormonal – o crescimento esquelético requer uma interação
adequada de diversos hormônios, tais como, hormônios sexuais,
tireoidianos, GH, entre outros.
19
e) Estilo de Vida – assim como temos os fatores potencializadores da
aquisição de massa óssea, a vida sedentária, cada vez mais freqüente
entre os adolescentes e o início do tabagismo, podem ser fatores
determinantes para que não se atinja a mineralização óssea ideal.
O processo de remodelamento ósseo ocorre ao longo da vida em ciclos de
quatro a seis meses de duração e é o resultado de dois ciclos intimamente
acoplados: reabsorção e síntese óssea. Determinado pela clássica seqüência
Ativação-Reabsorção-Formação (ARF), esse fenômeno é regulado por uma
complexa relação entre as células osteoclásticas (de reabsorção) e osteoblásticas
(de síntese) integrando o sistema RANK / RANKL / OPG, o qual ocorre nas
chamadas Unidades Metabólicas Ósseas (UMO). Em adultos jovens, cada UMO
possui vida média de 6 a 9 meses, tempo de vida dos osteoclastos de 2 semanas e
dos osteoblastos de 3 meses. Essas características estão associadas a uma
velocidade de reabsorção de 25 µ/dia em cada unidade, de forma que, anualmente
10% de todo esqueleto é remodelado [47].
As células encarregadas deste processo são os osteoclastos, da linha
monócito-macrofágica, ativadas por células do estroma, da linha osteoblástica, que
expressa a ativação do receptor de NFĸB (RANKL), para a ativação de osteoclastos
(figura 1). O RANKL procura unir-se ao seu receptor (RANK) e os proosteoclastos
estimulam de forma potente todos os aspectos da atividade osteoclástica: aumenta a
diferenciação, incrementa a atividade e diminui a apoptose dos osteoclastos. O
RANKL é necessário e suficiente para a ativação osteoclástica, requerendo de
outros fatores permissivos. A interação RANKL-RANK se opõe à ação do receptor
osteoprotegerina (OPG), que evita a ativação dos osteoclastos, ligando ao RANKL e
impedindo sua união ao receptor [48]. Para a osteoclastogênese também é
necessário o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) que podem
sintetizar os osteoblastos.
20
a)
b)
Figura 1. O Sistema RANK / RANKL / OPG. Em A: células osteoblásticas expressam a proteína
transmembrana RANKL e sintetizam a citocina M-CSF. Os precursores osteoclastos expressam o
receptor RANK. O acoplamento RANK / RANKL ativa a via osteoclástica favorecendo a reabsorção
óssea. Em B: os osteoblastos e células do estroma do tecido ósseo sintetizam osteoprotegrina (OPG)
que impedem o acoplamento RANK / RANKL inibindo a ativação osteoclástica e preservando a matriz
óssea [49].
O papel das citocinas segue sendo controvertido, explicando a interação das
células da medula óssea com as células da linha osteoblástica. Assim, a interleucina
1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral ω (TNF ω) e prostaglandina
E2 (PGE2) parecem incrementar a ativação osteoclástica; sem restrição, o fator de
crescimento β (TGF β) reduziria a perda óssea, incrementando a apoptose dos
osteoclastos [39].
Os hormônios sistêmicos, que estimulam a reabsorção óssea, geralmente,
não atuam diretamente sobre os precursores de células osteoclásticas, e sim sobre
as células de estroma-osteoblásticas. Tanto o paratormônio (PTH), 1,25 dihidroxivitamina D e os hormônios tireoidianos (HT), incrementam a expressão de RANKL
21
neste tipo celular, assim como, em alguns casos inibem a síntese de OPG com um
efeito líquido de incremento da reabsorção óssea [50].
O efeito dos estrógenos parece ser indireto, através da regulação de diversos
mediadores, já que seu papel de controle no sistema RANKL-RANK, é
exclusivamente aumentar os níveis de OPG, efeito que se potencializa com seu
papel supressor sobre as sínteses de: IL-1, IL-6, PGE2, M-CSF e TNF ω, freiando a
diferenciação e ativação dos proosteoclastos. Os estrógenos também atuam sobre
os osteoclastos já ativados, incrementando sua apoptose, tanto diretamente como
potencializando a síntese de TGF β [51]. Outro hormônio que influencia na
reabsorção óssea é a calcitocina, que inibe diretamente a atividade osteoclástica, se
bem que de forma transitória por um fenômeno rápido de regulação de seus
receptores expressados sobre os osteoclastos.
Este processo de reabsorção pode ajudar a incrementar a fragilidade óssea,
mas não simplesmente pela diminuição da densidade mineral. Nas espículas do
osso esponjoso se produzem erosões, durante a reabsorção óssea assim como
aumento da porosidade no osso cortical. Se este fenômeno acontece várias vezes
em um mesmo território, o resultado será a perda da armação sobre o que deveria
sustentar o fenômeno acoplado de formação óssea e também descontinuidade das
espículas. Entretanto, o processo de formação requer mais tempo do que a
reabsorção, pois se o remodelamento ósseo está muito acelerado, se compromete a
mineralização, com posterior aumento da fragilidade do osso.
As células implicadas na formação do osso, os osteoblastos, procedem das
células do estroma, que tem sofrido um processo de diferenciação mediante a
interação de fatores locais e sistêmicos. Com evidente plasticidade em seus
precursores, que podem amadurecer em osteoblastos ou adipócitos, dependendo do
estímulo acometido. Assim, a ativação dos receptores PPARγ é capaz de induzir a
maturação das células do estroma em adipócitos [52], sem descartar um papel
regulador da leptina, hormônio secretado por estes.
Entre os hormônios que regulam a atividade osteoblástica, os que mais
representam um papel importante são: GH e seus mediadores e os hormônios
sexuais. Para IGF-1 se tem atribuído um papel central, no aparecimento da
osteoporose, já que seus níveis diminuem progressivamente com a idade,
relacionando, em alguns casos clínicos, uma clara associação entre osteoporose e
diminuição de IGF-1 [53].
22
Os hormônios sexuais parecem influenciar também na formação óssea, visto
seu papel importante na reabsorção e na completa regulação de ambos os
processos por fatores locais [50]. Deste ponto de vista hormonal, a discussão da
formação óssea parece ser um mecanismo patogênico fundamental da osteoporose
induzida por corticóides, se bem que não está claro que o aumento de corticóides
desempenha um papel patogênico na osteoporose primária.
As células da linha osteoblástica segregam diversos fatores de crescimento:
uns atuam como mitógenos e outros como modificadores funcionais. As PMO,
membros da superfamília TGF β, tem a função de induzir a diferenciação das células
osteoblásticas, aumentando o pool de células maduras, sendo reguladas por fatores
locais [54]. Assim, mutações da esclerostina, proteína que inibe a formação óssea
suprimindo a atividade das PMO, podem identificar-se em famílias com uma elevada
massa óssea.
•
REGULAÇÃO DO REMODELAMENTO ÓSSEO
Por razões didáticas temos separados os processos de reabsorção e
formação ósseas. Estes processos estão altamente acoplados, sem mecanismos
independentes de regulação. A atividade dos osteoclastos e osteoblastos se
combinam na denominada unidade multicelular básica (UMB). Estas unidades
medem de 1 a 2 mm de comprimento e 0,2 a 0,4 mm de largura, compostas por
osteoblastos, osteoclastos, rama capilar, rama nervosa e tecido conjuntivo
associado. Nos adultos humanos nascem de 3 a 4 milhões destas unidades a cada
ano, funcionando simultaneamente, aproximadamente 1 milhão em cada momento.
Os osteoclastos se aderem ao osso (origem), produzem uma escavação (laguna de
Howship), que penetra no foco do osso que vai ser reparado (progressão) e entra
em repouso (terminação). No osso cortical se produz um túnel, que posteriormente
será preenchido (sistema Haversiano), enquanto que no osso esponjoso se produz
um escavado das trabéculas. Após a apoptose das células osteoclásticas, os
osteoblastos se aderem e cobrem a área escavada e segregam o osteóide, que
posteriormente será mineralizado. Todavia, não está totalmente claro se a ativação
dos osteoblastos se produz em série.
23
Além do controle hormonal, parece que as forças biomecânicas podem ter um
papel importante na gênese da perda óssea. Assim, foi sugerido a existência de um
mecanostato, sensível as mudanças da carga esquelética, capaz de adaptar a
massa óssea e sua distribuição as forças mecânicas ambientais.
Com uma carga normal se mantém a atividade das UMB em um modo
denominado de conservação esquelética. Quando temos uma carga elevada, a
formação óssea é induzida, mediante o modelamento e depósito de massa óssea
sobre as superfícies do osso. Entretanto, se a atividade é mantida com cargas
baixas de forma crônica, se induz ao remodelamento ósseo denominado desuso,
aumentando-se a renovação da superfície óssea, com perda neste osso da
superfície endostal.
Os resultados encontrados trazem a diminuição de estrógenos que é muito
similares a do desuso, pois se hipotetiza que o déficit de estrógenos poderia alterar
o nível de equilíbrio do mecanostato, com diminuição da sensibilidade do sensor
levando a um novo estado de equilíbrio [55].
•
MARCADORES BIOQUÍMICOS DO REMODELAMENTO ÓSSEO
As patologias enquadradas dentro da enfermidade óssea metabólica se
caracterizam por um desacoplamento do processo de remodelamento ósseo, ou
seja, aumentando a reabsorção, diminuindo a formação, ambos os processos
simultaneamente. Essas patologias estão sendo descobertas através de dados
clínicos, estudos de imagem e principalmente de marcadores bioquímicos que
permitem conhecer a situação funcional óssea.
Nos
últimos
anos
se
tem
caracterizado
componentes
celulares
e
extracelulares do tecido ósseo que refletem especificamente a formação e a
reabsorção óssea, não invasiva, relativamente barata e interpretada como
ferramentas muito úteis para o estudo da enfermidade óssea metabólica.
Classicamente, se tem subdividido em marcadores de formação e da
reabsorção, se bem que alguns destes marcadores podem refletir ambos os
processos [56].
•
MARCADORES DE FORMAÇÃO ÓSSEA
24
a) Fosfatase Alcalina: Específica do osso. Determina-se em soro, mediante
imunoensaio com anticorpos monoclonais. Apresenta uma importante
variabilidade interindividual e não é influenciada pela dieta. É uma das
isoenzimas da fosfatasa alcalina, que se diferencia por sua composição de
carboidratos. Aproximadamente os níveis circulantes de fosfatasa alcalina
total são procedentes de 50% do osso e os outros 50% da fonte hepática.
b) Osteocalcina ou proteína Gla: É uma proteína sintetizada pelos osteoblastos
maduros, odontoblastos e condrócitos. Caracteriza-se por três componentes
do aminoácido ligador de cálcio – ácido gammacarboxiglutâmico e se
determina por imunoensaio. Considera-se um marcador sensível específico
da atividade osteoblástica, podendo também derivar da reabsorção óssea.
Seus níveis seguem um ritmo circadiano com os valores mais elevados pela
manhã, não sendo influenciado pela dieta.
c) Propeptídeos de colágeno, amino e carboxiternais de colágeno tipo 1: São
fragmentos
da
ruptura
do
colágeno
tipo
1
recém
formado
por
endoproteinasas. Considera-se a fase colágena da formação óssea, podendo
proceder também de outros tecidos (pele, tendões, cartilagens, válvulas
cardíacas, grandes vasos, etc). Seguem um ritmo cardíaco e não são
influenciados pela dieta. Se determina em soro, mediante imunoensaio.
•
MARCADORES DA REABSORÇÃO ÓSSEA
a) Hidroxiprolina: É um aminoácido presente em todos os tipos de colágeno.
Quando liberada, sua ruptura enzimática é excretada aproximadamente 10%
na urina.
b) Galactosil-hidroxilisina e glucosil-galactosil-hidroxilisina: ambos se sintetisam
durante o metabolismo do procolágeno, o primeiro sobre todo do colágeno
ósseo.
c) Pontes de Piridinolina e Desoxipiridinolina: Estas pontes são lugares de união
entre as moléculas de colágeno tipo 1. As pontes de piridinolina são
abundantes em vários tecidos, considerando-se marcadores específicos do
remodelamento ósseo.
25
d) As pontes de telopeptídeos: Têm referências a dos produtos de degradação
do colágeno, com pontes procedentes na região amino ou carboxi terminais.
Podem ser determinadas tanto em sangue como em urina.
e) Fosfatase ácida tartarato-resistente 5b: é sintetizada e secretada pelos
osteoclastos durante a reabsorção ativa do osso. Pode determinar-se
mediante imunoensaio em plasma e seus níveis não são influenciados pela
dieta.
f) Sialoproteína óssea: É uma fosfoproteína no colágeno muito abundante no
osso. É sintetizada tanto por osteoblastos como por alguns osteoclastos, se
bem que, recentemente, graças à possibilidade de utilizar um imunoensaio
específico se tem demonstrado que reflete processos associados com a
reabsorção óssea.
g) O papel preciso dos marcadores bioquímicos não está claramente
estabelecido atualmente, já que é necessário resolver alguns aspectos
importantes ainda confusos. Um dos mais importantes é a elevada
variabilidade de determinações (sexo, idade, funções das gônadas,
alimentação, ritmos circadianos e certas mediações), além do próprio ensaio
[39].
2.2 Exercício Físico e Metabolismo Ósseo
A formação do esqueleto, seu crescimento, aumento de volume e resistência
são simultâneos ao desenvolvimento do corpo humano e juntos atingem a
maturidade. A perda da vitalidade e resistência também acontece sincronicamente
[57].
Estudos mostram que a atividade física é um importante fator na manutenção
da massa óssea [58]. Sabe-se ainda que, os mecanismos de carga, impostos pelos
exercícios, aumentam a DMO, independentemente do gênero e da idade dos
indivíduos que os praticam [59]. Isto acontece devido o tecido ósseo ser
dinamicamente responsivo, altamente adaptável [60] à demanda funcional que lhe é
imposta, o que gera alterações de sua massa e força.
26
A força mecânica proporcionada pelo exercício físico regular estimula a
atividade osteoblástica, por meio do efeito piezoelétrico (transformação de energia
mecânica em elétrica), ocasionando, assim, um estímulo direto na incorporação do
cálcio no osso [61]. Isso é sugerido pela presença de sinais bioquímicos que
parecem refletir um campo elétrico, possivelmente decorrente da sobrecarga
aplicada. Essa teoria se aplica a qualquer deformação ou sobrecarga óssea causada
por compressão, tensão, torção ou cisalhamento desse tecido [41].
Em nível celular, o processo de remodelação induzido pela sobrecarga é
realizado pela ação dos osteócitos, que atuam como receptores mecânicos do
estresse aplicado, e libera um fator químico estimulador da proliferação de
osteoblastos no local estressado. Esse processo provoca um aumento das
trabéculas ósseas (rede de barras ósseas horizontais e verticais), fazendo com que
haja o fortalecimento dessas estruturas, ocorrendo assim o aumento da DMO [62].
Outros fatores ligados ao estresse contínuo provocado pelo exercício físico resultam
em adaptações morfológicas, tais como o aumento da espessura cortical e maior
conteúdo ósseo na inserção musculotendínea dos sítios específicos ao movimento
[59].
Como dito anteriormente há, entre a maioria dos autores, um consenso de
que a prática da atividade física é um importante fator na manutenção da massa
óssea. Porém, um aspecto importante é que, para que ocorra uma resposta
osteogênica é necessária uma regularidade e, principalmente, uma duração e
intensidade adequadas [44], levando-se ainda em consideração as diferenças
genéticas entre os indivíduos [41]. Ressalta-se ainda que, a resistência dos ossos
esteja ligada à atividade física, e que tanto os músculos quanto os ossos tendem a
se tornar mais fortes e resistentes à medida que forem usados e exercitados [63]. No
momento em que a atividade física é suspensa, a massa óssea retorna a seus níveis
anteriores e os efeitos benéficos são perdidos [58]. Logo, a falta de atividade física,
pode acarretar em futuros problemas para a saúde óssea.
Os efeitos do exercício físico na melhoria da DMO podem ser, inicialmente,
explicados pela lei de Wolff, descrita, em 1892, pelo anatomista alemão Jullius Wolff.
Retrata-se na literatura como um fenômeno que mostra a relação entre a função e a
forma do osso, demonstrando que os ossos formam-se e remodelam-se de acordo
com a resposta às forças mecânicas aplicadas. Com isso, estabelece-se uma
ligação entre o nível de atividade física e o volume de massa óssea. Além disso,
27
verificou-se que a atividade e o estresse mecânico nos ossos são resultantes da
tensão muscular e, como conseqüência pode acarretar o aumento da DMO [64].
Os exercícios que envolvem a sustentação do próprio peso são essenciais
para o desenvolvimento e a manutenção de um esqueleto saudável [65]. Pesquisas
transversais têm mostrado que as mulheres jovens que participam de atividades
físicas envolvendo a sustentação do próprio peso corporal possuem massa óssea
mais alta na coluna lombar (L2-L4) e no colo do fêmur em relação a mulheres jovens
sedentárias [43].
A importância do estímulo mecânico, ou seja, do exercício físico para a DMO
foi confirmada em estudos com astronautas russos e americanos. As evidências
mostram que os astronautas, após um longo período no espaço, apresentavam
alteração na estrutura músculo esquelética, uma perda de cálcio e atrofia muscular,
em virtude da falta de estimulo mecânico decorrente da ausência de gravidade [60,
66]. Essas mudanças resultam da força gravitacional e da ação intensa dos
músculos ligados aos ossos que neste caso, não existia. A resposta adaptativa do
osso dependerá, portanto, da magnitude da carga e da freqüência de aplicação, as
quais, sendo regularmente repetidas, desencadeiam efeitos osteogênicos [59].
O processo de perda de massa óssea decorrente do envelhecimento [60]
pode ser devido à redução do nível de atividade física diária total e, com isso,
influencia na redução na massa muscular (sarcopenia). Essa redução pode estar
em torno de 40 a 50% na massa muscular entre os 25 e os 80 anos de idade, sendo
que esta perda afeta principalmente os membros inferiores e especialmente as fibras
do tipo II.
A redução na massa e na força musculares que ocorre com o envelhecimento
está
associada
à
menor
estimulação
da
musculatura
esquelética
e
conseqüentemente da inervação utilizada [67]. Uma alternativa, tradicionalmente
adotada para combater essa redução, tem sido a utilização de atividades aquáticas.
Algumas pesquisas mostram resultados significativos tanto para melhora de
alguns casos, como apresentam também resultados não significativos na melhora da
DMO após um ano de treinamento aquático. Portanto, vê-se a necessidade de
melhor avaliar os efeitos do treinamento aquático (natação), na DMO.
Estudos demonstram diferenças significativas na DMO de nadadores com
relação a grupos sedentários. Comparado com atletas de voleibol e basquetebol, os
nadadores tinham menor DMO na coluna lombar e calcâneo. A justificativa era pelo
28
fato da natação ser uma atividade física que não envolve sustentação do peso, ou
seja, uma sobrecarga gravitacional. Por ser no plano horizontal, reduz as cargas na
coluna e músculos antigravitacionais. Isto se agrava pelos longos períodos de
treinamento na posição horizontal [67].
De acordo com a literatura, quando se trata de atividade física e DMO,
sugerem-se, em ordem seqüencial, os exercícios físicos que têm maior estímulo
osteogênico: treinamento de força, modalidade
esportiva
coletiva,
corrida,
caminhada, hidroginástica e natação.
O treinamento de força parece ser o exercício físico mais indicado,
principalmente por proporcionar estímulos osteogênicos de forma segmentada.
Dentre os inúmeros benefícios apresentados pelo treinamento de força, observou-se
a relação com DMO, devido ao aumento progressivo das cargas, oferecendo um
estímulo osteogênico mais eficiente do que exercícios repetitivos [65]. É válido
deixar claro que para estimular a remodelação óssea, a contração muscular
responsável pela deformação óssea, necessita ultrapassar um determinado limiar de
esforço [41].
Trabalhos experimentais, em sua maior parte, têm no mínimo, um ano de
duração e demonstram que o treinamento de força parece ter efeitos benéficos
sobre a massa óssea. Acrescenta-se ainda que o treinamento de força seja uma
atividade física de fácil controle de intensidade e com uma boa margem de
segurança cardiológica [68].
Já para os esportes e corridas, já se observa o desenvolvimento da DMO,
principalmente em sítios específicos (tênis – rádio, voleibol – coluna, corrida – fêmur
e coluna). Particularmente para as corridas, estudos demonstram que a sobrecarga
imposta pela corrida é decorrente do peso corporal e, sendo assim, é constante ao
longo do tempo. Embora possa haver maior número de estímulos durante a corrida,
estudos demonstraram que a intensidade do estímulo é mais importante que a
freqüência do mesmo [41], explicando essa possível perda de eficiência relacionada
ao treinamento de força.
Em alguns casos, temos dados de DMO de nadadores menores que
sedentários, principalmente no sítio da coluna vertebral. Atualmente, porém, o
treinamento de força é parte importante do treinamento dos atletas dessa
modalidade [67]. Sendo assim, dentro do microciclo de treinamento de um nadador,
29
sugere-se a implantação de períodos de treinamentos com pesos, visando a
manutenção e até mesmo o ganho de massa óssea.
A literatura ainda estabelece o efeito indireto como outro fator importante, que
gera o ganho de massa óssea. Este efeito não depende do estímulo da força
mecânica gerada pelo exercício, mas sim pelo processo metabólico na produção de
hormônios que é gerado.
Numa avaliação, em todo o esqueleto, do efeito da atividade física no
tratamento da osteoporose, foi observado que, após três meses de atividade física, a
espessura do osso nasal das ratas com osteoporose, submetidas à atividade física
diária, era significativamente maior em relação aos animais com osteoporose
sedentários e até mesmo em relação aos animais normais. Contudo, o osso nasal
não sofre qualquer tipo de impacto durante o exercício, sugerindo, assim, que o
efeito benéfico provocado pela atividade física seja mediado, não somente pela força
mecânica, mas também, por hormônios e fatores de crescimento [69]. Mesmo
sabendo que o exercício físico causa grandes alterações no metabolismo e na
produção de hormônios, verificamos um amplo campo que pode ser explorado na
busca por tratamentos benéficos ao ganho de massa óssea.
Um ponto importante a ser discutido, é que, altos níveis de atividade física
[60] podem acarretar em prejuízo e diminuição da massa óssea. Para as mulheres,
encontramos a relação dos hormônios sexuais femininos que influenciam no
metabolismo ósseo por estimular a atividade osteoblástica. Essa ação é sugerida
pela existência de receptores estrogênicos nessas células [41]. Além disso, o
estrogênio inibe algumas citocinas, responsáveis pela proliferação de osteoclastos.
Esta talvez seja uma das explicações para o auto índice de mulheres que tem sua
massa óssea diminuída após a menopausa, relacionada com a diminuição na
produção de estrogênio e progesterona.
Com relação às mulheres atletas, uma das causas sugeridas para o processo
de perda óssea com o treinamento intenso de endurance, é o baixo percentual de
gordura corporal, como substrato para a síntese de estrogênio. A perda óssea,
nesse caso, ocorre devido a um déficit calórico, e uma dieta nutricional adequada
poderia evitar esses distúrbios hormonais em atletas do sexo feminino [70]. Estudos
não demonstraram nenhuma associação entre a testosterona e a variação da DMO.
Neste sentido, embora exista um efeito fortalecedor ósseo em atividades
físicas de maior sobrecarga, o treinamento intenso pode acarretar baixa produção
30
hormonal e seus efeitos negativos na saúde óssea axial, principalmente em
mulheres, não podem ser subestimados [41].
2.3 Sistema Raman como ferramenta da avaliação óssea
Técnicas de espectroscopia têm sido utilizadas para análise de tecidos
biológicos, apresentando resultados bastante confiáveis, uma vez que se consiga
adequar a técnica espectroscópica às informações necessárias para uma análise
precisa da amostra [71], ou seja, pode ser usada para acessar a constituição
molecular de um tecido específico e, em seguida, classificá-la conforme as
diferenças observadas no espectro [25].
Quando a luz incide sobre uma substância qualquer, ela pode ser absorvida
ou espalhada elasticamente. Espectroscopia de infravermelho (EI) mede a
freqüência na qual uma dada amostra absorve uma radiação infravermelho e a
intensidade desta absorção. Assim, o espectro de infravermelho representa a
identificação de uma amostra com picos de absorção correspondentes à freqüência
de vibração entre os átomos constituintes do material. A determinação das
freqüências permite identificar os componentes químicos da amostra, visto que cada
grupo químico é conhecido por absorver luz em uma dada freqüência [72]. A
intensidade de certa absorção está relacionada com a concentração de um
respectivo
componente,
fornecendo,
assim,
uma
análise
quantitativa.
Espectroscopia Raman com transformada de Fourier usa radiação de laser com
energia próxima à do infravermelho para excitar uma dada amostra e medir a luz
emitida pela mesma. Grande parte da luz espalhada pode ter a mesma freqüência
que a luz incidente (espalhamento Rayleigh – elástico). Entretanto, uma pequena
fração da luz incidente (hυi) pode ter sua energia diminuída (h(υi-υR) stokes) ou
aumentada (h(υi+υR) anti-stokes) (espalhamento Raman – inelástico) (Figura 2).
31
Figura 2 - Esboço de transições de elétrons para obtenção de componentes stokes e antistokes [72].
Visto que a energia da luz é proporcional à freqüência, a mudança de
freqüência da luz espalhada inelasticamente é igual à freqüência vibracional da
molécula espalhada. Esse processo de troca de energia entre molécula, luz
espalhada e luz incidente é conhecido como efeito Raman. Do ponto de vista
energético, o processo de espalhamento Raman pode ser descrito como a transição
de uma molécula do estado fundamental para um estado vibracional excitado,
acompanhada por uma absorção simultânea de um fóton incidente e emissão de um
fóton espalhado (Raman). A luz Raman espalhada pode ser coletada por um
espectrômetro, onde sua intensidade é mostrada em função de sua mudança de
freqüência (deslocamento Raman). Visto que cada amostra molecular possui seu
próprio conjunto vibracional molecular, o espectro Raman de uma amostra em
particular consistirá de uma série de picos, cada um deslocado pela sua freqüência
vibracional característica daquela molécula, fornecendo assim a identificação para a
molécula que está sendo estudada. O deslocamento Raman é freqüentemente
medido em comprimento de onda (cm-1), uma unidade conveniente para relacionar a
mudança de freqüência da luz espalhada em relação à freqüência da luz incidente. A
figura 3 mostra o diagrama de blocos ilustrando o sistema de espectroscopia Raman
de bancada.
32
Figura 3 - Diagrama de blocos ilustrando o sistema de
espectroscopia Raman de bancada [72].
Células e tecidos são constituídos de proteínas, ácidos nucléicos,
polissacarídeos, lipídios, vitaminas e outros componentes, os quais formam o
complexo molecular com uma estrutura extremadamente intricada. Todas as
doenças, sem exceção, são causadas por mudanças na bioquímica celular e/ou dos
tecidos. O corrente desafio da medicina moderna é o de encontrar uma técnica
analítica que investigue essas alterações por métodos não-invasivos e nãodestrutivos. Poucos métodos analíticos satisfazem esses requerimentos e são
sensíveis o suficiente para revelar detalhes de composição e de estrutura. As
técnicas que têm mais se destacado nesses estudos são as de espectroscopia
NMR, infravermelho e de Raman. Dentre elas, as técnicas de espectroscopia Raman
e de infravermelho estão atualmente emergindo como métodos poderosos para
diagnóstico médico, visto que alterações microscópicas podem ser detectadas por
espectroscopia óptica pelos sinais característicos da doença, resultando em um
diagnóstico in vivo não-invasivo.
Espectroscopia Raman e de EI podem fornecer informações bioquímicas
detalhadas, as quais podem ser utilizadas para detectar doenças em seu estágio
inicial de desenvolvimento. Como a técnica de espectroscopia vibracional pode ser
utilizada através de fibras ópticas, a remoção de amostra não é necessária, o que
representa uma grande vantagem sobre as técnicas convencionais de biópsia para
análise histopatológica [73]. Uma vez diagnosticado opticamente, o órgão doente
pode ser tratado efetivamente antes de alcançar um estágio avançado. Dependendo
33
da natureza da vibração, a qual é determinada por simetria da molécula, as
vibrações podem ser permitidas ou proibidas em infravermelho ou Raman.
Quando relacionamos a ER à mineralização óssea, encontramos alguns
estudos. Estes têm o objetivo analisar a composição tecidual óssea através das
bandas de intensidade geradas nos espectros.
O espectro Raman do osso mostra proeminentes bandas vibracionais
relacionadas com a composição tecidual óssea. A Figura 4 mostra as principais
bandas Raman em 862, 958, 1070, 1270, 1326, 1447 e 1668 cm-1. As bandas 1668
cm-1 e os espectros de 1270 até 1326 cm-1 são atribuídas a amida I e amida III e, as
bandas de 958 até 1070 cm-1 são atribuídas ao fosfato e carbonato de hidroxiapatita
(CHA), respectivamente [31]. A banda em 862 cm-1 pode ser atribuída à vibração de
bandas e C-C, C-C-H extensão de colágeno e lípidos. A banda em 1447 cm-1 é
atribuída
à
flexão
e
modos
de
estiramento
CH
grupos de lípidos e proteínas [74]. A intensidade do espectro Raman está
diretamente relacionada com a operação de concentração / incorporação de
CHA com o osso, visto que, o aumento da quantidade de osso em CHA é indicativo
de uma forma de amento da resistência óssea [31].
Deslocamento Raman (cm-1)
Figura 4 - Característica do CHA analisado pela espectroscopia Raman (958 cm-1,fosfato).
34
Sendo assim, vemos grandes possibilidades, da utilização da espectroscopia
Raman, como ferramenta na mensuração da quantificação óssea, tanto da parte
orgânica como da parte inorgânica.
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Modelo Experimetal
Foram utilizados 18 camundongos fêmeas (35.03 ± 0.32 g), linhagem Swiss,
adultos jovens (90 dias de idade), obtidos do biotério do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo (USP). Os animais foram mantidos
alocados coletivamente (n=10) em caixas de polietileno no biotério do Laboratório de
Fisiologia e Farmacodinâmica do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da
Universidade do Vale do Paraíba com temperatura (22-25ºC), umidade relativa (4060%) e fotoperíodo (ciclo de 12 horas claro-escuro) controlados. Além disto, todos
os animais tiveram acesso à ração peletizada (Purina® lab chow) e água ad libitum.
O estudo teve duração seis semanas e os animais foram divididos igualmente
em três grupos experimentais (n=6): animais sedentários não submetidos ao
protocolo de natação (SED); animais submetidos ao protocolo de natação cuja
intensidade correspondia a 40% da carga máxima (NAT-40); animais submetidos ao
protocolo de natação cuja intensidade correspondia a 80% da carga máxima (NAT80).
Todos os procedimentos adotados neste estudo estavam de acordo com os
princípios de manuseio e cuidado com animais de laboratório preconizados pelo
COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) e aprovado pelo Comitê de
Ética e Pesquisa da UNIVAP (Protocol # A106/CEP/2007).
3.2 Protocolo de Natação
Todos os animais foram submetidos a um período de adaptação à natação
(30 minutos diários sem carga, durante cinco dias consecutivos) para reduzir fatores
ligados ao estresse promovido pela atividade do nado [75]. Após a adaptação, os
animais foram individualmente submetidos ao teste de carga máxima (TCM). Foram
colocadas células de carga (placas de cobre), correspondendo a 0%, 1%, 2%, 3%,
etc., da massa corporal total do animal, colocadas a cada três minutos, em uma tira
36
elástica posicionada junto ao tórax até sua exaustão. Neste estudo, a massa
corporal do animal foi usada para permitir o cálculo individual dos percentuais da
carga de trabalho durante o TCM. A exaustão foi determinada pela incapacidade de
o animal manter-se abaixo da superfície da água por aproximadamente oito a dez
segundos [76, 77, 78]. Posteriormente, todas as placas de cobre encontradas na tira
elástica do animal foram pesadas em uma balança digital de alta precisão (Bel®)
para obter o valor da carga máxima tolerada. Este teste permitiu o ajuste da carga
de trabalho para o treinamento físico a 40% (NAT-40) e 80% (NAT-80) da carga
máxima.
O treinamento físico nas intensidades acima mencionadas foi realizado em
grupos de seis animais devido à promoção de exercício mais vigoroso quando
comparado com o nado individual [70]. Este treinamento ocorreu cinco vezes por
semana com sessões diárias de 30 minutos [10]. Ao final de cada semana
experimental, novo TCM foi realizado para possíveis reajustes da carga de
treinamento. O protocolo de natação foi realizado em um tanque de amianto com
capacidade para 250 litros de água, mantidos à temperatura de 35 ± 2ºC [10, 76].
3.3 Retirada das Amostras
Após o período experimental, os animais foram analgesiados com Xilazina (40
mg/kg) e anestesiados com Ketamina (50 mg/kg), via intramuscular e em seguida,
eutanasiados com solução de KCl (10%) administrado por via intracardíaca, para a
retirada das amostras biológicas. Cuidadosamente, o membro inferior direito foi
retirado do corpo de cada animal com posterior dissecação dos tecidos que
envolviam o fêmur.
3.4 Densidade Óptica
As imagens radiográficas foram obtidas por meio do sistema de radiografia digital
direta pelo sistema Visualix Gx-S HDI. Este sistema consiste de um programa
(Vixwin 1.4) que realiza a aquisição da imagem radiográfica por meio de um sensor
37
CCD (Charge - Coupled Device ou dispositivo de carga acoplado) de dimensões
27,5mm por 36,08mm, e área ativa de 20,00mm por 30mm. O aparelho de raios X
utilizado para aquisição das radiografias, foi o 765 DC (Gendex Dental Systems,
Dentsply International, IL, USA), operando com 65kVp, corrente de 7mA, área focal
efetiva de 6 cm e distância foco-sensor de 40 cm e tempo de exposição de 0,025
segundos, com feixe central de raios X direcionado de forma a incidir
perpendicularmente ao sensor. As imagens foram capturadas e armazenadas no
formato TIFF (Tagged Image File Format). Este formato permite preservar a qualidade da imagem.
Para fazer a análise da densidade óptica das imagens radiográficas foi utilizado o
programa de edição de imagens Adobe Photoshop versão 7.0 (Adobe systems
incorporated, 345 Park Avenue, San Jose, California 95110, USA). Para isso foi
utilizada a ferramenta histograma da aba imagem.
3.5 O Sistema Raman
Para a mensuração Raman, foi utilizado um laser de estado sólido de Ti:safira
(λ=830 nm) (Spectra Physics, modelo 3900S, Mountain View, CA, EUA)
bombardeado por um laser de Argônio (Spectra Physics, modelo 2017S, Mountain
View, CA, EUA) que gerou excitação infravermelho próximo. Um espectrógrafo
(Bruker Optics, modelo: 250 IS, MA, EUA) com resolução espectral de
aproximadamente 8 cm-1 dispersou a luz Raman espalhada da amostra e um sensor
CCD Deep Depletion (Princeton Instruments, modelo LN/CCD-1024-EHR1; Tucson,
AZ, EUA) refrigerado em nitrogênio líquido, detectou o sinal Raman. Esse sistema
foi controlado por um microcomputador, o qual estocou e processou os dados. A
potência laser usada sobre a amostra foi de 80 mW com tempo de aquisição
espectral 10 s. A figura 5 mostra os pontos de referência utilizados para a aquisição
dos espectros Raman. Neste estudo foram adquiridas duas leituras de cada
espécime, totalizando 36 espectros. Todos os espectros foram recolhidos no mesmo
dia para evitar desalinhamento óptico. O valor médio das intensidades de três
bandas características foi medido: fosfato (cerca de 903-991 cm-1), carbonato (cerca
de 1046-1110 cm-1) e matriz colágeno amida I (cerca de cm-1616-1720). As razões
destas áreas resultaram em medidas de carbonato/fosfato, fosfato/amida I e
38
carbonato/amida I [37]. Os dados foram analisados pelo software MatLab 5.1
(Newark, Nova Jersey, E.U.A) para calibração e subtração dos espectros de fundo.
Para a calibração do equipamento Raman, foi utilizado o naftaleno (C10H8) com
picos característicos [30,21,22], devido a sua intensidade na região de bandas (8001800 cm-1) de nosso interesse. O espectro do naftaleno também foi medido cada vez
que a amostra foi alterada para se certificar de que o laser e a coleta foram
otimizados. Para remover a fluorescência de fundo a partir do espectro original, uma
quinta forma polinomial foi encontrada para dar melhores resultados facilitando a
visualização dos picos encontrados no osso. Esta rotina também pode compensar o
ruído de fundo, devido ao CCD. A análise estatística foi realizada utilizando as
análises espectrais baseadas na análise de componentes principais (PCA) [79]. Uma
forma de análise de variância (ANOVA) foi usada para analisar o peso ósseo e as
mudanças de peso corporal semanais entre os três grupos. Uma análise posthoc
(Turquia-Kramer Test) foi usada para determinar a localização das diferenças
significativas quando necessária. Todos os dados foram expressos como média ±
DP, e as diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05.
Figura 5 - Pontos de referência utilizados para a aquisição dos espectros Raman
39
4 RESULTADOS
4.1 Peso Corporal
A figura 6 mostra o gráfico com a média e o desvio-padrão do peso corporal
de todos os grupos do início e ao final do período de treinamento. Os camundongos
de todos os grupos experimentais tiveram pesos semelhantes inicialmente. Após a
sexta semana de treinamento, o aumento do peso corporal de ambos os grupos
treinados foi menor que o grupo controle. Os grupos NAT-40 e NAT-80 exibiram
médias de peso corporal entre 9,6% e 10,9% menores que o grupo SED,
respectivamente (p < 0.05). Não existe diferença significativa na média do peso
corporal entre os dois grupos treinados durante todas as fases do período de
treinamento.
Semana 1
Semana 6
Média SED
Média NAT 40
Média NAT 80
Figura 6 - Comparação das médias e desvios-padrão do peso corporal do início e fim do período de
treinamento, indicando que o grupo SED teve um aumento de peso corporal significativo com relação
aos grupos treinados ao final do estudo (p < 0.05).
4.2 Análise dos Espectros Raman
O espectro Raman do osso mostrou as bandas vibracionais proeminentes
relacionadas com a composição tecidual óssea. A figura 7 mostra a média do
40
espectro Raman de cada um dos pontos obtidos da diáfise femoral para os grupos
SED, NAT-40 e NAT-80. As principais bandas Raman do osso foram encontradas
em ~ 960 cm−1 atribuída ao fosfato apatita (PO4), em ~1070 cm−1 atribuída ao
carbonato apatita (CO3), e em ~1660 cm−1 atribuída à amida I para a matriz
colágeno. Na figura 7 pode ser encontrada as diferenças na intensidade das bandas
Raman selecionadas em todos os grupos experimentais, principalmente no grupo
SED que apresentou maior intensidade comparado aos grupos NAT-40 e NAT-80.
Essas diferenças ainda foram avaliadas através do PCA (Análise do Componente
Principal) e das razões de intensidade das bandas.
Diáfise
Medial
Média SED
Média NAT-40
Média NAT-80
Diáfise
Lateral
Média SED
Média NAT-40
Média NAT-80
Deslocamento Raman (cm-1)
Figura 7 - Espectros Raman da diáfise óssea. As bandas indicam principalmente: a)
fosfato apatita (960 cm-1), b) carbonato apatita (1070 cm-1), c) amida I para matriz
colágeno (1660 cm-1).
41
A fim de avaliar as diferenças no espectro Raman dos tecidos ósseos
relacionados com a quantidade das fases mineral e orgânica, duas análises foram
realizadas. Primeiro, o PCA foi aplicado em todos os espectros Raman da diáfise
femoral, e os valores do componente principal foram usados para correlacionar as
diferenças da condição de treinamento dos animais, dependendo da informação
espectral encontrada no primeiro vetor do componente principal. Em segundo lugar,
razões entre as fases orgânicas e inorgânicas (carbonato, fosfato e bandas de
proteína) foram calculadas visando detectar o grau de remodelamento e qualidade
óssea.
Para a análise do PCA, o valor de intensidade média para os valores do
primeiro componente principal foram obtidas de todas as medições efetuadas em
cada grupo experimental em todas as referências nos pontos femoral. A Figura 8
apresenta a carga do vetor espectral do PC1. Pode ser visto que o PC1 apresenta a
maior parte das informações espectrais provenientes de apatita minerais (CHA: as
bandas 960 a 1070 cm-1), e alguma contribuição para a matriz orgânica (banda 1660
cm-1). O PC2 apresenta a informação espectral da banda 960 cm-1 e alguns
remanescentes do fundo de fluorescência em 1500-700 cm-1.
Deslocamento Raman (cm-1)
Figura 8 - Vetores do componente principal PC1 e PC2 para os sítios da diáfise medial e lateral.
42
As análises estatísticas ANOVA dos valores das intensidades de PC1 de
ambos os sítios (média dos sítios da diáfise medial e lateral) evidenciaram que as
concentrações de CHA nos grupos NAT-40 e NAT-80 foi significativamente menor
que o grupo SED (-45% e -50%, respectivamente, < 0.05) (Figura 9). Para PC2 não
foi encontrado diferença estatística significativa entre os grupos.
Média SED
Média NAT-40
Média NAT-80
Média SED
Média NAT-40
Média NAT-80
Figura 9 - Média da intensidade e desvio padrão para os valores dos componentes principais PC1 e
PC2 dos sítios da diáfise medial e lateral. * e ** indica grupo SED com diferença estatiscamente
significante aos grupos treinados NAT-40 e NAT-80, respectivamente (p < 0.05).
A avaliação do remodelamento, entre as razões carbonato/fosfato (1070/960
cm-1), fosfato/proteína (960/1660 cm-1) e carbonato/proteína (1070/1660 cm-1) foi
calculado usando as intensidades das bandas Raman. A Figura 10 apresenta as
razões para os sítios da diáfise medial e lateral. Apesar das diferenças das razões
não
estatiscamente
significativas,
foram
observados:
a)
maior
razão
carbonato/fosfato nos grupos NAT-40 e NAT-80 que no grupo SED (Figura 10a); b)
menor razão carbonato/proteína nos grupos NAT-80 e NAT-40 que no grupo SED
(Figura 10b) menor razão fosfato/amida I nos grupos NAT-80 e NAT-40 que no
grupo SED (Figura 10c). Uma alta razão carbonato fosfato foi geralmente associada
com uma baixa razão fosfato/proteína e carbonato/proteína, e vice versa (Figura 10).
43
(a)
Média SED
Média NAT 40
Média NAT 80
Média NAT 40
Média NAT 80
Média NAT 40
Média NAT 80
(b)
Média SED
(c)
Média SED
Figura 10 - Razão entre: a) carbonato/fosfato (1070/960 cm-1); b) carbonato/proteína (1070/1660
cm-1) e c) fosfato/proteína (1070/1660 cm-1) para os sítios da diáfise medial e lateral. Diferenças
estatisticamente não significativas entre os grupos.
4.3 Densidade Óptica Óssea Digital
A
densidade
óptica
óssea
mostrou
na
região
cortical
diferenças
estatisticamente não significativas entre os grupos experimentais. Porém, foi
encontrado que o grupo SED apresentou maior valor em relação ao grupo NAT-40 e
este um maior valor em relação ao grupo NAT-80 (Figura 11).
44
Média SED
Média NAT 40
Média NAT 80
Figura 11 - Média da densidade óptica cortical dos grupos SED e treinados. Diferenças
estatisticamente não significativas entre os grupos.
A figura 12 representa graficamente os valores médios de PC1 e a
intensidade Raman da razão fosfato/proteína com a correspondência da média da
densidade óptica óssea (Figura 12a). Também, foi representado a relação da
intensidade do carbonato com os valores correspondentes de PC2 (Figura 12b).
Densidade Óptica (níveis de cinza)
PC2 (u.a)
Figura 12 - a) Relação entre os valores de PC1 e a razão fosfato/proteína com a densidade óptica
óssea; b) Relação entre a razão carbonato/fosfato com a densidade óptica óssea.
45
5 DISCUSSÃO
Este artigo propõe uma aplicação da ER dispersiva para o estudo da
qualidade óssea. Esta técnica foi escolhida porque se tem revelado uma maneira
não-destrutiva de acessar a estrutura molecular dos componentes ósseos, mineral e
orgânico [29]. O objetivo foi avaliar a composição tecidual óssea, comparando a
quantidade relativa do conteúdo mineral (fosfato apatita, 903-991 cm−1 e carbonato
apatita, 1046-1110 cm−1) com a matriz colágeno (amide I, 1620-1680 cm−1) em 6
semanas de treinamento de natação de camundongos sedentários para a avaliação
da densidade óptica óssea. Portanto, a informação espectral fornecida pela ER
poderia ser usada como uma ferramenta para a quantificação da mineralização
óssea, esclarecendo os efeitos de diferentes intensidades natação sobre o
metabolismo ósseo de camundongos jovens saudáveis.
O tecido ósseo é um sistema complexo com muitas variáveis que afetam sua
composição, formação, força e propriedades [80]. Muitos métodos utilizados para o
estudo ósseo têm sido insuficientes para explorar plenamente todas as interações
que ocorrem em um sistema dinâmico como tal. Além disso, a maioria desses
métodos são incapazes de gerar informações a nível molecular [20,24]. A
espectroscopia vibracional, incluindo a ER, tem a vantagem de ser sensível a ambos
os componentes minerais e orgânicos dos ossos, permitindo, assim, o estudo das
interações da matriz mineral, assim como as propriedades de cada componente (29,
33-36). Portanto, as informações das maiores bandas dos espectros Raman do osso
foram estabelecidas [29]. Como marcadores de fosfato, carbonato e matriz foram
usados o fosfato simétrico P-O atribuído ao fosfato apatita (960 cm-1), carbonato
simétrico C-O simétrico atribuído ao carbonato apatita (1070 cm-1) e colágeno amida
I da matriz orgânica (1660 cm-1). Foi possível demonstrar que o espectro de Raman
mostra claramente a proeminência óssea bandas vibracionais relacionadas aos
biomarcadores (Figura 7).
No presente estudo, a avaliação da mineralização óssea e a fase orgânica foi
feito quantitativamente através de PCA e análise da razão das bandas,
respectivamente, aplicadas em todos os espectros Raman do fêmur. Na análise
PCA (Figura 9), verificou-se uma redução estatisticamente significativa sobre as
concentrações de CHA nos grupos treinados (PT40 e P80) na mesma localização
46
anatômica (pontos da diáfise femoral) comparado aos sedentários, que era nulo para
direcionar os músculos. Tal diferença sugere que a influência mecânica negativa
ocorre após um intenso regime de exercício sem peso ostentando os sítios dos
músculos esqueléticos onde estão inseridos (81). Este efeito deletério promovido
sobre o osso através do treinamento de natação tem sido descrito na literatura [9,
12, 13, 17]. Bourrin et al. [17] utilizou um regime intenso que envolveu ratos nadando
por 6 horas/dia, refletindo um regime de nadadores no pico máximo durante a
temporada. Encontraram decrementos da condição mineral óssea, que poderia ser
uma função de períodos prolongados na água e/ou exposição prolongada a
hormônios de estresse, como a corticosterona. Kim e Park [10] confirmaram que a
natação em ratos aumenta a ligação de deoxipiridinolina urinária (Dpd) na excreção,
refletindo dinamicamente a reabsorção óssea estimulada, e mostrou uma tendência
para o decréscimo da DMO do fêmur e da tíbia comparada ao grupo controle. Kim et
al. [12] observaram que períodos prolongados de natação resultaram na diminuição
da DMO e força do fêmur aproximadamente 7% e 20%, respectivamente, quando
comparado ao grupo de animais sedentários.
É importante notar que, apesar de não serem estatisticamente significativos,
os resultados da medição da densidade óptica digital dos ossos são animadores
(Figura 11), pois os mesmos foram achados pela análise do PCA, em detrimento à
concentração da densidade óssea nos grupos exercitados. Iwamoto et al. (82)
relataram que, embora a DMO de ratos exercitados não apresentaram diferenças
significativas em 4 ou 8 semanas, para o início do treinamento do exercício, ela
começou a mostrar em 12 semanas. Esse achado poderia ser o motivo para
nenhuma mudança significativa na DMO dos nossos grupos de natação, em que o
período experimental foi demasiado curto para alterar esta variável. Também é
importante considerar que a informação espectral presente nas cargas dos vetores
do PCA para a apatita mineral (bandas 960 e 1070 cm-1) e alguma contribuição para
a matriz orgânica (banda 1660 cm-1), enquanto técnicas de raio-x dependem de
absorção somente a partir da fase mineral. Este aspecto pode ter de alguma
maneira, influenciado a correlação dos achados entre a espectroscopia Raman e da
densidade óptica digital (Figura 12).
A razão do fosfato/proteína (960/1660 cm-1) e carbonato/proteína (1070/1660
cm-1) é diretamente proporcional ao nível de remodelamento [29]. No presente
estudo, foi observado baixos valores destas razões para os grupos exercitados
47
quando comparados ao grupo de animais sedentários (Figuras 10b e 10c). Com o
aumento do remodelamento, uma grande quantidade de tecido ósseo existente é
relativamente jovem. Por isso o tecido ósseo continua a mineralizar ao longo do
tempo, pois o tecido ósseo jovem contém relativamente menos mineral que o tecido
ósseo velho existente. Assim, as razões mineral/matriz tende a diminuir quando o
remodelamento está aumentado [37]. Neste contexto, foi observado maior
remodelamento nos grupos exercitados. A tendência para a diminuição da razão
mineral/matriz durante a carga mecânica gerada pelo exercício é consistente com a
teoria de que o aumento da remodelação ocorre após o treinamento [6].
Foi proposto que o aumento da remodelação leva o tecido ósseo a uma
menor resistência à fratura porque não está totalmente mineralizado (37). Desta
forma, a diminuição da razão mineral/matriz encontrados sugerem que a menor
densidade óssea nos animais exercitados foi resultado de alterações químicas no
tecido ósseo, talvez em decorrência do aumento da remodelação sem tempo
suficiente para a adequada mineralização. No osso adulto, a DMO depende da taxa
de remodelação (ou seja, o determinante biológico da mineralização é a taxa do
volume de respostas) [81]. De acordo com o modelo proposto por Boivin e Meunier
[83], foi hipotetizado que este protocolo de natação conduziu à formação de um
aumento na freqüência de ativação das PMO e induziu uma diminuição no tempo
disponível para a mineralização secundária. Isto leva a novas unidades estruturais
ósseas sendo reabsorvido antes de terem concluído integralmente a mineralização
secundária, o que foi provado pela presença de altas razões mineral/matriz e uma
baixa taxa de DMO.
A parte mineral óssea é metabolicamente ativa. Assim, inúmeras interações
entre os íons de fluído extracelular e íons que constituem os cristais de apatita são
possíveis. A diferença da razão carbonato/fosfato pode indicar uma diferença no
tamanho dos cristais no tecido ósseo mineral refletindo a cristalinidade do conteúdo
mineral [33-36]. Observou-se, embora não estatisticamente significativa, maior razão
carbonato/fosfato nos animais exercitados quando comparado com animais
sedentários (Figura 10a). Tem sido sugerido que a razão carbonato/fosfato parece
ser uma variável chave em fraturas osteoporóticas. McCreadie et al. (37)
observaram uma maior razão carbonato/fosfato na crista ilíaca cortical óssea de
mulheres com fratura. Resultado semelhante foi visto por Boskey (84) utilizando
biópsias da crista ilíaca de mulheres com osteoporose pós-menopáusica,
48
contrastando com o tecido de crista ilíaca a partir de indivíduos sem evidência de
doença óssea metabólica, demonstrou diferenças significativas em termos de
tamanho/perfeição do cristal mineral (aumento na osteoporose). Assim, os
resultados representam as diferenças que podem ser atribuídas à qualidade do
tecido ósseo e pode revelar-se obter informações adicionais sobre a fragilidade
óssea e o risco de fratura (por exemplo, o stress relacionado com fratura do
treinamento extenuante).
Em termos de peso corporal, os resultados demonstraram que o treinamento
de natação reduziu o ganho de peso corporal dos animais exercitados comparado
com os animais do grupo controle (Figura 6), semelhante ao relatado na literatura [9,
10, 85]. Os protocolos de treinamento foram baseados em estudos anteriores [40,
41] e usou o peso corporal como um indicador adicional para a monitorização e
ajuste a intensidade do treinamento de natação. Fisiologicamente, sabe-se que o
exercício pode influenciar negativamente as taxas de energia metabólica [40, 41,
85]. Neste estudo, as diferenças no peso corporal observadas entre os grupos
exercitados relacionado ao grupo de animais sedentários poderia ser diretamente
relacionada a intensidade do treinamento [9, 10, 12], menor eficiência mecânica dos
animais nadadores [82] e os fatores relacionados ao estresse promovido através do
treinamento de natação [41]. Portanto, o estresse promovido pelo exercício de longa
duração e intensidade resulta em elevados efeitos metabólicos (por exemplo, a
mobilização de ácidos graxos livres, reduzindo o peso corporal). No entanto, esses
aspectos têm efeitos negativos sobre os ossos [10, 12].
A maioria dos pesquisadores concorda que a atividade física apresenta
efeitos benéficos sobre o osso, mas os resultados ainda são contraditórios. Havia
sido descrita sem nenhuma alteração, aumento e, ainda, redução da massa óssea
em pequenos animais submetidos à atividade física [82]. Trabalhos anteriores
mostraram que diferentes níveis de intensidade no treinamento de endurance
levariam a diferenças no peso corporal e parâmetros ósseos de ratos [10].
Dependendo do tipo e intensidade do exercício, o efeito pode ser deletério ao osso
[82].
49
6 CONCLUSÕES
O presente estudo demonstrou que a espectroscopia Raman poderia
ser um método viável para a avaliação da composição tecidual óssea de forma não
invasiva ou minimamente invasiva, principalmente a quantidade e a razão entre as
fases matriz e mineral, isoladamente ou em conjunto com a avaliação da densidade
óssea. Através da espectroscopia Raman, podemos observar as alterações
mecânicas ocorridas nos ossos dos animais treinados, conforme a literatura.
Constatou-se o aumento do grau de remodelação, porém, com uma mineralização
diminuída nos animais treinados. Não houve diferença significativa nos resultados
encontrados relacionando-se as intensidades. Os animais sedentários apresentaram
maior densidade mineral óssea e menor grau de remodelação.
Com o avanço da fibra óptica, técnicas de espectroscopia Raman tornará
possível otimizações sobre a instrumentação para detectar diferenças mais sutis de
características espectrais específicas. Além disso, os resultados dão suporte
adicional para o fato de que a natação intensa pode ser prejudicial no osso em um
estado adulto saudáveis.
50
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59
ANEXO A: CEP
60
ANEXO B: ARTIGO SUBMETIDO
Effects of different swimming exercise intensities on bone tissue composition in mice: a
Raman spectroscopy quantitative study
Fabiano Fernandes da Silva1, Renato Aparecido de Souza1, Marcos Tadeu Tavares Pacheco1,
Wellington Ribeiro1, Marcos Augusto Souza Rodrigues da Silva1, Humberto Miranda1,
Fabiana Silva Pires1, Miguel Angel Castillo Salgado2, Julio Cezar de Melo Castilho3,
Landulfo Silveira Jr.1
1
Laboratory of Biomolecular Spectroscopy, Institute of Research and Development (IP&D),
Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), Av. Shishima Hifumi, Urbanova, 2911, São
José dos Campos, SP 12244-000, Brazil.
2
Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal, Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Av. Eng. Francisco José Longo, 777,
Jardim São Dimas, 122450-000, São José dos Campos, SP, Brazil.
3
Departamento de Radiologia, Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista - UNESP, Av. Eng. Francisco José Longo, 777, Jardim São
Dimas, 122450-000, São José dos Campos, SP, Brazil
Corresponding author: Landulfo Silveira Jr., Laboratory of Biomolecular Spectroscopy,
Institute of Research and Development (IP&D), Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP),
Av. Shishima Hifumi, Urbanova, 2911, São José dos Campos, SP 12244-000, Brazil,
[email protected]
Tel.: +55 12 3947-1124.
61
Abstract
Raman spectroscopy was used to quantify the effects of different swimming intensities on
femoral bone composition of minerals phosphate (960 cm-1) and carbonate (1170 cm-1)
apatites and collagen matrix (1660 cm-1) in an animal model. Eighteen Swiss Webster female
mice were divided in three groups (n = 6 per group) of sedentary (SED), swimming with an
intensity of 40% (PT-40) and to 80% (PT-80) of the maximum load, with training duration of
six weeks. Results evidenced that mineral concentrations in both PT-40 and PT-80 groups
were lower than the SED group. Intense swimming may be deleterious for bone mineral.
Keywords: Raman spectroscopy, bone mineralization, physical activity, bone quality.
62
Introduction
It has been widely reported in biomedical literature that the mechanical loading
generated by physical activity plays an important role in bone development (1-5). The
physical training increases the cancellous bone and osteoinductive activity due to an increase
of bone morphogenic proteins (BMPs), which decreases bone resorption and increases bone
formation (6). Thus, the physical activity could be considered a strategy to reduce the risk of
osteoporosis, which is characterized by low bone mass and deranged bone micro-architecture,
leading to increased bone fragility and risks of fracture (7, 8).
In animal and human studies, bone mineral density (BMD) is a common indicator
reflecting bone development and bone mechanical properties (9, 10). Resistance training and
physical activity with weight bearing has been shown to improve BMD (11). On the other
hand, previous studies have reported that weightlessness or skeletal unloading such as
swimming does not have an equivalent beneficial effect on BMD or leads to bone loss (9, 12,
13). However, the prescription of water activities has been traditionally adopted as a
preventive tool of bone health in elderly (14, 15). Particularly over-training and compulsive
exercise induced marked bone loss (16, 17). Prolonged swimming exercise training in rats
leads to decrease in BMD with stimulation of bone resorption (10), and in hypertensive rats
(SHRSP) that induce spontaneous osteoporosis might deteriorate hypophosphatemia and
osteopenia (12).
Different methods have been used to evaluate the bone density. Radiographic
examination is an important tool in clinical analysis because it is non-invasive and can be
easily performed. Taba et al. (18) showed a radiographic method to assess the bone density
based on grey-level analyses using image software, and concluded that this method showed
results similar to the histological findings. The bone composition can be assessed by Dual Xray Absorptiometry (DXA), which provides a measurement of the quantitative amount of
63
mineral presented (19). Since bone is a composite material, X-ray techniques rely on
absorption only from the mineral phase, while the organic phase (primarily collagen I)
remains essentially invisible (transparent), although the quality of bone is known to be
critically dependent on both phases (20). Therefore, there is a clear need for a technique that,
in addition to measuring the bone mineral phase, also measures bone collagen quality and
quantity.
Raman spectroscopy is an optical tool which could permit precise information on the
chemical composition of organic and inorganic samples, allowing less invasive and
nondestructive qualitative and quantitative analysis (21, 22). It has been considered effective
to assess sample information at the molecular level, and has been used on several minimally
and non-invasive diagnostic applications of biological samples such as detecting toxicity of
different doses of a pollutant on bacterium media (23) atherosclerosis in coronary and carotid
arteries (24. 25), human basocellular skin cancer (26), lactate identification in blood (27),
osteoinduction in biomaterial implants (28), several bone diseases (29), bone synthesis and
osteointegration after healing (30, 31), and evaluating the microstructure of human cortical
bone (osteon) (32). Thus, Raman spectroscopy has been accepted by many authors as a viable
tool for the study of bone mineralization (33, 34) and emerges as an important complement to
traditional methods for detection, quantification and imaging of local variations in the
molecular structures of bone matrix and mineral (29).
Several works have proposed the use of Raman spectroscopy to obtain the
mineralization and organic matrix to assess the bone quality (29, 33-35). At least two different
aspects of the mineral component of bone affect its mechanical properties: the degree of
remodeling and bone mineral density (mineral to matrix phases ratio) and the degree of
crystallinity of the mineral content (related to mineral quality and carbonate/phosphate ratio)
(29, 36). The chemical composition of bone tissue could be assessment by the ratios between
64
spectral Raman bands of interest, i.e., femoral trabecular bone had a higher mineral/matrix
ratio in fractured rather than in unfractured women, while iliac crest biopsies revealed a
higher carbonate/phosphate ratio in cortical bone from woman who had sustained a fracture
(37). Also, bones from postmenopausal osteoporotic patients found a lower mineral/matrix
ratio and higher carbonate/phosphate ratio when compared with normal patients (38). The
cristallinity, an important bone quality factor, could be associated with carbonate/phosphate
ratio and indicates the extent of carbonate incorporation in the hydroxiapatite lattice (34).
The aim of this study was to use near-infrared dispersive Raman spectroscopy to
evaluate the bone tissue composition of phosphate apatite (Raman shift at 903-991 cm−1
region), carbonate apatite (Raman shift at 1046-1110 cm−1) representing the mineral content
and collagen matrix (amide I with Raman shift at 1620-1680 cm−1) in swimming trained mice
(over 6 weeks) compared to sedentary animals. The spectral information provided by the
dispersive Raman spectroscopy was then compared to the radiographic assessment of bone
density in order to validate the Raman technique as a possible bone mineralization
quantification tool and to clarify the effects of different swimming exercise intensities
exercise on bone metabolism to the health young mice.
Material and Methods
Experimental model. 18 Swiss Webster female, young adult mice (3 months old, 35.0
± 0.3 g), obtained from the bioterium of Institute of Biomedics Science of São Paulo
University (São Paulo, SP, Brazil). The mice were kept in plastic cages (10 animals/cage) in
the bioterium of the Physiology and Pharmacodynamics Laboratory of the Research and
Development Institute of the University of the Vale do Paraíba (São José dos Campos, SP,
Brazil) with controlled temperature (22-25ºC), relative humidity (40-60%) and photoperiod
(12 hours light-dark cycle). Moreover, all the animals had access to palletized food (Purina®
65
lab chow) and water ad libitum. The study had duration of six weeks and the animals were
equally separated into three experimental groups (n = 6 per group): sedentary (SED), nonexercised animals; physical training at 40% (PT-40), animals submitted to the swimming
protocol with an intensity equal to 40% of the maximum load; physical training at 80% (PT80), animals submitted to the swimming protocol with an intensity equal to 80% of the
maximum load. All the adopted procedures in this study were according to the laboratory
animals handling and care principles recommended by the COBEA (Brazilian School of
Animal Experimentation) and approved by the Ethics in Research Committee of UNIVAP
(Protocol # A106/CEP/2007).
Swimming-training protocol. Trained animals were submitted to a swimming
adaptation period (30 min. daily without load, during five consecutive days) in order to
decrease factors related to the stress promoted by the swimming activity (39). After
adaptation, the animals were individually submitted to the maximum load test (40, 41). Load
cells corresponding to 0%, 1%, 2%, 3%, and so forth, of the total body weight of the animal,
were placed until its exhaustion, reaching the maximum tolerated load. Vests with lead loads
were comfortably attached to each animal's chest (39-41). The animal exhaustion was
determined by its inability to be above water surface for approximately 8 s (40, 41). This test
allowed the working load adjustment for the physical training of 40% (PT-40) and 80% (PT80) of the maximum load. The swimming-training sessions was performed in groups of six
animals because exercise becomes vigorous in groups when compared to individual
swimming (39). Such training occurred five times a week with training daily sessions of 30
min. (9). At the end of each experimental week, a new maximum load test was performed for
possible training load readjustments. The swimming protocol was performed in an asbestos
tank with 250 L of water kept at 35 ± 2ºC temperature (9).
66
Bone samples. All animals were anesthetized by intramuscular administration of
Xylazine (40 mg/kg) and Ketamine (50 mg/kg) and euthanized by intracardiac administration
of KCl solution (10%). The animals were 15 weeks of age at this time. The right femur was
harvested. All soft tissues were removed from the bones. The bones were wrapped in
aluminum foil and freezed at -20°C priori liquid nitrogen storage (-196°C), in order to
minimize the growth of aerobic bacteria, and because a chemical fixation is not advisable for
Raman studies due to fluorescence emissions from the fixative substances (24, 25, 31). Before
bone Raman spectroscopy and Digital Optical Density experiments, samples were warmed up
to room temperature with saline.
Dispersive Raman System. For Raman measurements, a laboratory dispersive Raman
spectrometer was used (24, 31). Briefly, it is composed by a semiconductor diode laser (Micro
Laser Systems Inc., model L4830S) with about 80 mW output power and 830 nm wavelength.
The laser beam was first filtered by a holographic band pass filter (Kaiser Optical Systems,
model HLBF 830) and directed to the sample holder, by a quartz prism before being focused
by a f = 25mm lens. Each tissue fragments was placed in an aluminum holder. The signal
scattered from the samples was collected by a set of lenses and was coupled to the entrance of
the spectrograph (Chromex, Model 250IS) for dispersion, which had a Rayleigh rejection
notch filter at 830 nm (Spectral Iridian Technologies, model PN - ZX 000080) in front the
entrance slit. The spectrograph slit was set to 200 µm, providing a spectral resolution of about
8cm-1. The signal dispersed by the spectrograph was detected by a 1024x256, liquid nitrogen
cooled CCD camera (Princeton Instruments, model LN/CCD-1024-EHR1) and controller
(Princeton Instruments, model ST130). An IBM-PC computer controls the acquisition and
storage of spectra. Each sample was referred to reading at the same day and experimental
conditions (temperature, humidity and room light). Raman signal was collected in 30s for all
67
samples. Spectra were acquired in the medial and lateral diaphyse of the femur, in a total of
36 spectra (18 animals).
For calibration, the Raman spectrum of naphthalene (C10H8) with known peaks was
used (24) due to its intense bands in the region of interest (800-1800 cm-1). The naphthalene
spectrum was also measured each time the sample was changed to be sure that the laser and
collection optics were optimized. To remove the fluorescence background from the original
spectrum, a fifth order polynomial fitting was found to give better results facilitating the
visualization of the peaks found in the bone. This routine can also remove any continuum,
offset background noise, due to CCD readout and cooling.
Digital optical density. In order to correlate the Raman measurements, the bone optical
density was measured by using a CCD (Charge-Coupled Device) sensor (Dentsply
International, Gendex Dental System model Visualix GX-S-HDI™ digital sensor) for
collecting digital X-ray radiographs (42). First, CCD and bone samples were stabilized in a
standardized fixing device. Afterwards, each femur was radiographed with an X-ray
equipment (SPECTRO-70X™; Dabi Atlante, São Paulo, SP, Brazil) at 10 mA and 65 kVp,
with 0.1 s exposure time and 40 cm focus-object distance. Radiographs were taken from rats
in both sedentary and exercised groups and digital images were acquired and transferred to
the computer. The cortical optical density was evaluated using the Vix win™ 1.4 system
(Gendex Dental System). Image resolution was 635 ppi (pixels per inch), the image size was
900 x 641 dpi and the pixel size was 40 mm. Images were stored in TIF format without
compression with resolution of 600 dpi. The images were exported from the Schick program
and imported to digital image software (Adobe Systems Inc., Adobes Photoshop 6.0) in a PC
displayed on the SVGA monitor (1024 x 768 pixel resolution). BMD was evaluated using
grey-level histogram in an area of 5 x 5 pixels for all bones. All the results were expressed in
grey levels (0-255) (43).
68
Statistical Analysis. The data were expressed as mean ± standard deviation. Statistical
analysis was performed using two approaches. First, the Principal Components Analysis
(PCA) (44) was applied in the Raman spectra in order to obtain a quantitative analysis of the
general amount of mineral and organic matrix of samples analyzed related to the training, by
using the scores of first and second principal components which represent the information of
organic and inorganic phase. Second, intensity and ratio analysis of selected bands were
performed, in which the mean value of the intensities of three characteristic bands were
measured: phosphate (903-991 cm−1) and carbonate apatite (1046-1110 cm−1) representing the
mineral content, and collagen matrix (amide I, 1620-1680 cm−1). Then, ratios of these band
intensities resulted in relative measurements of carbonate-phosphate, phosphate-protein and
carbonate-protein ratios (37).
One-way analysis of variance (ANOVA) was used to analyze the body weight changes
among the three test groups, to evaluate the differences in the PCA scores, the Raman band
ratios depending on the training intensity and the bone optical density. A posthoc analysis
(Tukey-Kramer test) was used to determine the location of significant differences when
necessary. Differences among groups were considered statistically significant when p< 0.05.
Further, to correlate the Raman findings with the bone optical density, Pearson correlation
coefficient was calculated for density and bands/PCA scatter plots using the data from each
experimental group.
Results
Body Weight. Figure 1 shows the mean and standard deviation body weight of all
groups in the beginning and ending of training. Mice in all experimental groups had similar
initial body weights. After the 6-week training period, the increase in body weight of both
exercise groups was less than in the control group. At the end of the training period, the mice
69
in PT-40 and PT-80 groups exhibited mean body weights that were about 9.6% and 10.9%
less than those of the SED mice, respectively (p < 0.05). There were no significant differences
in mean body weight between the two exercise groups at all time points during the training
period.
Raman Spectral Analysis. The Raman spectra of bone show prominent vibrational
bands related to bone tissue composition. Figure 2 shows the mean Raman spectra of each
diaphyse femoral points obtained for SED, PT-40 and PT-80 groups. Main Raman bands of
bone are found at ~ 960 cm−1 attributed to phosphate apatite (PO4 stretching), at ~1070 cm−1
attributed to carbonate apatite (CO3 stretching), and ~1660 cm−1 attributed to amide I from the
matrix collagen. In Figure 2 it can be found differences in the intensity of the selected Raman
bands in all experimental groups, mainly in the SED groups which had higher intensity
compared to PT-40 and PT-80. Those differences were further evaluated through PCA and
band intensity ratios.
In order to evaluate the differences in the Raman spectra of bone tissues related to the
amount of mineral and organic phase, two analyses were performed. First, PCA (Principal
Components Analysis) were applied in all Raman spectra of diaphyse femoral points, and the
principal components scores were then used to correlate those differences to the training
status of animals, depending on the spectral information found in the first principal
component vector. Second, ratios between organic and inorganic phases (carbonate,
phosphate and protein bands) were calculated aiming detect the degree of remodeling and
bone quality.
For the PCA analysis, the mean intensity value for the first principal component scores
were obtained from all readings taken in each experimental group on all reference femoral
points. Figure 3 presents the loading vector spectra of PC1. It can be seen that PC1 presents
most of the spectral information originating from apatite minerals (CHA: the 960 and 1070
70
cm-1 bands) and some contribution from organic matrix (1660 cm-1 band). PC2 presents the
spectral information from the 960 cm-1 band and some remnant from the background
fluorescence at 1500-700 cm-1.
ANOVA statistical analysis of the PC1 score intensities of both sites (mean of
diaphyse medial and lateral sites) evidenced that the concentrations of CHA in both PT-40
and PT-80 groups were significantly lower than the SED group (-45% and -50% respectively,
p < 0.05) (Figure 4). For PC2 it was found no statistically significant difference among
groups.
For remodeling evaluation, the ratio between carbonate-phosphate (1070/960 cm-1),
phosphate-protein (960/1660 cm-1) and carbonate-protein (1070/1660 cm-1) were calculated
using the Raman band intensities (39). Figure 5 presents the ratios for the diaphyse medial
and lateral sites. Although not statistically significant ratios differences, were observed: 1)
higher carbonate-phosphate ratio in the PT-40 and PT-80 groups than those of the SED mice
(Figure 5a); 2) lower phosphate-amide I ratio in the PT-80 and PT-40 groups than those of the
SED mice (Figure 5b); 3) lower carbonate-protein in the PT-80 and PT-40 groups than those
of the SED mice (Figure 5c). A high carbonate-phosphate ratio was generally associated with
a low phosphate-protein and carbonate-protein ratio, and vice versa (Figure 5).
Bone Digital Optical Density. The bone optical density in the cortical region showed
no statistically significant differences between the experimental groups. Although not
significant, were found that the sedentary group presented higher value in relation to the PT40 group and these last one higher than the PT-80 group (Figure 6).
Figure 7 plots the scatter plot of the mean PC1 score and the Raman intensity ratio of
phosphate-protein with the corresponding
mean
bone density (Figure 7a). Also, it was plotted
the scatter plot of the carbonate with the corresponding PC2 score (Figure 7b).
71
Discussion
This paper proposes an application of the dispersive Raman spectroscopy to the study
of bone quality. This technique was selected because it has proved to be a nondestructive way
of accessing the molecular structure of the bone mineral and organic components (29). The
objective was to evaluate the bone tissue composition, comparing the relative amount of
mineral content (phosphate apatite, 903-991 cm−1 and carbonate apatite, 1046-1110 cm−1)
with the collagen matrix (amide I, 1620-1680 cm−1) in over 6-week swimming trained and
sedentary mice to the assessment of bone optical density. Therefore, the spectral information
provided by Raman spectroscopy could be used as a tool for bone mineralization
quantification, clarifying the effects of different swimming exercise intensities exercise on
bone metabolism to the health young mice.
Bone is a complex system which many variables affect its composition, formation,
strength and failure properties (45). Many methods used to study bone have been inadequate
to explore fully all the interactions that take place in such a dynamic system. In addition, most
of these methods are unable to give information at the molecular level (20, 24). Vibrational
spectroscopy, including Raman spectroscopy, has the advantage of being sensitive to both the
mineral and organic components of bone, thus allowing for the study of mineral-matrix
interactions as well as each individual component’s properties (29, 33-36). So, the
assignments of all major bands in the Raman spectrum of bone mineral have been established
(29). As markers of phosphate, carbonate and matrix, were used phosphate P-O symmetric
stretch attributed to phosphate apatite (960 cm-1), carbonate C-O symmetric stretch attributed
to carbonate apatite (1070 cm-1) and collagen amide I from organic matrix (1660 cm-1). It was
possible to demonstrate that the Raman spectrum of bone shows clearly the prominent
vibrational bands related to biomarkers (Figure 2).
72
On this study, the evaluation of bone mineralization and organic phase were done
quantitatively through PCA and band ratio analysis, respectively, applied in all Raman spectra
of femoral bones. In PCA analysis (Figure 4), it was found a statistically significant reduction
on the concentrations of CHA in the swimming groups (PT-40% and PT-80%) at the same
anatomical location (diaphyse femoral points) compared to sedentary, that was void to direct
muscle attachments. Such difference suggests that negative mechanical influence occur after a
regimen of intense non-weight bearing exercise at skeletal sites where the muscles are
inserted (46). These deleterious effects on bone promoted by the swimming training have
been described in the literature (9, 12, 13, 17). Bourrin et al. (17) utilized an intense regimen
that involved rats swimming for 6 h/day, which more closely resembles the regimen of
collegiate swimmers at the peak of their training season. They found decrements in mineral
bone status which could be a function of prolonged weightlessness in the water and/or
prolonged exposure to stress hormones such as corticosterone. Kim and Park (10) confirmed
that swimming exercise in rats increased urinary deoxypyridinoline (Dpd) cross-links
excretion, reflecting dynamically stimulated bone resorption, and the femoral and tibial BMD
showed a tendency towards decrease as compared to control. Kim et al. (12) observed that
prolonged swimming resulted in a decrease of BMD and strength of the femur by
approximately 7% and 20%, respectively, than those of sedentary animals. The peculiarities
of these exercises are strenuous intensity exercise.
It is important to note that, despite not being statistically significant, the results of the
measurements of the digital optical density of bone are encouraging (Figure 6) as the same
findings were showed by PCA analysis, the decrement in bone density concentration in
exercised groups. Iwamoto et al. (47) reported that although BMD of exercised rats showed
no significant difference at 4 or 8 weeks from the start of exercise training, it began to show at
12 weeks. This finding might be the reason for no significant change of BMD in our
73
swimming exercise group, where the experimental period was too short to alter this variable.
It is also important to consider that PCA loading vectors present spectral information from
apatite minerals (960 and 1070 cm-1 bands) and some contribution from organic matrix (1660
cm-1 band) while X-ray techniques rely on absorption only from the mineral phase. This
aspect may have, in some way, affected the correlation between the Raman and the digital
optical density findings (Figure 7).
The ratio of phosphate-protein (960/1660 cm-1) and carbonate-protein (1070/1660 cm1
) are directly proportional to level of remodeling (29). In the present study, it was observed
lowers values for these ratios in exercised groups when compared to sedentary animals
(Figures 5b and 5c). With increased remodeling, a great amount of the existing bone tissue is
relatively young. Because bone tissue continues to mineralize over time, this younger bone
tissue contains relatively less mineral than older existing bone tissue. Thus, the average
mineral/matrix ratio tends to decrease when remodeling is increased (37). In this context, it
was observed higher remodeling in the exercised groups. The tendency for decrease in the
mineral/matrix ratio during mechanical loading generated by physical activity is consistent
with the theory that increased remodeling occurs after training (6).
It has been proposed that the increased remodeling leads to bone tissue that is less
resistant to fracture because it is not fully mineralized (37).Thus, the decreased mineral/matrix
ratio found suggest that the lower bone density in exercised animal was a result of chemical
changes in the bone tissue, perhaps as a result of increased remodeling without sufficient time
for adequate mineralization. In adult bone, the DMB depends on the rate of remodeling (i.e.,
the biological determinant of mineralization is the rate of turnover) (46). According to the
model proposed by Boivin and Meunier (48), it was hypothesized that this swimming training
protocol leaded to an increase in the activation frequency of BMPs and induced a decrease in
the time available for the secondary mineralization. This leads to new bone structural unities
74
being resorbed before they have fully completed their secondary mineralization, as proven by
the presence of high mineral/matrix ratio and a low mean DMB.
Bone mineral is metabolically active, thus numerous interactions between ions from
the extracellular fluid and ions constituting the apatite crystals are possible. The difference in
the carbonate/phosphate ratio may indicate a difference in size of mineral crystals in bone
tissue reflecting the crystallinity of the mineral content (33-36). It was observed, although not
statistically significant, higher carbonate to phosphate ratio in exercised animals when
compared
to
sedentary
animals
(Figure
5a).
It
has
been
suggested
that
the
carbonate/phosphate ratio appears to be a key variable in osteoporotic fracture. McCreadie et
al. (37) observed a greater carbonate/phosphate ratio in iliac crest cortical bone from women
with fracture. A similar result was seen by Boskey (49) using the iliac crest biopsies from
women with post-menopausal osteoporosis, contrasted with iliac crest tissue from individuals
without evidence of metabolic bone disease, demonstrated significant differences in and
mineral crystal size/perfection (increased in osteoporosis). Thus, the results represent
differences that may be attributed to the quality of bone tissue and may prove to be additional
information about bone fragility and fracture risk (e.g., stress fracture related to the strenuous
training).
In terms of body weight, the results demonstrated that the exercise-training regimen
reduced the gain of body weight on the exercised animals compared with the non-exercised
controls (Figure 1), similar to that reported in the literature (9, 10, 50). The training protocols
were based on previous studies (40, 41) and used the body weight as an additional indicator
for monitoring and adjusting the intensity of the swimming-training. Physiologically, it is well
known that the exercise can influence negatively the energy metabolic rates (40, 41, 50). In
this study, the differences in body weight observed between the exercised groups related to
the sedentary animals could be directly related to the training intensity (9, 10, 12), low
75
mechanic efficiency to swimming by the animals (47), and the factors related to the stress
promoted by the swimming activity (41). Therefore, the stress promoted by the exercise of
long duration and intensity results in elevated glucocorticoids for metabolic purposes (e.g.,
mobilization of free fatty acids, reducing the weight body). However, these aspects have
negative effects on bone (10, 12).
The majority of the researchers agree that the physical activity presents beneficial
effects on the bone, but results are still contradictory. It had been described no alteration,
increase and, even though, reduction of the bone mass in small animals submitted to the
physical activity (47). Previous works showed that different endurance training intensity
levels would lead to differences in body weight and bone parameters of rats (10). Depending
on the type and intensity of exercise, the effect to the bone can be deleterious (47).
In summary, it was considered that the quality of bone, in addition to bone quantity, is
important to understand how the mechanical loading generated by physical activity acts in
bone development. The present study demonstrates that the Raman spectroscopy could be a
feasible method for non-invasive or minimally invasive assessment of bone tissue
composition, mainly the amount and ratio between mineral and matrix phase, either alone or
in conjunction with evaluation of bone density. With the advance of fiber optic Raman
spectroscopy techniques it will be possible optimizations on the instrumentation to detect
more subtle differences of specific spectral features. Besides, the results give additional
support to the fact that intense swimming exercise may be deleterious in bone status in an
adult, healthy animal.
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Body weight (g)
82
45
1st week
*
**
6th week
*
35
**
25
mean SED
mean PT-40
mean PT-80
Figure 1. Comparison of the initial and final mean and sd body weight during the
experimental period. * and ** indicated SED group had a significantly higher body weight
than the physical training groups at the final of study (p < 0.05).
83
Intensity (arb. units)
a
Diaphyse
Medial
mean SED
mean PT-40
mean PT-80
b
800
1000
c
1200
Intensity (arb. units)
Diaphyse
Lateral
1400
1600
1800
mean SED
mean PT-40
mean PT-80
800
1000
1200
1400
1600
Raman Shift (cm-1)
1800
Figure 2. Raman spectra of diaphyse bone. Main bands are indicated: a) phosphate apatite
(960 cm-1), b) carbonate apatite (1070 cm-1), c) amide I from the matrix collagen (1660 cm-1).
84
Intensity (arb. units)
25000
20000
a
15000
10000
b
5000
c
0
-5000
-10000
800
1000
3000
Intensity (arb. units)
PC1
1200
1400
-1
Raman shift (cm )
1600
1800
PC2
2000
1000
0
-1000
-2000
-3000
800
1000
1200
1400
-1
Raman Shift (cm )
1600
1800
Figure 3. Principal components loading vectors PC1 and PC2 for the diaphyse medial and
lateral sites.
PC2 score (arb. units)
PC1 score (arb. units)
85
0.4
0.3
*
**
*
0.2
**
0.1
0.0
mean SED
mean PT-40
mean PT-80
mean SED
mean PT-40
mean PT-80
0.4
0.2
0.0
-0.2
-0.4
Figure 4. Mean intensity and standard deviation for the principal components scores PC1 and
PC2 of the diaphyse medial and lateral sites. * and ** indicated sedentary (SED) group with a
statistically significant difference than the physical training groups PT-40 and PT-80,
respectively (p < 0.05).
1070/960 Intensity
86
0.6
0.5
(a)
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1070/1660 Intensity
mean SED
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
960/1660 Intensity
8.0
mean PT-80
mean PT-40
mean PT-80
mean PT-40
mean PT-80
(b)
mean SED
10.0
mean PT-40
(c)
6.0
4.0
2.0
0.0
mean SED
Figure 5. Ratio between a) carbonate-phosphate (1070/960 cm-1); b) phosphate-protein
(960/1660 cm-1) and c) carbonate-protein (1070/1660 cm-1) for the diaphyse medial and
lateral sites. Differences between groups were not statistically significant.
Optical density (grey level)
87
140
130
120
110
mean SED
mean PT-40
mean PT-80
Figure 6. Mean of radiographic cortical optical density of SED and trained groups.
Differences between groups were not statistically significant.
88
8
PC1 score
0.4
960/1660
7
0.3
6
0.2
5
0.1
4
a)
0
960/1660 Intensity
PC1 score (arb. units)
0.5
3
115
120
125
Optical density (grey level)
130
1070/960 Intensity
0.3
0.2
0.1
0
-0.1
-0.2
b)
-0.3
0.3
0.4
0.5
PC2 score (arb. units)
Figure 7. a) Scatter plot between PC1 score and phosphate-protein ratio with the
corresponding bone density; b) scatter plot between carbonate-phosphate ratio with the
corresponding bone density.