UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MIINEIRO
ALINE APARECIDA FERREIRA
Valor da detecção de anticorpos contra plaquetas e dos níveis séricos de citocinas do perfil
Th1, Th2, Th17 e Treg na predição da resposta à transfusão de plaquetas
UBERABA
2015
i
ALINE APARECIDA FERREIRA
Valor da detecção de anticorpos contra plaquetas e dos níveis séricos de citocinas do perfil
Th1, Th2, Th17 e Treg na predição da resposta à transfusão de plaquetas
Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em
Ciências da Saúde, área de concentração "Patologia
Humana", da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro, como requisito parcial para obtenção do
Título de Doutor.
Orientador: Prof. Dr. Helio Moraes de Souza
Coorientador: Dr. Vagner de Castro
UBERABA
2015
ii
Este trabalho foi financiado pela FAPEMIG e Fundação HEMOMINAS
iii
Dedico este trabalho a Deus, presente a todo instante. Aos meus pais Vânia, Adair e Aristeu
pelo amor, instrução e confiança.
iv
Agradecimentos
A todos que contribuíram para a concretização deste trabalho...
Ao meu orientador, por abrir caminhos, pelo ensino e por acreditar em mim.
Ao meu coorientador Dr. Vagner de Castro pela disposição em compartilhar o
conhecimento, apoio durante treinamentos e padronizações e pela amizade.
À sempre presente, Dra. Sheila Soares, pela ideia inicial do trabalho, colaboração,
instrução e por ser, acima de tudo, amiga.
A esta Universidade e este Curso de Pós-Graduação, cujos professores e funcionários
me proporcionaram acesso ao conhecimento.
Aos professores da banca por aceitarem o convite em participar de minha formação.
À Beatriz do Laboratório de Imunologia Plaquetária da Unicamp, pelo suporte e
colaboração durante treinamentos e padronizações.
Ao Dr. Virmondes e ao Marcos pelas portas abertas do Laboratório de Imunologia,
possibilitando a realização dos testes de PIFT, dosagem de citocinas e interpretação dos
resultados.
Às equipes dos laboratórios de HLA da Unicamp e da LITU, pela contribuição na
realização das técnicas moleculares e sorológicas.
Ao Programa de Pesquisa do SUS (PP-SUS)/FAPEMIG, principal fonte financiadora,
louvável pelos seus objetivos.
À Fundação HEMOMINAS, pelo trabalho conjunto e disponibilização de serviços e
recursos para a realização do trabalho. Especialmente, a todos os amigos do Hemocentro
Regional de Uberaba ligados em diferentes pontos do “ciclo das plaquetas”, sem a colaboração
de vocês nada seria viável. Também aos amigos do Hemocentro Regional de Uberlândia,
principalmente ao Dr. Paulo e Dr. Adilson, pela colaboração na obtenção de amostras e dados.
Aos companheiros pós-graduandos, especialmente à Millena, Fernanda e Cristiane que
se envolveram na realização do trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Coagulação, pelo apoio durante essa fase, especialmente
à minha chefe Heloísa, à Vânia, Malu e Ilsione.
A todos os amigos de horas vagas, horas de almoço e de brincadeiras, especialmente à
Tatiane, Letícia e João Lucas.
Ao meu namorado Prasanna por se fazer presente apoiando, confortando e ouvindo
minhas longas histórias.
A todos os demais familiares e amigos pelo apoio e carinho.
Aos pacientes que acreditaram na pesquisa, pelo esforço e pela esperança.
v
“E tudo quanto fizerdes, fazei-o de coração, como ao Senhor, e não aos homens”
Colossenses 3:23
vi
RESUMO
Graças ao constante aperfeiçoamento da transfusão de plaquetas, a incidência de hemorragias
diminui cada vez mais entre pacientes oncohematológicos. Contudo, o incremento da contagem
de plaquetas após a transfusão pode não atingir os níveis esperados devido ao consumo,
destruição por lise ou fagocitose ou sequestro das plaquetas no endotélio. Dessa forma, o
incremento pós transfusional pode ser prejudicado tanto pela qualidade das plaquetas
transfundidas quanto por fatores clínicos e imunológicos do paciente. Como os fatores de risco
são muito comuns entre esses pacientes, mas nem sempre determinantes de resposta
insatisfatória, torna-se importante a identificação de marcadores que possam refletir a condição
de risco para falha na resposta à transfusão de plaquetas. Faltam na literatura estudos que
demonstrem a relação entre níveis séricos de citocinas e o incremento pós-transfusional.
Também permanece incerto o real valor da identificação de anticorpos pelo Teste de
Imunofluorescência Plaquetária (Platelet Immunofluorescence Test - PIFT) nesses pacientes.
Portanto, decidimos avaliar a hipótese de que essas duas análises são úteis na monitoração da
resposta à transfusão de plaquetas em pacientes oncohematológicos e no manejo desses
pacientes. Avaliamos no presente estudo 56 pacientes em 132 episódios transfusionais quanto
à contagem corrigida do incremento plaquetário (CCI) uma hora após a transfusão, aos níveis
séricos de citocinas dos perfis Th1, Th2, Th17 e Treg antes da transfusão e à presença de
anticorpos pelas técnicas PRA-HLA I - Panel Reactive Antibody Human Leukocyte Antigen
Class I, MAIPA (Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Platelet Antigens Assay) e
PIFT. As condições clínicas dos pacientes foram estudadas a partir de seus prontuários. O CCI
foi insatisfatório (<5000 plaquetas/µL) em 55 episódios (41,7%). A frequência de incremento
insatisfatório foi maior entre as transfusões para pacientes PIFT positivo com concentrados de
plaquetas (CPs) de PRP 79,3% em comparação a CPs de aférese (34,6%); também entre os
negativos com PRP, 34,5% versus 7,7%. Anticorpos contra antígenos HPA foram identificados
em seis amostras, sendo todas elas concomitantemente positivas para antígenos HLA de Classe
I. Os resultados do PRA-HLA I foram positivos em 66 de 123 amostras avaliadas (53,7%). A
concordância entre os resultados do PIFT e dos dois testes de referência ocorreu em 25,4% dos
resultados positivos e em 23,8% dos negativos; a discrepância foi de 17,5% nos PIFT positivo
e 19,8% nos negativos e os resultados inconclusivos foram de 7,1% e 6,4% das amostras
respectivamente positivas e negativas, resultando em sensibilidade de 56,1% e especificidade
de 57,7%. Por outro lado, a curva de distribuição das porcentagens de PRA-HLA I e incremento
corrigido demonstrou que todos os soros com PRA-HLA I ≥60% apresentaram incremento
insatisfatório. Assim, ao comparar os resultados do PIFT com as porcentagens de PRA-HLA I
com corte em 60%, a sensibilidade do PIFT passou a ser de 100% e a especificidade de 59,8%
com valor preditivo positivo de 31,5% e valor preditivo negativo de 100%. As citocinas foram
dosadas em 100 amostras e somente os níveis de IL-6 foram significativamente diferentes entre
episódios insatisfatórios e satisfatórios com medianas de 23,8 pg/mL (variando de 0,0 a 15713,0
pg/mL) e 7,0 pg/mL (variando de 0,0 a 9473,6 pg/mL), respectivamente. Nos episódios em que
foram transfundidos CPs de PRP que cursaram com incremento insatisfatório, os níveis séricos
de IL-6 antes da transfusão apresentaram mediana de 29,9 pg/mL (variando de 2,4 a 15713,0
pg/mL), enquanto naqueles com incremento satisfatório foi de 5,0 pg/mL (variando de 0,0 a
3658,4 pg/mL); essa diferença foi significativa. Quando CPs de aférese foram transfundidos,
os níveis séricos de IL-6 antes da transfusão apresentaram mediana de 7,7 pg/mL (variando de
0,0 a 4481,3 pg/mL) entre episódios insatisfatórios e de 9,6 pg/mL (variando de 0,0 a 9473,6
pg/mL) nos satisfatórios, sem diferença significativa. Os níveis de IL-6 não estiveram
relacionados com a detecção de anticorpos contra plaquetas pelo PIFT, sendo que, na presença
de PIFT positivo, os episódios insatisfatórios apresentaram mediana de 8,8 pg/mL (variando de
2,4 a 4481,3 pg/mL) e os episódios satisfatórios, mediana de 12,8 pg/mL (variando de 0,0 a
vii
9473,6 pg/mL). No entanto, ao avaliar os episódios em que o PIFT era negativo, aqueles que
cursaram com incremento insatisfatório apresentaram mediana de 66,1 pg/mL (variando de 2,8
a 15713,0 pg/mL) versus 5,4 pg/mL (variando de 0,0 a 3658,4 pg/mL) nos que cursaram com
incremento satisfatório. Os resultados do incremento e da sua relação com os resultados do
PIFT e níveis séricos de IL-6 também apresentaram diferenças significativas quando avaliados
quanto às variáveis idade, gênero, histórico gestacional, presença de anticorpos contra plaquetas
pelo PRA-HLA I, diagnóstico e presença de infecção e/ou febre. De acordo com os resultados
encontrados, o PIFT parece ser um bom teste de triagem na detecção de anticorpos contra
plaquetas por ser um teste menos complexo, mais rápido e mais barato. Esse estudo foi o
primeiro a demonstrar que os níveis de IL-6 antes da transfusão de plaquetas foram mais
elevados em pacientes que apresentaram incremento plaquetário insatisfatório. Esses resultados
sugerem que o estado inflamatório é capaz de modular a destruição e sequestro de plaquetas.
Além disso, mostrou que níveis mais elevados de IL-6 estiveram associados à pior resposta
quando CPs de PRP foram transfundidos, mas não quando a transfusão era de CPs de aférese.
Os mecanismos imunológicos associados ao baixo incremento após transfusão de plaquetas
precisam ser melhor elucidados para diferenciar quando a falta de incremento ocorre por
sequestro ou destruição das plaquetas e quando aloanticorpos e produtos de infecção atuam
sinergicamente. Mais estudos poderão corroborar para a compreensão do valor de resultados do
PIFT e dos níveis séricos de IL-6 na predição de resposta insatisfatória à transfusão de
plaquetas. Novas estratégias, viáveis mesmo em serviços onde testes de alto padrão e
complexidade como PRA-HLA I e MAIPA ou seleção de plaquetas compatíveis não estão
disponíveis, poderão ser desenhadas a partir dos resultados encontrados e contribuir para o
aperfeiçoamento da prática da transfusão de plaquetas e monitoramento da resposta
transfusional em pacientes cronicamente transfundidos.
Palavras-chave: transfusão de plaquetas, pacientes oncohematológicos, incremento plaquetário,
antígenos HLA Classe I, antígenos HPA, PIFT, citocinas.
viii
ABSTRACT
Due to the continuous improvement of the platelet transfusion, the incidence of bleeding has
decreased increasingly in blood cancer patients. However, the increment of the platelet counting
after transfusion cannot reach expected levels because of consumption, destruction by lysis or
phagocytosis or sequestration of platelets in the endothelium. Thus, the quality of platelets
transfused as by clinical and immunological factors of the patient may affect adversely the
increment post-transfusion. As the risk factors are very common among these patients, but are
not decisive of unsatisfactory response, it is important to identify markers that may reflect the
risk condition for failure to respond to platelet transfusion. Lacking in the literature studies that
show the relationship between serum levels of cytokines before transfusion and post-transfusion
increment. It also remains unclear the real value of identifying antibodies by PIFT (Platelet
Immunofluorescence Test) in these patients. So we decided to test the hypothesis that these two
analyzes are useful in monitoring the response to platelet transfusion in patients hematologyoncology and management of these patients. Were evaluated in this study 56 patients in 132
transfusion episodes as the corrected count increment one hour after platelet transfusion, the
serum levels of cytokines of Th1, Th2, Th17 and Treg profiles before transfusion and the
presence of antibodies by PRA-HLA I (Panel Reactive Antibody Human Leukocyte Antigen
Class I), MAIPA (Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Platelet Antigens Assay)
and PIFT techniques. The clinical conditions of the patients were studied from their records.
The increment was poor (<5000 platelets / uL) for 55 events (41.7%). The poor growth rate was
higher among transfusions for patients with positive PIFT receiving PRP platelet concentrates
(PCs), 79.3% of positive episodes with PRP versus 34.6% positive episodes with apheresis;
also 34.5% between negatives with PRP versus 7.7% negatives with apheresis. Antibodies
against HPA antigens were identified in six samples, all of which are concomitantly positive
for HLA class I. The HLA PRA-I results were positive in 66 samples from 123 evaluated
(53.7%). The consistency between the results of PIFT and both results of standard tests occurred
in 25.4% of positive and 23.8% negative. There was disagreement in 17.5% of the results PIFT
positive and 19.8% of results PIFT negative and inconclusive results in 7.1% and 6.4% of the
samples respectively positive and negative by the reference tests, resulting in sensitivity of
56.1% and specificity of 57.7%. Moreover, the distribution curve of percentages of the PRAHLA I and corrected increment showed that all sera with PRA-I HLA ≥60% showed poor
increment. Thus, when comparing the results of PIFT with the PRA-I HLA percentages to cut
by 60%, the sensitivity of PIFT increased to 100% and specificity of 59.8% with a positive
predictive value of 31.5% and negative predictive value of 100%. Cytokines were measured in
100 samples and only IL-6 levels were significantly different between satisfactory and
unsatisfactory episodes with median of 23.8 pg / mL (range 0.0 to 15713.0 pg/ml) and 7.0 pg/ml
(range 0.0 to 9473.6 pg/mL), respectively. In episodes that were transfused PRP PCs that
progressed with poor increment, IL-6 serum levels prior to transfusion showed a median of 29.9
pg / mL (range 2.4 to 15713.0 pg/ml) while in that progressed with satisfactory increase, the
levels had a median of 5.0 pg/mL (range 0.0 to 3658.4 pg/mL); this difference was significant.
When PCs of apheresis were transfused , IL-6 serum levels prior to transfusion showed a
median of 7.7 pg/ml (range 0.0 to 4481.3 pg/ml) between episodes unsatisfactory and median
of 9.6 pg/mL (range 0.0 to 9473.6 pg/mL) between satisfying episodes, with no significant
difference. IL-6 levels were not related to antibodies against platelets identified by PIFT, and
ix
in the presence of positive PIFT, the unsatisfactory episodes showed a median of 8.8 pg/ml
(ranging from 2.4 to 4481.3 pg/mL) and the satisfactory episodes median of 12.8 pg/mL (range
0.0 to 9473.6 pg/mL). However, when assessing the episodes where the PIFT was negative,
those which attended poorly the increment showed a median of 66.1 pg/mL (range 2.8 to
15713.0 pg/mL) and those which attended with satisfactory increment showed a median of 5.4
pg/mL (range 0.0 to 3658.4 pg/mL). The results of the increment and the increment in relation
to the results of PIFT and IL-6 serum levels also showed significant differences when evaluated
for age, gender, gestational history, presence of antibodies against platelets by PRA-HLA I,
diagnosis and presence of infections and/or fever. According to the results, the PIFT seems to
be a good screening test to detect antibodies against platelets for being a simpler test, faster and
cheaper. This study was the first to demonstrate that IL-6 levels before transfusion of platelets
were higher in patients who had a poor platelet increment after transfusion. These results
suggest an inflammatory condition that can modulate the destruction and sequestration of
platelets. Moreover, it showed that higher levels of IL-6 were associated with poor response
when PCs of PRP were transfused, but not when transfused PCs of apheresis. The
immunological mechanisms involved with low increment after platelet transfusion, need to be
further clarified to differentiate when the lack of increment is due to sequestration or destruction
of platelets and when alloantibodies and infection products act synergistically. More studies
will help to the understanding the value of the PIFT results and the IL-6 serum levels in
predicting poor response to platelet transfusion. New strategies are viable even in services
where high standard tests and complexity as PRA-HLA I and MAIPA or selection of compatible
platelets are not available, may be drawn from the results and contribute to the improvement of
the practice of platelet transfusion and response monitoring transfusion in chronically
transfused patients.
Keywords: platelet transfusion, hematology-oncology patients, platelet increment, HLA Class
I antigens, HPA antigens, PIFT, cytokines.
x
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
TÍTULO
PÁGINA
Figura 1
Marcação da população plaquetária analisada.................................. 28
Figura 2
Marcação de plaquetas com IgG FITC............................................. 29
Figura 3
Marcação de plaquetas com IgG FITC............................................. 29
Figura 4
Distribuição dos resultados da Contagem Corrigida do Incremento
(CCI) em relação à porcentagem de reatividade contra o painel de
antígenos (PRA) HLA Classe I........................................................
36
Análise das frequências de incremento insatisfatório e satisfatório
de acordo com os resultados do PIFT e tipo de concentrado de
plaquetas transfundido......................................................................
41
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Análise das frequências de incremento insatisfatório e satisfatório
de acordo com os resultados do PIFT e filtração dos concentrados
de plaquetas de PRP.........................................................................
Comparação entre os níveis de citocinas antes da transfusão de
plaquetas de acordo com o incremento pós transfusional................
xi
42
46
LISTA DE TABELAS
TÍTULO
PÁGINA
Tabela 1
Características dos pacientes do estudo............................................ 32
Tabela 2
Análises das características dos concentrados de plaquetas em
relação à resposta pós transfusional.................................................. 33
Tabela 3
Análises das características dos pacientes em relação à resposta
pós transfusional...............................................................................
35
Comparações entre os resultados do PRA-HLA I e do incremento
pós transfusional de acordo com presença ou não de aloanticorpos
e porcentagem de PRA.....................................................................
37
Comparação entre os resultados do PIFT e os resultados PRAHLA I, porcentagem de PRA-HLA I e CCI.....................................
39
Análises das frequências de incremento insatisfatório de acordo
com as características dos pacientes e concentrados de plaquetas
em relação aos resultados do PIFT...................................................
44
Tabela 4
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7
Análise dos níveis de IL-6 (pg/mL) antes da transfusão em relação
ao incremento pós transfusional de acordo com as características
dos concentrados de plaquetas.......................................................... 47
Tabela 8
Análise dos níveis de IL-6 (pg/mL) antes da transfusão em relação
ao incremento pós transfusional de acordo com as características
dos pacientes..................................................................................... 49
Tabela 9
Análise dos níveis de IL-6 antes da transfusão em relação ao
incremento pós transfusional de acordo com resultados do PIFT....
xii
50
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
%
Por cento
°C
Grau Celsius
α
alfa
γ
gama
µl
Microlitro
ACE
Antibody Capture ELISA – ELISA para captura de anticorpo
BC
Buffy Coat - Camada Leucoplaquetária
BSA
Bovine Serum Albumin - Albumina Sérica Bovina
CCI
Corrected Count Increment – Contagem Corrigida do Incremento
CH
Concentrado de Hemácias
CIVD
Coagulação Intravascular Disseminada
cm
Centímetro
CP
Concentrado de Plaquetas
CREG
Cross Reactive Group - Grupo de Reatividade Cruzada
DP
Desvio Padrão
EDTA
Ácido Dietilenoaminotetracético
ELISA
Enzime-Linked Immuno Sorbent Assay- Ensaio de Imunoabsorção
Enzima-Conjugado
FITC
Fluorescence Isothiocianate – Isotiocianato Fluoresceína
FS
Forward Scatter – Dispersão Frontal
GP
Glicoproteína
HEMOMINAS
Fundação Centro de Hematologia e Hemoterapia de Minas Gerais
HLA
Human Leukocyte Antigen - Antígenos Leucocitários Humanos
HPA
Human Platelet Antigen - Antígenos Plaquetários Humanos
IFN
Interferon
IgG
Imunoglobulina G
IL
Interleucina
Kg
Kilograma
L
Litro
LCT
Lymphocytotoxic Test - Teste de Linfocitotoxicidade
LFL
Logaritmo da fluorescência
xiii
LIFT
Lymphocyte Immunofluorescence Test - Teste de imunofluorescência de
linfócito
LSS
Log Side Scatter – Logarítmo da Dispersão Lateral
m2
Metro quadrado
MACE
Modified Antibody Capture ELISA – ELISA para captura de anticorpo
modificado.
MAIPA
Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Platelet Antigens Assay
– Teste de imobilização com anticorpos monoclonais específicos de
antígenos plaquetários
máx.
Máximo
Mín.
Mínimo
mL
Mililitro
p
Valor de probabilidade
PBS
Phosphate Buffer Saline – Solução tamponada com fosfato
PCR-RFLP
Polimerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length
Polymorphism - Reação em Cadeia da Polimerase – Polimorfismos de
Comprimento do Fragmento de Restrição.
PCR-SSP
Polimerase Chain Reaction - Sequence-Specific Priming – Reação em
Cadeia da Polimerase – Sequência Específica de Primer
PE
Phycoerythrin - Ficoeritrina
PG
Prostaglandina
PIFT
Platelet Immunofluorescence Test - Teste de imunofluorescência de
plaquetas
PRA
Panel Reactive Antibody - Anticorpos reativos contra painel de antígenos
PRP
Plasma Rico em Plaquetas
R1
média + 1DP/média
R2
média + 2DP/média
SC
Superfície Corporal
TNF
Tumor Necrosis Factor – Fator de necrose tumoral
UFTM
Universidade Federal do Triângulo Mineiro
UNICAMP
Universidade Estadual de Campinas
xiv
SUMÁRIO
1
1
INTRODUÇÃO
1.1
TRANSFUSÃO
DE
PLAQUETAS
EM
PACIENTES
1
ONCOHEMATOLÓGICOS..........................................................................
A importância da qualidade dos concentrados de plaquetas................... 2
1.1.1
1.1.3.1
Fatores relacionados ao paciente capazes de afetar a resposta à
5
transfusão de plaquetas................................................................................
Mecanismos envolvidos no baixo incremento de plaquetas após a
7
transfusão......................................................................................................
Consumo e sequestro de plaquetas................................................................. 8
1.1.3.2
Destruição de plaquetas por fagocitose, lise e apoptose............................... 9
1.2
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS........ 10
1.2.1
Cálculo corrigido do incremento................................................................. 10
1.2.2
Detecção de anticorpos contra plaquetas.................................................... 11
1.2.2.1
Testes inespecíficos........................................................................................
12
1.2.2.2
Testes específicos ..........................................................................................
12
1.3
1.4
O MANEJO DO PACIENTE REFRATÁRIO À TRANSFUSÃO DE
14
PLAQUETAS................................................................................................
CITOCINAS COMO BIOMARCADORES PLASMÁTICOS...................... 16
1.5
JUSTIFICATIVA........................................................................................... 17
1.6
HIPÓTESE..................................................................................................... 18
2
OBJETIVOS................................................................................................. 19
2.1
OBJETIVO GERAL......................................................................................
19
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................
19
3
MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 20
3.1
CASUÍSTICA ...............................................................................................
3.2
COLETA DE AMOSTRAS........................................................................... 20
3.3
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS........ 21
3.4
PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA PLAQUETAS........................... 22
3.4.1
Pesquisa e identificação de anticorpos anti-HLA Classe I......................... 22
3.4.2
Pesquisa e identificação de anticorpos anti-HPA...................................... 23
3.4.2.1
Genotipagem HPA.......................................................................................... 24
3.4.3
Teste de Imunofluorescência Plaquetária (PIFT) ..................................... 26
3.5
ANÁLISES DE CITOCINAS........................................................................ 29
3.6
ANÁLISES ESTATÍSTICAS........................................................................ 30
1.1.2
1.1.3
xv
20
SUMÁRIO
4
RESULTADOS............................................................................................. 31
4.1
CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES.................................................... 31
4.2
4.2.2.1
CARACTERÍSTICAS DAS TRANSFUSÕES DE PLAQUETAS
AVALIADAS................................................................................................
Frequências de incremento insatisfatório em relação às características
dos concentrados de plaquetas transfundidos............................................
Frequências de incremento insatisfatório em relação às características
dos pacientes.................................................................................................
Características demográficas........................................................................
4.2.2.2
Características Clínicas................................................................................. 34
4.2.3
4.2.3.1
Frequências de incremento insatisfatório em relação à presença de
35
aloanticorpos plaquetários..........................................................................
Distribuição quanto ao CCI e à porcentagem de PRA-HLA I...................... 36
4.2.3.2
Frequências de incremento insatisfatório em relação ao PRA-HLA I............ 37
4.3
EFETIVIDADE DO PIFT.............................................................................. 38
4.3.1
Efetividade do PIFT em relação ao PRA-HLA I....................................... 38
4.3.2
Efetividade do PIFT em relação à porcentagem de PRA-HLA I.............. 38
4.3.3
Efetividade do PIFT em relação ao tipo de resposta após a transfusão.... 39
4.4
5
RESULTADOS DO PIFT EM RELAÇÃO AO INCREMENTO E
CARACTERÍSTICAS DOS EPISÓDIOS TRANSFUSIONAIS..................
PIFT e resposta transfusional de acordo com as características dos
concentrados de plaquetas...........................................................................
PIFT e resposta transfusional em relação às características dos
pacientes........................................................................................................
PERFIL DAS CITOCINAS SÉRICAS ANTES DA TRANSFUSÃO DE
PLAQUETAS E RELAÇÃO COM O INCREMENTO PÓS
TRANSFUSIONAL.......................................................................................
Níveis de IL-6 antes da transfusão de plaquetas de acordo com
características dos CPs e relação com incremento pós transfusional.......
Níveis de IL-6 antes da transfusão de plaquetas de acordo com
características dos pacientes e relação com incremento pós
transfusional.................................................................................................
NÍVEIS DE IL-6 ANTES DA TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS DE
ACORDO COM RESULTADOS DO PIFT E RELAÇÃO COM
INCREMENTO PÓS TRANSFUSIONAL....................................................
DISCUSSÃO.................................................................................................
6
CONCLUSÕES............................................................................................
58
7
REFERÊNCIAS...........................................................................................
59
8
ANEXO.........................................................................................................
67
4.2.1
4.2.2
4.4.1
4.4.2
4.5
4.5.1
4.5.2
4.6
xvi
32
32
34
34
40
40
42
44
46
47
50
51
1 INTRODUÇÃO
Os cânceres hematológicos são marcados pela falência da medula óssea ocasionada pela
citotoxicidade das opções de tratamento disponíveis (quimioterapia e radioterapia) ou
infiltração de clones leucêmicos (KURZROCK, 2005). Em consequência de uma medula
hipoproliferativa, apresentam-se quadros de neutropenia, anemia e trombocitopenia
manifestados por condições adversas como aumento de infecções, fadiga e propensão a
sangramentos, respectivamente, comprometendo a qualidade de vida e impactando de forma
negativa na sobrevida dos pacientes (KURZROCK, 2005). Há poucas opções para o tratamento
dessas condições e elas têm se baseado no uso de fatores de crescimento hematopoiético
(GABRILOVE, 2001) e transfusão de hemácias e plaquetas (STANWORTH et al., 2010).
O uso de fatores de crescimento pode aumentar consistentemente a contagem de
leucócitos (VOSE et al., 2003) e, quanto à anemia, além dos concentrados de hemácias (CH) o
uso de eritropoetina beneficia grande parte dos pacientes (CRAWFORD, 2002). No entanto, a
trombocitopenia permanece como o problema clínico mais relevante. Diversos fatores
trombopoiéticos, tais como IL-3, IL-9, IL-1 BETA, SCF e TPO, introduzidos no tratamento da
plaquetopenia apresentaram respostas limitadas (KURZROCK, 2005) enquanto que a
transfusão de concentrados de plaquetas (CPs) tem se fundamentado como suporte na
prevenção e tratamento de hemorragias (BAYER et al., 1992; BLAJCHMAN et al, 2008;
HOLBRO et al., 2013).
1.1 TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS EM PACIENTES ONCOHEMATOLÓGICOS
Antes da instituição da transfusão de plaquetas, as hemorragias contribuíam para a morte
de 67% dos pacientes com leucemias (BAYER et al., 1992). Após instituição dessa terapia, a
incidência de hemorragias fatais caiu para 37% e vem diminuindo cada vez mais devido ao
aperfeiçoamento do tratamento médico no suporte transfusional terapêutico e profilático com
CP (BAYER et al., 1992; STANWORTH et al., 2010).
Embora existam controvérsias sobre quando a transfusão profilática de plaquetas se faz
necessária, geralmente, é realizada quando a sua concentração está abaixo de 10 x 109
plaquetas/L na ausência de febre e ≤ 20 x 109/L para pacientes febris ou com infecção e em
transplante de células tronco (BLAJCHMAN et al, 2008; THE TRAP STUDY GROUP, 1997;
STANWORTH et al., 2013). Em casos particulares, quando do tratamento anticoagulante ou
1
antes de serem submetidos a procedimentos invasivos, podem ser recomendadas mesmo com
contagens superiores. Em casos de sangramento ativo, as transfusões são terapêuticas e
dependem da contagem desejada, geralmente acima de 40 x 109/L (HEIM et al., 2008;
HOLBRO et al., 2013).
Dessa forma, a utilização de CPs tem crescido francamente. Em períodos de cinco anos,
Seifried e colaboradores (2011) e Shehata e colaboradores (2014) mostraram, respectivamente,
aumento da utilização de CPs em 31,5% (2006 a 2012) e 36% (2003 a 2007), enquanto o
consumo de concentrados de hemácias (CHs) aumentou cerca de 17,2% e 10% nos mesmos
períodos. Seifried e colaboradores (2011) também mostraram que 58% das unidades de CHs
utilizadas foram para pacientes em setores para tratamento de traumas, cuidados intensivos e
cirurgias. Em contraste, mais de dois terços dos CPs foram distribuídos para pacientes adultos
e pediátricos em tratamento de malignidades hematológicas.
Apesar da crescente utilização da transfusão de plaquetas, os riscos inerentes à sua
prática ainda são uma realidade. As principais complicações relacionadas são reações febris e,
em menor frequência, a bacteremia (EDER; CHAMBERS, 2007; HOLBRO et al., 2013). Além
disso, devido aos esquemas crônicos de transfusão, os pacientes são expostos a uma ampla
gama de antígenos de doadores e, dependendo do tempo de tratamento e da disponibilidade de
produtos desleucocitados, 10% a 100% desses pacientes podem se sensibilizar e desenvolver
aloanticorpos direcionados contra esses antígenos (FERREIRA et al., 2011; THE TRAP
STUDY GROUP, 1997; VASSALO et al., 2014). De forma geral, em 30% a 50% das
transfusões, os indivíduos apresentam incremento insatisfatório na contagem de plaquetas após
a transfusão (FERREIRA et al., 2011; KERKHOFFS et al., 2008; THE TRAP STUDY
GROUP, 1997). Essa falta de resposta pode ser decorrente de fatores relacionados à qualidade
dos CPs utilizados e/ou condições inerentes ao paciente de origem imunológica ou não
imunológica.
1.1.1 A importância da qualidade dos concentrados de plaquetas
Milhões de transfusões de plaquetas são realizadas por ano em todo o mundo graças ao
aperfeiçoamento dos métodos de produção e estocagem dos CPs (FISCHER et al., 2006). Mas
ainda assim, o seu aproveitamento é limitado e é um desafio aos serviços de hemoterapia a
obtenção de CPs em quantidade e qualidade suficientes para atender à demanda de todos os
pacientes que necessitam dessa terapia (CAMERON et al., 2007). Limitações nos processos de
2
obtenção, conservação, manipulação e infusão dos hemocomponentes podem desencadear
danos nos componentes celulares e plasmáticos, gerando incidentes e acidentes transfusionais
graves (EDER; CHAMBERS, 2007).
Um dos primeiros cuidados em termos de segurança transfusional é o controle da
transmissão de doenças. O que temos hoje é a triagem criteriosa de doadores e realização de
testes de detecção para vários agentes infecciosos. O controle da quantidade de leucócitos em
cada hemocomponente também se faz necessário, devido aos riscos inerentes à contaminação
por leucócitos (SEFTEL et al., 2004; THE TRAP STUDY GROUP, 1997) associados não só à
transmissão
de
patógenos
intracelulares,
mas
também
à
imunogenicidade
dos
hemocomponentes (BRECHER; HAY, 2005; HEDDLE et al., 2002; PROWSE, 2012; SEFTEL
et al., 2004).
Para garantir a qualidade dos concentrados de plaquetas, especificamente, mais três
fatores quanto à produção e estocagem devem ser considerados: redução da ativação de
plaquetas durante a coleta, preparo e estocagem; atividade glicolítica mínima e disponibilidade
de glicose durante todo o período de estocagem (GULLIKZZON, 2003). Esses fatores poderão
sofrer influência da concentração de leucócitos e das condições de armazenamento.
Fato é que os CPs contêm mediadores solúveis derivados tanto de plaquetas quanto de
leucócitos, presentes no plasma do doador ou liberados durante a coleta, produção e estocagem
(APELSETH, 2007). O acúmulo desses mediadores até o momento da transfusão pode ser
importante para o desenvolvimento de reações transfusionais, efeito imunomodulatório ou
efeitos diretos ou indiretos sobre as células do paciente (COGNASSE et al., 2006; HOLBRO
et al., 2013).
Por esse motivo, o preconizado é que os CPs sejam estocados a 22ºC ±2 sob agitação
constante por no máximo cinco dias em bolsas contendo conservantes apropriados para
manutenção da viabilidade das plaquetas (BRASIL, 2011). Os tipos de CPs obtidos por
centrifugação podem ser: Plasma Rico em Plaquetas (PRP), Buffy Coat (BC) ou Aférese
(TYNNGARD, 2009).
Para o PRP, o sangue total colhido em bolsas triplas é centrifugado em baixa rotação
para produção do PRP que é transferido para uma bolsa satélite utilizando extratores manuais.
Em seguida, a bolsa satélite é centrifugada novamente em alta rotação para separação dos CPs
(RAVINDRA et al., 2009) contendo no mínimo 5,5 x 1010 plaquetas em 40 - 70 mL de plasma
(BRASIL, 2011). Esse é o principal tipo de concentrado de plaquetas transfundido em nosso
3
país utilizando de cinco a seis doadores aleatórios, não leucorreduzidos para cada paciente
adulto.
A produção do BC utiliza bolsas quádruplas que são centrifugadas a alta rotação para
separação da camada leucoplaquetária e extração automatizada do plasma que é centrifugado
novamente em baixa rotação para obtenção do CP (MISHIMA et al., 2014; RAVINDRA et al.,
2009;) que contém no mínimo 5,5 x 1010 plaquetas em 40-70 mL de plasma (BRASIL, 2011).
No procedimento de aférese, um único doador é puncionado para coleta do sangue que
é transferido para a máquina de aférese. No interior da máquina, por processo de centrifugação
programado, ocorre a separação automática do CP (RAVINDRA et al., 2009) que contém no
mínimo 3x1011 plaquetas em um volume ≥ 200 mL de plasma (BRASIL, 2011). Os demais
componentes sanguíneos são então devolvidos para o doador através do mesmo ou de outro
acesso venoso periférico. A aférese é o padrão ouro nas transfusões por conter o maior número
de plaquetas e o menor de leucócitos (MISHIMA et al., 2014; THE TRAP STUDY GROUP,
1997).
Para a redução mais efetiva do número de leucócitos, é possível filtrar o produto
plaquetário antes ou após o armazenamento das plaquetas (SHARMA; MARWAHA, 2010).
Em muitos países tem sido instituída a leucorredução universal (SEFTEL et al., 2004;
MISHIMA et al., 2014). No Brasil, é realizada apenas mediante indicação médica devido ao
seu alto custo e, na maioria das vezes, utilizando-se um equipo de filtração no momento da
transfusão, à beira do leito do paciente.
No caso de pacientes imunocomprometidos ou que irão receber transplante de célulastronco alogênicas, recomenda-se que as bolsas de CP sejam irradiadas para inativação dos
leucócitos e prevenção da doença do enxerto versus hospedeiro (ZHU et al., 2014). Esse
processo parece não afetar a viabilidade das plaquetas in vitro ou a funcionalidade e recuperação
da contagem in vivo (SLICHTER et al., 2005; VAN DER MEER; PIETERSZ, 2005;).
Outros fatores, não verificados devido à ausência de sintomas no doador ou inexistência
de análises mais sofisticadas da qualidade dos CPs, também podem influenciar a resposta do
paciente à transfusão. Além disso, as características dos CPs não são determinantes exclusivos
da eficácia da transfusão de plaquetas e irão depender também de fatores relacionados ao
paciente que o predispõem a uma resposta insatisfatória.
4
1.1.2 Fatores relacionados ao paciente capazes de afetar a resposta à transfusão de
plaquetas
Pacientes oncohematológicos trombocitopênicos estão mais suscetíveis a ter um
incremento plaquetário pós transfusional insatisfatório devido a comorbidades clínicas e
intervenções médicas que comprometem a sobrevida das plaquetas. Em cerca de 80% dos casos
são condições associadas à destruição periférica, sequestro microvascular ou consumo, tais
como febre, infecção grave, uso de Anfotericina B, esplenomegalia, coagulação intravascular
disseminada (CIVD) e hemorragias (HOLBRO et al., 2013; SLICHTER et al., 2005).
A febre é a manifestação clínica da estimulação hipotalâmica por mediadores como IL1, IL-6, TNF, IL-8, MIP -1 e PG nos quadros inflamatórios sistêmicos (MIHARA et al., 2012).
O mecanismo de influência da febre na resposta à transfusão de plaquetas é incerto devido à
concomitância muitas vezes de infecção e uso de medicações. Assim, a combinação desses três
fatores parece ser a causa mais comum de resposta insuficiente à transfusão de plaquetas
(DOUGHTY et al, 1994).
Várias das medicações usadas no tratamento de pacientes oncohematológicos estão
associadas a trombocitopenias induzidas por drogas (ASTER; BOUGIE, 2007). Como esse tipo
de trombocitopenia é geralmente imuno-mediada, as plaquetas transfundidas estão sujeitas aos
mesmos efeitos que as plaquetas do paciente aumentando o risco de se ter um incremento póstransfusional insatisfatório (ASTER; BOUGIE, 2007). Nos quadros de infecção que podem
incluir quadros mais graves como os de sepse, pode ocorrer tanto o sequestro das plaquetas pelo
endotélio ativado (STOKES; GRANGER; 2012; WARKENTIN et al., 2003) quanto a
opsonização por anticorpos inespecíficos anti-plaquetas presentes na circulação (McGRATH et
al, 1988; STEPHAN, et al.,2000).
O aumento do tamanho do baço está associado com maior sequestro das plaquetas por
ser esse órgão o principal sítio de destruição plaquetária (SLICHTER et al., 2005). A
porcentagem de plaquetas retidas no baço 30 minutos após a transfusão em pacientes com
esplenomegalia é de cerca de 80% enquanto em indivíduos normais é de 40% (ASTER, 1966;
HILL-ZOBEL, et al., 1986).
No caso da CIVD, o alto consumo de fatores da coagulação e a excessiva geração de
trombina levam ao depósito de fibrina em pequenos vasos desencadeando ativação e consumo
de plaquetas (TOH; ALHAMDI, 2013). Pacientes oncohematológicos estão sujeitos a esse
5
processo devido à liberação de fator tecidual pelos grânulos de células leucêmicas de forma
espontânea ou em decorrência do tratamento quimioterápico (STOKES; GRANGER; 2012).
Pacientes submetidos ao transplante de células tronco hematopoiéticas apresentando
doença do enxerto contra o hospedeiro também podem ter resposta transfusional prejudicada.
Pode ocorrer consumo devido à microangiopatia associada (DALY et al., 2002) e também
destruição pela alta incidência de autoanticorpos nesses pacientes (ANASETTI et al., 1989;
PULANIC; LOZIER; PAVLETIC, 2009).
Além das condições clínicas, os pacientes oncohematológicos também podem
apresentar anticorpos
direcionados contra
antígenos
das
plaquetas dos
doadores
(aloanticorpos). A aloimunização aos antígenos HLA Classe I e HPA presentes na superfície
das plaquetas ocorre em cerca de 20% a 60% desses pacientes e são decorrentes de
sensibilização prévia durante gestação, transfusões e transplantes (FERREIRA et al., 2011;
PAVENSKI; FREEDMAN; SEMPLE, 2012; THE TRAP STUDY GROUP, 1997).
O sistema de antígenos HLA origina-se do complexo de histocompatibilidade principal
que codifica proteínas polimórficas da superfície celular responsáveis pela apresentação de
antígenos e que são encontradas tanto em plaquetas quanto em outras células sanguíneas e dos
tecidos (BROWN; NAVARRETE, 2011). Assim, a sensibilização durante a transfusão ocorre
também pela presença de leucócitos contaminantes e não se restringe à transfusão de CPs. As
plaquetas podem sintetizar moléculas HLA Classe I (SANTOSO et al., 1993) e também
adsorver moléculas HLA solúveis no plasma (LALEZARI; DRISCOLL, 1982). Dessa forma,
o número de antígenos na superfície das plaquetas pode ser relativamente alto quando
comparado a eritrócitos e granulócitos.
A leucorredução contribui para a prevenção de aloimunização HLA, uma vez que
estudos mostram, com este procedimento, quedas na incidência de 48% para 16% (MURPHY
et al., 1986), de 50% para 15% (SNIECINSKI et al., 1988); de 45% para 17-21% (THE TRAP
STUDY GROUP, 1997) e de 19% para 7% (SEFTEL et al., 2004). Células apresentadoras de
antígenos do próprio doador podem interagir diretamente com células T CD4+ do paciente,
apresentando os antígenos diretamente (AUCHINCLOSS; SYKES; SACHS, 1999;
PAVENSKI, FREEDMAN, SEMPLE, 2012;). Mas as células do paciente também podem
processar os antígenos das plaquetas transfundidas e apresentá-los por via indireta às células T
CD4+ do próprio paciente (GILSON; ZIMRING, 2012; SEMPLE; FREEDMAN, 2002).
Os antígenos HPA são sequências de aminoácidos das glicoproteínas (GP) presentes na
superfície das plaquetas. Os HPAs são expressos em seis diferentes GPs: GPIIb, GPIIIa, GPIba,
6
GPIbb, GPIa e CD109 (CURTIS; McFARLAND, 2013). A incidência de anticorpos anti-HPA
varia de 2% a 17% e não diminui com a redução de leucócitos (KIEFEL et al., 2001; LEGLER
et al., 1997; SANZ et al., 2001; THE TRAP STUDY GROUP, 1997).
De forma geral, a aloimunização contra os antígenos do sistema HLA Classe I é mais
comum do que para os do sistema HPA, correspondendo a 80% dos casos (KICKLER et al.,
1990a; LAUNDY et al., 2004) e indivíduos HLA Classe I sensibilizados têm maior chance de
desenvolverem anticorpos anti-HPA (KICKLER et al, 1990). Outro fato interessante é que
cerca de 70% dos anticorpos anti-HPA são desenvolvidos durante processos infecciosos, muitas
das vezes são transientes, e alguns se comportam como autoanticorpos reagindo contra
plaquetas do próprio paciente (McGRATH et al, 1988).
Quanto ao impacto da presença de aloanticorpos sobre a resposta à transfusão de
plaquetas, esse é o fator que prejudica de forma mais intensa o incremento pós transfusional;
contudo, representa apenas cerca de 20% das causas de falha na resposta à transfusão de CPs
(PAVENSKI, FREEDMAN, SEMPLE; 2012). Isso provavelmente está relacionado ao fato de
que a presença do aloanticorpo não necessariamente implica em comprometimento da resposta
transfusional, visto que somente 10% a 50% dos pacientes aloimunizados apresentam
comprometimento efetivo da resposta à transfusão de plaquetas (LEGLER et al, 1997; THE
TRAP STUDY GROUP, 1997).
Diante disso, entendemos que nenhum fator é um bom preditor de resposta pós
transfusional insatisfatória. Cada paciente apresentará um comportamento particular de acordo
com um contexto que dependerá da intensidade de cada fator e/ou da soma dos efeitos de vários
fatores.
1.1.3 Mecanismos envolvidos no baixo incremento de plaquetas após a transfusão
As plaquetas são produzidas pela fragmentação do citoplasma de megacariócitos que se
desenvolvem na medula óssea e no baço (LEEKSMA; COHEN, 1955). Ao serem liberadas na
circulação sanguínea, exercem um papel essencial na hemostasia, cicatrização de feridas e
processos de fibrose (SOARES et al., 2007). Em humanos, são produzidas diariamente 1 x 1011
plaquetas que apresentam sobrevida média de dez dias e são retiradas da circulação pelo sistema
retículo endotelial, principalmente no fígado e no baço (MASON et al., 2007). Assim, o
organismo é capaz de manter no sangue periférico concentrações normais de 150 a 400 x 10 9
plaquetas por litro de sangue.
7
Quando há um desequilíbrio com queda na produção de plaquetas, ou aumento de
consumo, ou destruição periférica, observa-se o quadro de trombocitopenia. Nos casos em que
a transfusão de plaquetas está indicada, a dose de plaquetas infundida é ajustada à superfície
corporal do paciente e incremento plaquetário desejado. Normalmente, a recuperação média é
de 60 (±15) % da dose transfundida (HANSON; SLICHTER, 1985). Contudo, o incremento
esperado pode não ser atingido devido ao consumo, sequestro microvascular ou destruição das
plaquetas transfundidas.
1.1.3.1 Consumo e sequestro de plaquetas
Na presença de sangramento ativo e clinicamente relevante, as plaquetas transfundidas
podem ser consumidas no sítio de lesão prejudicando o incremento pós transfusional.
Condições inflamatórias locais ou sistêmicas desencadeiam respostas características a
nível microvascular que podem ocasionar uma resposta inflamatória nos tecidos (STOKES;
GRANGER, 2012). Quando as plaquetas transfundidas atravessam essa vasculatura, são
expostas aos mesmos mediadores solúveis que as plaquetas do próprio paciente. Isso inclui
mediadores lipídicos, citocinas e quimiocinas liberadas pelos leucócitos ativados, células
endoteliais ativadas e células perivasculares (STOKES; GRANGER, 2012).
Esses mediadores se ligam a receptores sobre as plaquetas desencadeando uma resposta
de ativação que é caracterizada pela secreção dos grânulos densos e alfa, liberação de produtos
plaquetários, e mobilização e ativação das moléculas de adesão das plaquetas (LEVI; VAN,
2010). Assim, essa adesão das plaquetas ao endotélio vascular pode acontecer mesmo na
ausência de lesão.
O fato é que a ativação das células endoteliais que acompanha a inflamação parece ser
suficiente, na presença de ativação plaquetária, para promover a interação vaso-plaqueta. Com
isso, as plaquetas rolam sobre o endotélio e aderem firmemente a ele de maneira semelhante à
adesão dos leucócitos às células endoteliais (STOKES; GRANGER, 2012).
De forma especial, as plaquetas transfundidas podem ter sido ativadas anteriormente em
decorrência das condições de estocagem ou processo de filtração (COGNASSE et al., 2006). A
adesão das plaquetas ao endotélio ativado e possivelmente a leucócitos ativados ocasiona o que
denominamos sequestro microvascular das plaquetas (STOKES; GRANGER, 2012). Esse
sequestro pode contribuir para o baixo incremento após a transfusão de CPs.
8
Além disso, como mencionado anteriormente, nos casos de aumento do baço, pode
ocorrer outro quadro que é o sequestro esplênico.
1.1.3.2 Destruição de plaquetas por fagocitose, lise e apoptose
Durante a transfusão, os aloantígenos plaquetários podem ser apresentados direta ou
indiretamente aos linfócitos T auxiliares do paciente. Na via direta, os aloantígenos são
apresentados por células apresentadoras de antígeno do doador presentes no CP (linfócitos B e
monócitos) (AUCHINCLOSS; SYKES; SACHS, 1999; PAVENSKI, FREEDMAN, SEMPLE;
2012). Na via indireta, as plaquetas do doador são fagocitadas pelas células apresentadoras de
antígeno do próprio paciente e, posteriormente, essas células apresentam os antígenos aos
linfócitos T auxiliares (GILSON; ZIMRING, 2012; SEMPLE; FREEDMAN, 2002).
Quando os antígenos são apresentados via molécula HLA Classe II aos linfócitos T
auxiliares (primeiro sinal) na presença de eventos co-estimulatórios (segundo sinal), os
linfócitos T auxiliares são ativados e se tornam células efetoras (PAVENSKI, FREEDMAN,
SEMPLE; 2012). Esses linfócitos T efetores secretam citocinas capazes de estimular a
diferenciação dos linfócitos B em células plasmáticas que geram e secretam anticorpos IgG. As
plaquetas opsonizadas pelos anticorpos produzidos são então removidas da circulação.
A destruição das plaquetas mediada por anticorpo inclui não somente aloanticorpos, mas
qualquer anticorpo direcionado contra GPs da membrana das plaquetas, complexos associados
a drogas que se depositam na superfície plaquetária ou anticorpos ligados a células ou
complexos imunes que interagem com as plaquetas (TAYLOR et al., 2000).
Após a ligação plaqueta-anticorpo, os macrófagos e/ou células dendríticas do sistema
retículo-endotelial se ligam à porção Fc do anticorpo através do receptor Fc e fagocitam as
plaquetas. Esse processo usualmente ocorre no baço (STRATTON et al., 1989) e alguns estudos
sugerem que o stress oxidativo, possivelmente gerado por endotoxinas associadas a infecções,
pode favorecer a ligação da Proteína C Reativa que parece atuar como cofator amplificando a
depuração de plaquetas IgG mediada (KAPUR et al., 2014). Além desse processo, os anticorpos
que interagem com as plaquetas podem também ativar o complemento e fixar moléculas do
complemento sobre as plaquetas contribuindo para a lise das plaquetas (ZAPATA; COX;
SALVATO, 2014).
A lise de plaquetas é mediada por célula em decorrência da ativação do sistema
complemento que pode ocorrer também na ausência de anticorpos associados. Moléculas do
9
complemento (por exemplo, c3) liberadas durante infecção, toxicidade ou inflamação podem
se depositar sobre a superfície de plaquetas favorecendo a lise mediada por células (linfócitos
T citotóxicos, macrófagos e neutrófilos) (ZAPATA; COX; SALVATO, 2014). A lise por célula
T citotóxica pode ser por indução de apoptose ou via perforina/granzima (ZHANG et al., 2006).
A ativação das plaquetas nos processos infecciosos se dá pela ligação ao agente ou seus
produtos. Ocorre alteração da conformação das mesmas permitindo a expressão de P-selectina
que funciona como um receptor induzindo a fagocitose das plaquetas pelos macrófagos no baço
(DIACOVO et al, 1996; FLAUJAC; BOUKOUR; CRAMER-BORDE; 2010; JIN et al., 2012).
Além disso, essas plaquetas ativadas secretam quimiocinas que promovem quimiotaxia e
podem formar agregados em torno dos leucócitos. Todos esses eventos favorecem tanto a
fagocitose quanto a lise dessas plaquetas (ZAPATA; COX; SALVATO, 2014).
1.2 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS
A eficácia da transfusão de plaquetas pode ser avaliada através da resposta clínica do
paciente quanto à parada do sangramento ativo. Mas, além da presença ou ausência de
sangramento, o monitoramento da efetividade da transfusão de plaquetas com base na contagem
de plaquetas pós transfusional apresenta maior repercussão no direcionamento das decisões
clínicas quanto à necessidade de transfusões adicionais ou precaução quanto a procedimentos
invasivos (ARNOLD et al., 2006).
A avaliação mais objetiva é feita através do Cálculo Corrigido do Incremento (CCI),
amplamente conhecida, principalmente por ser a única forma de avaliação em transfusões
profiláticas (ARNOLD, 2006; BONSTEIN et al., 2012; SHASTRY; CHAUDHARY,2012). No
entanto, seu emprego na rotina ainda é incipiente (QUAGLIETTA et al., 2012) e raramente
realizada nos centros hemoterápicos brasileiros.
1.2.1 Cálculo Corrigido do Incremento
O CCI é definido como a diferença entre a contagem encontrada no paciente após a
transfusão (A) e a observada antes da transfusão (B), multiplicada pela superfície corporal (SC)
e dividida pelo número de plaquetas transfundidas (C) (ARNOLD et al., 2006; THE TRAP
STUDY GROUP, 1997; YANKEE; GRUMET; ROGENTINE, 1969;). Então:
10
CCI = (A – B) x SC
C
Onde:
A = Contagem de plaquetas/µL após a transfusão;
B = Contagem de plaquetas/µL antes da transfusão;
SC = Superfície corporal do paciente em m2;
C = Total de plaquetas transfundidas x 10-11.
Dessa forma, o CCI ajusta o número de plaquetas transfundidas para o volume de sangue
do paciente e número de plaquetas no produto plaquetário permitindo uma comparação mais
precisa da resposta à transfusão, uma vez que as diferenças no CCI podem ocorrer com produtos
distintos que tenham a mesma dose, mas diferentes qualidades (DAVIS et al., 1999;
SLICHTER et al., 2005). O CCI é considerado insatisfatório se inferior a 5.000 plaquetas/µL,
quando avaliado entre 10 e 60 minutos após a transfusão, e se menor que 2.500 plaquetas/µL
na avaliação após 18 a 24 horas (BISHOP et al., 1992; SCHIFFER, 2001).
Nos quadros em que há persistência de incremento insatisfatório o paciente é
denominado como refratário à transfusão de plaquetas. Para tanto, consideram-se no mínimo
duas transfusões, preferencialmente consecutivas, com CCI insatisfatório, visto que podem
ocorrer oscilações por fatores clínicos e farmacológicos (DAVIS et al., 1999; DZIK, 2007;
NOVOTNY, 1999; REBULLA, 2005).
Pacientes oncohematológicos refratários à transfusão de plaquetas demandam maior
suporte transfusional e suas contagens plaquetárias podem chegar a níveis muito baixos com
risco de hemorragias espontâneas (BONSTEIN et al., 2012). A frequência de refratariedade em
pacientes oncohematológicos varia de 7% a 34% (FERREIRA et al., 2011; HOD;
SCHWARTZ, 2008; QUAGLIETTA et al., 2012; THE TRAP STUDY GROUP, 1997).
Contudo, há relatos de frequência de até 50% em pacientes que receberam múltiplas transfusões
de produtos não leucorreduzidos (BONSTEIN et al., 2012).
1.2.2 Detecção de anticorpos contra plaquetas
Como os anticorpos direcionados contra as plaquetas podem interferir na resposta à
transfusão de plaquetas, a identificação dos mesmos pode auxiliar na discriminação dos fatores
11
etiopatogênicos envolvidos. É possível realizar a detecção de anticorpos diretamente, testandose a presença dos mesmos na superfície das plaquetas do paciente, ou indiretamente, pela
reatividade do soro do paciente contra plaquetas intactas ou fragmentos de antígenos fixados
em placas ou microesferas fluorescentes. Tais testes também se diferenciam de acordo com a
sensibilidade e especificidade.
1.2.2.1 Testes inespecíficos
A detecção inespecífica pode ser realizada utilizando-se plaquetas intactas que são
incubadas com o soro do paciente após sucessivas lavagens (BUB et al., 2013). Após incubação
com um anticorpo anti-imunoglobulina humana marcado, a positividade do teste pode ser
revelada utilizando-se microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo. O ensaio mais
empregado é o PIFT (Platelet Immunofluorescence Test) que é altamente sensível por detectar
qualquer anticorpo na superfície das plaquetas, inclusive autoanticorpos e aqueles ligados pelo
depósito de imunocomplexos. No entanto, a especificidade não pode ser determinada e há altas
taxas de resultados falso positivos se comparado a testes específicos (BUB et al., 2013,
FONTÃO-WENDEL et al., 2007).
Apesar da baixa especificidade, dentre os testes disponíveis, esse é o de menor
complexidade, menor custo e que demanda menor consumo de tempo (BUB et al., 2013).
Embora ainda existam muitas variações na realização da técnica, seu uso na triagem de
pacientes com suspeita de apresentarem anticorpos anti-plaquetas pode ser bastante eficaz
(BUB et al., 2013; FERREIRA et al., 2011; FONTÃO-WENDEL et al., 2007). O teste poderá
detectar não somente aloanticorpos, mas também anticorpos não específicos como aqueles
transientes e associados a infecções ou depósitos de imunocomplexos, geralmente associados
ao uso de medicamentos. Além disso, por usar plaquetas frescas, sua sensibilidade é mais alta
na detecção de antígenos presentes em moléculas que podem sofrer alteração conformacional
após armazenamento e certos processos de lavagem.
1.2.2.2 Testes específicos
Testes mais elaborados são capazes de determinar a especificidade do anticorpo para
alelos de antígenos HLA Classe I ou HPA.
12
A detecção de anticorpos contra HLA classe I, também expressa pela porcentagem de
Reatividade contra o Painel de Antígenos (PRA – Panel Reactivity Antigen), pode utilizar as
mesmas técnicas empregadas para avaliação de compatibilidade em transplantes. Assim, esses
ensaios têm melhor padronização e foram aprimorados ao longo dos anos com disponibilidade
de testes comerciais e de detecção em larga escala. Os ensaios iniciais utilizavam um painel de
linfócitos frente ao soro do paciente avaliando a posterior lise pelo sistema complemento
(Lymphocytotoxic Test - LCT) (ARAKI et al., 1995, ARRUDA, 2013). Posteriormente vieram
os testes de imunofluorescência (Lymphocyte Immunofluorescence Test - LIFT), avaliados por
ELISA ou citometria de fluxo (ARRUDA, 2013; LEVIN et al., 2003; LUBENKO et al., 2001)
e, atualmente, testes em larga escala que utilizam antígenos fixados em microesferas
fluorescentes (DZIK, 2007; FONTAO-WENDEL, 2007; HEIKAL; SMOCK, 2013;
JACKMAN et al., 2013).
Para identificação de aloanticorpos com especificidade para antígenos HPA são
utilizadas técnicas de ELISA (Enzime-Linked Immuno Sorbent Assay) com captura de antígeno:
ACE (Antibody Capture ELISA); MACE (Modified Antibody Capture ELISA) ou MAIPA
(Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Platelet Antigens Assay) (FONTAOWENDEL, 2007; HEIKAL; SMOCK, 2013; KIEFEL et al., 2001). O último é considerado
teste padrão ouro.
No ACE, as glicoproteínas das plaquetas ligam-se à placa por um anticorpo monoclonal
específico. O soro teste é adicionado e os anticorpos ligados são detectados por um segundo
anti-anticorpo marcado com enzima (HEIKAL; SMOCK, 2013). Nos métodos MACE e
MAIPA, o soro do paciente é incubado primeiramente com plaquetas conhecidas (antes da
captura de antígeno), seguindo-se a lavagem e lise plaquetária antes da captura do complexo
por anticorpos previamente fixados em placas (HEIKAL; SMOCK, 2013; KIEFEL et al.,
2001). O método MAIPA se diferencia do MACE por primeiramente incubar as plaquetas a um
anticorpo monoclonal específico de glicoproteína e ao soro do paciente antes da lise
(ARRUDA, 2013; BESSOS et al., 2005; HEIKAL; SMOCK, 2013).
Enfim, o que se espera é que o monitoramento dos pacientes com diferentes testes in
vitro permita identificar parâmetros ideais na predição da presença ou ausência de resposta
aloimune prejudicial ao transplante e à transfusão.
13
1.3 O MANEJO DO PACIENTE REFRATÁRIO À TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS
Quanto à transfusão de plaquetas para pacientes refratários devido à presença de
aloanticorpos, várias estratégias podem ser utilizadas, sendo primeiramente recomendado a
transfusão de CPs ABO compatíveis, filtrados e preferencialmente de aférese (VASSALLO et
al., 2013). Essa pode ser a única opção nos países onde é difícil estabelecer um painel de
doadores de plaquetas compatíveis por restrições de custo e/ou de estrutura (SHASTRY;
CHAUDHARY, 2012).
Alguns centros selecionam ainda os doadores cujos concentrados proporcionaram
incremento satisfatório, mas nem sempre é possível a identificação desses doadores. Nesses
casos, é inaceitável continuar a terapia profilática se o paciente não apresentar sangramento.
Quando há sangramento, recomenda-se o emprego de pool de vários doadores e em intervalos
menores, esperando que algum deles seja compatível e ajude a melhorar o incremento
(NEGASAWA; KIM; BALDINI, 1978).
Muitas vezes pode-se optar também pela infusão de Imunoglobulina G intravenosa
(IGIV) para modular a aloimunização. Em pacientes adequadamente selecionados, a terapia de
IGIV pode salvar vidas. No entanto, seu uso é limitado devido ao alto custo e aos riscos
associados, como reações sistêmicas que podem acometer entre 3% a 15% dos pacientes
(ANDERSON et al., 2007; LEE; NORRIS; SCHIFFER, 1987; SCHIFFER et al., 1984).
Outra opção adotada é a seleção de plaquetas que não possuam antígenos contra os quais
o paciente apresenta aloanticorpos, mas nem todos os centros identificam aloanticorpos
plaquetários em seus pacientes (VASSALO et al., 2013). Alguns estudos preliminares sugerem
que o uso de unidades de CPs antígeno negativas pode ser tão bem sucedido quanto o uso de
unidades HLA-idênticas (PAI, et al., 2010; VASSALO et al., 2013). Porém, essa estratégia não
previne a sensibilização aos antígenos não compartilhados entre paciente e doador.
Diante disso, a estratégia ideal é a seleção de doadores geneticamente compatíveis
(HOD; SCHWARTZ, 2008). Contudo, os doadores de plaquetas não são rotineiramente
genotipados para HLA Classe I e HPA (BISHOP et al., 1988; LEGLER et al., 1997) na maioria
dos serviços e, como o sistema HLA é altamente polimórfico, nem sempre há doadores
compatíveis disponíveis. Muitas vezes, pode-se optar pela seleção de doador parcialmente
incompatível.
Para ampliar as chances de seleção de doadores compatíveis, é possível selecionar
doadores com base em alguns grupos de alelos com padrões sorológicos de reatividade cruzada,
14
conhecidos como CREG (cross-reactive groups). Os CREG apresentam epítopos comuns que
são diferencialmente compartilhados entre as moléculas HLA Classe I de forma que as
moléculas de HLA-A e HLA-B podem ser agrupadas em nove ou mais famílias de CREG (PAI
et al., 2010).
A seleção baseada em CREGs amplia a determinação de antígenos HLA parcialmente
compatíveis de um potencial doador para o paciente. Essa abordagem geralmente funciona
perfeitamente se o soro do paciente não é muito reativo, ou seja, reatividade menor que 80%
contra os tipos de antígenos HLA. (BROOKS; MACPHERSON; FUNG, 2008; DUQUESNOY,
2002).
No entanto, Moroff e colaboradores (1992) ainda encontraram incremento insatisfatório
em cerca de 40% dos casos compatíveis pelo CREG, demonstrando limitada efetividade dessa
estratégia. Na busca por soluções, desenvolveu-se a estratégia de seleção de doadores
genotipados compatíveis para antígenos HLA Classe I através de uma ferramenta de avaliação
da compatibilidade HLA conhecida como HLAMatchmaker.
Este é um software algorítmico que identifica epítopos imunogênicos que se expressam
em regiões da molécula HLA acessíveis aos aloanticorpos (DUQUESNOY, 2008). Há uma
versão utilizando triplets, seqüências lineares de três resíduos de aminoácidos (DUQUESNOY,
2002), que fornecem uma descrição do repertório do epítopo HLA. E uma versão chamada
Eplet que se baseia na modelagem estereoquímica da proteína e contribui para identificar
resíduos críticos de aminoácidos que são expostos à ligação antígeno-anticorpo
(DUQUESNOY, 2006). A versão Eplet de HLAMatchmaker, portanto, representa um
repertório mais completo de epítopos HLA, levando em consideração a estrutura tridimensional
da molécula e fornecendo uma avaliação mais refinada da compatibilidade HLA
(DUQUESNOY, 2011).
De acordo com Duquesnoy (2011), o HLAMatchmaker aplica dois princípios: cada HLA
representa uma sequência distinta de eplets, estruturalmente definidas como potenciais
imunógenos capazes de induzir anticorpos específicos, e os pacientes não podem produzir
anticorpos contra epítopos que são expressos pelas suas próprias moléculas de HLA. Assim,
esse modelo inovador pode aumentar o número de doadores compatíveis para um dado receptor
sem a necessidade de uma extensa análise sorológica (DUQUESNOY, 2002; DUQUESNOY,
2008).
Mas no caso dos pacientes cuja causa da refratariedade à transfusão de plaquetas não é
decorrente de aloanticorpos, a causa base precisa ser tratada ou suspensa no caso de medicações.
15
Contudo, diante da necessidade de transfusão por sangramento ativo, o clínico deve avaliar a
instituição de transfusão plaquetária massiva, infusão contínua e lenta, uso de anti-fibrinolíticos
e Fator VII ativado (HOD; SCHWARTZ, 2008).
1.4 CITOCINAS COMO BIOMARCADORES PLASMÁTICOS
Os complexos mecanismos envolvidos no baixo incremento de plaquetas após a
transfusão sugerem que os níveis de diversas proteínas plasmáticas podem estar alterados nos
pacientes refratários, dentre elas as citocinas (HOD; SCHWARTZ, 2008). Contudo, não
encontramos na literatura trabalhos abordando a relação entre os níveis de citocinas antes da
transfusão de plaquetas e a resposta após a transfusão.
As citocinas são polipeptídeos produzidos por células tanto da imunidade inata quanto
da imunidade adquirida que se ligam a receptores específicos influenciando a atividade,
diferenciação, proliferação e sobrevida da célula imunológica. Elas podem atuar como próinflamatórias ou anti-inflamatórias (HARRISON et al., 2011).
Na imunidade inata, ocorre uma reação inflamatória local com recrutamento de
leucócitos e alterações sistêmicas que favorecem a erradicação da infecção. As principais
citocinas envolvidas nesse processo são IL-6, TNF e IFN- γ. O tipo do antígeno envolvido é
que determina a intensidade e as características da resposta à infecção com liberação de
citocinas que medeiam muitas das funções efetoras da imunidade inata (HARRISON et al.,
2011).
Os estímulos gerados na imunidade inata favorecem a proliferação e diferenciação de
células T antígeno-específicas e dos linfócitos B, caracterizando o perfil da subsequente
resposta imune adquirida. Após as células apresentadoras de antígenos ativarem as células T,
essas se diferenciam em células TCD4+ auxiliares (COSMI et al., 2014). De acordo com os
sinais expressos aos receptores de células T, moléculas co-estimulatórias, receptores de
citocinas e fatores de transcrição específicos, as células TCD4+ se diferenciam em
subpopulações de células T auxiliares efetoras (TH) tais como TH1, TH2, TH17 e T reguladoras
(TREG) (COSMI et al., 2014).
Cada grupo de células é caracterizado por funções efetoras distintas e um perfil
específico de citocinas, de forma que a proporção das citocinas produzidas pelas subpopulações
determinarão efeitos protetores ou consequências patológicas das respostas imunes (COSMI et
al., 2014).
16
Em resposta aos microorganismos que infectam ou ativam macrófagos e células NK,
essas células produzem IL-12 que estimula produção de IFN-γ capaz de induzir a diferenciação
das células T no padrão TH1 (BRADLEY; DALTON; CROFT, 1996). O IFN-γ está envolvido
principalmente no estímulo da eliminação de patógenos intracelulares através da ativação de
macrófagos e secreção de imunoglobulinas opsonizantes e fixadoras do complemento
(ROMAGNANI, 1994). O IFN-γ induz a produção de mais IL-12, o que amplifica a
diferenciação em células TH1 ao mesmo tempo em que inibe a diferenciação em células TH2
(BRADLEY; DALTON; CROFT, 1996).
A diferenciação em padrão TH2 é estimulada pela ligação de IL-4 que estimula a
produção de mais IL-4 (PARRONCHI et al., 1992). Essa subpopulação de células é
caracterizada pela produção de IL-4, IL-5, IL-13, IL-25 e IL-10 sendo que, IL-4, IL-13 e IL-10
antagonizam as ações do IFN-γ e inibem ativação dos macrófagos (PARRONCHI et al., 1992).
As células TH2 participam da eliminação de patógenos extracelulares, parasitas e alérgenos
através de eosinófilos e mastócitos e da indução de imunoglobulinas das classes IgG1 e IgE
(PULENDRAN; ARTIS, 2012).
O padrão TH17 é direcionado pela ação de IL-6 e TGF-β. As células TH17 produzem
grandes quantidades de IL-17, IL-22 e IL-21 e expressam receptores para o IL-23. A presença
de IL-23 garante então, o suporte e manutenção de TH17 (OUKKA, 2008). Esse padrão de
células T é responsável pela defesa contra fungos e bactérias extracelulares, graças à sua
capacidade de recrutar e ativar granulócitos neutrofílicos. Th17 também exerce papel
importante na patogênese de várias doenças autoimunes e inflamatórias (OUKKA, 2008).
A predominância de secreção de TGF-β irá direcionar a diferenciação em células TREG
que se caracterizam pela expressão predominante de IL-10. Essa subpopulação de células
protege o organismo de respostas efetoras exageradas e perigosas como nas respostas
autoimunes (COSMI et al., 2014).
1.5 JUSTIFICATIVA
Como levantado, vários mecanismos imunes contribuem para a falta de incremento na
contagem de plaquetas após a transfusão e faltam na rotina marcadores que possam refletir um
estado geral dos pacientes onco-hematológicos e predizer a resposta à transfusão. O perfil de
citocinas pode refletir o estado imune desses pacientes; contudo, não há na literatura estudos
17
que tenham realizado essa avaliação antes da transfusão e nem a sua associação com o
incremento pós transfusional.
Diante disso, decidimos avaliar a performance do PIFT como teste de triagem na
detecção de anticorpos anti-plaquetas por ser um teste mais simples e de menor custo. Além
disso, avaliar se os níveis séricos de citocinas pró e anti-inflamatórias antes da transfusão teriam
associação com a resposta pós transfusional, complementando as análises do CCI e PIFT.
1.6 HIPÓTESE
O PIFT é um teste de triagem útil na monitoração de pacientes onco-hematológicos sob
regimes de transfusão crônica de plaquetas e o padrão de resposta imune no plasma desses
pacientes antes da transfusão pode fornecer informações relevantes sobre seu estado
imunológico e direcionar o manejo do paciente frente à transfusão de plaquetas.
18
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do trabalho foi avaliar a resposta à transfusão de plaquetas em pacientes
onco-hematológicos e determinar o valor da detecção de anticorpos anti-plaquetas pela técnica
PIFT e a influência dos níveis de citocinas do perfil Th1, Th2, Th17 e Treg no soro desses
pacientes antes da transfusão de plaquetas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Avaliar a resposta à transfusão de plaquetas em pacientes onco-hematológicos e sua
associação com fatores capazes de influenciar a resposta à transfusão de plaquetas;
2) Avaliar a concordância entre o PIFT e técnicas de detecção específica de anticorpos
anti-plaquetas.
3) Avaliar a associação entre resposta à transfusão de plaquetas, resultados do PIFT e
fatores capazes de influenciar a resposta à transfusão de plaquetas;
4) Avaliar a relação entre níveis de citocinas do perfil Th1, Th2, Th17 e Treg no soro
desses pacientes antes da transfusão de plaquetas com a resposta transfusional.
5) Avaliar a associação entre resposta à transfusão de plaquetas, resultados do PIFT e
níveis de citocinas do perfil Th1, Th2, Th17 e Treg no soro desses pacientes antes da
transfusão de plaquetas.
19
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 CASUÍSTICA
O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro (UFTM) (registro nº 977/2007), da Universidade Federal de Uberlândia
(UFU) (registro nº 310/2010) e ao Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação HEMOMINAS
(registros nº 178/2007 e 271/2010) recebendo parecer favorável dessas instituições para a
realização do mesmo.
Foram incluídos no estudo: indivíduos com idade superior a 18 anos, com diagnóstico
de doença onco-hematológica, atendidos pelo Hospital de Clínicas da UFTM e Hospital de
Clínicas da UFU e submetidos à transfusão de Concentrados de Plaquetas. As amostras de
sangue e dados do prontuário foram coletados após assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (anexo).
3.2 COLETA DE AMOSTRAS
Para a contagem de plaquetas em cada CP a ser transfundido aos pacientes incluídos na
pesquisa, amostras homogêneas foram coletadas do macarrão da bolsa dos CPs obtidos por PRP
ou Aférese. O macarrão era selado a 10 cm da extremidade, garantindo a não abertura do
sistema, para separação de aproximadamente 2 mL do produto. Nos casos de CPs de PRP,
preparava-se um pool das amostras das bolsas a serem transfundidas. Todas as amostras
coletadas dos CPs eram homogeneizadas por no mínimo cinco minutos e a contagem
plaquetária realizada em contador de células automatizado.
Os dados referentes a contagem de plaquetas, tipagem ABO e leucorredução dos CPs a
serem transfundidos eram arquivados em questionário próprio relativo ao paciente em questão.
Todas as solicitações de CPs do serviço eram averiguadas quanto aos critérios de
inclusão do estudo e as principais dificuldades na obtenção de amostras dos pacientes foram no
repasse de informação mediante a solicitação para a coleta de amostra pré-transfusão,
incompatibilidades de horário, urgências na liberação do hemocomponente sem coleta de
sangue pré-transfusão e obtenção de acesso venoso em pacientes debilitados pelo longo período
de internação.
20
A obtenção de amostras para contagem de plaquetas dos pacientes foi realizada duas
vezes, uma durante o intervalo de até 60 minutos antes da transfusão e outra entre 10 e 60
minutos após a transfusão. Cada amostra de sangue total foi colhida em tubo de 5mL contendo
o anticoagulante EDTA. A contagem do número de plaquetas foi realizada em contador de
células automatizado.
As amostras de soro para pesquisa de anticorpos anti-plaquetas e dosagem de citocinas
foram obtidas antes da transfusão no mesmo momento em que foram colhidas as amostras em
EDTA. Foram coletadas amostras de sangue em tubos sem anticoagulante e centrifugadas por
20 minutos a 2000 g. Após separação do soro, o mesmo era centrifugado novamente por 20
minutos a 2000 g e aliquotado antes de ser armazenado à temperatura de -80°C.
3.3 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS
A resposta à transfusão de plaquetas foi avaliada através da Contagem Corrigida do
Incremento (CCI) de até uma hora após a transfusão de plaquetas. Utilizou-se os resultados das
contagens de plaquetas do paciente e dos CPs utilizados. A superfície corporal do paciente de
acordo com Dubois e Dubois (1916) foi calculada com base em informações do próprio paciente
ou do prontuário do mesmo.
As transfusões com CCI inferior a 5.000 foram consideradas insatisfatórias e os
pacientes com dois ou mais incrementos insatisfatórios foram denominados refratários à
transfusão de plaquetas (SLICHTER et al., 2005).
As características referentes a cada paciente e os dados terapêuticos e clínicos dos
mesmos foram obtidos dos prontuários médicos e arquivados em formulário próprio. As
características relacionadas foram:
1) Dados demográficos - idade, gênero, histórico gestacional, peso e altura;
2) Diagnóstico primário;
3) Presença de condições clínicas como febre, CIVD, esplenomegalia, infecção e
sangramento;
4) Medicações em uso.
21
3.4 PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA PLAQUETAS
As técnicas empregadas na detecção específica foram direcionadas para anticorpos
contra antígenos HLA Classe I e contra antígenos das GPs IIb/IIIa e Ia/IIa. O teste inespecífico
foi o PIFT (Platelet Immunofluorescence Test).
3.4.1 Pesquisa e identificação de anticorpos anti-HLA Classe I
A identificação específica foi realizada através de técnica de fluorimetria de fluxo
utilizando kits para detecção de anticorpos anti-HLA Classe I - Labscreen™ (LS1PRA, One
Lambda, Canoga Park, CA, EUA) seguindo as orientações do fabricante. As amostras de soro
dos pacientes colhidas até o ano de 2009 foram testadas no laboratório HLA da UNICAMP em
agosto de 2009. As amostras eram descongeladas imediatamente antes do ensaio e novamente
centrifugadas a 10000 g por dez minutos para separação de possíveis grumos.
O teste de rastreio LS1PRA utiliza um painel de antígenos HLA Classe I purificados e
agrupados por suspensão em 100 micro pérolas (beads) diferentes (esferas de 2 a 4 µm de
diâmetro) para identificação de anticorpos Imunoglobulina G anti-HLA da Classe I. O teste
fornece reagentes pré-calibrados para a detecção rápida da porcentagem de reatividade contra
o painel de antígenos (PRA – Panel-Reactive-Antibody) no soro humano, por meio do Sistema
de Ensaio Lambda Multi-Analítico de Pérolas (LABMAS – Lambda Array Beads Multi-Analyte
System), o qual caracteriza o analisador de fluxo LABScan 100 para aquisição de dados e
análise.
Em cada suspensão encontram-se beads controle-negativo (não revestidas com
antígenos HLA Classe I) e controle-positivo (revestidas com IgG humano purificado). Além
disso, a cada ensaio, utiliza-se o soro controle negativo para estabelecer o valor de background
para cada bead em uma bateria de testes. Após a incubação do soro teste com as beads
Labscreen, a ligação é identificada pela marcação fluorescente com um anticorpo
Imunoglobulina G (IgG) de cabra anti-humano conjugado com R-ficoeritrina (PE). O soro
positivo para IgG anti-HLA apresenta um desvio no canal fluorescente quando comparado com
o soro negativo. A PRA é representada pela porcentagem de esferas que reagem de forma
positiva ao mesmo soro.
Antes da aquisição dos dados, era feita a escolha da planilha de leitura lote-específica
(Template) respectiva ao catálogo e número do lote do kit utilizado. Essa planilha apresenta
22
dados referentes ao padrão de combinações de antígenos presentes sobre a superfície das beads,
o que permite caracterizar a especificidade do aloanticorpo pesquisado. Após a leitura da placa,
a reatividade dos soros testados era calculada, segundo instruções do fabricante, com base na
mediana do sinal fluorescente de cada bead e normalização para ligações não específicas à bead
controle negativa e correção dos resultados obtidos com base no soro controle negativo.
Além disso, para a validação do teste, deveria haver: contagem de no mínimo 50 beads
de cada especificidade (comumente o valor é maior que 100); valor médio de fluorescência das
beads controle-negativo sempre menor que 1500 e menor ou igual que a metade do valor das
beads controle-positivo e valor médio de fluorescência das beads do controle positivo maior
que 500.
3.4.2 Pesquisa e identificação de anticorpos anti-HPA
A identificação de anticorpos contra antígenos plaquetários humanos (HPA) foi
realizada através da técnica MAIPA (MoAb-specific immobilization of platelet antigens) com
poucas modificações.
Uma suspensão com 20 x 106 plaquetas era incubada com 30 µL do soro a ser testado.
Após lavar com PBS-BSA 2%, a solução era incubada com anticorpos monoclonais anti-GP
IIbIIIa (CD61, clone Y2/51; DakoCytomation®, Carpinteria, CA, EUA) ou GP IaIIa (CD49b
clone Gi9; Immunotech®, Marseille, França). Os imunocomplexos formados (antígeno
plaquetário + anticorpo do soro testado + anticorpo monoclonal) eram solubilizados a partir da
membrana plaquetária por um tampão de solubilização contendo Tris, NaCl 0,9% e Triton-X100. Em seguida, o produto formado era incubado em microplaca pré-sensibilizada com um
anticorpo de cabra contra camundongo (Jackson ImmunoResearch®) para imobilização dos
imunocomplexos. A reação de detecção era realizada por técnica de ELISA convencional
através de IgG anti-humana marcada com enzima peroxidase (GAH-IgG HP* - labelled goat
anti-human IgG horseradish peroxidase - Jackson ImmunoResearch®) seguida da adição do
substrato OPD (o-henylenediamine - DakoCytomation®).
As plaquetas utilizadas no teste foram obtidas de doadores previamente genotipados
para os sistemas HPA-1 e HPA-5. Foram selecionadas plaquetas apresentando HPA-1aa, -1bb
e -1ab para pesquisa de anticorpos anti-GP IIb/IIIa, e, apresentando HPA-5aa, -5bb e -5ab para
pesquisa de anticorpos anti-GP Ia/IIa. A especificidade dos anticorpos era avaliada de acordo
com a tipagem HPA das plaquetas utilizadas.
23
Para complementar a interpretação dos resultados, os pacientes também foram
genotipados para os sistemas HPA-1 e HPA-5.
3.4.2.1 Genotipagem HPA
O DNA genômico foi extraído de células mononucleares das amostras de sangue total
colhidas para contagem de plaquetas. Após centrifugação a 900 x g por 10 minutos em
condições assépticas, 1,5mL de buffy coat era transferido para tubos cônicos Falcon com
capacidade de 15 mL. A extração do DNA era realizada de acordo com as instruções do
fabricante do kit em uso, QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN, CA, EUA).
A genotipagem do sistema HPA-1 foi realizada através da reação em cadeia da
polimerase com primers alelo específicos (polymerase chain reaction with sequence-specific
primers - PCR-SSP). As características dos primers utilizados estão descritas no quadro abaixo:
Especificidade
Sequência
Tamanho
do Referência
produto de PCR
(pb)
HPA-1a
5’ CTTACAGGCCCTGCCTCT 3’
HPA-1b
5’ CTTACAGGCCCTGCCTCC 3’
Bellissimo
HPA-1 AS
5’ TGCTTCAGGTCTCTCCCC 3’
al. 1994)
244
(Skogen,
et
A amplificação das amostras de DNA foi realizada em termociclador Veriti® 96-Well
Thermal Cycler (Applied Biosystems, CA, EUA) e os reagentes foram fornecidos pela
Invitrogen™ Life Technologies (Invitrogen, CA, EUA). Os produtos amplificados foram
visualizados em gel de agarose 2% (Ultra Pure™ Agarose - Invitrogen, CA, EUA) elaborado
com tampão TAE 1X e corado com 0,5 µg/µl de brometo de etídio. Os reagentes e as condições
da PCR estão descritos a seguir:
24
Reagentes
Condição da PCR
Buffer = 3,0 μL
Buffer = 3,0 μL
94º/6´
MgCl2 = 1,2 μL
MgCl2 = 1,2 μL
94º/1´
DNTP =1,0 μL
DNTP =1,0 μL
62º/1´ 35x
HPA1a = 1,0μL
HPA1b = 1,0μL
72º/1´
HPA1AS = 1,0μL
HPA1AS = 1,0μL
72º/7´
HGHs = 0,4μL
HGHs = 0,4μL
HGHas = 0,4μL
HGHas = 0,4μL
Taq = 0,2μL
Taq = 0,2μL
H2O = 20,8μL
H2O = 20,8μL
DNA = 1,0μL
DNA = 1,0μL
Para a confirmação do genótipo HPA-1bb foi realizada a análise de polimorfismo dos
comprimentos dos fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP), segundo Jin e colaboradores (1993). Os primers para a amplificação da região que
contém o polimorfismo foram: sense 5’ TTCTGATTGCTGGACTTCTCTT 3’ e antisense 5’
TCTCTCCCCATGGCAAAGAGT 3’ (Invitrogen™ Life Technologies, CA, EUA), resultando
em um fragmento de 268 pb.
A enzima utilizada para a digestão foi a MspI (New England Biolabs, MA, EUA), com
concentração de 20.000 unidades/mL, sendo que fragmentos de 229 e 39 pares de base obtidos
foram correspondentes ao alelo A e fragmentos de 178, 51 e 39 correspondentes ao alelo B. Os
reagentes e as condições estão descritos a seguir:
HPA-1
Reagentes
Condições
PCR
Buffer = 3,0μL
94º/7´
MgCl2 = 1,0μL
94º/1´
dNTP = 1,0μL
56º/1´ 35x
Primer sense = 1,2μL
72º/1´
Primer antisense = 1,2μL
72º/7´
Taq = 0,5μL
H2O = 21,1μL
DNA = 1,0μL
25
Digestão
Buffer = 2,0μL
37ºC/ overnight
Enzima MspI = 0,8μL
H2O = 4,2μL
Produto de PCR = 8,0μL
O genótipo HPA-5 foi também avaliado por RFLP, segundo Jin e colaboradores (1993).
Os primers para a amplificação da região que contém o polimorfismo foram: sense 5’GTGACCTAAAGAAAGAGG-3’
e
antisense
5’-CTCTCATGGAAAATGGCAG-3’
(Invitrogen™ Life Technologies, CA, EUA), resultando em um fragmento de 276 pb. A enzima
utilizada para a digestão foi a MnlI (New England Biolabs, MA, EUA), com concentração de
5,000 units/ml, sendo que fragmentos de 136, 97 e 33 pares de base obtidos foram
correspondentes ao alelo A e fragmentos de 169 e 97 correspondentes ao alelo B. Os reagentes
e as condições estão descritos a seguir:
HPA-5
Reagentes
Condições
PCR
Buffer = 3,0μL
94º/7´
MgCl2 = 1,0μL
94º/1´
DNTP = 1,0μL
56º/1´ 35x
Primer sense = 1,2μL
72º/1´
Primer antisense = 1,2μL
72º/7´
Taq = 0,5μL
H2O = 21,1μL
DNA = 1,0μL
Digestão
Buffer = 3,0μL
37ºC/ overnight
BSA = 0,5μL
Enzima MnlI = 0,3μL
H2O = 3,2μL
Produto de PCR= 8,0 μL
3.4.3 Teste de Imunofluorescência Plaquetária (PIFT)
Para a pesquisa inespecífica de anticorpo ligado à plaqueta preparou-se a cada bateria
de testes um pool de plaquetas de dois doadores masculinos do grupo sanguíneo O e Rh
negativos. A separação do plasma rico em plaquetas foi feita por centrifugação a 600 g por 20
26
minutos. Após serem transferidas para outro tubo, as plaquetas foram lavadas por ressuspensão
em PBS/EDTA 0,1% (±2 mL), centrifugação a 2000 g por dez minutos e retirada do
sobrenadante. Após a terceira lavagem, foram ressuspensas em 1,5 mL de PBS/EDTA 0,1%.
Após contagem automática, a concentração de plaquetas foi ajustada para aproximadamente
100.000 plaquetas/µL.
Para cada teste, pipetou-se 50 µL do pool de plaquetas em tubo de citometria e
adicionou-se 50 µL do soro a ser testado. Além dos testes, a cada bateria de exames foram
concomitantemente testadas amostras de soros controles negativo e positivo (alíquotas
previamente identificadas). As preparações foram então incubadas por 30 minutos a 37°C.
Decorrido esse tempo, foram lavadas por três vezes consecutivas com PBS/EDTA 0,1% (±2
mL) seguindo-se a ressuspensão e centrifugação a 2000 g por cinco minutos.
Na última lavagem, o sobrenadante foi retirado e o pellet homogeneizado. Em seguida,
foram pipetados 60 µL do Anticorpo Policlonal de Coelho fração F(ab')2 Anti-Imunoglobulina
G Humana - Cadeia Gama conjugado à Fluoresceína Isotiocianato (FITC) (INVITROGEN,
Carlsbad, CA, EUA), previamente diluído em água autoclavada (1:50). Após incubação à
temperatura ambiente por 45 minutos ao abrigo de luz, seguiu-se novamente a lavagem com
PBS-EDTA 0,1% (± 2 mL), ressuspensão e centrifugação a 2000 g por cinco minutos. Após
retirar o sobrenadante, a amostra foi ressuspendida em 500 µL de PBS-EDTA 0,1%.
A leitura das plaquetas sensibilizadas foi realizada em citômetro de fluxo, aparelho
FASCalibur® (Becton Dickinson), periodicamente checado com o kit Calibrite™ beads
(Becton Dickinson). Com o auxílio do Software CellQuest® (Becton Dickinson) para aquisição
e análise, realizou-se a quantificação de partículas analisadas, estabilização do raio laser,
padronização da região dos histogramas onde as plaquetas estariam representadas graficamente,
estabilização das fluorescências e determinação do gating (demarcação dos eventos a serem
estudados).
27
R1
Figura 1. Marcação da população plaquetária analisada
Os histogramas das análises foram obtidos da seguinte forma:
Histograma 1: Foward Scatter (FS - ordenada) x Log Side Scatter (LSS - abscissa)
Histograma 2: Logaritmo da Fluorescência 1 (LFL1) – (abscissa)
A demarcação no histograma 1 (FS x LSS) da população plaquetária a ser analisada
permite excluir da análise possíveis eventos de autofluorescência de partículas, “debris”
celulares, interferências do aparelho (ruídos) e aglutinados plaquetários. A fluorescência
inespecífica foi eliminada através da análise prévia de um soro controle negativo. Foram
contados 10.000 eventos por teste.
Para a padronização do teste com o anticorpo utilizado e determinação dos intervalos de
corte para resultados negativos, inconclusivos e positivos, eram testados soros de 24 doadores
de sangue, todos masculinos e sem história de exposição prévia a transfusões ou transplantes.
Após verificação da homogeneidade e normalidade dos resultados, a média de fluorescência e
desvio padrão eram calculados. Valores inferiores ao R1 (média + 1DP/média) foram
considerados como resultados negativos; valores entre R1 e R2 (média + 2 DP/média),
inconclusivos, e, valores superiores ao R2, positivos.
A Figura 2 apresenta a Fluorescência de um paciente com resultado negativo cuja
mediana de fluorescência (4.91) esteve abaixo do valor de R1 (1,16).
28
M1
Figura 2. Marcação de plaquetas com IgG FITC.
Exemplo de resultado negativo (mediana <R1).
A Figura 3 apresenta o resultado de Fluorescência de uma amostra de paciente positiva
cuja mediana de fluorescência (33,98) esteve acima do valor de R2 (1,33).
M1
Figura 3. Marcação de plaquetas com IgG FITC.
Exemplo de resultado positivo (mediana >R2)
3.5 ANÁLISES DE CITOCINAS
Os níveis de citocinas nas amostras de soro foram quantificados utilizando o kit
Cytometric Bead Array Kits (BD Biosciences). As citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17,
29
IFN-γ (interferon-γ) e TNF (tumor necrosis factor) foram dosadas de acordo com as orientações
do fabricante.
3.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Para análise estatística utilizou-se o programa GraphPad InStat (GraphPad, San Diego,
CA, USA). Todas as variáveis foram submetidas ao teste de Kolmogorov-Smirnov para avaliar
se os valores apresentavam distribuição normal e ao teste Levene para testar a homogeneidade
das variâncias. Para variáveis categóricas, aplicou-se o Teste do Qui-quadrado e, para variáveis
numéricas, o teste de Mann–Whitney. O nível de significância para rejeição da hipótese nula
(H0) foi de 5% (p<0,05).
30
4 RESULTADOS
Participaram do estudo 56 pacientes, avaliados pelo CCI de 1h em 132 episódios
transfusionais de concentrados de plaquetas. A pesquisa de anticorpos anti-plaquetas pela
técnica PIFT foi realizada para 54 pacientes em 127 amostras de soro disponíveis e 53 deles
(126 amostras) foram testados para anticorpos anti-HLA Classe I e anti GP IIb/IIIa e GP IaIIa.
Como o critério para dosagem de citocinas era que a amostra tivesse sido colhida no intervalo
de até uma hora antes da transfusão, apenas 100 soros puderam ser avaliados e uma dessas
amostras foi a que não pode ser testada pelos testes sorológicos específicos.
4.1 CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES
A idade dos pacientes variou de 19 a 85 anos com mediana de 51 anos. Quando
segregados, 19 (33,9%) apresentavam idade inferior a 40 anos e 37 (66,1%) idade superior ou
igual a 40. Quanto ao gênero, 22 eram femininos (39,3%) e 34 masculinos (60,7%). A maioria
das mulheres tinham histórico gestacional (86,4%, n=19).
Os pacientes com diagnóstico de câncer mieloproliferativo foram 34, sendo 29 (51,8%)
com diagnóstico de Leucemia Mielóde Aguda e cinco com Mielodisplasia (8,9%); aqueles com
cânceres linfoproliferativos foram 22, sendo 15 (26,8%) com Linfomas e sete (12,5%) com
Leucemias Linfocíticas (quatro agudas e três crônicas).
Com relação à caracterização do paciente como refratário ou não, apenas dez pacientes
(17,8%) tiveram refratariedade confirmada, 29 (51,8%) eram não refratários e 17 (30,4%)
apresentaram um incremento insatisfatório, contudo, uma segunda avaliação não pode ser
realizada por razões logísticas. A Tabela 1 apresenta de forma resumida as características dos
pacientes incluídos no estudo.
31
Tabela 1. Características dos pacientes do estudo.
Características
n (%)
56 (100%)
Pacientes
Idade (anos)
<40
≥40
19 (33.9)
37 (66.1)
Gênero
Feminino
Masculino
22 (39.3)
34 (60.7)
Histórico gestacional
Diagnóstico
Refratariedade
19 (33.9)
Mieloproliferativo
Leucemia Mielóide
Mielodisplasia
Linfoproliferativo
Leucemia Linfocítica
Linfoma
Sim
Não
Não avaliada
29 (51.8)
5 (8.9)
7 (12.5)
15 (26.8)
10 (17.8)
29 (51.8)
17 (30.4)
4.2 CARACTERÍSTICAS DAS TRANSFUSÕES DE PLAQUETAS AVALIADAS
O valor do CCI de 1h apresentou resultado insatisfatório em 55 episódios transfusionais
(41,7%). As características dos CPs e dos pacientes, conhecidas como capazes de interferir no
incremento plaquetário, foram avaliadas em relação ao CCI.
4.2.1 Frequências de incremento insatisfatório em relação às características dos
concentrados de plaquetas transfundidos
Em 59 episódios (44,7%) foram utilizados CPs obtidos por aférese de doador único e
em 73 (55,3%), CPs obtidos de bolsas de sangue total pelo método PRP, utilizando em média
seis unidades por episódio transfusional. A frequência de CCI insatisfatório foi
significativamente maior entre pacientes que receberam CPs de PRP (57,5%) do que entre
aqueles recebendo CPs de aférese (22%) (p<0,0001).
32
Todos os CPs de aférese foram filtrados durante a coleta e 46 (63%) dos CPs de PRP
foram filtrados na beira do leito. Quando comparadas as frequências de CCI insatisfatório entre
CPs filtrados, a frequência de CCI insatisfatório continuou significativamente maior entre
pacientes recebendo PRP (50% versus 22%, respectivamente; p=0,0053). Ao avaliar somente
pacientes que receberam CPs obtidos por PRP, os que receberam CPs não filtrados
apresentaram CCI insatisfatório mais frequentemente (70,4% versus 50,0%), porém a diferença
não foi significativa (p=0,1458).
Quanto à compatibilidade ABO entre doadores e receptores, apenas em 15 episódios os
pacientes receberam plaquetas incompatíveis (11,4%) e em 12 destes (80,0%) os CPs utilizados
eram de aférese. A frequência de CCI insatisfatório foi menor entre pacientes recebendo
plaquetas incompatíveis (26,7% versus 43,6%) e não houve diferença significativa (p=0,3303).
Os resultados das análises para cada característica dos concentrados de plaquetas encontram-se
descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Análises das características dos concentrados de plaquetas em relação à resposta pós
transfusional.
Características
n
Incremento pós transfusional
Insatisfatório
Satisfatório
RR*
p
n (%)
n (%)
42 (57,5)
31 (42,5)
2,6 < 0,0001
13 (22,0)
46 (78,0)
Tipo de CP
PRP
AF
73
59
Leucorreduzidos
PRP
AF
46
59
23 (50,0)
13 (22,0)
23 (50,0)
46 (78,0)
2,3
0,0053
Leucorredução de PRP
Não
Sim
27
46
19 (70,4)
23 (50,0)
8 (29,6)
23 (50,0)
1,4
0,1458
Não 15
4 (26,7)
11 (73,3)
0,6
0,3303
Sim 117
51 (43,6)
66 (56,4)
*Relação entre resultados insatisfatórios com correções de Katz (teste Qui-quadrado) CP=
concentrado de plaquetas; RR= risco relativo; PRP= plasma rico em plaquetas; AF= aférese.
Compatibilidade ABO
33
4.2.2 Frequências de incremento insatisfatório em relação às características dos pacientes
As características demográficas e condições clínicas referidas no momento da
transfusão foram consideradas nas análises de frequência de incremento insatisfatório. Os
resultados dessas análises estão descritos a seguir e na Tabela 3.
4.2.2.1 Características demográficas
Nos pacientes com idade superior ou igual a 40 anos, a frequência de CCI insatisfatório
foi maior (50,6%) do que naqueles com idade inferior (24,4%) e essa diferença foi significativa
(p= 0,0069). Ao considerar o gênero, mulheres apresentaram maior frequência de CCI
insatisfatório (51,5%) do que homens (31,3%) com diferença significativa (p=0,0294). Entre
as mulheres, a frequência de resultado insatisfatório foi significativamente maior entre aquelas
com histórico gestacional (56,7% versus 12,5%; p=0,0487).
4.2.2.2 Características Clínicas
A análise dos episódios transfusionais quanto ao diagnóstico mostrou que doenças
mieloproliferativas estiveram associadas à maior frequência de incremento insatisfatório
(50,0%) quando comparadas a doenças linfoproliferativas (26,1%) com diferença significativa
(p=0,0135).
Em relação à presença de sangramento no momento da transfusão (n=32; 24,2%),
pacientes com sangramento tiveram CCI insatisfatório em 53,1% dos casos, enquanto aqueles
sem sangramento tiveram resposta insatisfatória em 38,0%. A diferença entre os dois grupos
não foi significativa (p=0,1920). Apenas em cinco episódios os pacientes apresentavam
esplenomegalia (3,8%) e não houve diferença significativa entre episódios com e sem
esplenomegalia quanto a presença de CCI insatisfatório (40,0% versus 41,7%, respectivamente;
p=0,9386).
A presença de infecção e/ou febre (n=28; 21,2%) foi um fator significativo para maior
frequência de CCI insatisfatório (p=0,0118), sendo a frequência entre indivíduos sem infecção
e/ou febre de 35,6%, e com infecção e/ou febre de 64,3%. As principais medicações em uso
foram vancomicina (43 pacientes) e anfotericina B (15 pacientes).
34
Tabela 3. Análises das características dos pacientes em relação à resposta pós transfusional.
Características
n
Incremento pós transfusional
Insatisfatório
Satisfatório
n (%)
n (%)
RR*
p
Demográficas
Idade
Gênero
Histórico Gestacional
≥40 anos
87
44 (50,6)
43 (49,4)
<40 anos
45
11 (24,4)
34 (75,6)
Feminino
68
35 (51,5)
33 (48,5)
Masculino
64
20 (31,3)
44 (68,7)
Sim
60
34 (56,7)
26 (43,3)
Não
8
1 (12,5)
7 (87,5)
Mieloproliferativo
86
43 (50,0)
43 (50,0)
Linfoproliferativo
46
12 (26,1)
34 (73,9)
Sim
32
17 (53,1)
15 (46,9)
Não
100
38 (38,0)
62 (62,0)
Sim
5
2 (40,0)
3 (60,0)
Não
127
53 (41,7)
74 (58,3)
Sim
28
18 (64,3)
10 (35,7)
Não
104
37 (35,6)
67 (64,4)
2,1
0,0069
1,7
0,0294
4,5
0,0487
1,9
0,0135
1,4
0,1920
1,0
0,9386
1,8
0,0118
Clínicas
Diagnóstico
Sangramento
Esplenomegalia
Febre e/ou Infecção
*Relação entre resultados insatisfatórios com correções de Katz (teste Qui-quadrado). RR=
risco relativo;
4.2.3 Frequências de incremento insatisfatório em relação à presença de aloanticorpos
plaquetários
A identificação específica de anticorpos anti-HLA Classe I foi positiva em soros de 24
pacientes (45,3%) e negativa em 29 (54,7%). Quatro pacientes (7,5%) apresentaram resultado
positivo para anticorpos anti-GP IIb/IIIa, sendo todos concomitantemente positivos para antiHLA Classe I. Destes, um paciente apresentou especificidade para HPA-1a e um para HPA-1b.
Em dois pacientes não foi possível determinar especificidade HPA. Nenhum paciente
apresentou positividade anti-GP Ia/IIa.
35
4.2.3.1 Distribuição quanto ao CCI e à porcentagem de PRA-HLA I
Com relação à positividade para aloanticorpos anti-HLA Classe I, observou-se que
todos os episódios transfusionais em que os indivíduos tinham PRA ≥60% apresentavam CCI
insatisfatório (Figura 4).
Figura 4. Distribuição dos resultados da Contagem Corrigida do Incremento (CCI) em
relação à porcentagem de reatividade contra o painel de antígenos (PRA) HLA Classe I.
36
4.2.3.2 Frequências de incremento insatisfatório em relação ao PRA-HLA I
A frequência de CCI insatisfatório foi significativamente maior nas transfusões cujos
soros apresentavam positividade para os aloanticorpos investigados (51,5%) quando comparada
àqueles com resultados negativos (28,3%) (p=0,0137, Tabela 4).
Ao considerar a porcentagem de PRA, os episódios foram divididos em três grupos:
PRA negativos (n=60; 47,6%); PRA <60% (n=47; 37,3%) e PRA ≥60% (n=19; 15,1%). A
frequência de CCI insatisfatório foi significativamente diferente entre os grupos (p<0,0001)
com valores respectivos de 28,3%; 31,9% e 100%. Quando avaliados aos pares, não houve
diferença significativa entre o grupo com PRA negativo e o grupo com PRA <60% (p=0,8502).
Então, esses dois foram agrupados e a diferença entre o novo grupo (n=107, 84,9%) e o grupo
PRA ≥60% foi também significativa (100% versus 29,9%, respectivamente; p<0,0001). Todas
as comparações quanto aos resultados do PRA-HLA I em relação à resposta transfusional estão
demonstradas na Tabela 4.
Tabela 4. Comparações entre os resultados do PRA-HLA I e do incremento pós transfusional
de acordo com presença ou não de aloanticorpos e porcentagem de PRA.
PRA- HLA I
Incremento pós transfusional
Insatisfatório n (%) Satisfatório n (%)
34 (51,5)
32 (48,5)
17 (28,3)
43 (71,7)
Positivo
Negativo
n
66
60
p
Positivo ≥60%
Positivo <60%
Negativo
19
47
60
19 (100,0)
15 (31,9)
17 (28,3)
0 (0,0)
32 (68,1)
43 (71,7)
<0,0001
Positivo <60%
Negativo
47
60
15 (31,9)
17 (28,3)
32 (68,1)
43 (71,7)
0,8502
0,0137
Positivo ≥60%
19
19 (100,0)
0 (0,0)
< 0,0001
Negativo e positivo <60% 107
32 (29,9)
75 (70,1)
PRA=Reatividade contra Painel de Antígenos; HLA I=Antígenos Leucocitários Humanos de
Classe I. Teste Qui-quadrado.
37
4.3 EFETIVIDADE DO PIFT
Os resultados do PIFT foram positivos para 30 pacientes (53,6%), negativos para 17
(30,4%) e inconclusivos para sete (12,5%). Dentre os 127 episódios transfusionais cujas
amostras de soro foram analisadas, 55 (43,3%) foram PIFT positivos; 55 (43,3%), negativos e
17 (13,4%) inconclusivos. Os resultados quanto à efetividade do PIFT em relação ao PRA-HLA
I, porcentagem de PRA-HLA I e CCI estão descritos a seguir e demonstrados na Tabela 5.
4.3.1 Efetividade do PIFT em relação ao PRA-HLA I
A comparação dos resultados do PIFT aos resultados do teste de identificação específica
de anticorpo anti-HLA Classe I demonstrou concordância em 32 testes positivos (25,4%) e em
30 (23,8%) testes negativos. Houve discordância em 22 testes (17,5%) PIFT positivo/HLA I
negativo e em 25 testes (19,8%) PIFT negativo/HLA I positivo. Os resultados do PIFT foram
inconclusivos em nove testes (7,1%) HLA I positivos e em oito testes (6,4%) HLA I negativos.
As frequências não foram significativamente diferentes (p=0,1810), sendo a sensibilidade e a
especificidade do PIFT (teste Qui-quadrado) em relação ao teste de detecção de anticorpo antiHLA I de 56,1% e 57,7%, respectivamente. Os valores preditivos positivo e negativo foram
59,3% e 54,6%, respectivamente, com razão de chance de 1,3 (Tabela 5).
4.3.2 Efetividade do PIFT em relação à porcentagem de PRA-HLA I
Quando o PIFT foi avaliado em relação à porcentagem de PRA do teste anti-HLA I, os
resultados foram significativamente diferentes considerando-se as associações com PRA <60%
e PRA ≥60% (p<0,0001). O PIFT foi positivo em 17 amostras (13,4%) com PRA ≥60% e em
37 amostras (29,4%) com PRA<60%. Já as amostras com PIFT negativo, foram todas
PRA<60% (n=55; 43,7%). Os resultados foram inconclusivos em duas amostras (1,6%) PRA
≥60% e em 15 (11,9%) PRA<60%. A sensibilidade e especificidade do PIFT na detecção de
resultados PRA ≥60% e PRA <60% foram 100,0% e 59,8%, respectivamente. Os valores
preditivos positivo e negativo foram de 31,5% e 100,0%, respectivamente com razão de chance
de 2,5.
38
4.3.3 Efetividade do PIFT em relação ao tipo de resposta após a transfusão
Em relação ao CCI, os resultados do PIFT eram positivos em 32 (25,2%) episódios cujos
incrementos foram insatisfatórios e em 23 (18,1%) dos episódios com incrementos satisfatórios.
Os resultados do PIFT foram negativos em 12 (9,4%) episódios de CCI insatisfatório e em 43
(33,9%) de CCI satisfatório. Os resultados inconclusivos em soros de episódios insatisfatórios
foram sete (5,5%) e de episódios satisfatórios foram 10 (7,9%). Ao considerar somente
resultados positivos e negativos, observou-se que a maior frequência de CCI insatisfatório entre
pacientes com PIFT positivo foi significativamente diferente da frequência entre pacientes com
PIFT negativo no momento da transfusão (p=0,0002). O PIFT apresentou sensibilidade e
especificidade para CCI insatisfatório de 72,7% e 65,2%, respectivamente. O valor preditivo
positivo foi de 58,2% e o valor preditivo negativo foi de 78,2% com razão de chance de 2,1.
Tabela 5. Comparação entre os resultados do PIFT e os resultados PRA-HLA I, porcentagem
de PRA-HLA I e CCI.
PIFT
Anticorpo
anti-HLA I
Negativo
≥60%
<60%
32 (25,4) 22 (17,5)
17
(13,4)
37
(29,4)
55
(43,7)
15
(11,9)
Positivo
Positivo n (%)
PRA
Negativo n (%)
25
(19,8)
30 (23,8)
0 (0,0)
Inconclusivo n
(%)
9 (7,1)
8 (6,4)
2 (1,6)
CCI
Insatisfatório Satisfatório
32 (25,2)
23 (18,1)
12 (9,4)
43 (33,9)
7 (5,5)
10 (7,9)
p*
0,1810
< 0,0001
0,0002
Sensibilidade*
56,1%
100,0
72,7%
Especificidade*
57,7%
59,8
65,2%
59,3% / 54,6%
31,5 / 100,0
58,2% / 78,2%
1,3
2,5
2,1
VPP/ VPN*
Razão de chance*
*As análises consideraram somente resultados PIFT positivos e negativos (teste Qui-quadrado).
PIFT=Teste de Imunofluorescência Plaquetária; HLA I= Antígenos Leucocitários Humanos
Classe I; PRA= Reatividade contra Painel de Antígenos; CCI= Contagem Corrigida do
Incremento; VPP=Valor Preditivo Positivo; VPN=Valor Preditivo Negativo.
39
4.4 RESULTADOS DO PIFT EM RELAÇÃO AO INCREMENTO E CARACTERÍSTICAS
DOS EPISÓDIOS TRANSFUSIONAIS
Os resultados do PIFT foram verificados em relação à resposta transfusional de acordo
com as características dos CPs e dos pacientes para cada transfusão de plaquetas avaliada.
4.4.1 PIFT e resposta transfusional de acordo com as características dos concentrados de
plaquetas
Dentre as 58 transfusões de plaquetas cujo o tipo de CP utilizado foi PRP, a frequência
de incremento insatisfatório foi significativamente maior (p=0,0015) entre pacientes que
apresentavam resultado de PIFT positivo (79,3%, n=23) do que entre aqueles com PIFT
negativo (34,5%, n=10). Assim, nos episódios em que CPs de PRP foram utilizados, pacientes
com PIFT positivo tinham um risco relativo de apresentar incremento insatisfatório 2,3 vezes
maior do que pacientes PIFT negativo (Figura 5).
Para os episódios em que foram transfundidos CPs de aférese, a frequência de
incremento insatisfatório entre pacientes PIFT positivo (34,6%, n=9) também foi
significativamente maior (p=0,0416) comparada à frequência entre pacientes PIFT negativo
(7,7%, n=2). O risco relativo de um paciente com PIFT positivo apresentar incremento
insatisfatório foi 4,5 vezes maior em relação aos pacientes PIFT negativos nas transfusões de
CPs de aférese (Figura 5).
Quando as análises foram realizadas somente para pacientes com PIFT positivo, a
frequência de incremento insatisfatório foi significativamente maior (p=0,0021) entre as
transfusões utilizando PRP (79,3%) do que entre as transfusões utilizando aférese (34,6%). O
risco relativo de pacientes com PIFT positivo apresentarem incremento insatisfatório era 2,3
vezes maior para aqueles que recebiam transfusões de PRP (Figura 5).
Nos episódios transfusionais em que os pacientes apresentavam PIFT negativo, a
frequência de incremento insatisfatório também foi significativamente maior (p=0,0380) entre
as transfusões em que o tipo de CP utilizado era PRP (34,5%) do que entre aquelas que o tipo
utilizado era aférese (7,7%). Dessa forma, pacientes PIFT negativo que recebiam transfusões
de CPs de PRP apresentavam risco relativo de ter incremento insatisfatório 4,5 vezes maior do
que aqueles que recebiam transfusões de CPs de aférese (Figura 5).
40
Figura 5. Análise das frequências de incremento insatisfatório e satisfatório de acordo com os
resultados do PIFT e tipo de concentrado de plaquetas transfundido.
PRP/PIFT positivo versus negativo, p=0,0015; AF/PIFT positivo versus negativo, p=0,0416; PIFT
positivo, PRP versus AF, p=0,0021; PIFT negativo, PRP versus AF, p=0,0380. PIFT=Teste de
Imunofluorescência Plaquetária; CCI= Contagem Corrigida do Incremento PRP= plasma rico em
plaquetas; AF= aférese. Teste Qui-quadrado.
Ao considerar uso de CPs de PRP filtrados ou não, os pacientes que recebiam CPs
filtrados e tinham PIFT positivo apresentavam incremento insatisfatório mais frequentemente
que indivíduos com PIFT negativo (87,5% (n=14) versus 19,0% (n=4)). Essa diferença foi
significativa (p=0,0001) e com risco relativo 4,6 vezes maior para pacientes PIFT positivo
(Figura 6).
Quando o CP de PRP não era filtrado antes da transfusão, a frequência de incremento
insatisfatório entre os pacientes com PIFT positivo foi de 69,2% (n=9) e entre os pacientes com
PIFT negativo foi de 75% (n=6). A diferença não foi estatisticamente significativa (p=0,7763;
após correção de Yates, p=0,0807) (Figura 6).
41
Figura 6. Análise das frequências de incremento insatisfatório e satisfatório de acordo com os
resultados do PIFT e filtração dos concentrados de plaquetas de PRP.
Filtrado/PIFT positivo versus negativo, p=0,0001; Não filtrado/PIFT positivo versus negativo,
p=9,9999. PIFT=Teste de Imunofluorescência Plaquetária; CCI= Contagem Corrigida do Incremento;
PRP=Plasma Rico em Plaquetas. Teste Qui-quadrado.
4.4.2 PIFT e resposta transfusional em relação às características dos pacientes
As variáveis significativamente relacionadas ao CCI insatisfatório foram verificadas em
relação ao PIFT e estão apresentados na Tabela 6.
A frequência de incremento insatisfatório nos episódios em que os pacientes tinham
idade igual ou superior a quarenta anos foi significativamente mais elevada (p=0,0006) entre
os que apresentavam PIFT positivo (69,2%) do que entre aqueles que tinham PIFT negativo
(26,5%). Nos episódios em que os pacientes apresentavam idade inferior a 40 anos, a frequência
de incremento insatisfatório foi 31,3% entre os PIFT positivos e 14,3% entre os PIFT negativos
sem diferença significativa (p=0,4016). Ao comparar episódios com PIFT positivo entre si, a
maior frequência de incremento insatisfatório entre aqueles com pacientes de idade ≥40 anos
foi significativamente diferente da frequência entre aqueles cuja idade era <40 anos (p=0,0219).
Quando avaliada a resposta transfusional entre pacientes femininos, o incremento
insatisfatório foi significativamente mais frequente (p=0,0034) entre aquelas com PIFT
42
positivo (71%) do que entre as que tinham PIFT negativo (28,0%). Nas transfusões de pacientes
masculinos, a frequência de CCI insatisfatório foi de 41,7% entre os que apresentavam PIFT
positivo e de 16,7% entre aqueles com PIFT negativo, mas a diferença não foi significativa
(p=0,0832). A diferença entre as transfusões de pacientes femininos e masculinos na presença
de PIFT positivo também não foi estatisticamente significativa (p=0,0562).
Ao considerar somente mulheres com histórico gestacional, a frequência de episódios
com incremento insatisfatório foi maior quando o PIFT era positivo (77,8%) do que quando era
negativo (31,8%) (p=0,0032).
Os episódios em que os pacientes tinham diagnóstico de doença mieloproliferativa e
PIFT positivo apresentaram incremento insatisfatório mais frequentemente que episódios em
que os pacientes com o mesmo diagnóstico tinham PIFT negativo (71,9% versus 28,2%). Essa
diferença foi significativa (p=0,0006). Quando avaliadas as transfusões de pacientes com
doenças linfoproliferativas, aquelas em que o paciente tinha PIFT positivo também
apresentavam maior frequência de incremento insatisfatório do que as que o paciente tinha PIFT
negativo (39,1% versus 6,2%), contudo a diferença não foi significativa (p=0,0523).
Considerando todos os episódios em que os pacientes eram PIFT positivo, a diferença na
frequência de incremento insatisfatório entre doenças mieloproliferativas e linfoproliferativas
foi significativa (7,9% versus 39,1%; p=0,0315).
Na avaliação das transfusões a pacientes com febre e/ou infecção, a frequência de
incremento insatisfatório foi de 86,7% entre os episódios com PIFT positivo e de 42,9% entre
episódios com PIFT negativo, mas essa diferença não chegou a ser significativa (p=0,1020).
Nos episódios em que não houve relato de febre e/ou infecção, resultados PIFT positivos
estiveram associados à maior frequência de incremento insatisfatório (47,5%) do que resultados
PIFT negativo (18,8%) com diferença significativa (p=0,0080). Ao comparar somente
episódios com PIFT positivo, aqueles em que os indivíduos apresentavam febre e/ou infecção
cursavam com incremento insatisfatório mais frequentemente (86,7%) que aqueles sem febre
e/ou infecção (47,5%) (p=0,0206).
Ao considerar concomitância ou não de resultados positivos para PIFT e teste de
detecção de anticorpo anti-HLA I específico, nos casos em que o anti-HLA I era positivo, a
presença de PIFT positivo esteve significativamente associada a maior frequência de
incremento insatisfatório (78,1%) quando comparado aos casos anti-HLA I positivos com PIFT
negativo (20,0%) (p<0,0001). Nos episódios com anti-HLA I negativo, não houve diferença
43
significativa na frequência de incremento insatisfatório entre os casos PIFT positivo e PIFT
negativo (31,8% versus 23,3%; p=0,7150).
Tabela 6. Análises das frequências de incremento insatisfatório de acordo com as
características dos pacientes e concentrados de plaquetas em relação aos resultados do PIFT.
Características
n
PIFT Positivo
CCI
CCI
Insatisfatório Satisfatório
n (%)
n (%)
n
PIFT Negativo
CCI
CCI
Insatisfatório Satisfatório
n (%)
n (%)
RR*
p
Idade
≥40 anos
39
27 (69,2)
12 (30,8)
34
9 (26,5)
25 (73,5)
2,6
0,0006
<40 anos
16
5 (31,3)
11 (68,7)
21
3 (14,3)
18 (85,7)
2,1
0,4016
Feminino
31
22 (71,0)
9 (29,0)
25
7 (28,0)
18 (72,0)
2,5
0,0034
Masculino
24
10 (41,7)
14 (58,3)
30
5 (16,7)
25 (83,3)
2,5
0,0832
Gênero
Gestação
Sim
27
21 (77,8)
6 (22,2)
22
7 (31,8)
15 (68,2)
2,4
0,0032
Não
4
1 (25,0)
3 (75,0)
3
0 (0,0)
3 (100,0)
---
0,3496
Diagnóstico
Mieloproliferativo
32
23 (71,9)
9 (28,1)
39
11 (28,2)
28 (71,8)
2,5
0,0006
Linfoproliferativo
23
9 (39,1)
14 (60,9)
16
1 (6,2)
15 (93,8)
6,2
0,0523
Sim
15
13 (86,7)
2 (13,3)
7
3 (42,9)
4 (57,1)
2,0
0,1020
Não
40
19 (47,5)
21 (52,5)
48
9 (18,8)
39 (81,2)
2,5
0,0080
Positivo
32
25 (78,1)
7 (21,9)
25
5 (20,0)
20 (80,0)
3,9
<0,0001
Negativo
22
7 (31,8)
15 (68,2)
30
7 (23,3)
23 (76,7)
1,4
0,7150
Febre e/ou infecção
Aloimunização
PIFT=Teste de Imunofluorescência Plaquetária; CCI= Contagem Corrigida do Incremento;
RR= Risco Relativo; PRP=Plasma Rico em Plaquetas; AF= aférese. Teste Qui-quadrado.
4.5 PERFIL DAS CITOCINAS SÉRICAS ANTES DA TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS E
RELAÇÃO COM O INCREMENTO PÓS TRANSFUSIONAL
Ao avaliar os níveis de citocinas séricas nas 100 amostras de soro colhidas antes da
transfusão, 35 correspondiam a episódios com incremento pós transfusional insatisfatório e 65
a episódios com incremento satisfatório. As medianas dos valores de citocinas em cada situação
foram significativamente diferentes somente na análise dos níveis de IL-6 (p=0,0119) com
valores de 23,8 pg/mL (variando de 0,0 a 15.713,0 pg/mL) antes das transfusões com
44
incremento insatisfatório e de 7,0 pg/mL (variando de 0,0 a 9.473,6 pg/mL) entre transfusões
com incremento satisfatório.
Os episódios que cursaram com incremento insatisfatório também apresentaram valores
superiores de IL-10 (3,8 pg/mL; variando de 0,0 a 3640,8 pg/mL) e IFN-γ (2,4 pg/mL; variando
de 0,0 a 16,9 pg/mL) quando comparados aos níveis nos episódios com incremento satisfatório
(IL-10 de 2,9 pg/mL variando de 0,0 a 1249,0 pg/mL; IFN-γ 2,0 pg/mL variando de 0,0 a 19,9
pg/mL), contudo, as diferenças não foram significativas (p=0,0779 e p=0,0623,
respectivamente).
Os valores de IL-4 antes da transfusão foram de 1,2 pg/mL (variando de 0,0 a 3,1 pg/mL)
em episódios com incremento insatisfatório e de 1,4 pg/mL (variando de 0,0 a 3,5 pg/mL) nos
episódios com incremento satisfatório (p=0,6793). Os níveis de TNF antes da transfusão foram
de 1,4 pg/mL (variando de 0,0 a 2,6 pg/mL) nos episódios insatisfatórios e de 1,4 pg/mL
(variando de 0,0 a 2,8 pg/mL) nos episódios satisfatórios (p=0,9740).
Os níveis de IL-2 e IL-17 foram indetectáveis na maioria dos episódios com valores de
mediana de 0,0 pg/mL em episódios insatisfatórios e satisfatórios de ambas citocinas. Os níveis
de IL-2 nos episódios insatisfatórios variaram de 0,0 a 3,0 pg/mL e nos satisfatórios de 0,0 a
4,6 pg/mL (p=0,9016). Os níveis de IL-17 variaram de 0,0 a 160,1 pg/mL entre episódios
insatisfatórios e de 0,0 a 81,6 pg/mL nos episódios satisfatórios (p=0,6265).
Os resultados das análises descritas, com exceção das análises de IL-2 e IL-17, estão
demonstrados na Figura 7.
45
Figura 7. Comparação entre os níveis de citocinas antes da transfusão de plaquetas de acordo
com o incremento pós transfusional.
CCI= Contagem Corrigida do Incremento. Teste de Mann-Whitney; * p=0,0119.
4.5.1 Níveis de IL-6 antes da transfusão de plaquetas de acordo com características dos
CPs e relação com incremento pós transfusional
Os episódios em que CPs de PRP foram transfundidos e que cursaram com incremento
insatisfatório apresentaram níveis de IL-6 mais elevados do que os que cursaram com
incremento satisfatório (p=0,0133). A mediana dos níveis de IL-6 entre episódios
insatisfatórios foi de 29,9 pg/mL (variando de 2,4 a 15.713,0) e entre satisfatórios de 5,0 pg/mL
(variando de 0,0 a 3.658,4 pg/mL) (Tabela 7).
46
Ao analisar os episódios em que CPs de aférese foram transfundidos, observou-se que
episódios com incremento insatisfatório apresentaram mediana de 7,7 pg/mL (variando de 0,0
a 4.481,3 pg/mL) e episódios com incremento satisfatório, mediana de 9,6 pg/mL (variando de
0,0 a 9.473,6 pg/mL). Não houve diferença significativa entre os níveis observados nas duas
situações (p=0,5858) (Tabela 7).
Quando considerados somente os episódios transfundidos com CPs de PRP filtrados em
beira de leito, os níveis de IL-6 foram maiores entre aqueles com incremento insatisfatório
(mediana 19,94 pg/mL; variando de 2,8 a 15.713,0 pg/mL) quando comparados aos níveis nos
episódios satisfatórios (mediana 5,4 pg/mL; variando de 0,0 a 3.658,4 pg/mL), apesar de não
haver diferença significativa (p=0,1188) (Tabela 7).
Tabela 7. Análise dos níveis de IL-6 (pg/mL) antes da transfusão em relação ao incremento
pós transfusional de acordo com as características dos concentrados de plaquetas.
Características
n
Incremento pós transfusional
Insatisfatório
Satisfatório
Mediana de IL-6
Mediana de IL-6
n
(mín-máx)
(mín-máx)
p
Concentrado de Plaquetas
PRP
26 29,9 (2,4- 15.713,0) 28
AF
9
7,7
(0,0- 4.481,3)
37
5,0
(0,0- 3.658,4)
9,6
(0,0- 9.473,6)
0,0133
0,5858
Leucorredução de PRP
19,94
5,4
22
(2,8- 15.713,0)
(0,0- 3.658,4)
49,9
4,0
Não filtrado
16
6
(2,4- 2.292)
(2,8- 305,1)
PRP=Plasma Rico em Plaquetas; AF= aférese. Teste de Mann-Whitney.
Beira de leito
10
0,1188
4.5.2 Níveis de IL-6 antes da transfusão de plaquetas de acordo com características dos
pacientes e relação com incremento pós transfusional
Os níveis de IL-6 foram significativamente maiores nos episódios com incremento
insatisfatório em relação aos satisfatórios quando avaliado somente transfusões a pacientes com
idade <40 anos (p=0,0135). A mediana para episódios insatisfatórios foi de 34,0 pg/mL
(variando de 4,8 a 15.713,0 pg/mL) e para os satisfatórios de 4,8 pg/mL (variando de 0,0 a
9.473,6 pg/mL). Na análise similar das transfusões administradas a pacientes com idade ≥40
anos, não houve diferença significativa (p=0,3060); a mediana para insatisfatórios foi de 12,3
47
pg/mL (variando de 0,0 a 4.481,3 pg/mL) e para satisfatórios foi de 14,4 pg/mL (variando de
0,0 a 3.658,4 pg/mL) (Tabela 8).
A análise dos níveis de IL-6 nas transfusões de pacientes mulheres mostrou níveis mais
elevados nos episódios com incremento insatisfatório (mediana 83,4 pg/mL, mínimo 2,4 e
máximo 15.713,0 pg/mL) em relação aos episódios com incremento satisfatório (mediana de
14,7 pg/mL, mínimo 1,3 e máximo 646,9 pg/mL). A diferença entre os níveis nas duas situações
foi significativa (p=0,0230). A análise feita apenas com homens não mostrou diferença
significativa (p=0,3695). Nos episódios com incremento insatisfatório, a mediana foi de 6,2
pg/mL (mínimo 0,0 e máximo 71,3 pg/mL) e, nos episódios satisfatórios, foi de 5,2 pg/mL
(mínimo 0,0 e máximo 9.473,6 pg/mL). Ao considerar somente episódios de transfusão a
mulheres com história gestacional, os níveis de IL-6 naqueles que o incremento foi
insatisfatório apresentaram mediana de 83,4 pg/mL (mínimo 2,4 e máximo 15713,0 pg/mL) e
naqueles com incremento satisfatório, mediana de 17,6 pg/mL (mínimo 3,6 e máximo 646,9
pg/mL) (Tabela 8).
As análises das transfusões a pacientes com doenças mieloproliferativas mostraram
mediana de 23,8 pg/mL (variando de 2,4 a 4.481,3 pg/mL) nos casos em que o incremento foi
insatisfatório e de 12,8 pg/mL (variando de 0,0 a 3.658,4 pg/mL) nos casos satisfatórios, mas a
diferença não foi significativa (p=0,1953). Dentre indivíduos com doença linfoproliferativa,
houve diferença significativa (p=0,0484) quando os níveis de IL-6 nos episódios com
incremento insatisfatório (22,7 pg/mL, variando de 0,0 a 15.713,0 pg/mL) foram comparados
aos níveis nos episódios com incremento satisfatório (4,9 pg/mL, variando de 0,0 a 9.473,6
pg/mL) (Tabela 8).
Os pacientes com relato de febre e/ou infecção no momento da transfusão que cursaram
com incremento insatisfatório apresentaram níveis de IL-6 com mediana de 149,5 pg/mL
(variando de 2,4 a 15.713,0 pg/mL) e aqueles que cursaram com incremento satisfatório
apresentaram níveis com mediana de 76,9 pg/mL (variando de 0,0 a 3.658,4 pg/mL), as
diferenças nos níveis de IL-6 entre as duas situações não foram significativas (p=0,9682). Os
pacientes sem relato de febre e/ou infecção que cursaram com incremento insatisfatório tiveram
níveis com mediana de 10,3 pg/mL (variando de 0,0 a 2.292,5 pg/mL) e os com incremento
satisfatório, mediana de 5,7 pg/mL (variando de 0,0 a 9.473,6 pg/mL). A diferença nos níveis
de IL-6 entre esses que não tinham relato de febre foi significativa (p=0,0175) (Tabela 8).
Os episódios em que os pacientes apresentavam resultados positivos para anticorpos
anti-HLA I tiveram mediana de 12,3 pg/mL (variando de 0,0 a 4.481,3 pg/mL) entre aqueles
48
que tiveram incremento insatisfatório e de 6,4 pg/mL (variando de 0,0 a 646,9 pg/mL) entre os
que tiveram incremento satisfatório (Tabela 8). Essa diferença foi significativa (p=0,0284).
Quando os pacientes apresentavam resultados negativos para anticorpos anti-HLA I, a mediana
foi de 50,9 pg/mL (variando de 2,8 a 15.713,0 pg/mL) entre os que cursaram com incremento
insatisfatório e de 11,8 pg/mL (variando de 0,0 a 9.473,6 pg/mL) entre os que cursaram com
incremento insatisfatório, a diferença entre eles não foi significativa (p=0,0634) (Tabela 8).
Tabela 8. Análise dos níveis de IL-6 (pg/mL) antes da transfusão em relação ao incremento
pós transfusional de acordo com as características dos pacientes.
Características
n
Incremento pós transfusional
Insatisfatório
Satisfatório
mediana
mediana
n
(mín-máx)
(mín-máx)
p
Idade
≥40 anos
27
<40 anos
8
12,3
(0,0- 4.481,3)
34,0
(4,8- 15.713,0)
34
31
14,4
(0,0- 3.658,4)
4,8
(0,0- 9.473,6)
0,3060
0,0135
Gênero
Feminino
20
Masculino
15
83,4
(2,4- 15.713,0)
6,2
(0,0- 71,3)
24
41
14,7
(1,3- 646,9)
5.2
(0,0- 9.473,6)
0,0230
0,3695
Histórico Gestacional
Sim
20 83.4 (2.4- 15713.0) 19 17.6 (3.6- 646.9) 0.1560
Não
0
----
5
2.6 (1.3- 3.8)
----
Aloimunização
Positivo
23
Negativo
12
12,3
(0,0- 4.481,3)
50,9
(2,8- 15.713,0)
24
40
6,4
(0,0- 646,9)
11,8
(0,0- 9.473,6)
0,0284
0,0634
Diagnóstico
Mieloproliferativo
25
Linfoproliferativo
10
23,8
(2.4- 4.481.3)
22,7
(0,0- 15.713,0)
33
32
12,8
(0,0- 3.658,4)
4,9
(0,0- 9.473,6)
0,1953
0,0484
Febre e/ou infecção
Sim
10
Não
25
149,5
(2,4- 15.713,0)
10,3
(0,0- 2.292,5)
Teste de Mann-Whitney.
49
9
56
76,9
(0,0- 3.658,4)
5,7
(0,0- 9.473,6)
0,9682
0,0175
4.6 NÍVEIS DE IL-6 ANTES DA TRANSFUSÃO DE PLAQUETAS DE ACORDO COM
RESULTADOS DO PIFT E RELAÇÃO COM INCREMENTO PÓS TRANSFUSIONAL
Ao analisar os níveis de IL-6 antes da transfusão entre pacientes com resultado PIFT
positivo, observou-se mediana de 8,8 pg/mL (variando de 2,4 a 4.481,3 pg/mL) nos episódios
que apresentaram incremento insatisfatório e mediana de 12,8 pg/mL (variando de 0,0 a 9.473,6
pg/mL) naqueles que apresentaram incremento satisfatório. A diferença entre os dois níveis não
foi significativa (p=0,6624) (Tabela 9).
Nos episódios em que os pacientes apresentavam resultado PIFT negativo, os níveis de
IL-6 foram significativamente diferentes (p=0,0037). As transfusões com incremento
insatisfatório apresentaram mediana de 66,1 pg/mL (variando de 2,8 a 15.713,0 pg/mL) e as
transfusões com incremento satisfatório, mediana de 5,4 pg/mL (variando de 0,0 a 3.658,4
pg/mL) (Tabela 9).
Tabela 9. Análise dos níveis de IL-6 antes da transfusão em relação ao incremento pós
transfusional de acordo com resultados do PIFT.
PIFT
CCI
n
Insatisfatório
n
Satisfatório
p
Positivo
18 8,8 (2,4- 4481,3) 21 12,8 (0,0- 9473,6) 0,6624
mediana (mín-máx)
Negativo
11 66,1 (2,8-15713,0) 36 5,4 (0,0- 3658,4) 0,0037
mediana (mín-máx)
PIFT=Teste de Imunofluorescência Plaquetária; CCI= Contagem Corrigida do Incremento.
Teste de Mann-Whitney.
50
5 DISCUSSÃO
A avaliação da efetividade da transfusão de plaquetas através do CCI é muito pertinente
nas transfusões de indicação profilática (HOD; SCHWARTZ, 2008; SLICHTER et al., 2005),
bem como em pacientes com sangramento ativo, quando há limitações para monitoração e
avaliação do grau de sangramento (HEIM et al., 2008; KERKHOFFS et al., 2008). Assim, este
estudo incluiu uma seleção randômica de pacientes onco-hematológicos avaliados pelo CCI.
Dessa forma, os dados refletem o comportamento de uma rotina clínica durante tratamento da
trombocitopenia nesses pacientes.
As frequências de CCI insatisfatório (41,7%) e refratariedade plaquetária (25,6%)
observadas foram similares àquelas relatadas na literatura que variaram de 19% a 34%
(FERREIRA et al., 2011; HEIM et al., 2008; KERKHOFFS et al., 2008; THE TRAP STUDY
GROUP, 1997). Apesar da heterogeneidade das transfusões e dos pacientes, os resultados
apresentados quanto aos fatores capazes de interferirem adversamente no incremento pós
transfusional (Tabela 2) confirmaram observações de estudos anteriores (FERREIRA et al.,
2011; HEIM et al., 2008; LEGLER et al., 1997; SLICHTER et al., 2005; THE TRAP STUDY
GROUP, 1997).
Nas transfusões em que o tipo de CP administrado foi o PRP, a frequência de incremento
insatisfatório foi maior do que nas transfusões de CPs de aférese (57,5% versus 22%), similar
ao observado por outros estudos (FERREIRA et al., 2011; HEIM et al., 2008; LEGLER et al.,
1997; SEFTEL et al., 2004; SLICHTER et al., 2005; THE TRAP STUDY GROUP, 1997). Os
fatores responsáveis por essa diferença podem ser procedimento de obtenção, tipo de solução
aditiva da bolsa, tempo de estocagem, quantidade de leucócitos e níveis de mediadores
inflamatórios acumulados durante a estocagem (APELSETH et al., 2011; COSTA et al., 2012;
COGNASSE et al., 2006; MUYLLE et al., 1993; SEFTEL et al., 2004).
Quando avaliado o efeito da filtração, esse procedimento poderia desencadear ativação
das plaquetas ou diminuir a apresentação direta de antígenos pelos leucócitos do doador.
Contudo, não observou-se prejuízo ou benefício da resposta transfusional, pois não houve
diferença significativa entre CPs de PRP filtrados e não filtrados. No entanto, ao comparar
somente os incrementos de transfusões com CPs desleucocitados, aqueles em que a filtração
ocorreu em beira de leito (PRP) apresentaram maior frequência de incremento insatisfatório do
que aqueles com CPs filtrados durante a coleta (AF). Esse resultado sugere que a presença de
leucócitos durante a estocagem prejudica a eficácia da transfusão devido à produção de
51
mediadores inflamatórios que interagem com fatores intrínsecos ao paciente (APELSETH et
al., 2011; SEMPLE et al., 2007).
A influência significativa da idade, aqui apresentada e também em outros estudos, tem
sido atribuída à maior atividade imunológica em indivíduos jovens e à senescência do sistema
imune nos mais velhos (SLICHTER et al., 2005). Por outro lado, deve-se considerar também
que a presença de comorbidades é mais frequente e acumulada nesses últimos. O gênero
também foi outro fator demográfico importante. O gênero feminino reflete principalmente o
efeito da sensibilização prévia a antígenos específicos das GPs plaquetárias e da molécula HLA
de Classe I. Isto pelo fato de que somente três das pacientes não apresentavam histórico
gestacional e mulheres nulíparas apresentam risco de incremento insatisfatório menor que
homens (PAVENSKI; FREEDMAN; SEMPLE, 2012; SLICHTER et al., 2005).
Em relação aos fatores clínicos, o incremento insatisfatório foi mais frequente entre
episódios de pacientes com doença mieloproliferativa. Provavelmente essa segregação reflete
o perfil demográfico desses pacientes, tipo de tratamento, maior exposição a hemocomponentes
e condições associadas (HEIM et al., 2008; KERKHOFFS et al., 2008; LEGLER et al., 1997;
SLICHTER et al., 2005; STANWORTH et al., 2010). Ao considerar condições clínicas no
momento da transfusão, somente a presença de febre e/ou infecção demonstrou efeito
significante. No entanto, a falta de associação com sangramento, esplenomegalia e medicações
em uso, pode ser devido ao tamanho da amostra ou por ter sido avaliado somente o CCI de 1h,
visto que essas condições podem apresentar efeitos mais significativos após período mais
extenso avaliado pelo CCI de 16h-24h (HEIM et al., 2008; HOD; SCHWARTZ, 2008;
KERKHOFFS et al., 2008).
Os mecanismos associados com presença de infecção e baixo incremento na contagem
de plaquetas após a transfusão não foram ainda claramente elucidados (HOD; SCHWARTZ,
2008; STOKES; GRANGER, 2012). Em casos de sepse e CIVD, é possível que a resposta seja
prejudicada por consumo e sequestro em microvasculatura periférica, contudo, não houve
nenhum relato dessas condições nos pacientes do estudo. Mas, é possível que as plaquetas
tenham aderido às células endoteliais e neutrófilos devido à inflamação e ativação decorrentes
da infecção, estabelecendo um quadro de sequestro em capilares periféricos, pulmões, fígado e
intestinos (COX; KERRIGAN; WATSON, 2011; STOKES; GRANGER, 2012). Além disso,
pacientes com infecção podem apresentar anticorpos não específicos contra plaquetas e efeito
sinérgico de endotoxinas (p. ex. LPS) a anticorpos plaquetários, situações que intensificam a
fagocitose e lise das plaquetas (COX; KERRIGAN; WATSON, 2011; GENTILE et al., 2013;
52
KAPUR et al., 2014; PEERSCHKE; YIN; GHEBREHIWET, 2010; SEMPLE et al., 2007;
STOKES; GRANGER, 2012; TAYLOR et al., 2000).
A frequência de pacientes com aloanticorpos esteve entre aquelas demonstradas em
outros estudos (entre 20% a 60%) (FERREIRA et al., 2011; HEIM et al., 2008; HOD;
SCHWARTZ, 2008; LEGLER et al., 1997; SLICHTER et al., 2005; THE TRAP STUDY
GROUP, 1997). A investigação de aloanticorpos se faz relevante porque os mesmos podem
reagir com as plaquetas do doador transfundidas e diminuir função e sobrevida in vivo
(PAVENSKI; FREEDMAN; SEMPLE, 2012; SLICHTER et al., 2005). Contudo, como
esperado, somente 51,5% dos episódios onde aloanticorpos foram detectados manifestaram
incremento insatisfatório. Esses resultados reafirmam que a presença de aloanticorpos não é
fator determinante de incremento insatisfatório (FERREIRA et al., 2011; HEIM et al., 2008;
KERKHOFFS et al., 2008; LEGLER et al., 1997; QUAGLIETTA et al., 2012; SLICHTER et
al., 2005; THE TRAP STUDY GROUP, 1997). Por exemplo, no estudo do TRAP (1997), 45%
dos indivíduos do grupo controle desenvolveram anticorpos anti-HLA I e somente 13% deles
desenvolveram refratariedade. Embora nem todos os aloanticorpos sejam “patogênicos”,
continua incerto o porquê de nem todos os pacientes apresentarem resposta pós transfusional
inadequada (HOD; SCHWARTZ, 2008; PAVENSKI; FREEDMAN; SEMPLE, 2012). Quais
fatores imunomoduladores do paciente ou do doador são capazes de exercer um papel
significativo na aloimunização e refratariedade plaquetária?
Neste âmbito, a alta sensibilidade dos atuais métodos empregados na detecção de
aloanticorpos anti-HLA I tem sido discutida pela falta de significância clínica em muitos casos,
possivelmente devido à baixa avidez e/ou baixos títulos (JACKMAN et al., 2013). Além disso,
devido à alta variabilidade polimórfica do sistema HLA, deve-se considerar que indivíduos
reativos a menor proporção de antígenos terão menor probabilidade de receberem componentes
antígeno positivos quando comparada à probabilidade para indivíduos de alta reatividade
(VASSALO et al., 2014). Portanto, a porcentagem de PRA dos pacientes no momento da
transfusão foi verificada em relação ao CCI. Ainda que a correlação tenha sido baixa, foi
possível observar que todas as transfusões a pacientes com PRA ≥ 60% apresentaram
incremento insatisfatório (CCI ≤ 5.000 plaquetas/µL).
Quando avaliada a eficiência do PIFT na detecção de anticorpos em relação ao teste
PRA-HLA I, sua sensibilidade e especificidade foram baixas. Mas ainda assim, em relação ao
CCI, o PIFT apresentou associação mais evidente que o PRA-HLA I. A sensibilidade do PIFT
é limitada pelo fato de que o teste consiste no uso de plaquetas de apenas dois doadores
53
aleatórios (BUB et al., 2013), mas diante de um soro com PRA ≥60%, essa sensibilidade
aumenta. Como pacientes com PRA ≥60% são os que apresentam maior risco de ter um
incremento insatisfatório, isso nos leva a acreditar que o PIFT seja um bom teste de triagem,
especialmente para os pacientes oncohematológicos.
Quanto à baixa especificidade do PIFT, isso não é de todo ruim, pois se ele detecta
qualquer anticorpo que se liga à superfície das plaquetas, além dos aloanticorpos, é possível
que falsos resultados positivos incluam anticorpos relacionados à infecção e ao depósito de
imunocomplexos (BUB et al., 2013; HEIKAL; SMOCK, 2013; ROMERO-GUZMAN et al.,
2000) que podem ocasionar incremento insatisfatório (STOKES; GRANGER, 2012). Episódios
com infecção apresentaram maior frequência de incremento insatisfatório quando o PIFT era
positivo, mas não houve diferença significativa, provavelmente pelo pequeno número de
episódios com infecção.
Além disso, como algumas GPs são passíveis de sofrer alteração conformacional devido
aos processos de lavagem e de lise da técnica do MAIPA, o PIFT pode ser capaz de detectar
maior gama de aloanticorpos por utilizar plaquetas frescas e íntegras (BUB et al., 2013). Mais
uma vez, o PIFT pode ser um bom teste de triagem a ser complementado com técnicas mais
específicas e correlacionado com a clínica.
Os resultados também mostraram que a transfusão de aférese foi um fator protetor como
já demonstrado por outros estudos (FERREIRA et al., 2011; HEIM et al., 2008; THE TRAP
STUDY GROUP, 1997). A presença de resultado PIFT positivo seguida da transfusão de CPs
PRP esteve associada ao maior risco de incremento inadequado. Assim, o prévio conhecimento
de que o paciente tem um PIFT positivo pode ser um critério para transfusão de CPs de aférese
quando disponível e a seleção de plaquetas compatíveis não for uma opção factível.
A intenção de investigar níveis séricos das citocinas antes da transfusão de plaquetas foi
avaliar se os níveis desses mediadores refletiriam um estado de predisposição do paciente ao
consumo, sequestro ou destruição de plaquetas. Essa avaliação foi feita com base no CCI uma
hora após a transfusão e de acordo com a presença de fatores capazes de interferir na resposta
à transfusão de plaquetas. A própria doença de base, os fatores demográficos e clínicos, bem
como a resposta aloimune podem estar associados ao perfil de citocinas do paciente antes da
transfusão (HOD; SCHWARTZ, 2008; PAVENSKI; FREEDMAN; SEMPLE, 2012;
STOKES; GRANGER, 2012). Assim, os níveis de citocinas poderiam estar também associados
à resposta pós transfusional.
54
Foram encontrados níveis circulantes de IL-6 mais elevados nos soros dos pacientes que
cursaram com incremento insatisfatório em comparação àqueles que apresentaram resposta
satisfatória. As demais citocinas verificadas não apresentaram diferenças significativas de
acordo com o incremento pós transfusional dos episódios avaliados. Apesar de todas as
variações e particularidades, IL-6 parece ser um bom marcador na predição da resposta à
transfusão.
A IL-6 é uma citocina que atua principalmente como mediador pró-inflamatório
(BURGER, 2013; SCHELLER et al., 2011). Estudos demonstraram sua associação a reações
transfusionais não hemolíticas e pior prognóstico em pacientes onco-hematológicos e sépticos
(GENTILE et al., 2013; MIHARA et al., 2012). Devido ao envolvimento tanto em reações
inflamatórias locais quanto sistêmicas e ao fato de ser produzida por quase todas as células do
organismo, é improvável não encontrar níveis séricos aumentados de IL-6 em condições
patológicas (BURGER, 2013; SCHELLER et al., 2011).
Sob condições fisiológicas normais, a expressão gênica de IL-6 é induzida
principalmente por estímulos que causam uma resposta inflamatória, tais como TNF-α e -β, IL1, endotoxinas bacterianas e LPS, infecção viral e interferons (MIHARA et al., 2012). Suas
ações principais incluem a indução da expressão de quimiocinas e outros mediadores
inflamatórios e múltiplas funções envolvidas na resposta imune de células T, regulação da
hematopoiese, indução de reações de fase aguda, além de metabolismo de lipídios, cartilagens
e ossos (BURGER, 2013; MIHARA et al., 2012; SCHELLER et al., 2011).
Assim, níveis aumentados de IL-6 podem ser a consequência de uma condição base
indicando um estado inflamatório que pode predispor à destruição e sequestro das plaquetas
transfundidas (STOKES; GRANGER, 2012). Ou, a causa direta do aumento na destruição e
sequestro de plaquetas devido à ativação de células endoteliais e leucócitos que irão interagir
com as plaquetas (ZAPATA; COX; SALVATO, 2014). Em verdade, isso irá depender da soma
de vários fatores que podem ser evidentes ou subclínicos.
Nos episódios em que houve positividade para anticorpos anti-plaquetas e resposta
insatisfatória, o estado inflamatório pode ter conferido uma propensão à produção e secreção
de anticorpos a antígenos estranhos, uma vez que IL-6 atua como adjuvante no direcionamento
para o perfil Th2 e induz a diferenciação das células B ativadas em células plasmáticas
produtoras de anticorpos (MIHARA et al., 2012; SCHELLER et al., 2011). Isso explicaria os
maiores níveis de IL-6 associados aos episódios PRA-HLA I positivos com incremento
insatisfatório.
55
Além disso, IL-6 induz a produção de proteína C-reativa pelos hepatócitos, uma das
principais proteínas de fase aguda usada na prática clínica como biomarcador sensível à
infecção e inflamação (MIHARA et al., 2012). Foi demonstrado recentemente que a PCR
interage diretamente com as plaquetas, como cofator na destruição de plaquetas por fagocitose
mediada por IgG (KAPUR et al., 2014). Assim, os elevados níveis de IL-6 em pacientes com
aloanticorpos que apresentaram incremento insatisfatório, sugere que, devido à um estado
inflamatório, as proteínas C-reativas do plasma do paciente podem ter interagido com os
aloanticorpos detectados para uma destruição efetiva das plaquetas transfundidas.
Por outro lado, nos casos de infecção concomitante, produtos bacterianos, endotoxinas
e vírus podem agir sinergicamente com os anticorpos direcionados contra as plaquetas
favorecendo a lise e fagocitose das mesmas (SEMPLE et al., 2007; MIHARA et al., 2012;
ZAPATA; COX; SALVATO, 2014). Como as infecções podem induzir a produção de IL-6,
essa citocina pode ser um marcador para avaliar quando ambos, aloimunização e infecção,
podem ser relevantes para interferir na resposta transfusional. A quantidade de indivíduos com
infecção foi pequena no presente estudo e mais trabalhos merecem ser desenvolvidos para
investigar a soma dos efeitos desses dois fatores, infecção e aloimunização.
Nos episódios em que aloanticorpos não foram detectados pelo PIFT, a mediana dos
níveis de IL-6 foi pronunciadamente mais elevada naqueles que o incremento foi insatisfatório
do que naqueles com incremento satisfatório. Aparentemente, na ausência de anticorpos ligando
às plaquetas, os níveis de IL-6 e, por conseguinte, o grau de inflamação, precisaram estar
consideravelmente mais elevados para refletirem um posterior incremento insatisfatório. Os
altos níveis de IL-6 estão associados com aumento da ativação de células endoteliais
promovendo adesão e sequestro de plaquetas (PEERSCHKE; YIN; GHEBREHIWET, 2010).
As plaquetas sequestradas nesses sítios terão maior chance de serem também ativadas. Devido
ao estresse oxidativo, poderão expressar P-selectina e isso irá favorecer lise e fagocitose dessas
plaquetas (ZAPATA; COX; SALVATO, 2014).
Nos casos de as plaquetas transfundidas serem de CPs de PRP, a maior frequência de
incremento insatisfatório nesses casos pode estar associada ao estado das plaquetas,
possivelmente ativadas (COGNASSE et al., 2006; COSTA et al., 2012). Os CPs de aférese
parecem ter um efeito protetor onde os níveis de IL-6 do receptor não foram relevantes como
nas transfusões de PRP.
Muitos mediadores secretados por leucócitos e acumulados durante a estocagem podem
ativar as plaquetas (COSTA et al., 2012; MUYLLE et al., 1993; APELSETH et al., 2011).
56
Após serem transfundidas, ao encontrarem um microambiente com células endoteliais e
leucócitos também ativados, mediadores lipídicos, citocinas e quimiocinas, estariam mais
propensas à adesão celular mesmo na ausência de lesão vascular (STOKES; GRANGER, 2012).
Assim, podem rolar e aderir ao endotélio ativado ou aos leucócitos ativados atraídos por
quimiotaxia, sendo sequestradas nos capilares, conferindo incremento pós transfusional
insatisfatório (STOKES; GRANGER, 2012).
57
6 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados encontrados, o PIFT parece ser um bom teste de triagem
na detecção de anticorpos contra plaquetas. Seu emprego na rotina dos serviços pode ser
estimulado por ser um teste menos complexo, mais rápido e mais barato que pode ser realizado
para triagem dos pacientes que necessitam da realização de testes mais específicos e de alto
padrão.
Esse estudo foi o primeiro a demonstrar que os níveis de IL-6 antes da transfusão de
plaquetas foram mais elevados em pacientes que apresentaram em seguida um incremento
plaquetário insatisfatório. Esses resultados sugerem um estado inflamatório capaz de modular
a destruição e sequestro de plaquetas. Além disso, mostrou que níveis mais elevados de IL-6
estiveram associados a pior resposta quando CPs de PRP foram transfundidos, mas não quando
CPs de aférese foram transfundidos.
Os mecanismos imunológicos envolvidos com baixo incremento após transfusão de
plaquetas, precisam ser melhor elucidados para diferenciar quando a falta de incremento ocorre
por sequestro ou destruição das plaquetas e quando aloanticorpos e produtos de infecção atuam
sinergicamente.
Mais estudos podem corroborar para a compreensão do valor de resultados do PIFT e
dos níveis séricos de IL-6 na predição de resposta insatisfatória à transfusão de plaquetas. PIFT
e possivelmente proteína C-reativa podem vir a ser utilizados na rotina como biomarcadores no
monitoramento de pacientes sob esquemas de transfusão crônica de plaquetas e nos critérios de
seleção de CPs. Essa estratégia pode ser viável principalmente em serviços onde testes de alto
padrão e complexidade como PRA-HLA I e MAIPA, ou seleção de plaquetas compatíveis não
fazem parte de sua realidade.
58
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66
8 ANEXO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PACIENTES
FUNDAÇÃO HEMOMINAS / Hemocentros de Uberaba e Uberlândia
Serviço de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro e Universidade Federal de
Uberlândia
Vimos através deste, solicitar sua contribuição para a realização do projeto de pesquisa intitulado
“Segurança transfusional: avaliação da produção, distribuição e eficácia transfusional do concentrado
de plaquetas na hemorrede do estado de Minas Gerais”, coordenado pela Fundação HEMOMINAS,
contando também com a participação da Universidade Federal do Triângulo Mineiro e Universidade
Federal de Uberlândia.
Em decorrência da sua doença e/ou do seu tratamento, você está apresentando diminuição
do número de plaquetas, que é o componente do sangue responsável por evitar ou controlar
hemorragias. Por este motivo, você precisa receber transfusão de plaquetas para aumentar a
quantidade destas no seu sangue.
Estamos realizando uma pesquisa para saber se após ter recebido a transfusão o seu número
de plaquetas subiu para números desejáveis. Para isto precisamos colher seu sangue antes da
transfusão e novamente uma e 24 horas após a mesma para verificar sua resposta ao tratamento.
Serão coletados no total 20 mL de sangue, três amostras de 5 mL de sangue nos três momentos
mencionados e mais uma amostra de 5 mL no primeiro momento. Você poderá ter algum desconforto
quando receber uma picada para colher o sangue do seu braço, desconforto este que não traz qualquer
risco à sua saúde e será coletado por pessoa qualificada.
Ressaltamos que o nosso estudo se propõe a buscar alternativas para aumentar a segurança
dos procedimentos empregados na transfusão de plaquetas, especialmente quanto à sua eficácia para
o paciente. Ao concordar com a proposta, também serão colhidos, de seu prontuário alguns dados de
identificação será feita a avaliação da compatibilidade com as plaquetas do(s) doador(es).
Os resultados dos exames realizados serão repassados ao seu médico e ele ficará responsável
por lhe informar dos mesmos. Você poderá obter todas as informações que julgar necessárias, fazer
todas as perguntas que quiser, antes e durante o andamento da pesquisa e poderá não participar da
mesma ou retirar seu consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento.
67
Pela sua participação no estudo, você não receberá qualquer valor em dinheiro, mas
terá a garantia de que todas as despesas necessárias para a realização da pesquisa não
serão de sua responsabilidade. Seu nome não aparecerá em qualquer momento do estudo,
pois você será identificado com um número.
Os resultados individuais deste estudo serão mantidos em sigilo, podendo ser informados
apenas à sua pessoa e só serão publicados em conjunto. Caso você não concorde em participar
da pesquisa, isso não muda a sua condição de paciente nesta Instituição.
Sua participação é totalmente voluntária.
Eu, ____________________________________________, declaro que li e entendi as
informações relativas a este estudo. Concordo em participar voluntariamente da pesquisa. Tenho
liberdade de retirar o meu consentimento em qualquer fase da pesquisa, caso não queira
continuar participando da mesma.
__________________________, ______ de _______________________de ________.
Assinatura_____________________________________________________________
Responsável pela entrevista: ___________________________________________________
Nome / Assinatura
Para contato com o pesquisador responsável – cada cidade terá um pesquisador responsável
local

Uberaba: Helio Moraes de Souza - Fone: (34) 3312-5713

Uberlândia: Paulo Henrique Ribeiro de Paiva - Fone: (34) 3222-8801
Para contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação HEMOMINAS – Fone: (31) 3248
4587
68