Proteínas Recombinantes
Histórico e vantagens
Origem
• 1944 - Oswald Avery: transmissão de informações pelo DNA.
• 1961- François Jacob e Jacques Monod: síntese proteica
apartir do DNA.
• 1972- Paul Berg: Ligação de cadeias genéticas de animais
organismos diferentes.
• 1978- Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith:
Enzimas de restrição (Nobel)
Sistemas de Expressão
Sistemas de Expressão
Desvantagem: Produz muitas proteases!!
Sistemas de Expressão
Sistemas de Expressão
Sistemas de Expressão
Impacto das P.Rs no
desenvolvimento de vacinas
17 vacinas
em 137 anos.
31 vacinas
em 40 anos
Objetivo:
• Estabelecer uma abordagem eficiente frente a
proteínas de difícil expressão utilizando E.coli.
• Para estabelecer uma estratégia 71 proteínas
foram escolhidas e cada uma expressa em 15
formas diferentes: (cepa x temperatura x
plasmídeos x estresse)
Cepas de E.coli
•
BL21-Gold: deficiente em EndA1 nuclease
•
BL21-Codon plus: obtida da BL21 Gold, apresenta mais copias de genes que codificam tRNAs.
•
BL21-V2R1: Derivadas de cepas BL21 deficientes em lon (deficiente em proteases
dependentes de ATP) de e omT (deficiente em proteases de membrana).
•
BL21-V2R1 pRARE2: introdução do plasmídeo pRARE2 que fornece tRNAs.
•
BL21-Rosetta: códons raros, deficiente em protease e resistente a cloranfenicol.
•
ArcticExpress: contém chaperonas que auxiliam no folding e possibilitam o funcionamento
metabólico de 4° a 12°C.
•
JM109: mutações em EndA1 e RecA1, indicado para clonagem de plasmídeos.
•
W3110: mutação no gene gatA que responsável pela metabolização do C.
Plasmídeos
6 His-tags introduzidas em C-terminal ou N-terminal.
Purificação
• Os lisados e sobrenadantes são incubados
com beads NI-NTA.
• A avaliação da expressão é feita por SDS-PAGE.