Fundação Universidade Federal do Rio Grande
Instituto de Oceanografia
Disciplina de Poluição Marinha
CROMATOGRAFIA
(aula 1)
Ítalo Braga de Castro
Definição:
É um método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura por interação entre
uma fase estacionária e uma fase móvel.
Fase Estacionária: sólido (ou líquido impregnado com
sólido) que permanece dentro da coluna de separação.
Fase Móvel: solvente (gás ou líquido) que se move através
da coluna, carregando os solutos.
Histórico:
M. TSWEET (1903): Separação de misturas de
pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos e solventes variados.
éter de
petróleo
mistura de
pigmentos
CaCO3
pigmentos
separados
Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
Princípio:
Classificação:
1-De acordo com o sistema cromatográfico
•Em Coluna
Cromatografia Líquida
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Supercrítica
•Planar
Cromatografia em Camada Delgada (CDC)
Cromatografia em Papel (CP)
Classificação:
2-De acordo com a Fase Móvel
•Utilização de Gás
Cromatografia Gasosa (CG)
Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
•Utilização de Líquido
Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
•Utilização de Gás Pressurizado
Cromatografia Supercrítica (CSC)
Classificação:
3-De acordo com a Fase Estacionária
•Líquida
•Sólida
•Quimicamente Ligadas
4-De acordo com o Modo de Separação
•Por adsorção
•Por partição
•Por troca iônica
Mecanismos de separação:
Processos físicos -> Sorção
“atrações polares”
Classificação:
CROMATOGRAFIA
Planar
Em coluna
Gás
L
FL
L
Fluído supercrítico
FL
L
L
FL
Líquido
FL
L
S
S
S
CP
CCD
CGL
CCD
CGFL
CGS
CSS
CSFL
CLL
CLS
CE
Técnica
CLFL
Fase Móvel
Fase Estacionária
Tipos de Cromatografia
CTI
CB
Cromatografia em Papel:
- Cromatografia Planar Líquido-líquido
- Princípio: partição – relaciona a diferença de
solubilidades dos componentes de uma mistura, na fase
móvel e fase estacionária;
- Tipos:
circular
-
ascendente,
descendente,
bidimensional,
Análise qualitativa: Rf (fator de retenção);
Rf = distância percorrida pela substância
distância percorrida pela fase móvel
Cromatografia em camada delgada:









Método rápido (20-40 min.)
Uso de diversos agentes cromogênicos
Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g)
Grande gama de compostos pode ser analisada
Método simples e barato
F.M. - sistema de solventes
F.E - Adsorventes (sílica, alumina, celite, amido)
Métodos de detecção: físico-químicos
Princípio: Adsorção (polaridade)
Cromatografia em coluna:
Pode ser também chamada de cromatografia líquida clássica.
FE – sílica e alumina;
FM – eluente;
PRINCÍPIO: adsorção
Cromatografia Gasosa:
FASE MÓVEL
Fase
estacionária
injeção
separação
eluição
DETECTOR
Cromatografia Gasosa:
Cromatografia
Gás-Sólido (CGS)
Sólida
FE sólida com uma grande área superficial e a
separação baseia-se em mecanismos de
adsorção das substâncias neste sólido.
Em CG a FE
pode ser:
Líquida
Cromatografia
Gás-Líquido (CGL)
FE líquida pouco volátil recobrindo um suporte
sólido ou as paredes da coluna capilar. A
separação baseia-se em mecanismo de partição
das substâncias entre a fase líquida e gasosa.
Cromatografia Gasosa:

Rapidez
 Amostras voláteis

Alto poder de separação
 Compostos termicamente

Separação de várias classes
de compostos em uma
análise

Sensibilidade (ppm - ppb)

Facilidade de registrar dados

Variedade de detetores
(especificidade)
estáveis
 Técnicas auxiliares p/
identificação
Cromatografia Gasosa (Aplicações):
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
(para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo
de um gás ela deve se dissolver - pelo menos parcialmente - nesse
gás)
Misturas cujos constituintes sejam
VOLÁTEIS (“evaporáveis”)
DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que
sejam termicamente estáveis.
Cromatografia Gasosa (Aplicações):

Ambiental
◦
◦
◦

Alimentos
◦
◦
◦



Análise de ácidos graxos e triglicerídeos
Análise de compostos voláteis responsáveis pelo aroma característico
de alimentos
Análise de açúcares e aminoácidos
Farmacêutica
Química Forense/Toxicologia
◦
◦

Pesticidas, organoclorados e PCB’s
Hidrocarbonetos
Aminas e fenóis
Doping
Metabólitos de drogas
Química Industrial
Petroquímica
Cromatógrafo de Fase Gasosa:
Cromatografia Gasosa:
1
6
2
4
3
5
1 - Reservatório de Gás e Controles de
Vazão / Pressão.
2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Coluna Cromatográfica e Forno da
Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrônica de Tratamento de Sinal.
6 - Registro
Gás de Arraste:
Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através
da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE
Requisitos:
INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies
do instrumento.
PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase
estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
H2O, O2
hidrocarbonetos
oxida / hidroliza algumas FE
incompatíveis com DCE
ruído no sinal de DIC
Gás de Arraste:
Requisitos:
CUSTO
CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.
C
B
A
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
PUREZA
COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um
gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Gás de Arraste:
Componentes necessários à linha de gás:
controladores de vazão / pressão de gás
dispositivos para purificação de gás (“traps”)
3
6
4
2
1
5
1 - Cilindro de Gás
2 - Regulador de Pressão Primário
3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás
4 - Regulador de Pressão Secundário
5 - Regulador de Vazão
6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)
Injetor:
1
2
3
4
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de gás de arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna cromatográfica
Injeção:
Injeção:
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para
que a amostra vaporize imediatamente, mas sem ocasionar a sua
decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de
ebulição do componente menos volátil
VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado
físico da amostra
Amostras
Amostras
COLUNA
Líquidas
Gasosas
empacotada
 = 3,2 mm (1/4”)
0,2 L ... 20 L
0,1 ml ... 50 mL
capilar
 = 0,25 mm
0,01 L ... 3 L
0,001 ml ... 0,1 mL
Sólidos: convencionalmente se dissolve em um
solvente adequado e injeta-se a solução
Microseringa:
Microseringa de 10  L:
agulha (inox 316)
êmbolo
corpo (pirex)
Colunas:
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE
líquida depositada sobre
as partículas do recheio)
Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de  m) de FE líquida
ou sólida
Colunas (parâmetros):
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer
a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).
Estrutura química
do analito
p0 = f
Temperatura
da
coluna
Temperatura
da coluna
Pressão
de
vapor
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR
RETENÇÃO)
Velocidade
de
migração
Colunas (parâmetros):
TEMPERATURA DA COLUNA
CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É
ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG
Detectores:
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal
quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece
como um PICO no cromatograma.
Detectores:
UNIVERSAIS:
Geram
substância eluída.
sinal
para
qualquer
SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com
determinada propriedade físico-química.
ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam
determinado elemento ou grupo funcional em suas
estruturas
~ 60 detectores já usados em CG
~ 15 equipam cromatógrafos comerciais
4 respondem pela maior parte das aplicações
DCT TCD
Detector por
Condutividade
Térmica
DIC FID
Detector por
Ionização em
Chama
DCE ECD
Detector por
Captura de
Eletrons
EM MS
Detector Espectrométrico
de Massas
Detectores:
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD)
•É um Detector de 2 canais
•mede a diferença, em Condutividade Térmica , entre o Gás
de Arraste (Referência) e o do Gás de Arraste + Amostra
(analítico)
•possui 2 pares de filamentos, 1 em cada canal , formando
uma ponte.
• As vazões dos 2 canais devem ser praticamente iguais
•A presença de um componente, dissolvido no Gás de
arraste, ao atingir o canal analítico muda a resistência deste
filamento , provocando um desequilíbrio na ponte que gera
um sinal proporcional a quantidade deste
• A sua sensibilidade depende da corrente do Filamento ,
concentração dos componentes e da diferença da
Condutividade Térmica entre o Gás de arraste e o
componente .
TCD:
Detectores:
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID) .
•baseia-se no princípio de que a concentração de
um composto é diretamente proporcional a
concentração das partículas ionizadas presentes no
mesmo
•O Gás de arraste e os componentes que eluem da
Coluna atingem a chama . Esta ioniza (queima) as
moléculas orgânicas presentes na corrente gasosa .
•As partículas ionizadas, entre os eletrodos, gera
uma corrente que é medida através de uma
resistência
FID:
Collector
Flame jet
Air in
Hydrogen in
Column connection
Detectores:
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD)
•É um Detector seletivo, específico para análises de Compostos
Eletrofílicos (como os Halogênios nos Clorados) .
• A cela do ECD é revestida internamente por uma lâmina do
isótopo radioativo de “Ni-63”.
•As “Partículas Beta” emitidas pelo isótopo ionizam o Carrier e
os Íons e Elétrons resultantes migram para o anodo coletor por
influencia de uma voltagem polarizada pulsante , aplicada
entre a fonte e o coletor
•A freqüência de pulsação é controlada para manter a corrente
constante e é a geradora do sinal analítico .
•É um Detector não destrutivo e altamente sensível, ideal para
análise de pesticidas e agrotóxicos clorados
ECD:
Collector
63Nickel foil
Make-up gas in
Column connection
Detectores:
DETECTOR POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
•A GC/MS é uma técnica analítica , também bastante conhecida, que
visa identificar positivamente e ou quantificar os componentes de
uma mistura .
• Os componentes da amostra, previam. separados no GC, são
transferidas p/ o MS, através De uma linha de transferência.
• No MS ocorre a fragmentação da molécula e a detecção,
possibilitando ao usuário o detalhamento da estrutura e o peso
molecular do composto.
• Utilizando uma biblioteca específica podemos identificar
positivamente o composto, baseado na abundância dos seus
fragmentos (ions) .
Espectro de Massa (TBT):
Cromatografia Líquida:
• CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA (CLC)
• CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO
(CLAE)
Cromatografia Líquida:
Esquema para CLC:
Preparo da coluna
Aplica-se a amostra
Eluente
Detecção e quantificação (espectroscopia ou gravimetria)
Cromatografia Líquida:
Esquema para CLAE:
Coluna fechada
Injeção de amostra
Detector
Cromatogramas
Cromatografia Líquida de Alta Resolução:
Características da Fase Móvel usada em CLAE:
• Alto grau de pureza ou de fácil purificação;
• Dissolver a amostra sem decompor os seus
componentes;
• Não decompor ou dissolver a FE;
• Ter baixa viscosidade;
• Ser compatível ao detector utilizado;
• Ter polaridade adequada para permitir uma separação
dos componentes da amostra.
Cromatografia Líquida de Alta Resolução:
Tipos de amostras que podem ser analisadas por CLAE:
• aminoácidos;
• explosivos;
• lipídeos polares;
• metabólicos de animais e plantas;
• pigmentos de plantas;
• produtos farmacêuticos;
• proteínas;
• tintas.
Comparação entre CG e CLAE:
FATOR
CG
Requisitos para amostra
Amostra
volátil
ou
derivatizável, termicamente
estável na temperatura de
operação
do
sistema
cromatográfico.
Gases, líquidos ou sólidos
MM: 2 a 1200
Amostra
móvel.
10-12g
10-9
Tempo de análise
Minutos até poucas horas
Minutos até poucas horas
Capacidade analítica
Excelente, separação
de
amostras com até 200
componentes.
Excelente, separação
amostras
com
até
componentes.
Tempo de treinamento
para um operador
Cerca de 3 meses.
Pelo menos 6 meses.
Tipos de amostras
Quantidades
detectáveis
mínimas
CLAE
solúvel
na
fase
Líquidos e sólidos, iônicos
ou covalentes. MM: 32 a
4.000.000
de
50
Eficiência dos sistemas cromatográficos:
TEMPO
A migração de um
analito pela coluna
provoca inevitavelmente
o alargamento da sua
banda:
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
Separação deficiente de analitos
com retenções próximas.
Picos mais largos e menos
intensos = menor
detectabilidade
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de
dispersão do analito.
Análise Qualitativa:
Identificação individual das espécies
contidas na amostra
Aplicações
Qualitativas de
CG
Determinação da identidade da amostra
propriamente dita
Fontes de Informações Qualitativas
RETENÇÃO
Uso de dados de retenção de um analito para sua
identificação
DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as
substâncias eluídas
Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável
combinação de dados provenientes de pelo menos duas
fontes
Análise Qualitativa: (tempos de retenção)
t’R = f
Interações analito / FE
Pressão de vapor do analito
Condições operacionais
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado
de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de
cromatogramas da
amostra e de uma
solução padrão do
analito suspeito
Análise Qualitativa: (métodos de detecção)
Métodos de detecção que fornecem informações qualitativas sobre os
analitos eluídos:
Cromatografia Gasosa com Detecção
Espectrométrica de Massas (CG-EM)
Cromatografia Gasosa com Detecção
Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)
Cromatografia Gasosa com Detecção
Espectrométrica por Absorção no InfraVermelho (CG-EIV)
Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de
identificação baseadas em retenção
Padrões cromatográficos:
• Externos (Identificação)
Padrões •Internos (Quantificação)
•Surogates (Recuperação)
Controle de Qualidade dos dados:
• Programas de Intercalibração
•Materiais de referência
Cromatogramas:
RT: 6.00 - 15.00
10.43
100
95
90
12.91
85
80
75
70
65
Abundância relativa
60
55
50
45
10.15
40
35
11.78
30
25
11.34
20
15
10
12.51
5
7.08
8.01
10.67
9.51
8.82
13.69
14.39
14.75
0
6
7
8
9
10
11
Tempo (min)
12
13
14
15
Cromatogramas: