Biologia molecular de Plasmodium falciparum –
um curso prático
Molecular Biology of Plasmodium falciparum –
a practical course
3ª. Edição 2015
Gerhard Wunderlich & Carsten Wrenger
Departamento de Parasitologia /Instituto de Ciências Biomédicas
Organização
7 grupos de 2 pessoas
2 seminários (um por grupo, outro em 2/3 grupos)
1 exame final (30.1.2015)
Avaliação: seminários 30%, relatório 40%, exame 30%
Biossegurança
Seminário sobre tecnologias next generation sequencing
-Destaque o princípio como funciona cada sequenciamento
- tente fornecer um fluxograma como uma amostra é processada até chegar
no resultado (passos experimentais)
-Informe o poder de cada tecnologia (tempo de preparo de amostras,
quanta informação é conseguida em Gb e custo por base)
- informe como os dados são trabalhados depois (quais softwares)
Seminário do grupo sobre o gene/a proteína que
estão produzindo
-Busca informações básicas em plasmoDB.org (o ID do gene que
está trabalhando está no fim da apostila): tamanho, carga,
conformação, com quem interage, quando é expressa.
-Busca informações já levantadas no pubmed
(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) “escaneando” primeiramente os
resumos, consulte review caso exista, depois monte o sua visão
sobre a importância biológica da proteína
- algumas proteínas tem dados recentes publicados em revistas de
alto impacto (PfSEA, PFD0020c)
- Não repita o ciclo de vida ou dados de background da malaria no
seu seminário, todos antígenos são expressos em blood stage e o
ciclo de vida está na apostila
- máximo 20 min por seminário, não esqueça informar as fontes de
informação, vista a camisa como sua proteína fosse a mais
interessante de todas!
Ciclo de vida
A invasao de merozoitas em hemácias em câmera lenta
(Crabb/Cowman 2006)
Muitos antigenos da superfície do merozoita
são importantes para invasão e estao sendo
testados em vacinas
Kappe et al. 2013
MSP1
AMA1
RON2
MSP2
MSP3
EBA175
MSP4
MSP5
MSP9 etc
Bannister et al. TIP 2000
Craig et al. 2004
Vamos começar!
grupo
proteina
Anri Yamaguchi
[email protected]
1
EBA175
Caua Antunes Westmann
[email protected]
2
MSP3
5
PfSEA
Nelly Araya
Eduardo Delago Koyanagui
[email protected]
6
MSP4
Eiji Yamassaki de Almeida
[email protected]
7
PFD0020c
Felipe Genova Panicio
[email protected]
7
PFD0020c
Hellen Paula Valerio
[email protected]
3
Surf4.1
Jeronimo de Alencar Nogueira
[email protected]
6
MSP4
Lucas Monteiro Galotti de Souza
[email protected]
3
Surf4.1
Lucas Nishida
[email protected]
4
MSP9
Juliane Cristina Ribeiro Fernandes
[email protected]
MSP9
Rafaella Jekabson
[email protected]
1
EBA175
Larissa Gasques
[email protected]
2
MSP3
Thomas Müntefering
[email protected]
5
PfSEA
5
PfSEA
Marius Zimmermann
gDNAs of groups 1-7
PM
1
2
3
4
6
5
7
1
PM
-
2
+
+
-
3
+
-
+
4
+
+
-
Amplification of targets of groups 1-4 on genomic DNA, note where
the gel was cut, groups 5-7 have equal results
Reamplification of PFD0100c (surf4.1)
Amplification PFD0100c:
PM
1
2
3
1: group’s
buffer
2: bkup
buffer
3: neg ctrl
150 ul of this material used for reinvasion in 3 bottles
“floated trophs and schizonts”
Rest of floated culture – pellet fraction
“reinvaded rings”, in fact trophs! Tube
“anel”!
Harvested rings day 4! Still containing schizonts
Whole RNA preparation, seen are the rRNAs as the two major bands,
Below the quantities used for cDNA synthesis (Total volume of 20 µl)
PM
A
T
E
4 ul
8 ul
2 ul
Nanodrop:
Results for cDNA test with PCR, oligo K2 (Fructose1,6bisphosphate aldolase)
A
EBA175
T
E
-
+
Lower part:
pGEM clones
group with
EBA175,
BamH1EcoR1 digest,
clone 4
fragment was
cut out of gel
pGEM clone BamH1/EcoR1 digests, with cut fragments as holes in the gel
MSP3
PfSEA1
PFD0100c/surf4
MSP4
PM
PFD0020
MSP9
gerds
Subcloning the fragments in pGEX2T so far without recombinants!
(I’m currently redoing it)
Bradford data
conc. µgµl
Mean
Grupo rawdata
1
0.432
0.432
0.42
0.4280
0.193
0.5
0.362
0.352
0.352
0.3553
0.169
0.25
0.285
0.272
0.277
0.2780
0.203
0.125
0.244
0.231
0.238
0.2377
0.402
0.0625
0.192
0.185
0.172
0.1830
0.156
0.03125
0.169
0.182
0.171
0.1740
0.281
0.015625
0.15
0.157
0.163
0.1567
0.541
0
0.163
0.165
0.163
0.1637
Coomassie stained gel
260
140
95
72
52
PM
1
2
3
4
5
42
34
26
17
1: GST-MSP1_19
2: GST-MSP1_2-6
3: GST-PfRH5
4: GST-MAEBL
5: GST-EBA175
6:GST-ATS
7: GST-PFD0020c
8: pure GST
6
7
8
Western blot data (best pic of series)
1 2 3 4
5
6 7 8
Elisa assay: raw data
plasma/OD450
pfd0020
msp1_2-6
msp1.19
ats
pfrh5
eba175
maebl
gst
1
0.086
0.603
0.393
0.112
0.069
0.057
0.057
0.032
2
0.109
0.051
0.263
0.115
0.076
0.067
0.071
0.046
3
0.073
0.04
0.094
0.128
0.188
0.035
0.074
0.046
4
0.084
0.094
0.066
0.165
0.168
0.068
0.047
0.026
5
0.116
0.103
0.339
0.142
0.114
0.094
0.053
0.055
6
0.054
0.123
0.052
0.199
0.047
0.036
0.044
0.031
7
0.044
0.046
0.06
0.093
0.042
0.531
0.096
0.023
8
0.033
0.035
0.084
0.121
0.054
0.093
0.047
0.06
Coating too short?
9 neg1
neg2
neg3
0.046 0.039 0.271 0.069
0.035 0.063 0.095 0.043
0.084 0.078 0.067 0.123
0.121 0.417 0.081 0.271
0.054 0.064 0.077
0.06
0.093 0.046 0.071 0.231
0.047 0.051 0.039 0.057
0.06 0.023
0.05 0.045
Calculations ELISA
plasma/OD450
pfd0020
msp1_2-6
msp1.19
ats
pfrh5
eba175
maebl
gst
1
0.086
0.603
0.393
0.112
0.069
0.057
0.057
0.032
2
0.109
0.051
0.263
0.115
0.076
0.067
0.071
0.046
3
0.073
0.04
0.094
0.128
0.188
0.035
0.074
0.046
4
0.084
0.094
0.066
0.165
0.168
0.068
0.047
0.026
5
0.116
0.103
0.339
0.142
0.114
0.094
0.053
0.055
6
0.054
0.123
0.052
0.199
0.047
0.036
0.044
0.031
7
0.044
0.046
0.06
0.093
0.042
0.531
0.096
0.023
8
0.033
0.035
0.084
0.121
0.054
0.093
0.047
0.06
9 neg1
neg2
neg3
0.046
0.039
0.271
0.069
0.035
0.063
0.095
0.043
0.084
0.078
0.067
0.123
0.121
0.417
0.081
0.271
0.054
0.064
0.077
0.06
0.093
0.046
0.071
0.231
0.047
0.051
0.039
0.057
0.06
0.023
0.05
0.045
corrected values
pfd0020
msp1_2-6
msp1.19
ats
pfrh5
eba175
maebl
1
0.054
0.571
0.361
0.08
0.037
0.025
0.025
2
0.063
0.005
0.217
0.069
0.03
0.021
0.025
3
0.027
-0.006
0.048
0.082
0.142
-0.011
0.028
4
0.058
0.068
0.04
0.139
0.142
0.042
0.021
5
0.061
0.048
0.284
0.087
0.059
0.039
-0.002
6
0.023
0.092
0.021
0.168
0.016
0.005
0.013
7
0.021
0.023
0.037
0.07
0.019
0.508
0.073
8
-0.027
-0.025
0.024
0.061
-0.006
0.033
-0.013
9 neg1
neg2
neg3
-0.014
0.016
0.221
0.024
-0.025
0.04
0.045
-0.002
0.024
0.055
0.017
0.078
0.061
0.394
0.031
0.226
-0.006
0.041
0.027
0.015
0.033
0.023
0.021
0.186
-0.013
0.028
-0.011
0.012
corrected values 2
pfd0020
msp1_2-6
msp1.19
ats
pfrh5
eba175
maebl
0.054
0.571
0.361
0.08
0.037
0.025
0.025
0.063
0.005
0.217
0.069
0.03
0.021
0.025
0.027
0
0.048
0.082
0.142
0
0.028
0.058
0.068
0.04
0.139
0.142
0.042
0.021
0.061
0.048
0.284
0.087
0.059
0.039
0
0.023
0.092
0.021
0.168
0.016
0.005
0.013
0.021
0.023
0.037
0.07
0.019
0.508
0.073
0
0
0.024
0.061
0
0.033
0
0
0
0.024
0.061
0
0.033
0
Reactivity indices
1
2
pfd0020
msp1_2-6
7.352358
msp1.19
3.234428 1.944241
ats
pfrh5
eba175
maebl
3
4
5
6
7
8
9
1.184618
2.544536
2.6447
2.6447 1.098854
1.909429
1.762076
0.016
0.04
0.055
0.394
0.041
0.023
0.028
0.221
0.045
0.017
0.031
0.027
0.021
0
0.024
0
0.078
0.226
0.015
0.186
0.012
med
desvpad cutoff
0.087 0.116116 0.319233
0.028333 0.024664 0.077662
0.05 0.030806 0.111612
0.217 0.181667 0.580335
0.027667 0.013013 0.053692
0.076667 0.094691 0.266048
0.013333 0.014048 0.041428
Result cDNA with gene specific oligos
msp3
A T S
msp4
+ - A
msp9
T S + -
A
T S
var (pfd0020c)
A T S
+* -
Rings
msp9
+ -
eba175
A T
surf4.1
S + - A T
S + -
pfsea1
A
T S + -
Trophs
*The pos. control of PFD0020c was forgotten (no gDNA)
Schizonts= Trophs + 8 h
(no photo)
You find the sizes of the Molecular weight
standard in your course script!