Francisco Pascoal
Ana Coelho
Sara Medinas
Coordenadora de
estágio: Margarida
Santana
A - Introdução
DNA
 Constituído por duas
cadeias de nucleótidos;
 Cada nucleótido tem uma
pentose, uma base fosfato,
e uma base azotada;
 Todos os nucleótido são
essencialmente iguais,
variando apenas a base
azotada.
DNA
 As duas cadeias formam
uma dupla hélice e têm
sentidos opostos, como
está evidenciado na figura.
 Os nucleótidos das cadeias
ligam-se através das bases
azotadas.
Adenina(A)-Timina(T)
Guanina(G)- Citosina (C)
DNA
As ligações G-C são triplas
(mais fortes)
As ligações A-T são duplas
(mais fracas)
Bactérias
Legenda:
1. DNA cromossómico;
2. Plasmídeos;
16s rDNA
O genoma bacteriano é constituído por cromossoma e plasmídeo, o DNA codificante
do RNA ribossomal (16s rDNA) está no cromossoma
Replicação do DNA é semi-conservativa
O PCR imita a replicação do DNA
O que é necessário para o PCR?
 DNTP (nucleótidos no meio de reacção);
 Iniciadores;
 Enzima (DNA polimerase termo estável, isolada
a partir de uma bactéria termofilica);
 Tampão com magnésio.
Após a primeira replicação
cada molécula de DNA
origina duas moléculas.
Consequentemente, a
quantidade de moléculas
formadas será 2ⁿ, sendo n o
número de replicações.
Com este processo e a partir
de pequenas quantidades de
DNA, obtemos grandes
quantidades – amplificação.
Nota:
São necessários dois
iniciadores, um “forward“
e um “reverse”.
Os iniciadores a utilizar
dependem da parte que se
quer amplificar.
No nosso caso,
utilizámos o P341 F-GC e
P518 R, que são primers
universais bacterianos. 1
Legenda:
1. Iniciador
2. DNTP
2
1. Desnaturação de DNA a alta temperatura (95ºC);
2. Descida de temperatura para os iniciadores se unirem à cadeia;
3. Subida à temperatura optima de extensão da DNA polimerase;
1,2 e 3, constituem um ciclo que é repetido 35 vezes.
DGGE
No final do PCR obtemos um único fragmento, mas que corresponde
a uma enorme quantidade de DNA de diferentes microrganismos.
Para os podermos separar usamos o DGGE
Como funciona?
Temos um gel com um gradiente de concentração de ureia,
(maior concentração em baixo do gel.)
A ureia vai desnaturar o DNA. Como temos diferentes
sequencias de DNA, umas com mais G-C do que outros, estas
vão oferecer maior resistência à desnaturação do que as ricas
em A-T.
As moléculas mais ricas em G-C migram mais, só desnaturando
na zona do gel com mais ureia.
B – Material e métodos
Micro pipetas
Para pipetar pequenos
volumes, as micro
pipetas são um utensílio
fundamental, que
tivemos de aprender a
utilizar correctamente.
Verificação do DNA
Em 1 está colocado um gel de agarose,
ligado a uma fonte de alimentação. No gel
colocámos as amostras de DNA recolhido.
O DNA migra do pólo negativo para o
positivo, separando-se de acordo com o seu
tamanho.
Como vamos ver as bandas de
DNA?
Usamos Brometo de Etidio, que
se intercala no DNA e é visível
sob UV.
1
Corrida do gel
Para evitar contaminações
as reacções de PCR são
preparadas numa câmara
previamente tratada com
UV.
Após a preparação das soluções,
fizemos o PCR no termociclador.
Preparação dos géis para o DGGE
3
2
4
1
Em 6 temos placas de vidro, onde
é depositado o gel, que deriva do
gradientador.
1.Placa de agitação
2.Agitadores magnéticos
3.Gradientador: dois tubos
que levam soluções com
diferente concentração de
ureia.
4. Bomba peristáltica.
6
Tina de eletroforece
Aqui é colocado o gel
C- Resultados
1. Marcador;
2. Amostra B (sem manganésio);
3. Amostra M (com manganésio);
Por comparação com o
marcador, podemos inferir
que a amostra B tem menos
concentração do que a
amostra M.
1
2
3
Após o PCR vêm-se bandas da região
amplificada, correspondente a um fragmento
de cerca de 200 Pb.
200pb
De novo, percebe-se que há mais
concentração de amostra B do que de M.
Migração dos fragmentos em DGGE
B
Sem manganésio
M
Marcador
Com
magnésio
D- Discussão
• É difícil visualizar as bandas da amostra
B, muito provavelmente devido à
quantidade de DNA presente.
•A banda assinalada na foto anterior não
existe em B e poderá corresponder a um
organismo que se adapta melhor a solos ricos
em manganésio
Também se conclui que temos poucos
microrganismos, ou seja, pouca
diversidade; o gel ao lado é exemplo dos
muitos microrganismos esperados em
solos “saudáveis”