Genómica
Licenciatura em Ciências Biomédicas
Departamento de Ciências da Saúde,
UCP
Fevereiro 2013
Sumário
• 1. Sequenciação
• Evolução histórica:
– O método de Sanger
– Sequenciação automática
– Sequenciação completa de genomas
• Aspetos técnicos das várias formas de sequenciação
– Preparação de fragmentos de DNA para sequenciação.
– Reação
– Deteção
• Aplicações dos resultados da sequenciação
Sequenciação
• O que é?
• Para que serve?
• Desafios?
• Eventos que permitiram a sequenciação:
–
–
–
–
Electroforese em acrilamida
PCR
Fluorimetria em capilares
Miniaturizãção
PERSPETIVA HISTÓRICA DAS
TÉCNICAS
3 grupos principais
Manual (Maxam & Gilber
e Sanger)
1975/1977
Automática
(Baseado
em Sanger)
1980’s
Massiva (Next
Generation)
2000
Sequenciação Manual
• Maxam e Gilbert
– Término de sequências em várias bases
• Sanger
– Síntese de sequências que terminam em cada
uma das 4 bases aleatroriamente
Sequenciação de Sanger
Sequenciação de Sanger
Sequenciação de Sanger
Sequenciação de Sanger
Sequenciação automática de Sanger
• Em vez de radioatividade usa-se fluorescência.
– Podem usar-se 4 fluorocromos diferentes
• Podem ler-se todas as reações num mesmo tubo
capilar (e.g citometria de fluxo) ou poço do gel de
eletroforese.
• Os detetores detetam cores diferentes no capilar ou
no gel.
• Os resultdos são interpretados pelo software
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Sequenciação automática de Sanger
© John Wiley & Sons, Inc.
Manual/Automatizada
Técnicas de sequenciação massiva
• Sequenciação por síntese de novo
• A síntese ocorre em dezenas de milhares de
fragmentos ao mesmo tempo.
• É retirada uma “foto” em cada passo de forma
a que se sabe como é que a sequencia
“cresce”
Um outro suporte são esferas
• Emulsion PCR
ASPETOS TÉCNICOS DAS VÁRIAS
FORMAS DE SEQUENCIAÇÃO
Construção de Bibliotecas
• Genómicas DNA library conjunto dos clones de
todos os fragmentos do genoma de um organismo.
• cDNA conjunto das regiões de um genoma expressas
num momento e/ou condição fisiológica.
© John Wiley & Sons, Inc.
Preparação do DNA
• Fragmentação
– Enzimas de restrição
– Radiação
• Amplificação
– Por clonagem (demorada e muito trabalhosa)
– Por PCR
APLICAÇÕES DOS RESULTADOS DE
SEQUENCIAÇÃO
Aplicações
• Conhecimento da diversidade
• Aplicações individualizadas
Bibliografia
• Korf, Bruce & Irons, Mira (2013) Human
Genetics and Genomics 4th edition John Wiley
& Sons (Ltd). ISBN-13: 978-0-470-654477.
Capítulo 14
• Artigos disponibilizados aos alunos na pasta
da intranet relativa à Genómica.
• Snustad Principles of genetics. Capítulo 15
Secção de sequanciação