UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
LILIANE MOREIRA SILVA GOMES
UTILIZAÇÃO DE CO-PRODUTOS DA MAMONA ASSOCIADOS À
CADEIA PRODUTIVA DO BIODIESEL NA EXPRESSÃO DA
CAPACIDADE PRODUTIVA E REPRODUTIVA EM CAPRINOS E
OVINOS NO NORDESTE BRASILEIRO
FORTALEZA
2013
LILIANE MOREIRA SILVA GOMES
UTILIZAÇÃO DE CO-PRODUTOS DA MAMONA ASSOCIADOS À
CADEIA PRODUTIVA DO BIODIESEL NA EXPRESSÃO DA
CAPACIDADE PRODUTIVA E REPRODUTIVA EM CAPRINOS E
OVINOS NO NORDESTE BRASILEIRO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de pesquisa: Reprodução e Sanidade de pequenos
Ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. Davide Rondina.
FORTALEZA
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário(a) Responsável –Thelma Marylanda Silva de Melo- CRB-3 / 623
G633u
Gomes, Liliane Moreira Silva
Utilização de co-produtos da mamona associados à cadeia produtiva
do biodiesel na expressão da capacidade produtiva e reprodutiva em
caprinos e ovinos no nordeste brasileiro/ Liliane Moreira Silva Gomes . —
2013.
CD-ROM. 217 f.:il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho
acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará, Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias, Doutorado em Ciências Veterinárias,
Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientação: Prof. Dr. Davide Rondina.
1. Ricinus communis L. 2. Subproduto. 3. Desempenho produtivo e
reprodutivo. 4. Cabra. 5. Ovelha.. I. Título.
CDD: 636.39
Ao meu esposo, Cleidson Manoel Gomes da
Silva e aos meus Pais, Vilmar Ferreira da
Silva e Wânia de Paiva Moreira.
Dedico
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará (UECE), em especial ao Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) que através de sua equipe de funcionários,
professores, secretários e coordenadores, muito contribuíram para minha formação
profissional.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
auxílio financeiro na forma de bolsa de estudo, indispensável para a realização desse trabalho.
Ao Núcleo de Atenção Médica Integrada – Nami, pertencente à Universidade de
Fortaleza (UNIFOR), em especial ao Dr. Nilton Cesar Weyne da Cunha e a técnica Maria
Helena Ripardo Carneiro, pela realização das análises hormonais.
A toda a equipe do Laboratório de Biologia Molecular e do Desenvolvimento,
pertencente à UNIFOR, aos professores Marcelo Bertolini e Luciana Relly Bertolini, e aos
colegas Kaio César Simiano Tavares, Débora Barbosa Rios, Igor de Sá Carneiro, Luís
Henrique de Aguiar, Leonardo Tondello Martins, Carlos Enrique Mendés Calderón, Saul
Gaudencio Neto e Cristiano Feltrin, em especial a Cícera Regina Lazzarotto. A todos muito
obrigada pele imensa ajuda durante execução do experimento.
Ao colégio Padre João Piamarta, em especial ao Lino e aos funcionários Luciano,
Carlinhos e Antônio por terem cedido os animais, fornecido alojamento durante toda fase
experimenal e contribuído na execução do experimento, sempre cuidando dos animais
experimentais e auxiliando nas atividades executadas.
A professora Tânia Vasconcelos Cavalcante, por ter me incentivado a ingressar na
área acadêmica e pela grande amizade.
Ao meu orientador, Davide Rondina, pela orientação, ensino, cobrança e auxílio
durante todo meu doutorado.
A todos os componentes e ex-componetes do Laboratório de Nutrição e Produção de
Ruminantes (LANUPRUMI), em especial a Aline Maia Silva, César Carneiro Linhaes
Fernandes, Fabiana Vinhas Rodrigues, que sempre me ajudaram durante o experimento e pela
amizade construída. Em especial, ao Cláudio que esteve presente em todas as etapas do meu
experimento, alias do nosso experimento.
Aos meus colegas, Simone Vieira Castro, Eudes Veira Castro, Oscar de Oliveira
Brasil, Adeline de Andrade Carvalho e Luciana Rocha Faustino, pelo convívio e amizade
durante todo este período.
À minha família, em especial a minha avó Alivercina de Paiva Moreira e meu tio in
memória, Carlos Mouzart Moreira. Amo vocês.
Aos meus pais, Vilmar Ferreira da Silva e Wânia de Paiva Moreira, que sempre me
apoiaram em todas as decisões que tomei. Meu eterno amor.
Ao meu esposo, Cleidson Manoel Gomes da Silva, sempre presente em todos os
momentos. Muito obrigada por fazer parte da minha vida.
E a Deus o meu guia, “Sois meu refúgio e minha cidadela, meu Deus, em que eu
confio”, “Pois que se uniu a mim, eu o livrarei; e o protegerei, pois conhece o meu nome.”
Salmo 91.
RESUMO
Objetivou-se com o presente estudo avaliar as características produtivas e reprodutivas de
cabras e ovelhas alimentadas com farelo de mamona antes e após o tratamento de
detoxificação, por diferentes períodos. Para tanto, foram utilizadas 60 cabras e 56 ovelhas
adultas pluríparas, cíclicas e com idade, peso e condição de escore corporal homogênea. Os
experimentos foram divididos em quatro fases. Na primeira fase (gestação): foram avaliados a
taxa de gestação, os níveis de progesterona e o desenvolvimento embrionário/fetal inicial em
cabras (alimentadas com farelo de mamona detoxificado ou não) e em ovelhas (alimentadas
com farelo de mamona detoxificado). Na segunda fase (pós-parto): foi verificado em cabras e
ovelhas o efeito da ingestão de farelo de mamona detoxificado sobre a produção de leite,
atividade luteal, perfil metabólico e desempenho das crias. Na terceira fase (abate): foram
avaliadas as características da carcaça, a composição centesimal e o perfil de ácidos graxos no
lombo de ovelhas alimentadas com farelo de mamona detoxificado. Na quarta fase
(desempenho reprodutivo in vitro): avaliou o efeito da ingestão por longo período de mamona
detoxificado em ovinos sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais e a
capacidade de desenvolvimento de oócitos de folículos antrais e em caprinos sobre os níveis
de RNAm para diferentes genes no oócito, células da granulosa murais e células cumulus. Em
ambas as espécies, não houve efeito do tipo de dieta sobre a resposta à sincronização de estro,
níveis plasmáticos de progesterona, taxa de concepção e desenvolvimento embrionário/fetal.
Além disso, o tipo de dieta não afetou a prolificidade, a atividade luteal, a produção de leite e
o desenvolvimento das crias em ovelhas. Nesta mesma espécie foi observado que o uso farelo
de mamona detoxificado por longos períodos não afetou a foliculogênese pré-antral e antral,
bem como as características de carcaça. No entanto, os níveis do ácido heptadecanoico foram
menores (P<0,05) em animais alimentados com farelo de mamona detoxificado. Em cabras, a
ingestão por um longo período de farelo de mamona detoxificado diminuiu (P<0,05) a taxa de
maturação dos oócitos e alterou os níveis de mRNA para diferentes genes em oócitos
imaturos e nas células do cumulus. O farelo de mamona detoxificado pode ser utilizado como
uma fonte alternativa de proteína para ovelhas. Por outro lado, sua utilização por prolongados
períodos interferiu negativamente no ganho de peso das crias e no desempenho reprodutivo in
vitro das cabras, indicando que seu uso deve ser realizado com cautela, especialmente em
cabras submetidas a técnicas de reprodução assistida.
Palavras-chave: Ricinus communis L. Subproduto. Desempenho produtivo e reprodutivo.
Cabra. Ovelha.
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the productive and reproductive traits of goats and
sheep fed with castor meal before and after detoxification treatment for different periods.
Therefore, 60 and 56 adult pluriparous goat and sheep, respectively, were used. All animals
were cyclic and had homogenous age, body weight and body condition. The experiments
were divided into four phases. In the first phase (pregnancy): were evaluated the pregnancy
rates, levels of progesterone and the initial embryonic/fetal development of goat (fed with
detoxified castor meal or not) and sheep (fed with detoxified castor meal). In the second phase
(postpartum): were evaluated the effect of ingestion of detoxified castor meal on milk
production, luteal activity and performance of offspring in goat and sheep. In the third phase
(slaughter): were evaluated the carcass characteristics, the centesimal composition and the
fatty acid profile of loin in sheep fed with or without detoxified castor meal. In the fourth
phase (in vitro reproductive performance): we evaluated the effect of the ingestion of
detoxified castor meal for long period in sheep on in vitro development of preantral follicles
and on the developmental competence of oocytes from antral follicles and in goats on mRNA
levels for different genes in the oocyte, mural granulosa cells and cumulus cell. In both
species, there was no effect of the type of diet on estrus synchronization, plasmatic
progesterone levels, conception rate and embryo/fetal development. In addition, the type of
diet did not affect the prolificacy, luteal activity, milk production and development of
offspring in sheep. In the same specie was observed that the use detoxified castor meal for
long did not affect preantral and antral folliculogenesis, as well as carcass characteristics.
However, the heptadecanoic acid levels were lower (P<0.05) in animals fed with detoxified
castor bean meal. In goats, the ingestion of detoxified castor meal for long period decreased
(P<0.05) oocyte maturation rate and altered mRNA levels for different genes in immature
oocyte and cumulus cells. The detoxified castor meal can be used as an alternative protein
source in sheep diet. On the other hand, its use for prolonged periods negatively affected the
weight gain of offspring and in vitro reproductive performance of goats, indicating that
detoxified castor bean meal should be applied with caution, especially for goats undergoing
assisted reproduction techniques.
Keywords: Ricinus communis L. Byproduct. Productive and reproductive performance. Goat.
Sheep.
LISTA DE FIGURAS
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1 -
Evolução da produção de biodiesel no Brasil. Fonte: Superintendência de
Refino, Processamento de Gás Natural e Produção de Biocombustíveis –
ANP (2012)..................................................................................................... 25
Figura 2 -
Produção de óleo de mamona no Brasil. Fonte: adaptado de CONAB
(2012).............................................................................................................. 29
7 CAPÍTULO 2
Figure 1 -
Protocol for oestrus synchronization and blood sample collection to
measure P4, IgG and metabolites levels in goats fed without castor meal,
with castor meal and detoxified castor meal. PGF2α: prostaglandin; P4:
progesterone………………………………………………………………… 87
Figure 2 -
Plasma P4 concentrations in pregnant goats fed diets without castor meal
(WCM), with detoxified castor meal (DCM) and with castor meal (CM),
that had single and multiple births, up to day 20 after CIDR removal.
Values are means ± SE (standard error). ANOVA results for the effects of
diet, time and the interaction diet vs. time are represented in the
figure.……………………………………………………………………….. 88
Figure 3 -
Plasma concentrations of urea, LDH, AST and GGT in pregnant goats with
single and multiple births fed diets without castor meal (WCM), with
detoxified castor meal (DCM) and with castor meal (CM). ANOVA results
for the effects of diet, time and the interaction diet vs. time are represented
in the figure……………………………………………………..…………... 89
8 CAPÍTULO 3
Figure 1 -
Plasma concentrations of urea, NEFA, glucose, urea, creatinine and protein
in goats fed diets without detoxified castor meal (WDCM) and with
detoxified castor meal (DCM). A,B P < 0.05 comparison between diets.
ANOVA results for the effects of diet, time, type of parturition and the
interaction diet vs. time, and diet vs. type of parturition are represented in
the figure. Values are given as means ± SEM.……………………………...
107
Figure 2 -
Plasma concentrations of bilirubin, albumin, cholesterol, triglycerides and
TGO in goats fed diets without detoxified castor meal (WDCM) and with
detoxified castor meal (DCM). A,B P < 0.05 comparison between diets.
ANOVA results for the effects of diet, time, type of parturition and the
interaction diet vs. time, and diet vs. type of parturition are represented in
the figure. Values are given as means ± SEM................................................
108
9 CAPÍTULO 4
Figure 1 -
Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on
the relative expression of genes related to quality, metabolism, oxidative
stress and apoptosis in goat immature oocytes...............................................
Figure 2 -
134
Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on
the relative expression of genes related to the quality of goat oocytes in
metaphase II (MII) or not competent (NC) oocytes………………………...
Figure 3 -
135
Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on
the relative expression of genes related to metabolism in goat oocytes in
metaphase II (MII) or not competent (NC) oocytes………………………
Figure 4 -
136
Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on
the relative expression of genes related to oxidative stress and apoptosis in
goat oocytes in metaphase II (MII) or not competent (NC) oocytes………..
Figure 5 -
137
Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on
the relative expression of genes related to endocrine function, metabolism
and oxidative stress in granulosa cells............................................................ 138
Figure 6 -
Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on
the relative expression of genes related to endocrine function, metabolism
and oxidative stress in cumulus cells.............................................................. 139
10 CAPÍTULO 5
Figure 1 -
Blood concentrations of metabolites during pregnancy and at slaughter in
ewes supplemented for long period without (WDCM) or with (DCM)
detoxified castor meal. Values are given as means±SEM. Statistically
significant effect of Diet and Time treatments and Interaction given in the
figure referred to 0 versus 75 days of feeding……………...……………….
154
Figure 2 -
Profile of plasma progesterone during 60 days post-partum of ewes fed for
long period without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal.
Values are given as means±SEM. Statistically significant effect of Diet,
Time treatments and Interaction are shown in the figure………...................
156
11 CAPÍTULO 6
Figure 1 -
Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles in
non cultured tissue and after in vitro culture for one or seven days in
animals fed with soybean meal (control) and detoxified castor meal.
a,b
Differs significantly among the culture periods in the same treatment
groups (P < 0.05)………………………………….……………………........... 181
Figure 2 -
Percentage (mean ± SD) of primordial (A), intermediate (B), primary (C)
and secondary (D) follicles in non cultured tissue (day 0) and after in vitro
culture for one or seven days after animals were fed with soybean meal
(control) and detoxified castor meal.
a,b,c
Differs significantly among the
culture periods in the same treatment group (P < 0.05).
A,B
Differs
significantly among treatment in the same duration of culture (P < 0.05)….
Figure 3 -
182
Viability of preantral follicles in non cultured tissue (Day 0) or after seven
days of in vitro culture (Day 7) from animals fed with soybean meal
(control) and detoxified castor meal.
a,b
Differs significantly between
culture duration in the same treatment group (P < 0.05)……………………
Figure 4 -
183
(A) Isolated viable preantral follicle labeled by calcein-AM (green). (B)
Isolated non-viable preantral follicle labeled with ethidium homodimer-1
(red). (C and D) Isolated preantral follicles after seven-day culture from
animals fed with soybean meal (control). (E and F) Isolated preantral
follicles after seven-day culture from animals fed with detoxified castor
meal…………………………………………………………………………. 184
Figure 5 -
Sheep embryos obtained by parthenogenesis after 5 days of in vitro
culture. (A) Soybean meal (control). (B) Detoxified castor meal..................
185
LISTA DE TABELAS
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1 -
Composição química dos principais resíduos produzidos durante a extração
do biodiesel. Fonte: adaptado de Abdalla et al. (2008)...................................
31
6 CAPÍTULO 1
Tabela 1 -
Principais efeitos dos desreguladores endócrinos sobre maturação oocitária
em função da espécie estudada........................................................................
Tabela 2 -
66
Distribuição geográfica da literatura sobre o efeito dos desreguladores
endócrinos na função reprodutiva...................................................................
67
7 CAPÍTULO 2
Table 1 -
Proportion of the diet ingredientes in dry matter basis………………...……
85
Table 2 -
Chemical composition of diets………………………………………………
86
Table 3 -
Concentration of progesterone (P4) on day of CIDR removal and
reproductive performance of goats fed diets without castor meal (WCM),
with
detoxified
castor
meal
(DCM)
and
with
castor
meal
(CM)....………………………………………………………………………
Table 4 -
90
Embryonic/fetal growth rate (mm/day) in goats fed diets without castor
meal (WCM, n=18), with detoxified castor meal (DCM, n=20) and with
castor meal (CM, n=20), that showed single and multiple births……...……
Table 5 -
91
Plasma concentrations of different metabolites in animals negative for
diagnosis of pregnancy………………………………………………………
92
8 CAPÍTULO 3
Table 1 -
Ingredient composition of diets………………………………...……………
Table 2 -
Body weight (BW), body condition (BC), loin area (LA), sternal fat
109
thickness (STFT), reproductive parameters and milk yield in goats fed diets
without detoxified castor meal (WDCM) and with detoxified castor meal
(DCM). Values are given as means ± SEM………………………………...
110
Table 3 -
Milk quality traits in goats fed diets without detoxified castor meal
(WDCM) and with detoxified castor meal (DCM). Values are given as
means ± SEM………………………………………………………………..
Table 4 -
111
Body weight (BW), daily weight gain, loin area and loin subcutaneous fat
thickness (SFT) in kids derived from goats fed diets without detoxified
castor meal (WDCM) and with detoxified castor meal (DCM). Values are
given as means ± SEM………………………………………………………
112
9 CAPÍTULO 4
Table 1 -
Composition of the concentrate-based supplements………………………...
130
Table 2 -
Composition of the diets…………………………………………………….
131
Table 3 -
Sequence of PCR primers, TaqMan probes, and GenBank accession codes..
132
Table 4 -
Number of follicles, total number of oocytes recovered per goat, mean
number of non-viable and viable (G-I, -II and -III) oocytes and maturation
rates in goats fed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM).
Values are means ± SE………………………………………………………
133
10 CAPÍTULO 5
Table 1 -
Ingredient composition of the concentrate - based supplements…………….
144
Table 2 -
Ingredient composition of diets…………………………………………...…
145
Table 3 -
Reproductive and productive performance of ewes supplemented for a long
period without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal…………...
Table 4 -
149
Levels of progesterone (ng/mL) after estrus synchronization period in ewes
supplemented for long period without (WDCM) or with (DCM) detoxified
castor meal…...………………………………………………………………
Table 5 -
Embryonic/fetal development in ewes supplemented for long period
without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal………………….
Table 6 -
151
Concentrations of blood metabolites during post-partum in ewes fed for
long period without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal……...
Table 7 -
151
155
Anatomic and carcass parameters of ewes at 429 days of supplementation
without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal…………………..
157
Table 8 -
Dissection and centesimal composition of longissimus dorsi muscle of
ewes at 429 days of supplementation without (WDCM) or with (DCM)
detoxified castor meal…………………………………………………….…
Table 9 -
158
Means and standard errors for the quantification of fatty acids in the lipid
extract of the loin at 429 days of supplementation without (WDCM) or
with (DCM) detoxified castor meal…………………………………………
158
11 CAPÍTULO 6
Table 1 -
In vitro embryo production after fertilization or parthenogenesis…………..
186
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% - Percentual
< - Menor
> - Maior
± - Mais ou menos
® - Registro
µL - Microliter (Microlitro)
µm - Micrometer (Micrômetro)
acetil-CoA - Acetil-coenzima A
AD - Abdominal diameter (Diâmetro abdominal)
AL - albumin (Albumina)
ALT - Alanina aminotransferase
ANOVA - Analysis of variance (Análise de variância)
ANP - Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC - Association of Official Analytical Chemists
AST - Aspartate aminotransferase
ATP - Trifosfato de adenosina
BC - Body condition (Condição corporal)
BMP15 - Bone morphogenetic protein 15 (Proteína morfogenética óssea 15)
BPD - Biparietal diameter (Diâmetro biparietal)
BSA - Bovine serum albumin (Albumina sérica bovinaa)
BW - Body weight (Peso corporal)
CaO - Calcium oxide (Óxido de cálcio)
CCOs - Complexos cumulus oócitos
CE - Ceará
CEC - Condição do escore corporal
CEUA - Comitê de Ética para o Uso de Animais
CIDR - Controlled internal drug release
CL - Corpus luteus (Corpo lúteo)
CM - Castor meal (Farelo de mamona)
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2 - Carbon dioxide (Dióxido de carbono)
COCs - Cumulus oocyte complexes (Complexos cumulus oócitos)
CONAB - Companhia Nacional de Abastecimento
CONAMA - Conselho Nacional do Meio Ambiente
CP - Crude protein (Proteína bruta)
CRL - Crown-rump length (Comprimento crânio-caudal)
CT - Cholesterol (Colesterol)
Cu - Cobre
D - Diet (Dieta)
D.O.U. - Diário Oficial da União
DCM - Detoxified castor meal (Farelo demamona detoxificado)
DE - Desreguladores endócrinos
DFA - Desirable fatty acids (Ácidos graxos desejáveis)
DLD - Depth of longissimus dorsi (Profundidade do longissimus dorsi)
DM - Dry matter (Matéria seca)
DNA - Ácido desoxirribonucléico
ED - Endocrine disruptors (Desreguladores endócrinos)
EFSA - European Food Safety Authority (Autoridade Europeia para a Segurança Alimentar)
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EMPARN - Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte
EUA - Estados Unidos da América
FATEC - Universidade de Tecnologia do Sertão Central
FBS - Fetal bovine serum (Soro fetal bovino)
FDM - Farelo de mamona detoxificado
FDN - Fibra em detergente neutro
Fig - Figure (Figura)
FIV - Fertilização in vitro
FM - Farelo de mamona
FSH - Follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante)
FSHR - Follicle stimulating hormone receptor (Receptor do hormônio folículo estimulante)
FUNCAP - Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
g - Grama
g/d - Grama por dia
g/dL - Grama por decilitro
g/kg - Grama por kilograma
GDF9 - Growth diferentiation factor 9 (Fator de crescimento e diferenciação 9)
GGT - Gamma glutamyl transferase (gama-glutamil transferase)
G-I, II, III, IV - Grade-I, II, III, IV (Grau-I, II, III, IV)
GL - Glucose (Glicose)
GLUT1 - Glucose transporter 1 (Transportador de glicose 1)
GnRH - Hormônio liberador de gonadotrofinas
GOT - Glutamic oxaloacetic transaminase (Transaminase glutâmico-oxalacética)
GPT - Glutamic pyruvic transaminase (Transaminase glutâmico-pirúvica)
h - Horas
ha - Hectare
HCl - Ácido clorídrico
HSP70 - 70 Kilodalton heat shock proteins (Proteína de choque térmico 70)
IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia
IGF1 - Insulin-like growth fator 1 (Fator de crescimento semelhante à insulina 1)
IGF1R - Insulin-like growth fator 1 receptor (Receptor do fator de crescimento semelhante à
insulina 1)
IgG - Immunoglobulin G (Imunoglobulina G)
ITS - Insulin, tranferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio)
IU/L - Units per litre (Unidades por litro)
IVF - In vitro fertilization (Fertilização in vitro)
kg - Kilograma
kg/d - Kilograma por dia
kg/kg - Kilograma por kilograma
L - Liter (Litro)
LAMOFOPA - Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais
LANUPRUMI - Laboratório de Nutrição e Produção de Ruminantes
LDH - Lactate dehydrogenase (Lactato desidrogenase)
LEA - Loin-eye área (Área de olho de lombo)
LeptinaR - Receptor de Leptina
LH - Luteinizing hormone (Hormônio luteinizante)
LHR - Luteinizing hormone receptor (Receptor do hormônio luteinizante)
m - Meter (metro)
mA - Miliampère
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
máx - Máximo
MEIA - Microparticle enzyme immunoassay (Imunoensaio enzimático de micropartículas)
MEM - Minimum Essential Medium (Méio essencial mínimo)
mg - Miligrama
mg/dia - Miligrama por dia
mg/dL - Milligrams per decilitre (Miligrama por decilitro)
mg/kg - Miligrama por kilograma
mg/kg/dia - Miligrama por kiligrama por dia
MII - Metáfase II
min - Mínimo
min - Minuto
mM - Milimolar
mm - Millimeter (Milímetro)
MMA - Ministério do Meio Ambiente
mm/day - Millimeter per day (Milímetro por dia)
mm2 - Square millimeter (Milímetro quadrado)
MnSOD - Manganese superoxide dismutase (Magnésio superóxido desmutase)
MS - Matéria seca
MSFA - Monosaturated fatty acids (Ácido graxo monosaturado)
MUFA - Monounsaturated fatty acids (Ácido graxo monoinsaturado)
n - Número
NEFA - Ácido graxo não esterificado
ng/dL - Nanogram per deciliter (Nanograma por decilitro
ng/mL - Nanogram per Milliliter (Nanograma por mililitro)
NP - Non-pregnant (Não gestante)
NRC - National Research Council (Conselho Nacional de Pesquisa)
ns - Not significant (Não singificativo)
º - Grau
º C - Graus Celsius
P - Pregnant (Gestante)
p - probability (Probabilidade)
P4 - Progesterone (Progesterona)
PB - Proteína bruta
PBS - Phosphate buffer saline (Tampão fosfato salina)
PGF2α - Prostaglandin F2α (Prostaglandina F2α)
pH - Potential of hydrogen (Potencial de hidrogênio)
PNPB - Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel
PPGCV - Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias
ppm - Parte por milhão
proc - Processo
PSFA - Polysaturated fatty acids (Ácido graxo polisaturado)
PUFA - Polyunsaturated fatty acids (Ácido graxo poliinsaturado)
qPCR - Quantitative polymerase chain reaction (Reação em cadeia de polimerase
quantitativa)
RDC - Resolução da Diretoria Colegiada
RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia
rFSH - Recombinant follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante
recombinante)
RIISPOA - Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal
RNA - Ribonucleic acid (Ácido ribonucléico)
RNAm - Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)
S - South (Sul)
SAS - Statistical Analysis System (Sistema de análises estatísticas)
SD - Standard deviation (Desvio padrão)
SDA - Secretaria do Desenvolvimento Agrário
SE - Standard error (Erro padrão)
SEM - Standard error medium (Erro padrão da média)
SFA - Saturated fatty acids (Ácido graxo saturado)
SFM - Sem farelo de mamona
SFT - Subcutaneous fat thickness (Espessura de gordura subcutânea)
Sig - Significant (Significância)
SNK - Student Newman Keuls
SOF - Synthetic oviduct fluid (Fluido sintético de oviduto)
T - Time (Tempo)
TCM - Tissue Culture medium (Meio de cultivo de tecido)
TD - Thoracic diameter (Diâmetro tarácico)
TDN - Total digestible nutrients (Nutrientes digestíveis totais)
TG - Triglycerides (Triglicerídeos)
TP - Total protein (Proteína total)
UECE - Universidade Estadual do Ceará
UFA - Unsaturated fatty acids (Ácido graxo insaturado)
UI/L - Units per litre (Unidades por litro)
UK - United Kingdom (Reino Unido)
UNIFOR - Universidade de Fortaleza
UR – Urea (Úreia)
V - Volts
VD - Vesicle diameter (Diâmetro de vesícula)
VGBD - Oócitos com quebra da vesícula germinativa
vs - Versus
W - West (Oeste)
WCM - Without castor meal (Sem farelo de mamona)
WDCM - Without detoxified castor meal (Sem farelo de mamona detoxificado)
μM - Micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 23
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 24
2.1
BIODIESEL
NO
BRASIL:
PERSPECTIVA
DE
DESENVOLVIMENTO
ECONÔMICO E REDUÇÃO DO IMPACTO AMBIENTAL ........................................... 24
2.2 IMPLEMENTAÇÃO DO BIODIESEL NO NORDESTE DO BRASIL ...................... 26
2.2.1 Principais oleaginosas utilizadas na produção do biodiesel ................................ 26
2.3 UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS DO BIODIESEL NA ALIMENTAÇÃO ANIMAL .. 30
2.3.1 Glicerina .............................................................................................................. 31
2.3.2 Farelo de soja ....................................................................................................... 33
2.3.3 Farelo e/ou torta de girassol................................................................................. 34
2.3.4 Farelo e/ou torta babaçu ...................................................................................... 35
2.3.5 Farelo e/ou torta de algodão ................................................................................ 36
2.3.6 Farelo e torta de dendê......................................................................................... 37
2.3.7 Farelo e/ou torta de mamona ............................................................................... 38
3 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 41
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS ............................................................................................. 43
5 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 44
5.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 44
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 44
6 CAPÍTULO 1 - Impacto dos contaminantes ambientais sobre a saúde reprodutiva de
fêmeas ruminantes .................................................................................................................. 45
7 CAPÍTULO 2 - Use of castor meal (Ricinus communis L.) as source of dietary protein
in goats during the mating period: impact on reproductive and metabolic responses .... 69
8 CAPÍTULO 3 - Metabolic stress and reproductive features in peripartum goats
supplemented for long period with detoxified castor meal as source of dietary nitrogen.
.................................................................................................................................................. 93
9 CAPÍTULO 4 - Comparative expression profile of genes related to oocyte development
in goat fed with residues of biodiesel castor industry by long-period.............................. 113
10 CAPÍTULO 5 - Reproductive responses and productive characteristics in ewes
supplemented with detoxified castor meal for long period ............................................... 140
11 CAPÍTULO 6 - In vitro development of ovine preantral follicles and oocyte cleavage
rate are not affected by long-term ingestion of detoxified castor meal ........................... 164
12 CONCLUSÕES................................................................................................................ 187
13 PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 188
14 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 189
15 ANEXO I (Comitê de ética I).......................................................................................... 216
16 ANEXO II (Comitê de ética II) ...................................................................................... 217
23
1 INTRODUÇÃO
A alimentação inadequada é um dos fatores que limita o potencial produtivo e
reprodutivo dos pequenos ruminantes. Essa realidade se agrava, principalmente, naqueles
rebanhos que dependem de pastagens naturais como sua principal fonte de nutrientes, pois
estas possuem a produção e a qualidade sujeitas a fatores climáticos. Neste sentido, o uso de
alimentos alternativos, como resíduos ou subprodutos agroindustriais, pode minimizar os
efeitos negativos da época seca nos animais e consequentemente às grandes perdas
econômicas. De encontro a essa problemática, destaca-se o enorme volume de subprodutos
gerados na agroindústria do Brasil, que possibilitam uma ampla flexibilidade na formulação
de rações para ruminantes, uma vez que esses podem conter na sua composição elementos
característicos ou complementares contribuindo para um ajuste mais rigoroso das dietas
animais.
No Brasil não existem estatísticas satisfatórias sobre a utilização de subprodutos em
rações de ruminantes. No entanto, ao levar em consideração a produção, a área cultivada e os
subprodutos obtidos a partir de algumas culturas na produção agroindustrial brasileira, é
possível imaginar o grande potencial que a inclusão de alguns subprodutos exerce sobre a
formulação de rações para animais. Na região Nordeste do Brasil, a agroindústria do biodiesel
gera um grande volume de subprodutos, especialmente a partir da semente da mamona
(Ricinus communis). É estimado que para cada tonelada de óleo extraído, são produzidos 1,2
toneladas de farelo de mamona (AZEVEDO et al., 1997). Inicialmente não se cogitava a
utilização destes subprodutos na alimentação animal devido à presença de uma toxina de
natureza protéica capaz de inativar a síntese de proteínas denominada ricina (EFSA, 2008).
No entanto, alguns estudos tem demonstrado que é possível inativar a ricina (ANANDAN et
al., 2005), tornando os subprodutos da mamona seguro para serem utilizados na alimentação
animal (DINIZ et al., 2011). Recentemente, diversos estudos avaliaram o efeito da utilização
de subprodutos da mamona na alimentação de ruminantes (MENEZES et al., 2012; POMPEU
et al., 2012). Contudo, ainda não existem evidências conclusivas quanto ao período de
alimentação e níveis de inclusão dos subprodutos da mamona, seja detoxificado ou não, na
dieta de ruminantes, principalmente do ponto de vista reprodutivo.
Com a finalidade de mostrar as razões e contribuições científicas e tecnológicas desta
pequisa, serão descritos a seguir, os principais aspectos relacionados com a implementação do
biodiesel no Brasil, principalmente na região Nordeste, enfatizando a utilização dos resíduos
do biodiesel na alimentação de ruminantes.
24
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 BIODIESEL NO BRASIL: PERSPECTIVA DE DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO
E REDUÇÃO DO IMPACTO AMBIENTAL
A extração e utilização do petróleo fóssil tem gerado altos custos aos cofres públicos e
intensificado às discussões no que se refere aos impactos ambientais decorrentes da queima
deste tipo de combustível. Estas questões tem contribuído n o estudo e elaboração de políticas
públicas voltadas à produção e ao uso de fontes renováveis de energia, em particular o
biodiesel. Diante disso, muitos países adotaram políticas de apoio à produção e ao uso de
biocombustíveis. Essas políticas são destinadas a aumentar a segurança energética nacional,
estimular o desenvolvimento econômico, reduzir a dependência de combustíveis fósseis e
consequentemente às emissões de gases causadores do efeito estufa e outros poluentes. O
biodiesel é um biocombustível biodegradavel, não tóxico com baixa liberação de gases e
assim considerado um combustível ecológico, podendo promover uma redução substancial na
emissão de monóxido de carbono e de hidrocarbonetos quando utilizado em substituição ao
diesel convencional (DEMIRBAS, 2008).
No Brasil, a partir dos anos 2000, foi elaborada uma série de programas e de políticas
públicas, cujo objetivo principal era estimular a produção e o uso do biodiesel no mercado
nacional. O Brasil tem se destacado dentre os diversos países que se dedicam a realizar
estudos na área da produção de biocombustíveis (etanol e biodiesel). Entretanto, somente em
dezembro de 2004 é que de fato o governo brasileiro conseguiu lançar um programa que
tivesse grandes repercussões na estrutura produtiva do biodiesel, o Programa Nacional de
Produção e Uso de Biodiesel (PNPB), cujo objetivo era estimular a produção de biodiesel e
principalmente integrar a agricultura familiar. Além disso, em janeiro de 2005 através da lei
11.097 o governo federal começou a incluir o biodiesel ao diesel convencional em proporções
graduais. Em 2005 foi determinada a inclusão voluntária de 2% de biodiesel ao óleo diesel
comercializado até 2007, já a partir de 2008, essa adição de 2% passou a ser obrigatória. Entre
2008 a 2012, foi sugerida a inclusão de 5% de biodiesel ao óleo diesel comercial, passando a
ser obrigatório a partir de 2013 (Resolução ANP 07/08). No entanto em janeiro de 2010 a
adição de 5% de biodiesel no diesel comercial passou a ser obrigatória, conforme Resolução
nº 6/2009 do Conselho Nacional de Política Energética (CNPE), publicada no Diário Oficial
da União (DOU) em 26 de outubro de 2009.
25
Com a concessão do Selo Combustível Social pelo Ministério do Desenvolvimento
Agrário aos produtores de biodiesel que adquirem percentuais mínimos de matéria-prima de
agricultores familiares, o governo atribui redução parcial ou total de tributos federais, acesso a
melhores condições de financiamento, além de poderem concorrer a 80% do volume total
negociado nos leilões de biodiesel (D.O.U. de 7.12.2004, seção 1, páginas 2 e 3). Estas
medidas tem estimulado fortemente a produção de biodiesel no Brasil, que vem crescendo
significativamente nos últimos anos, sendo estimada uma produção de 3,0 bilhões de litros em
2013 (Figura 1). Esse resultado credencia o Brasil como um dos maiores mercados mundiais
de biodiesel, juntamente com a Alemanha e os Estados Unidos.
Figura 1 - Evolução da produção de biodiesel no Brasil. Fonte: Superintendência de Refino,
Processamento de Gás Natural e Produção de Biocombustíveis – ANP (2012).
Apesar do grande potencial econômico do biodiesel, durante sua extração são gerados
diversos resíduos que se não aproveitados de forma coreta pode inviabilizar toda a cadeia
produtiva. Alguns órgãos fiscalizadores tem se mobilizado e constantes revisões tem ocorrido,
buscando resoluções ligadas a estas questões. A resolução da RDC ANVISA 306/04, e a
resolução 358/05 do CONAMA, são exemplos de órgãos fiscalizadores que classificam,
propõem tratamentos e indicam formas de manipulação e descarte de resíduos agroindustriais.
Os resíduos do biodiesel, assim como todo resíduo agroindustrial, após serem gerados,
necessitam de destino adequado, pois não podem ser acumulados indefinidamente no local em
que foi produzido. No entanto, grande parte destes resíduos é lançada indiscriminadamente no
26
meio ambiente. Esta prática por longos períodos favorece a maximização de contaminantes
ambientais e alimentares, que podem afetar negativamente a saúde reprodutiva de animais e
humanos, gerando grandes preocupações entre comunidades científicas, bem como no âmbito
da saúde pública (ver detalhes sobre os principais impactos dos contaminantes ambientais na
saúde reprodutiva no artigo de revisão apresentado no Capítulo 1 da presente Tese).
De acordo com Timofiecsyk e Pawlowsky (2000), o termo resíduo deve ser utilizado
em sentido amplo, englobando não somente sólidos como também os efluentes líquidos e os
materiais presentes nas emissões atmosféricas. Entretanto, após a extração do biodiesel, os
resíduos são predominantemente sólidos e algumas vezes são denominados “erroneamente”
de lixo. Segundo Demajorivic (1995), resíduos sólidos diferenciam-se do termo lixo porque,
enquanto este último não possui nenhum tipo de valor, ou seja, é algo que deve ser apenas
descartado, aqueles possuem valor econômico agregado, por possibilitarem reaproveitamento
no próprio processo produtivo. Caso não sejam aproveitados, os resíduos além de criar
potenciais problemas ambientais, representam grandes perdas de matérias-primas e energia,
exigindo investimentos significativos em tratamentos para controlar a poluição. Por outro
lado, se for empregada uma tecnologia adequada, este material pode ser convertido em
produtos comerciais ou matérias-primas para processos secundários.
2.2 IMPLEMENTAÇÃO DO BIODIESEL NO NORDESTE DO BRASIL
A diversidade de culturas agrícolas (oleaginosas) a serem empregadas varia conforme
as características de cada região ou estado brasileiro. Para o desenvolvimento da cadeia
produtiva de diferentes espécies de oleaginosas, em cada estado e/ou região do país, é preciso
levar em consideração vários fatores que envolvem o meio ambiente e suas inter-relações com
a sociedade. Na região Nordeste do Brasil, a produção do biodiesel tem se destacado quando
comparado às demais regiões do país. Este destaque se deve ao grande contingente de pessoas
ainda presentes no meio rural, cuja subsistência é a agricultura familiar, associada à elevada
produtividade de plantas oleaginosas bem adaptadas ao clima semiárido (SOARES;
CARNEIRO, 2010).
2.2.1 Principais oleaginosas utilizadas na produção do biodiesel
As principais oleaginosas cultiváveis no Nordeste do Brasil que poderiam ser
utilizadas para a produção de biodiesel são: a soja (Glycine max), o girassol (Helianthus
27
annuus), o babaçu (Orrbignya speciosa), o algodão (Gossypium spp. L.), a palma ou
dendezeiro (Elaeis Guineensis) e a mamona (Ricinus communis) (ANP, 2013).
A soja é considerada uma das principais fontes de óleo vegetal do mundo. Embora
tenha origem em clima temperado, após intensos trabalhos de melhoramento genético, hoje
esta leguminosa pode ser cultivada tanto em ambiente subtropical quanto tropical. O Brasil é
o segundo maior produtor de soja do mundo, colhendo cerca de 50 milhões de toneladas ao
ano (SLUSZZ; MACHADO, 2006). Segundo a ANP (2013), a principal matéria-prima
utilizada para a produção de biodiesel no Brasil é o óleo de soja, que contribui com 76,61%
da produção total de biodiesel, porém sua produção está vinculada à agricultura patronal e não
à agricultura familiar. De acordo com Domingues e Bermann (2012) a região Nordeste do
Brasil é responsável por 7% da produção nacional de soja. O óleo de soja surgiu como um
subproduto do processamento do farelo de soja e tornou-se um dos principais óleos vegetais
comercializados no mundo. A produção de biodiesel, sendo a soja a principal matéria-prima,
compete com a produção de alimentos, podendo aumentar seus preços tanto pela menor oferta
desses alimentos, quanto pelo aumento do valor das terras e da logística de transporte
(SALLET; ALVIM 2011). Nesse sentido, a implementação do biodiesel no Brasil não está
cumprindo plenamente os objetivos de inclusão social proposto pelo Programa Nacional de
Produção e Uso do Biodiesel. Além disso, devido à cadeia produtiva ser mais eficiente e um
mercado mais consolidado torna-se difícil a inserção social de outras oleaginosas e sua
competitividade frente à soja.
No Brasil, a cultura de girassol está distribuída em todo território nacional devido a
sua ampla adaptação a diferentes condições climáticas (tolerância à seca, a geadas e ao calor),
quando comparada à maioria das espécies normalmente cultivadas no país (FAGUNDES,
2002). O plantio desta oleaginosa na região Nordeste do Brasil, teve início em 2006 no Rio
Grande do Norte, quando foram plantadas 800 hectares. De acordo com o PNPB, aos poucos,
agricultores familiares das áreas aptas ao cultivo no girassol no Nordeste estão descobrindo as
vantagens do plantio manual em áreas de 2 a 5 hectares, consorciando com milho e feijão.
Além da diversificação da renda pela venda do grão, o consórcio permite ampliar a apicultura,
além do uso das sobras da planta na alimentação de caprinos e bovinos. Esta oleaginosa pode
produzir para cada tonelada processada, 400 kg de óleo, 350 kg de torta não tóxica e 250 kg
de casca (EMPARN, 2009). Essas características, associadas ao ciclo vegetativo de 100 dias e
sua boa adequação à rotação e sucessão de culturas, fazem do girassol uma importante
alternativa complementar para o Nordeste alcançar a escala de produção de óleo adequada
para atender a capacidade das usinas instaladas na região. No entanto, sua produção nesta
28
região chega somente a 0,2 mil toneladas na safra de 13/14, quando comparado a 90 mil
toneladas produziada na região centro-oste (CONAB, 2013).
O babaçu é de origem da região Amazônica e da Mata Atlântica. Essa planta é de
cultivo perene e apresenta uma produção que pode alcançar até dois mil frutos por ano por
planta. Na região do Nordeste Brasileiro existe uma área de cerca de 12 milhões de hectares
plantados de babaçu, sendo que a maior parte está concentrada no estado do Maranhão e Piauí
(SANTOS, 2008). Esta oleoginosa possuem cerca de 66% de óleo, similar ao óleo de dendê,
com um rendimento de 0,1 - 0,3 toneladas de óleo por hectare (EMBRAPA, 2006). Além
disso, o óleo de babaçu possui características excelentes para produção do biodiesel, devido
sua composição ser predominantemente de ácido láurico (44%) (LIMA et al., 2007). Este fato
facilita a reação de transesterificação, de modo a se obter um produto, biodiesel, de excelentes
características físico-químicas (LIMA et al., 2007). Apesar das características do babaçu
indicar seu uso para a produção do biodiesel, esta palmeira continua a ser tratada como um
recurso marginal, permanecendo como parte integrante dos sistemas tradicionais e de
subsistência.
Outra oleaginosa utilizada no Nordeste do Brasil para a produção do biodiesel é o
algodão. A Bahia é a maior produtora de algodão do Nordeste, com produção de 1.270,2 mil
toneladas de caroço de algodão na safra 2013/2014 (CONAB, 2013). No entanto, sua cultura
gira em torno do setor têxtil tendo sua pluma como principal produto e as sementes como um
subproduto da produção (SOUSA et al., 1999). Além disso, a porcentagem de óleo em sua
semente é muito baixa com relação às outras oleaginosas, cerca de 24% (GONDIM-TOMAZ
et al., 1998). Assim, a utilização do algodão para produção de biodiesel depende da demanda
da indústria têxtil. Apesar desta limitação, atualmente, o algodão é a terceira matéria-prima
mais importante para a produção do biodiesel nacional, contribuindo com cerca de 2,71% da
produção total do biodiesel no Brasil e a segunda para a região Nordeste, reponsável por
14,95% da produção do biodiesel nesta região (ANB, 2013). A EMBRAPA algodão tem se
dedicado a pesquisas para conseguir cultivares de algodão com boa fibra e maior conteúdo de
óleo, para atender o mercado de energia no Brasil e no exterior.
A palma (dendezeiro) é outra cultura com potencial para produção de biodiesel,
principalmente na região Norte-Nordeste. Esta oleaginosa merece destaque pelo fato de ser
perene e com colheita durante todo o ano, apresentando ainda bom teor de óleo e bom
rendimento na produção de biodiesel (SLUSZZ; MACHADO, 2006). Apresenta uma
produtividade que pode atingir até 5 t de óleo por hectare por ano (CLEMENT, 2005). Esta
produção pode chegar a ser 25 vezes maior que a de soja. Na região Nordeste, o estado da
29
Bahia é o maior produtor de dendê, com a área cultivada de 40 mil hectares, localizado
principalmente na região costeira do estado (MMA, 2006). Entretanto, a região Nordeste do
Brasil participa apenas com 19% da produção de palma, o restante da produção se concentra
na região norte (81% do total da produção brasileira).
Historicamente, o Brasil é um dos maiores produtores de mamona do mundo, tendo
China e Índia como principais concorrentes. A mamona é uma oleaginosa de fácil cultivo e
bem adaptada as condições de clima e solo da região semiárida brasileira (SLUSZZ;
MACHADO, 2006). Estas características conferem a mamona uma posição de destaque frente
às outras oleaginosas aptas à produção de biodiesel em especial na região Nordeste do Brasil,
principalmente por ser uma região pobre e com potencial de produção limitado para outras
culturas. Essa cultura figura como a mais importante para a fabricação de Biodiesel no
Nordeste. Ademais existe o aspecto social associado a sua produção, já que seu plantio pode
ser consorciado com outras culturas, produzindo simultaneamente bens de consumo familiar.
O Nordeste sempre foi a principal região produtora de mamona no Brasil, com destaque para
a Bahia. Na safra 2004/2005 o Nordeste alcançou uma produção de 143,3 mil toneladas,
enquanto o Brasil produziu 147,9 mil toneladas, ou seja, o Nordeste produziu
aproximadamente 97% da safra nacional. As variações ocorridas na produção de mamona no
Brasil e na região Nordeste de 1997 a 2012 estão representadas na figura 2.
Figura 2 - Produção de mamona no Brasil e na região Nordeste. Fonte: adaptado de CONAB
(2012).
30
Apesar das grandes vantagens da produção de mamona para o biodiesel, seu uso ainda
enfrenta alguns entraves: a) o principal fator decorre dos baixos níveis de produtividade
alcançados na região, apresentando o menor rendimento por hectare, 523 kg/ha, em 2009.
Eventualmente, esse fato pode reduzir o número de interessados em ingressar nessa atividade
em razão da baixa rentabilidade esperada e, por conseguinte, comprometer a oferta de óleos
vegetais; b) deficiência da cadeia produtiva, que se encontra em processo de articulação pelo
poder público local, para a constituição de cooperativas que deverão se responsabilizar pelas
unidades extratoras de óleo; c) óleo com maior densidade e viscosidade em comparação aos
demais, limitando seu uso para produção de biodiesel. Por outro lado, essas mesmas
características conferem alto poder lubrificante ao óleo da mamona, contribuindo para a
elevação de seu preço no mercado; d) a toxicidade da mamona, que impede o seu uso na
alimentação animal, fato que contribui para desestimular o seu uso pelo pequeno produtor
familiar, que tem a pecuária como atividade complementar a produção agrícola (ABDALLA
et al., 2008).
2.3 UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS DO BIODIESEL NA ALIMENTAÇÃO ANIMAL
O biodiesel é fabricado através de transesterificação, na qual a glicerina é separada da
gordura ou óleo vegetal. O processo gera dois produtos: ésteres (o nome químico do
biodiesel) e glicerina (produto valorizado no mercado de sabões); além de coprodutos (torta,
farelo e outros) que podem constituir outras fontes de renda importantes aos produtores.
Geralmente, a torta e/ou farelo gerado na extração do óleo não passam por processo de
agregação de valor porque são desconhecidas as suas potencialidades nutricionais e
econômicas, salvo algumas exceções como soja, algodão e girassol. Segundo Laufenberg, et
al. (2003), os resíduos podem conter muitas substâncias de alto valor, podendo ser
convertidos em produtos comerciais ou matérias-primas para processos secundários, como na
alimentação animal, desde que se empregue uma tecnologia adequada.
Diversos estudos tem avaliado o uso de resíduos do biodiesel em rações animais e
identificados considerações importantes em diferentes espécies animais. A maioria das tortas
ou farelos das oleaginosas que vêm sendo utilizadas para produção de biodiesel no Brasil é
passível de utilização na alimentação animal. No entanto, cada uma apresenta suas
particularidades no que diz respeito a cuidados antes de serem fornecidas aos animais, devido
a alguns fatores tóxicos ou antinutricionais que possuem. Portanto, deve-se ter cautela quanto
31
às quantidades máximas que podem ser fornecidas dentro da formulação das dietas dos
animais e práticas de armazenamento.
Os principais resíduos gerados durante a produção do biodiesel com potencial de
utilização na alimentação de ruminantes são: a glicerina, farelo de soja, farelo e/ou torta de
girassol, farelo e/ou torta de babaçu, algodão e mamona. A composição química destes
resíduos está descritas na tabela 1.
Tabela 1 - Composição química dos resíduos produzidos a partir de diferentes oleaginosas
durante a extração do biodiesel. Fonte: adaptado de Abdalla et al. (2008).
Proteína bruta
Extrato etéreo
Fibra bruta
Espécie
Min
Máx
Min
Máx
Min
máx
Soja
42
47
3
4
7
8
Caroço de algodão
42
47
3
3
10
11
Amendoim
41
45
8
9
14
15
Mamona
39
43
4
4
18
20
Gergelim
36
40
12
13
5
5
Nabo forrageiro
34
38
22
24
19
21
Canola
32
36
22
24
7
8
Pinhão-manso
25
60
4
12
40
45
Girassol
20
22
20
22
21
23
Babaçu
18
20
7
8
26
29
Dendé/Palma
14
15
6
7
38
43
2.3.1 Glicerina
A glicerina bruta é o principal resíduo gerado durante a extração do biodiesel e
atualmente tem provocado grandes preocupações quanto ao seu destino. Segundo Chi et al.
(2007) a glicerina corresponde cerca de 10% da massa total resultante do processo de
produção do biodiesel e esta não possui legislação específica para seu descarte, sendo
armazenada e, consequentemente, tem se acumulado nas usinas de produção de biodiesel,
formando grandes estoques de glicerina bruta, a qual ainda não possui destino certo. No
32
entanto, a glicerina pode ser utilizada como uma fonte energética alternativa na alimentação
animal, particularmente para ruminantes, onde o glicerol, componente principal da glicerina
bruta, pode ser disponibilizado diretamente para produção de ácidos graxos de cadeia curta
que são absorvidos no rúmen para obtenção de energia.
A grande maioria dos trabalhos relacionados a esse assunto se concentra na área de
bovinocultura leiteira, que tem utilizado a glicerina como um artifício preventivo de
distúrbios metabólicos que estão associados ao período de transição, sendo recomendada para
esta fase cerca de 5 a 8% de glicerina com base na matéria seca da dieta (DONKIN, 2008), e
como suplemento para vacas em lactação, principalmente no pico de lactação (DRACKLEY
et al., 1992).
Apesar de ser conhecido o valor nutricional da glicerina, ainda há uma escassez de
pesquisas e informações sobre a utilização da glicerina na dieta de ruminantes, principalmente
em ovinos e caprinos. Além disso, estudos sobre os efeitos do uso da glicerina sobre o
desempenho reprodutivo são limitados (MORIEL et al., 2011). Atualmente têm se utilizado a
glicerina como fonte energética alternativa em dietas para bovinos em terminação,
substituindo alimentos convencionais como o milho, bem como na alimentação de vacas
leiteiras na tentativa de reduzir efeitos do balanço energético negativo durante o pós-parto e
melhorar a produção de leite. Parsons et al. (2009) incluíram glicerina bruta, em substituição
ao milho, na dieta de novilhos em terminação e observaram maior ganho peso e melhor
conversão alimentar. De acordo com Chung et al. (2007), a utilização de glicerina na dieta
vacas Holandesas, proporcionou um aumento na produção de leite durante 6 semanas de
aleitamento (52 vs 46 kg/d), mesmo após o período de suplementação. Estes dados sugerem
um efeito benéfico da glicerina na alimentação animal, possivelmente através de mudanças no
metabolismo animal.
Segundo Wang et al. (2009), a suplementação com glicerol em até 200 g/d estimula os
microrganismos ruminais, ou enzimas digestivas, melhorando a fermentação ruminal,
aumentando a produção de propionato e facilitando a digestibilidade do alimento no trato
digestivo de novilhos. Além disso, em vacas da raça Holandesa a utilização de 250 g/dia de
glicerina (correspondente a 162,5 g de glicerol/dia), durante 3 semanas pós-parto, aumentou a
disponibilidade de energia observada pelo maior nível de glicose no sangue, bem como
menores níveis de β-hidroxibutirato sanguíneo e menores corpos cetônicos na urina (Chung et
al., 2007).
Apesar dos efeitos benéficos da utilização de glicerina na dieta animal, o nível de
inclusão é determinante para o sucesso do uso da glicerina a alimentação animal. Além disso,
33
sua tolerância parece variar entre espécies. Em borregos a adição de 15% de glicerina não
afetou o padrão de crescimento e as características de carcaça (GUNN et al., 2010a; GUNN et
al., 2010b). Segundo Meale et al. (2013) a inclusão de 12% de glicerina na alimentação de
ovelhas não afeta o consumo de matéria seca, o peso vivo e o rendimento e qualidade da lã.
Além disso, foi observado que a inclusão de glicerina na alimentação de ovinos tem um efeito
benéfico sobre a produção de ácidos graxos (AVILA-STAGNO et al., 2013). No entanto, a
utilização de 30 a 40% de glicerina na dieta de borregos em terminação reduziu o ganho de
peso, afetou a qualidade da carcaça e alterou os níveis sanguíneos de insulina (GUNN et al.,
2010b).
Em bovinos, Schröder e Südekum (2007) verificaram que a adição superior a 10% de
glicerina bruta da matéria seca na dieta afeta o consumo alimentar a ingestão de água, bem
como a digestibilidade da dieta e nutrientes. Da mesma forma, Parsons et al. (2009)
observaram que a adição de 12 e 16% de glicerina na dieta de novilhas reduziu o ganho de
peso e afetou as características da carcaça. No entanto, estes mesmos autores observaram que
a utilização em até 8% de glicerina melhora a eficiência de ganho de peso de novilhas em
terminação. Por outro lado, Mach et al. (2009) não observaram efeitos deletérios em touros
Holandeses sobre o ganho de peso, a fermentação ruminal, o metabolismo e as características
da carcaça quando a inclusão de glicerina foi de até 12,1%.
2.3.2 Farelo de soja
O farelo de soja é considerado o principal suplemento de proteína utilizada na
alimentação animal. Seu uso para este fim foi estabelecido há muitos anos. A utilização de
farelo de soja é satisfatória em quase todos os sistemas de alimentação, bem como na pesquisa
experimental nutricional (WEBSTER et al., 1992; BERNARD, 1990). Além disso, com
normativa 8/2004 do MAPA que proíbe a produção, a comercialização e a utilização de
produtos destinados à alimentação de ruminantes que contenham em sua composição
proteínas e gorduras de origem animal, tem-se aumentado ainda mais a pressão de demanda
para este subproduto. O farelo de soja apresenta proteínas de boa qualidade e aminoácidos de
alta digestibilidade. Contudo, a utilização da soja “in natura” tem como problema a presença
de compostos que deprimem o desenvolvimento dos animais, tais como inibidores de tripsina
e de proteases (SILVA; SILVA, 2000). Para evitar estes problemas são empregadas técnicas
de processamentos térmicos que melhoram a qualidade nutricional do farelo de soja,
inativando estes compostos antinutricionais (MENDES et al., 2004). Tais entraves não tem
34
sido preocupantes para ruminantes visto que vacas e cabras leiteiras têm sido alimentadas
com grão de soja “in natura” sem quaisquer efeitos negativos sobre produção e qualidade do
leite (BERNARD, 1990; OLIVEIRA JUNIOR et al., 2002). Todavia, os preços elevados e a
flutuação na produção de soja limitam seu uso na alimentação animal, principalmente por
pequenos produtores, o que tem provocado o aumento no interesse por outras fontes de
proteínas para a alimentação animal.
2.3.3 Farelo e/ou torta de girassol
O óleo de girassol é considerado, dentre os óleos vegetais, o de melhor qualidade
nutricional devido a sua riqueza em ácidos graxos poliinsaturados (65,3%), principalmente o
ácido linoléico (MACEDO et al., 2008). Além disso, a farinha de girassol apresenta um
elevado teor protéico (cerca de 30% de proteína bruta), com proteínas de alta digestibilidade
total e degrabilidade ruminal e um alto teor de fibra (> 40% de fibra em detergente neutor FDN) (ALCAIDE et al., 2003). Os teores elevados de proteína na torta de girassol, sugerem
que este sub-produto pode ser um alimento valioso na alimentação de ruminantes,
substituindo fontes alimentares tradicionais como o farelo de soja (OLIVEIRA et al., 2007;
VINCENT et al., 1990).
A utilização do girassol, tanto na forma de farelo ou de torta, tem sido estudada
extensivamente em animais não ruminantes, como em aves (ZATARI; SEEL, 1990;
FURLAN et al., 2001; HERNÁNDEZ et al., 2011) e peixes (SANZ et al., 1994; OLVERANOVOA et al., 2002). No entanto, pouca pesquisa tem sido relatada sobre a sua utilização em
ruminantes. Segundo Garcia et al. (2006), a inclusão de farelo de girassol em até 45% no
concentrado não influencia o consumo e o ganho de peso de bovinos. Além disso, em cabritos
foi demonstrado que o farelo de girassol pode ser utilizado com sucesso em sistema de
engorda (TITI, 2003). De acordo com Richardson et al. (1981), o farelo de soja pode ser
substituído pelo farelo de girassol de forma eficiente sem afetar o crescimento de novilhos e
ovelhas em terminação. Irshaid et al. (2003), verificaram que é possível a substituição total do
farelo de soja por farelo de girassol para ovelhas lactantes (37,5% da dieta) e carneiros da raça
Awassi (34,6% de substituição) sem prejuízo para a digetibilidade dos carneiros ou
desempenho das fêmeas. Economides (1998) cita que o farelo de girassol pode substituir
alimentos volumosos como a palha de cereais em até 50%. Por outro lado, segundo
Domingues et al. (2010) quanto maior a substituição do farelo de algodão pela torta de
girassol, menor o consumo matéria seca. Além disso, Louvandini et al. (2007), verificaram
35
que a substituição do farelo de soja em 50% e 100% pelo farelo de girassol proporcionou um
menor ritmo de crescimento e características de carcaça inferiores, quando fornecido para
cordeiros Santa Inês em confinamento.
2.3.4 Farelo e/ou torta babaçu
O babaçu apresenta excelente palatabilidade e um bom equilíbrio em aminoácidos,
com consequente elevado valor biológico (ANDRIGUETTO et al., 1999). Além disso,
segundo Pascoal (2006), a relação nutritiva, os altos valores dos nutrientes digestíveis totais e
do valor calórico colocam em destaque o uso do farelo do babaçu na alimentação animal. Dos
farelos produzidos no Brasil o farelo de babaçu é pouco utilizado na alimentação animal,
devido a sua composição bromatologica muito variada, por ser produzido em pequena escala
e não haver muitos estudos sobre as reais características nutricionais deste produto
(PASCOAL et al., 2006). Esta variação na composição bromatologica do farelo de babaçu
pode ser devido falta de padronização durante o processamento da extração do óleo desta
oleaginosa, visto que o babaçu é formado por 4 camadas (epicarpo, mesocarpo, endocarpo e
amêndoas) cada uma com valores nutricionais diferentes, o que dificulta a classificação desta
palmeira. Segundo Bomfim et al. (2009) torta e o farelo de babaçu já são classificados como
volumoso (>70% FDN) e com conteúdo de proteína relativamente baixo (20,68% de proteína
bruta - PB). No entanto, alguns trabalhos determinam que estes subprodutos sejam
considerados como proteico ou proteico-energético (PASCOAL et al., 2006). Miotto et al.,
(2012) estudaram a substituição silagem de capim elefante pela farinha do mesocarpo do
babaçu (0; 21; 38; 62 e 78%) na dieta de ovino e observaram que este subproduto pode ser
aproveitado como fonte energética para ruminantes.
Trabalhos recentes têm demonstrado o potencial de utilização do farelo de babaçu em
substituição ao farelo de soja em dietas para ruminantes. Almeida (2005) em estudo com
vacas leiteiras verificou que a utilização de farelo de babaçu promoveu um aumento na
produção de leite e melhor viabilidade econômica, quando incluído em 20%. Sousa Junior et
al. (2007) avaliou a substituição parcial do milho e do farelo de soja pelo farelo de babaçu em
dietas para ovinos, em quatro níveis de substituição (0, 10, 20 e 30%). Estes autores
verificaram que níveis até 20% o farelo de babaçu não afetou o desempenho dos animais,
porém, ao utilizar um nível de 30% ocorreu uma redução no ganho de peso, muito embora,
em nenhum nível de inclusão o rendimento de carcaça foi afetado. No entanto, Xenofonte et
al. (2008) observaram um efeito linear decrescente dos níveis de farelo de babaçu sobre o
36
consumo de matéria seca em g/dia de ovinos. Estes autores citam que se considerada a
composição química das dietas fornecidas neste experimento, a redução de consumo não pode
ser explicada pelos teores de fibra, proteína, minerais e nutrientes digestíveis totais. Eles
agregam este fato a possível presença de fatores antinutricional associado ao farelo de babaçu,
que pode ter contribuído para interferir no consumo de alimentos pelos animais. Com a
redução no consumo de matéria seca a quantidade de proteína bruta ingerida pelos animais
nos níveis de 20 e 30% ficou menor que a recomendada pelo NRC (1985), que é de 160 a 191
g/dia para atender às exigências dos animais utilizados neste experimento, o que contribuiu
em uma redução de aproximadamente 51,4 g/dia no ganho de peso vivo para cada 10% no
nível de participação desse alimento.
Para cordeiros em terminação a inclusão de farelo de babaçu reduziu o consumo, o
ganho de peso diário e o peso de abate quando substituiu o feno do capim-colonião (Panicum
maximum). Entretanto, no nível de 10% de inclusão do farelo de babaçu os animais
apresentaram ganhos de 161,25 g/dia (CARVALHO et al., 2007a). Além disso, Cruz et al.
(2012) utilizando farelo do mesocarpo do babaçu na dieta de bovinos Nelore em
confinamento verificaram um aumento no tempo de alimentação a fim de manter um nível de
consumo adequado de energia, compatível com as suas necessidades nutricionais, uma vez
que o farelo do mesocarpo do babaçu tinha baixos níveis de energia.
2.3.5 Farelo e/ou torta de algodão
O uso de derivados do algodão na ração animal, como o farelo e/ou torta de algodão, é
bastante difundido, devido a sua composição nutricional e por conter proteína de boa
qualidade. O farelo de algodão é o segundo farelo proteico mais produzido no mundo,
perdendo apenas para o farelo de soja (BOMFIM et al., 2009). No entanto, a planta do
algodão produz um pigmento tóxico, que consiste em um aldeído polifenólico denominado
gossipol. Durante a extração do óleo do algodão, dependendo do grau de extração do óleo e
do método utilizado, seus subprodutos podem conter altas concentrações de gossipol.
Segundo NCPA (2002) o teor de gossipol total pode chegar a 1,16 no farelo e 1,09 na torta.
Portanto, o nível de inclusão destes subprodutos nas dietas deve ser cuidadoso. Risco et al.
(1992) observaram que a concentração de 200 mg/kg de gossipol livre é segura para
alimentação de bezerros, por outro lado, 400 mg/kg de gossipol livre se mostrou tóxica e 800
mg/kg de gossipol livre pode resultar em mortalidade. Segundo Randel et al. (1996) a
ingestão de 5 mg/dia de gossipol livre no farelo de algodão afeta a qualidade embrionária em
37
novilhas. Por outro lado, a ingestão de 64 mg/kg de gossipol livre a partir de farelo de algodão
não afetou a produção de leite de vacas Holandesas (MENA et al., 2001).
Ruminantes jovens são mais sensíveis ao gossipol, sendo recomendado até 100 ppm
de gossipol no concentrado, já animais adultos são mais tolerantes a presença de gossipol
livre na dieta (MORGAN, 1989). Solomon et al. (2008) obsevaram que a suplementação com
300 g/dia de farelo de algodão aumentou o ganho de peso de cabras. Em outro estudo,
Chakeredza et al. (2001) verificaram que a inclusão de farelo de algodão na dieta de cordeiros
Dorper melhorou a taxa de crescimento, peso de carcaça e área de olho do lombo. A
utilização da torta de algodão na proporção de 4% da dieta de ovinos em terminação, não
afetou o consumo ou a digestibilidade, com ganho médio de 76 g/d de peso vivo (AHMED;
ABDALLA, 2005). De acordo com Pina et al. (2006) o farelo de algodão com 38% de
proteína bruta pode ser utilizado para vacas leiteira de alta produção (25 kg/d) quando
utilizada a silagem de milho como volumoso na proporção de 60% da dieta. Por outro lado,
Ribeiro et al. (2007) mostraram uma redução no ganho de peso na terminação de bovinos
alimentados com farelo de algodão, entretanto esta fonte proteica não afetou a qualidade da
carcaça.
2.3.6 Farelo e torta de dendê
A torta de dendê é um alimento pobre em proteína (14.5 - 19.6%), com alta
concentração de fibra (66.8 - 78.9% de FDN). Este subproduto é largamente utilizado na
alimentação animal na Ásia, principalmente na Malásia. Tem sido utilizado na dieta de
monogástricos, como suínos (RHULE, 1996; ADESEHINWA et al., 2007) e aves
(ONWUDIKE et al., 1988; PANIGRAHI; POWELL, 1991). No entanto, devido ao alto teor
de fibra e degradação lenta de proteína e fibra (HINDLE et al., 1995), este subproduto tem
sido mais aceito por ruminantes. Segundo, Silva et al. (2005) a inclusão de torta de dendê em
até 30% de substituição ao milho e farelo de soja, no concentrado de cabras em lactação, não
afetou a digestibilidade aparente da MS da ração.
A torta e o farelo de dendê apresentam um elevado teor de cobre (20,5 a 28,9 ppm),
podendo ser tóxico para esta espécie ovina (ALIMON, 2005). Atualmente diversos trabalhos
vêm sendo desenvolvidos para evitar os efeitos tóxicos da presença de cobre nos subprodutos
do dendê. Alimon, Ivan e Jalaludin (2011), verificaram que a adição de 1 g/kg de enxofre e 8
mg/kg na torta de dendê mantem as concentrações hepáticas de cobre e molibdénio, previne a
toxicidade cronica por cobre, sem afetar o crescimento de cordeiros. Segundo Akpan et al.
38
(2005), a inclusão na torta de palma de zinco ou RONOZYMETM P evita esta toxicidade. No
entanto, há divergencias quanto ao uso de subprodutos do dendê na aliemtação de ovinos.
Nunes et al. (2010) demostraram que a utilização de torta de dendê em níveis de até 19,5% da
dieta cordeiros não causa desordens metabólicas e alterações hepáticas. Costa et al. (2010)
relataram que a inclusão de torta de dendê em 30% em dietas de ovinos não induz quaisquer
condições adversas, além de melhorar o coeficiente de digestibilidade da fibra em detergente
ácido. Carvalho et al. (2006 e 2007b) concluíram que a inclusão de torta de dendê em
substituição ao farelo de soja não afetou parâmetros do comportamento alimentar em ovinos.
No que ser refere a parâmetros produtivos e reprodutivos, foi observado por Silva et
al. (2005b) que o milho moído e farelo de soja podem ser substituídos por torta de dendê em
até cerca de 19% da MS da dieta sem afetar o consumo e a produção de leite de cabras
leiteiras. Além disso, a utilização de torta de dendê em substituição ao milho e farelo de soja
em até 30% não alterou as características físico-químicas do leite de cabras (Silva et al.,
2006b). De acordo com Abubakr et al. (2013), a inclusão de 80% de torta de palma não
alterou a consumo de matéria seca, porém reduziu o ganho de peso e a qualidade da carcaça
de cabras. Segundo Yaakub et al. (2009) a utilização de farelo de dendê quando adicionado
molibdénio e enxofre não provoca alterações na espermatogenese de carneiros.
2.3.7 Farelo e/ou torta de mamona
A torta e o farelo de mamona são aproveitados principalmente na agricultura como
adubo orgânico, que é justificada rápida mineralização e liberação de nutrientes para as
plantas (SEVERINO et al., 2005). Também podem ser utilizados no controle de pragas, como
produto natural, devido os mesmos possuírem proteínas vegetais com efeitos inseticidas
(CARLINI; SÁ, 2002). Além disso, alguns estudos tem demonstrado que estes subprodutos
possuem elevado potencial para serem utilizados na alimentação animal, porém o seu uso com
esta finalidade tem sido limitado, devido à presença de compostos alergênicos (CB1A) e
tóxicos (ricina e ricinina) que podem ocasionar intoxicação em animais e seres humanos
(OSWEILER, 1996, KUMAR et al., 2003; ASLANI et al., 2007). Existem relatos de que os
complexos alergênicos presentes nos subprodutos da mamona podem causar desordens
respiratórias principalmente em seres humanos (PARUI, 1999). Com relação à ricinina,
estudos indicam que esta substância parece afetar o sistema nervoso central, provocando o
desencadeamento de convulsões (FERRAZ et al., 2002). No entanto, em ruminantes não
existem relatos de intoxicação por estas substâncias, provavelmente devido às baixas
39
concentrações presentes tanto na torta como no farelo de mamona (ANANDAN et al., 2005).
A ricina por sua vez, apresenta duas subunidades (subunidades A e B), ligados por
ligações dissulfureto (BARNES et al., 2009). De acordo com o modelo proposto pela Audi et
al. (2005), a subunidade B da ricina se liga às glicoproteínas e glicolípidos da membrana
plasmática e penetra no citosol por endocitose. Uma vez no citosol, a ricina é translocada por
transporte vesicular aos endossomas e depois para o aparelho de Golgi e retículo
endoplasmático, local de clivagem da subunidade A e B. A presença da subunidade A no
citosol promove a inativação da síntese de proteínas por remover uma adenina na subunidade
ribossomal 60S. Esta substância é considerada um dos mais potentes compostos tóxicos
presentes na natureza (OLSNES, 1975). Sua ingestão por seres humanos e animais pode
induzir a morte, dependendo da concentração ingerida (SMALLSHAW et al.,
00 ,
E S, 2010). Diversos trabalhos demonstram que o extrato da mamona causa severas
alterações, como redução na taxa de ovulação, indução de abortos (SALHAB et al., 1999),
altera a função testicular (EKWERE et al., 2011) e suprimi a produção de testosterona
(NITHYA et al., 2011).
Apesar da presença destas substâncias no farelo e torta de mamona, diversos estudos
tem testado o efeito da adição destes subprodutos, submetidos ou não a diferentes métodos de
detoxificação, na alimentação de ruminantes e não ruminantes (SANTOS et al., 2011, CAI et
al., 2005, MATOS JÚNIOR et al., 2011). O processo de detoxificação dos subprodutos da
mamona pode ser realizado por vários métodos, sendo a autoclavagem (físico) e a utilização
de hidróxido ou óxido de cálcio (químico) os mais recomendados (ANANDAN et al., 2005;
OLIVEIRA et al., 2010a). Contudo não existem evidencias conclusivas quanto ao nível de
inclusão e à utilização dos subprodutos da mamona submetidos ou não ao processo de
detoxificação antes de serem adicionados na dieta de ruminantes.
Vieira et al. (2011) propõem que a utilização de farelo de mamona detoxificado na
alimentação de ovinos em terminação pode melhorar o comportamento ingestivo dos mesmos,
especialmente sobre o número de mastigações merícicas por bolo ruminal. Contudo, foi
demostrado por Oliveira et al. (2010b) que a torta de mamona mesmo detoxificada é capaz de
afetar crescimento microbiano ruminal. Além disso, foi demostrado por Silva et al. (2011)
que a substituição em mais de 67% de farelo de soja por farelo de mamona detoxificado reduz
digestibilidade da matéria seca, matéria orgânica, proteína bruta e carboidratos totais em
ovinos em terminação. Por outro lado, Furtado et al. (2012), observaram que a torta de
mamona não detoxificada foi utilizada na dieta de ovinos, como alimento proteico alternativo,
40
participando em até 8% da ração total, sem ocasionar expressivas reduções no consumo e na
digestibilidade.
Segundo Diniz et al. (2011), o farelo de mamona detoxificado pode substituir
totalmente o farelo de soja em dietas de terminação de bovinos mestiços. De acordo com
Vieira et al. (2010), o farelo de soja pode ser substituído em até 100% por farelo de mamona
detoxificado sem afetar as características da carcaça e os componentes não-carcaça de ovinos
em terminação. Em outro estudo, Diniz et al. (2010) não observaram alterações nas
características da carcaça de bovino de corte quando alimentados por 84 dias, tanto com
farelo de mamona detoxificado, quanto com farelo de mamona não detoxificado. Por outro
lado, Pompeu et al. (2012) observaram que a cada 1% de substituição do farelo de soja pela
torta de mamona detoxifidada por autoclavagem, estimaram-se decréscimos de 0,62 g/dia no
ganho de peso médio diário e um acréscimo de 0,35 dia para os animais ganharem 12 kg em
ovinos em confinamento. De acordo com Urbano et al. (2013), a substituição de feno de tifton
85 por casca de mamona na dietas de ovinos não é recomendado, pois diminui o peso ao
abate, peso da carcaça quente e fria, peso dos corte comerciais e as medidas morfométricas.
Segundo Oliveira et al. (2010a), a utilização de subprodutos da mamona detoxificado
não promove alterações na função hepática de ovinos quando alimentados por 21 dias. Da
mesma forma, Menezes et al. (2012) não observaram alterações no perfil plasmático de ureia,
hemoglobina, proteína total, glicose, AST, ALT e cálcio de ovinos alimentados por 20 dias
com farelo de mamona detoxificado. Além disso, Santos et al. (2011) demonstraram que a
substituição de 100% de feno de capim Tifton 85 pela casca de mamona na dieta de cabras
reduziu a produção de leite, porém melhorou seus aspectos qualitativos. Por outro lado, a
substituição em 0,67 kg/kg de farelo de soja por farelo de mamona detoxificado com óxido de
cálcio em vacas com produção diária de 20 kg, reduziu a produção e a composição do leite
(Cobianchi et al., 2012).
No que se referem a parâmetros reprodutivos, poucos estudos foram desensvolvidos
até o momento. Recentemente, Silva et al. (2013, ver capítulo 6 da presente tese)
demonstraram que o farelo de mamona detoxificado pode ser usado por longo período como
fonte de proteína alternativa sem afetar a foliculogênese pré-antral e antral de ovelhas. Em
outro estudo, Arruda et al. (2013) verificaram que a suplementação de cabras com farelo de
mamona provoca alterações nos níveis plasmáticas de IgG, bem como nos níveis de RNAm
para HSP70, sendo estes efeitos acompanhados por uma menor taxa de embriões transferíveis.
41
3 JUSTIFICATIVA
Na região Nordeste do Brasil, existe uma grande necessidade de se buscar e conhecer
alimentos alternativos que sejam abundantes e acessíveis ao produtor, principalmente durante
os períodos secos, quando a qualidade e a quantidade de forragens na caatinga são baixas.
Durante estes períodos de escassez alimentar, a suplementação do rebanho passa ser a única
estratégia para manter a produtividade. Este problema se agrava devido à baixa produção de
grãos para a formulação de rações concentradas nesta região, necessitando adquirir estes
produtos, principalmente soja e milho, a partir de outros estados, aumentando
consideravelmente os custos de produção. Assim, a utilização de fontes alimentares
alternativas que não afetam negativamente o desempenho animal, bem como a saúde humana
apresenta-se como uma alternativa viável para reduzir os custos com a suplementação animal,
além de diminuir a pressão sobre o uso de cereais, disponibilizando-os para a população
humana. Portanto, o uso de alimentos alternativos pode flexibilizar a formulação de rações
para ruminantes, uma vez que estes podem conter em sua composição elementos
característicos ou complementares que pode contribuir para um ajuste mais rigoroso das
dietas.
Neste contexto, a disponibilidade e os preços atrativos dos subprodutos ou resíduos da
agroindústria do biodiesel na região Nordeste do Brasil, torna-se imprescindível que seja
estudado o efeito da utilização destes subprodutos na alimentação de cabras e ovelhas. Nos
últimos anos, a produção de biodiesel a partir de oleaginosas tem recebido fortes incentivos
governamentais para a inclusão social de pequenos agricultores, principalmente na região do
semi-árido. Nesta região, a mamona tem sido considerada a principal oleaginosa utilizada na
produção do biodiesel, devido à sua grande capacidade de adaptação climática, fácil cultivo e
alta resistência à seca. No entanto, sua utilização para produção do biodiesel tem enfrentado
alguns entraves, principalmente após o processo de extração do óleo, devido a grande
quantidade de resíduos gerados, contendo compostos antinutricionais e potencialmente
tóxicos como a ricina. Assim, o principal destino dos subprodutos da mamona tem sido a sua
utilização como adubo orgânico. Porém, esta prática tem gerado grandes preocupações, pois
em longo prazo favorece uma maximização de contaminantes ambientais e alimentares, que
podem afetar negativamente a saúde reprodutiva de animais e humanos.
Apesar da presença de ricina, os subprodutos da mamona apresentam um elevado
nível de proteína (39 - 43%), com boa degradabilidade ruminal, tornando-os atrativos para o
uso como fonte alimentar alternativa para ruminantes. Portanto, vários estudos têm sido
42
realizados para estabelecer métodos eficientes para a detoxificação destes subprodutos,
visando torná-lo adequado para consumo animal. Atualmente o farelo de mamona
detoxificado vem sendo utilizado com sucesso como fonte protéica para ruminantes,
principalmente para animais em terminação.
O conhecimento acerca da expressão de genes envolvidos no processo de
desenvolvimento e competência do oócito, bem como a avalição das respostas produtivas e
reprodutivas em cabras e ovelhas é extremamente necessária para que possam ser
desenvolvidas estratégias que busquem validar a utilização de alimentos alternativos na
alimentação animal. Neste contexto, a compreenção de como os nutrientes da dieta afeta a
expressão de genes para características produtivas pode ser a chave que dará orientações para
serem aplicadas na seleção animal e, ser mais um subsídio eficiente na rastreabilidade
indivual de animais de interesse e seus respectivos produtos. Além disso, estudos em longo
prazo sobre os possíveis efeitos causados pela ingestão de torta e/ou farelo de mamona
possem alta relevância, uma vez que a mesma é um importante subproduto da cadeia
produtiva da mamona e a possibilidade de aumento na produção nacional de mamona faz
crescer a necessidade de agregar-lhe valor ao produto e mais conhecimento do efeito na
alimentação animal.
43
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS

O uso de farelo de mamona detoxificado ou não como fonte de nitrogênio em dietas
para cabras não altera a resposta ao tratamento de sincronização do estro, taxa de
concepção, desenvolvimento embrionário/fetal inicial e perfil metabólico-hormonal.

A utilização do farelo de mamona detoxificado na alimentação de cabras e ovelhas
durante o pós-parto, não afeta a resposta reprodutiva neste período, a produção e a
qualidade do leite e o desenvolvimento das crias.

Em ovelhas a utilização de farelo de mamona detoxificado não afeta a resposta ao
tratamento de sincronização do estro, a taxa de concepção, o desenvolvimento
embrionário/fetal inicial, o perfil metabólico-hormonal e as características anatômicas
e quanti-qualitativas de diferentes tecidos, bem como quando utilizado por longos
períodos, não altera o padrão de desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais e a
competência de desenvolvimento de oócitos oriundos de folículos antrais.

Em cabras os níveis de RNAm para diferentes genes, no oócito e nas células da
granulosa mural e do cumulus em caprinos não são afetados pela alimentação por
prolongados períodos com farelo de mamona detoxificado.
44
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
 Estudar o impacto da utilização do farelo de mamona detoxificado ou não, durante
diferentes períodos, sobre as características produtivas e reprodutivas de cabras e ovelhas
criadas no Nordeste do Brasil.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Apresentar e discutir estudos que relatam alterações reprodutivas causadas pela exposição
a desreguladores endócrinos e contaminantes ambientais;
 Avaliar o efeito da substituição total do farelo de soja por farelo de mamona detoxificado
ou não sobre a resposta à sincronização do estro, taxa de concepção, desenvolvimento
fetal inicial, presença de IgG e resposta metabólica-hormonal;
 Avaliar o efeito da utilização do farelo de mamona detoxificado na alimentação de cabras
durante o período pós-parto, sobre mudanças no escore de condição corporal, retorno da
atividade luteal, estresse metabólico, produção de leite e desenvolvimento das crias;

Determinar se a ingestão de farelo de mamona detoxificado por longo período afeta os
níveis de RNAm, para diferentes genes, no oócito, bem como nas células da granulosa
mural e do cumulus em cabras;

Verificar o efeito da suplementação com farelo de mamona detoxificado na alimentação
de ovelhas durante a gestação, parto, pós-parto, desenvolvimento ponderal das crias e ao
abate;

Avaliar o efeito da ingestão a longo período de farelo de mamona detoxificado sobre o
desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais ovino, bem como sobre a competência de
desenvolvimento de oócitos oriundos de folículos antrais.
45
6 CAPÍTULO 1
Impacto dos contaminantes ambientais sobre a saúde reprodutiva de fêmeas ruminantes
Impact of environmental contaminants on reproductive health of female ruminants
Periódico: Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.36, n.2, p.73-83, abr./jun.2012.
46
Resumo
Diversos poluentes ambientais têm sido identificados como desreguladores endócrinos (DE).
Estes agentes exógenos, além de interferirem negativamente na fisiologia hormonal,
prejudicam a saúde reprodutiva de animais e humanos, gerando grandes preocupações entre
comunidades científicas, bem como no âmbito da saúde pública. Esta revisão tem como
objetivo apresentar e discutir estudos que relatam alterações reprodutivas causadas pela
exposição a desreguladores endócrinos, enfatizando os efeitos nocivos sobre a foliculogênese,
a maturação oocitária, o desenvolvimento embrionário, a gestação e a puberdade.
Palavras-chave: Desreguladores endócrinos. Poluentes ambientais. Reprodução. Ruminantes.
47
Impacto dos contaminantes ambientais sobre a saúde reprodutiva de fêmeas ruminantes
(Impact of environmental contaminants on reproductive health of female ruminants)
Liliane Moreira Silva¹, Cleidson Manoel Gomes da Silva², Davide Rondina¹,³
¹Laboratório de Nutrição e Produção de Ruminantes (LANUPRUMI); ²Laboratório de
Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA), Universidade Estadual do
Ceará, Fortaleza, Ceará.
³Correspondência: [email protected]
Resumo
Diversos poluentes ambientais têm sido identificados como desreguladores endócrinos
(DE). Estes agentes exógenos, além de interferirem negativamente na fisiologia hormonal,
prejudicam a saúde reprodutiva de animais e humanos, gerando grandes preocupações entre
comunidades científicas, bem como no âmbito da saúde pública. Esta revisão tem como
objetivo apresentar e discutir estudos que relatam alterações reprodutivas causadas pela
exposição a desreguladores endócrinos, enfatizando os efeitos nocivos sobre a foliculogênese,
a maturação oocitária, o desenvolvimento embrionário, a gestação e a puberdade.
Palavras-chave: poluentes ambientais, desreguladores endócrinos, ruminantes.
Abstract
Several environmental pollutants have been identified as endocrine disruptors (ED).
These exogenous agents, in addition to negatively influence hormonal physiology, undermine
the reproductive health of animals and humans, sparking concerns among scientific
communities, as well as within public health. This review aims to demonstrate and discuss
studies that have reported reproductive changes caused by exposure to endocrine disrupters,
emphasizing the harmful effects on folliculogenesis, oocyte maturation, embryo development,
pregnancy and puberty.
Key-words: endocrine disrupters, environmental pollutants, ruminants.
48
Introdução
A presença de contaminantes no meio ambiente, originada pelos agentes poluidores da
indústria ou pelo uso massivo de pesticidas e herbicidas no setor agropecuário, tem sido alvo
de forte preocupação nos últimos anos no âmbito da saúde pública (Agência Nacional de
Vigilância Sanitária - ANVISA, 2010). Alguns destes contaminantes são considerados
desreguladores endócrinos (DE), ou seja, são agentes exógenos que interferem na síntese,
secreção, transporte, metabolismo, ligação, ação ou eliminação de hormônios responsáveis
pela homeostase da saúde reprodutiva (Kavlock e Ankley, 1996).
De forma geral, os efeitos dos DE ocorrem pela ingestão direta de alimentos
produzidos em solos contaminados ou, indiretamente, pela ingestão de produtos de origem
animal oriundos de animais contaminados (Ounnas et al., 2010), ou, ainda, pela inalação e
absorção cutânea (Rhind et al., 2010). Alguns estudos apontam que a gravidade dos efeitos
depende da classe dos DE envolvidos, da concentração, do tempo de exposição e,
particularmente, da idade e do estádio de desenvolvimento em que o animal exposto se
encontra, ou seja, durante a vida fetal, a neonatal ou a adulta (Rubin, 2011; Meador et al.,
2008). Na atualidade, é praticamente impossível predizer o padrão de exposição de animais de
produção, como os ruminantes, aos DE, devido à grande diversidade de agentes poluentes que
são lançados constantemente ao meio ambiente (Majdič, 010).
Existem várias características que tornam os DE intrinsecamente perigosos:
apresentam meia-vida longa, o que resulta em um aumento constante na sua concentração no
meio ambiente global; podem ser encontrados em longas distâncias a partir do local onde
foram produzidos, utilizados ou liberados; e possuem baixa solubilidade em água e altíssima
solubilidade em lipídios (Brevini et al., 2005). Esta última característica torna tais substâncias
bioacumulativas, induzindo a sérios problemas reprodutivos, especialmente em organismos
imaturos, em geral mais sensíveis, devido a uma menor capacidade de metabolização e
eliminação de substâncias potencialmente tóxicas ao sistema endócrino (Aziz et al., 2001).
A partir da detecção destas moléculas no meio ambiente, uma série de anormalidades
ligadas ao sistema reprodutivo em animais e seres humanos vêm sendo investigadas. Na
função reprodutiva masculina tem sido descrito o aumento do número de casos de
criptorquidismo, hipospadia, redução da libido, prejuízos nas produções espermática e
hormonal, impotência, assim como maior incidência de tumores de testículo e próstata
(Baker, 2001; Sultan et al., 2001; Garry et al., 2002; Paul et al., 2005). Em fêmeas, foram
relatadas alterações no comportamento reprodutivo e na qualidade oocitária e folicular, falha
49
na implantação, perdas de gestação, tumores de mama e baixa fertilidade ou mesmo
infertilidade (Berger et al., 2008, 2010; Feugier et al., 2008). De acordo com Pocar et al.
(2003), todos os órgãos endócrinos dependem de um delicado equilíbrio endógeno hormonal,
sendo que este equilíbrio pode ser perturbado pela exposição aos agentes externos, como os
DE, que podem interagir com receptores hormonais, interferir na síntese e/ou alterar o
metabolismo desses hormônios.
Entretanto, apesar do marcado crescimento dos setores industrial e agropecuário destes
últimos anos na América Latina, especialmente no Brasil, existem ainda poucos estudos
relacionando as funções reprodutivas em consequência da exposição a contaminantes
ambientais em animais de produção, particularmente em ruminantes. Diante dessa
problemática, este trabalho de revisão pretende apresentar e discutir os mais recentes
resultados sobre as principais alterações reprodutivas causadas pela exposição a
desreguladores endócrinos, dando particular atenção às fêmeas ruminantes.
Foliculogênese
A foliculogênese, resumidamente, pode ser definida como um processo que se inicia
com a formação do folículo primordial e culmina com o estádio de folículo pré-ovulatório ou
De Graaf (Van den Hurk e Zhao, 2005). A grande maioria dos folículos ovarianos (cerca de
99,9%) não chega à ovulação, morrendo durante a vida reprodutiva por um processo
denominado atresia, o qual pode ocorrer por via degenerativa (Saumande, 1991) e/ou
apoptótica (Hussein, 2005). Na via degenerativa, a isquemia pode ser uma das principais
causas do desencadeamento da morte folicular (Farber, 1982), resultando em alterações na
permeabilidade da membrana celular, aumento de água intracelular, vacuolização
citoplasmática e, consequentemente, degeneração (Barros et al., 2001). No que se refere à via
apoptótica, sabe-se que se trata de um evento que depende da expressão de genes pró e
antiapoptóticos e tem como característica marcante a fragmentação do DNA (Hussein, 2005).
Na literatura atual, poucos trabalhos descrevem os efeitos diretos de DE sobre a
ativação da via apoptótica durante o desenvolvimento folicular. Contudo, tem sido relatada a
presença de poluentes ambientais no fluido folicular de vacas, ovelhas, cabras e porcas
(Kamarianos et al., 2003). De acordo com Perez-Reyes et al. (2001), estes compostos podem
agir como moléculas de sinalização, ou seja, atuar como agentes apoptóticos em diferentes
tipos celulares. Pocar et al. (2005), testando uma mistura comercial de pesticidas (Aroclor1254®), detectaram um aumento significativo na expressão do gene pró-apoptótico Bax,
50
concomitante com uma diminuição do gene antiapoptótico Bcl-2, expressando, portanto, alto
percentual de apoptose em células do cumulus de oócitos bovinos. Em ovinos, Fowler et al.
(2008) verificaram que uma prolongada exposição, utilizando baixas doses de DE por meio da
dieta, afeta gravemente o desenvolvimento folicular no ambiente ovariano fetal. Neste
trabalho, foi constatado que os níveis de prolactina, fator de crescimento e diferenciação-9
(GDF-9) e genes antiapoptóticos nos ovários daqueles fetos expostos a um coquetel de DE
foram significativamente inferiores quando comparado ao grupo-controle. Apesar de poucos
estudos, sobretudo em animais, este tipo de alteração no padrão de expressão gênica pode ser
uma das causas de subfertilidade ou até mesmo da infertilidade, devido à aceleração da
depleção folicular (Tilly, 2001).
A exposição a metais pesados, como o chumbo e o cádmio, tem sido outro ponto
relevante sobre o impacto de DE no desenvolvimento folicular de várias espécies (ovelhas:
Leoni et al., 2002; vacas: Rodriguez-Tellez et al., 2005; coelhas: Dobranic et al., 2002; e
humanos: Younglai et al., 2002). Em condições experimentais, animais que sofreram
exposição ao chumbo tiveram danos no folículo ovariano (Azarnia et al., 2004) e no oócito
(Avazeri et al., 2006). Silberstein et al. (2006) relataram que a presença de chumbo no fluido
folicular comprometeu a taxa de gestação em humanos. Mlynarcikova et al. (2005, 2009)
observaram uma supressão na expansão das células do cumulus induzida pelo FSH e uma
significativa inibição da síntese e acumulação do ácido hialurônico em oócitos suínos
expostos a diferentes concentrações de cádmio.
Na tentativa de avaliar a influência dos DE durante a foliculogênese, diversos estudos
evidenciaram como estas substâncias modulam a produção de hormônios esteroides nesta
fase. Grasselli et al. (2010), ao cultivarem em meio contendo bisfenol A células da granulosa
oriundas de folículos suínos, observaram um efeito negativo sobre a esteroidogênese, devido à
inibição da produção de estradiol e de progesterona. Além disso, foi observada uma redução
significativa na concentração de estradiol, bem como na expressão de RNA mensageiro
(RNAm) para aromatase P450, considerada uma enzima-chave na produção deste hormônio,
ao se utilizar o bisfenol A (Zhou et al., 2008) e o mono-(2-etilhexil) ftalato (Lovekamp-Swan
e Davis, 2003), no cultivo de células da granulosa e da teca oriundas de folículos de ratas.
Mlynarcikova et al. (2005, 2009) observaram uma redução significativa na produção de
progesterona e de estradiol, mesmo na presença de FSH, quando o bisfenol A, o bisfenol
dimetacrilato e o 4-cloro-3-metilfenol foram adicionados ao meio de cultivo de células da
granulosa de folículos de suínos. A esteroidogênese ovariana, portanto, pode ser um dos
principais processos atingidos pela exposição aos DE. Apesar desses estudos, os mecanismos
51
pelos quais ocorrem os efeitos tóxicos sobre as células foliculares, bem como o conhecimento
sobre qual é a real relevância da morte folicular induzida por estas substâncias, ainda não
foram satisfatoriamente investigados.
Maturação oocitária
Os processos de desenvolvimento e de maturação oocitária são pontos críticos para o
sucesso da fertilização e dos posteriores desenvolvimentos embrionário e fetal (Feugier et al.,
2008). A interrupção em qualquer uma destas etapas prejudica consideravelmente o potencial
reprodutivo de fêmeas (Rhind et al., 2010). Nesse sentido, diversos modelos vêm sendo
utilizados visando estudar o efeito de poluentes ambientais sobre o desempenho reprodutivo
de diferentes espécies. Dentre esses modelos, os testes in vitro têm sido mais utilizados em
função do elevado controle das condições experimentais, da maior praticidade e da
possibilidade de administrar os DE sobre as estruturas a serem estudadas (oócitos ou
embriões). Younglai et al. (2002) obtiveram uma correlação significativa entre a presença de
poluentes ambientais no fluido folicular e no soro sanguíneo, com falhas na maturação e/ou
fertilização in vitro em humanos. Além disso, a presença de DE no fluido folicular humano
foi correlacionada com uma redução significativa na taxa de fertilização e, consequentemente,
no percentual de embriões de alta qualidade (Petro et al., 2012).
A Tab. 1 ilustra os principais efeitos produzidos pelos DE sobre a maturação oocitária
em função da espécie estudada. Atualmente, em ruminantes existem poucas informações
sobre o impacto dos DE durante a maturação oocitária, contudo alguns trabalhos já foram
conduzidos em oócitos bovinos (Rodriguez-Tellez et al., 2005), bubalinos (Nandi et al., 2010)
e ovinos (Leoni et al., 2002). Pocar et al. (2001a, b) descrevem que o principal efeito de
pesticidas ambientais sobre a maturação de oócitos bovinos é o bloqueio do processo de
maturação, ou seja, a inibição da retomada da meiose. Segundo Rodriguez-Tellez et al.
(2005), a exposição de oócitos bovinos ao cádmio e ao chumbo, além de prejudicar a
maturação oocitária, provoca sérias alterações acrossomais. Nandi et al. (2010), ao avaliarem
o efeito da exposição a metais pesados sobre a viabilidade, a maturação, a fertilização e o
desenvolvimento embrionário de oócitos de búfalos, verificaram que o cádmio e o chumbo
adicionados ao meio de maturação inibiram o crescimento e o desenvolvimento oocitário. Em
ovinos, Leoni et al. (2002) constataram que a exposição a metais pesados promoveu graves
alterações na maturação oocitária de maneira dose-dependente. Estes autores, ao utilizarem
baixa concentração de cádmio ( μM), observaram uma expansão anormal das células do
52
cumulus; já quando usaram alta concentração desta substância ( 0 μM), foi verificada uma
completa degeneração das células do cumulus, consequentemente, foi constatado um baixo
percentual de oócitos que atingiram o estádio de metáfase II.
Em suínos, a exposição aos pesticidas atrazina, diazinona e malationa afetou
negativamente a viabilidade e a maturação oocitária, por induzir um bloqueio na transição de
vesícula germinativa para metáfase II (Casas et al., 2010). Nesta mesma espécie, Brevini et
al. (2005) verificaram que concentrações subletais de contaminantes ambientais afetaram
negativamente a maturação do oócito, induzindo um bloqueio significativo da retomada da
meiose. Além disso, Can et al. (2005), em oócitos de camundongos, mostraram que o bisfenol
A (10-30 mM) causou uma inibição dose-dependente da progressão da meiose devido a uma
desorganização da formação do fuso meiótico durante a meiose I e a II. Lenie et al. (2008) e
Eichenlaub-Ritter et al. (2008) também encontraram um número significativamente reduzido
de oócitos de camundongos em MII após exposição com bisfenol A. Segundo Mlynarcikova
et al. (2009), ambos os fenóis, 4-cloro-3-metilfenol e di-(2-etilhexil) ftalato (100 mM),
reduziram consideravelmente a maturação meiótica dos oócitos. Neste estudo, o número de
oócitos com quebra da vesícula germinativa (VGBD) (78,7 e 72,4%, respectivamente) bem
como a taxa de oócitos em metáfase II (MII; 50 e 53,6%, respectivamente) após 44 horas de
cultivo foram menores em relação ao controle (89,6% para VGBD e 81,5% para MII).
Outras substâncias identificadas como potenciais DE são o bifenilpoliclorado e o
fenoxapropetil, utilizados na agricultura. O primeiro diminuiu a maturação nuclear de oócitos
bovinos por alterar a poliadenilação do RNA materno, modificando a migração e promovendo
exocitose dos grânulos corticais (Pocar et al., 2001b). Já o segundo, um herbicida conhecido
por afetar especificamente a produção de ATP por meio da inibição da acetil-CoA carboxilase
(Waller et al., 2003), quando adicionado na maturação in vitro de oócitos suínos em
condições experimentais, promoveu uma inibição da maturação nuclear por um mecanismo
ainda desconhecido (Casas et al., 2010). Campagna et al. (2001) relataram que a exposição de
oócitos imaturos in vitro a uma mistura de organoclorados diminuiu significativamente as
taxas de maturação e penetração espermática em suínos.
Desenvolvimento embrionário
O desenvolvimento embrionário inicial é extremamente vulnerável aos efeitos
embriotóxicos de substâncias consideradas como DE (Pocar et al., 2003). Alguns eventos
responsáveis por estes efeitos foram identificados, porém os mecanismos exatos pelos quais
53
estas substâncias interferem na qualidade embrionária ainda têm sido pouco investigados. Na
espécie humana, esses estudos são extremamente limitados, em virtude dos grandes riscos à
saúde. Diante disso, ainda permanecem muitas dúvidas sobre a equivalência entre as doses
testadas e a concentração dos DE presente no meio ambiente. Assim, o modelo animal é o
principal viés para avaliar o impacto dos DE sobre a saúde reprodutiva humana. Até o
momento, a maioria dos estudos que avaliam os efeitos dos DE sobre o desenvolvimento
embrionário tem utilizado os roedores como modelos, testando componentes isolados ou em
associação, administrados por diferentes vias e períodos de exposição e com diferentes doses
farmacológicas (Fowler et al., 2008). No que se refere a animais domésticos, os suínos e os
ovinos têm sido os mais utilizados para testar o efeito de diferentes DE sobre o
desenvolvimento de embriões antes e após a implantação no endométrio uterino.
Ducolomb et al. (2009), ao utilizarem os organofosforados diazinona e malationa em
concentrações crescentes (0, 50 e 100 μM), durante a fertilização in vitro (FIV) de gametas
suínos, verificaram que a diazinona não afetou a taxa de clivagem, entretanto diminuiu o
número de mórulas. Por outro lado, a malationa afetou drasticamente a viabilidade
embrionária a partir das fases iniciais de desenvolvimento. Em outro estudo, nesta mesma
espécie foi observado que a malationa promoveu severas alterações no padrão de expressão
gênica, principalmente de genes relacionados ao metabolismo mitocondrial como as
subunidades I e III do citocromo C, durante o desenvolvimento embrionário (Salazar et al.,
2007).
Em camundongos, a exposição ao paraquat alterou profundamente o desenvolvimento
embrionário in vivo, causando uma redução no percentual de embriões de oito células, bem
como no número de mórulas compactas (Hausburg et al., 2005). Nesta mesma espécie, foi
constatado um aumento na taxa de absorção embrionária após exposição materna ao bisfenol
A (Al-Hiyasat et al., 2004). De forma semelhante, a exposição ao bisfenol A (10,125 mg/dia)
reduziu significativamente a taxa de implantação, contudo, quando foram utilizadas doses
inferiores, não foi observado efeito sobre a implantação embrionária em camundongos
(Berger et al., 2007). Estes autores, em 2008, verificaram que a administração durante quatro
dias consecutivos de 10,125 mg de bisfenol A reduziu o número de locais de implantação
uterina, seguido de redução nos níveis de progesterona urinária, ao passo que uma única
injeção de 6,75 mg, no dia zero de gestação, ou de 10,125 mg, nos dias zero e um de gestação,
foi suficiente para interromper a implantação embrionária. Além disso, o número de embriões
a partir do 10º e 12° dias de gestação em camundongos foi drasticamente afetado quando
54
expostos a 10 mg/kg/dia de bisfenol A entre os dias zero e sete de gestação (Tachibana et al.,
2007).
Ao se avaliar o efeito da exposição ao bisfenol A em camundongos, foi verificada uma
redução significativa na expressão de receptores de progesterona, porém não houve diferença
no número de corpos lúteos entre animais expostos e não expostos durante os primeiros
quatro dias de gestação (Berger et al., 2010). Por outro lado, coelhas expostas à ricina A
tiveram uma redução de 30% no número de corpos lúteos, bem como no número de locais de
implantação (Salhab et al., 1999). Estes resultados sugerem que a exposição aos DE durante o
início da gestação pode interromper a implantação intrauterina. No entanto, é difícil entender
o mecanismo de toxicidade produzida em embriões, devido à restrição de pesquisa com
diferentes tipos e concentrações de DE.
Gestação e puberdade
Atualmente, verifica-se uma marcada concentração de estudos que avaliam os efeitos
nocivos dos DE na Europa e nos EUA, e, em contrapartida, um número reduzido desses
estudos em outras regiões, especialmente em países em desenvolvimento. Todavia, é nestas
regiões que se concentram as atividades de agropecuária, extrativismo e mineração, expondo
tanto animais quanto seres humanos a uma vasta gama de poluentes ambientais considerados
como DE. A Tab. 2 apresenta uma compilação dos principais estudos presentes na literatura,
classificados em função do país onde se desenvolveu a pesquisa e da espécie estudada, bem
como em virtude do tipo, da utilização e dos efeitos dos DE.
Alguns estudos vêm sendo conduzidos visando determinar qual a real influência dos
DE em indivíduos que foram expostos durante a vida fetal, a lactação e a puberdade.
Bellingham et al. (2010) observaram que fetos ovinos expostos a uma mistura de DE tiveram
uma diminuição significativa na expressão de RNAm para a proteína e o receptor do
hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) no hipotálamo, demonstrando que os DE
podem alterar drasticamente o eixo neuroendócrino fetal, com graves consequências para a
vida adulta. Da mesma forma, Bellingham et al. (2009) observaram que a exposição de
ovelhas gestantes a um complexo coquetel de DE provocou significativas alterações no
padrão de secreção hormonal da pituitária fetal, sem ocasionar alterações no padrão de
secreção hormonal materno.
Diversos trabalhos demonstram que os DE promovem perturbações no ambiente
uterino com graves consequências sobre a manutenção da gestação e a sobrevivência
55
neonatal. Segundo Takahashi et al. (2000) e Schonfelder et al. (2002), em ratos e humanos,
respectivamente, os DE podem atravessar a barreira placentária e se acumular tanto na
placenta quanto no feto. Berger et al. (2007) demonstraram que a exposição ao bisfenol A no
início da gestação de camundongos diminuiu significativamente o percentual de fêmeas
paridas e o número de crias. Tachibana et al. (2007), após oito administrações seguidas de 10
mg/kg de bisfenol A no início da gestação de camundongos, verificaram uma redução no
número de embriões, de crias e um aumento na mortalidade neonatal. Da mesma forma, foi
constatado que mulheres grávidas expostas ao bisfenol A conceberam bebês com peso ao
nascimento inferior a mulheres não expostas (Miao et al., 2011). Além disso, estudos têm
verificado que a exposição à ricina-A, um componente inibidor de proteína, apresenta
característica abortiva. A administração oral de mamona (rica em ricina) por 10 dias antes da
monta em coelhas resultou em uma diminuição de 4,3 vezes na taxa de gestação (Salhab et
al., 1997). Após administração por três dias consecutivos de ricina A e extrato de mamona,
Salhab et al. (1998) relataram que a gestação de coelhas foi interrompida. Estes últimos
resultados são de importância no Brasil, visto que atualmente o principal destino dos coprodutos da mamona é na forma de adubo, principalmente na hortifruticultura.
Estudos têm sugerido que a exposição à DE durante a vida fetal de ratos resulta em
mudanças irreversíveis na função reprodutiva das crias, devido ao acúmulo destes DE no
organismo, promovendo efeitos negativos sobre o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal, mesmo
após o período de exposição (Ma et al., 2006). Zimmer et al. (2008) verificaram que a
exposição de fetos caprinos ao bifenilpoliclorado, via ingestão materna, ao longo do
desenvolvimento fetal e durante a lactação, afetou a concentração de cortisol durante a
maturação sexual das crias, e este efeito foi observado meses após o período de exposição.
Além disso, diversos autores têm demonstrado que a exposição à DE durante a vida fetal pode
interferir no início da puberdade em diferentes espécies (Mouritsen et al., 2010). Segundo
Grande et al. (2007) e Ma et al. (2006), a exposição de ratas ao di-(2-etilhexil) ftalato,
considerado um DE, durante a gestação e lactação, promoveu atraso no início do primeiro cio.
Em condições fisiológicas, quando as fêmeas mamíferas entram na puberdade, ocorre
uma série de alterações, como: aumento rápido do crescimento corporal, maturação das
gônadas e do cérebro e aparecimento do primeiro estro (Hafez e Hafez, 2004). Neste período,
o GnRH produzido no hipotálamo estimula a produção e a liberação de ambas as
gonadotrofinas, LH e FSH, por meio da pituitária (adeno-hipófise; Terasawa e Fernandez,
2001). Estas gonadotrofinas agem diretamente sobre as gônadas, levando a um aumento dos
níveis plasmáticos de estradiol e de outros hormônios requeridos para ciclicidade ovariana
56
(Terasawa e Fernandez, 2001). Contudo, alguns trabalhos têm relatado que a idade de início
da puberdade depende de vários fatores, incluindo a genética e o ambiente (Parent et al.,
2003). No que se refere aos fatores ambientais, a exposição a agentes externos, como os DE,
pode interagir com receptores hormonais e interferir na síntese e no metabolismo de
hormônios, podendo alterar o início da puberdade. Essa hipótese foi comprovada por Patisaul
et al. (2009), ao verificarem que ratos recém-nascidos expostos a diferentes poluentes
ambientais (fitoestrógeno, bisfenol A e benzoato de estradiol) apresentaram puberdade
precocemente. Independentemente do mecanismo de ação, acredita-se que tais substâncias
podem interferir no desenvolvimento puberal em diferentes níveis, incluindo os sinais
neuroendócrinos no eixo hipotálamo-hipófise, bem como nas gônadas e nos órgãos-alvo
periféricos (Schoeters et al., 2008). No cérebro, os DE podem estimular neurônios,
provocando uma maturação do hipotálamo e o início da puberdade precoce ou até mesmo
prematura (Mouritsen et al., 2010). No entanto, alguns compostos podem agir de forma
contrária por meio da inibição de gonadotrofinas por um mecanismo de feedback negativo.
Salazar et al. (2004) verificaram que ratas adultas tratadas com dibutilftalato na dieta, em
doses de 12 e 50 mg/kg por 2,5 meses antes do acasalamento, durante a gestação e a lactação,
com posterior exposição direta dos filhotes até 12 semanas de idade, apresentaram um atraso
evidente na ocorrência da abertura vaginal e do primeiro estro. Por outro lado, ratas tratadas
com o di-η-butilftalato, em doses de 0,5, 5, 50, 100 ou 500 mg/kg, entre 12 e 21 dias de
gestação (Mylchreest et al., 2000), e na dose de 500 mg/kg, com início no dia 22 pós-parto
(Gray Jr. et al., 2006), não apresentaram alterações na idade à puberdade. Da mesma forma,
Lee et al. (2004) demonstraram que o di-η-butil- ftalato, nas concentrações de 20, 200, 2000 e
10000 ppm, administrado por meio da dieta, não diminuiu a idade da abertura vaginal. Além
disso, Guerra et al. (2010) não observaram efeito sobre o desenvolvimento e a função
reprodutiva de ratas cujas mães foram expostas ao di-η-butilftalato durante a gestação e a
lactação.
Em animais de laboratório e em humanos, vários estudos têm avaliado a associação
entre o momento em que ocorre a puberdade e a exposição a diferentes produtos químicos,
com ênfase nas ações endócrinas (Rasier et al., 2008; Patisaul et al., 2009). Alguns estudos
sustentam a hipótese de que os compostos exógenos podem causar efeitos clínicos,
especialmente em crianças pré-púberes, por meio da detecção dos níveis de hormônios
endógenos sexuais baixos ou mesmo indetectáveis (Mouritsen et al., 2010). Além disso, a
exposição a metais tóxicos, como chumbo e mercúrio, tem sido associada a atraso na
puberdade (Wu et al., 2003; Hauser et al., 2008). Assim, alguns estudos indicam que os
57
efeitos do chumbo sobre o eixo hipotalâmico-hipofisário (Dearth et al., 2002) estão
diretamente relacionados com a supressão da expressão do gene GnRH, considerado o gatilho
para a puberdade, constituindo, portanto, um relevante indicador do nível de alterações que
está ocorrendo no eixo hipotalâmico e, consequentemente, no perfil endócrino do indivíduo
(Gore et al., 2002).
A atrazina tem sido bastante utilizada nos últimos 40 anos, por ser um composto de
meia-vida curta com insignificante bioacumulação no solo e pouco efeito em mamíferos
adultos, sendo, pois, considerada um dos pesticidas mais seguros (Hayes, 2002). Apesar disso,
Cooper et al. (2000) relataram que este composto pode ocasionar diversas disfunções
endócrinas, incluindo atraso no início da puberdade (Stoker et al., 2002), redução no número
de células germinativas no ovário (Tavera-Mendoza et al., 2002) e indução no
envelhecimento reprodutivo prematuro, bem como na formação de tumores na glândula
mamária (Ashby et al., 2002).
Considerações finais
Em conjunto, os DE podem interferir na função reprodutiva de forma direta ou
indireta, entretanto os mecanismos envolvidos em cada fase reprodutiva são bastante
específicos, com grau diverso de sensibilidade, podendo produzir efeitos diferentes em fases
específicas ou provocar danos nas fases sucessivas. Isto se deve à grande diversidade das
estruturas químicas dos DE, o que dificulta generalizar os mecanismos intracelulares
envolvidos na sua toxicidade, bem como nos seus efeitos sobre as funções celulares. No
entanto, a maioria dos dados atualmente disponíveis deriva de experimentos realizados em
espécies de laboratório ou modelos in vitro, e, portanto, as extrapolações para outras espécies
devem ser feitas com cautela. Em ruminantes, são pouco conhecidos os impactos dos
contaminantes ambientais na função reprodutiva, bem como sua relevância sobre o
desempenho produtivo destas espécies. Ademais, existem grandes preocupações sobre a saúde
humana, uma vez que a incidência de câncer de mama em mulheres, uma doença que está
correlacionada com a exposição aos DE, está aumentando a uma taxa de 2% a cada ano
(Office for National Statistics, 2008). Neste sentido, novas investigações sobre os
mecanismos envolvidos na ação destes compostos e o fornecimento de dados sobre os níveis
de riscos serão úteis para que medidas visando à segurança à saúde pública sejam tomadas.
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Agradecimentos
Liliane Moreira Silva e bolsista de doutorado CNPq (proc. n 551634/2010-3) e
Prof. Davide Rondina é bolsista de produtividade em pesquisa do CNPq.
Referências
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Agrotóxicos e toxicologia: programa
de análise de resíduos de agrotóxicos em alimentos: relatório anual. Citação e referências a
documentos eletrônicos. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br. Acesso em: 16 set. 2010.
Al-Hiyasat AS, Darmani H, Elbetieha AM. Leached components from dental composites
and their effects on fertility of female mice. Eur J Oral Sci, v.112, p.267-272, 2004.
Ashby J, Tinwell H, Stevens J, Pastoor T, Breckenridge C. The effects of atrazine on the
sexual maturation of female rats. Regul Toxicol Pharm, v.35, p.468-473, 2002.
Avazeri N, Denys A, Lefevre B. Lead cations affect the control of both meiosis arrest and
meiosis resumption of the mouse oocyte in vitro at least via the PKC pathway. Biochimie,
v.88, p.1823-1829, 2006.
Azarnia M, Shakour A, Rostami1 P, Sanaie-Mehr A. The protective role of l-cysteine
against follicular atresia induced by lead in mouse ovary. Acta Med Iranic, v.42, p.83-88,
2004.
Aziz MH, Agrawal AK, Adhami VM, Shukla Y, Seth PK. Neurodevelopmental
consequence of gestacional exposure (GD14- GD20) to low doses of deltamethrin in rats.
Neurosci Lett, v.300, p.161-165, 2001.
Baker HWG. Male infertility. In: DeGroot LJ, Jameson JL (Ed.). Endocrinology. 4.ed.
Philadelphia, PA: W.B.Saunders, 2001. p.2308-2328.
Barros LF, Hermosilla T, Castro J. Necrotic volume increase and the early physiology of
necrosis. Comp Biochem Phys A, v.130, p.401-409, 2001.
Bellingham M, Fowler PA, Amezaga MR, Rhind SM, Cotinot C, Mandon- Pepin B,
Sharpe RM, Evans NP. Exposure to a complex cocktail of environmental endocrinedisrupting compounds disturbs the kisspeptin⁄GP 54 system in ovine hypothalamus and
pituitary gland. Environ Hlth Perspect, v.117, p.1556-1562, 2009.
Bellingham M, Fowler PA, Amezaga MR, Whitelaw CM, Rhind SM, Cotinot C,
Mandon-Pepin B, Sharpe RM, Evans NP. Foetal hypothalamic and pituitary expression of
59
Gonadotrophin-Releasing Hormone and Galanin Systems is disturbed by exposure to sewage
sludge chemicals via maternal ingestion. J Neuroendocrinol, v.22, p.527-533, 2010.
Berger RG, Foster W, de Catanzaroa D. Bisphenol-A exposure during the period of
blastocyst implantation alters uterine morphology and perturbs measures of estrogen and
progesterone receptor expression in mice. Reprod Toxicol, v.30, p.393-400, 2010.
Berger RG, Hancock T, de Catanzaro D. Influence of oral and subcutaneous bisphenol-A
on intrauterine implantation of fertilized ova in inseminated female mice. Reprod Toxicol,
v.23, p.138-144, 2007.
Berger RG, Shaw J, de Catanzaro D. Impact of acute bisphenol-A exposure upon
intrauterine implantation of fertilized ova and urinary levels of progesterone and 17βestradiol. Reprod Toxicol v.26, p.94-99, 2008.
Brevini TAL, Cillo F, Antonini S, Gandolfi F. Effects of endocrine disrupters on the oocyte
and embryo of farm animals. Reprod Domest Anim, v.40, p.291-299, 2005.
Brevini TAL, Vassena R, Paffoni A, Francisci C, Fascio U, Gandolfi F. Exposure of pig
oocytes to PCBs during in vitro maturation: effects on developmental competence,
cytoplasmic remodelling and communications with cumulus cells. Eur J Histochem, v.48,
p.347-356. 2004.
Campagna C, Sirard M, Ayotte P, Bailey JL. Impaired maturation, fertilization, and
embryonic development of porcine oocytes following exposure to an environmentally
relevant organochlorine mixture. Biol Reprod, v.65, p.554-560, 2001.
Can A, Semiz O, Cinar O. Bisphenol-A induces cell cycle delay and alters centrosome and
spindle microtubular organization in oocytes during meiosis. Mol Hum Reprod, v.11, p.389396, 2005.
Casas E, Bonilla E, Ducolomb Y, Betancourt M. Differential effects of herbicides atrazine
and fenoxaprop-ethyl, and insecticides diazinon and malathion, on viability and maturation of
porcine oocytes in vitro. Toxicol In vitro, v.24, p.224-230, 2010.
Cooper RL, Stoker TE, Tyrey L, Goldman JM, McElroy WK. Atrazine disrupts the
hypothalamic control of pituitary-ovarian function. Toxicol Sci, v.53, p.297-307, 2000.
Dearth RK, Hiney JK, Srivastava V, Burdick SB, Bratton GR, Dees WL. Effects of lead
(Pb) exposure during gestation and lactation on female pubertal development in the rat.
Reprod Toxicol, v.16, p.343-352, 2002.
Dobranic T, Dobranic V, Tomaskovic A, Cergolj M, Bedrica L, Markovic D. The effect
of cadmium salts on plasma hormone levels and histopathology of the ovaries in female
rabbits. Tierarztl Umsch, v.57, p.539-540, 2002.
60
Ducolomb Y, Casas E, Valdéz A, González G, Altamirano-Lozano M, Betancourt M. In
vitro effect of malathion and diazinon on oocytes fertilization and embryo development in
porcine. Cell Biol Toxicol, v.25, p.623-633, 2009.
Eichenlaub-Ritter U, Vogt E, Cukurcam S, Sun F, Pacchierotti F, Parry J. Exposure of
mouse oocytes to bisphenol A causes meiotic arrest but not aneuploidy. Mutat Res, v.651,
p.82-92, 2008.
Farber JL. Membrane injury and calcium homeostasis in the pathogenesis of coagulative
necrosis. Lab Invest, v.47, p.114-123, 1982.
Feugier A, Frelon S, Gourmelon P, Claraz M. Alteration of mouse oocyte quality after a
subchronic exposure to depleted uranium. Reprod Toxicol, v.26, p.273-277, 2008.
Fowler PA, Dorà NJ, McFerran H, Amezaga MR, Miller DW, Lea RG, Cash P,
McNeilly AS, Evans NP, Cotinot C, Sharpe RM, Rhind SM. In utero exposure to low
doses of environmental pollutants disrupts fetal ovarian development in sheep. Mol Hum
Reprod, v.14, p.269-280, 2008.
Garry VF, Harkins M, Lyubimov A, Erickson L, Long L. Reproductive outcomes in
women of the Red River Valley of the north. I. The spouses of pesticide applicators:
pregnancy loss, age at menarche, and exposures to pesticides. J Toxicol Environ Hlth, v.65,
n.11, p.769-786, 2002.
Gore AC, Wu TJ, Oung T, Lee JB, Woller MJ. A novel mechanism for endocrinedisrupting effects of polychlorinated biphenyls: direct effects on gonadotropin-releasing
hormone neurons. J Neuroendocrinol, v.14, p.814-823, 2002.
Grande SW, Andrade JM, Talsness CE, Grote K, Golombiewski A, Sterner-Kock A,
Chahoud I. A dose-response study following in utero and lactational exposure to di-(2ethylhexyl) phthalate (DEHP): reproductive effects on adult female offspring rats.
Toxicology, v.229, p.114-122, 2007.
Grasselli F, Baratta L, Baioni L, Bussolati S, Ramonib R, Grolli S, Basini G. Bisfenol A
disrupts granulosa cell function. Domest Anim Endocrin, v.39, p.34-39, 2010.
Gray Jr. LE, Laskey J, Ostby J. Chronic di-η-butyl phthalate exposure in rats reduces
fertility and alters ovarian function during pregnancy in female Long Evans Hooded rats.
Toxicol Sci, v.93, p.189-95, 2006.
Guerra MT, Scarano WR, Toledo FC, Franci JAA, Kempinas WG. Reproductive
development and function of female rats exposed to di-η-butyl-phthalate (DBP) in utero and
during lactation. Reprod Toxicol, v.29, p.99-105, 2010.
Hafez ESE, Hafez B. Reprodução animal. 7.ed. São Paulo: Manole, 2004. p.173-180.
61
Hausburg MA, DeKrey GK, Salmen JJ, Palic MR, Gardiner CS. Effects of paraquat on
development of preimplantation embryos in vivo and in vitro. Reprod Toxicol, v.20, p.239246, 2005.
Hauser R, Sergeyev O, Korrick S, Lee MM, Revich B, Gitin E, Burns JS, Williams PL.
Association of blood lead levels with onset of puberty in Russian boys. Environ Hlth
Perspect, v.116, p.976-980, 2008.
Hayes TB, Collins A, Lee M, Mendoza M, Noriega N, Stuart A, Vonk A. Hermaphroditic,
demasculinized frogs after exposure to the herbicide atrazine at low ecologically relevant
doses. Proc Natl Acad Sci USA, v.99, p.5476-5480, 2002.
Hunt PA, Koehler KE, Susiarjo M, Hodges CA, Ilagan A, Voigt RC, Thomas S, Thomas
BF, Hassold TJ. Bisfenol A exposurecauses meiotic aneuploidy in the female mouse. Curr
Biol, v.13, p.546-553, 2003.
Hussein M R. Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms. Hum Reprod Update, v.11,
p.162-178, 2005.
Kamarianos A, Karamanlis X, Goulas P, Theodosiadou E, Smokovitis A. The presence of
environmental pollutants in the follicular fluid of farm animals (cattle, sheep, goats, and pigs).
Reprod Toxicol, v.17, p.185-190, 2003.
Kavlock RJ, Ankley, GT. A perspective on the risk assessment process for endocrinedisruptive effects on wildlife and human health. Risk Anal, v.6, p.16, 1996.
Lee KY, Shibutani M, Takagi H, Kato N, Takigami S, Uneyama C, Hirose M. Diverse
developmental toxicity of di-η-butyl phthalate in both sexes of rat offspring after maternal
exposure during the period from late gestation through lactation. Toxicology, v.203, p.221238, 2004.
Lenie S, Cortvrindt R, Eichenlaub-Ritter U, Smitz J. Continuous exposure to bisfenol A
during in vitro follicular development induces meiotic abnormalities. Mutat Res, v.651, p.7181, 2008.
Leoni G, Bogliolo L, Deiana G, Berlinguer F, Rosati I, Pintus PP, Ledda S, Naitana S.
Influence of cadmium exposure on in vitro ovine gamete dysfunction. Reprod Toxicol, v.16,
p.371-377, 2002.
Lovekamp-Swan T, Davis BJ. Mechanisms of phthalate ester toxicity in the female
reproductive system. Environ Hlth Perspect, v.111, p.139-145, 2003.
Ma M, Kondo T, Ban S, Umemura T, Kurahashi N, Takeda M, Kishi R. Exposure of
prepubertal female rats to inhaled di(2-ethylhexyl)phthalate affects the onset of puberty and
postpubertal reproductive functions. Toxicol Sci, v.93, p.164-171, 2006.
62
Majdič G. Endocrine disrupting chemicals and domestic animals. Slov Vet Res, v. 47, p.5-11,
2010.
Meador JP, McCaarty LS, Escher BI, Adams WJ. The tissue-residue approach for toxicity
assessment: concepts, issues, applications, and recommendations. J Environ Monitor, v.10,
p.1486-1498, 2008.
Miao M, Yuan W, Zhu G, He X, Li De-K. In utero exposure to bisphenol-A and its effect
on birth weight of offspring. Reprod Toxicol, v.32 p.64-68, 2011.
Mlynarcikova A, Kolena J, Fickova M, Scsukova S. Alterations in steroid hormone
production by porcine ovarian granulosa cells caused by bisphenol A and bisphenol A
dimethacrylate. Mol Cell Endocrinol, v.244, p.57-62, 2005.
Mlynarcikova A, Nagyova E, Fickov M, Scsukova S. Effects of selected endocrine
disruptors on meiotic maturation, cumulus expansion, synthesis of hyaluronan and
progesterone by porcine oocyte-cumulus complexes. Toxicol In vitro, v.23, p.371-377, 2009.
Mouritsen A, Aksglaede L, Sørensen K, Sloth Mogensen S, Leffers H, Main KM,
Frederiksen H, Andersson AM, Skakkebaek NE, Juul A. Hypothesis: exposure to
endocrine-disrupting chemicals may interfere with timing of puberty. Int J Androl, v.33,
p.346-359, 2010.
Mylchreest E, Wallace DG, Cattley RC, Foster PMD. Dose-dependent alterations in
androgen-regulated male reproductive development in rats exposed to di(η-butyl) phthalate
during late gestation. Toxicol Sci, v.55, p.143-51, 2000.
Nandi S, Gupta PS, Selvaraju S, Roy SC, Ravindra JP. Effects of exposure to heavy
metals on viability, maturation, fertilization, and embryonic development of buffalo (Bubalus
bubalis) oocytes in vitro. Arch Environ Con Toxicol, v.58, p.194-204, 2010.
Office for National Statistics. Cancer statistics registrations: registrations of cancer
diagnosed in 2005, England. London, UK: National Statistics, 2008. (Series MB1 no. 36).
Ounnas F, Feidt C, Toussaint H, Marchand P, Bizec BL, Rychen G, Jurjanz S.
Polychlorinated biphenyl and low polybrominated diphenyl ether transfer to milk in lactating
goats chronically exposed to contaminated soil. Environ Sci Technol, v.44, p.2682-2688,
2010.
Parent AS, Teilmann G, Juul A, Skakkebaek NE, Toppari J, Bourguignon JP. The
timing of normal puberty and the age limits of sexual precocity: variations around the world,
secular trends, and changes after migration. Endocr Rev, v.24, p.668-693, 2003.
63
Patisaul HB, Todd KL, Mickens JA, Adewale HB. Impact of neonatal exposure to the
ERalpha agonist PPT, bisphenol-A or phytoestrogens on hypothalamic kisspeptin fiber
density in male and female rats. Neurotoxicology, v.30, p.350-357, 2009.
Paul C, Rhind SM, Kyle CE, Scott H, McKinnell C, Sharpe RM. Cellular and hormonal
disruption of fetal testis development in sheep reared on pasture treated with sewage sludge.
Environ Hlth Persp, v.113, p.1580-1587, 2005.
Petro EML, Leroy JLMR., Covaci A, Fransen E, Neubourg DD, Dirtu AC, Pauw ID,
Bols PEJ. Endocrine-disrupting chemicals in human follicular fluid impair in vitro oocyte
developmental competence. Hum Reprod, v.0, p.1-9, 2012.
Perez-Reyes PL, Sanchez-Alonso JA, Lopez-Aparicio P, Recio MN, Perez-Albarsanz
MA. Different molecular capacity in the induction of apoptosis by polychlorinated biphenyl
congeners in rat renal tubular cell cultures. Biosci Reprod, v.21, p.765-778, 2001.
Pocar P, Augustin R, Gandolfi F, Fischer B. Toxic effects of in vitro exposure to p-tertoctylphenol on bovine oocyte maturation and developmental competence. Biol Reprod, v.69,
p.462-468, 2003.
Pocar P, Brevini TA, Perazzoli F, Cillo F, Modina S, Gandolfi F. Cellular and molecular
mechanisms mediating the effects of polychlorinated biphenyls on oocyte developmental
competence in cattle. Mol Reprod Dev, v.60, p.535-541, 2001a.
Pocar P, Nestler D, Risch M, Fischer B. Apoptosis in bovine cumulus–oocyte complexes
after exposure to polychlorinated biphenyl mixtures during in vitro maturation. Reproduction,
v130, p.857-868, 2005.
Pocar P, Perazzoli F, Luciano AM, Gandolfi F. In vitro reproductive toxicity of
polychlorinated biphenyls: effects on oocyte maturation and developmental competence in
cattle. Mol Reprod Dev, v.58, p.411-416, 2001b.
Rasier G, Parent AS, Gerard A, Denooz R, Lebrethon MC, Charlier C, Bourguignon JP.
Mechanisms of interaction of endocrinedisrupting chemicals with glutamate-evoked secretion
of gonadotropin- releasing hormone. Toxicol Sci, v.102, p.33-41, 2008.
Rhind SM, Evans NP, Bellingham M, Sharpe RM, Cotinot C, Mandon-Pepin B, Loup B,
Sinclair KD, Lea RG, Pocar P, Fischer B, van der Zalm E, Hart K, Schmidt JS,
Amezaga MR, Fowler PA. Effects of environmental pollutants on the reproduction and
welfare of ruminants. Animal, v.4, p.1227-1239, 2010.
Rodriguez-Tellez BE, Marcano L, Villamediana-Monreal PC. Effects of cadmium
chloride exposure on in vitro maturation of bovine oocytes. Rev Cient, v.15, p.443-450, 2005.
64
Rubin BS. Bisphenol A: an endocrine disruptor with widespread exposure and multiple
effects. J Steroid Biochem, v.127, p.27-34, 2011.
Salazar V, Castillo C, Ariznavarreta C, Campón R, Tresguerres JAF. Effect of oral
intake of dibutyl phthalate on reproductive parameters of Long Evans rats and pre-pubertal
development of their offspring. Toxicology, v.205, p.131-137, 2004.
Salazar Z, Ducolomb Y, Betancourt M, Bonilla E, Cortés L, Hernández-Hernández F,
González-Márquez H. Gene expression analysis on the early development of pig embryos
exposed to malathion. Int J Toxicol, v.26, p.143-149, 2007.
Salhab AS, Al-Tamimi SO, Gharaibeh MN, Shomaf MS. The abortifacient effects of
castor bean extract and ricin A-chain in rabbits. Contracept, v.58, p.193-197, 1998.
Salhab AS, Issa AA, Alhougog I. On the contraceptive effect of castor beans. Int J
Pharmacogn, v.35, p.63-65, 1997.
Salhab AS, Shomaf MS, Gharaibeh MN, Amer NA. Effects of castor bean extract and ricin
a-chain on ovulation and implantation in rabbits. Contraception, v.59, p.395-399, 1999.
Saumande J. La folliculogenèse chez les ruminants. Rec Med Vét, v.167, p205-218, 1991.
Schoeters G, Den Hond E, Dhooge W, van Larebeke N, Leijs M. Endocrine disruptors and
abnormalities of pubertal development. Basic Clin Pharmacol Toxicol, v.102, p.168-175,
2008.
Schonfelder G, Wittfoht W, Hopp H, Talsness CE, Paul M, Chahoud I. Parent bisphenol
A accumulation in the human maternal–fetal–placental unit. Environ Health Perspect, v.110,
p.703-707, 2002.
Silberstein T, Saphier O, Paz-Tal O, Trimarchi JR, Gonzalez L, Keefe DL. Lead
concentrates in ovarian follicle compromises pregnancy. J Trace Elem Med Biol, v.20, p.205207, 2006.
Stoker TE, Guidici DL, Laws SC, Cooper RL. The effects of atrazine metabolites on
puberty and thyroid function in the male Wistar rat. Toxicol Sci, v.67, p.198-206, 2002.
Sultan C, Balaguer P, Terouanne B, Georget V, Paris F, Jeandel C, Lumbroso S, Nicolas
J. Environmental xenoestrogens antiandrogens and disorders of male sexual differentiation.
Mol Cell Endocrinol, v.178, p.99-105, 2001.
Tachibana T, Wakimoto Y, Nakamuta N, Phichitraslip T, Wakitani S, Kusakabe K,
Hondo E, Kiso Y. Effects of bisphenol A (BPA) on placentation and survival of the neonates
in mice. J Reprod Dev, v.53, p.509-514, 2007.
65
Takahashi O, Oishi S. Disposition of orally administered 2,2-bis(4-hydroxyphenyl) propane
(bisphenol A) in pregnant rats and the placental transfer to fetuses. Environ Health Perspect,
v.108, p.931-935, 2000.
Tavera-Mendoza L, Ruby S, Brousseau P, Fournier M, Cyr D, Marcogliese D. Response
of the amphibian tadpole Xenopus laevis to atrazine during sexual differentiation of the ovary.
Environ Toxicol Chem, v.21, p.1264-1267, 2002.
Terasawa E, Fernandez DL. Neurobiological mechanisms of the onset of puberty in
primates. Endocr Rev, v.22, p.111-151, 2001.
Tilly JL. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nat Rev Mol Cell
Biol, v.2, p.838-848, 2001.
Van Den Hurk R, Zhao J. Formation of mammalian oocytes and their growth,
differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology, v.63, p.1717-1751,
2005.
Waller RF, Ralph SA, Reed MB, Su V, Douglas JD, Minnikin DE, Cowman AF, Besra
GS, Mc Fadden GI. A type II pathway for fatty acid biosynthesis presents drug targets in
Plasmodium falciparum. Antimicrob Agents Chemother, v.47, p.297-301, 2003.
Wu T, Buck GM, Mendola P. Blood lead levels and sexual maturation in u.s. girls: the third
national health and nutrition examination survey, 1988-1994. Environ Health Perspect, v.111,
p.737-741, 2003.
Younglai EV, Foster WG, Hughes EG, Trim K, Jarrell JF. Levels of environmental
contaminants in human follicular fluid, serum, and seminal plasma of couples undergoing in
vitro fertilization. Arch Environ Contam Toxicol, v.43, p.121-126, 2002.
Zhou W, Liu J, Liao L, Han S, Liu J. Effect of bisphenol A on steroid hormone production
in rat ovarian theca-interstitial and granulosa cells. Mol Cell Endocrinol, v.283, p.12-18,
2008.
Zimmer KE, Gutle AC, Lyche JL, Dahl E, Oskam IC, Krogenæs A, Skaare JU, Ropstad
E. Altered stress-induced cortisol levels in goats exposed to polychlorinated biphenyls (PCB
126 and PCB 153) during fetal and postnatal development. J Toxicol Environ Health, v.72,
p.164-172, 2008.
66
Tabela 1. Principais efeitos dos desreguladores endócrinos sobre maturação oocitária em função da espécie estudada.
Espécie
Búfalo
Tipo DE
Metais pesados
Camundongo
Bovino
Urânio
Bifenilpoliclorado
Ovino
Suíno
Camundongo
Efeito
Retarda o crescimento e desenvolvimento de
oócitos in vitro
Diminuição da qualidade oocitária
Redução da maturação oócitária, a fecundação e,
competência do desenvolvimento
Referências
Nandi et al., 2010
Feugier et al., 2008
Pocar et al., 2001a
Pocar et al., 2001b
Cádmio
Diminuição na taxa de maturação oocitária e Leoni et al., 2002
fertilização
Atrazina, fenoxapropetil, Inibição maturação nuclear
Casas et al., 2010
diazinona e malationa
Bifenilpoliclorado
Desorganização do fuso meiótico
Brevini et al., 2004
Organoclorado
Redução da taxa de maturação
Campagna et al., 2001
Bisfenol A
Parada da atividade meiótica
Eichenlaub-Ritter et al., 2008
Lenie et al., 2008
Bisfenol A
Bisfenol A
Alteração cromossômica
Desorganização do fuso meiótico
Hunt et al., 2003
Can et al., 2005
67
Tabela 2. Distribuição geográfica da literatura sobre o efeito dos desreguladores endócrinos na função reprodutiva.
País
Alemanha
Espécie
Rato
Classe
Ftalato
Utilização
Plastificante
Rato
Tipo DE
Di-(2-etilhexil)
ftalato
Di-η-butilftalato
Brasil
Ftalato
Plastificante/ ectoparasita
Canadá
Camundongo
Bisfenol A
Difenol
França
Caprino
Bifenilpoliclorado
Organoclorado
Espanha
Rato
Dibutilftalato
Ftalato
Não foi observado efeito no Guerra et al., 2010
desempenho reprodutivo de
fêmeas
Plastificante
Redução na taxa de parição Berger et al., 2007
e prolificidade
Isolantes de equipamentos Resíduo no leite
Ounnas et al., 2010
elétricos e óleo lubrificante
Plastificante/ ectoparasita
Atraso na puberdade
Salazar et al., 2004
Japão
Camundongo
Bisfenol A
Difenol
Plastificante
Ratos
Ftalato
Plastificante
Coelho
Di-(2-etilhexil)
ftalato
Ricina A
Coelho
Ricina A
Noruega
Caprino
Bifenilpoliclorado
Reino
Unido
Ovino
Lodo de esgoto
-
-
Ovino
Coquetel de DE
-
-
Jordânia
Proteína inibidora Adubo orgânico
de ribossomos
Proteína inibidora Adubo orgânico
de ribossomos
Organoclorado
Isolantes de equipamentos
elétricos e óleo lubrificante
Efeito
Atraso no primeiro estro
Referências
Grande et al., 2007
Redução no número de Tachibana et al., 2007
embriões e crias e aumento
na mortalidade neonatal
Atraso no primeiro estro
Ma et al., 2006
Redução
gestação
Aborto
na
taxa
de Salhab et al., 1997
Salhab et al., 1998
Alteração na secreção de Zimmer et al., 2008
cortisol durante a vida fetal
e após a exposição
Redução na expressão do Bellingham, et al., 2010
gene mRNA para GnRH
Alteração
no
padrão Bellingham, et al., 2009
hormonal da pituitária fetal,
sem influência no padrão
materno
68
Rússia
USA
Humano
Rato
Construção civil
Plastificante/ Alimentação
Atraso na puberdade
Puberdade precose
Wu et al., 2003
Patisaul et al., 2009
Rato
Metal pesado
Metal
Bisfenol A e Difenol/Não
esteroide
fitoestrógeno
Di-η-butilftalato
Ftalato
Plastificante/ ectoparasita
Não influencia a puberdade
Gray Jr. et al., 2006
Rato
Dibutilftalato
Ftalato
Plastificante/ ectoparasita
Não influencia a puberdade
Mylchreest et al., 2000
Rato
Atrazina
Triazina
Herbicida
Atraso na puberdade
Stoker et al., 2002
Rato
Atrazina
Triazina
Herbicida
Tumores
mamária
na
glândula Ashby et al., 2002
69
7 CAPÍTULO 2
Uso de farelo de mamona (Ricinus communis L.) como fonte de proteína na dieta de
caprinos durante o período de monta: impacto sobre a resposta reprodutiva e
metabólica
Use of castor meal (Ricinus communis L.) as source of dietary protein in goats during the
mating period: impact on reproductive and metabolic responses
Periódico: Semina: Ciências Agrárias (aceito para publicação)
70
Resumo
Objetivou-se avaliar o efeito da substituição total do farelo de soja por farelo de mamona
detoxificado ou não sobre a resposta à sincronização do estro, taxa de concepção,
desenvolvimento fetal inicial, presença de IgG e resposta metabólica-hormonal. Sessenta
cabras mestiças foram alimentadas sem farelo de mamona (SFM), com farelo de mamona
detoxificado (FMD) e com farelo de mamona (FM) durante a gestação inicial. Todos os
animais tiveram o estro sincronizado, seguido de monta natural. A partir do 25º dia após a
monta, foi determinado o número de fetos e realizado o acompanhado do desenvolvimento
dos mesmos por ultrassonografia até os 60 dias de gestação. Foi avaliado o perfil de
progesterona (P4), os níveis de metabólitos e a resposta imunológica. A partir do 15º dia de
alimentação a imunoglobulina G (IgG) foi marcada através da técnica de Western Blotting,
apenas em animais que receberam farelo de mamona não detoxificado. Não houve efeito
(P>0,05) do tipo de dieta sobre a resposta à sincronização do estro, níveis plasmáticos de P4,
taxa de gestação e desenvolvimento embrionário/fetal. Em cabras gestantes, observou-se um
efeito da dieta (P<0,001) sobre os níveis plasmáticos de uréia em animais de gestação
múltipla, de gama-glutamil transferase (GGT) em gestação simples e de lactato desidrogenase
(LDH) em ambos os tipos de gestação. Verificou-se entre cabras não gestantes e gestantes um
aumento significativo nos níveis de ureia em todos os tipos de dietas e de LDH em cabras do
grupo SFM, porém o nível de GGT diminuiu nos grupos SFM e FM em cabras não gestantes
(P>0,05) quando comparado a cabras gestantes. Além disso, os níveis plasmáticos de LDH
em cabras do grupo SFM e de ureia em todos os tipos de dieta foram maiores nas cabras não
gestantes em comparação com cabras gestantes Pode-se inferir que a inclusão de 15% de
farelo de mamona detoxificado ou não na dieta de cabras não afeta o desempenho
reprodutivo, bem como o desenvolvimento embrionário e fetal inicial e metabólitos no
sangue.
Palavras-chave: Ricinus communis L. Desenvolvimento fetal. Metabólitos. Caprino.
71
Use of castor meal (Ricinus communis L.) as source of dietary protein in goats during the
mating period: impact on reproductive and metabolic responses
Uso de farelo de mamona (Ricinus communis L.) como fonte de proteína na dieta de
caprinos durante o período de monta: impacto sobre a resposta reprodutiva e
metabólica
Liliane Moreira Silva*1; Cláudio Henrique de Almeida Oliveira2; Cleidson Manoel Gomes da
Silva3; Aline Maia Silva4; César Carneiro Linhares Fernandes1; Roselayne Ferro Furtado5;
Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro6; Maria Izabel Florindo Guedes7; Davide Rondina6
Running head: Effects of castor meal on goat reproductive performance
1
Discentes de Doutorado em Ciências Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade
Estadual
do
Ceará,
Fortaleza-CE,
Brasil.
E-mail:
[email protected];
[email protected]
2
Discente de Doutorado em Biotecnologia, RENORBIO, Fortaleza-CE, Brasil. E-mail:
[email protected]
3
Médico Veterinário, Dr. em Ciências Veterinárias, Pesquisador da Universidade Estadual do
Ceará, Fortaleza-CE, Brasil. E-mail: [email protected]
4
Discente de Mestrado em Ciências Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade
Estadual do Ceará, Fortaleza-CE, Brasil. E-mail: [email protected]
5
Bióloga, Dra. em Biotecnologia, Pesquisadora da Embrapa Agroindústria Tropica, Fortaleza-
CE, Brasil. E-mail: [email protected]
6
Prof. Adjunto da Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza-CE,
Brasil. E-mail: [email protected]; [email protected]
7
Profa. Adjunta do Centro de Ciências as Saúde, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza-
CE, Brasil. E-mail: [email protected]
72
Summary
The aim of the present study was to evaluate the effect of total substitution of soybean meal
with castor meal detoxified or not on the response to oestrous synchronization, conception
rate, early fetal development, presence of IgG and metabolic-hormonal response. Sixty mixed
goats were fed diets without castor meal (WCM), with detoxified castor meal (DCM) and
with castor meal (CM) during early pregnancy. Oestrous was synchronized in all does,
followed by mating. Starting on the 25th day after mating, the number of fetuses was
determined and their development was followed by ultrasonography up to 60 days of
pregnancy. Plasma levels of progesterone (P4), liver enzymes and urea were determined along
with evaluation of immunological response. As of 15th day of experimental feeding,
immunoglobulin G (IgG) was detected by Western blotting only in goats that received nondetoxified castor meal. There was no effect (p>0.05) of type of diet on response to oestrous
synchronization, plasma P4 level, conception rate and embryonic/fetal development. In
pregnant goats, we observed an effect of diet (p<0.001) on plasma urea levels in multiplebirth pregnancy, gamma-glutamyltransferase (GGT) in single-birth pregnancy and lactate
dehydrogenase (LDH) in both types of pregnancy. It was verified between non-pregnant and
pregnant goats a significant increase in the urea levels in all types of diets and LDH in goat of
group WCM, but GGT levels decreased in groups WCM and CM in non-pregnant goats
(p>0.05). In addition, plasma levels of LDH in goats of group WCM and of urea in all types
of diet were higher in non-pregnant goats when compared to pregnant goats. In conclusion,
we can infer that the inclusion of 15% castor meal detoxified or not to the diet of goats does
not affect the reproductive performance, as well as embryonic and early fetal development
and blood metabolites.
Keywords: goat, Ricinus communis L., fetal development, , metabolites, goat
Resumo
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da substituição total do farelo de soja por
farelo de mamona detoxificado ou não sobre a resposta à sincronização do estro, taxa de
concepção, desenvolvimento fetal inicial, presença de IgG e resposta metabólica-hormonal.
Sessenta cabras mestiças foram alimentadas sem farelo de mamona (SFM), com farelo de
mamona detoxificado (FMD) e com farelo de mamona (FM) durante a gestação inicial. Todos
os animais tiveram o estro sincronizado, seguido de monta natural. A partir do 25º dia após a
73
monta, foi determinado o número de fetos e realizado o acompanhado do desenvolvimento
dos mesmos por ultrassonografia até os 60 dias de gestação. Foi avaliado o perfil de
progesterona (P4), os níveis de metabólitos e a resposta imunológica. A partir do 15º dia de
alimentação a imunoglobulina G (IgG) foi marcada através da técnica de Western Blotting,
apenas em animais que receberam farelo de mamona não detoxificado. Não houve efeito
(p>0,05) do tipo de dieta sobre a resposta à sincronização do estro, níveis plasmáticos de P4,
taxa de gestação e desenvolvimento embrionário/fetal. Em cabras gestantes, observou-se um
efeito da dieta (p<0,001) sobre os níveis plasmáticos de uréia em animais de gestação
múltipla, de gama-glutamil transferase (GGT) em gestação simples e de lactato desidrogenase
(LDH) em ambos os tipos de gestação. Verificou-se entre cabras não gestantes e gestantes um
aumento significativo nos níveis de ureia em todos os tipos de dietas e de LDH em cabras do
grupo SFM, porém os níveis de GGT diminuiu nos grupos SFM e FM em cabras não
gestantes (p>0,05). Além disso, os níveis plasmáticos de LDH em cabras do grupo SFM e de
ureia em todos os tipos de dieta foram maiores nas cabras não gestantes em comparação com
cabras gestantes. Em conclusão, pode-se inferir que a inclusão de 15% de farelo de mamona
detoxificado ou não na dieta de cabras não afeta o desempenho reprodutivo, bem como o
desenvolvimento embrionário e fetal inicial e metabólitos no sangue.
Palavras-chave: Ricinus communis L., desenvolvimento fetal, metabolites, caprino
Introduction
The production of biodiesel from oilseeds in Northeast Brazil has been received incentives
strong on the social inclusion of small farmers, mainly in the semi-arid region. Therefore, in
the last years, great efforts have been made at extending the use of castor bean (Ricinus
communis L.), due to its great edaphoclimatic adaptability. However, has generated great
environmental concerns with respect to the fate of residues produced, due to the presence of
potentially toxic compounds (ricin) (EFSA, 2008). Ricin is a toxin capable of inactivating
protein synthesis in eukaryotic cells (AUDI et al., 2005). In sheep, Aslani et al. (2007) found
that feed containing residues of castor bean caused cardiovascular, hepatic and
gastrointestinal alterations, followed by death. Despite the presence of ricin in castor meal,
studies have demonstrated that this byproduct has a high protein value (39 - 43%) and good
ruminal degradability (ABDALLA et al., 2008), making it attractive for use as an alternative
dietary source for ruminants (DINIZ et al., 2011). Therefore, it is necessary to adopt methods
74
that promote the inactivation of ricin, where alkaline treatment is the most recommended
(OLIVEIRA et al., 2010).
To date, the majority of studies have evaluated the effect of castor meal as an alternative
protein source for ruminants, only with regard to nutritional and production performance
aspects (OLIVEIRA et al., 2010; DINIZ et al., 2010), while no studies have investigated the
effects of long term diet with castor meal on reproductive performance in goats. Therefore,
the aim of the present study was to evaluate the effect of total substitution of soybean meal
with castor meal detoxified or not on the response to oestrous synchronization, conception
rate, early fetal development, presence of IgG and metabolic-hormonal response.
Material and Methods
Detoxication of castor bean and quantification of ricin
Castor meal was obtained from the factory BOM Brasil, located in Salvador - Bahia.
Detoxication was carried out according to Oliveira et al. (2010), with some modifications.
Castor meal was added to a solution of calcium oxide (CaO) (1 kg per 9 liters of water) at a
proportion of 60 g CaO/kg castor meal. After standing overnight (12-18 h) for the
detoxification process to occur, the treated material was dried for storage and later utilization.
This technique was chosen because it was efficacious, simple and easy to reproduce by the
producer.
The absence of ricin after the detoxification process was verified by polyacrylamide gel
electrophoresis in a 12% gel, under non-denaturing conditions (native-PAGE), performed in a
vertical mini-gel system with a Bio-Rad PowerPac Basic unit, where gels were stained with
Coomassie Blue R250. Ricin was quantified by assaying the total proteins of samples of
detoxified and non-detoxified castor meal, following the method of Bradford (1976) with
albumin serum bovine as the protein standard. Later, the image of the polyacrylamide gel was
digitized in ImageScanner™ of GE Healthcare (compatible with ImageMaster software) and
then analyzed by the program Image Master Platinum. The protein bands were quantified in
volume units (area vs. intensity) following the method described by Meunier et al. (2005).
Animals and experimental design
75
The experiment was conducted on Padre João Piamarta Farm, in Itaitinga-CE, located at 4º
01’ S and 38º 31’ W, in the period of April to July. The area, characterized by a constant
photoperiod regimen, has a warm, tropical, sub-humid climate with a mean annual rainfall
and temperature of 1.416,4 mm and 26 - 28º C, respectively, with two distinct seasons: rainy
from January to May and dry from June to December
Sixty mixed-breed goats cyclical and pluriparous were grouped into three lots (n = 20)
homogeneous (mean ± SEM) in weight, body condition and age (33.34 ± 1.05 kg, 2.34 ± 0.09
and 27.88 ± 0.95 months, respectively). Goats were kept in two pens separated by a central
feed alley, where receiving mineral salt and water ad libitum. Each pen measured 40 x 50 m
and contained a 40 x 3 m open front shelter. The feed alley and the front shelter was clay with
concrete and faced in east-west direction. Goats were submitted to thirty days of housing
adaptation. During this period, internal and external parasites treatment and control of ovary
function by ultrasonography was performed.
The does received three diets composed of mixture of guinea grass hay (Panicum
maximum v. Mombasa) and isoenergetic (74% of TDN) and isonitrogenous (14% CP on DM
basis) concentrates with different source of nitrogen (Table 1 and 2): soybean meal (WCM),
detoxified castor meal (DCM) and castor meal (CM). The formulation of diets was based
according to the nutritional requirements of mating and early pregnancy (NRC, 2007) for
adult non-dairy does and presents the same roughage:concentrate ratio (30:70). The diets were
provided twice a day (07:00 and 15:00) from 9 days before estrous synchronization with
continuation up to the 60th day of pregnancy (Fig. 1).
Oestrous was induced in all females using an intravaginal device (Controlled Internal Drug
Release device, CIDR®), impregnated with 0.33 g P4 (Eazi-Breed CIDR®, InterAg, Hamilton,
New Zealand), which was put in place for 5 days. Upon removal the device, the goats
received an application of 1 mL of prostaglandin F2α (Lutalyse®, Pfizer, Kalamazoo, USA),
according described by Silva et al. (2011). Next, males of proven fertility and marked in the
sternal region were placed together with the females for a period of 72 h, allowing the mated
females to be identified by the presence of the marker paint in the region of the croup.
Western blotting
The presence IgG was assayed by Western blotting, according to Furtado et al. (2011),
with some modifications. We utilized the 12% polyacrylamide gel run under non-denaturing
76
conditions with samples of crude extract of detoxified and non-detoxified castor meal.
Proteins in the gel were transferred to a nitrocellulose membrane using the Semi-Dry Transfer
system, utilizing transfer buffer and the application of 38 mA and 38 V for two hours. After
transfer, the membrane was blocked with 5% Molico® (Nestlé) in PBS and the primary
antibody (goat plasma of does fed detoxified or non-detoxified castor meal) was added. The
membrane was then incubated in a humid chamber for 2 h at 37 ºC, and washed 4 times for 15
min with Molico® solution. Next, secondary antibody (anti-goat IgG peroxidase conjugated,
diluted 1:5000) was added, and the membrane was again incubated under the same
conditions. After the incubation period, the membrane was washed twice with Molico®
solution, once with PBS and finally with water. Color development was performed with 30%
hydrogen peroxide, nickel chloride and Tris-HCl buffer, pH 7.2. The blood samples were
collected before (Day 0) and on days 15, 25 and 35 after feeding period (Fig. 1).
Blood sampling, liver enzymes, urea and progesterone assays
Blood samples were collected on days -15, 0, 10, 20, 30, 40, 50 and 60 after mating, for
determination of metabolites in heparinized tubes by jugular venipuncture (Fig. 1). Blood was
centrifuged at 3000 rpm for 15 min, and the plasma obtained was frozen at -20 ºC, until
analysis. Plasma concentrations of urea, lactate dehydrogenase (LDH), aspartate
aminotransferase (AST) and gamma glutamyl transferase (GGT) were determined by
spectrophotometric assays in an automated biochemical analyzer (Konelab, Wiener®),
utilizing commercial kits (Wiener Laboratorios, Rosario, Argentina). In addition, upon
removal of the CIDR® (day 0) and on days 4, 8, 12, 16 and 20 after removal of the device,
blood samples were collected for P4 determination (Fig. 1) by microparticle enzyme
immunoassay (MEIA) (Abbott Diagnostics AxSYM® SYSTEM), using a commercial kit
(Axsym P4, Abbott Japan Co, Ltda,Tokyo 106-8535 Japan). The sensitivity of the test was of
0.2 ng/mL and the intra- and interassay coefficient of variation was 7.9% and 3.3%,
respectively.
Embryonic and fetal measurements
Diagnosis of pregnancy, done on the 25th day of pregnancy, as well as the determination
of the number of fetuses and monitoring of embryonic/fetal development, was carried out by
real-time ultrasonography (Chisson D600 VET, Chisson Medical Imaging Co. Ltd., China),
77
utilizing a linear transrectal transducer of 3.5 - 5.0 MHz. The fetal measurements in goats fed
WCM (n = 18), DCM (n = 20) and CM (n = 20) were performed every five days. The
following parameters were evaluated according to methods proposed by Santos et al. (2004):
vesicle diameter (VD), from the 25th to 45th day of pregnancy; Crown-rump length (CRL),
from the 30th to 50th day of pregnancy; and biparietal diameter (BPD) and abdominal
diameter (AD), from the 40th to 60th day of pregnancy. Thoracic diameter (TD) was
determined from the 45th to 60th day of pregnancy, according to Lee et al. (2005).
For the measurement of structures of interest, ultrasonographic examinations were
recorded in the form of videos, followed by the capture and measure of at least three images
of each structure and measurement using the Image J program (Image J, National Institutes of
Health, Millersville, USA), previously calibrated. In twin pregnancy, the mean of two
embryos/fetuses was considered, following the method described by Bulnes, Moreno and
Sebastián (1998). The measurements were used to calculate the daily rates of embryonic/fetal
growth (mm/day).
Statistical analysis
The data were analyzed utilizing PROC GLM of the statistical program SAS (SAS, Inc.,
Cary, NC, USA). For the liver and kidney parameters, P4 and embryonic/fetal growth, the
factors tested were: diet (WCM, DCM and CM), type of pregnancy (single or multiple-birth),
time (time of measurement/sampling) and interactions of diet vs. pregnancy and diet vs. time.
For metabolites in non-pregnant goats the factors tested were diet and type of pregnancy
diagnosis (pregnant or non-pregnant) and interaction. For progesterone concentration
measured at CIDR removal, the effect used in the model was diet. The comparison between
the means was analyzed by the Duncan test or Student t-test according to the number of
treatments. For the variables with non-parametric distribution, the effect of diet was
determined using PROC NPAR1WAY of SAS, and the frequencies using the chi-squared test.
The values were expressed as the mean ± standard error of mean and the numeric variables as
the percentage or frequency.
Results
78
Electrophoresis showed the absence of subunits A and B of ricin in castor meal after
detoxification. Non-detoxified castor meal was found to contain ricin at 50 mg/kg residue.
At the beginning of the experimental period (day -15), IgG was not detected in any group.
However, after 15 days of experimental feeding, a positive immunological response was
observed only in does fed CM. In this group, the quantity of ricin supplied was approximately
34.01 g/day/animal, equivalent to 0.043 mg/kg body weight.
There was no effect (p>0.05) of type of diet on the plasma concentration of P4 on the day
of CIDR removal, number of goats in oestrous, rate of multiple-birth pregnancy and total
conception rate (Table 3). Plasma P4 levels increased (p<0.001) at the measurement time
evaluated (Fig. 2), and were higher than 3 ng/mL eight days after removal of the intravaginal
device in all groups evaluated. It should be noted that in the goats with multiple-birth
pregnancy, the plasma level of this hormone was higher compared to goats with single-birth
pregnancy (6.34 ± 0.38 ng/mL vs. 4.53 ± 0.25 ng/mL; p<0.001). Besides, we observed an
effect of type of diet (p<0.01) on plasma P4 levels in goats with multiple-birth pregnancy,
where DCM differed from WCM (7.18 ± 0.77 ng/mL vs. 5.87 ± 0.53 ng/mL; p<0.05).
The data relative to the parameters of embryonic/fetal development (Table 4) demonstrated
in all diets and in both types of pregnancy, a significant growth (p<0.001) for the time interval
was recorded. However, there were no differences between the types of diets (p>0.05).
With regard to the main liver and kidney function parameters in pregnant goats (Fig. 3), we
observed an effect of diet (p<0.001) on plasma urea levels in multiple-birth pregnancy, GGT
in single-birth pregnancy and LDH in both types of pregnancy. With regard to urea levels, the
group WCM showed higher mean values (mg/dL) compared to the other diets (WCM 28.70 ±
1.07 vs. DCM 22.67 ± 1.31 vs. CM 22.92 ± 0.99; p<0.001), while for GGT, does fed CM
showed higher mean concentrations (IU/L) (CM 50.82 ± 1.41 vs. WCM 43.48 ± 1.25 vs.
DCM 39.50 ± 0.80; p<0.001). Moreover, LDH (IU/L) in goats with single-birth pregnancy
was increased in group WCM (WCM 736.88 ± 36.03 vs. DCM 625.50 ± 24.01 vs. CM 600.73
± 21.32; p<0.001), while in multiple-birth pregnancy, the goats of group CM displayed lower
levels of this parameter (CM 471.07 ± 23.36 vs. WCM 616.67 ± 28.45 vs. DCM 631.00 ±
23.03; p<0.001).
In relation to effect of measurement time (Fig. 3), significance (p<0.05) was observed only
for the plasma levels of urea and LDH in both types of pregnancy, showing that the values
tended to decrease with time. In the goats that tested negative for pregnancy, no significant
79
differences were found for liver and kidney function parameters (GGT, AST, LDH and urea)
between the types of diets (Table 5). The levels of these parameters were also compared
between non-pregnant and pregnant goats within each type of diet (Table 5). Based on the
results, there was significant increase in the urea levels in all types of diets and LDH in goat
of group WCM, but GGT levels decreased in groups WCM and CM in non-pregnant goats
(p>0.05).
Discussion
Immunological response resulting from ingestion of castor meal was determined by
detection of ricin-specific IgG by Western blotting. As of day 15 of experimental feeding,
specific IgG protein was detected only in does that received non-detoxified castor meal. These
results demonstrated that the ingestion of non-detoxified castor meal induced a humoral
response, probably through the production of antibodies against ricin and/or ricinin. Thus, we
can infer that the presence of IgG is a good indicator of the magnitude of immunological
response to non-detoxified castor meal. Besides, IgG normally appears after a prolonged
exposure to the antigen (ZANIN; MARCHINI; CARVALHO, 2002).
In the present study, we found no effect of diet on response to oestrous synchronization,
levels of P4 at the time of CIDR removal, conception rate and twinning rate in adult goats.
These findings demonstrate the total substitution of soybean meal with detoxified or nondetoxified castor meal does not reduce reproductive performance of goats. In previous studies
by our group, we observed that the inclusion of 50% cashew bagasse in the diet of sheep
during the post-partum period also did not influence the response to oestrous synchronization
(RODRIGUES et al., 2011). Thus, it is believed that the expression of oestrous is directly
related to the levels of the animal’s body reserves (SI VA et al., 2011), and not to the intake
of alternative dietary sources. Besides, studies have revealed in goats (OLIVEIRA; GUIDO;
LIMA, 2001) and in cows (FLORES et al., 2006) that the utilization of CIDR in protocols of
oestrous synchronization is a highly efficient treatment.
During the whole monitoring period (4 to 20 days after mating), independent of type of
diet, plasma P4 levels increased in pregnant goats with single as well as multiple births. These
results demonstrated that the corpus luteum was functional, producing adequate
concentrations of P4 during the period of embryonic implantation. These observations are in
accordance with the findings of Kerbler et al. (1997), who found that luteal secretion of P4 is
80
essential for the production of oocytes of good quality, as well as for embryonic survival, in
sheep. In addition, P4 levels have been successfully utilized for evaluating ovarian function in
goats (SILVA et al., 2011) and sheep (RODRIGUES et al., 2011).
In the present study, type of diet, WCM, DCM or CM, had no effect on embryonic/early
fetal growth of goats. These results can be explained by the capacity of ruminal microbiota to
neutralize partially or totally the toxic compounds (ricin and/or ricinin) present in castor meal
(OLIVEIRA et al., 2010; DINIZ et al., 2010). In agreement with EFSA (2008) well-adapted
ruminants can tolerate moderate levels of ricin with long periods of exposure, without
substantial impact on reproductive performance. In another study, Barros et al. (2011) found
that the substitution of soybean meal by castor meal treated with calcium oxide did not
hamper production performance in Nelore heifers. Thus, we can infer that the addition of
castor meal detoxified or not to the diet of goats does not appear to affect early fetal
development.
The plasma levels of LDH in does of group WCM and of urea with all types of diets were
higher in non-pregnant goats when compared to pregnant goats. However, independent of
type of diet, urea and LDH levels in both types of pregnancy tended to decrease with time. In
pregnant goats, there was a significant decrease in urea and LDH levels in does fed DCM and
CM, while GGT levels increased only in does fed CM when compared to does fed WCM.
These results are not agreement with the findings of Silva et al. (2010), who found that
plasma urea levels in sheep at the end of feeding with detoxified castor meal were unchanged.
In another study, Oliveira et al. (2010) also did not observe alterations in plasma levels of
ALT and AST in sheep fed for 21 days with castor meal detoxified or not. In the present
study, despite the variation in the levels of urea, LDH and GGT in does fed CM, the levels of
these physiologic parameters are in agreement with the literature for the stipulated for goats
(SMITH; SHERMAN, 2009).
81
Conclusions
The supplementation with castor meal before and after detoxification process did not affect
the reproductive performance of goats, as well as embryonic and early fetal development and
blood metabolites. Thus, the results demonstrate that detoxification process is not necessary
when castor meal is included up to 15% in the goat feeding during early pregnancy. However,
further research is still necessary to evaluate if higher levels of castor meal inclusion and
long-term period affects the reproductive performance of goats.
Acknowledgments
Financial support was received from Edital CNPq/MAPA/SDA No. 064/2008 – ref. nº.
578189/2008-9 and Edital FUNCAP 05/2009 - ref. nº. 101.01.00/09. L.M. Silva was the
recipients of a Doctorate scholarship from CNPq (n°. 551634/2010-3). Dr. A. Leyva helped
with English translation and editing of the manuscript.
Ethics and Biosafety Committee
The study was approved by the Ethics Commission for the Use of Animals of the State
University of Ceará (CEUA-UECE), under Protocol nº. 09503497-8/82.
References
ABDALLA, A. L.; FILHO, J. C. S.; GODOI, A. R.; CARMO, C. A.; EDUARDO, J. L. P.
Utilização de subprodutos da indústria de biodiesel na alimentação de ruminantes. Revista
Brasileira de Zootecnia, Visoça, v. 37, n. spe, p. 260-258, 2008.
ASLANI, M. R.; MALEKI, M.; MOHRI, M.; SHARIFI, K.; NAJJAR-NEZHAD, V.;
AFSHARI, E. Castor bean (Ricinus communis) toxicosis in a sheep flock. Toxicology,
Hamburg, v. 49, n. 3, p. 400-406, 2007.
AUDI, J.; BELSON, M.; PATEL, M.; SCHIER, J.; OSTERLOH, J. Ricin poisoning: A
comprehensive review. The Journal of the American Medical Association, Boston, v. 294, n.
18, p. 2342-2351, 2005.
BARROS, L. V.; PAULINO, M. F.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S. C.; LO1PES,
S. A.; ROCHA, A. A.; VALENTE, É. E. L.; ALMEIDA, D. M. Replacement of soybean meal
82
by treated castor meal in supplements for grazing heifer during the dry-rainy season period.
Revista Brasileira de Zootecnia, Visoça, v. 40, n. 4. p. 843-851, 2011.
BRADFORD, M. M. A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry, Bethesda, v.
72, n.7, p. 248-254, 1976.
BULNES, A. G.; MORENO, J. S.; SEBASTIÁN, A. L. Estimation of fetal development in
Manchega dairy ewes by transrectal ultrasonographic measurements. Small Ruminant
Research, Bloemfontein, v. 27, n. 3, p. 243-250, 1998.
DINIZ, L. L.; VALADARES FILHO, S. C.; CAMPOS, J. M. S.; VALADARES, R. F. D.;
SILVA, L. D.; MONNERAT, J. P. I. S.; BENEDETI, P. B.; OLIVEIRA, A. S.; PINA, D. S.
Effects of castor meal on the growth performance and carcass characteristics of beef cattle.
Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, Korea, v. 23, n. 10, p. 1308-1318, 2010.
DINIZ, L. L.; VALADARES FILHO, S. C.; OLIVEIRA, A. S.; PINA, D. S.; SILVA, L. D.;
BENEDETI, P. B.; BAIÃO, G. F.; CAMPOS, J. M. S.; VALADARES, R. F. D. Castor bean
meal for cattle finishing: 1 - Nutritional parameters. Livestock Science, Foulum, v. 135, n.2-3,
p. 153-167, 2011.
EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY - EFSA. Scientific opinion of the panel on
contaminants in the food chain on a request from the European Commission on ricin as
undesirable substances in animal feed. The EFSA Journal, v. 726, p. 1-38, 2008.
FLORES, R.; LOOPER, M. L.; KREIDER, D. L.; POST, N. M.; ROSENKRANS JR., C. F.
Estrous behavior and initiation of estrous cycles in postpartum Brahman-influenced cows
after treatment with progesterone and prostaglandin F2{alpha}. Journal of Animal Science,
Storrs, v. 84, n. 7, p. 1916-1925, 2006.
FURTADO, R. F.; GUEDES, M. I. F.; ALVES, C. R.; MOREIRA, A. C. O. M.; FELIX, W.
P.; DUTRA, R. A. F. Produção de anticorpos policlonais anti-ricina. Ciência e
Agrotecnologia, Lavras, v. 35, n. 1, p. 124-130, 2011.
KERBLER, T. L.; BUHR, M. M.; JORDAN, L. T.; LESLIE, K. E.; WALTON, J. S.
Relationship between maternal plasma progesterone concentration and interferon-tau
synthesis by the conceptus in cattle. Theriogenology, Milan, v. 47, n. 3, p. 703-714, 1997.
LEE, Y.; LEE, O.; CHO, J.; SHIN, H.; CHOI, Y.; SHIM, Y.; CHOI, W.; SHIN, H.; LEE, D.;
LEE, G.; SHIN, S. Ultrasonic measurement of fetal parameters for estimation of gestational
age in Korean Black Goats. Journal of Veterinary Medicine Science, Tokyo, v. 67, n. 5, p.
497-502, 2005.
83
MEUNIER, B.; BOULEY, J.; PIEC, I.; BERNARD, C.; PICARD, B.; HOCQUETTE, J. F.
Data analysis methods for detection of differential protein expression in two-dimensional gel
electrophoresis. Analytical Biochemistry, Bethesda, v. 340, n. 2, p. 226-230, 2005.
NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC. Nutrient requirements of small ruminants:
sheep, goats, cervids and new words camelids. Washington: The National Academies Press,
2007.
OLIVEIRA, A. S.; OLIVEIRA, M. R. C.; CAMPOS, J. M. S. LANA, R. P.; MACHADO, O.
L. T.; RETAMAL, C. A.; DETMAMNN, E.; VALADARES-FILHO, S. C. In vitro ruminal
degradation of ricin and its effect on microbial growth. Animal Feed Science and Technology,
Madrid, v. 157, n. 1, p. 41-54, 2010.
OLIVEIRA, M. A. L.; GUIDO, S. I.; LIMA, P. F. Comparison of different protocols used to
induced and synchronize estrus cycle of Saanen goats. Small Ruminant Research,
Bloemfontein, v. 40, n. 2, p. 149-153, 2001.
RODRIGUES, M. R. C.; RONDINA, D.; ARAÚJO, A. A.; SOUZA, A. L.; NUNESPINHEIRO, D. C.; FERNANDES, A. A. O.; IBIAPINA, F. L. Respostas reprodutivas e
metabólicas de ovelhas alimentadas com bagaço de caju desidratado, durante o pós-parto.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 63, n. 1, p. 171179, 2011.
SANTOS, M. H. B.; LIMA, P. F.; MESSIAS, J. B.; OLIVEIRA, M. A. L. Medidas do
concepto utilizadas na prática ultrasonográfica de pequenos ruminantes. In: SANTOS, M. H.
B.; OLIVEIRA, M. A. L.; LIMA, P. F. (1 Ed). Diagnóstico de gestação na cabra e na ovelha.
Varela, São Paulo. 2004.
SILVA, D. C.; ALVES, A. A.; VASCONCELOS, V. R.; NASCIMENTO, H. T. S.;
MOREIRA FILHO, M. A.; OLIVEIRA, M. E. Metabolismo dos compostos nitrogenados em
ovinos alimentados com dietas contendo farelo de mamona destoxificado. Acta Scientiarum.
Animal Sciences, Maringá, v. 32, n. 2, p. 219-224, 2010.
SILVA, L. M.; RONDINA, D.; ARAÚJO, A. A.; SARGENTINI, C.; LIMA, I. M. T.;
RODRIGUES, M. R. C.; SOUZA, A. L.; GIORGETTI, A.; OLIVEIRA, C. H. A.,
RODRIGUES, F. V. Reproductive responses and progesterone levels of post-partum oestrus
synchronization in goats with different body reserves. Italian Journal of Animal Science,
Pavia, v. 10, n. 4, p. 220-224, 2011.
SMITH, M. C.; SHERMAN, D. M. Goat Medicine. 2. ed. Ames: Wiley-Blackwell, 2009.
84
ZANIN, C. M.; MARCHINI, J. S.; CARVALHO, I. F. Reações adversas a alimentos e
imunidade humoral: subclasses de IgG a antígenos alimentares. Nutrire: Journal of the
Brazilian Society of Food and Nutrition, v. 24, p. 125-134, 2002.
85
Table 1. Proportion of the diet ingredients in dry matter basis.
Diet
Constituent (% DM)
WCM
DCM
CM
Ground corn
81.8
79.6
81.2
Soybean meal
12.1
-
-
Detoxified castor meal
-
14.5
-
Castor meal
-
-
12.9
Urea
1.0
1.0
1.0
Vitamin mineralized premix
4.3
4.1
4.1
White salt
0.8
0.8
0.8
WCM - without castor meal; DCM - detoxified castor meal; CM - castor meal.
86
Table 2. Chemical composition of diets.
Composition (% DM)
Ingredient
Organic Matter
Crude Protein
Ether Extract
Ash
Neutral Detergent Fiber
Acid Detergent Fiber
Guinea grass hay
92.8
6.8
1.2
7.2
69.9
40.5
Detoxified castor meal
8 .4
36.1
.9
17.6
38.4
30.6
Castor meal
89.3
41.3
.0
10.6
40.1
33.8
WCM - diet
97.2
15.0
3.1
2.8
-
-
DCM - diet
97.1
15.0
3.5
.9
-
-
CM - diet
97.1
14.9
3.5
.9
-
-
Concentrate - based supplements
WCM - without castor meal; DCM - detoxified castor meal; CM - castor meal.
87
Figure 1. Protocol for oestrus synchronization and blood sample collection to measure P4, IgG and metabolites levels in goats fed without castor meal, with
castor meal and detoxified castor meal. PGF2α: prostaglandin; P4: progesterone.
88
Figure 2. Plasma P4 concentrations in pregnant goats fed diets without castor meal (WCM), with
detoxified castor meal (DCM) and with castor meal (CM), that had single and multiple births, up to
day 20 after CIDR removal. Values are means ± SE (standard error). ANOVA results for the effects of
diet, time and the interaction diet vs. time are represented in the figure.
89
Figure 3. Plasma concentrations of urea, LDH, AST and GGT in pregnant goats with single and multiple births fed diets without castor meal (WCM), with
detoxified castor meal (DCM) and with castor meal (CM). ANOVA results for the effects of diet, time and the interaction diet vs. time are represented in the
figure.
90
Table 3. Concentration of progesterone (P4) on day of CIDR removal and reproductive
performance of goats fed diets without castor meal (WCM), with detoxified castor meal
(DCM) and with castor meal (CM).
91
92
93
8 CAPÍTULO 3
Estresse metabólico e características reprodutivas de cabras durante o pós-parto
suplementadas por um longo período com farelo de mamona detoxificado como fonte de
nitrogêneo
Metabolic stress and reproductive features in peripartum goats supplemented for long period
with detoxified castor meal as source of dietary nitrogen
Periódico: Animal Science Journal (submetido em fevereiro de 2014)
94
Resumo
Objetivou-se avaliar o efeito da utilização do farelo de mamona detoxificado, sobre o
desempenho reprodutivo, estresse metabólico, produção de leite e desenvolvimento das crias,
durante o período de pós-parto em cabras. Os animais foram alimentados sem (SFMD, n=21)
ou com farelo de mamona detoxificado (FMD, n=20) durante todo o período de gestação até o
desmame das crias, 60 dias após o parto. Não houve diferença entre os grupos para a duração
da gestação, prolificidade ao parto, taxa de partos múltiplos e mortalidade. Assim em todos os
animais ao longo do pós-parto as concentrações plasmáticas de progesterona permaneceram
abaixo de 1 ng/mL. A espessura do tecido adiposo esternal e da área de lombo, os níveis de
ureia e colesterol, a produção de leite e o ganho de peso diário das crias foram inferiores no
grupo FMD quando comparado ao grupo SFMD (P<0,05). Em conclusão, a utilização do
farelo de mamona detoxificado durante o período pós-parto de cabras reduziu o desempenho
das crias em função de uma menor produção materna de leite durante o período de
aleitamento. Por outro lado, a inclusão deste resíduo nas dietas não interferiu no desempenho
reprodutivo ao parto bem como na atividade luteal das mães durante o pós-parto.
Palavras-chave: Ricinus commuis L. Caprino. Pós-parto, Lactação. Cabrito. Progesterona.
95
Metabolic stress and reproductive features in peripartum goats supplemented for long
period with detoxified castor meal as source of dietary nitrogen
Liliane Moreira SILVA; Cláudio Henrique de Almeida OLIVEIRA; Aline Maia SILVA;
César Carneiro Linhares FERNANDES; Cleidson Manoel Gomes da SILVA; Davide
RONDINA*
State University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
Running head: Effects of castor meal on peripartum goats
*Correspondence:
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV)
Laboratório de Nutrição e Produção de Ruminantes (LANUPRUMI)
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi.
Fortaleza – CE – Brasil. CEP: 60740-000
Tel./Fax.: +55.85. 3101.9858
E-mail address: [email protected]
96
ABSTRACT
This study evaluated the effect of detoxified castor meal on the reproductive performance,
metabolic stress, milk production, and kid development in peripartum goats. The diet of the
animals were with (DCM, n = 20) or without (WDCM, n = 21) detoxified castor meal during
the entire gestation and until weaning, 60 days post-birth. No differences were observed in the
gestation period, litter size, rate of multiple births, and mortality between the two groups. The
postpartum plasma concentrations of progesterone remained below 1 ng/mL in all animals.
The thickness of sternum adipose tissue and loin area, levels of urea and cholesterol, milk
production, and daily weight gain in the kids were low in DCM group when compared to
those in the WDCM group (P < 0.05). To conclude, the use of detoxified castor meal in
peripartum goats resulted in lower level of performance in the kids because of reductions in
the amount of milk received from their mothers during lactation. However, the inclusion of
detoxified castor meal in the diet did not compromise reproductive performance or alter the
activity of the corpora lutea of postpartum goats.
Key words: Ricinus communis L., postpartum, lactation, goat kids, progesterone.
INTRODUCTION
Ruminant production in tropical regions, especially in semi-dry areas such as North Eastern
Brazil, requires strategies to optimize alternative food sources, aiming at reducing the costs of
animal food supplements. Seasonal fluctuations in hay availability and quality, which is
associated with low grain production, are the limiting factors in animal production in these
areas (Kawas et al. 1999). However, with the growing importance of biodiesel as a source of
energy worldwide, new opportunities for ruminant production have been developed using
sub-products derived from oleaginous oil extraction.
Castor oil plant (Ricinus communis L.) is known for its ability to adapt to arenose soils and
resistance to drought and it has become an important resource for biofuel production in North
Eastern Brazil (Severino et al. 2005). However, the protein ricin is found in the endosperm of
castor seeds and remains in castor meal and castor meal even after the oil extraction process
(Aslani et al. 2007). This protein inhibits eukaryotic protein synthesis and is considered one
of the most potent plant toxins in nature (Aslani et al. 2007). For this reason, the fate of the
sub-products of castor oil plant processing is of concern, particularly in terms of its
environmental impact.
97
Castor oil plant residues remaining after oil extraction have been routinely used as organic
manure due to the presence of toxic compounds such as ricin (Severino et al. 2005). Previous
studies have shown that these residues are of high nutritional value, making it a suitable
animal feed after subjecting these to various detoxification processes (Anandan et al. 2005).
According to Vieira et al. (2011), detoxified castor meal, when used for 70 days, improves the
digestion in sheep in the finishing stages of production. Menezes et al. (2012) did not observe
alterations in the liver enzymes of sheep fed for 20 days with detoxified castor meal; in
addition, replacing 45% of soy meal with detoxified castor meal improves the ruminal
environment. Nevertheless, the substitution of 0.67 kg/kg of soy meal with detoxified castor
meal containing calcium oxide for 21 days in cows resulted in a reduction in milk production
and composition compared to its daily milk production of 20 kg (Cobianchi et al. 2012). In
addition, recent studies have demonstrated that detoxified castor meal could be used as a
long-term alternative source of protein in sheep without affecting preantral or antral
folliculogenesis (Silva et al. 2013). In another study, Arruda et al. (2013) found that the
supplementation of goat feed with detoxified castor meal showed results similar to that of the
control group. However, changes in the plasma levels of IgG and the mRNA levels of HSP70
were detected, as well as a lower rate of transferable embryos in animals fed non-detoxified
castor meal. Despite these studies, it is still unknown if detoxified castor meal can be used for
prolonged periods as an alternative protein source for the adequate nutrition of peripartum
goats.
The aim of this study was to evaluate the effects of using detoxified castor meal on the
body condition, activity of corpora lutea, metabolic stress, and milk production of peripartum
goats, as well as in the development of kids.
MATERIALS AND METHODS
Detoxification of castor meal and quantification of ricin
Castor meal was obtained from the factory Brasil óleo de Mamona (BOM), which is located
in Salvador – Bahia, Brazil. Detoxification was carried out according to the method described
by Oliveira et al. (2010a), with some modifications. The castor meal was added to a solution
of calcium oxide (CaO) (1 kg/9 L water) at a proportion of 60 g CaO/kg castor meal. After
leaving the mixture to stand overnight (12–18 h) for the detoxification process to occur, the
treated material was dried for storage and subsequent use. This technique was selected for its
high-efficiency and ease of production. The absence of ricin after the detoxification process
98
was verified by polyacrylamide gel electrophoresis (native-PAGE) on 12% gel under nondenaturing conditions. The procedure was performed in a vertical mini-gel system with a BioRad PowerPac Basic unit, and the gels were stained with Coomassie Blue R250.
Animals and experimental design
The experiment was conducted at the Padre João Piamarta Farm in Itaitinga-CE (4°01′ S and
38°31′ W) from April to November. The area is characterized by a constant photoperiod
regimen, and has a warm, tropical, sub-humid climate with 2 distinct seasons: rainy from
January to May and dry from June to December. The mean annual rainfall and temperature
are 1.416,4 mm and 26–28 °C, respectively.
Forty one mixed-breed, cyclic, and pluriparous goats were separated into 2 groups
homogeneous (mean ± SEM) in body weight and condition (41.2 ± 1.8 kg and 2.6 ± 0.1,
respectively). The goats were housed in 2 pens that were separated by a central feed alley,
where mineral salt and water were provided ad libitum. Each pen measured 40 × 50 m and
contained a 40 × 3 m open front shelter. The feed alley and the front shelter were composed
of clay and concrete, and faced an east-west direction. The animals were obtained from the
same farm. The health and reproductive characteristics of all animals were checked
throughout the entire course of gestation. The does received 2 different diet composed of a
mixture of guinea grass (Panicum maximum var. Mombasa) hay and isoenergetic (74% of
TDN) and isonitrogenous (14% CP on DM basis) concentrates with a different source of
nitrogen (Table 1). In the first group, without detoxified castor meal (WDCM n =20), the
animals received soybean meal as the nitrogen source in the concentrate. In the second group,
detoxified castor meal (DCM, n = 21), the animals were fed with detoxified castor meal,
which replaced soybean meal as the nitrogen source in the concentrate. The formulation of the
diets was based on the nutritional requirements (NRC, 2007) for adult non-dairy does. The
animals were fed the respective diets twice a day (at 07:00 and 15:00), from 20 days before
mating and until 60 days after parturition (when the kids were weaned). After parturition, the
kids remained with the does and were weaned until 60 days of age. The kidding period lasted
26 days.
At birth and every 7 days up to weaning, the weight and body condition score of the
mother and kid goats were evaluated according to Morand-Fehr and Hervieu (1999). In the
same period, ultrasounds of the sternum and loin regions were performed according to
Teixeira et al. (2008), with minor modifications. In the sternum region, the transducer was
99
placed perpendicular to the sternum at the third sternebra for the measurement of internal
sternal fat thickness (mothers). In the lumbar region, the transducer was placed perpendicular
to the longissimus dorsi length, between the 12nd and 13rd ribs, for the measurement of the
loin area (mothers and kids) and subcutaneous fat loin thickness (kids). Ultrasound
measurements in the kids were performed from day 14 post-birth until weaning.
Ultrasonographic measurements were obtained using a B mode ultrasound instrument
(Chisson D600 VET, Chisson Medical Imaging Co. Ltda., China), coupled to a 5.0 MHz
linear transducer and measured in triplicate using the software program ImageJ® (Image J,
National Institutes of Health, Millersville, USA).
Milk production and quality traits
Milk production was measured twice a week using the weigh-suckle-weigh technique, from
the third day post-partum until weaning (60 days post-partum), following the method
described by Celi et al. (2008). In brief, the day before the measurement, all kids were
isolated from dams at 16:00. At 08:00 the following day, each kid was weighed before and
after being allowed to suckle the dam. Suckling periods did not exceed 30 min. The difference
between pre- and post-suckling weight was recorded as the estimated milk production of the
dam.
Between birth and weaning, milk samples was collected weekly and stored at -20 ºC until
analysis using an automatic milk analyzer Lactoscan SA® (Milkotronic LTD, Nova Zagora,
Bulgaria). The percentages of lipids, proteins, lactose, minerals, and non-fat solids were
determined.
Blood sampling, metabolites, and progesterone assays
Blood samples were collected at partum and every 5 days until weaning. Blood was
centrifuged at 3000 rpm for 15 min, and the obtained plasma was stored in the freezer at -20
°C. The plasma concentrations of glucose, urea, creatinine, protein, total bilirubin, albumin,
cholesterol, triglycerides, and glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) were obtained by
spectrophotometric assays in an automated biochemical analyzer (Labmax 240, Labtest®),
using a commercial kit (Labtest®, Lagoa Santa, Brazil). NEFA concentrations were
determined by the enzymatic–colorimetric method (Randox Laboratories, UK), using a
commercial kit (NEFA Randox® Laboratories, Crumlin, Co. Antrim, Northern Ireland, UK).
100
The presence of corpora lutea in the ovaries was determined using progesterone
concentrations. A corpus luteus (CL) was considered to be functional when at least 2
consecutive samples showed progesterone levels of over 1 ng/mL. A CL was considered to be
non-functional when less than 1 ng/mL progesterone was detected (Rodrigues et al. 2011).
The progesterone assay was performed by a microparticle enzyme immunoassay (MEIA)
(Abbott Diagnostics Axsym® System), using a commercial kit (Axsym P4, Abbott, Tokyo,
Japan). The test was sensitive to within the level of 0.2 ng/mL, while the intra- and inter-assay
coefficient of variation was 7.9 and 3.3%, respectively.
Statistical analysis
All data were analyzed by the statistical program Statistica (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA).
Analysis of variance (ANOVA) was performed by GLM procedures. For all goats,
information was collected on body weight, weight loss, body condition, length of gestation,
litter size, number of kids weaned/does, kid weight weaned/does, and milk traits. In the
ANOVA model, the tested factors included diet (WDCM and DCM), type of parturition
(simple and multiple), and the interaction of diet versus the type of parturition. Data about
litter size and the number of weaned kids/does were previously log10 transformed. For kids,
the factors used for body weight analysis included diet, type of parturition, sex (male and
female), and the interaction of diet versus the type of parturition and diet versus sex. For the
milk quality parameters, progesterone and the plasma metabolite concentration and for the
daily weight gain of kids, the tested factors included diet, interval of assessment considered
(time), type of parturition, and the interaction of diet versus time and diet versus the type of
parturition. The ultrasonography results were analyzed by GLM procedures for repeated
measures ANOVA. The factors tested in does (loin area and sternal fat thickness) included
diet, type of parturition and the interaction of diet versus the type of parturition. For kids (loin
area and subcutaneous loin fat thickness), the ANOVA model included diet, type of
parturition, sex, and the interaction of diet versus the type of parturition and diet versus sex.
Images of the ultrasonography structures used for the measure (1, 2, and 3) were the repeated
measures. For the kidding, twinning and mortality rates, effect of group, and type of
parturition were analyzed by the Kruskal-Wallis ANOVA test. Comparisons of means were
determined by the student t-test ( groups) or Duncan’s multiple range test (more than 2
groups). Comparison of numbers was performed using the chi-squared test.
101
RESULTS AND DISCUSSION
No differences in live weight and body condition of the goats resulting from diet or type of
birth were observed (Table 2). A significant reduction (P < 0.05) in the live weight and body
condition of the mothers from birth to weaning was observed in both diets. A previous
reported has shown a significant reduction in live weight and body condition in goats during
lactation (Lake et al. 2005). The decrease in goat body mass associated with lactation is
believed to be due to the mobilization of fat and muscle tissues (Eknaes et al. 2006). A
significant reduction in sternal fat thickness and loin eye area from birth to weaning was
observed in the WDCM group (P < 0.05) (Table 2). In contrast, the animals in the DCM
group showed a smaller loin area and a decrease in sternal fat thickness only at birth. The
differences in stored body reserves, as well as in the extent of fat and muscle loss during the
peripartum period, are because of a negative energy balance (Tamminga, 2006). In this study,
the negative balance affected the plasma concentrations of various metabolites such as NEFA,
urea, and cholesterol (Fig. 1 and 2).
As expected, a decrease in plasma NEFA concentrations in both groups was observed at
birth, whereas those in the WDCM groups showed an increase (P < 0.05) between days 5 and
20 post-birth. Animals with higher body mass mobilize more body reserves postpartum
(Chillard et al. 1998). Nevertheless, this mobilization tends to decrease in the presence of a
negative energy balance (Butler, 2000). Thus, in this study, the reduction in stored body
reserves at birth in the DCM group led to a decrease in urea and cholesterol levels (P < 0.05)
between day of birth and day 20 post-birth when compared to that of the WDCM group (Fig.
1 and 2). On the other hand, both variables increased at weaning.
No significant changes in liver (protein, bilirubin, albumin and GOT) and kidney function
metabolites (creatinine) were observed during the experimental period. Similar results were
previously described for ovines fed with diets containing detoxified castor meal (Oliveira et
al. 2010b; Menezes et al. 2012). Thus, the results obtained in this study are within the
reference range, which indicates that the experimental diets provide sufficient nutrients for the
metabolic requirements of the animals.
The results of this study showed that the diets were not significantly advantageous in terms
of reproductive performance. No differences in gestation period, litter size, number of
multiple births, and mortality were observed between groups (Table 2). In addition, both
groups showed no indication of a corpora lutea during the entire experiment. For all animals,
plasma concentrations of progesterone were <1 ng/mL. In goats, the restart of the cyclic
102
activity is dependent on the extent of the negative energy balance, which in turn depends on
the capacity of the animal to recover from the loss of stored body reserves, which was not
observed in this study. At weaning, kids from both groups showed a body score of <2, which
was equivalent to a mean loss of 6 kg per animal. It has been previously reported that nonfunctional ovaries frequently occur peripartum (Roche et al. 2002). According to Chagas et
al. (2007), the absence of follicular development and ovulation peripartum may be
attributable to the inhibition of the hypothalamic-pituitary-ovarian axis, which is a
consequence of the high negative energy balance. As a result, gonadotropin-releasing
hormone (GnRH) production, as well as the synthesis and release of gonadotropins (FSH and
LH) and estradiol, are compromised, leading to a scenario of anovulation and anestrus
(Scaramuzzi et al. 2006).
Milk production was higher in the WDCM group (Table 2), regardless of the type of birth,
simple or multiple. For animals fed with detoxified castor meal, the decrease in milk
production was significantly prominent between the lactation peak and weaning. The type of
birth affected daily milk production, as well as the mean milk production during lactation.
The correlation between milk production and type of birth was expected, with increased milk
production occurring with multiple births. According to Ramsey et al. (1998), animals giving
birth to twins have significantly higher milk production than those giving rise to single births.
All the qualitative parameters of milk (Table 3) were diminished (P < 0.05) in the WDCM
group between days 1 and 30 post-birth. The DCM group showed similar results; however,
only that of lactose was statistically significant. Nutritional changes in milk during the first
weeks post-birth are well known and correspond to an increased production that precedes the
lactation peak (Silvestre et al. 2009; Goetsch et al. 2011). Correlations between milk
production and composition are either low or absent, indicating that higher milk productions
have lower levels of proteins and lipids (Ikonen et al. 2004).
In this study, the animals in the WDCM group showed an increased capacity in mobilizing
stored nutrients for milk production compared to the DCM group. This mobilization reflects
increased lipolysis and decreased lipogenesis in fat tissues at the start of lactation, which may
be attributable to changes in endocrine and metabolic characteristic (Bell, 1995). Some
studies have shown a positive correlation between decreased body score and increased milk
production in dairy cattle (Roche et al. 2009). According to Tamminga et al. (1997), body
mobilization, especially concerning fat tissues, is fundamental in milk production, in
particular during the first weeks of lactation.
103
The weight of the goat kids at birth (Table 4) was not significantly affected by the diet.
However, at weaning, the kids from the WDCM group had an accumulated difference of over
1 kg compared to that in the DCM group. Thus, despite the fact that both diets led to a
significant increase in the kids’ weight between birth and weaning (P < 0.05), the daily
weight gain was higher in the WDCM group. This discrepancy in the in vivo performance of
the kids was undoubtedly due to the increase in milk production and a consequent higher
availability of nutrients in the WDCM compared to the DCM group. These results are in
agreement with the findings of Žujović et al. (2011), who reported a significant effect of
mother milk production on the weight gain of kids up to 90 days of lactation.
The occurrence of multiple births significantly influenced the number of kids that were
weaned (1.8 ± 0.1 vs. 1.0 ± 0.0; P < 0.01), as well as the weight of the weaned kids (12.1 ±
1.2 vs. 7.9 ± 0.6; P < 0.01). In contrast, single births led to high loin areas (2.7 ± 0.03 vs. 2.4 ±
0.02; P < 0.01) and increased daily weight gain (78.5 ± 4.6 vs. 63.8 ± 2.9; P < 0.01).
According to Mexia et al. (2004), the type of birth determines the weight of the kids at birth.
In single births, intra-uterus nutrient mobilization is probably higher than that in multiple
births, thus, leading to high birth weights.
CONCLUSION
The use of detoxified castor meal for long periods led to deterioration in the performance of
kids during lactation due to low milk production. In contrast, detoxified castor meals did not
alter reproductive performance or affect the activity of the corpora lutea of postpartum goats.
ACKNOWLEDGMENTS
Financial support was received from Edital CNPq/MAPA/SDA nº. 064/2008 – ref. nº.
578189/2008-9. L.M. Silva was the recipient of a doctoral scholarship from CNPq (nº.
551634/2010-3).
REFERENCES
Anandan S, Anil Kumar GK, Ghosh J, Ramachandra KS. 2005. Effect of different physical
and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Animal Feed Science and
Technology 120, 159-168.
Arruda IJ, Silva LM, Oliveira CHA, Rodrigues FV, Silva AM, Fernandes CCL, Gomes-Filho
MA, Araújo AA, Silva CMG, RONDINA D. 2013. Embryo production and gene
104
expression in superovulated goats supplemented with de-oiled castor cake before and after
detoxification treatment. Animal Production Science. 2013, doi: org/10.1071/AN13268
Aslani MR, Maleki M, Mohri M, Sharifi K, Najjar-Nezhad V, Afshari E. 2007. Castor bean
(Ricinus communis) toxicosis in a sheep flock. Toxicology 49, 400-406.
Bell AW. Regulation of organic nutrient metabolism during transition from late pregnancy to
early lactation. 1995. Journal of Dairy Science 73, 2804-2819.
Butler WR. Nutritional interactions with reproductive performance in dairy cattle. 2000.
Animal Production Science 60-61, 449-459.
Celi P, Di Trana A, Claps S. 2008. Effects of perinatal nutrition on lactational performance,
metabolic and hormonal profiles of dairy goats and respective kids. Small Ruminant
Research 79, 129-136.
Chagas LM, Gore PJS, Meier S, Macdonald KA, Verkerk GA. 2007. Effect of
Monopropylene Glycol on Luteinizing Hormone, Metabolites, and Postpartum
Anovulatory Intervals in Primiparous Dairy Cows. Journal of Dairy Science 90, 11681175.
Chillard Y, Bocquier F, Doreau M. 1998. Digestive and metabolic adaptations of ruminants to
undernutrition, and conse- quences on reproduction. Reproduction Nutrition Development
38, 131-152.
Cobianchi JV, Oliveira AS, Campos JMS, Guimarães AV, Valadares Filho SC, Cobianchi FP,
Oliveira TES. 2012. Productive performance and efficiency of utilization of the diet
components in dairy cows fed castor meal treated with calcium oxide. Revista Brasileira
de Zootecnia 41, 2238-2248.
Eknaes M, Kolstad K, Volden H, Hove K. 2006. Changes in body reserves and milk quality
throughout lactation in dairy goats. Small Ruminant Research 63, 1-11, 2006.
Goetsch AL, Zeng SS, Gipson TA. 2011. Factors Affecting goat milk production and quality.
Small Ruminant Research 101, 55-63.
Ikonen T, Morri S, Tyriseva AM, Ruottinen O, Ojala M. 2004. Genetic and phenotypic
correlations between milk coagulation properties, milk production traits, somatic cell
count, casein content, and ph of milk. Journal of Dairy Science 87, 458-467.
Kawas JR, Schacht WH, Shelton JM, Olivares E, Lu CD. 1999. Effects of grain
supplementation on the intake and digestibility of range diets consumed by goats. Small
Ruminant Research 34, 49-56.
105
Lake SL, Scholljegerdes EJ, Atkinson RL, Nayigihugu V, Paisley SI, Rule DC, Moss GE,
Robinson TJ, Hess BW. 2005. Body condition score at parturition and postpartum
supplemental fat effects on cow and calf performance. Journal of Animal Science 83,
2908-2917.
Menezes DR, Costa RG, Araújo GGL, Pereira LGR, Oliveira PTL, Silva AEVN, Voltolini
TV, Moraes SA. 2012. Parâmetros sanguíneos, hepáticos e ruminais de ovinos alimentados
com dietas com farelo de mamona destoxificado. Pesquisa Agropecuária Brasileira 47,
103-110.
Mexia, A.A.; Macedo, F.A.F.; Alcalde, C.R.; Sakaguti, E.S.; Martins, E.N.; Zundt, M.,
Yamamoto, S.M.; Macedo, R.M.G. Desempenhos reprodutivo e produtivo de ovelhas
Santa Inês suplementadas em diferentes fases da gestação. Revista Brasileira de Zootecnia,
v. 33, n. 3, p. 658-667, 2004.
Morand-Fehr, P.; Hervieu, J. Apprécier l'état corporel des chèvres: Intérêt et méthod. Reussir
La Chevre, n. 231, p. 22-34, 1999.
National Research Council - NRC. Nutrient requirements of small ruminants: sheep, goats,
cervids and new words camelids. Washington, D.C.: National Academy Press, 2007. 384p.
Oliveira AS, Campos JMS, Oliveira MRC, Brito AF, Valadares Filho SC, Detmann E,
Valadares RFD, Souza SM, Machado OLT. 2010. Nutrient digestibility, nitrogen
metabolism and hepatic function of sheep fed diets containing solvent or expeller castor
seed meal treated with calcium hydroxide. Animal Feed Science and Technology 158, 1528b.
Oliveira AS, Oliveira MRC, Campos JMS, Lana RP, Machado OLT, Retamal CA, Detmamnn
E, Valadares-Filho SC. 2010. In vitro ruminal degradation of ricin and its effect on
microbial growth. Animal Feed Science and Technology 157, 41-54a.
Ramsey WS, Hatfield PG, Wallace JD. 1998. Relationships among ewe milk production and
ewe and lamb forage intake in Suffolk and Targhee ewes nursing single or twin lambs.
Journal Animal Science 76, 1247-1253.
Roche JR, Dalley D, Moate P, Grainger C, Hannah M, ’Mara F, ath M. 00 . Variations in
dietary cation–anion difference and the acid-base balance of dairy cows on a pasture-based
diet in South-eastern Australia. Grass Forage Science 55, 26-36.
Roche JR, Friggens NC, Kay JK, Fisher MW, Stafford KJ, Berry DP. 2009. Invited review:
Body condition score and its association with dairy cow productivity, health, and welfare.
Journal of Dairy Science 92, 5769-5801.
106
Rodrigues MRC, Rondina D, Araújo AA, Souza AL, Nunes-Pinheiro DC, Fernandes AAO,
Ibiapina FL. 2011. Respostas reprodutivas e metabólicas de ovelhas alimentadas com
bagaço de caju desidratado, durante o pós-parto. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia 63, 171-179.
Scaramuzzi RJ, Campbell BK, Downing JA, Kendall NR, Khalid M, Muñoz-Gutiérrez M,
Somchit A. 2006. A review of the effects of supplementary nutrition in the ewe on the
concentrations of reproductive and metabolic hormones and the mechanisms that regulate
folliculogenesis and ovulation rate. Reproduction Nutrition Development 46, 339-354.
Severino LS, Costa FX, Beltrão NEM, Lucena AMA, Guimarães MMB. 2005. Mineralização
da torta de mamona, esterco bovino e bagaço de cana estimada pela respiração microbiana.
Revista de Biologia e Ciências da Terra 5, 1-6.
Silva LM, Oliveira CHA, Silva AM, Silva CMG, Castro SV, Carvalho AA, Duarte ABG,
Costa EC, Feltrin C, Figueiredo JR, Rondina D. 2013. In vitro development of ovine
preantral follicles and oocyte cleavage rate are not affected by long-term ingestion of
detoxified castor meal. Small Ruminant Research 113, 353-359.
Silvestre AM, Martins AM, Santos VA, Ginja MM, Colaço JA. 2009. Lactation curves for
milk, fat and protein in dairy cows: A full approach. Livestock Science, 122, 308-313.
Tamminga S. 2006. The effect of the supply of rumen degradable protein and metabolisable
protein on negative energy balance and fertility in dairy cows. Animal Reproduction
Science, 96, 227-239.
Tamminga S, Luteijn PA, Meijer RGM. 1997. Changes in composition and energy content of
liveweight loss in dairy cows with time after parturition. Livestock Production Science 52,
31-38.
Teixeira A, Joy M, Delfa R. 2008. In vivo estimation of goat carcass composition and body fat
artition by real-time ultrasonography. Journal of Animal Science 86, 2369-2376.
Vieira MMM, Candido MJD, Bomfim MAD, Severino LS, Pereira ES, Beserra LT, Meneses
AJG, Fernandes JPB. 2011. Comportamento ingestivo de ovinos alimentados com rações
contendo quatro níveis de inclusão do farelo de mamona. Revista Ceres 58, 444-451.
Žujović M, Memiši N, Bogdanović V, Tomić Z, Maksimović N, Bijelić Z, Marinkov G. 011.
Effect of body weight of goats and lactation order on the growth rate of kids in the
suckling period. Biotechnology in Animal Husbandry 27, 1193-1200.
107
Figure 1 Plasma concentrations of urea, NEFA, glucose, urea, creatinine and protein in goats
fed diets without detoxified castor meal (WDCM) and with detoxified castor meal (DCM).
A,B P < 0.05 comparison between diets. ANOVA results for the effects of diet, time, type of
parturition and the interaction diet vs. time, and diet vs. type of parturition are represented in
the figure. Values are given as means ± SEM.
108
Figure 2 Plasma concentrations of bilirubin, albumin, cholesterol, triglycerides and TGO in
goats fed diets without detoxified castor meal (WDCM) and with detoxified castor meal
(DCM). A,B P < 0.05 comparison between diets. ANOVA results for the effects of diet, time,
type of parturition and the interaction diet vs. time, and diet vs. type of parturition are
represented in the figure. Values are given as means ± SEM.
109
Table 1 Ingredient composition of diets
DM: dry matter; WDCM: without detoxified castor meal; DCM: detoxified castor meal.
110
Table 2 Body weight (BW), body condition (BC), loin area (LA), sternal fat thickness
(STFT), reproductive parameters and milk yield in goats fed diets without detoxified castor
meal (WDCM) and with detoxified castor meal (DCM). Values are given as means ± SEM
A,B P < 0.05 comparison between diets; a,b P < 0.05 comparison between parturition and
weaning in the same column. TP: type of parturition; D × TP: diet vs. type of parturition; *
LP: milk yield at weaning/milk yield at peak.
111
Table 3 Milk quality traits in goats fed diets without detoxified castor meal (WDCM) and with detoxified castor meal (DCM). Values are given
as means ± SEM
A,B P < 0.05 comparison between diets; a,b P < 0.05 comparison between days for the same diet. TP: type of parturition; D × T: diet vs. time; D
× TP: diet vs. type of parturition.
112
Table 4 Body weight (BW), daily weight gain, loin area and loin subcutaneous fat thickness (SFT) in kids derived from goats fed diets without
detoxified castor meal (WDCM) and with detoxified castor meal (DCM). Values are given as means ± SEM
A,B P < 0.05 comparison between diets; a,b P < 0.05 comparison between birth and weaning in the same column.
TP: type of parturition; D × T: diet vs. time; D × TP: diet vs. type of parturition; D × S: diet vs. sex.
113
9 CAPÍTULO 4
Perfil comparativo da expressão de genes relacionados com desenvolvimento de oócitos
em cabras alimentados com resíduos da indústria do biodiesel da mamona por longo
período
Comparative expression profile of genes related to oocyte development in goat fed with
residues of biodiesel castor industry by long-period
Periódico: Reproduction, Fertility and Development (aceito para publicação)
114
Resumo
Objetivou-se determinar se a ingestão por longos períodos de farelo de mamona detoxificado
afeta os níveis de RNAm em oócitos e células da granulosa mural e do cumulus. Os expressão
gênica em CCOs imaturos, oócitos madurados (metafase II - MII) e oócitos não competentes
(NC), e células da granulosa mural e do cumulus foram analisados pela reação em cadeia da
polimerase em tempo real quantitativa. A taxa de maturação dos oócitos foi
significativamente menor (P<0,05) nos animais do grupo farelo de mamona detoxificado
(FMD) em comparação com os animais do grupo sem farelo de mamona detoificado (SFMD).
Os níveis de RNAm em CCOs imaturos de animais do grupo SFMD foram significativamente
superiores para GLUT1 e inferiores para HSP70 (P<0,05 ) em comparação com o grupo de
FMD. No entanto, os níveis de RNAm foram significativamente superiores para GDF9 e
inferiores para BMP15 em oócitos MII quando comparado com oócitos NC (P<0,05). Apenas
em células de cumulus os níveis de RNAm foram superiores para LHR , FSHR , LeptinaR e
IGF1 e inferiores para MnSOD no grupo SFMD quando comparado com o grupo FMD
(P<0,05). A inclusão de FMD na alimentação de cabra durante longos períodos altera a
dinâmica da expressão do gene em oócitos imaturos e em células do cumulus, refletindo-se
em uma diminuição na taxa de maturação oocitária.
Palavras-chave: Ricinus communis. Expressão gênica. Competência oocitária. Caprino.
115
Comparative expression profiles of genes related to oocyte development in goats after
long-term feeding with biodiesel castor industry residues
Liliane Moreira SilvaA,C, Cícera Regina LazzarottoB, Kaio César Simiano TavaresB, Cláudio
Henrique de Almeida OliveiraA, Aline Maia SilvaA, César Carneiro Linhares FernadesA, Luís
Henrique de AguiarB, Leonardo Tondello MartinsB, Saul Gaudencio NetoB, Débora Barbosa
RiosB, Luciana Relly BertoliniB, Marcelo BertoliniB, Cleidson Manoel Gomes SilvaA, Davide
RondinaA
A
School of Veterinary, State University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
B
School of Medicine, University of Fortaleza, Fortaleza, Ceará, Brazil
Running head: Intake of castor meal affects oocyte development
C
Author’s address for correspondence: Liliane Moreira Silva
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV)
Laboratório de Nutrição e Produção de Ruminantes (LANUPRUMI)
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi.
Fortaleza – CE – Brasil. CEP: 60740-000
Tel./Fax.: +55.85. 3101.9858
E-mail address: [email protected]
116
Abstract. The aim of this study was to determine whether detoxified castor meal intake for
long periods of time affects mRNA levels in oocytes and mural granulosa and cumulus cells.
The relative expression levels of genes in immature COCs, mature (metaphase II - MII) and
non-competent (NC) oocytes, and mural granulosa and cumulus cells were analyzed by realtime quantitative polymerase chain reaction. The oocyte maturation rate was significantly
lower (P < 0.05) in DCM group animals compared with the WDCM group animals. The
mRNA levels in immature COCs from WDCM animals were significantly higher for GLUT1
and lower for HSP70 (P < 0.05) compared with the DCM group. However, the mRNA levels
were significantly higher for GDF9 and lower for BMP15 in MII oocytes compared with NC
oocytes (P < 0.05). Only in cumulus cells were the mRNA levels significantly higher for
LHR, FSHR, LeptinR and IGF1 and lower for MnSOD in the WDCM group compared with
the DCM group (P < 0.05). In conclusion, the inclusion of DCM in goat feed for long periods
of time changes the dynamics of gene expression in immature oocytes and in cumulus cells,
which is reflected in a decrease in the oocyte maturation rate.
Additional keywords: Ricinus communis, gene expression, oocyte competence, does
Introduction
For biodiesel production, the castor seed plant (Ricinus communis L.) has been highlighted as
a potential candidate for oil extraction in developing regions of the world, including Brazil
(FAO, 2008). Therefore, the animal industry is strategically positioned to take advantage of
biodiesel byproducts. Castor meal can be highlighted among these byproducts because of its
high nutritional value (39 - 43% protein) and its low cost (Abdalla et al. 2003). However, its
direct use in animal feed is not recommended due to the presence of ricin, which is considered
one of the most toxic compounds in nature (European Food Safety Authority 2008). Ricin
toxicity is related to its ability to inhibit protein synthesis, and it can cause multiple biological
effects such as apoptosis, cell membrane injury and increased inflammatory mediators (Audi
et al. 2005). Previous studies have shown that ricin is extremely toxic to pre-implantation
embryos in mice (Storeng and Jonsen 1983), decreases fertility in female rabbits (Salhab et al.
1999), and reduces rat semen quality (Sandhyakumary et al. 2003; Ekwere et al. 2011).
Despite the presence of ricin in castor meal, it is currently possible to efficiently detoxify
this byproduct through different methods. The use of calcium oxide by Oliveira et al. (2010)
was successful in the detoxification of castor meal, producing a safe product for ruminant
feed. Silva et al. (2013) demonstrated that detoxified castor meal could be used for a long
117
period as an alternative source of protein without affecting preantral or antral folliculogenesis
in sheep. In another study, Arruda et al. (2013) found that the supplementation of goat feed
with detoxified castor meal showed results similar to the control group; however, there were
changes in the plasma levels of IgG and the mRNA levels of HSP70, as well as a lower rate of
transferable embryos in animals fed non-detoxified castor meal. However, there have been no
studies of the gene expression dynamics associated with meiotic competence in goat oocytes
investigating the possible toxic effects of feeding detoxified castor meal for a long period of
time.
The aim of this study was to determine whether detoxified castor meal intake for long
periods of time affects mRNA levels in oocytes and mural granulosa and cumulus cells. The
expression of genes related to the acquisition of meiotic competence, including genes
involved in oocyte quality (growth differentiation factor (GDF9) and bone morphogenetic
protein 15 (BMP15)), metabolism (insulin-like growth factor-1 (IGF1), IGF1 receptor
(IGF1R) and glucose transporters 1 (GLUT1)), oxidative stress (heat shock protein (HSP70)),
and apoptosis (BAX/BCL2L10), were investigated in oocytes. The endocrine activity
(luteinizing hormone receptor (LHR) and follicle-stimulating hormone receptor (FSHR)),
metabolism (leptin receptor (LeptinR) and IGF1), and oxidative stress (HSP70 and
manganese superoxide dismutase (MnSOD)) of genes related the mural granulosa and
cumulus cells were analyzed.
Material and Methods
This study was submitted and approved by the Ethics Committee for Experimental Use of
Animals of the State University of Ceará (CEUA-UECE) with the protocol number
09230950-0/74.
Detoxification of castor bean and quantification of ricin
The detoxification procedure was carried out according to Oliveira et al. (2010), with some
modifications. Briefly, castor meal was added to a calcium oxide solution (1 kg of CaO per 9
L of water) at a proportion of 60 g of CaO per kg of castor meal, and after standing overnight,
the treated material was dried for storage and utilization. The efficiency of the detoxification
process was verified by the absence of ricin as demonstrated by 12% polyacrylamide gel
electrophoresis under non-denaturing conditions (native-PAGE) followed by staining the gels
with Coomassie Blue R-250. Ricin levels were quantified by assaying the total proteins in
118
samples of detoxified and non-detoxified castor meal, following the method of Bradford
(1976) and using bovine serum albumin as the protein standard. The digitized image of the
polyacrylamide gel was analyzed using the program Image Master Platinum (GE Healthcare
Biosciences, Little Chalfont, UK). The protein bands were quantified in volume units (area x
intensity) following the method described by Meunier et al. (2005).
Animals and experimental design
The experiment was conducted in the Padre João Piamarta Farm, in Itaitinga-CE, located at 4º
01’ S and 38º 31’ W, in the period from April to September. The area, characterized by a
constant photoperiod regimen, has a warm, tropical, sub-humid climate with a mean annual
rainfall and temperature of 1,416.4 mm and 26-28ºC, respectively, with two distinct seasons:
rainy from January to May and dry from June to December.
Forty one mixed-breed, adult, and cyclic goats, generally homogeneous (mean ± SEM) in
weight (33.34 ± 1.05 kg) and body condition (2.34 ± 0.09), were divided into two treatment
groups: a diet with soybean meal as the nitrogenous source in the concentrate (WDCM, n =
20) and a diet with detoxified castor meal substituting for the soybean meal (DCM, n = 21) in
the concentrate (Tables 1 and 2). The diets were composed of a mixture of guinea grass hay
(Panicum maximum v. Mombasa) and were isoenergetic (74% of TDN) and isonitrogenous
(14% CP on DM basis). The diet formulations were based on the nutritional requirements for
adult non-dairy does (NRC, 2007). The feed was provided twice a day (07:00 and 15:00) for
500 days. The goats were kept in two pens separated by a central feed alley, and they received
mineral salt and water ad libitum. Each pen measured 40 x 50 m and contained a 40 x 3 m
open front shelter. The feed alley and front shelter were made of clay with concrete and faced
in an east-west direction. The animals underwent thirty days of housing adaptation. During
this period, treatments for internal and external parasites were performed and ultrasonography
was used to control for ovary function.
Four days before the ovarian recovery, all goats received 5 mg of dinoprost tromethamine
(Lutalyse®; Pfizer Animal Health, New York City, USA), followed by the placement of an
internal controlled-release drug device (CIDR®; Pfizer Animal Health, New York City,
USA), which was left in the cranial portion of the vagina to synchronize the goats’ follicular
waves.
Ovary handling, oocyte and granulosa cell recovery
119
After 500 days of feeding, 25 animals were slaughtered (WDCM, n = 12; DCM, n = 13). The
goats’ reproductive tracts were collected immediately post-mortem and stored in PBS at 37ºC
during transport to the laboratory. The ovaries were removed and washed once with PBS. The
number of visible follicles was determined. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were
collected by the method of ovarian slicing. Prior to slicing, each ovary was placed in a Petri
dish and covered with PBS containing 1 IU/mL heparin. All of the follicles present on the
surface of the ovary were sliced with a scalpel under a stereomicroscope, and the COCs were
recovered from each dish and transferred to a Petri dish containing washing medium TCM
199. The COCs were classified as grade-I (G-I) to G-IV based on the unexpanded cumulus
cell layers and cytoplasmic uniformity as follows: G-I, multilayered compact cumulus cells
and finely granulated oocyte cytoplasm; G-II, one to three layers of cumulus cells and
granulated oocyte cytoplasm; G-III, no cumulus layer or heterogeneous oocyte cytoplasm;
and G-IV, oocytes with abnormal shapes and heterogeneous oocyte cytoplasm or apoptotic
oocytes within a jelly-like cumulus cell corona. Only G-I, G-II and G-III COCs were destined
for in vitro maturation (IVM) and were immediately stored individually in RNAlater (RNA
Stabilization Reagent; Qiagen SpA) overnight at 4ºC and subsequently at -80ºC until RNA
extraction. In addition, granulosa cells obtained from each animal during oocyte retrieval
were collected by pipetting and were stored in RNAlater at -80ºC until RNA extraction.
IVM and assessment of oocyte maturation
The selected COCs were divided into three groups according to quality (G-I, -II, -III) and the
experimental group. After washing, the oocytes were transferred to 50 µL of maturation
medium composed of TCM199 powder supplemented with 22 mg/L pyruvate, 2200 mg/L
NaHCO3, 111 mL/L heat-inactivated fetal calf serum (HIFCS), 10 mL/L antibioticantimycotic, 5 μg/m FSH, 5 μg/m
H, and 1 μg/mL 17-β-estradiol under mineral oil and
then incubated for 24 h at 37.5°C with 5% CO2. Following IVM, the COCs were visualized
under a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan), and the cumulus cells were
carefully removed by repeated pipetting. The cumulus cells of each experimental group were
pooled in a 200-µL tube and stored in RNAlater until RNA extraction. Denuded oocytes were
assessed for nuclear maturation by polar body screening, with oocytes with a clear first polar
body considered matured (MII), whereas oocytes with no visible polar bodies were classified
as non-competent (NC). All of the oocytes were individuality stored in RNAlater at -80°C
until total RNA extraction.
120
COCs, mature and non-competent oocytes qRT-PCR
TaqMan qPCR (Heid et al. 1996) was optimized to quantify transcripts for different genes in
goat COCs, MII and NC oocytes (GDF9, BMP15, IGF1, IGF1R, GLUT1, HSP70, BAX, and
BCL2L10 - Table 3). The samples were reversed transcribed, and the specific targets were
amplified using the CellsDirectTM One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Briefly, COCs, MII, and NC oocytes were washed in PBS supplemented with 0.1% polyvinyl
alcohol and grouped according to quality (G-I, -II, -III) and experimental group (n= 4 or 5).
Each pool of COCs, MII, and NC oocytes was transferred to a 200-µL nuclease-free tube
containing 10 μ of resuspension buffer and 1 μ lysis enhancer. The tubes were incubated at
50°C for 10 minutes in a thermocycler. A solution of 1.6 μ of 10X DNase I buffer ( 00 mM
TRIS-HCl, pH 8.4, 40 mM MgCl2, 500 mM KCl, Invitrogen) and 5 μ
of DNase I
(Amplification Grade DNase I, Invitrogen) was added to each tube. Each tube was vortexed to
mix, briefly spun down, and incubated at room temperature for 5 minutes to allow the DNase
I to degrade the genomic DNA). Next, the samples were incubated at 75°C for 10 minutes
with 4 μ of EDTA to inactivate the DNase. The total
NAs isolated from C Cs and MII
and NC oocyte pools were sorted directly into CellsDirectTM One-Step qRT PCR Kit
(Invitrogen) reaction. The TaqMan qPCR reactions (20 µL) contained 400 nM of each
specific primer, 100 nM of each endogenous primer, 80 nM of the specific TaqMan probe and
the endogenous TaqMan, 500 nM ROX, 0.8 µL of enzyme (Taq and SuperScript III), 10 µL
of PCR master mix (CellsDirectTM One-Step qRT-PCR Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA), and 1
µL of the RNA sample. We performed reverse transcription (RT) and specific-target
amplification (STA) serially, using a temperature setting for RT of 15 minutes at 50ºC. The
Dynamic qPCR profile included 2 minutes at 95ºC to inactivate the RT enzyme and hot-start
activate the Taq polymerase followed by 50 cycles of a one-step program consisting of 15
seconds at 95ºC (denaturation) and 60 seconds at 60ºC (annealing and extension). We
performed all the reactions in duplicate and normalized the results using the comparative 2∆∆CT
method (Livak and Schmittgen 2001) with the ribosomal protein S9 (RPS9)
housekeeping gene for background. The data were analyzed using Step nePlus™ qPC
Systems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA).
Granulosa and cumulus cells
Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) was used for the
gene expression analysis for FSHR, LHR, LeptinR, IGF1, HSP70, and MnSOD (Table 3) in
121
granulosa and cumulus cells. Total RNA was isolated and treated with DNase using the
CellsDirectTM One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA), according to the
manufacturer’s instructions. Briefly, complementary DNA (cDNA) was synthesized by
reverse transcription of total RNA with the Superscript III enzyme (Invitrogen, Carlsbad, CA)
and Oligo(T)20 primer (Invitrogen, Carlsbad, CA). The qPCR reactions were performed in a
final volume of 20 µL containing the following components: 1 µL of cDNA, 10 µL of 2x
Power SYBR® Green PCR Master Mix, 6.6 µL of ultra-pure water and 600 nM (final
concentration) of both the sense and antisense primers. The reference gene RPS9 was selected
as an endogenous control for normalization. Primer specificity and amplification efficiency
were verified for each gene. The thermal cycling profile for the first qPCR step consisted of
initial denaturation and polymerase activation for 10 minutes at 95ºC, which was followed by
50 cycles of 30 seconds at 95ºC, 30 seconds at 60ºC, and 30 seconds at 72ºC. A final
extension was performed for 10 minutes at 72ºC. The specificity of each primer set was tested
using a melting curve analysis, which was performed between 60º and 95ºC for all genes. All
amplifications were performed using a Step nePlus™ eal-Time PCR Systems thermocycler
(Applied Biosystems, Carlsbad, CA). The 2-∆∆CT method was used to transform the threshold
cycle values into normalized relative expression levels (Livak and Schmittgen 2001).
Statistical analysis
The maturation rate was expressed as a percentage and was compared using the chi-squared
test. All data were initially subjected to the Kolmogorov-Smirnov test to confirm a normal
distribution using the statistical program Statistica (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). To
analyze the effects of the different feeds (WDCM and DCM), the parameters number of
follicles, total number of oocytes recovered, and mean number of non-viable and viable
oocytes were subjected to an analysis of variance (ANOVA). In immature oocytes, the
relative expression data were logarithmically transformed (log10 (X + 1)) for a normal
distribution adjustment. The relative expression levels for different genes were evaluated by
ANOVA and compared between the groups based on the type of oocyte (MII and NC) and
grade (I, II, and III) using Fisher’s t test. Differences between the groups were considered
significant when P < 0.05.
Results
Number of visible follicles and rates of oocyte recovery and in vitro maturation
122
There were no differences in the number of superficial follicles visible in the ovaries, oocyte
recovery rates, mean number of non-viable and viable oocytes, or number of G-I, II, and III
oocytes between the two diets (WDCM and DCM) (Table 4). However, the maturation rate
was significantly lower (P < 0.05) in the DCM group (45.3%) than in the WDCM group
(58%).
Immature oocyte mRNA profiles
The expression levels for different genes in the immature oocytes are shown in Fig. 1.
Transcripts for all of the eight evaluated genes were detected in immature oocytes in both the
WDCM and DCM groups. The mRNA levels for HSP70 and GULT1 were affected by the
type of diet. The mRNA expression levels for GLUT1 were higher (P < 0.05) in oocytes from
goats in the WDCM group than the DCM group. However, the HSP70 mRNA levels were
significantly lower (P < 0.05) in oocytes from goats in the WDCM group than the DCM
group.
Oocyte mRNA profiles after in vitro maturation
The analysis of the two genes related to oocyte quality (GDF9 and BMP15) showed no
statistically significant differences between the groups. However, the mRNA levels for these
genes differed based on grade (G-I, -II, and -III) and oocyte type (MII and NC) within each
treatment group (Fig. 2). In the WDCM group, the GDF9 mRNA levels were significantly
higher in G-II oocytes compared with G-III oocytes (P < 0.05), although they did not differ
from G-I oocytes. Significantly higher levels of GDF9 mRNA and lower values of BMP-15
mRNA were found in MII oocytes compared with NC oocytes (P < 0.05) in both groups,
regardless of grade. Analysis of the expression levels of genes related to metabolism (IGF1,
IGF1R and GLUT1) showed no significant differences between groups, except in G-II NC
oocytes, which had IGF1 mRNA levels that were significantly higher in the WDCM group
than the DCM group (Fig. 3). The IGF1 mRNA levels in G-I NC oocytes were higher than in
G-III oocytes (P < 0.05) in the WDCM group. In contrast, in the DCM group, the IGF1
mRNA levels in G-I NC oocytes were significantly higher compared with G-III oocytes (P <
0.05), although the levels did not differ from G-II oocytes. Moreover, in the DCM group, the
IGF1 mRNA levels in G-I oocytes were significantly higher in NC oocytes compared with
MII oocytes (P < 0.05). The IGF1R mRNA levels were higher (P < 0.05) in G-III MII oocytes
compared with NC oocytes in both groups (Fig. 3). Regarding GLUT1, for both the WDCM
123
and DCM groups, the mRNA levels were higher in G-II MII oocytes compared with NC
oocytes (P < 0.05). Furthermore, in the DCM group, the GLUT1 mRNA levels were
significantly higher in G-II MII oocytes compared with G-I oocytes (P < 0.05), although they
did not differ in G-III oocytes (Fig. 3). No significant differences were observed in the HSP70
and BCL2L10/BAX mRNA levels (Fig. 4).
Granulosa and cumulus cells mRNA profiles
In granulosa cells, the expression levels of genes related to follicle endocrine function (FSHR
and LHR), metabolism (LeptinR and IGF1), and oxidative stress (HSP70 and MnSOD)
showed no significant differences between the groups (Fig. 5). However, in the WDCM
group, the LHR, FSHR, leptinR, and IGF1 mRNA levels were significantly higher, and the
MnSOD levels were significantly lower, compared with the DCM group in cumulus cells
(Fig. 6). The HSP70 mRNA levels did not differ between the groups.
Discussion
Our results showed that long-term feeding with DCM did not affect the number of superficial
antral follicles in the ovary or the recovery of morphologically viable oocytes. However, the
oocyte maturation rate was lower in animals in the DCM group compared with the WDCM
group. This result indicated that the inclusion of castor meal in the goats’ diet, even after the
detoxification process, negatively affected oocyte maturation. Arruda et al. (2013) recently
found that short-term intake of non-detoxified castor meal (22 days) reduced ovulation rates,
as well as the number of transferable embryos in goats. In contrast, Silva et al. (2013)
observed no adverse effects on the viability and survival of preantral follicles or on the
development competence of oocytes from antral follicles in sheep fed detoxified castor meal
for a long period (15 months). These conflicting results can be attributed to differences
between the feeding period, the evaluated parameters and the species studied.
The oocyte quality may be determined by its ability to be fertilized and develop into an
embryo, fetus and healthy kid or by the expression of specific molecular markers (GrazulBilska et al. 2012). It is believed that mRNA molecules are stored during oocyte growth and
used in the maturation phase and early embryonic development (Brevini Gandolfi and
Gandolfi 2001). The mRNA expression levels of different genes related to oocyte quality,
endocrine function, metabolism, and oxidative stress status in granulosa and cumulus cells
124
were assessed in this study to determine the effect of feeding DCM on the goats’ oocytes
competence.
The GDF9 and BMP15 mRNA levels were measured to assess the quality of the oocytes.
Both are members of the transforming growth factor β (TGFβ) superfamily, secreted by the
oocyte during folliculogenesis (Su et al. 2004), and involved in the acquisition of oocyte
meiotic competence (Hussein et al. 2011). The diet had no effect on the expression of these
genes before or after IVM in this study. However, the GDF9 mRNA levels were higher in
oocytes that reached the MII stage compared with NC oocytes in both groups after 24 hours
of IVM; an inverse relationship was observed for BMP15 mRNA levels. The production of
mRNA factors secreted by the oocyte has been previously reported to be temporally regulated
during oocyte maturation (Gilchrist et al. 2001), especially for BMP15 (Gueripel et al. 2006;
Yoshino et al. 2006). These results suggest that the acquisition of meiotic competence in
caprine oocytes depends on an appropriate balance between GDF9 and BMP15 transcription.
Li et al. (2008) observed that the level of expression for BMP15 in pig oocytes was regulated
during oocyte maturation, which could compensate for the decreased expression of GDF9
without affecting oocyte competence. In contrast, Zhu et al. (2008) verified a significant
reduction in the BMP15 expression levels after IVM in this same species.
In the current literature, there is no conclusive data on the expression of IGF1 in oocytes
matured in vitro; some studies have reported no expression (Yoshida et al. 1998; Nuttinck et
al. 2004), while others have demonstrated the presence of transcripts for this gene (Satrapa et
al. 2013). The presence of IGF1 and its receptor IGF1R in both COCs (immature oocytes)
and oocytes subjected to IVM (MII and NC) was detected in both groups (DCM and WDCM)
in this study. It can be concluded that success in detecting these genes is related to the
sensitivity of the TaqMan real-time PCR system (Leutenegger et al. 2001), which has been
optimized for IGF1 and IGF1R mRNA quantification in goat oocytes. However, the IGF1,
IGF1R, and GLUT1 mRNA levels in oocytes subjected to IVM were not affected by the diet
type. Similar results were observed by Pisani et al. (2008), who also found no differences in
mRNA levels for IGF1 and its receptor IGF1R in granulosa cells or for GLUT1 in oocytes
from sheep fed at different energy levels (0.5x vs. 1.5x maintenance energy requirements).
The control of BAX and BCL2L10 mRNA expression was investigated in this study as a
method for the early detection of apoptosis to elucidate a possible relationship between the
diet type tested and the occurrence of apoptosis in goat oocytes. The results showed no
differences in the expression dynamics for these genes, indicating that the diet type did not
125
affect oocyte viability. However, lower mRNA levels for LHR, FSHR, LeptinR, and IGF1
and higher levels for MnSOD in the DCM group compared with the WDCM group were
found when assessing the gene expression profiles in the expanded cumulus cells. These
results showed a decrease in GLUT1 mRNA levels and a decrease in HSP70 levels in
immature oocytes, which is strong evidence that goats fed DCM experience drastic alterations
in several genes in both immature oocytes and cumulus cells, which partly explains the lower
maturation rates found in the DCM group. It can be concluded that changes in the gene
expression levels detected in immature oocytes and cumulus cells are connected with the
presence of anti-nutritional factors present in the diet containing DCM. Although the
detoxification method used in this study is highly efficient (Anandan et al. 2005), some
studies have suggested that traces of ricin in the detoxified castor meal may remain even after
alkaline detoxification process (Oliveira et al. 2010; Cobianchi et al. 2012). Ricin is a
glycoprotein that irreversibly inactivates eukaryotic cells ribosomes (Audi et al. 2005). This
inhibition is due to the removal of a single adenine residue from the 28S ribosomal RNA
circuit located in the 60S subunit, preventing the elongation of the polypeptide chain, which
leads to cell death (Lord et al. 2003). In conclusion, the inclusion of DCM in goat feed for
long periods of time does not alter gene expression in oocytes matured in vitro, but it does
change the dynamics of gene expression in immature oocytes and cumulus cells, resulting in a
decrease in the rate of oocyte maturation.
Acknowledgments
Financial support was received from Edital CNPq/MAPA/SDA nº. 064/2008 – ref. nº.
578189/2008-9. L.M. Silva was the recipient of a doctoral scholarship from CNPq (n°.
551634/2010-3).
References
Abdalla, A.L., Filho, J.C.S., Godoi, A.R., Carmo, C.A., Eduardo, J.L.P. (2008). Utilização de
subprodutos da indústria de biodiesel na alimentação de ruminantes. Rev. Bras. Zootec. v.
37, p. 260-258.
Anandan, S., Anil Kumar, G.K., Ghosh, J. and Ramachandra, K.S. (2005). Effect of different
physical and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Anim. Feed Sci.
Technol. 120, 159-168.
126
Arruda, I.J., Silva, L.M., Oliveira, C.H.A., Rodrigues, F.V., Silva, A.M., Fernandes, C.C.L.,
Gomes-Filho, M.A., Araújo, A.A., Silva, C.M.G. and D. Rondina. (2013). Embryo
production and gene expression in superovulated goats supplemented with de-oiled castor
cake before and after detoxification treatment. Anim. Prod. Sci. In press.
Audi, J., Belson, M., Patel, M., Schier, J. and Osterloh, J. (2005). Ricin poisoning: A
comprehensive review. JAMA. 294, 2342-2351.
Bradford, M.M. (1976). A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
Brevini Gandolfi, T.A.L. and Gandolfi, F. (2001). The maternal legacy to the embryo:
cytoplasmic components and their effects on early development. Theriogenology 55,
1255-1276.
Cobianchi, J.V., Oliveira, A.S., Campos, J.M.S., Guimarães, A.V., Valadares Filho, S.C.,
Flávio, P.C., Oliveira, T.E.S. (2012). Productive performance and efficiency of utilization
of the diet components in dairy cows fed castor meal treated with calcium oxide. R. Bras.
Zootec. 41, 2238-2248.
Ekwere, E.O., McNeil, R.T. and Okwuasaba, F.K. (2011). The effect of Ricinus communislinn (RICOM 1013-J) on semen parameters: a comparative study. JPCS. 1, 7-11.
European Food Safety Authority ( 008). ‘ icin (from Ricinus communis) as undesirable
substances in animal feed. Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food
Chain.’(European Food Safety Authority: Parma).
Food and Agriculture
and
rganization of the United Nations. ( 008). ‘Biofuels: Prospects, isks
pportunities.’ (Electronic Publishing Policy and Support Branch, Communication
Division: Rome).
Gilchrist, R.B., Ritter, L.J. and Armstrong, D.T. (2001). Mouse oocyte mitogenic activity is
developmentally coordinated throughout folliculogenesis and meiotic maturation. Dev.
Biol. 240, 289-298.
Grazul-Bilska, A.T., Borowczyk, E., Bilski, J.J., Reynolds, L.P., Redmer, D.A., Caton, J.S.
and Vonnahme, K.A. (2012). Overfeeding and underfeeding have detrimental effects on
oocyte quality measured by in vitro fertilization and early embryonic development in
sheep. Domest. Anim. Endocrinol. 43, 289-298.
Gueripel, X., Brun, V. and Gougeon, A. (2006). Oocyte bone morphogenetic protein 15, but
not growth differentiation factor 9, is increased during gonadotropin-induced follicular
127
development in the immature mouse and is associated with cumulus oophorus expansion.
Biol. Reprod. 75, 836-843.
Hussein, T.S., Sutton-McDowall, M.L., Gilchrist, R.B. and Thompson, J.G. (2011). Temporal
effects of exogenous oocyte-secreted factors on bovine oocyte developmental competence
during IVM. Reprod. Fert. Develop. 23, 576-584.
Leutenegger, C.M., Higgins, J., Matthews, T., Tarantal, A.F., Luciw, P., Pedersen, N.C. and
North, T.W. (2001). Real-time TaqMan PC
as a specific and more sensitive alternative
to the branched-chain DNA assay for quantitation of simian immunodeficiency virus
RNA. AIDS Res. Hum. Retrov. 17, 243-251.
Li, H.K., Kuo, T.Y., Yang, H.S., Chen, L.R., Li, S.S. and Huang, H.W. (2008). Differential
gene expression of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9
during in vitro maturation of porcine oocytes and early embryos. Anim. Reprod. Sci. 103,
312-322.
Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408.
Lord, P.W., Stevens, R.D., Brass A. and Goble C.A. (2003). Investigating semantic similarity
measures across the Gene Ontology: the relationship between sequence and annotation.
Bioinformatics 19, 1275-1283.
Meunier, B., Bouley, J., Piec, I., Bernard, C., Picard, B. and Hocquette, J. F. (2005). Data
analysis methods for detection of differential protein expression in two-dimensional gel
electrophoresis. Anal. Biochem. 340, 226-230.
Moreira, J.F.C., Rodríguez, N.M., Fernandes, P.C.C., Veloso, C.M., Saliba, E.O.S.,
Gonçalves, L.C., Borges, I., Borges, A. L.C.C. (2003). Concentrados protéicos para
bovinos. 1. Digestibilidade in situ da matéria seca e da proteína bruta. Arq. Bras. Med.
Vet. Zoo. 55, 315-323.
National Research Council ( 007). ‘Nutrient requirements of small ruminants: sheep, goats,
cervids and new words camelids.’ (The National Academies Press: Washington).
Nuttinck, F., Charpigny, G., Mermillod, P., Loosfelt, H., Meduri, G., Freret, S., Grimard, B.
and Heyman, Y. (2004). Expression of components of the insulin-like growth factor
system and gonadotropin receptors in bovine cumulus–oocyte complexes during oocyte
maturation. Domest. Anim. Endocrinol. 27, 179-195.
Oliveira, A.S., Campos, J.M.S., Oliveira, M.R.C., Brito, A.F., Valadares Filho, S.C.,
Detmann, E., Valadares, R.F.D., Souza, S.M., Machado, O.L.T. (2010). Nutrient
128
digestibility, nitrogen metabolism and hepatic function of sheep fed diets containing
solvent or expeller castor seed meal treated with calcium hydroxide. Anim. Feed Sci.
Technol. 158, 15-28.
Pisani, L.F., Antonini, S., Pocar, P., Ferrari, S., Brevini, T.A.L., Rhind, S.M. and Gandolfi, F.
(2008). Effects of pre-mating nutrition on mRNA levels of developmentally relevant
genes in sheep oocytes and granulosa cells. Reproduction 136, 303-312.
Salhab, A.S., Shomaf, M.S., Gharaibeh, M.N., Amer, N.A. (1999). Effects of castor bean
extract and ricin a-chain on ovulation and implantation in rabbits. Contraception 59, 395399.
Sandhyakumary, K., Bobby, R.G., Indira, M. (2003). Antifertility effects of Ricinus
communis (Linn) on rats. Phytother. Res. 17, 508-511.
Satrapa, R.A., Castilho, A.S., Razza, E.M., Pegorer, M.F., Puelker, R. and Barros, C.M.
(2013). Differential expression of members of the IGF system in OPU-derived oocytes
from Nelore (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus) cows. Anim. Reprod. Sci. 138, 155158.
Silva, L.M.; Oliveira, C.H.A.; Silva, A.M.; Silva, C.M.G.; Castro, S.V.; Carvalho, A.A.;
Duarte, A.B.G.; Costa, E.C.; Feltrin, C.; Figueiredo, J.R.; Rondina, D. (2013). In vitro
development of ovine preantral follicles and oocyte cleavage rate are not affected by longterm ingestion of detoxified castor meal. Small Rum. Res. 113, 353-359.
Storeng, R. and Jonsen, J. (1983). Inhibitory effect of ricin on the development of
preimplantation mouse embryos. J. Toxicol. Environ. Health 12, 193-202.
Su, Y.Q., Wu, X., O'Brien, M.J., Pendola, F.L., Denegre, J.N., Matzuk, M.M. and Eppig, J.J.
(2004). Synergistic roles of BMP15 and GDF9 in the development and function of the
oocyte-cumulus cell complex in mice: genetic evidence for an oocyte-granulosa cell
regulatory loop. Dev. Biol. 276, 64-73.
Yoshida, Y., Miyamura, M., Hamano, S. and Yoshida, M. (1998). Expression of growth
factor ligand and their receptor mRNAs in bovine ova during in vitro maturation and after
fertilization in vitro. J. Vet. Med. Sci. 60, 549-54.
Yoshino, O., McMahon, H.E., Sharma, S. and Shimasaki, S. (2006). A unique preovulatory
expression pattern plays a key role in the physiological functions of BMP-15 in the
mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 10678-10683.
129
Zhu, G., Guo, B., Pan, D., Mu, Y. and Feng, S. (2008). Expression of bone morphogenetic
proteins and receptors in porcine cumulus–oocyte complexes during in vitro maturation.
Anim. Reprod. Sci. 104, 275-283.
130
Table 1. Composition of the concentrate - based
supplements.
Constituent (% DM)
Diet
WDCM
DCM
Ground corn
81.8
79.6
Soybean meal
12.1
-
-
14.5
Urea
1.0
1.0
Vitamin mineralized premix
4.3
4.1
White salt
0.8
0.8
Detoxified castor meal
131
Table 2. Composition of the diets.
Composition (% DM)
Ingredients
Neutral
Acid
detergent
detergent
fiber
fiber
7.2
69.9
40.5
.9
17.6
38.4
30.6
Organic
Crude
Ether
matter
protein
extract
Guinea grass hay
92.8
6.8
1.2
Detoxified castor meal
8 .4
36.1
Ash
Concentrate - based supplements
WDCM – diet
97.2
15.0
3.1
2.8
-
-
DCM – diet
97.1
15.0
3.5
.9
-
-
132
Table 3. Sequence of PCR primers, TaqMan probes, and GenBank accession codes.
133
Table 4. Number of follicles, total number of oocytes recovered per goat, mean number
of non-viable and viable (G-I, -II and -III) oocytes and maturation rates in goats fed
without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM). Values are means ± SE.
Different letters in the same row indicate significant differences (P < 0.05).
134
Figure 1. Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on the
relative expression of genes related to quality, metabolism, oxidative stress and apoptosis in
goat immature oocytes.
a,b
Indicate significant differences between groups (P < 0.05).
135
Figure 2. Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on the
relative expression of genes related to the quality of goat oocytes in metaphase II (MII) or not
competent (NC) oocytes.
a,b
Indicate significant differences between grade oocytes in the same groups and type oocytes
(P < 0.05).
A,B
Indicate significant differences between type oocytes in the same groups and
grade oocytes (P < 0.05).
136
Figure 3. Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on the
relative expression of genes related to metabolism in goat oocytes in metaphase II (MII) or
not competent (NC) oocytes.
a,b
Indicate significant differences between grade oocytes in the same group and type oocytes
(P < 0.05).
A,B
Indicate significant differences between type oocytes in the same group and
grade oocytes (P < 0.05). * Indicate significant differences between groups in the same type
and grade oocytes (P < 0.05).
137
Figure 4. Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on the
relative expression of genes related to oxidative stress and apoptosis in goat oocytes in
metaphase II (MII) or not competent (NC) oocytes.
138
Figure 5. Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on the
relative expression of genes related to endocrine function, metabolism and oxidative stress in
granulosa cells.
139
Figure 6. Effect of feed without (WDCM) or with detoxified castor meal (DCM) on the
relative expression of genes related to endocrine function, metabolism and oxidative stress in
cumulus cells.
a,b
Indicate significant differences between groups (P < 0.05).
140
10 CAPÍTULO 5
Resposta reprodutiva e características produtivas de ovelhas suplementadas por longo
período com farelo de mamona detoxificado
Reproductive Responses and Productive Characteristics in Ewes Supplemented with
Detoxified Castor Meal for Long Period
Periódico: Revista Brasileira de Zootecnia (submetido em agosto de 2013)
141
Resumo
Objetivou-se avaliar o efeito da suplementação com farelo de mamona detoxificado (FMD) na
alimentação de ovelhas durante a gestação, parto, pós-parto, desenvolvimento ponderal das
crias e ao abate. Foram utilizadas 56 ovelhas que tiveram o estro sincronizado, seguido de
monta natural. No início da gestação e no pós-parto foram avaliados os níveis de metabólitos
sanguíneos e de progesterona. Ao abate, foi determinado a composição centesimal e o perfil
de ácidos graxos no lombo das ovelhas. Os resultados demonstraram que não houve efeito da
dieta sobre a resposta reprodutiva após a sincronização do estro. No início da gestação, os
níveis de albumina e creatinina foram inferiores (P<0,0001) no grupo FMD. A suplementação
com FMD não alterou o peso e a condição corporal das ovelhas ao parto. No entanto, ao
desmame, o grupo FMD apresentou a AOL superior em relação grupo sem farelo de mamona
detoxificado (SFMD) (P<0,01). Tanto ao parto, quanto ao desmame, as crias oriundas de
ovelhas suplementadas com FMD, apresentaram a AOL superior (P<0,0001) quando
comparado ao grupo SFMD. No pós-parto, os níveis de glicose (P<0,05), ureia, proteína e
colesterol (P<0,0001) foram inferiores no grupo FMD. O retorno a ciclicidade foi semelhante
entre os grupos, com média de 47 dias após o parto. Ao abate, foi verificado que os
componentes anatômicos e de carcaça, bem como os resultados da análise centesimal não
sofreram alterações com o tipo de dieta, exceto o nível do ácido heptadecenóico que foi
superior (P<0,05) no grupo FMD. A suplementação com FMD tem potencial para ser
utilizado na dieta de ovelhas sem afetar as taxas de concepção, gestação, prolificidade, retorno
a ciclicidade e produção de leite, incluindo o perfil dos metabólitos sanguíneos e
características de carcaça.
Palavras-chave: Ricinus communis L. Carcassa. Desempenho reprodutivo. Ovino.
142
Reproductive Responses and Productive Characteristics in Ewes Supplemented with
Detoxified Castor Meal for Long Period1
Liliane Moreira Silva2*, Aline Maia Silva2, Cláudio Henrique de Almeida Oliveira2,
Hilton Alexandre Vidal Carneiro3, Priscila Teixeira de Souza3, Frederico José Beserra4,
Cleidson Manoel Gomes da Silva2, Davide Rondina2
1
Financial support was received from Edital CNPq/MAPA/SDA No. 064/2008 - ref. No.
578189/2008-9
2
Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil; *e-mail for correspondence:
[email protected]
3
Universidade de Tecnologia do Sertão Central, FATEC, Instituto Centro de Ensino
Tecnologico, Quixeramobim, Ceará, Brazil
4
Universidade de Fortaleza, UNIFOR, Fortaleza, Ceará, Brazil
ABSTRACT – The objective of the present study was to evaluate the effect of
supplementation with detoxified castor meal (DCM) in the feed of ewes during pregnancy,
partum, post-partum and weight development of offspring and at slaughter. The study
consisted of 56 ewes with synchronized estrus followed by natural mating. In the beginning of
pregnancy and in post-partum, hepatic and renal function-related parameters and progesterone
levels were measured. At slaughter, the proximate composition and fatty acid profile were
determined in the loin of ewes. The results demonstrated that there was no effect of diet on
reproductive response after estrus synchronization. In the beginning of pregnancy, albumin
and creatinine levels were lower (P<0.0001) in the DCM group. Supplementation with DCM
did not alter the weight or body condition of ewes at partum. However, at weaning, the DCM
group showed a higher loin-eye area (LEA) in relation to the group feed without detoxified
castor meal (WDCM), (P<0.01). At partum as well as at weaning, the offspring of the ewes
supplemented with DCM, showed a higher LEA (P<0.0001) compared to the WDCM group.
In post-partum, levels of glucose (P<0.05), urea, protein and cholesterol (P<0.0001) were
lower in the DCM group. Return to cyclicity was similar between the groups, with a mean of
47 days after partum. At slaughter, it was found that anatomic and carcass components, as
well as results of proximate analysis were not affected by the type of diet, except for an
increase in heptadecenoic acid in the DCM group (P<0.05). In conclusion, DCM
143
supplementation can be utilized in the diet of ewes without affecting lambing, pregnancy,
prolificacy, return to cyclicity and milk production, as well as blood biochemical parameters
and carcass characteristics.
Key Words: Ricinus communis L., carcass, reproductive performance, sheep
Introduction
The growing worldwide preoccupation with the environment, together with the search
for sources of renewable energy, places biodiesel at the center of attention and interests. In
Northeast Brazil, the cultivation of castor beans (Ricinus communis), for the production of
biodiesel, has been greatly promoted, since it is a plant that is well adapted to the region and
has a high productivity (Barbosa et al., 2010). Besides, castor bean byproducts, such castor
meal it has a protein content of 39 - 43% (Abdalla et al., 2008) and thus, it can be a good
source of protein for ruminants.
The utilization of these byproducts for substituting forage or part of the concentrate in
the feed of ruminants has been evaluated (Barros et al., 2011). However, these byproducts
contain antinutritional or specific bioactive compounds, such as ricin, a ribosome inactivator
protein (Audi et al., 2005), making detoxification necessary before being introduce in animal
feed. Various studies, using different methods, have evaluated the utilization of detoxified
castor meal in the feed of ruminants, showing no adverse effects on carcass, digestibility or
synthesis of proteins by the ruminal microbiota (Vieira et al., 2010; Diniz et al., 2011;
Oliveira et al., 2010).
In the reproductive scope, studies conducted in rabbits showed that castor bean extract
negatively affects the processes of implantation and ovulation (Salhab et al., 1999), besides
inducing abortion in rats (Salhab, 1996). In males, Sandhyakumary et al. (2003) observed a
reduction in sperm motility in vitro and in vivo utilizing castor bean extracts in the semen of
the epididymis tail of rats. Despite these studies, there are no works to date that have
evaluated the effect of castor meal as a source of protein on the reproductive characteristics of
livestock, as well as if their long-term supply promotes any adverse effect on reproductive
performance of ewes. Thus, the aim of the present study was to evaluate the effect of DCM in
substitution of soybean meal in the feed of ewes during pregnancy, partum, post-partum, on
the offspring weight development and carcass characteristics of ewes at slaughter.
144
Material and Methods
The study was approved by the Ethics Commission for the Use of Animals of the State
University of Ceara (CEUA-UECE), under Protocol No. 09503497-8/82.
The detoxification of castor meal was carried out according to Oliveira et al. (2010),
with some modifications. Castor meal was added to calcium oxide solution (1 kg per 9 liters
of water), and after standing overnight, the treated material was dried for storage and
utilization. The efficiency of the detoxification process was verified by the absence of ricin as
demonstrated by 12% polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions
(native-PAGE), where gels were stained with Coomassie Blue R250.
The experiments were conducted on Padre Joao Piamarta Farm, in Itaitinga-CE, located
at 4º 01’ S and 38º 31’95 W, in the period between April of 2010 and June of 2011. The area,
characterized by a constant photoperiod regimen, has a warm tropical, sub-humid climate
with a mean annual rainfall and temperature of 904.5mm and 26 - 28 ºC, with two distinct
seasons: rainy from January to May and dry from June to December.
Fifty-six mixed-breed, adult, cycling ewes (mean±SEM) homogeneous in weight
(33.03±0.65 kg) and body condition (2.31±0.06), were divided into two groups: without
detoxified castor meal (WDCM, n=29) and detoxified castor meal (DCM, n=27). In the first
group (WDCM), the animals received soybean meal in the concentrate as nitrogen source. In
the second group (DCM), the animals were fed with detoxified castor meal replacing soybean
meal in the concentrate (Table 1).
Table 1 - Ingredient composition of the concentrate - based
supplements
Constituent (% DM)
Diet
WDCM
DCM
Ground corn
81.8
79.6
Soybean meal
12.1
-
-
14.5
Urea
1.0
1.0
Vitamin mineralized premix
4.3
4.1
White salt
0.8
0.8
Detoxified castor meal
145
Ewes were kept in two pens separated by a central feed alley, where receiving mineral
salt and water ad libitum. Each pen measured 40 x 50 m and contained a 40 x 3 m open front
shelter. The feed alley and the front shelter was clay with concrete and faced in east-west
direction. Animals were submitted to thirty days of housing adaptation. During this period,
internal and external parasites treatment and control of ovary function by ultrasonography was
performed.
In both groups, the diets were composed by mixture of guinea grass hay (Panicum
maximum v. Mombasa) and isoenergetic (74% of TDN) and isonitrogenous (14% CP on DM
basis) concentrates (Table 2). The formulation of diets was based according to the nutritional
requirements (NRC, 2007) for mature ewe according to the reproductive period. The feed was
provided twice a day (07:00 and 15:00) for 429 days, from 15 days before mating to slaughter
about 262 days after parturition.
Table 2 - Ingredient composition of diets
Composition (% DM)
Ingredients
Neutral
Acid
Detergent
Detergent
Fiber
Fiber
7.20
69.98
40.46
2.94
17.63
38.43
30.63
Organic
Crude
Ether
Matter
Protein
Extract
Guinea grass hay
92.80
6.81
1.20
Detoxified castor meal
82.37
36.14
Ash
Concentrate – based supplements
WCM – diet
97.20
15.00
3.15
2.80
-
-
DCM – diet
97.07
15.00
3.49
2.93
-
-
Estrus was induced in all females using an intravaginal device (Controlled Internal Drug
Release device, CIDR®), impregnated with 0.33 g P4 (Eazi-Breed CIDR®, InterAg, Hamilton,
New Zealand), which was inserted for 5 days. Upon removal of the device, the ewes received
an application of 1 mL of prostaglandin F α (Lutalyse®, Upjohn, Kalamazoo, USA). Males of
proven fertility and marked in the sternal region were placed together with the females for a
period of 72 h, allowing the mated females to be identified by the presence of the marker
paint in the region of the croup.
Diagnosis of pregnancy, done on the 30th day of pregnancy, as well as the
determination of the number of fetuses and monitoring of embryonic/fetal development, was
carried out by real-time ultrasonography (Chisson D600 VET, Chisson Medical Imaging Co.
146
Ltd., China), utilizing a linear transrectal transducer of 3.5 - 5.0 MHz. The fetal measurements
in animals fed WDCM and DCM were performed every 10 days. The following parameters
were evaluated according to methods proposed by Santos et al. (2004): vesicle diameter
(VD), from the 30th to 40th day of pregnancy; crown-rump length (CRL), from the 30th to
50th day of pregnancy; and biparietal diameter (BPD) and abdominal diameter (AD) from the
40th to 60th day of pregnancy. Thoracic diameter (TD) was determined from the 40th to 60th
day of pregnancy, according to Lee et al. (2005). For the measurement of structures of
interest, ultrasonographic examinations were recorded in the form of videos, followed by the
capture of at least three images of each structure and measurement using the Image J program
(Image J, National Institutes of Health, Millersville, USA), previously calibrated. In twin
pregnancy, the mean of two embryos/fetuses was considered, following the method described
by Bulnes et al. (1998).
We measured pregnancy length (period from the time of mating up to partum), lambing
rate (proportion of lambed ewes to mated ewes), litter size (proportion of lambs born to
lambed ewes) and incidence of twin births. The mortality rate of offspring was determined
from birth up to weaning.
At partum and every 7 days up to weaning (60 days after partum), weight and body
condition score of the ewes were evaluated, as well as loin-eye area and depth of longissimus
dorsi by ultrasonography. In addition, in vivo performance of offspring was evaluated by
weight (measured weekly from birth up to weaning) and loin-eye area and subcutaneous fat
thickness (14 days after birth up to weaning, weekly). The ultrasonographic measurements
were obtained using a B mode ultrasound instrument (Chisson D600 VET, Chisson Medical
Imaging Co. Ltda., China), coupled to a 5.0 MHz linear transducer, conformed described by
Silva et al. (2011).
Milk production was measured two times a week using the weigh-suckle-weigh
technique, from the third day post-partum up to the moment of weaning (60 days postpartum), according to Celi et al. (2008). Briefly, the day before the measurement, all kids
were isolated from dams at 16:00 h. Beginning 08:00 of the following day, each kids was
weighed before and after being allowed to suckle the dam. Suckling periods did not exceed 30
min. Difference between pre- and post-suckling weights was recorded as estimated milk
production of the dam.
After 429 days of feeding, animals were fasted for solids and liquids, for 16 hours,
followed by weighing and slaughter according to RIISPOA guidelines (1980). The ewe were
147
then skinned and eviscerated and removed of the head and extremities. After evisceration, the
anatomical components were weighed (lung, heart, spleen, liver, kidneys, tongue, empty
stomach, empty intestines and omentum and cardiac and renal adipose tissue). After
evisceration, the carcass was weighed to obtain the hot carcass weight. The carcasses were
then stored at 4 ºC for 24 hours and reweighed to determine the cold carcass weight. The
carcasses were then cut longitudinally into two half-carcasses, and the following cuts were
made in the left half: shoulder, ham, loin, rib and neck, as described by Cesar; Sousa (2007)
and Silva Sobrinho (2001).
The loin of all slaughter animals was identified and stored in a freezer at -18 °C for
further tissue composition analysis. The loin was thawed inside plastic bags in a refrigerator
at 10 °C for 20 hours for the tissue analysis. In the dissection, the muscle, adipose and bone
tissues were separated using a scalpel, knife and anatomic clamp.
The centesimal composition of the muscle was determined according to the AOAC
(1990), and the moisture was obtained by drying a sample in an oven at 105 °C until it
reached a constant weight. The nitrogen content was determined by the Kjeldahl method and
converted to crude protein using a factor of 6.25. The fixed mineral residue was determined
by incineration at 550 °C. The total lipids were determined by a hot extraction process using
an organic solvent (hexane) at 120 °C. The fatty acid profile was quantified using gas
chromatography (model GCMSQP5050A, SHIMADZU, Brazil), connected to a flame
ionization detector. The separation took place in a CARBOWAX 20M (SUPELCO) fused
silica capillary column (stationary phase, polyethylene glycol) that was 60 m long, with an
internal diameter of 0.53 mm and 1 μm film thickness. A sample of
μ of the methyl ester
samples was injected into a split/splitless injector at 250 °C. The chromatograms containing
the data of retention time and the fatty acid area percentages were stored in Peaksimple
software (ARI Instruments, USA). The fatty acids were identified by comparing the retention
time of the methyl esters of the samples with authentic standards of fatty acid esters (Merck,
USA).
Blood samples were collected for determination of the main hepatic and renal functionrelated parameters before the start of the dietary treatment (day 0), at time of natural mating
(15 days of feeding), every 10 days after mating continuing up to 60 days of pregnancy (75
days of feeding) and at slaughter of animals (429 days of feeding). Blood was centrifuged at
3000 rpm for 15 min, and the plasma obtained was stored in the freezer at -20 ºC. Plasma
concentrations of urea, creatinine, lactate dehydrogenase (LDH), glutamic pyruvic
148
transaminase (GPT), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) and albumin were determined
by spectrophotometric assays in an automated biochemical analyzer (Labmax 240, Labtest®),
utilizing commercial kits (Labtest®, Lagoa Santa, Brazil). In addition, at partum and every 7
days up to weaning (60 days post-partum), blood was collected for assays of the biochemical
parameters
urea,
albumin,
protein,
glucose,
cholesterol
and
triglycerides,
by
spectrophotometric assays in an automated biochemical analyzer (Labmax 240, Labtest®),
utilizing commercial kits (Labtest®, Lagoa Santa, Brazil).
Upon removal of the CIDR® (day 0) and on days 4, 8, 12, 16 and 20 after removal of
the device, blood samples were collected for P4 determination by microparticle enzyme
immunoassay (MEIA) (Abbott Diagnostics AxSYM® SYSTEM), using a commercial kit
(Axsym P4, Abbott, Tokyo, Japan). The sensitivity of the test was of 0.2 ng/mL, and the intraand interassay coefficient of variation was 7.9 and 3.3%, respectively. In addition, every 5
days after partum up to 60 days post-partum, blood samples were collected for determination
of the presence of corpora lutea in the ovaries, on the basis of progesterone concentration. A
functional corpus luteus (CL) was considered when at least two consecutive samples showed
progesterone levels over 1 ng/mL; a non-functional corpus luteus was there was no detection
of progesterone over 1 ng/mL (Rodrigues et al., 2011).
The data were analyzed utilizing the statistical program SAS (Statistical Analysis
System, versão 9.2.). The parameters a parametric distribution were evaluated by ANOVA of
GLM procedures. For live weight, body condition, LEA, DLD and SFT, milk production,
carcass anatomic parameters, tissue analysis and fatty acid profile, the effect tested was the
diet or dietary group (WDCM and DCM) and the comparisons between means were
performed by the Student t-test. For analysis of fetal growth and plasma progesterone level
and other biochemical parameters, the factors tested were diet, interval of measurement or
time and interaction between the two sources of variation. The Duncan test was used for
comparison between means. The chi-square test was used for the variables in the form of
frequencies, including the number of animals marked after estrus synchronization, rates of
pregnancy, multiple pregnancy, lambing, multiple births and mortality, and prolificacy, and
number of corpora lutea.
149
Results and Discussion
In the present study, all dietary groups (P>0.05), showed high rates of estrus
synchronization and pregnancy (Table 3), where these results were similar to those reported
by Motlomelo et al. (2002). Recently, Rodrigues et al. (2011) found that the inclusion of 50%
cashew bagasse substituting for elephant grass did not have any influence on the rate of estrus
synchronization and pregnancy in sheep. Saunders et al. (2012) also found in sheep that the
supply of diets containing sources of protein of different ruminal degradability did not alter
pregnancy rate.
Data after partum were evaluated only in females with single pregnancy.
Table 3 - Reproductive and productive performance of ewes supplemented for a long period
without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal
Time of feeding
Attributes
(days)
No. of ewes exposed
WDCM
DCM
29
27
Sig.
BW, kg
0
33.52±0.82
33.96±1.35
ns
BC
0
2.24±0.09
2.38±0.09
ns
No. of ewes marked, %
15
89.7 (26)
88.9 (24)
ns
Pregnancy rate, %
45
82.8 (24)
85.2 (23)
ns
Twin pregnancy rate, %
45
4.2 (1/24)
21.7 (5/23)
ns
36.08±1.04a
36.41±1.54a
ns
2.7±0.11a
2.7±0.11a
ns
LEA, mm
523.25±6.61a
543.17±14.87a
ns
DLD, mm
14.27±0.15a
14.03±0.31a
ns
Parturition rate, %
79.31 (23)
70.37 (19)
ns
Pregnancy length, d
151.86±0.74
152.11±0.93
ns
4.35 (1)
21.05 (4)
ns
24
22
1.04
1.16
ns
4.17 (1)
4.54 (1)
ns
32.64±0.76b
32.36±1.57b
ns
Estrus synchronization
Parturition
167
BW, kg
BC
2
Twinning rate, %
No. of lambs
Litter size
Mortality, %
Weaning
227
Ewes BW, kg
150
Ewes BC
2.1±0.06b
1.9±0.06b
ns
LEA, mm2
399.37±8.08b
432.89±9.30b
**
DLD, mm
11.96± 0.20b
11.87±0.26b
ns
SFT, mm
2.68±0.06
2.48±0.06
*
Total, L
5.52±0.35
5.45±0.41
ns
Average milk yield, L
0.32±0.08
0.32±0.07
ns
Peak, week
3.47±0.23
3.00±0.33
ns
Average yield at peak, L
0.49±0.03
0.51±0.03
ns
Persistence 2nd mth, %
48.86±5.87
56.74±5.20
ns
3.06±0.10b
2.94±0.20b
ns
LEA at birth, mm2
290.54±6.44b
325.86±6.99b
***
SFT at birth, mm
1.47±0.03b
1.38±0.05b
ns
BW weaning, kg
9.15±0.42a
9.03±0.55a
ns
394.57±6.05a
425.81±9.22a
***
2.04±0.05a
2.05±0.06a
ns
Milk yield
167 - 227
Lambs
167 - 227
BW birth, kg
2
LEA at weaning, mm
SFT at weaning, mm
* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, ns not significant;
a,b
indicates significant difference
between partum and weaning within the same group (P<0.05). LEA: loin-eye area; DLD:
depth of longissimus dorsi; SFT: subcutaneous fat thickness.
Progesterone is essential in the maintenance of pregnancy (Inskeep 2004). Thus, serum
progesterone levels at the moment of CIDR removal and during the first 20 days of
pregnancy, can be an important tool for diagnosing possible early embryonic losses (Silva et
al., 2011). In the present study, the plasma concentrations of progesterone (Table 4)
determined at the time of the removal of the synchronization device (day 0) and up to the 20th
day after mating, did not differ between the dietary treatments (P>0.05). During the sampling
interval after mating, the two experimental groups showed increasing plasma progesterone
levels with values over 3 ng/mL starting on the 8th day in group WDCM and 12th day with
diet DCM, indicating the presence of a functioning corpus luteum. These findings are in
accordance with earlier studies, where it was found that plasma progesterone levels, in the
estrous cycle of ewes, significantly increase during the luteal phase (Berardinelli et al., 2001),
remaining elevated during the whole pregnancy (Khanum et al., 2008).
In all parameters evaluated, embryonic and fetal development was not affected by the
type of diet (Table 5).
151
Table 4 - Levels of progesterone (ng/mL) after estrus synchronization period in ewes supplemented for
long period without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal
Attributes
Days after CIDR removal (Time of feeding - days)
Day 0 (14)
Day 8 (22)
Day 12 (26)
Day 16 (30)
Day 20 (34)
WDCM
5.5±0.6
3.30±0.40
3.69±0.32
4.69±0.67
5.53±0.84
DCM
6.2±0.9
2.19±0.39
3.52±0.61
4.95±1.00
4.83±0.99
D
T
DxT
ns
***
ns
*** P<0.001, ns: not significant; D: diet; T: time.
Table 5 - Embryonic/fetal development in ewes supplemented for long period without (WDCM) or
with (DCM) detoxified castor meal
Attributes
Time of feeding
WDCM
(days)
DCM
Vesicle diameter
30 days of pregnancy
45
24.35±0.23
24.31±0.31
40 days of pregnancy
55
36.71±0.23
37.82±0.19
Crown-rump length
30 days of pregnancy
45
10.00±0.08
10.67±0.18
40 days of pregnancy
55
23.88±0.21
24.22±0.36
50 days of pregnancy
65
38.09±0.18
39.03±0.36
Abdominal diameter
40 days of pregnancy
55
8.24±0.10
8.49±0.08
50 days of pregnancy
65
11.43±0.12
11.87±0.12
60 days of pregnancy
75
17.62±0.11
18.26±0.11
Thoracic diameter
40 days of pregnancy
55
5.71±0.11
5.77±0.07
50 days of pregnancy
65
8.11±0.13
8.04±0.09
60 days of pregnancy
75
11.44±0.11
11.81±0.14
Biparietal diameter
40 days of pregnancy
55
6.89±0.08
6.98±0.08
50 days of pregnancy
65
9.97±0.09
10.45±0.12
60 days of pregnancy
75
15.19±0.08
15.19±0.13
D
T
DxT
ns
***
ns
ns
***
ns
ns
***
ns
ns
***
ns
ns
***
ns
*** P<0.001, ns: not significant; D: diet; T: time.
According to Berardinelli et al. (2001), early embryonic development in ewes can be
influenced by the protein level in the diet. These authors found that the ingestion of high
amounts of protein (2x live weight maintenance requirements) caused alterations in embryo
152
transport through the oviduct, leading to asynchrony between the stage of embryonic
development and uterine environment. Thus, we inferred that the level of inclusion and not
the origin of protein is responsible for altering the pattern of early embryonic development.
Besides, earlier studies by our research group (Silva et al., 2013) demonstrated the
substitution of soybean meal by detoxified castor meal in the feed of ewes for long periods
did not alter the development pattern of pre-antral and antral follicles, as well as the quality of
oocyte and capacity of early embryonic development in vitro. In evaluating the effect of time
on embryonic/fetal development, we observed a significant growth (P<0.001) in all variables
analyzed (VD, CRL, AD, TD, BD). These results were expected since the growth of the
embryo/fetus shows a linear profile during pregnancy (Karen et al., 2009). In addition, it is
important to point out that this analysis from a clinical point of view is highly efficacious for
detecting fetal abnormalities as early as possible. Certainly, early pregnancy diagnosis,
together with the determination of number of fetuses and estimate of fetal age allows an
increase in livestock productivity (Lega et al., 2007).
Figure 1 shows the mean values for liver and kidney function parameters measured
during the first 75 days of feeding. There was an effect of diet on the plasma concentration of
albumin (WDCM 2.63±0.04 g/dL vs. 2.31±0.05 g/dL DCM, P<0.0001) and creatinine (DCM
0.94±0.05 mg/dL vs. 0.89±0.04 mg/dL WDCM, P<0.0001). Besides, all the blood parameters
evaluated significantly varied with time, with the exception of GOT. According to Payne and
Payne (1987), serum albumin level is one of main indicators of protein metabolism over a
long period in ruminants, where it is considered the most sensitive indicator for determining
protein nutritional state (Peixoto et al., 2010). However, despite the difference in albumin
levels, both groups had consistent values in the physiological range for the ovine species
(Piccione et al., 2009). With regard to creatinine levels, the values of both groups appeared to
be lower than the reference range for the species (Gonzalez and Silva, 2006), indicating a
deficit protein metabolism, possibly due to a greater metabolic demand during pregnancy
(Piccione et al., 2009). In relation to the influence of time on the metabolites evaluated, it is
well known that different reproductive stages influence the levels of various metabolites in
ewes (Piccione et al., 2009), considering the change in the protein and energy demand in
these different stages.
There were no significant differences (P>0.05) in any of the parameters evaluated,
including pregnancy length, lambing rate, twinning rate, litter size and mortality post-partum
(Table 3). These results are in agreement with the studies of Mexia et al. (2004), who
153
observed litter size rates of 1.19 to 1.32 with 25% twin births and 75% of single births, after
evaluating the reproductive behavior of Santa Inês ewes supplemented with cassava starch
residue or soybean husks.
During suckling, live weight, body condition, LEA and DLD of ewes showed a
significant decrease (P<0.05) in both dietary treatments. In general, weight loss in lactating
females in post-partum is common, due to the large supply of nutrients required for their
maintenance and milk production, where they normally mobilize part of their body reserves to
meet such demand. On the other hand, the measurements taken at partum and weaning were
not affected by diet (Table 3), with exception of LEA, which was significantly greater
(P<0.05) at weaning in the DCM group, indicating that there was less mobilization of body
reserves in animals of the DCM group in relation to those in the WDCM group (Table 3). SFT
was greater at partum and lower at weaning in the DCM group (P<0.05). Despite this
difference, it is difficult to explain this observation, since the measurement of SFT is done
together with the epidermis, thus being difficult to detect with precision variations in the
deposition of subcutaneous fat tissue in lactating ewes.
The evaluations regarding the milk production of the ewes showed similar results
(P>0.05) between the two groups, where there was a peak of lactation about 3 weeks after the
beginning of lactation with a mean milk yield of 0.32±0.07 L. These values are lower than
that reported by Araujo et al. (2008), who observed a milk production in Santa Inês ewes
during lactation of 1.48 kg/day. These differences may be due to the method applied to
evaluate milk production. According to Unal et al. (2007), the estimate of milk production in
Santa Inês ewes by the method of manual milking, after injection of oxytocin, result in a
higher production compared to the weight-suckle-weight method.
154
Figure 1 - Blood concentrations of metabolites during pregnancy and at slaughter in ewes supplemented for long period without (WDCM) or with (DCM)
detoxified castor meal. Values are given as means±SEM. Statistically significant effect of Diet and Time treatments and Interaction given in the
figure referred to 0 versus 75 days of feeding.
155
The values of indicators of energy metabolism, such as cholesterol (CT), triglycerides
(TG) and glucose (GL) and of indicators of protein metabolism, such as albumin (AL), total
protein (TP) and urea (UR), are given in Table 6.
Table 6 - Concentrations of blood metabolites during post-partum in ewes fed for long period without
(WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal
Attributes
Parturition
Weaning
(167 days of feeding)
(227 days of feeding)
D
T
DxT
WDCM
DCM
WDCM
DCM
Urea, mg/dL
17.20±1.36
17.28±0.81
23.36±2.17
21.79± 1.28
***
***
*
Albumin, g/dL
2.60±0.06
2.70±0.07
2.12±0.07
2.28±0.07
ns
***
**
Protein, g/dL
6.90±0.17
6.74±0.13
6.53±0.17
6.38±0.10
***
*
ns
Glucose, mg/dL
62.80±4.55
57.26±6.16
58.26±2.41
54.69±1.94
*
ns
ns
Cholesterol, mg/dL
61.50±3.22
58.95±2.28
65.16±2.03a
37.34±1.64b
***
***
***
Triglycerides, mg/dL
13.80±0.08
13.96±0.09
20.37±1.34
18.18±1.39
ns
***
ns
* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, ns: not significant;
a,b
comparison between columns (P<0.05); D:
diet; T: time.
At weaning, only CT values were shown to be significantly higher in the WDCM group
(P<0.05). According to Kaneko (1997), the reference values of CT for the ovine species
varies between 52 and 76 mg/dL, indicating that cholesterol levels in the DCM group were
below normal for the species. According to Rabassa et al. (2009), cholesterol concentrations
lower than reference levels is a strong indication of energy deficiency in the diet. In
evaluating the effect of time, all the metabolites examined were affected, except glucose
(P>0.05), indicating that the metabolic profile of ewes is dynamic during the lactation period
(Piccione et al., 2009). The plasma levels of CT, GL, TP and UR were influenced by the type
of diet, where they were higher in the WDCM group. The interaction diet vs. time, in turn,
influenced UR, AL and CT levels (P<0.05). Despite these differences, the values obtained in
the present study concurred with reference values (Gonzalez and Silva 2003), indicating that
the diets tested provided adequate nutritional support for the metabolism of the animals
during lactation.
Plasma progesterone level in ewe is an indicator of ovarian activity (Morales-Teran et
al., 2004) and directly reflects the functionality of the corpus luteum. In the present study, the
time between partum and the presence of the first functional corpus luteum was similar
156
(P>0.05) between the groups (47 and 49 days in the WDCM and DCM groups, respectively)
(Figure 2).
Figure 2 - Profile of plasma progesterone during 60 days post-partum of ewes fed for long period
without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal. Values are given as means±SEM.
Statistically significant effect of Diet, Time treatments and Interaction are shown in the
figure.
In addition, there was no significant difference (P>0.05) between the two groups in the
number of ewes that showed functional CL (n=6, WDCM and n=4, DCM), non-functional CL
(n=9, WDCM and n=10, DCM), or lack of CL (n=4, WDCM and n=2, DCM). Rodrigues et
al. (2011), in evaluating the effect of adding dehydrated cashew bagasse to the diet of ewes,
also did not observe any influence of feed on the time of return of first functional corpus
luteum. In another study, Mbayahaga et al. (1998) reported an interval of 81 days between
partum and first activity of the corpus luteum, longer than that observed in our study.
The performance parameters of the offspring (BW, LEA and STF) significantly
increased (P<0.05) in the course of the suckling period. Birth weight and SFT of the lambs,
from birth to weaning (Table 1), did not differ between the groups (P>0.05). On the other
hand, the LEA was significantly larger (P<0.001) in the DCM group at birth and at weaning,
indicating a greater gain in muscle mass of the fetuses during pregnancy, which in return
reflected in a greater LEA at birth and consequently at weaning.
Tables 7, 8 and 9 give the results obtained for the ewes at slaughter, after 429 days of
feed. No differences (P>0.05) were revealed in the anatomic and carcass parameters (Table
7), as well as in the cuts and centesimal composition of the loin between dietary groups
(Table 8), with exception of bone weight which was greater in the DCM group. These
157
findings are in agreement with the study by Pompeu et al. (2012) and Vieira et al. (2010), in
finding that supplementation with detoxified castor meal at levels of up to 67% and 100%,
respectively, did not influence the carcass characteristics of ewes. With respect to the lipid
profile of the longissimus dorsi muscle (Table 9), only heptadecanoic acid was higher in the
animals fed with DCM (P>0.05). This result suggests that the supply of DCM allowed a
greater synthesis of heptadecanoic acid by the microorganisms of the rumen, and that
consequently, there was a greater deposition of this substance in the muscle tissue of the
ewes.
Table 7 - Anatomic and carcass parameters of ewes at 429 days of supplementation
without (WDCM) or with (DCM) detoxified castor meal
Parameters
WDCM
DCM
Sig.
31.90±1.14
32.53±1.56
ns
Lungs
338.75±17.47
335.85±18.05
ns
Heart
149.58±6.78
158.75±9.98
ns
Bladder
76.25±5.51
82.50±13.03
ns
440.83±23.60
511.57±43.54
ns
Kidney
79.58±2.64
82.50±3.11
ns
Tongue
109.17 ±3.74
103.75±5.61
ns
Empty stomach
1278.33±49.21
1323.33±83.43
ns
Empty intestines
1473.33±87.24
1363.33±94.80
ns
Omental fat tissue
812.92±134.83
693.75±137.42
ns
Heart fat tissue
51.67±5.20
102.18±41.01
ns
Renal fat tissue
375.58±80.65
326.75±66.89
ns
Hot carcass
14.71±0.48
14.67±0.81
ns
Cold carcass
13.99±0.48
14.02±0.77
ns
Half carcass
7.19±2.07
7.19±2.08
ns
Leg
2.41±0.08
2.41±0.11
ns
Shoulder
1.28±0.05
1.29±0.09
ns
Loin
0.48±0.02
0.49±0.03
ns
Neck
0.75±0.03
0.73±0.04
ns
Ribs
2.12±0.10
2.12±0.14
ns
Fasting weight (kg)
Anatomic parameters (g)
Liver
Carcass parameters (kg)
* P<0.05, ** P<0.01, ns not significant.
158
Table 8 - Dissection and centesimal composition of longissimus dorsi muscle of ewes at
429 days of supplementation without (WDCM) or with (DCM) detoxified
castor meal
Parameters
WDCM
DCM
Sig.
Loin
469.58±26.46
495.25±29.40
ns
Muscle
238.01±6.26
260.34±17.47
ns
Bone
71.45±5.97
100.52±8.67
*
Connective
68.82±5.64
57.07±4.95
ns
Adipose
61.38±13.49
59.45±6.57
ns
Moisture
76.24±0.46
77.27±0.34
ns
Ash
1.20±0.05
1.15±0.08
ns
Fat
2.39±0.23
2.48±0.23
ns
Protein
20.15±0.46
19.08±0.39
ns
Dissection (g)
Composition (%)
* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, ns not significant.
Table 9 - Means and standard errors for the quantification of fatty acids in the lipid extract of
the loin at 429 days of supplementation without (WDCM) or with (DCM)
detoxified castor meal
Fatty acid
WDCM
DCM
Sig.
Octanoic
C8:0
0.7353±0.1621
0.7025±0.3305
ns
Decanoic
C10:1
1.1376±0.4500
0.8119±0.4019
ns
Myristic
C14:0
1.4116±0.1188
1.6405±0.1174
ns
Pentadecanoic
C15:0
0.7113±0.1476
1.3892±0.3729
ns
Palmitic
C16:0
20.0170±1.8123
19.1118±1.3610
ns
Sapienic
C16:1 n-10
0.9141±0.0835
1.0347±0.1684
ns
Palmitoleic
C16:1 n-7
1.0489±0.1095
1.3865±0.1280
ns
Heptadecenoic
C17:1
1.3062±0.1834
2.6319±0.3902
*
Stearico
C18:0
17.0000±1.2106
15.033±1.3676
ns
Oleic
C18:1 n-9
31.3470±3.2798
31.2563±2.0245
ns
Linoleic
C18:2 n-6
4.0217±0.7189
4.4002±1.3975
ns
C20:4
4.7265±1.5098
1.9749±0.5836
ns
Arachidonic
159
SFA
-
40.5514±2.7312
40.0210±2.2588
ns
UFA
-
38.5154±2.8469
38.2615±2.6507
ns
MUFA
-
34.0910±3.3308
34.0865±2.1959
ns
PUFA
-
5.1618±0.6610
4.1750±1.0441
ns
UFA/SFA
-
0.9552±0.0481
0.9700±0.0796
ns
MUFA/SFA
-
0.8349±0.0489
0.8643±0.0670
ns
PSFA/SFA
-
0.1404±0.0302
0.1057±0.0279
ns
MSFA/PSFA
-
7.2180±1.3938
22.5904±10.6778
ns
DFA
-
53.6706±3.7022
51.8506±2.8404
ns
* P<0.05, ns not significant; SFA: saturated fatty acids; UFA: unsaturated fatty acids; MUFA:
monounsaturated fatty acids; PUFA: polyunsaturated fatty acids; MSFA: monosaturated fatty
acids; PSFA; polysaturated fatty acids; DFA: desirable fatty acids.
Conclusions
The results demonstrate that detoxified castor meal can be included up to 15% in ewes
feed without affecting conception and pregnancy rates, litter size, return to cyclicity and milk
production. Hepatic and renal function-related parameters and progesterone levels were not
substantially altered in ewes supplemented with DCM. The loin-eye area was larger in
offspring from ewes supplemented with DCM at birth and at weaning. After supplementation
with DCM for a long period, no alterations were observed in carcass characteristics of ewes,
except heptadecanoic acid levels evaluated in the longissimus dorsi muscle.
Acknowledgments
L.M. Silva was the recipient of a Doctorate scholarship from CNPq (No. 551634/20103). The authors thank the technical team of Colégio Padre João Piamarta for the support and
help in the management of the animals and Dr. Hilton Cesar Rodrigues Magalhaes of
Embrapa Frutos Tropicais, Fortaleza, Ceará for determining the fatty acid profile.
160
References
ABDALLA, A.L.; FILHO, J.C.S.; GODOI, A.R. et al. Utilização de subprodutos da indústria
de biodiesel na alimentação de ruminantes. Revista Brasileira de Zootecnia. v.37, p.260258, 2008.
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC. Official methods of
analysis. 15.ed. Washington: AOAC, 1990. 1298p.
ARAUJO, R.C.; PIRES, A.V.; SUSIN, I. Milk yield, milk composition, eating behavior, and
lamb performance of ewes fed diets containing soybean hulls replacing coastcross
(Cynodon species) hay. Journal of Animal Science, v.86, p.3511-3521, 2008.
AUDI, J.; BELSON, M.; PATEL, M. et al. Ricin poisoning: a comprehensive review.
Journal of the American Medical Association, v.294, p.2342-2351, 2005.
BARBOSA, D.C.; SERRA, T.M.; MENEGHETTI, S.M.P. et al. Biodiesel production by
ethanolysis of mixed castor and soybean oils. Fuel, v.89, p.3791-3794, 2010.
BERARDINELLI, J.G.; WENIG, J.; BURFENING, P.J. et al. Effect of excess degradable
intake protein on early embryonic development, ovarian steroid and blood urea nitrogen
on days 2, 3, 4, and 5 of the estrus cycle in mature ewes. Journal of Animal Science,
v.79, p.193-199, 2001.
BULNES, A.G.; MORENO, J.S.; SEBASTIÁN, A.L. Estimation of fetal development in
Manchega dairy ewes by transrectal ultrasonographic measurements. Small Ruminant
Research, v.27, p.243-250, 1998.
CELI, P.; DI TRANA, A.; CLAPS, S. Effects of perinatal nutrition on lactational
performance, metabolic and hormonal profiles of dairy goats and respective kids. Small
Ruminant Research, v.79, p.129-136, 2008.
CESAR, M.F.; SOUSA, W.H. Carcaças ovinas e caprinas - obtenção, avaliação e
classificação. Uberaba: Agropecuária Tropical, 2007. 232p.
DINIZ, L.L.; VALADARES FILHO, S.C.; DE OLIVEIRA, A.S. et al. Castor bean meal for
cattle finishing: 1-Nutritional parameters. Livestock Science, v.135, p.153-167, 2011.
GONZÁLEZ, F.H.D.; SILVA, S.C. Introdução à bioquímica clínica animal. Porto Alegre:
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2003. 360p.
INSKEEP, E.K. Preovulatory, postovulatory, and postmaternal recognition effects of
concentrations of progesterone on embryonic survival in the cow. Journal of Animal
Science, v.82, n.13, p.24-39, 2004.
161
KANEKO, J.J. Serum proteins and dysproteinemias. In: KANEKO, J.J.; HARVEY, J.W.;
BRUSS M.L. (Ed). Clinical Biochemistry of domestic animals. 5 ed. San Diego:
Academic Press, 1997. p.317-367.
KAREN, A.M.; FATTOUH, el-S,M.; ABU-ZEID, S.S. Estimation of gestational age in
Egyptian native goats by ultrasonographic fetometry. Animal Reproduction Science,
v.114, p.167-174, 2009.
KHANUM, S. A.; HUSSAIN, M.; KAUSAR, R. Progesterone and estradiol during estrus
cycle and gestation in dwarf goats (Capra hircus). Pakistan Veterinary Journal, v.28,
p.1-4, 2008.
LEE, Y.; LEE, O.; CHO, J. et al. Ultrasonic measurement of fetal parameters for estimation
of gestacional age in Korean Black Goats. Journal of Veterinary Medicine Science,
v.67, p.497-502, 2005.
LÉGA, E.; TONIOLLO, G.H.; OLIVEIRA, J.A. et al. Determinação da idade fetal por meio
da técnica ultra-sonográfica de fetometria e de morfologia fetal em cabras. Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, p.851-856, 2007.
MBAYAHAGA, J.; MANDIKI, S.N.M.; BISTER, J.L. et al. Body weight oestrus and ovarian
activity in local Burundian ewes and goats after parturition in the dry season. Animal
Reproduction Science, v.51, p. 289-300, 1998.
MEXIA, A.A.; MACEDO, F.A.F.; ALCALDE, C.R. et al. Desempenhos reprodutivo e
produtivo de ovelhas Santa Inês suplementadas em diferentes fases da gestação. Revista
Brasileira de Zootecnia, v.33, p.658-667, 2004.
MORALES-TERAN, G.; PRO-MARTINEZ, A.; FIGUEROA-SANDOVAL, B. et al.
Continuous or restricted suckling and its relationship to length of postpartum anoestrus in
Pelibuey ewes. Agrociencia, v.38, p.165-171, 2004.
MOTLOMELO, K.C.; GREYLING, J.P.C.; SCHWALBACH, L.M.J. Synchronisation of
oestrus in goats: the use of different progestagen treatments. Small Ruminant Research,
v.45, p.45-49, 2002.
NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC. Nutrient requirements of small ruminants:
sheep, goats, cervids and new words camelids. Washington, D.C.: The National
Academies Press, 2007.
OLIVEIRA, A.S.; OLIVEIRA, M.R.C.; CAMPOS, J.M.S. et al. In vitro ruminal degradation
of ricin and its effect on microbial growth. Animal Feed Science and Technology, v.157,
p.41-54, 2010.
162
PAYNE, J.M.; PAYNE, S. The metabolic profile test. Oxford: Oxford University Press.
1987. 179p.
PEIXOTO, L.A.O.; OSÓRIO, M.T.M.; OSÓRIO, J.C.S. et al. Desempenho reprodutivo e
metabólitos sanguíneos de ovelhas Ile de France sob suplementação com sal orgânico ou
sal comum durante a estação de monta. Revista Brasileira de Zootecnia, v.39, p.191197, 2010.
PICCIONE, G.; CAOLA, G.; GIANNETTO, C. Selected biochemical serum parameters in
ewes during pregnancy, post-parturition, lactation and dry period. Animal Science Papers
and Reports, v. 27, p.321-330, 2009.
POMPEU, R.C.F.F.; CÂNDIDO, M.J.D.; PEREIRA, E.S. et al. Desempenho produtivo e
características de carcaça de ovinos em confinamento alimentados com rações contendo
torta de mamona destoxificada em substituição ao farelo de soja. Revista Brasileira de
Zootecnia, v.41, p.726-733, 2012.
RABASSA, V.R.; TABELEÃO, V.C.; SCHNEIDER, A. Avaliação metabólica de ovelhas de
cria mantidas em campo nativo durante o período de outono/inverno. Revista Brasileira
de Agrociência, v.15, p.125-128, 2009.
REGULAMENTO DA INSPEÇÃO INDUSTRIAL E SANITÁRIA DE PRODUTOS DE
ORIGEM ANIMA - RIISPOA. Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de
Produtos de Origem Animal. Brasília, Brasil, 1980.
RODRIGUES, M.R.C.; RONDINA, D.; ARAÚJO, A.A. et al. Respostas reprodutivas e
metabólicas de ovelhas alimentadas com bagaço de caju desidratado, durante o pós-parto.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.63, p.171-179, 2011.
SALHAB, A.S. Induction of mid-term abortion by ricin A-chain in mice. Pharmaceutical
Biology, v.34, p.151-153, 1996.
SALHAB, A.S.; SHOMAF, M.S.; GHARAIBEH, M.N. et al. Effects of castor bean extract
and ricin A-chain on ovulation and implantation in rabbits. Contraception, v.59, p.395399, 1999.
SANDHYAKUMARY, K.; BOBBY, R.G.; INDIRA, M. Antifertility effects of Ricinus
communis (Linn) on rats. Phytotherapy Research, v.17, p.508-511, 2003.
SAUNDERS, G.A.; ALVES, N.G.; PÉREZ, J.R.O. et al. Efeito do nível nutricional antes e
após a ovulação sobre a taxa de gestação e a prolificidade em ovelhas Santa Inês. Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.64, p.1085-1093, 2012.
163
SILVA, L.M.; OLIVEIRA, C.H.A.; RODRIGUES, F.V. et al. Desempenho e características
da carcaça de cordeiros alimentados com bagaço de caju. Archivos de Zootecnia, v.60,
p.777-786, 2011.
SILVA, L.M.; OLIVEIRA, C.H.A.; SILVA, A.M. et al. In vitro development of ovine
preantral follicles and oocyte cleavage rate are not affected by long-term ingestion of
detoxified castor meal. Small Ruminant Research, v.113, p.353-359, 2013.
SILVA, L.M.; RONDINA, D.; ARAÚJO, A.A. Reproductive responses and progesterone
levels of postpartum oestrus synchronization in goats with different body reserves. Italian
Journal of Animal Science, v.10, p.160-164, 2011.
ÜNAL, N.; ATASOY, F.; AKÇAPINAR, H. Milk yield measured by oxytocin plus hand
milking and weigh-suckle-weigh methods in ewes originating from local crossbred in
Turkey. Revue de Médecine Vétérinaire, v.158, p.320-325. 2007.
VIEIRA, M.M.M.; CÂNDIDO, M.J.D.; BOMFIM, M.A.D. Características da carcaça e dos
componentes não-carcaça em ovinos alimentados com rações à base de farelo de mamona.
Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v.11, p.140-149, 2010.
164
11 CAPÍTULO 6
Desenvolmento in vitro de folículos pré-antrais ovinos e taxa de clivagem oocitária não
são afetados pela ingestão de farelo de mamona detoxificado por longo período
In vitro development of ovine preantral follicles and oocyte cleavage rate are not affected by
long-term ingestion of detoxified castor meal
Periódico: Small Ruminant Research 113 (2013) 353–359.
165
Resumo
No presente estudo, foi avaliado o efeito da ingestão a longo período de mamona detoxificado
sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais ovino, bem como sobre a
competência de desenvolvimento de oócitos oriundos de folículos antrais. Fragmentos
ovarianos foram cultivados por um ou sete dias, e posteriormente analisados por histologia e
microscopia de fluorescência (experimento 1). Os complexos cumulus oócitos (CCOs)
obtidos a partir de folículos antrais foram maturados in vitro e ativado por partenogênese ou
fertilização in vitro (experimento 2). Após um dia de cultivo, em ambos os grupos testados,
houve uma redução significativa no percentual de folículos primordiais e um concomitante
aumento no percentual de folículos intermédios quando comparado com o tecido não
cultivado. Após 7 dias de cultivo, o percentual de folículos primários, em ambos os grupos
testados, foram significativamente mais elevados quando comparados com o tecido não
cultivado ou do tecido cultivado durante 1 dia (P<0,05). O número de embriões produzidos in
vitro foi semelhante entre os grupos testados. No entanto, para os animais alimentados com
farelo de mamona detoxificado, o método de partenogênese resultou em um maior número de
embriões (mórulas) quando comparado com a activação por fertilização in vitro (FIV). O
farelo de mamona detoxificado de pode ser utilizado na alimentação como uma fonte
alternativa de proteína sem afetar a foliculogênese pré-antral e antral de ovinos.
Palavras-chave: Ricinus communis L. Desempenho reprodutivo. Cultivo in vitro. Ovelhas.
166
In vitro development of ovine preantral follicles and oocyte cleavage rate are not affected
by long-term ingestion of detoxified castor meal
L.M. Silvaa*, C.H.A. Oliveiraa, A.M. Silvaa, C.M.G. Silvab, S.V. Castrob, A.A. Carvalhob,
A.B.G. Duarteb, E.C. Costab, C. Feltrinc, J.R. Figueiredob, D. Rondinaa
a
Laboratory of Ruminant Production and Nutrition, LANUPRUMI, Faculty of Veterinary
Medicine, PPGCV, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil
b
Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles , LAMOFOPA, Faculty of
Veterinary Medicine, PPGCV, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
c
University of Fortaleza, UNIFOR, Fortaleza-CE, Brazil.
Running head: Intake of castor meal and ovarian folliculogenesis
*Correspondence should be addressed to:
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV)
Laboratório de Nutrição e Produção de Ruminantes (LANUPRUMI)
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi.
Fortaleza – CE – Brasil. CEP: 60740-000
Tel./Fax.: +55.85. 3101.9858
E-mail address: [email protected] (L.M. Silva)
167
Abstract
In the present study, we evaluated the effect of long-term ingestion of detoxified castor
meal on in vitro development of sheep preantral follicles as well as on the developmental
competence of oocytes from antral follicles. Ovarian fragments were cultured for one or seven
days and further analyzed by histology and fluorescence microscopy (experiment 1). The
cumulus oocyte complexes (COCs) obtained from antral follicles were matured in vitro and
activated by parthenogenesis or fertilization in vitro (experiment 2). Even after 1 day of
culture, in both tested groups, a significant reduction in the percentage of primordial follicles
and a concomitant increase in the percentage of intermediate follicles were observed when
compared to non cultured tissue. After 7 days of culture, the percentage of primary follicles in
both tested groups was significantly higher when compared to the non cultured tissue or the
tissue cultured for 1 day (P < 0.05). The number of in vitro embryos produced was similar
between the tested groups. However, for those animals fed with detoxified castor meal, the
parthenogenesis method resulted in a higher number of embryos (morulae) when compared to
in vitro fertilization (IVF) activation. The detoxified castor meal can be used as an alternative
protein source without affecting the ovine preantral and antral folliculogenesis.
Keywords: Ricinnus communis L.,, reproduction performance, in vitro culture, ewe
1. Introduction
The castor oil plant (Ricinus communis L.) is one of the most traditional crops
produced in the semi-arid region of Brazil. Its cultivation has great economic and social
importance, with direct practical applications in the cosmetics and automobile industries, and
it is one of the main oils used for biodiesel production (Diniz et al., 2010). However, there are
major environmental concerns regarding the large amount of byproducts generated by the
biodiesel industry during castor oil manufacture (European Food Safety Authority, 2008). For
each ton of castor oil, 1.31 ton of husks and 1.13 ton of meal are produced (Lima et al., 2011).
This byproduct is a potentially environmental contaminant containing toxic and allergenic
elements, including ricin, ricinine and the allergen complex CB-1 (Burdock et al., 2006).
The ricin consists of a two-subunit protein (subunit A and B) bound by disulfide
linkages (Barnes et al., 2009). According to the model proposed by Audi et al. (2005), the
ricin B subunit binds to the plasma membrane glycoproteins and glycolipids and penetrates
the cytosol by endocytosis. Once in the cytosol, ricin is translocated by vesicular transport
168
into endosomes and then to the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum, the site of subunit
A and B cleavage. The presence of subunit A in the cytosol promotes protein synthesis
inactivation by removal of adenine from the 60S ribosomal subunit. Furthermore, ricinine and
CB-1 can trigger, respectively, bleeding and respiratory disorders in humans (Schieltz et al.,
2011). Despite the presence of toxic compounds, there is a growing interest in converting
castor byproducts to alternative feed sources for ruminants due to the nutritional content of
these products.
Several studies have been conducted to establish efficient methods for castor meal
detoxification and, thus, make it suitable for animal consumption (Godoy et al., 2009).
Currently, there are many chemical and mechanical methods (Anandan et al., 2005) used to
detoxify castor meal. However, until now, the effects of castor meal feeding on livestock and
livestock reproduction have not been well understood. Moreover, no previous research has
investigated the possible toxic effects of a long-term castor meal diet on the folliculogenesis
of sheep.
The possible detrimental effect caused by this type of feed on pre-antral
folliculogenesis can be evaluated using in vitro follicular culture, particularly culture
employing primordial follicles, which represent the main resting stockpile of germ cells in the
mammalian ovary (Figueiredo et al., 2011). Similarly, techniques used for oocyte activation,
such as in vitro fertilization and parthenogenesis, can be employed to investigate oocyte
developmental competence from antral follicles to produce embryos in vitro. Therefore, the
aforementioned techniques can aid in studies of reproductive toxicology. Thus, the aim of this
study was to verify if the long-term ingestion of detoxified castor meal affects the activation,
viability and growth of ovine preantral follicles cultured in vitro as well as the developmental
potential of oocytes from antral follicles to produce embryos in vitro after activation by
parthenogenesis or in vitro fertilization.
2. Material and Methods
This study was submitted and approved by the Ethics Committee for experimental use
of animals of the State University of Ceará (CEUA-UECE) with the protocol number
09230950-0/74.
2.1. Source of animals and dietary treatments
169
In this work, 12 adult (2–4 years) multiparous Santa Inês breed sheep were used for
the study. During 15 months (March 2010 to June 2011), the animals were randomly divided
into two experimental groups: soybean meal (control), n = 6; and detoxified castor meal, n =
6. The group of animals fed with soybean meal (control) received Tifton hay and concentrated
meal (80% corn, 15% soybean meal, and 5% minerals). The animals fed with the detoxified
castor meal received Tifton hay and concentrated meal (80% corn, 15% castor meal, and 5%
minerals). Both diets were isoenergetic (74% of NDT) and isoproteic (14% gross protein)
following the nutritional requirements of maintenance (NRC, 2007). Each experimental group
was kept in a collective stall with mineral salt and water ad libitum.
2.2. Chemical treatment of castor meal and quantification of ricin
The detoxification was performed as described by Oliveira et al. (2010), with some
modifications. For each 1 kg of castor meal, 60 g of calcium oxide was added for
detoxification. The treated samples were left overnight (8 h). Subsequently, the sun-dried
lime-treated samples were used for analysis. After this process, ricin elimination was detected
by electrophoresis in a 12% polyacrylamide gel under non-denaturing conditions (nativePAGE) performed in a vertical mini-gel Bio-Rad PowerPac Basic Supply system. The gel was
stained with Coomassie Blue R250, and ricin quantification was accomplished by
determination of total protein in the castor meal samples using the Bradford method (1976);
bovine serum albumin (BSA) was the standard for normalization. The polyacrylamide gel
images were visualized by an ImageScannerTM from GE Healthcare (ImageMaster software
compatible) and were analyzed with the Image Master Platinum program. The protein bands
were quantified into volume units (area × intensity) following the methodology described by
Meunier et al. (2005).
2.3. Chemical source and ovarian recovery
Unless otherwise mentioned, all chemicals used in the present study were purchased
from Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA). The ovaries of six animals from each
experimental group i.e., soybean meal (control) and detoxified castor meal, were collected
immediately postmortem. The ovaries were washed once in 70% alcohol for 10 seconds and
twice in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with HEPES and antibiotics (100
µg/mL penicillin and100 µg/mL streptomycin) and finally transported within 1 h to the
laboratory in MEM at 4 ºC (Chaves et al., 2008).
170
2.4. Experiment 1. Effect of long-term ingestion of detoxified castor meal on the activation,
growth and viability of ovine preantral follicles
2.4.1. Ovine preantral follicle culture
In the laboratory, ovarian cortical tissue samples from each ovarian pair of both
experimental groups i.e., soybean meal (control) and detoxified castor meal, were cut into
slices (approximate size 3 mm × 3 mm, with a thickness of 1 mm) using a needle and scalpel
under sterile conditions. The tissue slices were then immediately analyzed (non cultured
tissue) or placed in culture for one or seven days randomly. Before and after culture period the
fragments were analyzed by classical histology and fluorescence microscopy.
The ovine tissue slices destined for in vitro culture were transferred to 24-well culture
dishes containing 1mL of culture media. The basic culture medium was α-MEM (pH 7.2–7.4)
supplemented with ITS (insulin 10 µg/mL, transferrin 5.5 µg/mL and selenium 5 ng/mL), 2
mM glutamine, 2 mM hypoxanthine, 1.25 mg/mL BSA and 50 ng/mL recombinant follicle
stimulating hormone (rFSH). The culture medium was incubated for 1 h prior to use and
replenished every other day. The culture was performed at 39 ºC in 5% CO2 in a humidified
incubator. In this particular experiment, the animal represents the experimental unit.
2.4.2. Morphological analysis and assessment of in vitro follicular growth
Before (non cultured tissue) and after one or seven days in culture, the pieces were
fixed in Carnoy’s solution for 4 h and then dehydrated in increasing concentrations of ethanol.
After paraffin embedding (Synth, São Paulo, Brazil), the ovine tissue slices were cut into 7-m
sections, and each section was mounted on glass slides and stained with hematoxylin–eosin.
The follicular development stages and survival rates were assessed microscopically in serial
sections. Coded, anonymized slides were examined using a microscope (Nikon, Japan) under
400 × magnification. The developmental stages of follicles were classified as either
primordial (1 layer of flattened granulosa cells around the oocyte) or growing follicles as
described by Silva et al. (2004). Growing follicles were subdivided into intermediate (one
mixed layer of flattened and cuboidal granulosa cells), primary (one layer of cuboidal
granulosa cells), or secondary (two or more layers of cuboidal granulosa cells around the
oocyte). Individual follicles were further classified as histologically normal when an intact
oocyte was observed to be surrounded by well-organized granulosa cells in one or more layers
andwhenno pyknotic nucleus was present. Atretic follicles were defined as those with a
171
retracted oocyte, pyknotic nucleus, and/or disorganized granulosa cells detached from the
basement membrane. Overall, for each animal, preantral follicles were evaluated in non
cultured tissue (n = 30) or ovarian tissue cultured for one day (n = 30) or seven days (n = 30),
totaling 90 follicles per animal.
To evaluate follicular activation, only intact follicles with a visible oocyte nucleus
were recorded, and the proportion of primordial and growing follicles was calculated at day 0
(non cultured tissue) and after 1 or 7 days of culture. In addition, follicle and oocyte diameters
were measured only in morphologically normal follicles. Follicle diameter was recorded as
the length from edge to edge of the basement membrane or from the outside edge of the thecal
cell layer when present. Oocyte diameter was recorded as the length from edge to edge of the
oocyte membrane. Two perpendicular diameters were recorded for each parameter, and the
average of these two values was reported. Further, each follicle was examined in every
section in which it appeared and matched with the same follicle on adjacent sections to avoid
double counting, thus ensuring that each follicle was only counted once regardless of its size.
2.4.3. Viability assessment of follicles cultured in vitro
Before (non cultured tissue) and after one or seven days of culture, preantral follicles
were isolated using the mechanical method described by Amorim et al. (2000). Such
mechanical procedure has been successfully used for the isolation of preantral follicles from
ovarian fragments before or after in vitro culture (Celestino et al., 2011). Briefly, with a tissue
chopper (The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshal, Surrey, UK) adjusted to a
sectioning interval of 87.5 µm, samples were cut into small pieces. These pieces were placed
in 2 mL of MEM and suspended 100 times using a large Pasteur pipette (diameter: 1600 µm)
and then 100 times with a smaller Pasteur pipette (diameter: 600 µm) to dissociate preantral
follicles from stromal tissue. The obtained material was filtered in 200 µm nylon mesh,
resulting in a suspension containing small preantral follicles ≥ 00 µm that were transferred
into a 100 µL droplet of MEM. Preantral follicles were analyzed using a two-color
fluorescence cell viability assay based on the simultaneous determination of live and dead
cells by calcein-AM and ethidium homodimer-1 exposure, respectively. While the first probe
detected intracellular esterase activity in viable cells, the latter labeled the nucleic acids of
non-viable cells showing plasma membrane disruption. The test was performed by adding 4
µM calcein-AM and 2 µM ethidium homodimer-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe,
172
Germany) to the suspension of isolated follicles, followed by incubation at 37 ºC for 15 min
and analysis with an inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan).
2.5. Experiment 2. Effect of long-term ingestion of detoxified castor meal on the meiotic
competence of oocytes activated by parthenogenesis or in vitro fertilization
2.5.1. In vitro maturation, parthenogenic activation and fertilization of oocytes derived from
antral follicles
The cumulus oocyte complexes (COCs) were obtained during the ovarian tissue
fragmentation of experiment 1. The COCs from each experimental group, soybean meal
(control) and detoxified castor meal, were pooled and classified as G-I to G-IV based on the
unexpanded cumulus cell layers and cytoplasmic uniformity as follows: G-I, multilayered
compact cumulus cells and finely granulated oocyte cytoplasm; G-II, one to three layers of
cumulus cells and granulated oocyte cytoplasm; G-III, no cumulus layer or heterogeneous
oocyte cytoplasm; and G-IV, oocytes with abnormal shapes and heterogeneous oocyte
cytoplasm or apoptotic oocytes within a jelly-like cumulus cell corona. Only G-I, G-II and GIII COCs were selected for in vitro maturation (IVM).
The selected COCs were washed 3 times in a maturation medium composed of
TCM199 supplemented with 1 mg/mL BSA, 5 mg/mL pituitary Luteinizing Hormone (LH),
0.5 mg/mL rFSH, 1 mg/mL 17 β-estradiol, 10 ng/mL Epidermal Growth Factor (EGF), 50
mg/mL insulin-like growth factor – 1 (IGF-1), 100 mmol/L cysteamine and 1 mmol/L
pyruvate. Using this medium in our laboratory, the mean maturation rate of COCs recovered
from antral follicles was 80% (Figueiredo et al., unpublished data). After washing, the
oocytes were transferred to 50 mL drops of maturation medium under mineral oil and then
incubated for 24 h at 39 ºC with 5% CO2 in air. After maturation, the oocytes were destined
either for in vitro fertilization (IVF) or parthenogenic activation as described below. The rate
of morula was calculated as follows: (number of oocytes reached the morula stage/number of
oocytes destined to activation) × 100.
2.5.2. In vitro Fertilization
For the IVF procedure, frozen semen from Santa Ines rams with proven fertility was
used in the present study. Frozen/thawed semen was separated by centrifugation (10 min at
900 g) on 2 mL of Percoll discontinuous density gradient (45/90%) (Amersham Biosciences
173
Limited, USA). The spermatozoa were placed in 100 µL droplets of IVF medium, which
consisted of TCM 199 supplemented with 2% estrus sheep serum and 10 mg/mL heparin in a
Petri dish covered with mineral oil and placed in a CO2 incubator for 1 h at 39 ºC before
insemination. The sperm concentration was then adjusted to 200 × 106 cells/mL, and 15
oocytes were added to the stabilized droplets containing spermatozoa. The dishes were placed
in a 5% CO2 incubator at 39 ºC. Then, only 24 h after insemination, presumptive zygotes were
evaluated under a stereomicroscope for evidence of cleavage. The presumptive zygotes were
washed and cultured in vitro for 5 days in synthetic oviduct fluid (SOF) medium
supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS).
2.5.3. Parthenogenic activation
In vitro matured oocytes were activated by exposure to 2 mM 6-DMAP in SOFaa +
0.4% BSA for 3.5 h at 39 °C. Activated oocytes were cultured in SOFaa + 10% FCS at 39 °C
under 5% CO2 in air. Embryo formation rates were determined after 5 days of in vitro culture.
2.6. Statistical analysis
Data were initially subjected to the Kolmorogov-Smirnov and Bartlett tests to confirm
normal distribution and homoscedasticity, respectively. Two-way analysis of variance
(ANOVA) was then performed using general linear model procedures (SAS version 8.0, Inc.,
Cary, NC, 1996). The model used in ANOVA included the feed system, days of culture and
replicates as sources of variation. The Dunnett’s test was applied for comparison among
treatments, and the Student Newman Keuls (SNK) test was used to compare percentages of
primordial survival and developing follicles between treatments and days of culture. The
results are expressed as mean ± standard deviation (SD). Data from degenerated oocytes and
embryo production are expressed as percentages and were compared using the Chi-square
test. Differences between groups were considered significant when P < 0.05.
3. Results
3.1. Experiment 1
3.1.1. Ovine preantral follicle survival before and after in vitro culture
174
A total of 90 preantral follicles per animal were analyzed histologically. The
percentages of morphologically normal preantral follicles in non cultured tissue or ovarian
tissue cultured for one or seven days are shown in Fig. 1. After seven days of in vitro culture,
there was no significant difference between the two experimental groups in terms of the
percentage of morphologically normal preantral follicles. However, there was a significant
decrease in the percentage of morphologically normal preantral follicles in both treatments
during the culture period (P < 0.05).
3.1.2. Activation and follicular growth after in vitro culture
After one day of culture, both treatments showed a significant reduction in the
percentage of primordial follicles (Fig. 2A, P < 0.05) with a concomitant increase in the
percentage of intermediate follicles (Fig. 2B, P < 0.05) when compared to the non cultured
tissue. From day 1 to day 7, a significant reduction in the percentage of primordial follicles
from the animals fed with soybean meal (control) was observed (Fig. 2A, P < 0.05).
Furthermore, at day 7 in both treatment groups, soybean meal (control) and detoxified castor
meal, the percentage of intermediate follicles significantly decreased when compared to the
tissue cultured for one day (Fig. 2B, P < 0.05). Alternatively, after seven days of culture, there
was a significant increase in the percentage of primary follicles in both groups when
compared to one day and non cultured tissue (Fig. 2C, P < 0.05). The oocyte and follicular
diameters ranged from 20.35 to 20.99 and 27.38 to 31.49 µm, respectively, and were not
affected by either culture duration nor the type of diet tested.
3.1.3. Ovine preantral follicle viability before and after in vitro culture
The follicular viability after seven days of culture was evaluated with fluorescent
Calcein-AM and ethidium homodimer- 1 probes (Fig. 3). The first probe detected the nonspecific esterase activity in the cytoplasm of viable follicular cells (Fig. 4A), while the second
probe detected plasma membrane disruption and bound the nucleic acids of non-viable cells
(Fig. 4B). At least 30 preantral follicles were assessed in each experimental group. Follicular
viability was not significantly affected by the type of diet tested at day 0 or at day 7.
However, in both treatment groups, a decrease in the percentage of viable follicles was
observed after seven days of in vitro culture (P < 0.05). Fig. 4C–F shows viable preantral
follicles after seven days of in vitro culture obtained from sheep fed with soybean meal
(control) and detoxified castor meal (Fig. 5).
175
3.2. Experiment 2
Data regarding the number of oocytes retrieved, degenerated and activated by
parthenogenesis or IVF, as well as number of embryos produced from ewes fed with soybean
meal (control) and detoxified castor meal, are shown in Table 1. Using parthenogenesis
activation, a higher percentage of embryo production using oocytes from animals fed
detoxified castor meal was obtained when compared with those fed with soybean meal
(control). Only in those animals fed with detoxified castor meal did parthenogenesis
activation result in a greater percentage of embryo production than IVF.
4. Discussion
The present study demonstrates, for the first time, that the total replacement of
soybean meal with detoxified castor meal as a long-term diet (14–15 months) for sheep has no
negative effects on preantral or antral folliculogenesis.
To date, most studies evaluated the possible effects of partial substitution of
commercially available protein sources, such as soybean meal (Oliveira et al., 2010; Diniz et
al., 2011) or cottonseed meal (Moreira et al., 2003), with detoxified castor meal on ruminant
digestibility. However, the evaluation of detoxified castor meal on reproductive performance
has not yet been realized.
In this study, the percentage of normal follicles in non cultured tissue was similar in
both tested groups. This result demonstrates that detoxified castor meal did not affect in vivo
follicular viability. Furthermore, when the effects of a soybean- versus detoxified castor mealbased diet on the in vitro survival of preantral follicles cultured for seven days was evaluated,
high follicular survival rates (> 60%) were achieved in both groups. Indeed, this survival rate
after culture (7 days) was lower when compared to the non cultured tissue and after one day
of in vitro culture. Previous studies testing several growth factors also observed similar
reductions in follicular survival after in vitro culture of ovine and caprine preantral follicles
enclosed in ovarian tissue (Figueiredo et al., 2011). Notably, even after seven days of in vitro
culture, the percentage of morphologically normal follicles was equivalent between the tested
groups. Similar results were obtained in the current study after using a two-color fluorescence
cell viability assay. This accurate method based on fluorescent probes has been successfully
applied to analyze the viability of bovine (Schotanus et al., 1997) and caprine (Silva et al.,
2010) preantral follicles. Therefore, such probes are a reliable tool to confirm the follicular
176
survival rates obtained histologically. These results indicate that the type of diet provided to
the animals did not affect follicular survival either before or after in vitro culture.
In this study, in both groups, after one day of in vitro culture, there was a significant
reduction in the percentage of primordial follicles; such reduction was associated with an
increase in the number of intermediate follicles, indicating the occurrence of follicular
activation. These data are in agreement with previous reports showing that α-MEM promotes
follicular activation after in vitro culture of ovarian tissue for 1 day (Bruno et al., 2008; LimaVerde et al., 2009). This satisfactory result may be due to the rich composition of the basic
medium used, as well as the addition of hormones such as FSH and insulin, which stimulate
the follicular proliferation, viability, and activation (Matos et al., 2007; Fortune, 2003). In
addition, after seven days of ovarian cortical tissue culture, both groups demonstrated an
increase in the percentage of primary follicles compared to tissue cultured for one day or non
cultured tissue.
The degenerated oocyte rate and the number of embryos produced were similar
between the tested treatments when the IVF was used. This result demonstrates that
replacement of soybean meal with calcium oxide treated and detoxified castor meal did not
impair follicular development in adult Santa Inês ewes. The use of 0, 33, 67 and 100%
detoxified castor meal in place of soybean meal does not appear to affect the reproductive
performance of Nelore heifers between the rainy and dry seasons (Barros et al., 2011).
IVF and parthenogenesis were used to evaluate the developmental competence of
oocytes from ewes fed with soybean meal (control) and detoxified castor meal. Using
parthenogenic activation, a higher percentage of embryos was obtained from the oocytes of
animals fed the detoxified castor meal diet when compared to those fed soybean meal
(control). Only for those animals fed with detoxified castor meal, parthenogenic activation
resulted in a greater percentage of embryonic production than IVF. It is well established that
in vitro embryonic production depends on oocyte competence, sperm quality, and the culture
conditions utilized. Whereas parthenogenesis exclusively evaluates oocyte influence on early
embryo development (Latham, 1994), it can be stated that oocyte quality was better in
animals fed with castor meal when compared to soybean meal because the number of in vitro
produced embryos was higher. However, the specific compounds in the detoxified castor meal
that contribute to this effect remain unknown.
In conclusion, the present study demonstrates that detoxified castor meal can be used
as an alternative protein source without affecting ovine preantral and antral folliculogenesis.
177
Therefore, this feed represents an alternative method for reducing the costs of animal feed
supplementation. However, further research in the possible detrimental effects of long-term
detoxified castor meal ingestion on the reproductive performance of ewes is still necessary.
Acknowledgements
Financial support was received from Edital CNPq/MAPA/SDA nº. 064/2008 - ref. nº.
578189/2008-9. L.M. Silva was the recipients of a Doctorate scholarship from CNPq (nº.
551634/2010-3).
References
Amorim, C.A., Lucci, C.M., Rodrigues, A.P.R., Carvalho, F.C.A., Figueiredo, J.R., Rondina,
D., Cecchi, R., Giorgetti, A., Martini, A., Gonc¸ alves, P.B.D., 2000. Quantitative and
qualitative analysis of the effectiveness of a mechanical method for the isolation of
preantral follicles from ovine ovaries. Theriogenology 6, 1251–1262.
Anandan, S., Anil Kumar, G.K., Ghosh, J., Ramachandra, K.S., 2005. Effect of different
physical and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Anim. Feed
Sci. Technol. 120, 159–168.
Audi, J., Belson, M., Patel, M., Schier, J., Osterloh, J., 2005. Ricin poisoning: a
comprehensive review. J. Am. Med. Assoc. 294, 2342–2351. Barnes, D.J., Baldwin,
B.S., Braasch, D.A., 2009. Degradation of ricin in castor seed meal by temperature
and chemical treatment. Ind. Crop. Prod. 29, 509–515.
Barros, L.V., Paulino, M.F., Detmann, E., Valadares Filho, S.C., Lopes, S.A., Rocha, A.A.,
Valente, É.E.L., Almeida, D.M., 2011. Replacement of soybean meal by treated castor
meal in supplements for grazing heifer during the dry-rainy season period. R. Bras.
Zootec. 40, 843–851.
Bradford, M.M., 1976. A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72, 248–254.
Bruno, J.B., Lima-Verde, I.B., Martins, F.S., Matos, M.H.T., Lopes, C.A.P., Maia-Júnior,
J.E., Báo, S.N., Nobre-Junior, H.V., Maia, F.D., Pessoa, C., Moraes, M.O., Silva,
J.R.V., Figueiredo, J.R., Rodrigues, A.P.R., 2008. Característica histológica, ultra-
178
estrutural e produção de nitrito de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro na
ausência ou presença de soro. Arq. Bras. Med. Vet. Zoo. 60, 1329–1337.
Burdock, G.A., Carabin, I.G., Griffiths, J.C., 2006. Toxicology and pharmacology of sodium
ricinoleate. Food Chem. Toxicol. 44, 1689–1698.
Celestino, J.J.H., Lima-Verde, I.B., Bruno, J.B., Matos, M.H.T., Chaves, R.N., Saraiva,
M.V.A., Silva, C.M.G., Faustino, L.R., Rossetto, R., Lopes, C.A.P., Donato, M.A.M.,
Peixoto, C.A., Campello, C.C., Silva, J.R.V., Figueiredo, J.R., 2011. Steady-state level
of bone morphogenetic protein-15 in goat ovaries and its influence on in vitro
development and survival of preantral follicles. Mol. Cell. Endocrinol. 338, 1–9.
Chaves, R.N., Martins, F.S., Saraiva, M.V., Celestino, J.J., Lopes, C.A., Correia, J.C., Verde,
I.B., Matos, M.H., Báo, S.N., Name, K.P., Campello, C.C., Silva, J.R., Figueiredo,
J.R., 2008. Chilling ovarian fragments during transportation improves viability and
growth of goat preantral follicles cultured in vitro. Reprod. Fertil. Dev. 20, 640–647.
Diniz, L.L., Valadares Filho, S.C., Campos, J.M.S., Valadares, R.F.D., Silva, L.D., Monnerat,
J.P.I.S., Benedeti, P.B., Oliveira, A.S., Pina, D.S., 2010. Effects of castor meal on the
growth performance and carcass characteristics of beef cattle. Asian-Aust. J. Anim.
23, 1308–1318.
Diniz, L.L., Valadares Filho, S.C., Oliveira, A.S., Pina, D.S., Silva, L.D., Benedeti, P.B.,
Baião, G.F., Campos, J.M.S., Valadares, R.F.D., 2011. Castor bean meal for cattle
finishing: 1 – nutritional parameters. Livest. Sci. 135, 153–167.
EFSA, 2008. Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain on a request
from the European Commission on ricin as undesirable substances in animal feed.
EFSA J. 726, 1–38.
Figueiredo, J.R., Celestino, J.J.H., Faustino, L.R., Rodrigues, A.P.R., 2011. In vitro culture of
caprine preantral follicles: advances, limitations and prospects. Small Ruminant Res.
98, 192–195.
Fortune, J.E., 2003. The early stages of follicular development: activation of primordial
follicles and growth of preantral follicles. Anim. Reprod. Sci. 78, 135–163.
Godoy, M.G., Gutarra, M.L.E., Maciel, F.M., Felix, S.P., Bevilaqua, J.V., Machado, O.L.T.,
Freire, D.M.G., 2009. Use of a low-cost methodology for biodetoxification of castor
bean waste and lipase production. Enzyme Microb. Technol. 44, 317–322.
Latham, K.E., 1994. Strain-specific differences in mouse oocytes and their contributions to
epigenetic inheritance. Development 120, 3419–3426.
179
Lima, R.L.S., Severino, L.S., Sampaio, L.R., Sofiatti, V., Gomes, J.A., Beltrão, N.E.M., 2011.
Blends of castor meal and castor husks for optimized use as organic fertilizer. Ind.
Crop. Prod. 33, 364–368.
Lima-Verde, I.B., Matos, M.H.T., Bruno, J.B., Martins, F.S., Santos, R.R., Báo, S.N., Luque,
M.C.A., Vieira, G.A.B., Silveira, E., Rodrigues, A.P.R., Figueiredo, J.R., Oliveira,
M.A.L., Lima, P.F., 2009. Antioxidants - tocopherol and ternatin affects morphology
and activation of goat preantral follicles cultured in vitro. Arq. Bras. Med. Vet. Zoo.
61, 57–65.
Matos, M.H., Lima-Verde, I.B., Bruno, J.B., Lopes, C.A., Martins, F.S., Santos, K.D., Rocha,
R.M., Silva, J.R., Báo, S.N., Figueiredo, J.R., 2007. Follicle stimulating hormone and
fibroblast growth factor-2 interact and promote goat primordial follicle development in
vitro. Reprod. Fertil. Dev. 19, 677–684.
Meunier, B., Bouley, J., Piec, I., Bernard, C., Picard, B., Hocquette, J.F., 2005. Data analysis
methods for detection of differential protein expression. in two-dimensional gel
electrophoresis. Anal. Biochem. 340, 226–230.
Moreira, J.F.C., Rodríguez, N.M., Fernandes, P.C.C., Veloso, C.M., Saliba, E.O.S., Gonc¸
alves, L.C., Borges, I., Borges, A.L.C.C., 2003. Concentrados protéicos para bovinos,
1. Digestibilidade in situ da matéria seca e da proteína bruta. Arq. Bras. Med. Vet.
Zoo. 55, 315–323.
National Research Council, 2007. Nutrient Requirements of Small Ruminants. National
Academy of Sciences, Washington D.C, pp. 362.
Oliveira, A.S., Campos, J.M.S., Oliveira, M.R.C., Brito, A.F., Valadares Filho, S.C.,
Detmann, E., Valadares, R.F.D., Souza, S.M., Machado, O.L.T., 2010. Nutrient
digestibility, nitrogen metabolism and hepatic function of sheep fed diets containing
solvent or expeller castor seed meal treated with calcium hydroxide. Anim. Feed Sci.
Technol. 158, 15–28.
Schieltz, D.M., McGrath, S.C., McWilliams, L.G., Rees, J., Bowen, M.D., Kools, J.J.,
Dauphin, L.A., Gomez-Saladin, E., Newton, B.N., Stang, H.L., Vick, M.J., Thomas,
J., Pirkle, J.L., Barr, J.R., 2011. Analysis of active ricin and castor bean proteins in a
ricin preparation, castor bean extract, and surface swabs from a public health
investigation. Forensic Sci. Int. 209, 70–79.
180
Schotanus, K., Hage, W.J., Vanderstiehele, H., Van den Hurk, R., 1997. Effects of
conditioned medium from murine cell lines on the growth of isolated bovine preantral
follicles. Theriogenology 48, 471–483.
Silva, C.M.G., Matos, M.H.T., Rodrigues, G.Q., Faustino, L.R., Pinto, L.C., Chaves, R.N.,
Araújo, V.R., Campello, C.C., Figueiredo, J.R., 2010. In vitro survival and
development of goat preantral follicles in two diferente oxygen tensions. Anim.
Reprod. Sci. 117, 83–89.
Silva, J.R.V., van den Hurk, R., Matos, M.H.T., Santos, R.R., Pessoa, C., Moraes, M.O.,
Figueiredo, J.R., 2004. Influences of FSH and EGF on primordial follicles during in
vitro culture of caprine ovarian cortical tissue. Theriogenology 61, 1691–1704.
181
Fig. 1. Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles in non cultured
tissue and after in vitro culture for one or seven days in animals fed with soybean meal
(control) and detoxified castor meal.
a,b
Differs significantly among the culture periods in the
same treatment groups (P < 0.05).
Soybean meal
Normal follicles (%)
100
a
a
Detoxified castor meal
b
b
80
c
c
60
40
20
0
Non cultured control
(Day 0)
Day 1
Day 7
182
Fig. 2. Percentage (mean ± SD) of primordial (A), intermediate (B), primary (C) and
secondary (D) follicles in non cultured tissue (day 0) and after in vitro culture for one or
seven days after animals were fed with soybean meal (control) and detoxified castor meal.
a,b,c
Differs significantly among the culture periods in the same treatment group (P < 0.05).
A,B
Differs significantly among treatment in the same duration of culture (P < 0.05).
Sobybean meal
(control)
A
C
Detoxified castor
meal
B
D
183
Fig. 3. Viability of preantral follicles in non cultured tissue (Day 0) or after seven days of in
vitro culture (Day 7) from animals fed with soybean meal (control) and detoxified castor
meal. a,b Differs significantly between culture duration in the same treatment group (P < 0.05).
Soybean meal (control)
100
Detoxified castor meal
a
Follicular viability (%)
a
80
b
b
60
40
20
0
Day 0
Day 7
184
Fig. 4. (A) Isolated viable preantral follicle labeled by calcein-AM (green). (B) Isolated nonviable preantral follicle labeled with ethidium homodimer-1 (red). (C and D) Isolated
preantral follicles after seven-day culture from animals fed with soybean meal (control). (E
and F) Isolated preantral follicles after seven-day culture from animals fed with detoxified
castor meal.
185
Fig. 5. Sheep embryos obtained by parthenogenesis after 5 days of in vitro culture. (A)
Soybean meal (control). (B) Detoxified castor meal.
186
Table 1 In vitro embryo production after fertilization or parthenogenesis.
Type of
Number of oocytes
Number total of
Number of oocytes
Number of oocytes
Embryos/Morula
activation
recovered/animal
oocytes recovered
degenerated (%)
destined to activation
(%)
54
8 (14.81)aA
Parthenogenesis
24
2 (8.33)bA
IVF
29
3 (10.34)aB
21
8 (38.09)aA
Treatments
IVF
Soybean meal (control)
15.50
Detoxified castor meal
11.33
93
68
15 (16.13)
18 (26.47)
Parthenogenesis
a,b
A,B
Indicate significant differences in the same types of activation between treatments (P < 0.05).
Indicate significant differences between types of activation in the same treatment (P < 0.05).
187
12 CONCLUSÕES

A substituição de farelo de soja por farelo de mamona detoxificado, seja por curtos ou
longos períodos, demostrou ser uma alternativa viável para alimentação de ovelhas.
Por outro lado, em cabras sua utilização por prolongados períodos interferiu
negativamente no desenvolvimento das crias e no desempenho reprodutivo in vitro
destes animais, indicando que seu uso deve ser realizado com bastante cautela,
especialmente para cabras destinadas à reprodução.
188
13 PERSPECTIVAS
Nos últimos anos o Brasil aparece em posição de destaque com relação à produção do
biodiesel a partir de fontes renováveis de energia, principalmente devido à obtenção de óleos
vegetais extraídos de plantas oleaginosas. Acredita-se que esta expansão da agroenergia em
bases sustentáveis pode ajudar a recuperar áreas degradadas e a reduzir a pressão sobre a
expansão da fronteira agrícola que causa o desmatamento e ainda gerar renda e emprego no
setor rural, especialmente em regiões menos desenvolvidas. Atualmente, os principais
empregos dos subprodutos do processamento do biodiesel são adubação orgânica, geração de
energia e alimentação de animais, principalmente ruminantes.
Neste contexto, o presente estudo deixa a perspectiva de que o farelo de mamona
detoxificado poderá ser utilizado como uma excelente fonte proteica para alimentação de
ovinos e caprinos. No entanto, existem fortes evidências de que a espécie caprina é mais
sensível do que ovina quanto à ingestão, por longos períodos, de mamona detoxificado.
Somente em cabras, a ingestão de farelo de mamona detoxificado em substituição ao farelo de
soja diminuiu a taxa de maturação dos oócitos e alterou os níveis de mRNA para diferentes
genes em oócitos imaturos e nas células do cumulus. Além disso, interferiu negativamente no
ganho de peso das crias, indicando que seu uso deve ser realizado com cautela, especialmente
em animais submetidos a técnicas de reprodução assistida.
Diante disso, tornam-se imprescindíveis futuros investimentos governamentais na
implantação de pesquisas públicas e privadas que visam o desenvolvimento de novos estudos
no intuito de compreender exatamente os mecanismos fisiológicos e moleculares e/ou
nutrigenômicos que determinaram estas diferenças encontradas entre as espécies caprina e
ovina, conforme demonstrado no presente estudo. Acredita-se que este tipo de estudo tem
sido e poderá ser uma valiosa ferramenta para que se possam incluir de forma segura e
eficiente os subprodutos do biodiesel na alimentação de pequenos ruminantes, com menores
custos de produção.
189
14 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDALLA, A.L.; FILHO, J.C.S.; GODOI, A.R.; CARMO, C.A.; EDUARDO, J.L.P.
Utilização de subprodutos da indústria de biodiesel na alimentação de ruminantes. Revista
Brasileira de Zootecnia, v. 37, n. spe, p. 260-258, 2008.
ABUBAKR, A.R.; ALIMON, A.R.; YAAKUB, H.; ABDULLAH, N.; IVAN, M. Growth,
nitrogen metabolism and carcass composition of goats fed palm oil by-products. Small
Ruminant Research, v.112, n.1-3, p.91-96, May 2013.
ADESEHINWA, A.O.K. Utilization of palm kernel cake as a replacement for maize in diets
of growing pigs: effects on performance, serum metabolites, nutrient digestibility and cost of
feed conversion. Bulgarian Journal of Agricultural Science, v. 13, p. 593-600, 2007.
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA – ANVISA (2004). RDC ANVISA
nº 306/04: Aspectos Jurídicos da Resolução Diretoria da Colegada da Anvisa sobre Resíduos
de Servisos de Saúde. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br>. Acesso em 16 de
setembro de 2013
AHMED, M.M.M.; ABDALLA, H.A. Use of different nitrogen sources in the fattening of
yearling sheep. Small Ruminant Nutrition, v. 56, n. 1-3, p.39-45, 2005.
AKPAN, H. D.; UDOSEN, E. O.; AKPAN, E. J.; JOSHUA, A. A. The effect of phytase and
zinc supplementation on palm kernel cake toxicity in sheep. Pakistan Journal of Nutrition, v.
4, n. 3, p. 148-153, 2005.
A CAIDE, E. M.; UIZ, D. . .; M UMEN, A.; Mart n Garc at, A.I. Ruminal degradability
and in vitro intestinal digestibility of sunflower meal and in vitro digestibility of olive byproducts supplemented with urea or sunflower meal: Comparison between goats and sheep.
Animal Feed Science and Technology, v. 110, n. 1-4, p. 3-15, 2003.
AL-HIYASAT, A.S.; DARMANI, H.; ELBETIEHA, A.M. Leached components from dental
composites and their effects on fertility of female mice. European Journal of Oral Sciences,
v. 112, n. 3, p. 267-272, 2004.
ALIMON, A.R. The Nutritive Value of Palm Kernel Cake for Animal Feed. Palm Oil
Developments, v. 40, p. 12-14, 2005.
ALIMON, A.R.; IVAN, M.; JALALUDIN, S. Effects of different levels of dietary sulfur and
molybdenum on concentrations of copper and other elements in plasma and liver of lambs fed
palm kernel cake diets. British Journal of Nutrition, v. 106, n. 8, p. 1224-1230, 2011.
ALMEIDA, R.S. Substituição parcial da uréia por diferentes níveis de farelo de babaçu na
alimentação de vacas leiteiras. (Graduação em Zootecnia). Faculdade de Imperatriz FACIMP. 27 p. 2005.
AMORIM, C.A.; LUCCI, C.M.; RODRIGUES, A.P.R.; CARVALHO, F.C.A.;
FIGUEIREDO, J.R.; RONDINA, D.; CECCHI, R.; GIORGETTI, A.; MARTINI, A.;
GONÇALVES, P.B.D. Quantitative and qualitative analysis of the effectiveness of a
190
mechanical method for the isolation of preantral follicles from ovine ovaries. Theriogenology,
v. 53, n. 6, p. 1251-1262, 2000.
ANANDAN, S.; ANIL KUMAR, G.K.; GHOSH, J.; RAMACHANDRA, K.S. Effect of
different physical and chemical treatments on detoxification of ricin in castor cake. Animal
Feed Science and Technology, v. 120, n. 1, p. 159-168, 2005
ANDRIGUETTO, J. M.; PERLY, L.; MINARDI, I. Nutrição animal: As bases e os
fundamentos da nutrição animal - Os alimentos. São Paulo: Nobel, 1999.
ARAÚJO, A.E.; SILVA, C.A.D.; FREIRE, E.C.; COSTA, J.N.; AMARAL, J.A.B.;
MEDEIROS, J.C. SILVA, K.L.; BARROS, M.A.L.; BELTRÃO, N.E.M.; SUASSUNA,
N.D.; FIRMINO, P.T.; FERREIRA, P.F.; ALMEIDA, R.P.; SANTOS, R.F.; FREIRE, ROSA,
M.M.; PEREIRA, S.R.P. Cultura do algodão herbáceo na agricultura familiar. Embrapa
Algodão Sistemas de Produção, 1 Jan/2003. Disponível em:
<http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Algodao/AlgodaoAgriculturaFa
miliar>. Acesso em 12 setembro 2013
ARAUJO, R.C.; PIRES, A.V.; SUSIN, I. Milk yield, milk composition, eating behavior, and
lamb performance of ewes fed diets containing soybean hulls replacing coastcross (Cynodon
species) hay. Journal of Animal Science, v. 86, n. 12, p. 3511-3521, 2008.
ARRUDA, I.J.; SILVA, L.M.; OLIVEIRA, C.H.A.; RODRIGUES, F.V.; SILVA, A.M.;
FERNANDES, C.C.L.; GOMES-FILHO, M.A.; ARAÚJO, A.A.; SILVA, C.M.G.; D.
RONDINA. Embryo production and gene expression in superovulated goats supplemented
with de-oiled castor cake before and after detoxification treatment. Animal Production
Science, In press, 2013.
ASHBY. J.; TINWELL, H.; STEVENS, J.; PASTOOR, T.; BRECKENRIDGE. C. The
effects of atrazine on the sexual maturation of female rats. Regulatory Toxicology and
Pharmacology, v. 35, n. 3, p. 468-473, 2002.
ASLANI, M.R.; MALEKI, M.; MOHRI, M.; SHARIFI, K.; NAJJAR-NEZHAD, V.;
AFSHARI, E. Castor bean (Ricinus communis) toxicosis in a sheep flock. Toxicology, v. 49,
n. 3, p. 400-406, 2007.
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC. Official methods of
analysis. 15.ed. Washington: AOAC, 1298 p. 1990.
AUDI, J.; BELSON, M.; PATEL, M.; SCHIER, J.; OSTERLOH, J. Ricin poisoning: A
comprehensive review. The Journal of the American Medical Association, v. 294, n. 18, p.
2342-2351, 2005.
AVAZERI, N.; DENYS, A.; LEFEVRE, B. Lead cations affect the control of both meiosis
arrest and meiosis resumption of the mouse oocyte in vitro at least via the PKC pathway.
Biochimie, v. 88, n. 11, p. 1823-1829, 2006.
AVILA-STAGNO, J.; CHAVES, A.V.; HE, M.L.; HARSTAD, O.M.; BEAUCHEMIN, K.A.;
McGINN, S.M. Effects of increasing concentrations of glycerol in concentrate diets on
nutrient digestibility, methane emissions, growth, fatty acid profiles, and carcass traits of
lambs. Journal of Animal Science, v. 91, p. 829-837, 2013.
191
AZARNIA, M.; SHAKOUR, A.; ROSTAMI, P.; SANAIE-MEHR, A. The protective role of
l-cysteine against follicular atresia induced by lead in mouse ovary. Acta Medica Iranica, v.
42, n. 2, p. 83-88, 2004.
AZEVEDO, D. M. P. DE; LIMA, E. F.; BATISTA, F. A. S. Recomendações técnicas para o
cultivo da mamoneira (Ricinus communis L.) no Brasil. Campina Grande: CNPA, 52 p. 1997.
AZIZ, M.H.; AGRAWAL, A.K.; ADHAMI, V.M.; SHUKLA, Y.; SETH, P.K.
Neurodevelopmental consequence of gestacional exposure (GD14- GD20) to low doses of
deltamethrin in rats. Neuroscience Letters, v. 300, n. 6, p. 161-165, 2001.
BAKER, H.W.G. Male infertility. In: DeGroot LJ, Jameson JL (Ed.). Endocrinology. 4.ed.
Philadelphia, PA: W.B.Saunders, 2001, 2308-2328p.
BARBOSA, D.C.; SERRA, T.M.; MENEGHETTI, S.M.P.; Meneghetti, M.R. Biodiesel
production by ethanolysis of mixed castor and soybean oils. Fuel, v. 89, n. 12, p. 3791-3794,
2010.
BARNES, D.J.; BALDWIN, B.S.; BRAASCH, D.A. Degradation of ricin in castor seed meal
by temperature and chemical treatment. Industrial Crops and Products, v. 29, n. 2-3, p. 509515, 2009.
BARROS, L.F.; HERMOSILLA, T.; CASTRO, J. Necrotic volume increase and the early
physiology of necrosis. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular &
Integrative Physiology, v. 130, n. 3, p. 401-409, 2001.
BARROS, L.V.; PAULINO, M.F.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; LOPES,
S.A.; ROCHA, A.A.; VALENTE, É.E.L.; ALMEIDA, D.M. Replacement of soybean meal by
treated castor meal in supplements for grazing heifer during the dry-rainy season period.
Revista Brasileira de Zootecnia, v. 40, n. 4. p. 843-851, 2011.
BELL, A.W. Regulation of organic nutrient metabolism during transition from late pregnancy
to early lactation. Journal of Dairy Science, v. 73, p. 2804-2819, 1995.
BELLINGHAM, M.; FOWLER, P.A.; AMEZAGA, M.R.; RHIND, S.M.; COTINOT, C.;
MANDON-PEPIN, B.; SHARPE, R.M.; EVANS, N.P. Exposure to a complex cocktail of
environmental endocrine-disrupting compounds disturbs the kisspeptin⁄GP 54 system in
ovine hypothalamus and pituitary gland. Environmental Health Perspectives, v. 117, n. 10, p.
1556-1562, 2009.
BELLINGHAM, M.; FOWLER, P.A.; AMEZAGA, M.R.; WHITELAW, C.M.; RHIND,
S.M.; COTINOT, C.; MANDON-PEPIN, B.; SHARPE, R.M.; EVANS, N.P. Foetal
hypothalamic and pituitary expression of Gonadotrophin-Releasing Hormone and Galanin
Systems is disturbed by exposure to sewage sludge chemicals via maternal ingestion. Journal
of Neuroendocrinology, v. 22, n. 6, p. 527-533, 2010.
BERARDINELLI, J.G.; WENIG, J.; BURFENING, P.J.; ADAIR, R. Effect of excess
degradable intake protein on early embryonic development, ovarian steroid and blood urea
nitrogen on days 2, 3, 4, and 5 of the estrus cycle in mature ewes. Journal of Animal Science,
v. 79, n. 1, p. 193-199, 2001.
192
BERGER, R.G.; FOSTER, W.; DeCATANZAROA, D. Bisphenol-A exposure during the
period of blastocyst implantation alters uterine morphology and perturbs measures of estrogen
and progesterone receptor expression in mice. Reproductive Toxicology, v. 30, n. 3, p. 393400, 2010.
BERGER, R.G.; HANCOCK, T.; DeCATANZARO, D. Influence of oral and subcutaneous
bisphenol-A on intrauterine implantation of fertilized ova in inseminated female mice.
Reproductive Toxicology, v. 23, n. 2, p. 138-144, 2007.
BERGER, R.G.; SHAW, J.; DeCATANZARO, D. Impact of acute bisphenol-A exposure
upon intrauterine implantation of fertilized ova and urinary levels of progesterone and 17βestradiol. Reproductive Toxicology, v. 26, n. 2, p. 94-99, 2008.
BERNARD, J.K. Effect of Raw or Roasted Whole Soybeans on Digestibility of Dietary
Nutrients and Milk Production of Lactating Dairy Cows. Journal of Dairy Science, v. 73, n.
11, p. 3231-3236, 1990.
BOMFIM, M.A.D.; SILVA, M.M.C.; SANTOS, S.F. Potencialidades da utilização de
subprodutos da indústria de biodiesel na alimentação de caprinos e ovinos. Tecnologia &
Ciência Agropecuária, v. 3, n. 4, p. 15-26, 2009.
BRADFORD, M.M. A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248254, 1976.
BREVINI GANDOLFI, T.A.L.; GANDOLFI, F. The maternal legacy to the embryo:
cytoplasmic components and their effects on early development. Theriogenology, v. 55, n. 6,
p. 1255-1276, 2001.
BREVINI, T.A.L.; CILLO, F.; ANTONINI, S.; GANDOLFI, F. Effects of endocrine
disrupters on the oocyte and embryo of farm animals. Reproduction in Domestic Animals, v.
40, n. 4, p. 291-299, 2005.
BREVINI, T.A.L.; VASSENA, R.; PAFFONI, A.; FRANCISCI, C.; FASCIO, U.;
GANDOLFI, F. Exposure of pig oocytes to PCBs during in vitro maturation: Effects on
developmental competence, cytoplasmic remodelling and communications with cumulus
cells. European Journal of Histochemistry, v. 48, n. 4, p. 347-356, 2004.
BRUNO, J.B.; LIMA-VERDE, I.B.; MARTINS, F.S.; MATOS, M.H.T.; LOPES, C.A.P.;
MAIA-JÚNIOR, J.E.; BÁO, S.N.; NOBRE-JUNIOR, H.V.; MAIA, F.D.; PESSOA, C.;
MORAES, M.O.; SILVA, J.R.V.; FIGUEIREDO, J.R.; RODRIGUES, A.P.R. Característica
histológica, ultra-estrutural e produção de nitrito de folículos pré-antrais caprinos cultivados
in vitro na ausência ou presença de soro. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e
Zootecnia, v. 60, n. 6, p. 1329-1337, 2008.
BULNES, A. G.; MORENO, J. S.; SEBASTIÁN, A. L. Estimation of fetal development in
Manchega dairy ewes by transrectal ultrasonographic measurements. Small Ruminant
Research, v. 27, n. 3, p. 243-250, 1998.
BURDOCK, G.A.; CARABIN, I.G.; GRIFFITHS, J.C. Toxicology and pharmacology of
sodium ricinoleate. Food and Chemical Toxicology, v. 44, n. 10, p. 1689-1698, 2006.
193
BUTLER, W.R. Nutritional interactions with reproductive performance in dairy cattle.
Animal Production Science, v. 60-61, p. 449-459, 2000.
CAI, X.; LUO, L.; XUE, M.; WU, X.; ZHAN, W. Growth performance, body composition
and phosphorus availability of juvenile grass carp (Ctenopharyngodon idellus) as affected by
diet processing and replacement of fishmeal by detoxified castor bean meal. Aquaculture
Nutrition, v. 11, n. 4, p. 293-299, 2005.
CAMPAGNA, C.; SIRARD, M.; AYOTTE, P.; BAILEY, J.L. Impaired maturation,
fertilization, and embryonic development of porcine oocytes following exposure to an
environmentally relevant organochlorine mixture. Biology of Reproduction, v. 65, n. 2, p.
554-560, 2001.
CAN, A.; SEMIZ, O.; CINAR, O. Bisphenol-A induces cell cycle delay and alters
centrosome and spindle microtubular organization in oocytes during meiosis. Molecular
Human Reproduction, v. 11, n. 6, p. 389-396, 2005.
CARLINI, C. R.; SÁ, M. F. G. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on
their potentialities as bioinseticides. Toxicon, v. 40, n. 11, p. 1515-1539, 2002.
CARVALHO, F.F.R.; XENOFONTES, A.R.B.; BATISTA, A.M.V. et al. Desempenho de
ovinos SPRD em crescimento alimentados com diferentes níveis de farelo de babaçu
(Orbignea speciosa -Jack). In: reunião anual da sociedade brasileirade zootecnia, 44, 2007c.
Jaboticabal. Anais... Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2007a.
CARVALHO, G.G.P.; PIRES, A.J.V.; SILVA, H.G.O.; VELOSO, C.M.; SILVA, R.R.
Aspectos metodológicos do comportamento ingestivo de cabras lactantes alimentadas com
farelo de cacau e torta de dendê. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 36, n. 1, p. 103-110,
2007b.
CARVALHO, G.G.P.; PIRES, A.J.V.; SILVA, R.R.; VELOSO, C.M.; SILVA, H.G.O.
Comportamento ingestivo de ovinos alimentados com dietas compostas de silagem de capimelefante amonizada ou não e subprodutos agroindustriais. Revista Brasileira de Zootecnia, v.
35, n. 4, p. 1805-1812, 2006.
CASAS, E.; BONILLA, E.; DUCOLOMB, Y.; BETANCOURT, M. Differential effects of
herbicides atrazine and fenoxaprop-ethyl, and insecticides diazinon and malathion, on
viability and maturation of porcine oocytes in vitro. Toxicology in vitro, v. 24, n. 1, p. 224230, 2010.
CELESTINO, J.J.H.; LIMA-VERDE, I.B.; BRUNO, J.B.; MATOS, M.H.T.; CHAVES, R.N.;
SARAIVA, M.V.A.; SILVA, C.M.G.; FAUSTINO, L.R.; ROSSETTO, R.; LOPES, C.A.P.;
DONATO, M.A.M.; PEIXOTO, C.A.; CAMPELLO, C.C.; SILVA, J.R.V.; FIGUEIREDO,
J.R. Steady-state level of bone morphogenetic protein-15 in goat ovaries and its influence on
in vitro development and survival of preantral follicles. Molecular and Cellular
Endocrinology, v. 338, n, 1-2, p. 1-9, 2011.
CELI, P.; DI TRANA, A.; CLAPS, S. Effects of perinatal nutrition on lactational
performance, metabolic and hormonal profiles of dairy goats and respective kids. Small
Ruminant Research, v. 79, n. 2-3, p. 129-136, 2008.
194
CESAR, M.F.; SOUSA, W.H. Carcaças ovinas e caprinas - obtenção, avaliação e
classificação. Uberaba: Agropecuária Tropical, 232 p. 2007.
CHAGAS, L.M.; GORE, P.J.S.; MEIER, S.; MACDONALD, K.A.; VERKERK, G.A. Effect
of Monopropylene Glycol on Luteinizing Hormone, Metabolites, and Postpartum
Anovulatory Intervals in Primiparous Dairy Cows. Journal of Dairy Science, v. 90, p. 11681175, 2007.
CHAKEREDZA, S.; MEULEN, U.; NDLOVU, L.R. Growth performance of weaner lambs
offered maize stover supplemented with varying levels of maize and cottonseed meals.
Livestock Production Science, v. 73, n. 1, p. 35-44, 2001.
CHAVES, R.N.; MARTINS, F.S.; SARAIVA, M.V.; CELESTINO, J.J.; LOPES, C.A.;
CORREIA, J.C.; VERDE, I.B.; MATOS, M.H.; BÁO, S.N.; NAME, K.P.; CAMPELLO,
C.C.; SILVA, J.R.; FIGUEIREDO, J.R. Chilling ovarian fragments during transportation
improves viability and growth of goat preantral follicles cultured in vitro. Reproduction
Fertility and Development, v. 20, n. 5, p. 640-647, 2008.
CHI, Z.; PYLE, D.; WEN, Z.; FREAR, C.; CHEN, S. A laboratory study of producing
docosahesaenoic acid from biodiesel-waste glycerol by microalgal fermentation. Process
Biochemistry, v. 42, n. 11, p. 1537-1545, 2007.
CHILLARD, Y.; BOCQUIER, F.; DOREAU, M. Digestive and metabolic adaptations of
ruminants to undernutrition, and conse- quences on reproduction. Reproduction Nutrition
Development, v. 38, p. 131-152, 1998.
CHUNG, Y.H.; RICO, D.E.; MARTINEZ, C.M.; CASSIDY, T.W.; NOIROT, V.; AMES, A.;
VARGA, G.A. Effects of feeding dry glycerin to early postpartum holstein dairy cows on
lactational performance and metabolic profiles. Journal Dairy Science, v. 90, p. 5682-5691,
2007.
CLEMENT, C.R.; LLERAS, E.; van LEEUWEN, J. O potencial das palmeiras tropicais no
Brasil: acertos e fracassos das últimas décadas. Agrociência, v. 9, n. 1-2, p. 67-71, 2005.
COBIANCHI, J.V.; OLIVEIRA, A.S.; CAMPOS, J.M.S.; GUIMARÃES, A.V.;
VALADARES FILHO, S.C.; COBIANCHI, F.P.; OLIVEIRA, T.E.S. Productive
performance and efficiency of utilization of the diet components in dairy cows fed castor meal
treated with calcium oxide. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 41, n.10, p. 2238-2248, 2012.
COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO - CONAB (2012). Série histórica de
área plantada, produtividade e produção, segundo levantamento de safras da Conab, 2012.
Disponível em: <http://www.conab.gov.br/detalhe.php?c=26107&t=2#this>. Acesso em 09
agosto 2012
COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO - CONAB (2013). Acompanhamento
da Safra Brasileira de Grãos 2013/14 - Primeiro Levantamento - Intenção de Plantio,
Outubro/2013. Disponível em:
<http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/13_10_23_13_46_38_boletim_portug
ues_outubro_2013.pdf>. Acesso em 12 agosto 2013
195
COOPER, R.L.; STOKER, T.E.; TYREY, L.; GOLDMAN, J.M.; MCELROY, W.K.
Atrazine disrupts the hypothalamic control of pituitary-ovarian function. Toxicological
Sciences, v. 53, n. 2, p. 297-307, 2000.
COSTA, D.A.; FERREIRA, G.D.G.; ARAÚJO, C.V.; COLODO, J.C.N.; MOREIRA, G.R.;
FIGUEIREDO, M.R.P. Consumo e digestibilidade de dietas com níveis de torta de dendê para
ovinos. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v. 11, n. 3, p. 783-792, 2010.
CRUZ, R.S.; ALEXANDRINO, E.; MISSIO, R.L.; NEIVA, J.N.M.; RESTLE, J.; MELO,
J.C.; JÚNIOR, A.S.; RESENDE, J.M. Feeding behaviors of feedlot bulls fed concentrate
levels and babassu mesocarp meal. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 41, n. 7, p. 1727-1736,
2012.
DEARTH, R.K.; HINEY, J.K.; SRIVASTAVA, V.; BURDICK, S.B.; BRATTON, G.R.;
DEES, W.L. Effects of lead (Pb) exposure during gestation and lactation on female pubertal
development in the rat. Reproductive Toxicology, v. 16, n. 4, p. 343-352, 2002.
DEMAJOROVIC, J. Da política tradicional de tratamento do lixo à política de gestão de
resíduos sólidos: as novas prioridades. Revista de Administração de Empresas, v. 35, n.3, p.
88-93, 1995.
DEMIRBAS, A. Biodiesel: A Realistic Fuel Alternative for Diesel Engines. British Library,
2008.
DINIZ, L.L.; VALADARES FILHO, S.C.; CAMPOS, J.M.S.; VALADARES, R.F.D.;
SILVA, L.D.; MONNERAT, J.P.I.S.; BENEDETI, P.B.; OLIVEIRA, A.S.; PINA, D.S.
Effects of castor meal on the growth performance and carcass characteristics of beef cattle.
Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, v. 23, n. 10, p. 1308-1318, 2010.
DINIZ, L.L.; VALADARES FILHO, S.C.; OLIVEIRA, A.S.; PINA, D.S.; SILVA, L.D.;
BENEDETI, P.B.; BAIÃO, G.F.; CAMPOS, J.M.S.; VALADARES, R.F.D. Castor bean
meal for cattle finishing: 1 - Nutritional parameters. Livestock Science, v. 135, n. 2-3, p. 153167, 2011.
DOBRANIC, T.; DOBRANIC, V.; TOMASKOVIC, A.; CERGOLJ, M.; BEDRICA, L.;
MARKOVIC, D. The effect of cadmium salts on plasma hormone levels and histopathology
of the ovaries in female rabbits. Tierarztliche Umschau, v. 57, n. 10, p. 539-540, 2002.
DOMINGUES, A.R.; SILVA, L.D.F.; RIBEIRO, E.L.A.; CASTRO, V.S.; BARBOSA,
M.A.A.F.; MORI, R.M.; VIEIRA, M.T.L.; SLIVA, J.A.O. Intake, ruminal parameters and
plasmatic urea concentration in beef cattle fed diets with different levels of sunflower cake in
substitution to the cotton meal. Ciências Agrárias, v. 31, n. 4, p. 1059-1070, 2010.
DOMINGUES, M.S.; BERMANN, C. O arco de desflorestamento na Amazônia: da pecuária
à soja. Ambiente & Sociedade, v. 15, n. 2, p. 1-22, 2012.
DONKIN, S.S. Glycerol from biodiesel production: the new corn for dairy cattle. Revista
Brasileira de Zootecnia, v. 37, n. spe, p.280-286, 2008.
196
DRACKLEY, J.K.; RICHARD, M.J.; BEITZ, D.C.; YOUNG, J.W. Metabolic changes in
dairy cows with ketonemia in response to feed restriction and dietary 1,3-butanediol. Journal
of Dairy Science, v. 75, n. 6, p. 1622-1634, 1992.
DUCOLOMB, Y.; CASAS, E.; VALDÉZ, A.; GONZÁLEZ, G.; ALTAMIRANO-LOZANO,
M.; BETANCOURT, M. In vitro effect of malathion and diazinon on oocytes fertilization and
embryo development in porcine. Cell Biology and Toxicology, v. 25, n. 6, p. 623-633, 2009.
ECONOMIDES, S. The nutritive value of sunflower meal and its effect on replacing cereal
straw in the diets of lactating ewes and goats. Livestock Production Science, v. 55, p. 89-97,
1998.
EICHENLAUB-RITTER, U.; VOGT, E.; CUKURCAM, S.; SUN, F.; PACCHIEROTTI, F.;
PARRY, J. Exposure of mouse oocytes to bisphenol A causes meiotic arrest but not
aneuploidy. Mutation Research, v. 651, n. 1-2, p. 82-92, 2008.
EKNAES, M.; KOLSTAD, K.; VOLDEN, H.; HOVE, K. Changes in body reserves and milk
quality throughout lactation in dairy goats. Small Ruminant Research, v. 63, p. 1-11, 2006.
EKWERE, E.O.; MCNEIL, R.T.; OKWUASABA, F.K. The effect of ricinus communis-linn
(RICOM 1013-J) on semen parameters: a comparative study. Journal of Pharmacy and
Clinical Sciences, v. 1, p. 7-11, 2011.
EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA - EMBRAPA. Plano Nacional
de Agroenergia 2006-2011 / Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Secretaria
de Produção e Agroenergia. 2. ed. rev. - Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica, 110
p. 2006.
EMPRESA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA DO RN - EMPARN. Recomendações
técnicas para o cultivo do girassol. Governo do Estado Do Rio Grande do Norte. 1 ed. - Natal,
RN, 27 p. 2008. Disponível em:
<http://www.emparn.rn.gov.br/contentproducao/aplicacao/emparn/arquivos/pdf/cartilha
_cultivo_do_girassol.pdf. 2009.> Acesso em 29 agosto 2013
EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY - EFSA. Scientific opinion of the panel on
contaminants in the food chain on a request from the European Commission on ricin as
undesirable substances in animal feed. The EFSA Journal, v. 726, p. 1-38, 2008.
FAGUNDES, M. H. Sementes de girassol: alguns comentários. Disponível em:
<http:/www.conab.gov.br>. Acesso em 10 setembro 2013
FARBER, J.L. Biology of disease: Membrane injury and calcium homeostasis in the
pathogenesis of coagulative necrosis. Laboratory Investigation, v. 47, n. 2, p. 114-123, 1982.
FERRAZ, A. C.; ANSELMO-FRANCI, J.A.; PEROSA, S.R.; CASTRO-NETO, E.F.;
BELLISSIMO, M.I.; OLIVEIRA, B.H.; CAVALHEIRO, E.A.; NAFFAHMAZZACORATTI, M.G.; CUNHA, C. Amino acid and monoamine alterations in the
cerebral cortex and hippocampus of mice submitted to ricinine-induced seizures.
Pharmacology Biochemistry and Behavior, v. 72, n. 4, p. 779-786. 2002.
197
FEUGIER, A.; FRELON, S.; GOURMELON, P.; CLARAZ, M. Alteration of mouse oocyte
quality after a subchronic exposure to depleted uranium. Reproductive Toxicology, v. 26, n. 24, p. 273-277, 2008.
FIGUEIREDO, J.R.; CELESTINO, J.J.H.; FAUSTINO, L.R.; RODRIGUES, A.P.R. In vitro
culture of caprine preantral follicles: advances, limitations and prospects. Small Ruminant
Research, v. 98, n. 1-3, p. 192-195, 2011.
FLORES, R.; LOOPER, M.L.; KREIDER, D.L.; POST, N.M.; ROSENKRANS, J.R.; C.F.
Estrous behavior and initiation of estrous cycles in postpartum Brahman-influenced cows
after treatment with progesterone and prostaglandin F2{alpha}. Journal of Animal Science, v.
84, n. 7, p. 1916-1925, 2006.
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. FAO
( 008). ‘Biofuels: Prospects, isks and pportunities.’ (Electronic Publishing Policy and
Support Branch, Communication Division: Rome). Disponível em:
<ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/011/i0100e/i0100e.pdf>. Acesso em 10 setembro 2013
FORTUNE, J.E. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles
and growth of preantral follicles. Animal Reproduction Science, v. 78, n. 3-4, p. 135-163.
2003
FOWLER, P.A.; DORÀ, N.J.; MCFERRAN, H.; AMEZAGA, M.R.; MILLER, D.W.; LEA,
R.G.; CASH. P.; MCNEILLY, A.S.; EVANS, N.P.; COTINOT, C.; SHARPE, R.M.; RHIND,
S.M. In utero exposure to low doses of environmental pollutants disrupts fetal ovarian
development in sheep. Molecular Human Reproduction, v. 14, n. 5, p. 269-280, 2008.
FURLAN, A.C.; MANTOVANI, C.; MURAKAMI, A.E.; MOREIRA, I.; SCAPINELLO, C.;
MARTINS, E.N. Utilização do Farelo de Girassol na Alimentação de Frangos de Corte.
Revista Brasileira de Zootecnia, v. 30, n. 1, p. 158-164, 2001.
FURTADO, R.F.; GUEDES, M.I.F.; ALVES, C.R.; MOREIRA, A.C.O.M.; FELIX, W.P.;
DUTRA, R.A.F. Produção de anticorpos policlonais anti-ricina. Ciência e Agrotecnologia, v.
35, n. 1, p. 124-130, 2011.
FURTADO, R.N.; CARNEIRO, M.S.S.; CÂNDIDO, M.J.D.; GOMES, F.H.T.; PEREIRA,
E.S.; POMPEU, R.C.F.F.; SOMBRA, W.A. Valor nutritivo de dietas contendo torta de
mamona submetida a métodos alternativos de destoxificação para ovinos. Arquivo Brasileiro
de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 64, n.1, n. 155-162, 2012.
GARCIA, J.A.S.; VIEIRA, P.F.; CECON, P.R.; SETTI, M.C.; McMANUS, C.;
LOUVANDINI, H. Desempenho de bovinos leiteiros em fase de crescimento alimentados
com farelo de girassol. Ciência Animal Brasileira, v. 7, n. 3, p. 223-233, 2006.
GARRY, V.F.; HARKINS, M.; LYUBIMOV, A.; ERICKSON, L.; LONG, L. Reproductive
outcomes in women of the Red River Valley of the north. I. The spouses of pesticide
applicators: pregnancy loss, age at menarche, and exposures to pesticides. Journal of
Toxicology and Environmental Health, Part A, v. 65, n. 11, p. 769-786, 2002.
198
GILCHRIST, R.B.; RITTER, L.J.; ARMSTRONG, D.T. Mouse oocyte mitogenic activity is
developmentally coordinated throughout folliculogenesis and meiotic maturation.
Developmental Biology, v. 240, n. 1, p. 289-298, 2001.
GODOY, M.G.; GUTARRA, M.L.E.; MACIEL, F.M.; FELIX, S.P.; BEVILAQUA, J.V.;
MACHADO, O.L.T.; FREIRE, D.M.G. Use of a low-cost methodology for biodetoxification
of castor bean waste and lipase production. Enzyme and Microbial Technology, v. 44, n. 5, p.
317-322, 2009.
GOETSCH, A.L.; ZENG, S.S.; GIPSON, T.A. Factors Affecting goat milk production and
quality. Small Ruminant Research, v. 101, p. 55-63, 2011.
GONDIM-TOMAZ, R.M.A.; SOAVE, D.; ERISMANN, N.M.; SABINO, N.P.; KONDO,
J.I.; CIA, E.; AZZINI, A. Preparo de sementes para determinação do teor de óleo pelo método
de rmn em seis variedades de algodoeiro. Bragantia, v. 57, n. 2, p. 197-202, 1998.
GONZÁLEZ, F.H.D.; SILVA, S.C. Introdução à bioquímica clínica animal. Porto Alegre:
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 360 p. 2003.
GORE, A.C.; WU, T.J.; OUNG, T.; LEE, J.B.; WOLLER, M.J. A novel mechanism for
endocrine-disrupting effects of polychlorinated biphenyls: direct effects on gonadotropinreleasing hormone neurons. Journal of Neuroendocrinology, v. 14, n. 10, p. 814-823, 2002.
GRANDE, S.W.; ANDRADE, J.M.; TALSNESS, C.E.; GROTE, K.; GOLOMBIEWSKI, A.;
STERNER-KOCK, A.; CHAHOUD, I. A dose-response study following in utero and
lactational exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP): reproductive effects on adult
female offspring rats. Toxicology, v. 229, n. 1-2, p. 114-122, 2007.
GRASSELLI, F.; BARATTA, L.; BAIONI, L.; BUSSOLATI, S.; RAMONIB, R.; GROLLI,
S.; BASINI, G. Bisfenol A disrupts granulosa cell function. Domestic Animal Endocrinology,
v. 39, n. 1, p. 34-39, 2010.
GRAY JR, L.E.; LASKEY, J.; OSTBY, J. Chronic di-η-butyl phthalate exposure in rats
reduces fertility and alters ovarian function during pregnancy in female Long Evans Hooded
rats. Toxicological Sciences, v. 93, n. 1, p.189-95, 2006.
GRAZUL-BILSKA, A.T.; BOROWCZYK, E.; BILSKI, J.J.; REYNOLDS, L.P.; REDMER,
D.A.; CATON, J.S.; VONNAHME, K.A. Overfeeding and underfeeding have detrimental
effects on oocyte quality measured by in vitro fertilization and early embryonic development
in sheep. Domestic Animal Endocrinology, v. 43, n. 4, p. 289-298, 2012.
GUERIPEL, X.; BRUN, V.; GOUGEON, A. Oocyte bone morphogenetic protein 15, but not
growth differentiation factor 9, is increased during gonadotropin-induced follicular
development in the immature mouse and is associated with cumulus oophorus expansion.
Biology of Reproduction, v. 75, n. 6, p. 836-843, 2006.
GUERRA, M.T.; SCARANO, W.R.; TOLEDO, F.C.; FRANCI, J.A.A.; KEMPINAS, W.G.
Reproductive development and function of female rats exposed to di-η-butyl-phthalate (DBP)
in utero and during lactation. Reproductive Toxicology, v. 29, n. 1, p. 99-105, 2010.
199
GUNN, P.J.; NEARY, M.K.; LEMENAGER, R.P.; LAKE, S.L. Effects of crude glycerin on
performance and carcass characteristics of finishing wether lambs. Journal of Animal Science,
v. 88, p. 1771-1776, 2010a.
GUNN, P.J.; SCHULTZ, A.F.; Van EMON, M.L.; NEARY, M.K.; LEMENAGER, R.P.;
RUSK, C.P.; LAKE, S.L. Effects of elevated crude glycerin concentrations on feedlot
performance, carcass characteristics, and serum metabolite and hormone concentrations in
finishing ewe and wether lambs. The Professional Animal Scientist, v. 26, n. 3, p. 298-306,
2010b.
HAFEZ, E.S.E.; HAFEZ, B. Reprodução animal. 7.ed. São Paulo: Manole, 2004. 173-180p.
HAUSBURG, M.A.; DEKREY, G.K.; SALMEN, J.J.; PALIC, M.R.; GARDINER, C.S.
Effects of paraquat on development of preimplantation embryos in vivo and in vitro.
Reproductive Toxicology, v. 20, n. 2, p. 239-246, 2005.
HAUSER, R.; SERGEYEV, O.; KORRICK, S.; LEE, M.M.; REVICH, B.; GITIN, E.;
BURNS, J.S.; WILLIAMS, P.L. Association of blood lead levels with onset of puberty in
Russian boys. Environmental Health Perspectives, v. 116, n. 7, p. 976-980, 2008.
HAYES, T.B.; COLLINS, A.; LEE, M.; MENDOZA, M.; NORIEGA, N.; STUART, A.;
VONK, A. Hermaphroditic, demasculinized frogs after exposure to the herbicide atrazine at
low ecologically relevant doses. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 99, n. 8,
p. 5476-5480, 2002.
HERNÁNDEZ, F.; LÓPEZ, M.J.; GARCÍA, V.; MARTÍNEZ, S.; MEGÍAS, M.D.;
MADRID, J. Influence of cereal type and the inclusion of sunflower meal as a source of
additional dietary fibre on nutrient retention, growth performance and digestive organ size in
broilers from one to twenty-one days of age. Animal Feed Science and Technology, v. 165, n.
3, p. 251-257, 2011.
HINDLE, V.A.; STEG, A.; van VUUREN, A.M.; VROONS-DE-BRUIN, J. Rumen
degradation and post-ruminal digestion of palm kernel by-products in dairy cows. Animal
Feed Science and Technology, v. 51, n. 1, p. 103-121, 1995.
HUNT, P.A.; KOEHLER, K.E.; SUSIARJO, M.; HODGES, C.A.; ILAGAN, A.; VOIGT,
R.C.; THOMAS, S.; THOMAS, B.F.; HASSOLD, T.J. Bisfenol A exposurecauses meiotic
aneuploidy in the female mouse. Current Biology, v. 13, n. 7, p. 546-553, 2003.
HUSSEIN, M.R. Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms. Human Reproduction
Update, v. 11, n. 2, p. 162-178, 2005.
HUSSEIN, T.S.; SUTTON-MCDOWALL, M.L.; GILCHRIST, R.B.; THOMPSON, J.G.
Temporal effects of exogenous oocyte-secreted factors on bovine oocyte developmental
competence during IVM. Reproduction, Fertility and Development, .v. 23, n. 4, p. 576-584,
2011.
IKONEN, T.; MORRI, S.; TYRISEVA, A.M.; RUOTTINEN, O.; OJALA, M. Genetic and
phenotypic correlations between milk coagulation properties, milk production traits, somatic
cell count, casein content, and ph of milk. Journal of Dairy Science, v. 87, p. 458-467, 2004.
200
INSKEEP, E.K. Preovulatory, postovulatory, and postmaternal recognition effects of
concentrations of progesterone on embryonic survival in the cow. Journal of Animal Science,
v. 82, n. 13, p. 24-39, 2004.
IRSHAID, R.H.; HARB, M.Y.; TITI, H.H. Replacing soybean meal with sunflower seed meal
in the ration of Awassi ewes and lambs. Small Ruminant Research, v. 50, n. 1, p. 109-116,
2003.
KAMARIANOS, A.; KARAMANLIS, X.; GOULAS, P.; THEODOSIADOU, E.;
SMOKOVITIS, A. The presence of environmental pollutants in the follicular fluid of farm
animals (cattle, sheep, goats, and pigs). Reproductive Toxicology, v. 17, n. 2, p. 185-190,
2003.
KANEKO, J.J. Serum proteins and dysproteinemias. In: KANEKO, J.J.; HARVEY, J.W.;
BRUSS M.L. (Ed). Clinical Biochemistry of domestic animals. 5 ed. San Diego: Academic
Press, 1997. 317-367p.
KAREN, A.M.; FATTOUH, el-S.M.; ABU-ZEID, S.S. Estimation of gestational age in
Egyptian native goats by ultrasonographic fetometry. Animal Reproduction Science, v. 114, n.
1-3, p. 167-174, 2009.
KARUNOJEEWA, H.; THAN, S.H.; ABU-SEREWA, S. Sunflower seed meal, sunflower oil
and full-fat sunflower seeds, hulls and kernels for laying hens. Animal Feed Science
Technology, v. 26, n. 1-2, p. 45-54, 1989.
KAVLOCK, R.J.; ANKLEY, G.T. A perspective on the risk assessment process for
endocrine-disruptive effects on wildlife and human health. Risk Analysis, v. 16, n. 6, p. 16,
1996.
KAWAS, J.R.; SCHACHT, W.H.; SHELTON, J.M.; OLIVARES, E.; LU, C.D. Effects of
grain supplementation on the intake and digestibility of range diets consumed by goats. Small
Ruminant Research, v. 34, p. 49-56, 1999.
KERBLER, T.L.; BUHR, M.M.; JORDAN, L.T.; LESLIE, K.E.; WALTON, J.S.
Relationship between maternal plasma progesterone concentration and interferon-tau
synthesis by the conceptus in cattle. Theriogenology, v. 47, n. 3, p. 703-714, 1997.
KHANUM, S.A.; HUSSAIN, M.; KAUSAR, R. Progesterone and estradiol during estrus
cycle and gestation in dwarf goats (Capra hircus). Pakistan Veterinary Journal, v. 28, n. 1, p.
1-4, 2008.
KUMAR, O.; SUGENDRAN, K; VIJAYARAGHAVAN, R. Oxidative stress associated
hepatic and renal toxicity induced by ricin in mice. Toxicon, v. 41, n. 3, p. 333-338, 2003.
LAKE, S.L.; SCHOLLJEGERDES, E.J.; ATKINSON, R.L.; NAYIGIHUGU, V.; PAISLEY,
S.I.; RULE, D.C.; MOSS, G.E.; ROBINSON, T.J.; HESS, B.W. Body condition score at
parturition and postpartum supplemental fat effects on cow and calf performance. Journal of
Animal Science, v. 83, p. 2908-2917, 2005.
LATHAM, K.E. Strain-specific differences in mouse oocytes and their contributions to
epigenetic inheritance. Development, v. 120, n. 12, p. 3419-3426, 1994.
201
LAUFENBERG, G. Transformation of vegetable waste into added products: (A) the
upgrading concept; (B) practical implementations. Bioresource Technology, v. 87, n. 2, p.
167-198, 2003.
LEE, K.Y.; SHIBUTANI, M.; TAKAGI, H.; KATO, N.; TAKIGAMI, S.; UNEYAMA, C.;
HIROSE, M. Diverse developmental toxicity of di-η-butyl phthalate in both sexes of rat
offspring after maternal exposure during the period from late gestation through lactation.
Toxicology, v. 203, n. 1-3, p. 221-238, 2004.
LEE, Y.; LEE, O.; CHO, J.; SHIN, H.; CHOI, Y.; SHIM, Y.; CHOI, W.; SHIN, H.; LEE, D.;
LEE, G.; SHIN, S. Ultrasonic measurement of fetal parameters for estimation of gestational
age in Korean Black Goats. Journal of Veterinary Medicine Science, v. 67, n. 5, p. 497-502,
2005.
LÉGA, E.; TONIOLLO, G.H.; OLIVEIRA, J.A.; RESENDE, V.R. Determinação da idade
fetal por meio da técnica ultra-sonográfica de fetometria e de morfologia fetal em cabras.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 59, n. 4, p. 851-856, 2007.
LENIE, S.; CORTVRINDT, R.; EICHENLAUB-RITTER, U.; SMITZ, J. Continuous
exposure to bisfenol A during in vitro follicular development induces meiotic abnormalities.
Mutation Research, v. 651, n. 1-2, p. 71-81, 2008.
LEONI, G.; BOGLIOLO, L.; DEIANA, G.; BERLINGUER, F.; ROSATI, I.; PINTUS, P.P.;
LEDDA, S.; NAITANA, S. Influence of cadmium exposure on in vitro ovine gamete
dysfunction. Reproductive Toxicology, v. 16, n. 16, p. 371-377, 2002.
LEUTENEGGER, C.M.; HIGGINS, J.; MATTHEWS, T.; TARANTAL, A.F.; LUCIW, P.;
PEDERSEN, N.C.; NORTH, T.W. Real-time TaqMan PC as a specific and more sensitive
alternative to the branched-chain DNA assay for quantitation of simian immunodeficiency
virus RNA. AIDS Research and Human Retroviruses, v. 17, n. 3, p. 243-251, 2001.
LI, H.K.; KUO, T.Y.; YANG, H.S.; CHEN, L.R.; LI, S.S.; HUANG, H.W. Differential gene
expression of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 during in
vitro maturation of porcine oocytes and early embryos. Animal Reproduction Science, v. 103,
n. 3-4, p. 312-322, 2008.
LIMA, J.R.O.; SILVA, R.B.; SILVA, C.C.M.; SANTOS, L.S.S.; SANTOS JR., J.R.E.M.M.;
MOURA, C.V.R. Biodiesel de babaçu (Orbignya sp.) obtido por via etanólica. Química Nova,
v. 30, n. 3, p. 600-603, 2007.
LIMA, J.R.O.; SILVA, R.B.; SILVA, C.C.M.; SANTOS, L.S.S.; SANTOS JUNIOR, J.R.;
MOURA, E.M.; MOURA, C.V.R. Biodiesel de babaçu (Orgignya sp.) obtido por via
etanólica. Química Nova, v. 30, n. 3, p. 600-603, 2007.
LIMA, R.L.S.; SEVERINO, L.S.; SAMPAIO, L.R.; SOFIATTI, V.; GOMES, J.A.;
BELTRÃO, N.E.M. Blends of castor meal and castor husks for optimized use as organic
fertilizer. Industrial Crops and Products, v. 33, n. 2, p. 364-368, 2011.
LIMA-VERDE, I.B.; MATOS, M.H.T.; BRUNO, J.B.; MARTINS, F.S.; SANTOS, R.R.;
BÁO, S.N.; LUQUE, M.C.A.; VIEIRA, G.A.B.; SILVEIRA, E.; RODRIGUES, A.P.R.;
FIGUEIREDO, J.R.; OLIVEIRA, M.A.L.; LIMA, P.F. Effects of α-tocopherol and ternatin
202
antioxidants on morphology and activation of goat preantral follicles in vitro cultured.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 61, n. 1, p. 57-65, 2009.
LIVAK, K.J.; SCHMITTGEN, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time
quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. v. 25, n. 4, p. 402-408,
2001.
LORD, P.W.; STEVENS, R.D.; BRASS A.; GOBLE C.A. Investigating semantic similarity
measures across the Gene Ontology: the relationship between sequence and annotation.
Bioinformatics, v. 19, n. 10, p. 1275-1283, 2003.
LOUVANDINI, H.; NUNES, G.A.; GARCIA, J.A.S. Desempenho, características de carcaça
e constituintes corporais de ovinos Santa Inês alimentados com farelo de girassol em
substituição ao farelo de soja na dieta. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 36, p. 603-609,
2007.
LOVEKAMP-SWAN, T.; DAVIS, B.J. Mechanisms of phthalate ester toxicity in the female
reproductive system. Environmental Health Perspectives, v. 111, n. 2, p. 139-145, 2003.
MA, M.; KONDO, T.; BAN, S.; UMEMURA, T.; KURAHASHI, N.; TAKEDA, M.; KISHI,
R. Exposure of prepubertal female rats to inhaled di(2-ethylhexyl) phthalate affects the onset
of puberty and postpubertal reproductive functions. Toxicological Sciences, v. 93, n. 1, p.
164-171, 2006.
MACEDO V.P.; GARCIA C.A.; SILVEIRA A.C.; MONTEIRO A.L.G.; MACEDO F.A.F.;
SPERS R.C. Composições tecidual e química do lombo de cordeiros alimentados com rações
contendo semente de girassol em comedouros privativos. Revista Brasileira de Zootecnia, v.
37, n. 10, p.1860-1868, 2008.
MACH, N.; BACH, A.; DEVANT, M. Effects of crude glycerin supplementation on
performance and meat quality of Holstein bulls fed high-concentrate diets. Journal of Animal
Science, v. 87, n. 2, p. 632-638, 2009.
MAJDIČ, G. Endocrine disrupting chemicals and domestic animals. Slovenian Veterinary
Research, v. 47, n. 1, p. 5-11, 2010.
MATOS JÚNIOR, J.B.; DIAS, A.N.; BUENO, C.F.D.; RODRIGUES, P.A.; VELOSO,
Á.L.C.; FARIA FILHO, D.L.E. Metabolizable energy and nutrient digestibility of detoxified
castor meal and castor cake for poultry. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 40, n. 11, p. 24392442, 2011.
MATOS, M.H.; LIMA-VERDE, I.B.; BRUNO, J.B.; LOPES, C.A.; MARTINS, F.S.;
SANTOS, K.D.; ROCHA, R.M.; SILVA, J.R.; BÁO, S.N.; FIGUEIREDO, J.R. Follicle
stimulating hormone and fibroblast growth factor-2 interact and promote goat primordial
follicle development in vitro. Reproduction Fertility and Development, v. 19, n. 5, p. 677-684,
2007.
MBAYAHAGA, J.; MANDIKI, S.N.M.; BISTER, J.L.; PAQUAY, R. Body weight oestrus
and ovarian activity in local Burundian ewes and goats after parturition in the dry season.
Animal Reproduction Science, v. 51, n. 4, p. 289-300, 1998.
203
MEADOR, J.P.; McCAARTY, L.S.; ESCHER, B.I.; ADAMS, W.J. The tissue-residue
approach for toxicity assessment: concepts, issues, applications, and recommendations.
Journal of Environmental Monitoring, v. 10, n. 12, p. 1486-1498, 2008.
MEALE, S.J.; CHAVES, A.V.; DING, S.; BUSH, R.D.; McALLISTER, T.A. Effects of
crude glycerin supplementation on wool production, feeding behavior, and body condition of
Merino ewes. Journal of Animal Science, v. 91, n. 2, p. 878-885, 2013.
MENA, H.; SANTOS, J.E.P.; HUBER, J.T.; SIMAS, J.M.; TARAZON, M.; CALHOUN,
M.C. The Effects of Feeding Varying Amounts of Gossypol from Whole Cottonseed and
Cottonseed Meal in Lactating Dairy Cows. Journal of Dairy Science, v. 84, n. 10, p. 22312239, 2001.
MENDES, W.S.; SILVA, I.J.; FONTES, D.O.; RODRIGUEZ, N.M.; MARINHO, P.C.;
SILVA, F.O.; AROUCA, C.L.C.; SILVA, F.C.O. Composição química e valor nutritivo da
soja crua e submetida a diferentes processamentos térmicos para suínos em crescimento.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 56, n. 2, p. 207-213, 2004.
MENEZES, D.R.; COSTA, R.G.; ARAÚJO, G.G.L.; PEREIRA, L.G.R.; OLIVEIRA, P.T.L.;
SILVA, A.E.V.N.; VOLTOLINI, T.V.; MORAES, S.A. Parâmetros sanguíneos, hepáticos e
ruminais de ovinos alimentados com dietas com farelo de mamona destoxificado. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, v. 47, n. 1, p.103-110, 2012.
MEUNIER, B.; BOULEY, J.; PIEC, I.; BERNARD, C.; PICARD, B.; HOCQUETTE, J.F.
Data analysis methods for detection of differential protein expression in two-dimensional gel
electrophoresis. Analytical Biochemistry, v. 340, n. 2, p. 226-230, 2005.
MEXIA, A.A.; MACEDO, F.A.F.; ALCALDE, C.R.; SAKAGUTI, E.S.; MARTINS, E.N.;
ZUNDT, M., YAMAMOTO, S.M.; MACEDO, R.M.G. Desempenhos reprodutivo e
produtivo de ovelhas Santa Inês suplementadas em diferentes fases da gestação. Revista
Brasileira de Zootecnia, v. 33, n. 3, p.658-667, 2004.
MIAO, M.; YUAN, W.; ZHU, G.; HE, X.; LI, De-K. In utero exposure to bisphenol-A and its
effect on birth weight of offspring. Reproductive Toxicology, v. 32, n. 1, p. 64-68, 2011.
MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE - MMA (2006). Caracterização das Oleaginosas para
Produção de Biodiesel. STCP Engenharia de Projetos Ltda. Disponível em:
<http://www.mma.gov.br/estruturas/sqa_pnla/_arquivos/item_5.pdf>. Acesso em 13 agosto
2013
MIOTTO, F.R.C.; RESTLE, J.; NEIVA, J.N.M.; MACIEL, R.P.; FERNANDES, J.J.R.
Consumo e digestibilidade de dietas contendo níveis de farelo do mesocarpo de babaçu para
ovinos. Revista Ciência Agronômica, v. 43, n. 4, p. 792-801, 2012.
MLYNARCIKOVA, A.; KOLENA, J.; FICKOVA, M.; SCSUKOVA, S. Alterations in
steroid hormone production by porcine ovarian granulosa cells caused by bisphenol A and
bisphenol A dimethacrylate. Molecular and Cellular Endocrinology, v. 244, n. 1-2, p. 57-62,
2005.
MLYNARCIKOVA, A.; NAGYOVA, E.; FICKOV, M.; SCSUKOVA. S. Effects of selected
endocrine disruptors on meiotic maturation, cumulus expansion, synthesis of hyaluronan and
204
progesterone by porcine oocyte-cumulus complexes. Toxicology In vitro, v. 23, n. 3, p. 371377, 2009.
MORALES-TERAN, G.; PRO-MARTINEZ, A.; FIGUEROA-SANDOVAL, B. SANCHEZDEL-REAL, C.; GALLEGOS-SANCHEZ, J. Continuous or restricted suckling and its
relationship to length of postpartum anoestrus in Pelibuey ewes. Agrociencia, v. 38, n. 2, p.
165-171, 2004.
MORAND-FEHR, P.; HERVIEU, J. Apprécier l'état corporel des chèvres: Intérêt et méthod.
Reussir La Chevre, n. 231, p. 22-34, 1999.
MOREIRA, J.F.C.; RODRÍGUEZ, N.M.; FERNANDES, P.C.C.; VELOSO, C.M.; SALIBA,
E.O.S.; GONÇALVES, L.C.; BORGES, I.; BORGES, A.L.C.C. Concentrados protéicos para
bovinos. 1. Digestibilidade in situ da matéria seca e da proteína bruta. Arquivo Brasileiro de
Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 55, n. 3, p. 315-323, 2003.
MORGAN, S.E. Gossypol as a toxicant in livestock. In Burrows GE (ed): The Veterinary
Clinics of North America: Food Animal Practice. Philadelphia. W.B. Saunders, 1989. 251263p.
MORIEL, P.; NAYIGIHUGU, V.; CAPPELLOZZA, B.I.; GONÇALVES, E.P.; KRALL,
J.M.; FOULKE, T.; CAMMACK, K.M.; HESS, B.W. Camelina meal and crude glycerin as
feed supplements for developing replacement beef heifers. Journal of Animal Science, v. 89,
n. 12, p. 4314-4324, 2011.
MOTLOMELO, K.C.; GREYLING, J.P.C.; SCHWALBACH, L.M.J. Synchronisation of
oestrus in goats: the use of different progestagen treatments. Small Ruminant Research, v. 45,
n. 1, p.45-49, 2002.
MOURITSEN, A.; AKSGLAEDE, L.; SØRENSEN, K.; SLOTH MOGENSEN, S.;
LEFFERS, H.; MAIN, K.M.; FREDERIKSEN, H.; ANDERSSON, A.M.; SKAKKEBAEK,
N.E.; JUUL, A. Hypothesis: exposure to endocrine-disrupting chemicals may interfere with
timing of puberty. Journal of Andrology, v. 33, n. 2, p. 346-359, 2010.
MYLCHREEST, E.; WALLACE, D.G.; CATTLEY, R.C.; FOSTER, P.M.D. Dose-dependent
alterations in androgen-regulated male reproductive development in rats exposed to di(ηbutyl) phthalate during late gestation. The Journal of Toxicological Sciences, v. 55, p. 143151, 2000.
NANDI, S.; GUPTA, P.S.; SELVARAJU, S.; ROY, S.C.; RAVINDRA, J.P. Effects of
exposure to heavy metals on viability, maturation, fertilization, and embryonic development
of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes in vitro. Archives of Environmental Contamination and
Toxicology, v. 58, n. 1, p. 194-204, 2010.
NATIONAL COTTONSEED PRODUCTS ASSOCIATION – NCPA (2002). Cottonseed
Feed Products Guide. Disponível em:
<http://www.cottonseed.com/publications/feedproductsguide.asp>. Acesso em 12 agosto
2013
NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC. Nutrient requirements of sheep. 6.ed.
Washington, D.C.: National Academy Press, 1985. 99p.
205
NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC. Nutrient requirements of small ruminants:
sheep, goats, cervids and new words camelids. Washington, D.C.: The National Academies
Press, 2007.
NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC. Nutrient requirements of small ruminants:
sheep, goats, cervids and new words camelids. Washington, D.C.: The National Academies
Press, 2007.
NITHYA, R.S.; ANUJA, M.M.; SWATHY, S.S.; RAJAMANICKAM, C.; INDIRA, M.
Effects on spermatogenesis in swiss mice of a protein isolated from the roots of Ricinus
communis (Linn.) (Euphorbiaceae). Journal of Hazardous Materials, v. 187, n. 1-3, p. 38692, 2011.
NUNES, A.S.; OLIVEIRA, R.L.; AYRES, M.C.C.; BAGALDO, A.R.; NETO, A.F.G.;
BARBOSA, L.P. Condição hepática de cordeiros mantidos com dietas contendo torta de
dendê proveniente da produção de biodiesel. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 39, n. 8, p.
1825-1831, 2010.
NUTTINCK, F.; CHARPIGNY, G.; MERMILLOD, P.; LOOSFELT, H.; MEDURI, G.;
FRERET, S.; GRIMARD, B.; HEYMAN, Y. Expression of components of the insulin-like
growth factor system and gonadotropin receptors in bovine cumulus–oocyte complexes
during oocyte maturation. Domestic Animal Endocrinology, v. 27, n. 2, p. 179-195, 2004.
OFFICE FOR NATIONAL STATISTICS. Cancer statistics registrations: registrations of
cancer diagnosed in 2005, England. London, UK: National Statistics, 2008.
OLIVEIRA JUNIOR, R.C.; SUSIN, I.; PIRES, A.V.; SIMAS, J.M.C.; MORAIS, J.B.
Desempenho de cabras em lactação alimentadas com grão de soja ão de soja. Acta
Scientiarum, v. 24, n. 4, p. 1113-1118, 2002.
OLIVEIRA, A.S.; CAMPOS, J.M.S.; OLIVEIRA, M.R.C.; BRITO, A.F.; VALADARES
FILHO, S.C.; DETMANN, E.; VALADARES, R.F.D.; SOUZA, S.M.; MACHADO, O.L.T.
Nutrient digestibility, nitrogen metabolism and hepatic function of sheep fed diets containing
solvent or expeller castorseed meal treated with calcium hydroxide. Animal Feed Science and
Technology, v. 158, n, 2-3, p. 15-28, 2010.
OLIVEIRA, A.S.; OLIVEIRA, M.R.C.; CAMPOS, J.M.S. LANA, R.P.; MACHADO,
O.L.T.; RETAMAL, C.A.; DETMAMNN, E.; VALADARES-FILHO, S.C. In vitro ruminal
degradation of ricin and its effect on microbial growth. Animal Feed Science and Technology,
v. 157, n. 1, p. 41-54, 2010.
OLIVEIRA, M. Dal S.; MOTA, D.A.; BARBOSA, J.C.; STEIN, M.; BORGONOVI, F.
Composição bromatológica e digestibilidade ruminal in vitro de concentrados contendo
diferentes níveis de torta de girassol. Ciência Animal Brasileira, v. 8, n. 4, p. 629-638, 2007.
OLIVEIRA, M.A.L.; GUIDO, S.I.; LIMA, P.F. Comparison of different protocols used to
induced and synchronize estrus cycle of Saanen goats. Small Ruminant Research, v. 40, n. 2,
p. 149-153, 2001.
206
OLSNES, S.; FERNANDEZ-PUENTES, C.; CARRASCO, L.; VAZQUEZ, D. Ribosome
inactivation by the toxic lectins abrin and ricin. Kinetics of the enzymic activity of the toxin
A-chains. European Journal of Biochemistry, v. 60, p. 281-288, 1975.
OLVERA-NOVOA, M.A.; OLIVERA-CASTILLO, L.; MARTINEZ-PALACIOS, C.A.
Sunflower seed meal as a protein source in diets for Tilapia rendalli (Boulanger, 1896)
fingerlings. Aquaculture Research, v. 33, n. 3, p. 223-229, 2002.
ONWUDIKE, O.C. Palm kernel meal as a feed for poultry: Use of palm kernel meal by
laying birds. Animal Feed Science and Technology, v. 20, n. 4, p. 279-286, 1988.
OSWEILER, C. D. Toxicoses Relacionadas com Plantas. In: BUCK, W.B.; OSWEILWER,
G.D. Toxicologia veterinária. Porto Alegre: Artes Médicas. 1996, 386-439p.
OUNNAS, F.; FEIDT, C.; TOUSSAINT, H.; MARCHAND, P.; BIZEC, B.L.; RYCHEN, G.;
JURJANZ, S. Polychlorinated biphenyl and low polybrominated diphenyl ether transfer to
milk in lactating goats chronically exposed to contaminated soil. Environmental Science and
Technology, v. 44, n. 7, p. 2682-2688, 2010.
PANIGRAHI, S.; POWELL, C.J. Effects of high rates of inclusion of palm kernel meal in
broiler chick diets. Animal Feed Science and Technology, v. 34, n. 1-2, p. 37-47, 1991.
PARENT, A.S.; TEILMANN, G.; JUUL, A.; SKAKKEBAEK, N.E.; TOPPARI, J.;
BOURGUIGNON, J.P. The timing of normal puberty and the age limits of sexual precocity:
variations around the world, secular trends, and changes after migration. Endocrine Reviews,
v. 24, n. 5, p. 668-693, 2003.
PARSONS, G.L.; SHELOR, M.K.; DROUILLARD, J.S. Performance and carcass traits of
finishing heifers fed crude glycerin. Journal Animal Science, v. 87, n. 2, p. 653-657, 2009.
PARUI, S. Identification and partial characterization of the allergenic proteins of Ricinus
communis L. pollen - a new approach. Grana, v. 38, n. 5, p. 311-315, 1999.
PASCOAL, L.A.F.; BEZERRA, A.P.A.; GONÇALVES, J.S. Farelo de babaçu: valor
nutritivo e utilização na alimentação animal. Revista Eletrônica Nutritime, v. 3, n. 4, p. 339345, 2006.
PATISAUL, H.B.; TODD, K.L.; MICKENS, J.A.; ADEWALE, H.B. Impact of neonatal
exposure to the ER alpha agonist PPT, bisphenol-A or phytoestrogens on hypothalamic
kisspeptin fiber density in male and female rats. Neurotoxicology, v. 30, n. 3, p.350-357,
2009.
PAUL, C.; RHIND, S.M.; KYLE, C.E.; SCOTT, H.; MCKINNELL, C.; SHARPE, R.M.
Cellular and hormonal disruption of fetal testis development in sheep reared on pasture
treated with sewage sludge. Environmental Health Perspectives, v. 113, n. 11, p. 1580-1587,
2005.
PAYNE, J.M.; PAYNE, S. The metabolic profile test. Oxford: Oxford University Press, 1987.
179p.
PEIXOTO, L.A.O.; OSÓRIO, M.T.M.; OSÓRIO, J.C.S.; NÖRNBERG, J.L.; PAZINI, M.
Desempenho reprodutivo e metabólitos sanguíneos de ovelhas Ile de France sob
207
suplementação com sal orgânico ou sal comum durante a estação de monta. Revista Brasileira
de Zootecnia, v. 39, n. 1, p. 191-197, 2010.
PEREZ-REYES, P.L.; SANCHEZ-ALONSO, J.A.; LOPEZ-APARICIO, P.; RECIO, M.N.;
PEREZ-ALBARSANZ, M.A. Different molecular capacity in the induction of apoptosis by
polychlorinated biphenyl congeners in rat renal tubular cell cultures. Bioscience Reports, v.
21, n. 6, p. 765-778, 2001.
PETRO, E.M.L.; LEROY, J.L.M.R.; COVACI, A.; FRANSEN, E.; NEUBOURG, D.D.;
DIRTU, A.C.; PAUW, I.D.; BOLS, P.E.J. Endocrine-disrupting chemicals in human follicular
fluid impair in vitro oocyte developmental competence. Human Reproduction, v. 27, n. 4, p.
1-9, 2012.
PICCIONE, G.; CAOLA, G.; GIANNETTO, C. Selected biochemical serum parameters in
ewes during pregnancy, post-parturition, lactation and dry period. Animal Science Papers and
Reports, v. 27, n. 4, p.321-330, 2009.
PINA, D.S.; VALADARES FILHO, S.C.; VALADARES, R.F.D.; CAMPOS, J.M.S.;
DETMANN, E.; MARCONDES, M.I.; OLIVEIRA, A.S.; TEIXEIRA, R.M.A. Consumo e
digestibilidade aparente total dos nutrientes, produção e composição do leite de vacas
alimentadas com dietas contendo diferentes fontes de proteína. Revista Brasileira de
Zootecnia, v. 35, n. 4, p. 1543-1551, 2006.
PISANI, L.F.; ANTONINI, S.; POCAR, P.; FERRARI, S.; BREVINI, T.A.L.; RHIND, S.M.;
GANDOLFI, F. Effects of pre-mating nutrition on mRNA levels of developmentally relevant
genes in sheep oocytes and granulosa cells. Reproduction, v. 136, n. 6, p. 303-312, 2008.
POCAR, P.; AUGUSTIN, R.; GANDOLFI, F.; FISCHER, B. Toxic effects of in vitro
exposure to p-tert-octylphenol on bovine oocyte maturation and developmental competence.
Biology of Reproduction, v. 69, n. 2, p. 462-468, 2003.
POCAR, P.; BREVINI, T.A.; PERAZZOLI, F.; CILLO, F.; MODINA, S.; GANDOLFI, F.
Cellular and molecular mechanisms mediating the effects of polychlorinated biphenyls on
oocyte developmental competence in cattle. Molecular Reproduction and Development, v. 60,
n. 4, p. 535-541, 2001a.
POCAR, P.; NESTLER, D.; RISCH, M.; FISCHER, B. Apoptosis in bovine cumulus–oocyte
complexes after exposure to polychlorinated biphenyl mixtures during in vitro maturation.
Reproduction, v. 130, n. 6, p. 857-868, 2005.
POCAR, P.; PERAZZOLI, F.; LUCIANO, A.M.; GANDOLFI, F. In vitro reproductive
toxicity of polychlorinated biphenyls: effects on oocyte maturation and developmental
competence in cattle. Molecular Reproduction and Development, v. 58, n. 4, p. 411-416,
2001b.
POMPEU, R.C.F.F.; CÂNDIDO, M.J.D.; PEREIRA, E.S. BOMFIM, M.A.D.; CARNEIRO,
M.S.S.; ROGÉRIO, C.P.; SOMBRA, W.A.; LOPES, M.N. Desempenho produtivo e
características de carcaça de ovinos em confinamento alimentados com rações contendo torta
de mamona destoxificada em substituição ao farelo de soja. Revista Brasileira de Zootecnia,
v. 41, n. 3, p. 726-733, 2012.
208
RABASSA, V.R.; TABELEÃO, V.C.; SCHNEIDER, A. Avaliação metabólica de ovelhas de
cria mantidas em campo nativo durante o período de outono/inverno. Revista Brasileira de
Agrociência, v. 15, n. 1-4, p. 125-128, 2009.
RAMSEY, W.S.; HATFIELD, P.G.; WALLACE, J.D. Relationships among ewe milk
production and ewe and lamb forage intake in Suffolk and Targhee ewes nursing single or
twin lambs. Journal Animal Science, v. 76, p. 1247-1253, 1998.
RANDEL, R.D.; WILLARD, S.T.; WYSE, S.J.; FRENCH, L.N. Effects of diets containing
free gossypol on follicular development, embryo recovery and corpus luteum function in
Brangus heifers treated with bFSH. Theriogenology, v. 45, p. 911-922, 1996.
RASIER, G.; PARENT, A.S.; GERARD, A.; DENOOZ, R.; LEBRETHON, M.C.;
CHARLIER. C.; BOURGUIGNON, J.P. Mechanisms of interaction of endocrinedisrupting
chemicals with glutamate-evoked secretion of gonadotropin- releasing hormone.
Toxicological Sciences, v. 102, n. 1, p. 33-41, 2008.
REGULAMENTO DA INSPEÇÃO INDUSTRIAL E SANITÁRIA DE PRODUTOS DE
ORIGEM ANIMAL - RIISPOA. Brasília, Brasil, 1980. 166p.
RHIND, S.M.; EVANS, N.P.; BELLINGHAM, M.; SHARPE, R.M.; COTINOT, C.;
MANDON-PEPIN, B.; LOUP. B.; SINCLAIR, K.D.; LEA, R.G.; POCAR, P.; FISCHER, B.;
van der ZALM, E.; HART, K.; SCHMIDT, J.S.; AMEZAGA, M.R.; FOWLER, P.A. Effects
of environmental pollutants on the reproduction and welfare of ruminants. Animal, v. 4, n. 7,
p. 1227-1239, 2010.
RHULE, S.W.A. Growth rate and carcass characteristics of pigs fed on diets containing palm
kernel cake. Animal Feed Science and Technology, v. 61, n. 1-4, p. 167-172, 1996.
RIBEIRO, G.M.; SAMPAIO, A.A.M.; FERNANDES, A.R.M.; HENRIQUE, W.;
SUGOHARA, A.; AMORIM, A.C. Efeito da fonte protéica e do processamento físico do
concentrado sobre a terminação de bovinos jovens confinados e o impacto ambiental dos
dejetos. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 36, n. 6, p.2082-2091, 2007.
RICHARDSON, C.R.; BEVILLE, R.N.; RATCLIFF, R.K.; ALBIN, R.C. Sunflower meal as
a protein supplement for growing ruminants. Journal of Animal Science, v. 53, n. 3, p. 557563, 1981.
RISCO, C.A.; HOLMBERG, C.A.; KUTCHES, A. Effect of graded concentration of
gossypol on calf performance: toxicological and pathological considerations. Journal of Dairy
Science, v. 75, n.10, p. 2787-2798, 1992.
CHE, J. .; DA E , D.; M ATE, P.; G AINGE , C.; HANNAH, M.; ’MA A, F.;
RATH, M. Variations in dietary cation–anion difference and the acid-base balance of dairy
cows on a pasture-based diet in South-eastern Australia. Grass Forage Science, v. 55, p. 2636, 2002.
ROCHE, J.R.; FRIGGENS, N.C.; KAY, J.K.; FISHER, M.W.; STAFFORD, K.J.; BERRY,
D.P. Invited review: Body condition score and its association with dairy cow productivity,
health, and welfare. Journal of Dairy Science, v. 92, p. 5769-5801, 2009.
209
RODRIGUES, M.R.C.; RONDINA, D.; ARAÚJO, A.A.; SOUZA, A.L.; NUNESPINHEIRO, D.C.; FERNANDES, A.A.O.; IBIAPINA, F.L. Respostas reprodutivas e
metabólicas de ovelhas alimentadas com bagaço de caju desidratado, durante o pós-parto.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 63, n. 1, p. 171-179, 2011.
RODRIGUEZ-TELLEZ, B.E.; MARCANO, L.; VILLAMEDIANA-MONREAL, P.C.
Effects of cadmium chloride exposure on in vitro maturation of bovine oocytes. Revista
Cientifica, v. 15, n. 5, p. 443-450, 2005.
ROELS, S.; COOPMAN, V.; VANHAELEN, P.; CORDONNIER, J. Lethal Ricin
Intoxication in Two Adult Dogs: Toxicologic and Histopathologic Findings. Journal of
Veterinary Diagnostic Investigation, v. 22, n. 3, p. 466-468, 2010.
RUBIN, B.S. Bisphenol A: an endocrine disruptor with widespread exposure and multiple
effects. Journal of Steroid Biochemistry, v. 127, n. 1-2, p. 27-34, 2011.
SALAZAR, V.; CASTILLO, C.; ARIZNAVARRETA, C.; CAMPÓN, R.; TRESGUERRES,
J.A.F. Effect of oral intake of dibutyl phthalate on reproductive parameters of Long Evans
rats and pre-pubertal development of their offspring. Toxicology, v. 205, n. 1-2, p. 131-137,
2004.
SALAZAR, Z.; DUCOLOMB, Y.; BETANCOURT, M.; BONILLA, E.; CORTÉS, L.;
HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ, F.; GONZÁLEZ-MÁRQUEZ, H. Gene expression analysis
on the early development of pig embryos exposed to malathion. International Journal of
Toxicology, v. 26, n. 2, p. 143-149, 2007.
SALHAB, A.S. Induction of mid-term abortion by ricin A-chain in mice. Pharmaceutical
Biology, v. 34, n. 2, p. 151-153, 1996.
SALHAB, A.S.; AL-TAMIMI, S.O.; GHARAIBEH, M.N.; SHOMAF, M.S. The
abortifacient effects of castor bean extract and ricin A-chain in rabbits. Contraception, v. 58,
n. 3, p. 193-197, 1998.
SALHAB, A.S.; ISSA, A.A.; ALHOUGOG, I. On the contraceptive effect of castor beans.
Pharmaceutical Biology, v. 35, n. 1, p. 63-65, 1997.
SALHAB, A.S.; SHOMAF, M.S.; GHARAIBEH, M.N.; AMER, N.A. Effects of castor bean
extract and ricin a-chain on ovulation and implantation in rabbits. Contraception, v. 59, n. 6,
p.395-399, 1999.
SALLET, C.L.; ALVIM, A.M. Biocombustíveis: uma análise da evolução do biodiesel no
Brasil. Economia & Tecnologia - Ano 07, vol. 25 - Abril/Junho de 2011.
SANDHYAKUMARY, K.; BOBBY, R.G.; INDIRA, M. Antifertility effects of Ricinus
communis (Linn) on rats. Phytotherapy Research, v. 17, n. 5, p. 508-511, 2003.
SANTOS, M. H. B.; LIMA, P. F.; MESSIAS, J. B.; OLIVEIRA, M. A. L. Medidas do
concepto utilizadas na prática ultrasonográfica de pequenos ruminantes. In: SANTOS, M. H.
B.; OLIVEIRA, M. A. L.; LIMA, P. F. (1 Ed). Diagnóstico de gestação na cabra e na ovelha.
Varela, São Paulo. 2004.
210
SANTOS, N.A. Propriedades Termo-Oxidativas e de Fluxo do Biodiesel de Babaçu
(Orbignya phalerata). Dissertação de mestrado, João Pessoa-PB, 2008.
SANTOS, S.F.; BOMFIM, M.A.D.; CÂNDIDO, M.J.D.; SILVA, M.M.C.; PEREIRA, L.P.S.;
SOUZA NETO, M.A.; GARRUTI, D.S.; SEVERINO, L.S. Efeito da inclusão da casca de
mamona na dieta de cabras leiteiras sobre a produção, composição e perfil dos ácidos graxos
do leite. Archivos de Zootecnia, v. 60, n. 229, p.113-122, 2011.
SANZ, A.; MORALES, A.E.; de la HIGUERA, M.; CARDENETE, G. Sunflower meal
compared with soybean meal as partial substitutes for fish meal in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss) diets: protein and energy utilization. Aquaculture, v. 128, n. 3-4, p.
287-300, 1994.
SATRAPA, R.A.; CASTILHO, A.S.; RAZZA, E.M.; PEGORER, M.F.; PUELKER, R.;
BARROS, C.M. Differential expression of members of the IGF system in OPU-derived
oocytes from Nelore (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus) cows. Animal Reproduction
Science, v. 138, n. 3-4, p. 155-158, 2013.
SAUMANDE, J. La folliculogenèse chez les ruminants. Recueil in Médicine Véterinarie, v.
167, p. 205-218, 1991.
SAUNDERS, G.A.; ALVES, N.G.; PÉREZ, J.R.O.; SOUZA, J.C.; MOURA, A.M.; MUNIZ,
J.A.; LIMA, R.R.; LAZARIN, G.B. Efeito do nível nutricional antes e após a ovulação sobre
a taxa de gestação e a prolificidade em ovelhas Santa Inês. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia, v. 64, n. 5, p. 1085-1093, 2012.
SCARAMUZZI, R.J.; CAMPBELL, B.K.; DOWNING, J.A.; KENDALL, N.R.; KHALID,
M.; MUÑOZ-GUTIÉRREZ, M.; SOMCHIT, A. A review of the effects of supplementary
nutrition in the ewe on the concentrations of reproductive and metabolic hormones and the
mechanisms that regulate folliculogenesis and ovulation rate. Reproduction Nutrition
Development, v. 46, p. 339-354, 2006.
SCHIELTZ, D.M.; MCGRATH, S.C.; MCWILLIAMS, L.G.; REES, J.; BOWEN, M.D.;
KOOLS, J.J.; DAUPHIN, L.A.; GOMEZ-SALADIN, E.; NEWTON, B.N.; STANG, H.L.;
VICK, M.J.; THOMAS, J.; PIRKLE, J.L.; BARR, J.R. Analysis of active ricin and castor
bean proteins in a ricin preparation, castor bean extract, and surface swabs from a public
health investigation. Forensic Science International. v. 209, n. 1-3, p. 70-79, 2011.
SCHOETERS, G.; DEN HOND, E.; DHOOGE, W.; VAN LAREBEKE, N.; LEIJS, M.
Endocrine disruptors and abnormalities of pubertal development. Basic & Clinical
Pharmacology & Toxicology, v. 102, n. 2, p. 168-175, 2008.
SCHONFELDER, G.; WITTFOHT, W.; HOPP, H.; TALSNESS, C.E.; PAUL, M.;
CHAHOUD. I. Parent bisphenol A accumulation in the human maternal–fetal–placental unit.
Environmental Health Perspectives, v. 110, n. 11, p. 703-707, 2002.
SCHOTANUS, K.; HAGE, W.J.; VANDERSTIEHELE, H.; Van den HURK, R. Effects of
conditioned medium from murine cell lines on the growth of isolated bovine preantral
follicles. Theriogenology, v. 48, n. 3, p. 471-483, 1997.
211
SCHRÖDER, A.; SÜDEKUM, K.-H. Glycerol as a by-product of biodiesel production in
diets for ruminants. In: INTERNATIONAL RAPESEED CONGRESS, v. 10. Canberra.
Gosford, Australia: Regional Institute, 1999. 241p.
SEVERINO, L.S.; COSTA, F.X.; BELTRÃO, N.E.M.; LUCENA, A.M.A.; GUIMARÃES,
M.M.B. Mineralização da torta de mamona, esterco bovino e bagaço de cana estimada pela
respiração microbiana. Revista de Biologia e Ciências da Terra, v. 5, n. 1, p. 1-6, 2005.
SILBERSTEIN, T.; SAPHIER, O.; PAZ-TAL, O.; TRIMARCHI, J.R.; GONZALEZ, L.;
KEEFE, D.L. Lead concentrates in ovarian follicle compromises pregnancy. Journal of Trace
Elements in Medicine and Biology, v. 20, n. 3, p. 205-207, 2006.
SILVA, C.M.G.; MATOS, M.H.T.; RODRIGUES, G.Q.; FAUSTINO, L.R.; PINTO, L.C.;
CHAVES, R.N.; ARAÚJO, V.R.; CAMPELLO, C.C.; FIGUEIREDO, J.R. In vitro survival
and development of goat preantral follicles in two diferente oxygen tensions. Animal
Reproduction Science, v. 117, n. 1, p. 83-89, 2010.
SILVA, D.C.; ALVES, A.A.; OLIVEIRA, M.E.; MOREIRA FILHO, M.A.; RODRIGUES,
M.M; VALE, G.E.S.; NASCIMENTO, H.T.S. Consumo e digestibilidade de dietas contendo
farelo de mamona destoxificado para ovinos em terminação. Revista Brasileira de Saúde e
Produção Animal, v. 12, n. 1, p. 96-106, 2011.
SILVA, D.C.; ALVES, A.A.; VASCONCELOS, V.R.; NASCIMENTO, H.T.S.; MOREIRA
FILHO, M.A.; OLIVEIRA, M.E. Metabolismo dos compostos nitrogenados em ovinos
alimentados com dietas contendo farelo de mamona destoxificado. Acta Scientiarum. Animal
Sciences, v. 32, n. 2, p. 219-224, 2010.
SILVA, H.G.O.; PIRES, A.J.V.; SILVA, F.F.; VELOSO, C.M.; CARVALHO, G.G.P.;
CEZÁRIO, A.S.; SANTOS, C.C. Características físico-químicas e custo do leite de cabras
alimentadas com farelo de cacau ou torta de dendê. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia, v.58, n. 1, p.116- 123, 2006.
SILVA, H.G.O.; PIRES, A.J.V.; SILVA, F.F.; VELOSO, C.M.; CARVALHO, G.G.P.;
CEZÁRIO, A.S.; SANTOS, C.C. Digestibilidade de dietas contendo farelo de cacau ou torta
de dendê em cabras lactantes. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 40, n. 4, p. 405-411,
2005a.
SILVA, H.G.O.; PIRES, A.J.V.; SILVA, F.F.; VELOSO, C.M.; CARVALHO, G.G.P.;
CEZÁRIO, A.S.; SANTOS, C.C. Farelo de Cacau (Theobroma cacao L.) e Torta de Dendê
(Elaeis guineensis, Jacq) na Alimentação de Cabras em Lactação: Consumo e Produção de
Leite. Sociedade Brasilieira de Zootecnia, v. 34, n. 5, p. 1786-1794, 2005b.
SILVA, J.R.V.; van den HURK, R.; MATOS, M.H.T.; SANTOS, R.R.; PESSOA, C.;
MORAES, M.O.; FIGUEIREDO, J.R. Influences of FSH and EGF on primordial follicles
during in vitro culture of caprine ovarian cortical tissue. Theriogenology, v. 61, n. 9, p. 16911704, 2004.
SILVA, L.M.; OLIVEIRA, C.H.A.; RODRIGUES, F.V.; RODRIGUES, M.R.C.; BESERRA,
F.J.; SILVA, A.M.; LEMOS, J.C.; FERNANDES, A.A.O.; RODINHA, D. Desempenho e
características da carcaça de cordeiros alimentados com bagaço de caju. Archivos de
Zootecnia, v. 60, n. 231, p. 777-786, 2011.
212
SILVA, L.M.; OLIVEIRA, C.H.A.; SILVA, A.M.; SILVA, C.M.G.; CASTRO, S.V.;
CARVALHO, A.A.; DUARTE, A.B.G.; COSTA, E.C.; FELTRIN, C.; FIGUEIREDO, J.R.;
RONDINA, D. In vitro development of ovine preantral follicles and oocyte cleavage rate are
not affected by long-term ingestion of detoxified castor meal. Small Ruminant Research, v.
113, n. 2-3, p. 353-359, 2013.
SILVA, L.M.; RONDINA, D.; ARAÚJO, A.A.; SARGENTINI, C.; LIMA, I.M.T.;
RODRIGUES, M.R.C.; SOUZA, A.L.; GIORGETTI, A.; OLIVEIRA, C.H.A.,
RODRIGUES, F.V. Reproductive responses and progesterone levels of post-partum oestrus
synchronization in goats with different body reserves. Italian Journal of Animal Science, v.
10, n. 4, p. 220-224, 2011.
SILVA, M.R.; SILVA, M.A.A.P. Fatores antinutricionais: inibidores de proteases e lectinas.
Revista de Nutrição, v. 13, n. 1, p. 3-9, 2000.
SILVESTRE, A.M.; MARTINS, A.M.; SANTOS, V.A.; GINJA, M.M.; COLAÇO, J.A.
Lactation curves for milk, fat and protein in dairy cows: A full approach. Livestock Science,
v. 122, p. 308-313, 2009.
SLUSZZ, T.; MACHADO, J.A.D. Características das potenciais culturas matérias- primas do
biodiesel e sua adoção pela agricultura familiar. In: ANAIS do 6 Encontro de Energia Meio
Rural, 2006, Campinas,: Unicamp, 2006. 1-10p.
SMALLSHAW, J.E.; FIRAN, A.; FULMER, J.R.; RUBACK, S.L.; GHETIE, V.; VITETTA,
E.S. A novel recombinant vaccine which protects mice against ricin intoxication. Vaccine, v.
20, n. 27-28, p. 3422-3427, 2002.
SMITH, M. C.; SHERMAN, D. M. Goat Medicine. 2. ed. Ames: Wiley-Blackwell, 2009.
SOARES, C.C.; CARNEIRO, M.E.R. Bibliotecas rurais para inclusão social no Brasil.
Inclusão Social, v. 3, n. 2, p. 15-25, 2010.
SOLOMON, M.; MELAKU, S.; TOLERA, A. Supplementation of cottonseed meal on feed
intake, digestibility, live weight and carcass parameters of Sidama goats. Livestock Science. v.
119, n. 1, p. 137-144, 2008.
SOUSA JUNIOR, A.; OLIVEIRA, M.E.; ALVES, A.A.; AZEVÊDO, D.M.M.R.; LOPES,
J.B.; ARAÚJO, D.L.C. Digestibilidade de dietas contendo farelo de babaçu para ovinos em
terminação. Archivos de Zootecnia. v. 56, n. 216, p. 967-970, 2007.
SOUSA, J.G.A.; QUEIROGA, V.D.P.; IBEI , . .; G MES, J.P.; A MEIDA, F.D.A.С.
Influência dos fatores colheita, beneficiamento e armazenamento na germinação das sementes
de algodão herbáceo. Agropecuária Técnica, v. 20, n. 1, p. 35-41, 1999.
STOKER, T.E.; GUIDICI, D.L.; LAWS, S.C.; COOPER, R.L. The effects of atrazine
metabolites on puberty and thyroid function in the male Wistar rat. Toxicological Sciences, v.
67, n. 2, p. 198-206, 2002.
STORENG, R.; JONSEN, J. Inhibitory effect of ricin on the development of preimplantation
mouse embryos. Journal of Toxicology and Environmental Health, v. 12, n. 2-3, p. 193-202,
1983.
213
SU, Y.Q.; WU, X.; O'BRIEN, M.J.; PENDOLA, F.L.; DENEGRE, J.N.; MATZUK, M.M.;
EPPIG, J.J. Synergistic roles of BMP15 and GDF9 in the development and function of the
oocyte-cumulus cell complex in mice: genetic evidence for an oocyte-granulosa cell
regulatory loop. Developmental Biology, v. 276, n. 1, p. 64-73, 2004.
SULTAN, C.; BALAGUER, P.; TEROUANNE, B.; GEORGET, V.; PARIS, F.; JEANDEL,
C.; LUMBROSO, S.; NICOLAS, J. Environmental xenoestrogens antiandrogens and
disorders of male sexual differentiation. Molecular and Cellular Endocrinology, v. 178, n. 12, p. 99-105, 2001.
SUPERINTENDÊNCIA DE REFINO, PROCESSAMENTO DE GÁS NATURAL E
PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS - ANP (2012). Boletim mensal do biodiesel, agosto
2012. Disponível em:
<http://www.anp.gov.br/?pg=68327&m=biodiesel&t1=&t2=biodiesel&t3=&t4=&ar=0&ps=1
&cachebust=1383062526757>. Acesso em 21 setembro 2013
SUPERINTENDÊNCIA DE REFINO, PROCESSAMENTO DE GÁS NATURAL E
PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS - ANP (2013). Disponível em:
<http://www.anp.gov.br/?pg=68327&m=biodiesel&t1=&t2=biodiesel&t3=&t4=&ar=0&ps=1
&cachebust=1383062526757>. Acesso em 12 setembro 2013
TACHIBANA, T.; WAKIMOTO, Y.; NAKAMUTA, N.; PHICHITRASLIP, T.;
WAKITANI, S.; KUSAKABE, K.; HONDO, E.; KISO, Y. Effects of bisphenol A (BPA) on
placentation and survival of the neonates in mice. Journal of Reproduction and Development,
v. 53, n. 3, p. 509-514, 2007.
TAKAHASHI, O.; OISHI, S. Disposition of orally administered 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)
propane (bisphenol A) in pregnant rats and the placental transfer to fetuses. Environmental
Health Perspectives, v. 108, n. 10, p. 931-935, 2000.
TAMMINGA, S. The effect of the supply of rumen degradable protein and metabolisable
protein on negative energy balance and fertility in dairy cows. Animal Reproduction Science,
v. 96, p. 227-239, 2006.
TAMMINGA, S.; LUTEIJN, P.A.; MEIJER, R.G.M. Changes in composition and energy
content of liveweight loss in dairy cows with time after parturition. Livestock Production
Science, v. 52, p. 31-38, 1997.
TAVERA-MENDOZA, L.; RUBY, S.; BROUSSEAU, P.; FOURNIER, M.; CYR, D.;
MARCOGLIESE, D. Response of the amphibian tadpole Xenopus laevis to atrazine during
sexual differentiation of the ovary. Environmental Toxicology and Chemistry, v. 21, n. 6, p.
1264-1267, 2002.
TEIXEIRA, A.; JOY, M.; DELFA, R. In vivo estimation of goat carcass composition and
body fat artition by real-time ultrasonography. Journal of Animal Science, v. 86, p. 23692376, 2008.
TERASAWA, E.; FERNANDEZ, D.L. Neurobiological mechanisms of the onset of puberty
in primates. Endocrine Reviews, v. 22, n. 1, p. 111-151, 2001.
214
TILLY, J.L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews
Molecular Cell Biology, v. 2, n. 11, p. 838-848, 2001.
TIMOFIECSYK, F.R.; PAWLOWSKY, U. Minimização de Resíduos na Indústria de
Alimentos: Revisão. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos, v. 18, n.
2, p. 221-236, 2000.
TITI, H.H. Replacing soybean meal with sunflower meal with or without fibrolytic enzymes
in fattening diets of goat kids. Small Ruminant Research, v. 48, p. 45-50, 2003.
ÜNAL, N.; ATASOY, F.; AKÇAPINAR, H. Milk yield measured by oxytocin plus hand
milking and weigh-suckle-weigh methods in ewes originating from local crossbred in Turkey.
Revue de Médecine Vétérinaire, v. 158, n. 6, p. 320-325. 2007.
URBANO, S.A.; FERREIRA, M.A.; JÚNIOR, W.M.D.; ANDRADE, R.P.X.; SIQUEIRA,
M.C.B.; FÉLIX, S.C.R. Carcass characteristics of sheep fed with castor bean hulls in
replacement of tifton 85 hay. Ciência e agrotecnologia, v. 37, n.1, p. 85-93, 2013.
VAN DEN HURK, R.; ZHAO, J. Formation of mammalian oocytes and their growth,
differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology, v. 63, n. 6, p. 17171751, 2005.
VIEIRA, M.M.M.; CÂNDIDO, M.J.D.; BOMFIM, M.A.D. Características da carcaça e dos
componentes não-carcaça em ovinos alimentados com rações à base de farelo de mamona.
Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v. 11, n. 1, p. 140-149, 2010.
VIEIRA, M.M.M.; CANDIDO, M.J.D.; BOMFIM, M.A.D.; SEVERINO, L.S.; PEREIRA,
E.S.; BESERRA, L.T.; MENESES, A.J.G.; FERNANDES, J.P.B. Comportamento ingestivo
de ovinos alimentados com rações contendo quatro níveis de inclusão do farelo de mamona.
Revista Ceres, v. 58, n. 4, p. 444-451, 2011.
VINCENT, I.C.; HILL, R.; CAMPLING, R.C. A note on the use of rapeseed, sunflower and
soybean meals as protein sources in compound foods for milking cattle. Animal Production,
v. 50, n. 3, p. 541-543, 1990.
WALLER, R.F.; RALPH, S.A.; REED, M.B.; SU, V.; DOUGLAS, J.D.; MINNIKIN, D.E.;
COWMAN, A.F.; BESRA, G.S., Mc FADDEN, G.I. A type II pathway for fatty acid
biosynthesis presents drug targets in Plasmodium falciparum. Antimicrob Agents Chemother,
v. 47, n. 1, p. 297-301, 2003.
WANG, C.; LIU, Q.; HUO, W.J.; YANG, W.Z.; DONG, K.H.; HUANG, Y.X.; GUO, G.
Effects of glycerol on rumen fermentation, urinary excretion of purine derivatives and feed
digestibility in steers. Livestock Science, v. 121, n. 1, p. 15-20, 2009.
WEBSTER, C.D.;TIDWELL, J.H.; GOODGAME, L.S.; YANCEY, D.H.; MACKEY, L. Use
of soybean meal and distillers grains with solubles as partial or total replacement of fish meal
in diets for channel catfish. Ictalurus punctatus. Aquaculture, v. 106, n. 3-4, p. 301-309, 1992.
WU, T.; BUCK, G.M.; MENDOLA, P. Blood lead levels and sexual maturation in u.s. girls:
the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994. Environmental Health
Perspectives, v. 111, n. 5, p. 737-741, 2003.
215
XENOFONTE, A.R.B.; CARVALHO, F.F.R.; BATISTA, Â.M.V.; MEDEIROS, G.R.;
ANDRADE, R.P.X. Desempenho e digestibilidade de nutrientes em ovinos alimentados com
rações contendo farelo de babaçu. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 37, n. 11, p. 2063-2068,
2008.
YAAKUB, H.; MASNINDAH, M.; SHANTHI, G.; SUKARDI, S.; ALIMON, A.R. The
effects of palm kernel cake based diet on spermatogenesis in Malin×Santa-Ines rams. Animal
Reproduction Science, v. 115, n. 1-4, p. 182-188, 2009.
YOSHIDA, Y.; MIYAMURA, M.; HAMANO, S.; YOSHIDA, M. Expression of growth
factor ligand and their receptor mRNAs in bovine ova during in vitro maturation and after
fertilization in vitro. Journal of Veterinary Medical Science, v. 60, n. 5, p. 549-54, 1998.
YOSHINO, O.; MCMAHON, H.E.; SHARMA, S.; SHIMASAKI, S. A unique preovulatory
expression pattern plays a key role in the physiological functions of BMP-15 in the mouse.
Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 103, n. 28, p. 10678-10683. 2006
YOUNGLAI, E.V.; FOSTER, W.G.; HUGHES, E.G.; TRIM, K.; JARRELL, J.F. Levels of
environmental contaminants in human follicular fluid, serum, and seminal plasma of couples
undergoing in vitro fertilization. Archives of Environmental Contamination and Toxicology,
v. 43, n. 1, p. 121-126, 2002.
ZANIN, C.M.; MARCHINI, J.S.; CARVALHO, I.F. Reações adversas a alimentos e
imunidade humoral: subclasses de IgG a antígenos alimentares. Nutrire: Journal of the
Brazilian Society of Food and Nutrition, v. 24, n. 1, p. 125-134, 2002.
ZATARI, I.M.; SELL, J.L. Effects of pelleting diets containing sunflower meal on
performance of broiler chickens. Animal Feed Science and Technology, v. 30, n. 1-2, p. 121129, 1990.
ZHOU, W.; LIU, J.; LIAO, L.; HAN, S.; LIU, J. Effect of bisphenol A on steroid hormone
production in rat ovarian theca-interstitial and granulosa cells. Molecular and Cellular
Endocrinology, v. 283, n. 1-2, p. 12-18, 2008.
ZHU, G.; GUO, B.; PAN, D.; MU, Y.; FENG, S. Expression of bone morphogenetic proteins
and receptors in porcine cumulus–oocyte complexes during in vitro maturation. Animal
Reproduction Science, v. 104, n. 2-4, p. 275-283, 2008.
ZIMMER, K.E.; GUTLE, A.C.; LYCHE, J.L.; DAHL, E.; OSKAM, I.C.; KROGENÆS, A.;
SKAARE, J.U.; ROPSTAD, E. Altered stress-induced cortisol levels in goats exposed to
polychlorinated biphenyls (PCB 126 and PCB 153) during fetal and postnatal development.
Journal of Toxicology and Environmental Health, v. 72, n.3-4, p. 164-172, 2008.
ŽUJ VIĆ, M.; MEMIŠI, N.; B GDAN VIĆ, V.; T MIĆ, Z.; MAKSIM VIĆ, N.;
BIJE IĆ, Z.; MA INK V, G. Effect of body weight of goats and lactation order on the
growth rate of kids in the suckling period. Biotechnology in Animal Husbandry, v. 27, n. 3, p.
1193-1200, 2011.
216
15 ANEXO I (Comitê de ética I)
217
16 ANEXO II (Comitê de ética II)