3D Functionalized Multi-Supportive Structures (FMSS) – A Novel
Route for Spinal Cord Injury Regeneration
ABSTRACT
A deregulation or injury in the nervous system usually leads to devastating consequences.
In the particular case of spinal cord injury (SCI), patients have to deal with several
neurological deficits and disabilities. Therefore, it is urgent to develop therapeutic
strategies that can specifically target this problem. Different possible solutions have been
experimented to solve these conditions, such as cell and molecular therapies, although the
outcomes are still not satisfactory, imposing a need for alternative approaches. Tissue
engineering has been proposed as a new method to address these problems. The tissue
engineering strategy usually implies the use of a 3D structure that is able to support the
cell growth and differentiation in an adequate environment towards the development of a
functional tissue engineered system. With the concepts of tissue engineering in mind, the
main goal of the work described in this thesis was to develop a structure that can be
easily, efficiently, and successfully applied in the treatment of spinal cord lesions.
In the work presented in this thesis, a natural blend of starch/poly-ε-caprolactone (SPCL)
was processed by rapid prototyping in order to create a tubular porous scaffold. Then,
these SPCL scaffolds were filled with the gellan gum hydrogel with the purpose of
creating a novel hybrid structure. In this biphasic scaffold the SPCL phase aims to
mimick the vertebra bone functions, while the gellan gum hydrogel is designed to be a
cell encapsulation system to support axonal regeneration in the injured spinal cord. The
developed scaffolds presented tunable outer layer thickness, mechanical modulus,
fiber/filament orientation, and pore geometry. Moreover, the scaffolds disclosed a noncytotoxic behavior and allowed the in vitro culturing of oligodendrocytes, olfactory
ensheathing cells (OECs) and Schwann cells for periods up to three weeks. In order to
overcome some of the drawbacks associated with the use of gellan gum, namely the
absence of biological signals for cellular adhesion and proliferation, this hydrogel was
chemically conjugated with the peptide sequence GRGDS, via Diels-Alder click
chemistry. It was observed that the novel GRGDS-gellan gum had a profound effect on
neural stem cell morphology and proliferation. These results demonstrated the importance
of GRGDS for cell-gellan gum interaction. Subsequently, the in vivo experiments
revealed that hybrid structures are biocompatible. However, more importantly, in vivo
tests showed that SPCL are suitable structures to promote spine stabilization and that the
stabilization of SCI rats was associated with functional motor recovery. Finally, in the
scope of this thesis, it was also assessed the effects of OECs secretome on the growth of
adult stem cells derived from adipose, bone marrow, umbilical cord and nervous tissue.
Results revealed that OECs secretome increase the metabolic activity and/or proliferation
of these adult stem cells.
As a concluding remark, it can be stated that the work described in this thesis brings new
knowledge to the cell biology, biomaterial and spinal cord injury fields. The results
obtained in the in vivo experiments indicate that researchers currently testing treatments
for SCI repair might have to take into account the use of spine stabilization in
combination with their approaches. From the biomaterial point of view, the simplicity
and broad applicability of the Diels-Alder click chemistry (used to functionalize the
gellan gum) can be easily extended to other molecules to further improve this material.
Finally, important understanding was herein created about biological/molecular
interactions between OECs and adult stem cells from several origins.
Estruturas de Suporte Multifuncionais: Uma Nova Terapia para
Regeneração de Lesões da Medula Espinal
RESUMO
Uma lesão do sistema nervoso acarreta normalmente consequências devastadoras. No
caso particular de lesões da medula espinal (LME), os pacientes têm que lidar com
múltiplas insuficiências biológicas. Por este motivo, é urgente desenvolver terapias que
possam resolver eficazmente este problema. Diferentes estratégias têm sido propostas
para tratar esta condição, tais como, terapias baseadas em transplantação celular e/ou
terapias moleculares. No entanto, os resultados não têm sido satisfatórios, reforçando a
ideia que são necessárias abordagens alternativas. A engenharia de tecidos tem sido
proposta como um novo método para enfrentar estes problemas. Esta estratégia implica o
uso de uma estrutura 3D que é capaz de suportar o crescimento e a diferenciação celular
de forma a criar um ambiente adequado para o desenvolvimento de um tecido funcional.
Tendo por base os conceitos da engenharia de tecidos, o principal objectivo do trabalho
descrito nesta tese foi o desenvolvimento de um sistema que possa ser aplicado
facilmente e eficazmente no tratamento de LME.
Neste trabalho, o polímero natural de poli-caprolactona de amido (SPCL) foi processado
por prototipagem rápida de forma a criar estruturas tubulares porosas. Seguidamente, o
interior das estruturas de SPCL foram preenchidos com o hidrogel gellan gum de forma a
criar uma estrutura híbrida. Neste sistema, o SPCL tem como objectivo mimetizar as
funções do osso vertebral. Por sua vez, o hidrogel tem como objectivo servir como um
sistema de encapsulamento celular de forma a suportar a regeneração nervosa. As
estruturas desenvolvidas possuem espessura, orientação e geometria do poro e
características mecânicas configuráveis. Adicionalmente, as estruturas apresentaram um
comportamento não tóxico e permitiram o crescimento in vitro de oligodendrócitos,
células do bolbo olfactivo (OECs) e células de Schwann. De forma a ultrapassar algumas
das desvantagens do gellan gum, nomeadamente o facto de este material não possuir na
sua estrutura sinais biológicos, este material foi modificado com o péptido GRGDS. Foi
observado que o GRGDS-gellan gum tem um forte efeito na morfologia e proliferação de
células estaminais neuronais. Estes resultados demonstraram a importância do péptido
GRGDS na interacção célula-gellan gum. Seguidamente, as experiencias in vivo
revelaram que estas estruturas são biocompatíveis, mas, mais importante, os testes em
animais demostraram que as estruturas de SPCL permitem a eficaz estabilização da
coluna vertebral e que esta estabilização promove a recuperação da função motora de
ratos com LME. Finalmente, no âmbito do trabalho descrito nesta tese, foi também
estudado o efeito que os factores secretados pelas OECs exercem sobre a proliferação
e/ou actividade metabólica de células estaminais adultas derivadas do tecido adiposo, da
medula óssea, do cordão umbilical e do tecido nervoso. Os resultados revelaram que as
OECs produzem factores que promovem o aumento da actividade metabólica e/ou
proliferação dessas células estaminais adultas.
O trabalho descrito nesta tese originou novo conhecimento para as áreas de biologia, de
biomateriais e de regeneração de LME. As experiências in vivo revelaram que os
investigadores que estejam actualmente a testar terapias para LME devem ter em conta a
estabilização vertebral. Do ponto de vista dos biomateriais, a modificação do gellan gum
é simples e de ampla aplicabilidade. Neste sentido, o gellan gum pode agora ser
facilmente modificado com diferentes moléculas consoante a aplicação desejada.
Finalmente, o entendimento sobre o efeito dos factores produzidos pelas OECs em
células estaminais, poderá revelar-se importante para futuras terapias celulares.