I.
Electrotransferência de Proteínas
(de Gel de Poliacrilamida para Membrana de Nitrocelulose)
1. Preparar o tampão de transferência: 25 mM Tris, 192 mM glicina e
20% (v/v) metanol.
2. Cortar a membrana e o papel de filtro com as dimensões do gel. (Usar
sempre luvas quando se manuseia as membranas para prevenir
contaminação.)
3. Equilibrar o gel e imergir a membrana, o papel de filtro e as esponjas
em tampão de transferência, durante 15 min.
4. Preparar a gel sandwich, num tabuleiro com tampão de transferência:
Face cinza
Esponja (fina)
papel de filtro (3x)
membrana
gel
papel de filtro (3x)
Esponja (grossa)
Nota: É importante remover todas as bolhas de ar, à medida que se vai
procedendo à montagem da sandwich, para a obtenção de bons
resultados. Para tal, utilizar uma pipeta de Pasteur.
5. Fechar a cassete cuidadosamente e colocá-la no módulo. Colocar o
módulo com ambas as cassetes na tina e encher completamente com
tampão.
6. Estabelecer a corrida, em condições previamente optimizadas para as
proteínas em estudo. (No caso de se tratarem de proteínas com peso
molecular entre 10 e 50 KDa estabelecer a corrida a 400 mA durante
1 hora).
II. Imunomarcação
1. Os locais de ligação não específicos são bloqueados imergindo a
membrana numa solução de 5% de leite em põ magro em “Trisbuffered saline Tween” (TBS-T)1, durante 1 hora à temperatura
ambiente num agitador.
2. Lavar a membrana 3 vezes com tampão de lavagem (TBS-T) durante 10
minutos à temperatura ambiente.
3. Incubar a membrana com o anticorpo primário diluído (anticorpo
produzido contra a proteína em estudo), durante 1 hora à
temperatura ambiente e “overnight” a 4ºC, em agitação.
4. Repetir as lavagens como descrito no passo 2.
5. Incubar a membrana com anticorpo secundário diluído (anticorpo que
reconheça o anticorpo primário), durante 1 a 2 horas, à temperatura
ambiente e em agitação.
6. Repetir as lavagens como descrito no passo 2.
7. Proceder à revelação das membranas.
III. Revelação por ECL
Nota: Este procedimento deve ser realizado no quarto-escuro.
1. Preparar a solução de detecção ECL: misturar um volume de solução de
detecção 1 com igual volume de solução de detecção 2 (preparar um
volume suficiente para cobrir a membrana). Homogeneizar a solução.
2. Após a remoção do TBS-T, incubar a membrana com a solução de
detecção durante 1 minuto à temperatura ambiente.
3. Colocar a membrana na cassete de revelação, com o lado contendo as
proteínas virado para cima e expô-la a um filme de revelação. Após o
tempo necessário (a optimizar consoante a proteína em estudo),
remover o filme e proceder à sua revelação e fixação com as soluções
apropriadas.
Revelação
(30 s)
1
água
Fixação
(30 s)
água
Stock TBS-T 10X (“Tris buffered saline Tween”): 100 mM Tris-HCl , pH8 ;0.5 M
NaCl;0.5% (v/v) Tween 20;
Anticorpo Secundário- Peroxidase de rábano
Perácido
Produto Oxidado
Membrana
Anticorpo Primário
Proteína
Forma oxidada
da enzima
+
Luminol
+
Activador
Luz
Filme