I. Electrotransferência de Proteínas (de Gel de Poliacrilamida para Membrana de Nitrocelulose) 1. Preparar o tampão de transferência: 25 mM Tris, 192 mM glicina e 20% (v/v) metanol. 2. Cortar a membrana e o papel de filtro com as dimensões do gel. (Usar sempre luvas quando se manuseia as membranas para prevenir contaminação.) 3. Equilibrar o gel e imergir a membrana, o papel de filtro e as esponjas em tampão de transferência, durante 15 min. 4. Preparar a gel sandwich, num tabuleiro com tampão de transferência: Face cinza Esponja (fina) papel de filtro (3x) membrana gel papel de filtro (3x) Esponja (grossa) Nota: É importante remover todas as bolhas de ar, à medida que se vai procedendo à montagem da sandwich, para a obtenção de bons resultados. Para tal, utilizar uma pipeta de Pasteur. 5. Fechar a cassete cuidadosamente e colocá-la no módulo. Colocar o módulo com ambas as cassetes na tina e encher completamente com tampão. 6. Estabelecer a corrida, em condições previamente optimizadas para as proteínas em estudo. (No caso de se tratarem de proteínas com peso molecular entre 10 e 50 KDa estabelecer a corrida a 400 mA durante 1 hora). II. Imunomarcação 1. Os locais de ligação não específicos são bloqueados imergindo a membrana numa solução de 5% de leite em põ magro em “Trisbuffered saline Tween” (TBS-T)1, durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador. 2. Lavar a membrana 3 vezes com tampão de lavagem (TBS-T) durante 10 minutos à temperatura ambiente. 3. Incubar a membrana com o anticorpo primário diluído (anticorpo produzido contra a proteína em estudo), durante 1 hora à temperatura ambiente e “overnight” a 4ºC, em agitação. 4. Repetir as lavagens como descrito no passo 2. 5. Incubar a membrana com anticorpo secundário diluído (anticorpo que reconheça o anticorpo primário), durante 1 a 2 horas, à temperatura ambiente e em agitação. 6. Repetir as lavagens como descrito no passo 2. 7. Proceder à revelação das membranas. III. Revelação por ECL Nota: Este procedimento deve ser realizado no quarto-escuro. 1. Preparar a solução de detecção ECL: misturar um volume de solução de detecção 1 com igual volume de solução de detecção 2 (preparar um volume suficiente para cobrir a membrana). Homogeneizar a solução. 2. Após a remoção do TBS-T, incubar a membrana com a solução de detecção durante 1 minuto à temperatura ambiente. 3. Colocar a membrana na cassete de revelação, com o lado contendo as proteínas virado para cima e expô-la a um filme de revelação. Após o tempo necessário (a optimizar consoante a proteína em estudo), remover o filme e proceder à sua revelação e fixação com as soluções apropriadas. Revelação (30 s) 1 água Fixação (30 s) água Stock TBS-T 10X (“Tris buffered saline Tween”): 100 mM Tris-HCl , pH8 ;0.5 M NaCl;0.5% (v/v) Tween 20; Anticorpo Secundário- Peroxidase de rábano Perácido Produto Oxidado Membrana Anticorpo Primário Proteína Forma oxidada da enzima + Luminol + Activador Luz Filme