Differential effects of Human Papillomavirus
DNA Types on p53 Tumor-Supressor Gene
Apopitosis in sperm
Lee, CA,Huang, CTF, King A, Chan PJ.
Gynecologic Oncology 85, 511–516 (2002)
Equipe: Cybelle Cristina
Maria Angélica
Papilomavirus
Estrutura:
DNA dupla fita circular
8 ORFs (E e L), 1 região de controle (LCR)
Capsídeo icosaédrico
Patogênese:
Infectam células basais do epitélio
Causam lesões hiperplásicas benignas
que podem evoluir para o câncer
HPVs de alto e baixo risco
Infecções latentes no epitélio e outros
tecidos
Presença do HPV no sêmen:
Alterações na motilidade do
espermatozóide (astenospermia)
Diminuição da capacidade reprodutiva
Fragmentação do DNA e apoptose em
espermatozóides
p53:
Proteína nuclear que se liga ao DNA e regula
a expressão de pts envolvidas no controle do
ciclo celular
Possui três domínios: ligante ao DNA,
oligomerização e ativação da transcrição
Gene localiza-se no cromossomo 17
Encontra-se freqüentemente mutado durante infecção por
HPV
HPV E6 + Ubiquitina-ligase + p53
p53
Objetivo
Determinar a integridade dos exons 5 e 8 do gene p53
de espermatozóide durante a exposição a diferentes
tipos de HPV.
Materiais e Métodos
Preparação da amostra
•Amostras de espermatozóide foram coletadas de
doadores HPV negativos e lavadas;
•Fragmentos de DNA de HPV dos tipos 6b/11 (157 pb), 16
(98 pb), 18 (83 pb), 31 (162 pb) e 33 (103 pb) e um
fragmento controle HLA-DQA1 (242 pb) foram colocados
em tubos e incubados juntos com as amostras por 24h.
Um tubo sem fragmentos de DNA também foi incubado
(controle não tratado)
•Os fragmentos de DNA do HPV contém os genes E6 e E7
A integridade dos exons 5 e 8 do gene p53 foi avalida
através dos ensaios DNA disc chip
Ensaio DNA Disc Chip
HPV e DQA
Amplificação
do DNA
Exons 5 e 8
p53
Descongelamento Aquecimento p/
Primers antisense
Amostra não tratada
Primers sense
Ressuspenção
Marcação do DNA
com corantes
fluorescente
Desnaturação do DNA
DNA fitas simples derivado amostras
expostas ao DNA de HPV e DQA
Corante Syr Gold
DNA fitas simples derivado amostras
não tratadas
Bisbemizide
Ensaio DNA Disc Chip
DNA fita simples
DQA
Discos de
membrana
confeccionados
DNA fita simples
controle
DNA fita simples
HPV
Discos alinhados em
um vidro
Formação do Chip
Os
discos
foram
analisados
em
um
microscópio
de
epifluorescência
Imagens capturadas por
uma câmera e gravadas
em um computador
Imagens coladas para
o programa Paint,
convertidas em escala
de cinza e analisadas
RESULTADOS
*A análise do gene P53 em esperma mostrou significante
fragmentação apopitótica no exon 5 exposto ao DNA do HPV
tipo 18 acarretando uma queda na fluorescência exibida pelo
exon;
*Em contraste, a exposição do DNA ao HPV tipo 16 resulta em
fragmentação do DNA do exon 8 mas não do exón 5;
*O HPV dos tipos 31 e 33 não exibem fragmentação
significante;
*O DNA intacto DQA1 exibe máxima fluorescência em
contraste com o DNA danificado que devido a pouca hibridação
exibe pouca fluorescência;
*A motilidade do espermatozóide foi reduzida na
presença de fragmentos de DNA das regiões E6 e E7em
todos os tipos de HPV testados;
*A motilidade também foi reduzida na presença de
fragmentos do controle positivo;
8
7
6
5
motilidade %
4
deslocamento lateral da
cabeça
3
2
1
0
controle
HPV 16
HPV 18
HPV
6b/11
HPV 31
HPV 33
DQA1
DISCUSSÃO
* Neste estudo, fragmentos de DNA preferencialmente das
regiões E6 e E7 dos genes de oncoproteínas de
transformação foram utilizados para avaliar o efeito direto
na instabilidade da P53em esperma;
*A nível genômico, o efeito direto da integração do HPV no
genoma do hospedeiro causando instabilidade no gene P53
não foi claramente demonstrado, embora seja sugerida uma
relação de causa e efeito;
*Embora em muitos casos o gene P53 tenha sido danificado,
os dados sugerem que os danos dependem do tipo de vírus
pois estes tem alvo específico representado por importantes
exons;
CONCLUSÃO
*Em suma, o presente estudo demonstrou que fragmentos
das regiões E6 e E7 do DNA de HPV tipos 16 e 18 alteram a
expressão dos exóns 5 e 8 do gene da P53;
*Os HPVs tipos 31 e 33 não afetam significativamente os
exóns da P53;
*A motilidade e progressão foram reduzidas em espermas
expostos a fragmentos do DNA de HPV sugerindo a
diminuição da capacidade de fertilização e possibilidade de
transmissão de genes modificados pelos vírus durante a
fertilização.