Pós-Graduação em Genética
Técnicas Citoquímicas aplicadas às
alterações biológicas em resposta a
agressões ambientais
Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise
Docente: Profa Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira
Aluna: Maria Isabel Afonso da Silva
A ordem Chelonia:
• muitas particularidades
• características peculiares
Poucas referências bibliográficas
M.a. de evolução
e adaptações
INTRODUÇÃO
Crescente expansão
das fronteiras agrícolas
intensa exploração
e industriais
e urbanização
contaminam os
habitats dos
animais silvestres
• Comprometer a sobrevivência e fisiologia dos organismos;
• Induzir alterações genéticas
Mutações e/ou Carcinogênese.
INTRODUÇÃO
Phrynops geoffroanus ou “Cágado-de-Barbelas”
Ampla distribuição
na América do Sul
INTRODUÇÃO
Perfil hematológico
Manejo adequado
Perfil fisiológico
Biologia da espécie
Preservação
Hematologia de répteis
Características fisiológicas
Influências ambientais
O perfil hematológico de répteis pode sofrer grande variação
fisiológica;
A interpretação dos achados da série branca é distinta e complexa
 É necessário elaborar um perfil para a espécie em estudo em
determinada região e situação através de pesquisas periódicas.
Estudos em relação a diversas condições ambientais => hábitos de
vida e adaptações ao ambiente,
• futura comparação com outras espécies para maior compreensão
dos aspectos evolutivos e conhecimento sobre esta.
Punção Cardíaca
Amostras Sanguíneas
1- Hemograma
• Hematócrito
• Dosagem da hemoglobina circulante
• Contagem de células
• Contagem de eritrócitos
• Cálculo de leucócitos
• Cálculo dos índices hematimétricos
•VGM
•CHGM
•HGM
• Contagem diferencial dos leucócitos
Panótipo (HematocorBiológicaR)
Reação de Acidofilia/Basofilia
-Mediadas por Ligações Eletrostáticas
• Coloração de rotina para análise geral da morfologia das células
sanguíneas
• Facilita a identificação e diferenciação dos leucócitos
Basofilia:
Corantes básicos (+)/ catiônico
Substrato aniônico (-)
Como a hematoxilina
- grupamentos fosfatos dos ácidos nucléicos (Núcleo)
Acidofilia:
Corantes ácidos (-)/ aniônico
Substrato catiônico (+)
Como a eosina
Amino de resíduos protéicos (NH3)- (núcleo e Citoplasma)
Células Vermelhas de Quelônios
Atuam na inflamação, promovem fagocitose; como célula hemostática
Células brancas de Quelônios
Requisitados no combate a doenças
infecciosas de origem bacterianas
Respondem à infecções
bacterianas
infecção viral,
Células Brancas de Quelônios
•Estão presentes no combate a
infecções bacterianas.
•Encontrados em infecções
parasitárias.
•reações imunes.
Citoquímica de Enzimas
• proteínas de forma tridimensional  acelerar as
reações químicas  são catalisadores biológicos.
• O resultado da reação é uma mudança específica do
substrato, criando uma nova molécula química ou um
produto.
•As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação química
que realizam.
habilidade de
catalisar, em
condições ácidas, a
hidrólise de
monoesteres
ortofosfato
Podem ser diferenciadas de acordo com propriedades estruturais,
catalíticas, imunológicas, distribuição no tecido e localização subcelular
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Fosfatases ácidas
• Encontradas em eritrócitos, leucócitos, fígado, baço, rins,
ossos e outros tecidos em humanos
• Em répteis não se tem muito estudo sobre sua
localização.
A LAP => monoester ortofosfórico do compartimento
endossomo/lisossomo fundamental para o catabolismo
de um ou vários substratos no lisossomo.
•Muitas doenças lisossomais => manifestações
morfológicas, bioquímicas e clínicas causadas pelo
armazenamento do conteúdo lisossômico.
Fosfatases ácidas
Responsáveis pela hidrólise dos fosfatos de ésteres orgânicos, que
durante a incubação cria a base para as reações citoquímicas.
• Especificidade por substrato menos limitada
• Ótima atividade em valores baixos de pH.
Localização:
•Lisossomos,
•complexo de Golgi,
• corpos multivesiculares
• superfície do RER
hidrolizam uma variedade de ésteres orgânicos com a liberação
de íons fosfatos.
Seu papel é muito importante na autólise de tecidos
Fosfatases ácidas
Método de fosfato de chumbo - Gömöri (1950)
37ºC por 30’
-glicerofosfato de sódio +
Nitrato de Chumbo (com
tampão acetato).
enzimas liberam o
fosfato do substratoprecipitado insolúvel
sulfeto de chumbo
• depósito granular denso e escuro,
com coloração marrom.
de fosfato de chumbo
lavar em Tampão
Acetato (pH 5,0) e
mergulhar em sulfeto
de amônia 1%, 1’
Como controle, é utilizado meio de incubação sem o substrato
Observações:
• O meio de incubação é preparado no dia anterior e permanece over-night a 37º C;
• os reagentes são guardados em solução estoque a 4ºC.
• O pH da solução de incubação final é importante e não pode exceder 5,2.
• A solução de sulfeto de amônia a 1% é preparada no momento de uso.
relacionada com a destruição da matriz óssea pela ação de
enzimas, com a reabsorção de tecido ósseo.
Peroxidases
doador
POD: fazem parte do
grupo das enzimas
oxidases.
catalisar a transferência H
peróxido de hidrogênio
•Variações nos padrões dos sistemas isoenzimáticos da peroxidase =>
organismos submetidas a estresses abióticos.
• O incremento da atividade dessas enzimas antioxidantes é
fundamental para evitar danos em nível celular.
peroxidases
peróxido de
hidrogênio
decomposto pela oxidação de cosubstratos
(compostos fenólicos e/ou antioxidantes)
•Organismos com altos níveis de antioxidantes => mais tolerantes a danos
oxidativos
Peroxidases
É incapaz de funcionar anaerobicamente e precisam de
peróxido como catalizador.
Método=> Sato (1928), segundo Lison (1960).
Peroxidases:catalítico
para H2O2
oxida
benzidina (incolor
e insolúvel)
azul de benzidina (instável e insolúvel)
benzopurpurina (cor marrom avermelhado)
Peroxidases
1) Solução: sulfato de cobre e ácido acético durante 1’.
2)Lavar com água destilada.
3)Cobrir com uma solução saturada de benzidina + H2O2 (10 V) –
homogeneizar- 2 a 8 minutos.
Como controle da reação=> dois meios, um na ausência de
benzidina e outro sem peróxido de hidrogênio.
4)Lavar novamente e cobrir com solução aquosa de fucsina básica a
1% durante 20 segundos.
O material, após novamente ser lavado em água destilada, é seco ao
ar e montado em gelatina-glicerina
Método citoquímico de peroxidase em amostras de sangue humano. À
esquerda- atividade de peroxidase positiva em neutrófilo. A amostra à direita
corresponde ao controle da reação.
Os métodos + comumente usados para avaliar genotoxicidade e danos
citotóxicos => contagem de MN e fragmentação de DNA - detectados
em diferentes tipos de células pelo ensaio cometa
Mutagênicos:
• agem sobre o desenvolvimento=> redução no índice mitótico =>
comprometimento no desenv. e cresc. do organismo.
• impacto significativo sobre o “pool” gênico de uma população
Alterações citogenéticas específicas x teratogênese
Genotóxicos:
• defeitos hereditários -mutações em células germinativas
•efeitos teratogênicos
•mutações pontuais, deleções, translocações e aneuploidia;
•quebra da dupla fita de DNA,
•aberrações cromossômicas,
•formação de micronúcleo,
•intercâmbio de cromátides irmãs.
Os micronúcleos:
•fragmentos cromossômicos acêntricos
•originam-se de
cromossomos com atraso
durante a anáfase
•dispersos no citoplasma – separados do núcleo principal.
Aparência:
•pequeno núcleo
•MO: material nuclear, intensidade luminosa ~ núcleo,
•formato oval/circular
•A< 1/3 do núcleo
Os micronúcleos:
•formados durante a telófase
•representam a perda de cromatina
cromossômico estrutural
dano no aparelho mitótico
Teste do micronúcleo:
• desenvolvido por Schmid (1975)
avaliar genotoxicidade e danos citotóxicos.
detecta mutações brutas: aberrações cromossômicas
Utilizações:
monitoramento biológico e ambiental
 rastreio de compostos para determinar a sua
genotoxicidade após exposição direta ou indireta
avaliações toxicológicas dos produtos químicos industriais
avaliações dos perigos de exposição geral.
Teste do micronúcleo:
Esfregaços:
1. Fixar 10’ em metanol absoluto
2. Após 24 horas=> em HCl à 60O C por 11’
3. Reativo de Schiff por 2 horas, em local escuro.
4. “Fast Green” por 20 segundos.
Teste do micronúcleo:
Vantagens:
• acessível, não-invasivo
•análise rápida de um elevado número de
células
•a velocidade e facilidade de análise,
•não-exigência de células em metáfase,
•pequenas concentrações de células
•eficácia em danos clastogênicos e
aneugênicos.
Ensaio Cometa
Outra técnica útil para biomonitoramento de contaminação
ambiental.
 Processo rápido, simples e sensível => vários tipos de
células
 Possibilidade de medir a integridade do DNA em nível
celular.
 Pode detectar baixos níveis de danos de DNA
 Exige um pequeno número de células por amostra,
 Flexível
 Curto período de tempo necessário para concluir um
estudo
Ensaio Cometa
Células com danos no DNA
produzem aumento da
migração de fragmentos de
DNA do núcleo
"cauda de cometa".
• A visualização de mobilidade dos fragmentos de DNA => modo
conveniente e sensível de detectar quebra de DNA nas células.
• O nível de base de danos no DNA varia => espécie x tipo de células; isto
influenciará a sensibilidade do ensaio
Agentes endógenos/ produtos do metabolismo celular aeróbio e
inflamação + exógenos/ uma variedade de agentes químicos e físicos
modificar o DNA celular e outros componentes celulares.
Ostling e Johanson em 1984
sangue coletado é diluído
em solução fisiológica
Singh et al. (1988) e Klaude et
al. (1996)
Depositar 10 L da suspensão
celular preparada com 120 L
de agarose de baixo ponto de
fusão a 37º C sobre lâminas
pré-gelatinizadas.
20’ em geladeira cobertas com
lamínulas.
tampão NaOH com EDTA
(pH ~13), por 20 minutos
em corrente de
eletroforese, no escuro
solução de lise - 1h
neutralizadas com Tris, por 15 minutos e fixadas em etanol
absoluto por 10 minutos.
A análise => microscópio de fluorescência, em objetiva de 40x.
CONCLUSÃO
Há grande impacto dos poluentes do ambiente sobre o
organismo em estudo.
Técnicas de micronúcleo, cometa
Ferramentas de biomonitoração das regiões naturais
Avaliação de agentes genotóxicos e mutagênicos
Phrynops geoffroanus
como um organismo sentinela
de efeitos genotóxicos.
Os dados úteis para futuros estudos que envolvam a
biomonitorização das regiões naturais
OBRIGADA!!!