UPC II - M
PROTOCOLOS
UPC II - MICROBIOLOGIA
Aula Prática 3
Recolha e processamento de amostras microbiológicas – Biofilme oral
Os microrganismos são ubiquistas e podem existir em qualquer superfície ou
ambiente, tanto como populações planctónicas, em suspensão e dispersos no meio,
como populações sésseis, aderentes a superfícies sólidas (bióticas ou abiótica) sob a
forma de biofilme. Os biofilmes podem formar-se em condutas de água, louças
sanitárias, cascos de navio, na pele e mucosas de animais (incluindo o homem), nos
dentes, em próteses.
Estima-se que mais de 90% dos microrganismos vivam sob a forma de biofilmes,
colonizando qualquer tipo de superfície, como é o caso da superfície do dente.
Embora a flora oral seja muito diversificada, em biofilmes verifica-se a prevalência de
espécies de Streptococcus e outros microrganismos produtores de ácidos como
lactobacilos e leveduras.
Genericamente, pode definir-se biofilme como sendo uma matriz polimérica, de
aspecto gelatinoso, aderente a uma superfície sólida que é essencialmente
constituída por aglomerados de células microbianas, produtos extracelulares
resultantes do seu metabolismo e água.
As análises microbiológicas tradicionais assentam na cultura dos microrganismos
para detetar a sua presença. Os cuidados para que o isolamento de microrganismos
seja possível começam na obtenção da amostra. Independentemente do tipo de
amostra a utilizar, há sempre que ter em conta os seguintes cuidados: recolher uma
amostra representativa; recolher as amostras e mantê-las em condições de assepsia e
viabilidade até serem analisadas, adequar os métodos de recolha e tratamento das
amostras aos objetivos da análise.
A. Obtenção do inóculo:
•
Utilize uma zaragatoa estéril embebida numa solução salina. Esta solução
serve não só para não irritar as mucosas mas também para recolher os
microrganismos mais facilmente.
AS Duarte
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•
Toque com a zaragatoa na área do interior da bochecha, dentes ou
garganta.
•
Rode a zaragatoa com os microrganismos na superfície de uma placa de
LA numa zona restrita da placa (cerca de ¼ da superfície, numa
extremidade).
•
Com uma ansa (agulha de inoculação) espalhe esse inóculo por riscado
de acordo com o protocolo B (Riscado em placa).
•
Identifique a placa com o seu nome e incube a 37°C.
•
Depois de uma incubação de 18 a 24 horas
verifique se houve
crescimento, registe o número de colónias que se desenvolveram bem
como as suas características de cor e aspeto. Caso não tenha obtido
crescimento nas placas volte a incubar e vá verificando em períodos de
24 horas.
B. Riscado em placa (técnica de isolamento de microrganismos)
Após crescimento em meio sólido é possível observar a morfologia das diferentes
colónias e isolar os microrganismos. Assim vamos utilizar o crescimento em LA numa
placa de Petri para separar (isolar) colónias de microrganismos numa mistura. Para
obter colónias separadas além de se utilizar meio sólido em placas tem que se
proceder à inoculação segundo um método especial chamado riscado em placa.
Esta técnica consiste em “diluir” uma amostra de microrganismos captada pela ansa.
Assim, risca-se o agar em várias direcções, flamejando a ansa sempre que se altera a
direcção, seguindo o método representado na figura 1. Para que se obtenha culturas
isoladas depois da incubação é essencial que: não se esqueça de flamejar a ansa
entre riscados, não perfure o agar durante o riscado. Tente espalhar o inóculo o mais
possível sem “recuar” quando está a riscar numa determinada direção.
Procedimento:
•
Identifique a placa.
•
Flameje a ansa até esta ficar incandescente e passe também o cabo pela
chama. Deixar arrefecer durante alguns segundos.
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•
Com uma mão levante o menos possível a tampa da placa de Petri.
•
Começando onde colocou a amostra inicial, na base da placa, risque a
superfície do agar sem perfurar, até cerca de meio da placa.
•
Tape a placa e rode 90°.
•
Flameje a ansa.
•
Na nova posição da placa risque de novo até meio da mesma.
•
Tape a placa e rode 90°.
•
Flameje a ansa novamente.
•
Na nova posição da placa risque de novo até meio da mesma.
•
Fixe a tampa da placa com fita-cola e identifique a placa com o seu nome.
Ponha a placa no suporte que vai ser incubado na estufa.
•
Incubar a 37ºC 18-24h. Observar a placa para verificar se o isolamento foi
eficaz. Repetir o procedimento até ter colónias isoladas.
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Figure
1:
Procedimento
para
isolamento de colónias - técnica de
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AS Duarte
colónias
riscado em placa.
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