PUCRS – CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – Genética I
AULA PRÁTICA
APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE PCR E ELETROFORESE DE DNA
Analise a seguinte situação hipotética (1):
Uma equipe de pesquisadores está realizando um inventário da
biodiversidade de uma área tropical ainda inexplorada, porém já
sofrendo grande impacto de fragmentação antropogênica. Um dos
principais focos de interesse dos botânicos participantes da equipe é a
identificação de populações remanescentes de uma espécie rara e
altamente
ameaçada
de
árvore,
endêmica
daquela
região.
A
identificação desta espécie em fragmentos de floresta é, portanto,
muito importante para a definição a priorização de áreas a serem
protegidas. Um desafio para estes pesquisadores é a identificação
desta espécie, que pode ser diferenciada morfologicamente de
espécies
próximas
(também
presentes
na
área)
apenas
por
características da flor. O cronograma das coletas de campo e da
definição de ações de conservação nestas áreas inviabiliza a espera do
período de disponibilidade de flores desta árvore. Assim sendo, os
botânicos e geneticistas da equipe desenvolveram um método de
identificação molecular desta árvore, através da técnica de PCR. A
partir de seqüências previamente analisadas de um intron nuclear,
identificou-se uma diferença de 200 pb entre o segmento desta espécie
e o das demais árvores deste gênero, permitindo o desenho de um
ensaio de tipagem em gel de agarose. O fragmento amplificado desta
espécie apresenta 400 pb, enquanto aqueles das demais espécies
apresentam 200 pb. Com base neste ensaio, analise amostras de DNA
obtidos de folhas de 2 árvores candidatas localizadas nestes
fragmentos florestais.
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APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE PCR E ELETROFORESE DE DNA
Analise a seguinte situação hipotética (2):
Técnicos de um laboratório de pesquisa forense atuando em parceria
com o Ministério do Meio Ambiente e a Polícia Federal recebem diversos
carregamentos de amostras de animais, plantas e produtos naturais
apreendidos com o objetivo de identificarem as espécies e/ou populações
envolvidas. Esta identificação é necessária para que as devidas medidas
penais sejam aplicadas a indivíduos indiciados por crimes como tráfico de
animais silvestres, e também acusados de praticar biopirataria ou outros usos
indevidos de componentes da biodiversidade. Abordagens moleculares são
extremamente úteis nestas análises, entre elas o uso de PCR para
caracterizar segmentos específicos de DNA.
Um indivíduo é preso em um aeroporto com um carregamento
escondido de 30 ovos, que as autoridades suspeitam serem provenientes de
uma espécie ameaçada de ave, e terem por destino o tráfico internacional de
animais. Análises externas iniciais indicam que os embriões contidos nos
ovos morreram durante o transporte, e seu estágio de desenvolvimento
permite apenas uma identificação morfológica a nível de gênero. Este gênero
contém duas espécies, uma delas altamente ameaçada (e não representada
em criadouros) e a outra bastante comum, e não ameaçada. O homem preso
alega que os ovos pertencem a esta segunda espécie, e provêm de um
criadouro comercial. O laboratório dispõe de um ensaio molecular baseado
na amplificação por PCR de um segmento do DNA mitocondrial, em que há
uma banda-controle de 600 pb nas duas espécies do gênero, e uma segunda
banda de 200 pb apenas na espécie ameaçada. Compare o resultado deste
ensaio em três amostras: (1) amostra-controle da espécie comum; (2)
amostra-controle da espécie ameaçada; e (3) amostra de um dos ovos
apreendidos.
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APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE PCR E ELETROFORESE DE DNA
Analise a seguinte situação hipotética (3):
Modificada a partir de um conceito original do Prof. Carlos A. S. Ferreira (PUCRS)
Organismos transgênicos são cultivados e comercializados
em vários países do mundo, porém em outros eles têm a sua
comercialização
proibida.
Além
disso,
algumas
empresas
de
alimentação certificam os seus clientes que não utilizam organismos
transgênicos e/ou alimentos produzidos com o uso de defensivos
agrícolas fora dos padrões recomendados pela legislação. No caso de
transgênicos, esta garantia somente pode ocorrer através de análises
que incluam testes para a detecção de alterações genéticas.
Alternativamente, a empresa pode produzir todos os organismos que
utiliza em seus alimentos. Um dos organismos transgênicos mais
comercializados é a uva contendo maior concentração de resveratrol. A
alteração genética introduzida foi a inserção de um gene que aumenta
a produção de resveratrol, o qual é semelhante a um gene
naturalmente presente na videira. Este gene pode ser detectado pela
técnica do PCR utilizando iniciadores específicos, sendo que o
fragmento amplificado a partir do gene naturalmente presente na
videira
apresenta
600
pb
enquanto
que
o
gene
introduzido
artificialmente apresenta 200 pb. Analise o resultado de 2 testes
originados de produtores de diferentes regiões.
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APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE PCR E ELETROFORESE DE DNA
Analise a seguinte situação hipotética (4):
Muitas doenças genéticas humanas são causadas por alterações
na seqüência de DNA de genes envolvidos em aspectos importantes
de nosso metabolismo. Estas alterações (mutações) incluem mudanças
em bases específicas (p. ex. de A para G), bem como deleções (ou
seja perda de um segmento) ou inserções (ou seja adição de um
segmento em uma localização atípica, p. ex. dentro de um exon).
A doença hipotética X resulta da deleção (perda) de um
segmento de 400 bases no exon 5 do gene hipotético ABC204. Este
exon codifica uma parte importante da proteína produzida a partir deste
gene, de forma que a perda de 400 bases neste segmento resulta em
uma proteína não funcional, levando a uma doença metabólica grave
quando em homozigose. A presença desta deleção pode ser detectada
por PCR, utilizando primers localizados em regiões adjacentes do exon
5. O alelo normal produz um fragmento de PCR de 600 bases,
enquanto o alelo defeituoso (portando a deleção) produz um fragmento
de 200 bases. Pessoas normais têm 2 cópias do alelo normal (ou seja
são homozigotas para este alelo); pessoas exibindo a doença têm 2
cópias do alelo defeituoso; e pessoas portadoras da doença (não
exibem o problema mas podem transmiti-lo aos seus filhos) têm uma
cópia de cada alelo. Analise o resultado de 3 testes derivados de
amostras de diferentes pacientes que têm suspeita da doença X.
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APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE PCR E ELETROFORESE DE DNA
Analise a seguinte situação hipotética (5):
Modificada a partir de um conceito original do Prof. Carlos A. S. Ferreira (PUCRS)
Vários alimentos podem ser contaminados por uma série de
microorganismos
patogênicos
e
não
patogênicos.
Estes
microorganismos podem em muitos casos alterar características
importantes destes alimentos ou de produtos gerados a partir deles. A
detecção destes microorganismos, desta forma, acaba sendo muito
importante para a qualidade e segurança alimentar. A detecção da
bactéria patogênica Salmonella enteritidis pode ser realizada através
da amplificação específica de um fragmento de DNA pela técnica de
PCR. O fragmento amplificado faz parte de uma região correspondente
ao gene que codifica uma porina (proteína presente na membrana
externa), e possui um tamanho de 400 pb. Outras enterobactérias não
patogênicas gram-negativas, porém incluindo algumas capazes de
alterar significativamente características importantes de alimentos,
também apresentam uma porina cujo gene permite amplificação por
PCR utilizando os mesmo iniciadores. O fragmento gerado, entretanto,
é maior (750 pb). A análise dos alimentos suspeitos envolve uma etapa
de enriquecimento, a qual se segue a extração e precipitação de DNA.
Este material é submetido ao PCR. Analise o resultado de 3 destes
testes, a partir de DNA extraído de diferentes lotes de salada de batata
com maionese.