S
OLU@iES
DE SORBITOL-GELATINA E DE ÁCIDO
GLUTiiMICO-LACTOSE NA
ESTABILIZACAO DE PREP=@jES
REFERfiNCIA DO VÍRUS DO SARAMPO
Edda de Rizzo, l Ehabed Chrzktina Nunes Tenório, ’
Inácib Franca Mendes, l Framzkco Lzkvw Woe Fang, 1 Mide2 Marie Pra( ’
CéZ&zSayoko l¿%ata,l Come Miyaki,I Nema Mar& Frazatti GaZZina,l
Hiroho Nakabata TuchiyaI e Olga K2ue Akimural
IN
TRODU@O
A prodyão de preparasoes
referência constitui procedimento usual
em laboratórios de virologia, sendo sua
aferisào feita frente a padrões internacionais de referencia, obtidos de laboratórios internacionais de padróes biológicos da OrganizaSao Mundial da Saúde ou
de órgáo por ela credenciado. Para
melhor reprodutibilidade de resultados,
o lote produzido deve permitir trabalhar
durante período razoável de tempo e se;
conservado em cond@es adequadas. E
durante a estocagem, entretanto, que a
qualidade do reagente, que é fun@o de
sua estabilidade, viabilidade e potencia,
é colocada à prova (l-2).
A liofiliza@o é o mais importante método usado para a desidratasáo
de reagentes biológicos para diagnóstico,
vírus, bactérias, soros e vacinas (2-4). Ao
serem liofilizados, os microorganismos
têm sua sobrevivência extremamente de’ Instituto Butancan, Setvico de Virologia, Se@o de
Cuba de Tecidos e Controle. Enderqo: Av. Vital Brasil 1500, São Paulo, SP, CEP 05504, Brasil.
pendente da composi@o do meio estabilizador empregado, cuja furyáo é protege-los de efeitos danosos que podem
advir do congelamento, da super-secagem ou do aparecimento de grupamentos carbonila (5,). Dentre as substâncias
mais empregadas com essa finalidade
estáo as albuminas humana e bovina, gelatina, sacarose,amido, lactose, sorbitol,
lactobionato de sódio ou de potássio,
Tris-ED’IX, hidrolisado de caseína e glutamato de sódio (4-6).
A inclusáo de um vírus padráo
dos National Institutes of Health (NIH)
dos Estados Unidos da América ou de
urna cepa referência nacional, titulada
frente ao primeiro em titula@es de vírus
do sarampo, é requisito recomendado
pela OMS (7) para estabelecer urna correla@0 de potência com o v’rrus em teste.
Os vírus do sarampo usados
na produfáo de vacinas ou de preparasoes consideradas como referencia sáo
8
s
$
is
ä
$
G
Fg
45
preservados por meio da liofiliza@o e estocagem em baixas temperaturas, após
estabiliza@0 (5).
Na presente investiga@0 testaram-se dois estabilizadores para o vírus
do sarampo, cepa Schwarz: sorbitol-gelatina e ácido glutâmico-lactose. Para tal,
duas suspensões virais estabilizadas
foram estocadas sob as seguintes condisóes:
0
suspensáo ‘IA”: congelada a
-70 “C
0
suspensáo ‘IB”: liofilizada e
estocada a - 20 “C.
Durante 21 meses titularamse as amostras de “A” e “B” quanto à
potência, em paraleio com um virus padráo. 0 objetivo foi comparar a estabilidade proporcionada pelos dois estabilizadores às suspensõesdo vírus em estudo,
nas condicóes de estocagem mencionadas, com vistas à sua utiliza@0 como prepara@0 referencia - lote trabalho.
ATERIAIS
E MÉTODOS
$
m
Y
i
CL
3
8
8
a,
.::
8
s
B
Fg
46
Submeteram-se vírus vivos,
atenuados, pertencentes à cepa Schwarz,
provenientes de dois lotes de vacinas
comerciais codificados como “A” e “B”,
a urna passagem em cultura de células
primárias de embriáo de galinha (CEG),
para a obten@0 de volumes razoáveis de
suspensáoviral(500-600 ml), com título
mínimo de 103~soDICT,,/ml (doses infectantes de cultura de tecidos 50%).
Obtiveram-se culturas primárias de CEGpor tripsinita@o de embriões
de galinha de nove dias, em agita@0
contínua (duas horas), utilizando solu@o
de tripsina (Difco Laboratories Inc.
1: 250) a 0,25% em tampáo fosfato
isento de cálcio e magnésio, pH 7,4,
acrescido de 0,l % de dextrose. As células dispersas obtidas foram ressuspensas
em meio essencial mínimo de Eagle (Eagle MEM) (8) suplementado com 5 % de
soro de vitela e 25 pg de neomicina/ml e
semeadasem garrafas de cultura retangulares com 50 cm2 de área útil. Após a
confluencia, asculturas foram inoculadas
com os vírus “A” e “B” (3 000 a 10 000
DICT,, por garrafa) e , 72 horas após haver
ocorrido o efeito citopatogênico (ECP), o
conteúdo foi colhido, homogeneizado,
misturado aos meios estabilizadores nas
propor@es indicadas e distribuido em
frascos tipo penicilina (2 ml/ frasco) que
foram recravados.
Para preservar o vírus durante
a estocagem e / ou liofiliza@o , optou-se
pelo uso de dois meios estabilizadores,
cujas composifões sáo as seguintes:
0
Meio sorbitol-gelatina: obtido
pela mistura volume por volume (v/v) de
solu@o de sorbito1 a 50% e de gelatina a
25 % e juntado aS suspensões virais na
propor@o de 1: 10;
0
Meio ácido glutâmico-lactose:
KOH: 0,274 g; ácido glutâmico: 0,72 g;
K*HPOd: 1,254 g; KH2P04: 0,52 g; lactose: 100 g; vermelho de fenol: 0,222 g;
água deioniaada: q.s.p. 1 litro. Ao vírus
ele foi adicionado na propor@o de 1: 2.
Frascoscontendo 2 ml de vírus
estabilizado foram estocados a frio e ao
abrigo da luz durante 21 meses, sob as
seguintes condigoes:
0
- 70 “C: vírus apenas estabilizado;
0
- 20 “C: vírus estabilizado e
liofilizado (1).
A linhagem de células Vero,
mantida em meio Eagle MEM acrescido
de 10% de soro de vitela, foi utilizada
nas titula@es da potência dos vírus do
sarampo estabilizados e / ou liofilizados e
mantidos em baixas temperaturas.
Realizaram-se no dia zero e
nos meses2, 3, 5, 7 ao 10, 12 ao 16 e 18
ao 2 1, titulafões das suspensõesde virus
“A” e “B” quando os frascosmantidos a
- 70 “C foram descongelados, e os frascos contendo o vírus do sarampo estabilizado e liofilizado foram reconstituidos
pela adi@o de 2 ml de água apirogênica.
A partir desse ponto, o conteúdo dos
frascos foi diluído em série, ao décimo,
com meio Eagle MEM, sendo as dilui@es
mantidas em banho de gelo e ao abrigo
da luz (1). Inocularam-se com 0,5 ml de
cada diluicáo (oito tubos por diluicáo) os
tubos de culturas confluentes de células
Vero, multiplicadas em Eagle MEM
(0,17 % de NaHC03) suplementado com
10% de soro de vitela e 25 pg de neomicina/ml, após terem seu sobrenadante
decantado. Após urna hora a 36,5 “C
para a adsor@o do vírus, cada tubo recebeu 1,5 ml de Eagle MEM (O,22% de
NaHCO,) acrescido de 2 % de soro de vitela e de 25 pg de neomicina/ml. A duracáo dos testes foi de sete dias, com
leituras de ECP nos dias 4 e 7 (9-10).
Todas as titulaSoes foram feitas em
triplicata, sendo o resultado o título médio obtido nas três dosagens de cada
arriostra.
Os títulos foram calculados
pelo método de Reed e Müench (ll) e
expressosem DICTSo.
Em todas as titulacóes incluiuse um vírus do sarampo-padráo, preparado no Instituto Butantan, a partir de
amostra liofilizada obtida de laboratório
credenciado pela OrganizaSáo Mundial
da Saúde.
R
ESIJITADOS
E DISCUSSiiO
Nas tabelas 1 e 2 aparecem,
respectivamente, os resultados das titula@es das amostras das suspensóes“A” e
“B” de virus do sarampo estabilizadas,
com sorbitol-gelatina e com ácido glutâmico-lactose e náo estabilizadas (controle), realizadas periodicamente duranteaestocagemde21mesesa -70 “C.
A figura 1 constitui a representagáográfica dos resultados constantes
do quadro 1. Ela se refere à suspensáo
“A” (congelada a - 70 “C após a estabilizayáo) e foi feita pelo sistema de retas
de regressão,adotado por permitir analisar melhor o comportamento dos meios
estabilizadores em questáo, com rela@o
ao vírus do sarampo (12).
A figura 2 apresenta as retas
traGadascom base nos resultados das titulasoes da potência das amostras da suspensáo de virus “B”, estabilizada e náo
estabilizada (controle), submetidas à
liofiliza@o e, posteriormente, estocadas
a - 20 “C, pelo período previsto de
21 meses.
Os coeficientes de correlasáo
(12) entre o título do vírus do sarampo,
presente nas amostras das suspensõesvirais “A” e “B”, e o tempo de estocagem
decorrido apresentaram valores que constam na tabela 3. Estes valores correspondem às retas que foram negativas tanto
para a suspensáo Gral “A’ como para a
“B”, com a ocorrência de apenas urna
reta com valor positivo para esta última.
Analisando a figura 1, verifica-se que as três retas sáo negativas, indicativo de que o vírus estocado a
- 70 “C, estabilizado ou nao, apresentou queda de título (l-18). Das duas solugoes estabilizadoras empregadas, a de
sorbitol-gelatina (r = - 0,65) foi a que
melhor protegeu a suspensáoGral. Comparando-se o coeficiente de correla@ioda
E:
.t?
a:
47
48
Figura 1, Titulo do virus do sarampo,cepa Schwarz (leg,,, BlCT5a/ml),suspensáo“FV’, segunde
a estabizader e o tempo de estocagema -70 %. SáoPaulo,1987
t
5
13
7
a
9 io
12
I
I
13 14
,
I
15 16
.
ia is
20 21
Tempo OmW
0 S.em&abilkador
(k - 0,73)
h Sat~~ol - gehtina (r= - OS)
a Áhdo gluSmic0 - hclwi (r= -0,82)
Figura 2. T”dulodo virus do sarampo,cepa Schwan (log10DICTSO/ml),suspensão“B”, liofilizada,
segundoDestabikadw e o tempo de estecagema -20 OC.SãoPaulo,1987
5
*
2
3
5
7
9
10
12 13 14
Tempo V=4
0 5emeslabiliia&r[r=-0.46)
A ,C&ivA-gelruina(r= +0,18)
0 Ácido gluramica - kctose [r= - 0,Ol)
15 16
16
19 20 21
TAEIEIA3. Coeficientesde correla@oentre a ptincia do vírus do sarampo,cepa
Schwarz, suspensóes“A” e “B”, e o tempo de estc$agem(21 meses). Sáo Paulo,1987
Suspensão
vira1
“A’
“6”
(liofilizada)
Temperatura
de
estocagem
Estabilizador
Coeficientede
correla@ode Pearson
(0
-70 “C
Ausente
~orbiol-gelatina
Acido glutâmico-lactose
-0,73
-0,65
-0,82
-20 “C
Ausente
Sorbiol-gelatina
iicido gltimico-lactose
-0,40
+0,18
-0,Ol
reta correspondente à estabiliza@0 com
ácido glutâmico-lactose (r = - 0,82),
com o coeficiente obtido para a suspensão de vírus controle que náo foi estabilizada (r = - O,73), ambas estocadas a
- 70 “C, ficou demonstrado que a presensa deste estabilizador foi mais prejudicial para o vírus do sarampo do que a
sua ausencia.
Das retas representando a suspensáo vira1 “B”, na figura 2, a correspondente 2 estabiliza@0 com sorbitolgelatina apresentou coeficiente de
correlafáo igual a + 0,18, indicativo de
que urna preserva@0 mais eficiente do
vírus ocorreu com ela do que com a solu@o de ácido glutâmico-lactose (r =
- O,Ol), que foi menos efetiva. A suspensáo controle demonstrou que a
ausencia de estabilizador provocou
queda de título mais acentuada (r =
- 0,40) do que aquela verificada com o
uso de qualquer dos estabilizadores estudados.
A atuacáo do ácido glutâmico-lactose na preserva@0 do virus do
sarampo variou com a temperatura em
que as suspensóes foram conservadas e
também com o fato de serem ou náo
liofílizadas. No primeiro caso, estabilizando a suspensáo “A”, ele teve efeito
danoso para o virus (r = - 0,82), enquanto que no segundo, da suspensáo
“B”, que fora submetida à liofilizgáo, a
reta correspondente apresentou r =
- 0,Ol , indicando que o vírus foi preservado pelo estabilizador. Do mesmo
modo, a solucáo de sorbitol-gelatina
também teve melhor efeito protetor para
a suspensáo vira1 quando esta foi liofilizada, pois quando foi apenas congelada
a - 70 “C, seu desempenho caiu sensivelmente (r = - 0,65).
A pesquisa demonstrou que
das solu@es em teste a de sorbitol-gelatina foi a mais indicada para preservar
suspensões do vírus do sarampo, cepa
Schwarz, que váo ser submetidas à liofiliza@0, pois , estocada por 21 meses a
- 20 “C, a suspensáo “B”, liofilizada,
apresentou estabilidade satisfatória (r =
+ 0,18, figura 2), preenchendo melhor
os requisitos para ser considerada e usada
como prepara@0 referencia - lote trabalho, do que a suspensáo ‘ ‘A”, que foi
apenas mantida congelada a - 70 “C
(r = - 0,65, figura 1).
R
ESUMO
Os autores realizaram 0 estudo descrito neste artigo com o objetivo
de avaliar o efeito protetor proporcionado por duas solu@es estabilizadoras
ao vírus do sarampo, cepa Schwarz sorbitol-gelatina e ácido glutâmico-lactose -, submetido à liofiliza@o, com
vistas à produ@o de preparasoes referência - lotes trabalho. 0 efeito da estocagema -20 “Cou -70 “Csobreapotência de suspensõesvirais estabilizadas,
liofilizadas ou náo, foi avaliado durante
2 1 mesestendo as amostras sido tituladas
quanto à potencia em paralelo com um
vírus padráo obtido de laboratório credenciado pela Organiza@0 Mundial da
Saúde.
Depois de comentar e comparar as várias fases do exudo, tipos de
células empregadas, meios estabilizadores, como foram estocadas as suspensões, a titula@o dos v’rrus estabilizados,
etc., os autores concluem ter ficado demonstrado que a solu@o de sorbitol-gelatina proporcionou estabilidade mais
satisfatória (r = - 0,Ol) 2s suspensõesvirais que foram liofilizadas e mantidas a
- 20 ” C sendo, portanto, considerada
como estabilizador eficiente na prepara@o de vírus referência do sarampo 0
lotes trabalho, liofilizados.
A
GRADECIMEN’I’OS
Ao Dr. Murillo
Adelino
Soares, Diretor do Serviso de Virologia
do Instituto Butantan, pela orienta@
técnica na realiza@0 das liofiliza@es. A
Dra. Masaio Mizuno Ishizuka, Professora
Adjunta da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de
Sáo Paulo, pela orienta@0 na análise estatística dos resultados.
R
EFERiNCIAS
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S
UMMARY
SORBITOLGELATIN AND
GLUTAMIC ACID-LACTOSE
SOLU’I’IONS AS SWTL~RS
OF REFERENCEMEASLZS
VIRUS PREPARATIONS
The study described in this article was carried out for the purpose of evaluating the protective effects of two stabilizing
solutions-sorbitol-gelatin
and glutamic
acid-lactose-on freeze-dried measles virus
(Schwartz strain) with a view to the production of referente preparations in working
lots. The effect of storage at - 20 “C and
- 70 “C on the potency of stabilized virus
suspensions, whether or not freeze-dried, was
evaluated over a period of 21 months; the
samples were concurrently titered for potency
52
13 Rizzo, E. de, Fang, E L. W., Gallina, N. M. F.,
Tákata, C. S., Miyaki, C., Pluciennik, A. M.
A., Sato, A., Pral, M. M., Pral? E. M. E e
Mendes, 1. F. Seringas hipodéncas descartáveis versus reutilizáveis. Estudo de possíveis
efeitos sobre o vírus da vacina viva, atenuada
contra o sarampo. Rev Sade Pdica (Sáo
Paulo) 20475480, 1986.
with a standard virus obtained from a laboratory authorized by the World Health Organitation.
After comparing and commenting on the different phases of the study, tbe
types of cells and stabilizing media used, how
the suspensions were stored, the titering of
the stabilized viruses, etc., the authors conclude that they have demonstrated a more
satisfactory stabilization (r = - 0.01) of
freeze-dried virus suspensions stored at
- 20 “C by sorbitol-gelatin, which is therefore regarded as an effective stabilizer for the
preparation of freeze-dried referente measles
virus in working lots.