HELOÍSA HELENA PARO DE OLIVEIRA
CULTIVO DE CÉLULAS ASCÍTICAS DO TUMOR DE WALKER 256 NA
PRESENÇA DE ÓLEO DE PEIXE-BSA COMPLEXADO:
Efeitos sobre proliferação e morte celular e seus mecanismos de ação.
CURITIBA
2006
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HELOÍSA HELENA PARO DE OLIVEIRA
CULTIVO DE CÉLULAS ASCÍTICAS DO TUMOR DE WALKER 256 NA
PRESENÇA DE ÓLEO DE PEIXE-BSA COMPLEXADO:
Efeitos sobre proliferação e morte celular e seus mecanismos de ação.
Dissertação
apresentada
para
obtenção do título de Mestre no curso
de Pós-Graduação em Biologia
Celular e Molecular, área de
concentração Fisiologia, do Setor de
Ciências Biológicas, da Universidade
Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Cláudio
Fernandes
CURITIBA
2006
Dedico este trabalho a todos os
animais que deram sua vida pelo
progresso da ciência.
“No semblante de um animal que não
fala, há todo um discurso que só um
espírito sábio é capaz de entender.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos os professores que tive em minha vida e que ajudaram a
me tornar a pessoa que sou hoje.
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação de Biologia Celular e Molecular
pela oportunidade e formação de qualidade.
Aos professores do colegiado, com os quais muito aprendi e que sempre me
trataram com respeito.
Ao apoio financeiro do CNPq.
Ao Dr João, Dra Glacy e enfermeiras do HC e Hospital Angelina Caron pela
ajuda e oportunidade de pesquisa.
Ao pessoal do Biotério: Luizão, Iselen, Ana, Dona Teresa, Júlio, Cândido
entre tantos outros, pela atenção, ajuda e apoio.
À Marlene, Ruth e Cláudio por serem sempre prestativos comigo.
Ao professor Ricardo, que sempre me emprestava o pHmetro e ao professor
Zanata, que me deixava usar o “quarto-escuro” e me emprestava as soluções, por
sua gentileza e generosidade.
Ao meu orientador “pop” e amigo Luiz Cláudio pelo auxílio, paciência,
tranqüilidade, confiança em meu trabalho e pela amizade.
À velha guarda do laboratório de metabolismo celular: Alessandra, Oswaldo,
João, Claudinha, Júlia, Ricardo, Maurício, Rica “Chairs”, Nathália, Rogéria, Dalva,
Evelise e Evinho tanto pelos
ensinamentos quanto pelos
momentos de
descontração.
À nova guarda do Labmetab: Carine, Sérgio “Belezinha”, Gleisson
“Testosterona”, Fernanda, Luis, Marcelo, Carina, Lu, Cris, Paulo, Norton, Gi, Gabi e
todos os estagiários que fizeram deste lugar um ambiente agradável, divertido,
amigável, no qual eu tinha vontade de estar todos os dias.
Às queridas Vanes e Luciéle que já partiram, mas ainda não se enquadram na
“velha-guarda”, pelas conversas, apoio, ajuda e amizade.
Aos meus fiéis escudeiros que tanto me apoiaram e me ajudaram nos
experimentos: Sandrinho, Diogo “Estress”, Ana Lúcia e em especial a Fabizinha, que
esteve sempre do meu lado me incentivando e cujo apoio me fez chegar até aqui.
À Kátia, companheira de Imunobllotting, por sempre estar disposta a me
ajudar, ao Fernando, pelo auxílio no Facs e ao Chico, por toda ajuda, conselhos,
sugestões e apoio.
Aos amigos do mestrado Marquitcho, Ana, Ene, Clarice, Kethy e em especial
ao “Denis”, meu amigão e companheiro de todas as horas.
Às minhas mais novas e grandes amigas “Candy” e Keila pela amizade,
companhia, apoio, festas e risadas.
Aos meus amigos da faculdade por todos os momentos de descontração,
pelos encontros sempre divertidos, pelas risadas e pela torcida: Rafa N., Pá, Zé,
Gilson, Sil, Lu, Cy, Kleiton, André, Thá, Gu e Jô (um pouco distantes) e em especial
a Ferzinha, que esteve sempre do meu lado e com quem sei que sempre poderei
contar.
Ao Rafa pela companhia, amizade, apoio, incentivo, carinho e amor durante
todo o tempo que passamos juntos.
As minhas amigas e amigos de infância, adolescência ou de coração: Calola,
Paty, Pati Bert, Sibele, Cynara, Fer, Chrys, Rose, Mi, Toty, Aline, Heitor, Jean, Edu
entre tantos, pelas risadas, pela diversão, pelo ombro amigo e por tudo que aprendi
com a amizade de vocês.
Ao meu grande amigo Samir pela amizade, pelo apoio, pelas conversas,
risadas, por tudo que fez e faz por mim e por ser meu anjo da guarda.
A minha primona do coração Lígia, que sempre me recebe de braços abertos
e acredita em mim, por todo seu apoio, amizade e carinho.
Às minhas gatinhas lindas, Zara e Zinha, pela companhia diária, carinho,
amor e alegria e por terem me ensinado a respeitar ainda mais os animais.
À minha psicóloga por ajudar a me tornar uma pessoa mais forte e segura.
À minha família linda, meus avós (já no céu), minha vózinha postiça, minhas
tias, tios e primos por terem me propiciado um ambiente saudável, de amizade e
alegria no qual eu pude crescer.
Aos meus irmãos maravilhosos, que sempre acreditaram em mim, por todo
apoio, amor e proteção e por tudo que fizeram por mim para que eu pudesse chegar
aonde cheguei.
Às minhas sobrinhas queridas, que me fazem sentir especial e que eu amo
muito, por todo carinho, alegria, afeto e amor que me deram.
À minha mãe, uma mulher divertida, alegre e caridosa, por todo seu amor,
sua força, coragem, apoio, compreensão, conversas e incentivo em todos os
momentos da minha vida. Obrigada por me ajudar a ser a mulher que sou hoje.
Ao meu pai, que já não está mais aqui, por tudo que fez por mim. Sinto muito
a sua falta e gostaria muito que pudesse estar aqui presente, mas tenho certeza que
olha por mim de onde estiver.
À Deus, que sempre esteve ao meu lado, por todas as oportunidades e por ter
colocado tantas pessoas especiais em minha vida.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................ix
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................xi
RESUMO..................................................................................................................xiii
ABSTRACT...............................................................................................................xiv
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................1
1.1. Câncer..................................................................................................................1
1.2. Genética e câncer ................................................................................................2
1.3. Nutrição e câncer .................................................................................................7
1.3.1. Ácidos graxos: nomenclatura e efeitos...........................................................8
1.3.2. Peroxidação lipídica .....................................................................................10
2. OBJETIVOS..........................................................................................................12
3. MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................13
3.1. Animais...............................................................................................................13
3.2. Reagentes, enzimas, soluções e ácidos graxos.................................................13
3.4. Complexação do óleo de peixe à albumina........................................................14
3.5. Tumor de Walker 256 .........................................................................................14
3.5.1. Obtenção das células do tumor de Walker 256............................................14
3.6. Coleta e separação das células .........................................................................15
3.7. Cultivo das células tumorais com óleo de peixe-BSA complexado ....................15
3.7.1. Proliferação celular .................................................................................................................... 15
3.7.2. Peroxidação lipídica .................................................................................................................. 16
3.7.3. Atividade da catalase ...................................................................................17
3.7.4. Determinação da apoptose em citômetro de fluxo .......................................18
3.7.5. Ensaio de extração protéica .........................................................................19
3.7.6. Quantificação protéica..................................................................................19
3.8. Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
..................................................................................................................................20
3.8.1. Corrida das proteínas no gel de poliacrilamida ............................................20
3.9. Western blotting .................................................................................................21
3.10. Análise Estatística ............................................................................................21
4. RESULTADOS......................................................................................................22
4.1. Proliferação de células do tumor de Walker 256 em cultura ..............................22
4.2. Apoptose e necrose em células do tumor de walker 256 ...................................23
4.3. Fotomicrografias das células tumorais ...............................................................25
4.4. Peroxidação lipídica das células tumorais..........................................................27
4.5. Atividade da enzima catalase nas células tumorais ...........................................28
4.6. Expressão das proteínas AKT, ERK, Bcl-2 e Bax em células do tumor de walker
256 ............................................................................................................................29
5. DISCUSSÃO .........................................................................................................34
6. CONCLUSÕES .....................................................................................................42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................43
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – ácido araquidônico
Abs – absorbância
AGPI – ácidos graxos poliinsaturados
AMP – adenosine monophosphate
Bax – Bcl-2 antagonist X
BHT – butylated hydroxytoluene
BSA – bovine seric albumin
CEEA – comissão de ética na experimentação animal
COX – ciclooxigenase
cpm – contagem por minuto
CRE – cyclic AMP response element
CREB – CRE-binding protein
DHA – docosahexaenoic acid
EDTA – ethylenediaminetetracetic acid
EGTA - ethylene glycol-bis-(b-aminoethyl ether)-tetra-acetic acid
ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay
EPA – eicosapentaenoic acid
epm – erro padrão da média
ERK – extracellular signal-regulated kinase
FOX – ferrous oxidation/xylenol orange
GAP – GTPase activating protein
GDP – guanosin diphosphate
GF – growth factor
Grb2 – growth factor receptor-bound protein 2
GTP – guanosin triphosphate
HRP – horseradish peroxidase
ID – inferior direito
IE – inferior esquerdo
I-B – inhibitor of kappa B
IKK – IB kinase
ILK – integrin linked kinase
JNK – c-Jun N-terminal
MAPK – mitogen-activated protein kinase
MAPKK – mitogen-activated protein kinase kinase
MAPKKK – mitogen-activated protein kinase kinase kinase
MEK – MAPK kinase
MeOH – Metanol
n-3 – ômega-3
n-6 – ômega-6
NF-B – nuclear factor kappa B
OP – óleo de peixe
PBS – phosphate-buffered saline
PDK – 3-phosphoinositide-dependent kinase
PG – Prostaglandinas
PI – propidium iodide
PI-3K – phosphatidylinositol 3-kinase
PIP2 – phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
PIP3 – phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate
PKB – protein kinase B
PKC – protein kinase C
PLA2 – phospholipase A2
ROS – reactive oxygen species
rpm – rotações por minuto
RPMI - Roswell Park Memorial Institute
RTK – receptor tyrosine kinase
S473 – resíduo de serina na posição 473 da proteína Akt
SAPK – stress-activated protein kinase
SD – superior direito
SDS – sodium dodecyl sulphate
SDS-PAGE – SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
SE – superior esquerdo
SFB – soro fetal bovino
SOS – son of sevenless
T308 – resíduo de treonina na posição 308 da proteína Akt
TEMED – tetramethylethylenediamine
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema geral da via da ERK.................................................................04
Figura 2 – Mecanismo de ativação da PKB/Akt........................................................05
Figura 3 – Proliferação das células de tumor de Walker 256, através da
incorporação de (2-14C)-timidina em DNA, cultivadas na presença de meio de cultura
RPMI (Meio), BSA 2% (BSA) e óleo de peixe-BSA complexado (OP).......................22
Figura 4 – Gráfico de density plot mostrando a incorporação de anexina V e/ou PI
pelas células tumorais cultivadas em meio de cultura...............................................23
Figura 5 – Gráfico de density plot mostrando a incorporação de anexina V e/ou PI
pelas células tumorais cultivadas na presença de BSA 2%.......................................24
Figura 6 – Gráfico no formato density plot mostrando a incorporação de anexina V
e/ou PI pelas células tumorais cultivadas na presença de óleo de peixe complexado
a BSA 2% ..................................................................................................................24
Figura 7 – Porcentagem de células tumorais marcadas com anexina V e PI,
cultivadas na presença de meio de cultura RPMI (Meio), BSA 2% (BSA) e óleo de
peixe-BSA complexado (OP)......................................................................................25
Foto 1. Células tumorais cultivadas em meio de cultura, por 24 h............................26
Foto 2. Células tumorais cultivadas na presença de BSA 2%, por 24 h...................26
Foto 3. Células tumorais cultivadas na presença de óleo de peixe-BSA complexado,
por 24 h......................................................................................................................27
Figura 8 – Taxa de peroxidação lipídica das células tumorais cultivadas na presença
de meio de cultura RPMI (Meio), BSA 2% (BSA) e óleo de peixe-BSA complexado
(OP)............................................................................................................................28
Figura 9 – Atividade da enzima catalase das células tumorais cultivadas na
presença de meio de cultura RPMI (Meio), BSA 2% (BSA) e óleo de peixe-BSA
complexado (OP)........................................................................................................29
Figura 10 – Expressão da proteína AKT em células cultivadas em meio RPMI
(Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe complexado
a BSA 2% (OP)...........................................................................................................30
Figura 11 – Expressão da proteína ERK 1/2 em células cultivadas em meio RPMI
(Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe complexado
a BSA 2% (OP)...........................................................................................................31
Figura 12 – Expressão da proteína Bcl-2 em células cultivadas em meio RPMI
(Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe complexado
a BSA 2% (OP)...........................................................................................................32
Figura 13 – Expressão da proteína Bax em células cultivadas em meio RPMI (Meio),
na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe complexado a BSA
2% (OP)......................................................................................................................33
Esquema 1 – Vias de sinalização em células cuja membrana é rica em AGPI n-6
(Figura A) e n-3 (Figura B).........................................................................................41
RESUMO
O consumo excessivo de gorduras saturadas e de ácidos graxos poliinsaturados
(AGPI) n-6 associado à baixa ingestão de AGPI n-3, facilitam o desenvolvimento de
câncer. Vários estudos mostram que dietas com baixo teor de gordura, ricas em
AGPI n-3, podem prevenir o desenvolvimento e progressão do câncer e que estes
ácidos têm efeito significativo sobre crescimento e proliferação celular, exibindo
atividade anti-tumoral em diversas linhagens de células cancerosas e também sobre
o tumor de Walker 256, in vivo. A atividade anti-tumoral exercida pelo óleo de peixe
tem sido aventada como resultado da inibição do crescimento celular e/ou do
aumento da apoptose das células tumorais. Os AGPI n-3 podem atuar sobre genes
e vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento tumoral. A via da MAPK ERK é
uma das mais importantes para proliferação celular e há evidências de que esta via
esteja envolvida na patogênese e progressão de tumores. Outra quinase serinatreonia envolvida com progressão tumoral é a PKB/Akt, a qual tem ação antiapoptótica, contribuindo para sobrevivência celular. Ainda, as proteínas Bax (próapoptótica) e Bcl-2 (anti-apoptótica) também têm sido mostradas participarem do
desenvolvimento tumoral. A ação inibitória das dietas ricas em AGPI n-3 sobre o
crescimento tumoral pode ocorrer também via peroxidação lipídica. Neste estudo
investigamos in vitro, os possíveis agentes intracelulares arrolados como
participantes das vias de apoptose e mitogênese. Para tanto, células ascíticas do
tumor de Walker 256 foram cultivadas em meio de cultura RPMI-1640 (Meio), na
presença do veículo albumina sérica bovina 2% (BSA) ou do óleo de peixe
complexado à BSA (OP). Foram analisadas a proliferação das células, através da
incorporação de [2-14C]-timidina em DNA; apoptose e necrose por citometria de
fluxo; peroxidação lipídica pelo método FOX; atividade da enzima catalase;
expressão de proteínas envolvidas na sinalização de morte (Bcl-2 e Bax) e de
proliferação celular (PKB/Akt e ERK 1/2). O óleo de peixe-BSA complexado (OP) foi
capaz de reduzir a proliferação das células tumorais em 4 vezes e aumentar em 20
vezes a morte destas células, por apoptose ou necrose, quando comparadas às das
células cultivadas apenas em meio de cultura e BSA. Estas ações do óleo de peixe
sobre as células tumorais envolveu uma elevação da taxa de peroxidação lipídica,
que foi aproximadamente 4 vezes maior, redução da atividade da catalase em
aproximadamente 6 vezes e diminuição significativa na expressão das proteínas
PKB/Akt, ERK 1/2 e Bcl-2. A proteína Bax não teve sua expressão alterada na
presença de óleo de peixe-BSA complexado. Todos estes mecanismos de ação do
óleo de peixe parecem interligados, e sua ação anti-tumoral parece ser a somatória
de mudanças na composição da membrana, alterações nas vias de transdução de
sinais e talvez na expressão de genes que levam a sinais de proliferação e
apoptose.
ABSTRACT
The increased consumption of saturated fat and n-6 polyunsaturated fatty acids
(PUFA) along with reduction of n-3 PUFA favors tumors development. Several
studies indicate that low fat diets, rich in n-3 PUFA, prevent the development and
progression of tumors in several lineages and also suppress cell growth and
proliferation in Walker 256 tumor, in vivo. Tumor growth reduction by n-3 PUFA can
occur either by the inhibition of cellular proliferation and/or by the induction of
necrotic or apoptotic cell death. The n-3 PUFA effects could be on gene expression
and signal transduction pathways involved in tumor development. The ERK MAPK
pathway is one of the most important for cell proliferation and this pathway is
involved in the pathogenesis and progression of cancer. PKB/Akt is another serinethreonine protein kinase that has been implicated in tumor progression having an
antiapoptotic action, therefore contributing to cell survival. Bax (pro-apoptotic) and
Bcl-2 (antiapoptotic) proteins have also been associated with tumor development.
The n-3 PUFA antitumor effect can also occur through lipid peroxidation. The present
study investigate, in vitro, the possible intracellular mechanisms involved in
apoptosis and mitogenesis pathways. Walker 256 tumor ascitic cells were seeded in
RPMI-1640 culture medium (Medium), in the presence of bovine seric albumin 2%
(BSA) or fish oil-BSA complex (FO). The followig assays were performed: cell
proliferation by [2-14C]-thymidine incorporation into DNA, apoptosis and necrosis by
flow cytometry, lipid peroxidation by FOX method, catalase enzime activity,
expression of proliferation-associated (PKB/Akt, ERK 1/2) and cell death-associated
(Bcl-2, Bax) proteins. Fish oil-BSA complex was able to reduce in about four-fold the
tumor cell proliferation and increase in 20-fold the cell death when compared to
untreated cells (Medium and BSA). The fish oil effects involved lipid peroxidation
increase and reduction of the catalase enzime activity, along with PKB/Akt, ERK 1/2
and Bcl-2 proteins expression. Bax expression was not changed. We suggest that all
these mechanisms are interconnected and the antitumor activity of fish oil might be
due to the combination of cell membrane fluidity and signaling transduction
pathways alteration with proliferative and apoptotic gene expression modification.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer
A integridade e função de um tecido são conferidas por um equilíbrio entre
proliferação e morte celular, o qual é mantido por um complexo sistema de
sinalização intra e extracelular. Quando este equilíbrio é perdido, as células passam
a se proliferar de maneira descontrolada, formando uma massa de células que
constituem um tumor primário. Algumas células do tumor primário podem perder a
capacidade de adesão e invadir a membrana basal do tecido que lhe deu origem
através da produção de enzimas proteolíticas. Assim, atravessam as paredes dos
vasos sanguíneos, caem na circulação e formam áreas de proliferação em outros
tecidos denominadas metástases (FERREIRA & ROCHA, 2004).
O aparecimento de tumor está associado a alterações genéticas que se
acumulam no material genético (DNA) da célula. A perda do controle da proliferação
e
a
aquisição
de
características
associadas
à
progressão
tumoral
são
conseqüências destas alterações. A célula alterada adquire maior capacidade de
proliferação em relação às células vizinhas e sofre expansão clonal, transmitindo,
geneticamente, a alteração para as células que se originam a partir dela. Devido à
complexidade e à existência de vias alternativas no controle da proliferação celular,
é necessária a ocorrência de alterações adicionais e sucessivas em diferentes
genes para que haja a formação de tumor. Cada nova alteração é acompanhada de
onda de expansão clonal e, ao final deste processo, surge uma população celular
com grande potencial de crescimento e invasão, um tumor maligno. Assim, o câncer
pode ser considerado como doença genética complexa resultante de alterações
simultâneas em genes geralmente relacionados à proliferação, diferenciação e morte
celular (FERREIRA & ROCHA, 2004).
A denominação câncer é dada somente para tumores malignos, cujas células
têm a capacidade de invadir tecidos vizinhos. Os cânceres são classificados de
acordo com o tecido e tipo celular que lhe dão origem. Cânceres que se originam de
células epiteliais são chamados carcinomas; aqueles que se originam de tecidos
conjuntivos ou musculares são denominados sarcomas; e cânceres que não se
enquadram nestas categorias incluem as várias leucemias, derivadas de células
hematopoiéticas e cânceres derivados do sistema nervoso. Em paralelo com o
conjunto de nomes para tumores malignos, há um conjunto de nomes relacionados
aos tumores benignos: adenoma, por exemplo, é tumor epitelial benigno com
organização glandular; condroma é tumor benigno de cartilagem e seus tipos
correspondentes de tumor maligno são respectivamente adenocarcinoma e
condrosarcoma (ALBERTS et al., 2002).
1.2. Genética e câncer
Hanahan e Weinberg (2000) sugerem que o vasto catálogo de genótipos de
células cancerosas seja a manifestação de seis alterações essenciais na fisiologia
da célula que coletivamente ditam o crescimento maligno: auto-suficiência em sinais
de crescimento, insensibilidade a sinais inibidores de crescimento, evasão da morte
celular
programada
(apoptose),
potencial
replicativo
ilimitado,
angiogênese
sustentada e invasão tecidual e metástase.
Funcionalmente, os genes ligados ao câncer podem pertencer aos seguintes
grupos: oncogenes, genes supressores tumorais e genes mutantes. Oncogenes são
usualmente derivados de seus correlatos celulares normais, os proto-oncogenes, os
quais em sua forma não-mutada funcionam como componentes essenciais das vias
de sinalização intracelular. Eles compreendem ligantes, receptores, trocadores
moleculares, transdutores de sinais citoplasmáticos e fatores de transcrição.
Heterogeneidade funcional também é vista entre proteínas com atividades
supressoras tumorais, as quais incluem ligantes, fosfatases, acetilases e fatores de
transcrição. Mutações nestes genes eliminam o impacto negativo no crescimento e
sobrevivência e, portanto, contribuem para a formação tumoral. Produtos de genes
mutantes normalmente funcionam na manutenção da estabilidade genética
assegurando a integridade genômica. A perda funcional destes permite o acúmulo
de número suficiente de mutações necessárias para a ocorrência do processo de
transformação (HANAHAN & WEINBERG, 2000).
As proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) pertencem a uma
grande família de quinases serina-treonina e formam as principais vias de
sinalização de proliferação celular da superfície da célula ao núcleo (DONG, DAVIS
& FLAVELL, 2002). Existem três principais subfamílias de MAPK: as quinases
reguladas por sinais extracelulares (MAPK ERK, Ras/Raf1/MEK/ERK); as proteínas
quinases ativadas por stress ou c-Jun N-terminal (SAPK ou JNK) e a MAPK14. Já
está bem estabelecido que estas cascatas de sinalização levam à expressão gênica
alterada em seres humanos (HOMMES, PEPPELENBOSCH & VAN DEVENTER,
2003).
A via da MAPK ERK é uma das mais importantes para proliferação celular, e
vários fatores de crescimento e proto-oncogenes transduzem sinais que promovem
crescimento e diferenciação através desta cascata (TROPPMAIR et al., 1994). A
cascata de ERK 1/2 consiste das MAPKKK A-Raf, B-Raf e Raf-1, das MAPKK MEK
1 e MEK 2 e das MAPK ERK 1 e ERK 2, também conhecidas como MAPK p44/42
(ROUX & BLENIS, 2004).
Proteínas Ras (H-Ras, K-Ras e N-Ras) diferem somente na região carboxiterminal, ligam nucleotídeos guanina (GTP e GDP) com alta afinidade e possuem
atividade
GTPase
intrínseca
(SCHLESSINGER,
1993).
Ras
está
predominantemente no estado ligado a GDP e após interação com o complexo de
proteínas adaptadoras Grb2-SOS na membrana plasmática, o GDP é substituído
pelo GTP. Subsequentemente, ele volta ao estado ligado ao GDP através da
atividade de uma proteína ativadora de GTPase (GAP) (FEIG, 1994). No seu estado
ativado, ligado a GTP, a Ras pode ativar a via da MAPK ERK (figura 1) (CAMPBELL
et al., 1998) e, adicionalmente, interagir com e ativar a PI-3K, resultando na ativação
da Akt (MARTE & DOWNWARD, 1997).
O proto-oncogene Raf-1 é o substrato mais bem caracterizado da Ras. Uma
vez ativada, a quinase Raf-1 fosforila MEK 1 e MEK 2, que por sua vez fosforila
ERK. Existe também uma intercomunicação substancial, em nível da Raf-1, entre a
via da Raf/MEK/ERK e da via da PI-3K e Akt, sugerindo outros papéis para Raf-1
além da ativação de MEK (SATO, FUJITA & TSURUO, 2004). Quando ativadas, as
enzimas ERK fosforilam vários alvos citoplasmáticos ou migram para o núcleo, onde
fosforilam e ativam vários fatores de transcrição, que regulam genes que aumentam
proliferação celular e protegem as células contra apoptose (LEWIS, SHAPIRO &
AHN, 1998).
Figura 1. Esquema geral da via da ERK. Receptor tirosina quinase ativado (RTK)
causa a relocalização do complexo Grb2-SOS. SOS é um fator trocador de
nucleotídeo guanina para Ras e causa a conversão de Ras-GDP em Ras-GTP, a
qual recruta Raf para a membrana, promovendo sua ativação. Raf ativada fosforila e
ativa MEK, que, por sua vez, estimula atividade da ERK. Adaptado de Baccarini
(2005).
Outra proteína quinase serina-treonina, a proteína quinase B ou Akt
(PKB/Akt), emergiu como reguladora de processos celulares como apoptose,
proliferação, diferenciação e metabolismo. A interrupção da sinalização normal da
PKB/Akt tem sido documentada como ocorrência freqüente em vários cânceres
humanos e esta enzima parece ter papel importante em sua progressão.
(NICHOLSON & ANDERSON, 2002).
A PKB recebeu este nome por sua alta
homologia com a proteína quinase A e proteína quinase C (PKC) e é conhecida por
existir em três isoformas, ,  e  (Akt 1, Akt 2 a Akt 3, respectivamente)
(VANHAESEBROECK & ALESSI, 2000).
A ativação celular da PKB/Akt é dependente da geração de lipídios de
membrana que contenham inositol, fosforilados pela fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K), a qual é ativada por receptores tirosina-quinase e receptores acoplados à
proteína G. Após seu recrutamento para estes receptores, na membrana plasmática,
a PI-3K é ativada e fosforila o fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) gerando o
segundo mensageiro fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3). PIP3 não ativa a
PKB/Akt diretamente, mas, ao invés disso, recruta esta proteína para membrana e
altera sua conformação para permitir que ela seja fosforilada subsequentemente
pela quinase dependente de fosfoinositídio-1 (PDK-1) (Figura 2) (NICHOLSON &
ANDERSON, 2002).
Figura 2. Mecanismo de ativação da PKB/Akt. Em células não estimuladas, a Akt
não é fosforilada e permanece no citosol. Após a ativação do receptor tirosinaquinase (RTK), ou outro receptor (não mostrado), por um fator de crescimento (GF),
PI-3K é recrutada para o receptor e ativada, resultando na produção de PIP3. Este,
por sua vez, recruta Akt para membrana, onde ela é fosforilada no resíduo de
treonina (T308) no domínio catalítico pela PDK-1 e no resíduo de serina (S473) no
domínio regulatório por um mecanismo ainda não definido, possivelmente
envolvendo (a) autofosforilação, (b) PDK-1, (c) quinase ligada a integrina (ILK) ou (d)
uma PDK-2 não identificada. Adaptado de Nicholson & Anderson (2002).
A ativação da PI-3K também pode ocorrer independente de receptor, por
exemplo, em células que expressam constitutivamente proteínas Ras. Como
receptores de superfície estão comumente superexpressos ou constitutivamente
ativos em muitos tipos de tumores, as vias de sinalização subseqüentes estão
frequentemente ativadas (BLUME-JENSEN & HUNTER, 2001).
Um dos meios pelo qual PKB/Akt promove a sobrevivência celular é pela
fosforilação direta de fatores de transcrição que controlam a expressão de genes pró
e anti-apoptóticos. PKB/Akt parece regular tanto negativamente fatores que
promovem a expressão de genes de morte celular quanto positivamente fatores que
induzem sobrevivência celular (NICHOLSON & ANDERSON, 2002).
O fator de transcrição NF-B está envolvido na regulação da proliferação
celular, apoptose e sobrevivência via ampla gama de citocinas e fatores de
crescimento. Vários estudos indicam que ele é crítico na tumorigênese (BALDWIN,
2001). O NF-B é regulado através da sua associação com o co-fator inibidor I-B, o
qual seqüestra NF-B no citoplasma. Fosforilação do I-B, por quinases, conhecidas
como IKK, promove sua degradação permitindo que o NF-B se desloque para o
núcleo e induza seus genes-alvo. PKB/Akt tem sido mostrada interagir com e ativar
IKK. Dados sugerem que PKB/Akt fosforila IKK diretamente, mas, além disso,
acredita-se que seja essencial para a destruição do I-B mediada pelo IKK e para
ativação do NF-B (ROMASHKOVA e MAKAROV, 1999). Estes achados indicam
que esta quinase é reguladora crítica da transcrição gênica dependente de NF-B e
pode ter papel importante em promover a sobrevivência de células cancerosas
(NICHOLSON & ANDERSON, 2002). A ativação de NF-B também tem sido
relacionada com a superexpressão de Bcl-2 (DE
MOISSAC, ZHENG &
KIRSHENBAUM, 1999).
A via da PKB/Akt também está envolvida, em alguns tipos celulares, no
aumento da expressão do gene anti-apoptótico Bcl-2. A região promotora da Bcl-2
contém um sítio de elemento responsivo ao AMP cíclico (CRE), e o fator de
transcrição proteína ligadora do CRE (CREB) foi identificado como regulador positivo
da expressão da Bcl-2. A PKB/Akt tem como um de seus alvos a CREB e a
fosforilação desta proteína ocorre em um sítio que aumenta a ligação da CREB a
proteínas acessórias necessárias para indução de genes que contém CRE em suas
regiões promotoras (PUGAZHENTHI et al., 2000).
Em 1993, os primeiros membros pró-apoptóticos da família Bcl-2 foram
reportados. Bax (antagonista X da Bcl-2) foi identificada como uma proteína que
interage com a Bcl-2, opondo a sua atividade e promovendo a morte celular
apoptótica (OLTVAI, MILLIMAN & KORSMEYER, 1993). As localizações favoritas
desta proteína são a membrana externa da mitocôndria e as membranas do retículo
endoplasmático. As ações da Bax nas membranas mitocondriais têm sido
extensivamente estudadas, evidenciando que esta controla a permeabilidade da
membrana externa da mitocôndria, portanto promovendo a liberação de proteínas
apoptogênicas, como citocromo c, destas organelas (MARTINOU & GREEN, 2001).
Existe também a possibilidade destas proteínas controlarem alguns aspectos da
permeabilidade da membrana interna da mitocôndria, cuja integridade é necessária
para manter o gradiente de H+ que propicia a força para geração de ATP e o fluxo de
elétrons através da cadeia respiratória; o rompimento da mesma poderia levar a
geração de espécies reativas de oxigênio e depleção de ATP, culminando em
necrose (REED, 2006).
1.3. Nutrição e câncer
Nas últimas duas décadas, através de técnicas de biologia molecular, foi
mostrado que fatores genéticos determinam a suscetibilidade a doenças e que
fatores ambientais determinam quais indivíduos geneticamente suscetíveis serão
afetados (SIMOPOULOS, 2001). A nutrição é um dos fatores ambientais de maior
importância. Geneticamente falando, os seres humanos vivem hoje num ambiente
nutricional que difere daquele onde nossa constituição genética foi selecionada.
Estudos sobre aspectos evolucionários da dieta indicam que grandes mudanças
ocorreram em nossa dieta, particularmente no tipo e quantidade de ácidos graxos
essenciais, e no conteúdo de antioxidantes dos alimentos (SIMOPOULOS, 1999).
Estudo evolutivo da dieta humana mostra que nossos ancestrais, a partir do
período Paleolítico, consumiam grande quantidade de proteínas, cálcio, potássio e
agentes antioxidantes. Com a industrialização, houve aumento das calorias obtidas
a partir das gorduras, em particular as saturadas, as trans e os ácidos graxos n-6,
associado ao decréscimo na ingestão de n-3, antioxidantes e cálcio, em particular
nas populações Ocidentais. Este aumento no consumo de n-6 nos últimos 100 anos
foi devido ao desenvolvimento da tecnologia na extração de óleos vegetais para uso
na culinária doméstica (SIMOPOULOS, 2002).
As rápidas mudanças em nossa dieta foram potentes promotoras de doenças
crônico-degenerativas como aterosclerose, hipertensão, obesidade, diabetes e
muitos cânceres (SIMOPOULOS, 2002). Fatores nutricionais vêm sendo apontados
como críticos na carcinogênese de numerosos tipos de cânceres. Estudos em
migrantes que mudaram, de países com baixa incidência de câncer de próstata,
para a América do Norte onde a incidência é grande, sugerem que fatores
ambientais têm influência sobre o desenvolvimento do neoplasma mais freqüente
em homens (SCHULMAN, EKANE & ZLOTTA, 2001).
Desde 1960, estudos epidemiológicos sugerem correlação entre ácidos
graxos e aparecimento de tumores. Há estimativa de que 30% de todos os casos
estejam ligados à dieta, demonstrando que o consumo excessivo de gorduras
saturadas e ácidos graxos n-6 e a baixa ingestão de ácidos graxos n-3, facilitam o
aparecimento de doenças cardiovasculares e câncer (MCENTEE & WHELAN, 2002).
1.3.1. Ácidos graxos: nomenclatura e efeitos
Ácidos graxos são cadeias de hidrocarbonetos com um grupo carboxila no
terminal “” (polar) e um grupo metila no terminal "n" (apolar). Os carbonos podem
estar conectados por ligações simples ou duplas. O número de carbonos na cadeia
e o tipo de ligação entre os carbonos dão origem a diferentes tipos de ácidos graxos.
As ligações entre todos os carbonos nos ácidos graxos saturados são
completamente saturadas com hidrogênio e são ligações simples. Ácidos graxos
monoinsaturados e poliinsaturados possuem ligações que não são saturadas com
hidrogênio, portanto uma ou mais duplas ligações conectam os carbonos. A primeira
dupla ligação em um ácido graxo ômega-3 (n-3 ou -3) ocorre no terceiro carbono a
partir do terminal metila. Mamíferos, incluindo humanos, podem sintetizar ácidos
graxos saturados e monoinsaturados (n-9), mas são incapazes de sintetizar as
duplas ligações n-6 e n-3. Assim, devido sua importância como componentes
essenciais dos fosfolipídeos da membrana celular e como substrato para várias
enzimas, os ácidos graxos da família n-3 e n-6 são considerados essenciais e
devem ser obtidos na dieta (HARDMAN, 2004).
Os ácidos graxos da família n-3 podem ser consumidos como ácido linolênico (18:3 n-3), que é encontrado em várias quantidades em alguns óleos como
canola (11%), linhaça (57%) e de soja (8%) e em vegetais folhosos verdes. Ácidos
graxos n-3 de cadeia longa, principalmente os ácidos eicosapentaenóico (EPA - 20:5
n-3) e docosahexaenóico (DHA - 22:6 n-3) são encontrados em peixe e óleos de
peixe. Os ácidos graxos da família n-3 e n-6 não podem ser interconvertidos, mas
ambos podem ser alongados e dessaturados para formar outros ácidos graxos da
mesma família (HARDMAN, 2004).
Estudos experimentais mostraram que os ácidos graxos poliinsaturados
(AGPI), particularmente os pertencentes à família ômega-3 (presentes no óleo de
peixe), possuem papel essencial na regulação do equilíbrio energético do organismo
(PRICE, NELSON & CLARKE, 2000). Estes ácidos têm a habilidade de diminuir a
síntese de prostaglandina E2 (PGE2) e podem agir aumentando os mecanismos de
defesa contra células tumorais e a suscetibilidade das células tumorais a fármacos,
através de mudanças na composição da membrana celular (GOGOS et al., 1998).
Os possíveis mecanismos de inibição do crescimento tumoral, pelo óleo de peixe,
envolvem seus efeitos na fração fosfolipídica da população de células imunitárias, na
alteração da estrutura da membrana celular e em mudanças na transdução de sinais
celulares que influenciam crescimento e proliferação celular (MARSHALL &
JOHNSTON, 1983).
Várias linhas de evidências indicam que dietas com baixo teor de gordura,
ricas em ácidos graxos n-3, podem prevenir o desenvolvimento e progressão do
câncer de próstata e que dietas, com alto teor de gordura, ricas em ácidos graxos n6, podem promover o crescimento de câncer de próstata (GODLEY et al., 1996;
NORRISH et al., 1999). Em resposta a uma variedade de estímulos, o ácido graxo n6 (ácido araquidônico - AA) é liberado dos fosfolipídios de membrana e convertido
pela ciclooxigenase-2 (COX-2) em PGE2, que tem sido implicada na carcinogênese.
Inversamente, dieta rica em n-3 pode prevenir o desenvolvimento do câncer de
próstata por aumentar a razão de ácidos graxos n-3/n-6 nas membranas celulares.
Os ácidos graxos n-3 (EPA e DHA) competem com o n-6 como substratos para a
enzima COX-2 e isto resulta na produção de prostaglandinas (PG) e leucotrienos
das séries 3 e 5, respectivamente, onde a PGE3 não possui efeito mitogênico
(CULP, TITUS & LANDS, 1979).
Prostaglandinas da série E2, que promovem a sobrevivência da célula
tumoral, têm sido encontradas em concentrações mais elevadas em tecidos tumorais
do que em tecidos normais (CHULADA et al., 2000). Elas medeiam esta
sobrevivência por inibir a apoptose da célula tumoral e induzir sua proliferação
(SUMITANI et al., 2001), além de induzirem a angiogênese e metástase (CHAN et
al., 1999). Além disso, a PGE2 aumenta a progressão tumoral por alterar a
morfologia, motilidade e migração celular (GATELY, 2000).
1.3.2. Peroxidação lipídica
Um possível mecanismo pelo qual os AGPI n-3 poderiam estar atuando na
inibição
do
desenvolvimento
tumoral
é
através
da
peroxidação
lipídica.
Durante a peroxidação lipídica, uma molécula de oxigênio polar (grupo
hidroperóxido) é introduzida nas caudas hidrofóbicas de ácidos graxos insaturados.
A presença do grupo hidroperóxido desestabiliza as interações lipídeo/lipídeo e
lipídeo/proteína, o que leva às alterações estruturais das biomembranas e
lipoproteínas. Além disso, lipídeos hidroperóxidos são fontes para a formação de
radicais livres, que podem induzir modificações secundárias em outras membranas e
constituintes lipoprotéicos. Quando a bicamada lipídica das biomembranas é
oxidada, ela pode perder sua função de barreira e, portanto, colocar a integridade
das organelas subcelulares ou da célula toda em risco (KUHN & BORCHERT, 2002).
O fato da apoptose, em alguns casos, ser mediada por espécies reativas de
oxigênio (ROS) - moléculas quimicamente reativas derivadas de oxigênio - pode ser
devido ao dano causado ao DNA pelas ROS, mas também está relacionado ao
aumento da permeabilidade mitocondrial, liberação do citocromo c, aumento do Ca2+
intracelular e outros efeitos (KROEMER, DALLAPORTA & RESCHE-RIGON, 1998).
Ainda assim, as células tumorais poderiam se proteger dos danos causados pelos
radicais livres. Primeiro, a formação do ânion superóxido é limitada em tecidos
pobremente vascularizados, relativamente hipoxêmicos, como ocorre no centro de
grandes tumores sólidos. Segundo, concentrações aumentadas da catalase e
glutationa peroxidase (enzimas antioxidantes) podem diminuir o peróxido de
hidrogênio e então reduzir a formação do tóxico radical hidroxil (SINHA, 1989).
O mecanismo pelo qual os ácidos graxos n-3 atuam promovendo apoptose e,
consequentemente, a redução do desenvolvimento tumoral ainda não é conhecido.
Aventa-se que a suplementação crônica com o n-3 reduz crescimento tumoral,
possivelmente por alterar a peroxidação lipídica e/ou produção de eicosanóides pelo
tumor entre outros mecanismos.
Dados de nosso laboratório (OTA, 2002; BONATTO, 2003; TOGNI et al.,
2003; PINTO et al., 2004) demonstraram que o AGPI -3 é capaz de diminuir a taxa
de crescimento tumoral e o grau de caquexia em animais portadores de tumor.
MUND (2004) mostrou que a suplementação com óleo de peixe foi capaz de reduzir
a taxa de proliferação das células tumorais ex vivo, a expressão de COX-2 e a
concentração de prostaglandinas E2 plasmáticas além de aumentar a taxa de
apoptose e peroxidação lipídica.
Uma vez que a ação do óleo de peixe é de amplo espectro quanto a promover
a redução do crescimento tumoral bem como a morte celular e ainda que vários
mecanismos descritos foram mostrados acontecer no modelo do tumor de Walker
256, nós investigamos in vitro, os possíveis agentes intracelulares que têm sido
arrolados como participantes das vias de apoptose e mitogênese.
2. OBJETIVOS
O objetivo deste estudo foi investigar, em tumor ascítico de Walker 256, in
vitro, a ação do óleo de peixe sobre as proteínas intracelulares envolvidas nas vias
de apoptose e proliferação celular. Para alcançar estes objetivos nós investigamos:
 A proliferação das células tumorais ascíticas cultivadas na presença de óleo de
peixe, através da incorporação de [2-14C]-timidina em DNA;
 Apoptose e necrose por citometria de fluxo;
 A taxa de peroxidação lipídica e a atividade da enzima catalase nestas células;
 A expressão de proteínas envolvidas na sinalização de morte (Bcl-2 e Bax) e
proliferação celular (AKT e ERK).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais
Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo CEEA do
Setor de Ciências Biológicas-UFPR. Ratos albinos machos da linhagem Wistar com
70 dias, obtidos do Biotério do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Paraná, submetidos a ciclo claro/escuro (12/12) com água e alimentação à
vontade, em ambiente com temperatura controlada de 23  1ºC, foram utilizados
neste estudo. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Metabolismo
Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Paraná.
3.2. Reagentes, enzimas, soluções e ácidos graxos
Todos os componentes dos tampões foram obtidos da Reagen Quimibrás
Indústria Brasileira S/A. Xilenol laranja, hidroxitolueno butilado (BHT), albumina
sérica bovina (BSA) e iodeto de propídeo (PI) foram provenientes da Sigma
Chemical Co (St Louis, MO - EUA). Meio de cultura (RPMI 1640), antibiótico
(penicilina e estreptomicina) e soro fetal bovino (SFB) foram obtidos da Gibco (Grand
Island, NY - EUA). A anexina V proveniente da BD Biosciences (San Diego, CA EUA). As cápsulas de óleo de peixe foram cedidas gentilmente pela Fundação
Herbarium, contendo 1g/cápsula na proporção de 0,192 g de EPA e 0,124g de DHA.
O material radioativo - [2 -
14
C]-timidina (50 mCi/mmol) - foi obtido da New
England Nuclear Research Products (Du Pont Company - Biotechnology Systems EUA).
Os anticorpos Akt 1/2, Bcl-2 e Bax foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology
(Santa Cruz, CA - EUA) e o anticorpo p44/42 MAP (ERK 1/2) obtido da Cell
Signalling Technology (Danvers, MA - EUA).
3.4. Complexação do óleo de peixe à albumina
O óleo de peixe foi solubilizado em solução de albumina sérica bovina (BSA)
a 2% em meio RPMI-1640 filtrada (2 m) em câmara de fluxo laminar. Devido às
propriedades hidrofóbicas do óleo de peixe presente nas cápsulas, este foi filtrado
em filtro hidrofóbico de 2 m com auxílio de seringa estéril também na câmara de
fluxo e então complexado com a albumina 2% presente no meio RPMI-1640 por um
período de 24 horas na proporção de 1:10. Após este período, as gotículas de
gordura não complexadas foram retiradas com auxílio de pipeta tipo Pasteur e a
solução armazenada em geladeira.
3.5. Tumor de Walker 256
O tumor de Walker 256 é um carcinosarcoma que se desenvolveu
espontaneamente na região da glândula mamária de uma rata grávida em 1928, no
laboratório de George Walker no “John Hopkins University School of Medicine”. A
massa tumoral era do tamanho de uma noz grande e estava localizada na parte
inferior da parede abdominal. Nas duas primeiras gerações, o tumor de Walker
cresceu satisfatoriamente em apenas alguns animais injetados. Entre 1953 e 1954,
Sugiura transplantou o tumor em 500 ratos da linhagem Sherman, obtendo 100% de
crescimento e observou regressão em apenas 2% destes. O tumor tornou-se
palpável após uma semana de inoculação, sendo os animais mortos dentro de 6
semanas, quando o tumor media aproximadamente 5 centímetros de diâmetro
(STEWART, 1959).
3.5.1. Obtenção das células do tumor de Walker 256
Foi injetado intraperitonealmente em um rato macho adulto 1 mL de
suspensão de 107 células do tumor de Walker 256. Após aproximadamente cinco
dias, quando constatada a ascite, o animal foi ortotanaziado e injetado 10 mL de
solução salina 0,9% em sua cavidade abdominal. Em seguida, seu abdômen foi
massageado, aberto e, com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur, retirou-se da
cavidade abdominal o fluído contendo as células tumorais.
3.6. Coleta e separação das células
As células tumorais foram coletadas em tubo contendo EDTA 2% e mantidas
sob refrigeração. Estas foram então centrifugadas no próprio tubo de coleta, a 1200
rpm (Centrífuga Eppendorf modelo 5810R) por 7 minutos a 4 ºC. Em seguida, foram
colocadas em solução hemolítica contendo antibiótico e mantidas em banho-maria a
37 ºC por 15 minutos. Foram submetidas, na seqüência, à centrifugação a 1200 rpm
por 7 min a 4 ºC e lavadas com meio de cultura RPMI-1640 enriquecido com 10% de
soro fetal bovino (SFB) e 0,1% de antibióticos (penicilina 10.000 U e estreptomicina
10 mg/L). O sedimentado foi ressuspenso em meio de cultura RPMI contendo SFB e
antibiótico e esta solução foi deixada em placa de petri por 40 minutos para que os
macrófagos presentes no líquido ascítico aderissem e fossem desprezados do resto
dos procedimentos. Após, realizou-se a coleta da solução e as células foram
centrifugadas a 1200 rpm por 7 min a 4 ºC e ressuspensas em meio RPMI-1640 com
SFB e antibióticos. Alíquota foi separada para contagem das células tumorais em
câmara de Neubauer em microscopia de luz.
3.7. Cultivo das células tumorais com óleo de peixe-BSA complexado
3.7.1. Proliferação celular
Células tumorais, 1 x 105 células por poço, foram cultivadas em meio de
cultura RPMI-1640 enriquecido com 10% de soro fetal bovino, contendo 0,1% de
antibióticos (penicilina 10.000 U e estreptomicina 10 mg/L) e 20 L solução (2-14C)timidina (0,02 Ci/poço) em placas de 96 poços (volume final de 200 L), a 37 ºC em
atmosfera de 95% ar / 05% CO2, por 24 horas. As células foram cultivadas na
ausência (BSA 2% ou meio RPMI) ou presença de 25 L de óleo de peixe-BSA
complexado. Após 24 horas, as células tumorais foram coletadas automaticamente
em coletor múltiplo (Skatron Combi Multiple Cell Harvester, UK) em papéis filtro nº
11731 (Skatron Combi - UK). Neste processo não há necessidade de processos
extrativos preparatórios para obtenção de DNA celular. Os discos de papéis
contendo a radioatividade incorporada no DNA foram transferidos para tubos
contendo 1 mL de líquido de cintilação (ECOLUME-ICN) e mensurados em contador
Beckman LS 6500. Os resultados foram expressos em contagens por minuto (cpm).
3.7.2. Peroxidação lipídica
Foram cultivadas 106 células por poço em meio de cultura RPMI-1640
enriquecido com 10% de soro fetal bovino e 0,1% de antibióticos (penicilina 10.000
U e estreptomicina 10 mg/L), em placas de 6 poços (volume final de 4 mL), a 37º C
em atmosfera de 95% ar / 05% CO2, por 24 horas. As células foram cultivadas com
óleo de peixe-BSA complexado ou veículo (BSA 2%) ou meio RPMI contendo SFB e
antibiótico. Utilizou-se 1 mL de células, adicionado de 2,5 mL de meio de cultura
RPMI contendo SFB e antibiótico e 500 L de óleo de peixe BSA complexado ou de
BSA 2% ou de meio.
Após 24 horas, as células foram coletadas das placas e transferidas para
tubos de 15 mL, os quais foram centrifugados a 1200 rpm por 7 minutos. O
sobrenadante foi descartado e as células lavadas com tampão fosfato (PBS). O
sedimentado foi ressuspenso em 5 volumes de PBS e congelado para posterior
análise.
A taxa de peroxidação lipídica foi mensurada pelo método FOX ou xilenol
laranja conforme descrevem Jiang, Wollard & Wolff (1991). Este método quantifica a
formação de hidroperóxidos durante a peroxidação lipídica. Baseia-se no princípio
de que hidroperóxidos oxidam ferro a íon férrico e por sua vez este íon se liga ao
corante xilenol laranja.
As células tumorais foram sonicadas em banho de gelo por 10 vezes de 5
segundos (Kerry’s Ultrasonics Ltd). Após, 100 L deste homogenato foram
adicionados a 900 ìL de solução de trabalho, contendo MeOH 90%, 100 M de
xilenol laranja, 25 mM de H2SO4, 4 mM de BHT e 250 M de Fe2SO4. Uma alíquota
do homogenato foi separada para posterior quantificação protéica pelo método de
Bradford.
As amostras foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente e
posteriormente lidas no espectrofotômetro ULTROSPEC 2000 (Pharmacia) em
comprimento de onda de 560 nm. O cálculo para determinação da quantidade de
peroxidação lipídica nas células tumorais foi realizado utilizando-se a seguinte
fórmula:
[Hidroperóxidos] = Abs. x diluição x 106 x  -1 x d-1 x [proteínas]-1
Onde:
[Hidroperóxidos] = concentração em nmol de hidroperóxidos por mg proteínas
Abs. = valor de absorbância registrado a 560 nm após descontar o valor do “branco”
Diluição (da amostra) = 100 L de amostra em 1 mL de volume final, ou seja, 10x.
106 = fator de conversão da unidade milimol para nanomol
 = coeficiente de extinção molar aproximado para H2O2 a 560 nm = 4.3x104 M-1.cm-1
d = caminho óptico = 1 cm
[proteínas] = concentração de proteínas em mg. mL-1
3.7.3. Atividade da catalase
As células tumorais (106 células / poço) foram cultivadas com óleo de peixeBSA complexado ou veículo (BSA 2%) ou meio RPMI contendo SFB e antibiótico em
placas de 6 poços (volume final de 4 mL), como descrito acima. Após 24 horas, as
células foram coletadas das placas e transferidas para tubos de 15 mL, os quais
foram centrifugados a 1200 rpm por 7 minutos. O sobrenadante foi descartado e as
células lavadas com tampão fosfato (PBS). O sedimentado foi ressuspenso em 200
L de PBS e congelado em nitrogênio líquido para posterior ensaio. O princípio do
método, baseado em Aebi (1984), é o decréscimo de absorbância a 240 nm devido
à degradação do peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. As amostras foram
descongeladas, sonicadas em banho de gelo (6 vezes de 4 segundos), transferidas
para eppendorfs e centrifugadas a 9.000 g por 20 min a 4°C.
A quantificação da atividade da enzima foi realizada utilizando-se o programa
Swift II Reaction Kinectics. Para tanto, adicionou-se 10 ìL da amostra em 990 ìL de
meio de reação contendo Tris 1M, EDTA 5mM (pH 7,4) e H2O2 30% 20mM e a
absorbância mensurada a 240 nm durante um minuto e 30 segundos em intervalos
de dois segundos. Uma alíquota da amostra foi separada para posterior
quantificação protéica pelo método de Bradford. A atividade específica da enzima foi
calculada pela seguinte fórmula:
Atividade da Catalase = (ÄAbs min-1 x diluição x Vol total / Vol amostra) /
(Coeficiente de Extinção x [proteínas])
Onde:
Atividade da Catalase = mmol.min-1. mg proteínas-1
ÄAbs min-1 = variação de absorbância em 1 min de intervalo
Diluição = diluição da amostra
Vol total = volume total (amostra + meio de reação) na cubeta
Vol amostra = volume de amostra
Coef. Extinção = coeficiente de extinção do H2O2 = 40 M-1.cm-1
[proteínas] = concentração de proteínas em mg.mL-1
3.7.4. Determinação da apoptose em citômetro de fluxo
Foram cultivadas 106 células tumorais por poço em meio de cultura RPMI1640 enriquecido com SFB e antibióticos, com óleo de peixe-BSA complexado ou
veículo (BSA 2%) ou meio RPMI, em placas de 6 poços (volume final de 4 mL),
como descrito acima. Após 24 h as células foram coletadas das placas e transferidas
para tubos de 15 mL, os quais foram centrifugados a 1200 rpm por 7 minutos. O
sobrenadante foi descartado e as células lavadas com tampão fosfato (PBS). O
sedimentado foi ressuspenso em tampão de ligação contendo Hepes/NaOH 10 mM
(pH7,4), NaCl 140 mM e CaCl2 2,5 mM. Colocou-se então 100 L desta solução em
um tubo próprio para utilização em citômetro e adicionou-se 5 L de anexina V. As
amostras foram agitadas e incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente no
escuro. Após este período, mais 400 L de tampão de ligação foram adicionados e
as amostras lidas em citômetro utilizando-se o canal FL1 para anexina V e FL2 para
iodeto de propídeo (1g/mL), o qual foi adicionado imediatamente antes da leitura.
Os dados estão apresentados na forma de gráficos e foram analisados utilizando-se
o programa WinMDI 2.8.
3.7.5. Ensaio de extração protéica
Foram cultivadas 107 células tumorais por poço em meio de cultura RPMI1640 enriquecido com SFB e antibióticos, com óleo de peixe-BSA complexado ou
veículo (BSA 2%) ou meio RPMI, em placas de 6 poços (volume final de 4 mL),
exatamente como descrito acima.
Após 24 h, as células foram coletadas das placas e transferidas para
eppendorfs identificados, os quais foram centrifugados a 13000 rpm por 10 minutos.
O sobrenadante foi cuidadosamente descartado e as células lavadas com PBS
gelado. O sedimentado formado foi ressuspenso em 100 L de tampão de lise
(mesmo volume do sedimentado) contendo Hepes 20 mM, NaCl 15 mM, MgCl2 1,5
mM , EGTA 1 mM, Glicerol 10%, Triton X-100 1%, SDS (dodecil sulfato de sódio)
0,1% e inibidores de proteases e fosfatases (Pirofosfato de Na 0,1 M, Ortovanadato
de Na 0,1 M, e Fluoreto de Sódio 0,5 M). Após a adição do tampão, os eppendorfs
foram mantidos em gelo e agitados após 5, 10 e 15 minutos.
Transcorrido o tempo de lise celular, os eppendorfs foram centrifugados (10
minutos a 15000 rpm) e o sobrenadante, contendo o extrato celular, transferido para
outro eppendorf identificado e congelado a -20 ºC.
3.7.6. Quantificação protéica
A quantificação protéica foi feita pelo método de Bradford (1976). A
concentração de proteínas das amostras foi calculada com base em curva padrão de
proteína conhecida (albumina sérica bovina). Quando necessário, as amostras foram
diluídas 5 vezes ou mais para não extrapolar a curva da proteína padrão. Foram
plaqueados 250 L de solução de Bradford e 10L de cada um dos padrões ou das
amostras (4 réplicas) em placas de 96 poços e a leitura foi realizada em leitor de
Elisa (Bio-Rad Microplate Reader - Benchmark) a 595 nm.
O cálculo da concentração protéica de cada amostra foi feito a partir da
equação da reta (y = ax + b), sabendo-se que y = absorbância e x = concentração
da amostra. A partir dos valores de absorbância (y) é possível calcular a
concentração da amostra, isolando-se o x. Este valor deve ser multiplicado pela
diluição para se obter a concentração de proteína da amostra em µg/mL.
3.8. Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
Após a quantificação protéica das amostras, foi feita diluição com tampão
Laemmli de forma que a concentração final ficasse 30 µg por poço. É importante que
todas as amostras fiquem em uma concentração protéica única para que isso não
interfira na análise de suas bandas.
O tampão Laemmli possui SDS para desnaturar a proteína e propiciar carga
negativa constante para todas as proteínas; glicerol para dar maior densidade à
amostra do que o tampão de corrida; e -mercaptoetanol (agente redutor)
responsável por quebrar as pontes dissulfeto presentes na amostra, possibilitando a
separação das proteínas em subunidades.
3.8.1. Corrida das proteínas no gel de poliacrilamida
Quando submetidas a um campo elétrico, as proteínas migram de acordo com
vários fatores, como o peso molecular, carga, formato e a interação com outras
moléculas (proteínas e lipídios).
O método "SDS-PAGE" descrito por Laemmli em 1970 foi desenvolvido para
que esta migração dependa unicamente do tamanho da proteína. O SDS é um
poderoso detergente carregado negativamente que se liga a regiões hidrofóbicas
das proteínas. O complexo formado SDS-proteína distribui carga negativa
semelhante entre todas as proteínas, que migram para o pólo positivo do campo
elétrico. Portanto, a migração das proteínas no método "SDS-PAGE" depende
unicamente dos seus pesos moleculares.
O gel de empilhamento é preparado a 4% e permite que todas as proteínas
migrem com a mesma velocidade no início da corrida. Chegando ao gel de
separação, as proteínas começam a migrar de acordo com seus tamanhos. A
concentração do gel de resolução vai depender da proteína que se pretende
analisar.
Os
géis
foram
preparados
a
partir
de
uma
solução
de
acrilamida:bisacrilamida (30:1). A polimerização química da acrilamida com a
bisacrialamida foi, então, iniciada com a adição do persulfato de amônio e do
TEMED; o persulfato de amônio gera radicais livres que levam à polimerização,
enquanto o TEMED catalisa a formação destes radicais.
As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida em
"SDS-PAGE" na porcentagem de 10 % por cerca de 2 horas (8 V/ cm de gel até
entrar no gel de resolução e depois aumentando a voltagem para 15 V/ cm de gel).
Esta separação das proteínas é importante para a posterior identificação das
proteínas de interesse pelo Western Blotting.
3.9. Western blotting
O método de Western blotting surgiu em 1979, descrito por TOWBIN e
colaboradores. A idéia geral deste método é a identificação de proteínas específicas
pelo uso de anticorpos mono ou policlonais, incluindo a detecção, a quantidade
relativa e o peso molecular de proteínas em uma mistura complexa. Após a
separação das proteínas em SDS-PAGE, elas foram transferidas para uma
membrana de nitrocelulose, onde se procedeu o método. A membrana foi incubada
em tampão de bloqueio, que contém 5 % de leite em pó desnatado, o que evitou que
os anticorpos se ligassem inespecificamente. Após bloqueada, a membrana foi,
então, incubada em tampão de incubação contendo 3% de BSA e o anticorpo
primário contra a proteína que se queria analisar. Para visualizar a interação
antígeno-anticorpo utilizou-se um segundo anticorpo, complexado com a enzima
HRP (Horseradish peroxidase), voltado para o primeiro. Esta enzima permitiu, pela
adição de um substrato cromogênico ou quimioluminescente, a visualização da
proteína identificada pelo anticorpo em filme Kodak para radiografia. Foram
utilizados anticorpos policlonais para as proteínas Akt 1/2, ERK 1/2, Bcl-2 e Bax. As
bandas foram analisadas por densitometria através do programa “Image J”.
3.10. Análise Estatística
Os dados estão apresentados como média  erro padrão da média e foram
submetidos à análise de variância de uma via (ANOVA) com pós teste de Tukey com
significância para p < 0,05.
4. RESULTADOS
4.1. Proliferação de células do tumor de Walker 256 em cultura
A proliferação tumoral, em contagem por minuto (cpm), dos grupos
experientais Meio – células tumorais cultivadas em meio de cultura RPMI acrescidos
de SFB e antibióticos, BSA – células tumorais cultivadas em meio de cultura na
presença de BSA 2%, e OP – células tumorais cultivadas em meio de cultura na
presença de óleo de peixe-BSA complexado, está apresentada na figura 3. A
proliferação das células tumorais cultivadas durante 24 h com óleo de peixe-BSA
complexado foi quatro vezes menor quando comparado a das cultivadas em meio e
BSA (p < 0,001). Entre estes últimos não houve diferença significativa na
proliferação celular (p > 0,05).
10000
cpm
8000
6000
4000
a
2000
0
Meio
BSA
OP
Figura 3. Proliferação das células de tumor de Walker 256, através da incorporação
de (2-14C)-timidina em DNA, cultivadas durante 24 h em meio de cultura RPMI
(Meio), ou meio de cultura com BSA 2% (BSA) ou em meio de cultura com óleo de
peixe-BSA complexado (OP). Os dados estão apresentados como média ± epm de 3
experimentos.
a p < 0,001 quando comparado ao grupo Meio e BSA.
4.2. Apoptose e necrose em células do tumor de walker 256
A apoptose e necrose foram determinadas por citometria de fluxo através de
marcação com anexina V e iodeto de propídeo, e os dados apresentados em density
plot. O grupo Meio está apresentado na figura 4, BSA na figura 5 e OP na figura 6.
No quadrante inferior esquerdo (IE) está a porcentagem de células viáveis, no
quadrante inferior direito (ID) a porcentagem de células marcadas com anexina V, no
quadrante superior direito (SD) células marcadas com anexina V e iodeto de
propídeo e no quadrante superior esquerdo (SE) as células marcadas com iodeto de
propídeo. As células cutivadas na presença de Meio e BSA não apresentaram
diferenças quanto às taxas de apoptose e necrose (p > 0,05), enquanto as células
cultivadas na presença de óleo de peixe-BSA complexado (OP) tiveram as taxas de
apoptose e necrose elevadas em aproximadamente 20 vezes quando comparado a
dos grupos Meio e BSA (p < 0,001) (figura 7).
SE
SD
IE
ID
Figura 4. Gráfico de density plot mostrando a incorporação de anexina V e/ou iodeto
de propídeo pelas células tumorais cultivadas em meio de cultura (Meio).
SE
SD
IE
ID
Figura 5. Gráfico de density plot mostrando a incorporação de anexina V e/ou iodeto
de propídeo pelas células tumorais cultivadas em meio de cultura na presença de
BSA 2% (BSA).
SE
SD
IE
ID
Figura 6. Gráfico no formato density plot mostrando a incorporação de anexina V
e/ou iodeto de propídeo pelas células tumorais cultivadas em meio de cultura na
presença de óleo de peixe complexado a BSA 2% (OP).
%
a
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Meio
BSA
OP
Figura 7. Porcentagem de células tumorais marcadas com anexina V e iodeto de
propídeo, cultivadas durante 24 h na presença de meio de cultura RPMI (Meio), meio
de cultura com BSA 2% (BSA) e em meio de cultura com óleo de peixe-BSA
complexado (OP). Os dados estão expressos em média ± epm de 3 experimentos.
a p < 0,001 quando comparado ao grupo Meio e BSA.
4.3. Fotomicrografias das células tumorais
As fotomicrografias, ilustrativas, das células tumorais cultivadas em meio de
cultura RPMI (foto 1), na presença de BSA 2% (foto 2) e na presença de óleo de
peixe-BSA complexado (foto 3) foram capturadas em microscópio invertido
utilizando-se filme Kodak ISO 100 com filtro para contraste de fase, após 24 horas
de cultivo.
Foto 1. Células tumorais cultivadas em meio de cultura RPMI-1640, por 24 horas.
Foto 2. Células tumorais cultivadas na presença de BSA 2%, por 24 horas.
Foto 3. Células tumorais cultivadas na presença de óleo de peixe-BSA complexado,
por 24 horas.
4.4. Peroxidação lipídica das células tumorais
Na figura 8 estão apresentados os resultados da taxa de peroxidação lipídica
(nmol de hidroperóxido/ mg de proteína) das células tumorais cultivadas na presença
de meio de cultura (Meio), de BSA 2% (BSA) e na de óleo de peixe-BSA
complexado (OP). Os grupos Meio e BSA não apresentaram diferença significativa
entre si quanto à taxa de peroxidação lipídica (p > 0,05). Por outro lado, na presença
do óleo de peixe-BSA complexado (OP) a taxa de peroxidação lipídica foi elevada
em aproximadamente 4 vezes, a qual foi significativamente maior quando
comparada à dos grupos Meio e BSA (p < 0,001).
nmol de hidroperóxido/mg de proteína
a
35
30
25
20
15
10
5
0
Meio
BSA
OP
Figura 8. Taxa de peroxidação lipídica das células tumorais cultivadas durante 24 h
em meio de cultura RPMI (Meio), meio de cultura com BSA 2% (BSA) e meio de
cultura com óleo de peixe-BSA complexado (OP). Os dados estão expressos em
média ± epm de 3 experimentos.
a p < 0,001 quando comparado ao grupo Meio e BSA.
4.5. Atividade da enzima catalase nas células tumorais
A figura 9 apresenta a atividade da enzima catalase (mmol H2O2 / min. mg
proteína), das células tumorais cultivadas durante 24 h na presença de meio de
cultura (Meio), de BSA 2% (BSA) e de óleo de peixe complexado a BSA 2% (OP).
Os grupos Meio e BSA não apresentaram diferença estatística significativa entre si
(p > 0,05), enquanto a presença do óleo de peixe-BSA complexado (OP) diminui a
atividade desta enzima em aproximadamente 6 vezes, a qual foi significativamente
menor quando comparada à dos grupos Meio e BSA (p < 0,001).
mmol H2O2.min-1.mg prot-1
14
12
10
8
6
4
a
2
0
Meio
BSA
OP
Figura 9. Atividade da enzima catalase expressa em mmol H2O2 / min. mg proteína
das células tumorais cultivadas durante 24 h em meio de cultura RPMI (Meio), meio
de cultura com BSA 2% (BSA) e meio de cultura com óleo de peixe complexado a
BSA 2% (OP). Os dados estão expressos em média ± epm de 3 experimentos.
a p < 0,001 quando comparado ao grupo Meio e BSA.
4.6. Expressão das proteínas AKT, ERK, Bcl-2 e Bax em células do tumor de walker
256
A expressão de AKT em células tumorais cultivadas em meio de cultura RPMI
(Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe complexado
a BSA 2% (OP) está apresentada na figura 10. O óleo de peixe-BSA complexado
reduziu significativamente a expressão de AKT quando comparada a das células
cultivadas em meio de cultura e na presença de BSA 2% (p < 0,01).
57 KDa
unidades arbitrárias
Meio
BSA
250
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
OP
a
Meio
BSA
OP
Figura 10. Expressão da proteína AKT em células cultivadas durante 24 h em meio
RPMI (Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe
complexado a BSA 2% (OP). Os dados estão apresentados em unidades arbitrárias
como média ± epm de 3 experimentos.
a p < 0,01 quando comparado ao Meio e ao BSA.
Os dados da figura 11 apresentam a expressão da proteína ERK 1/2 em
células tumorais cultivadas em meio de cultura RPMI (Meio), na presença de BSA
2% (BSA) e na presença de óleo de peixe complexado a BSA 2% (OP). A presença
do óleo de peixe-BSA complexado reduziu significativamente a expressão de ERK
1/2 em comparação a das células cultivadas em meio de cultura e na presença de
BSA 2% (p < 0,001).
44 KDa
42 KDa
unidades arbitrárias
Meio
BSA
250
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
OP
a
Meio
BSA
OP
Figura 11. Expressão da proteína ERK 1/2 em células cultivadas durante 24 h em
meio RPMI (Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe
complexado a BSA 2% (OP). Os dados estão apresentados em unidades arbitrárias
como média ± epm de 3 experimentos.
a p < 0,001 quando comparado ao Meio e ao BSA.
A expressão da proteína Bcl-2 em células tumorais cultivadas em meio de
cultura RPMI (Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe
complexado a BSA 2% (OP) está apresentada na figura 12. O óleo de peixe-BSA
complexado reduziu significativamente a expressão de Bcl-2 quando comparada a
das células cultivadas em meio de cultura e na presença de BSA 2% (p < 0,01).
30 KDa
Meio
BSA
OP
unidades arbitrárias
200
a
175
150
125
100
75
50
25
0
Meio
BSA
OP
Figura 12. Expressão da proteína Bcl-2 em células cultivadas durante 24 h em meio
RPMI (Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe
complexado a BSA 2% (OP). Os dados estão apresentados em unidades arbitrárias
como média ± epm de 3 experimentos.
a p < 0,01 quando comparado ao Meio e ao BSA.
A figura 13 apresenta a expressão da proteína Bax em células tumorais
cultivadas em meio de cultura RPMI (Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na
presença de óleo de peixe complexado a BSA 2% (OP). Não houve diferença
estatística entre os grupos (p > 0,05).
21 KDa
Meio
BSA
OP
unidades arbitrárias
200
175
150
125
100
75
50
25
0
Meio
BSA
OP
Figura 13. Expressão da proteína Bax em células cultivadas durante 24 h em meio
RPMI (Meio), na presença de BSA 2% (BSA) e na presença de óleo de peixe
complexado a BSA 2% (OP). Os dados estão apresentados em unidades arbitrárias
como média ± epm de 3 experimentos. Não houve diferença significativa entre os
grupos (p > 0,05).
5. DISCUSSÃO
Os ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) parecem ter três principais papéis
biológicos. Primeiro, estão envolvidos na regulação do metabolismo lipídico e nos
processos de transporte e entrega de lipídeos aos tecidos. Segundo, são
importantes componentes de todas as membranas celulares, presentes na forma de
fosfolipídios, os quais representam quase 50 % do volume das membranas. A
natureza dos ácidos graxos nos fosfolipídios de membrana contribui grandemente
para a fluidez desta, influenciando a atividade das proteínas de membrana. Além
disso, os fosfolipídios também são fontes de segundos mensageiros, como
diacilglicerol, inositol-1,4,5-trifosfato entre outros, responsáveis por eventos de
sinalização da membrana para o citosol e núcleo, para promover respostas celulares
apropriadas. Terceiro, são substratos para síntese de moléculas bioativas como
prostaglandinas, tromboxanas e leucotrienos, conhecidas como eicosanóides
(CALDER, 2003).
Em resumo, por serem rapidamente incorporados nas
membranas celulares, influenciam profundamente as respostas biológicas, como a
estabilidade e fluidez de membrana, mobilidade celular, formação de receptores,
ligação de ligantes aos seus receptores, ativação de vias de sinalização intracelular,
diretamente ou através da formação de eicosanóides, expressão gênica e
diferenciação celular (SENKAL, 2005).
Os AGPI têm efeito significativo sobre crescimento celular e proliferação,
onde os da família n-3, principalmente EPA e DHA, presentes no óleo de peixe, têm
sido demonstrados terem atividade anti-tumoral em várias linhagens de células
cancerosas (BEGIN, 1989) e também sobre as células do tumor de Walker 256, in
vivo (TOGNI et al., 2003; PINTO JR et al., 2004; PIZATO et al.,2005). A atividade
anti-tumoral exercida pelo óleo de peixe pode ser resultado da inibição do
crescimento celular, do aumento da apoptose das células tumorais ou de ambos. É
provável que os ácidos graxos presentes no óleo de peixe atuem sobre genes e vias
de sinalização envolvidas no desenvolvimento tumoral.
Há poucos relatos sobre os efeitos do EPA e DHA in vitro, mas os dados
disponíveis até o momento mostram, consistentemente, que estes dois ácidos
graxos têm efeitos inibidores no crescimento tumoral (NOGUCHI et al, 1995;
SENZAKI et al, 1998 e CHAMRAS et al, 2002). A maioria dos estudos utiliza estes
ácidos graxos puros no meio de cultura, significando em alto custo financeiro, mas a
razão de tal estratégia é definir qual AGPI tem efeito primário sobre o tumor. Quando
nos alimentamos, ingerimos alimentos que contêm gorduras, as quais são digeridas
e posteriormente absorvidas. Por serem insolúveis em água, no plasma, os ácidos
graxos são transportados ligados à albumina, a qual contém vários sítios de ligação
para estes ácidos (DEVLIN, 1998). Portanto, um experimento mais próximo do
fisiológico seria aquele que mimetizaria esta situação através da complexação do
óleo de peixe à albumina. Assim, ao fornecermos óleo de peixe-BSA complexado ao
meio de cultura, estaríamos efetuando o mesmo mecanismo de transporte e entrega
de nutrientes às células.
Quando as células ascíticas obtidas do tumor de Walker 256 foram cultivadas
na presença de óleo de peixe-BSA complexado, este foi capaz de reduzir a
proliferação tumoral em 4 vezes (figura 3), quando comparada à do grupo controle
(Meio) e à do veículo (BSA 2%). Este nosso resultado corrobora dados de outros
autores (TOGNI et al., 2003; PINTO JR et al., 2004; PIZATO et al.,2005). As
fotomicrografias capturadas em microscópio invertido são ilustrativas deste evento,
onde a foto 1 representa as células tumorais cultivadas em meio de cultura (Meio), a
foto 2 em presença de BSA e a foto 3 em presença do óleo de peixe-BSA
complexado (OP). Cabe destacar que além da proliferação estar reduzida nesta
última, são nítidas as alterações morfológicas.
Apoptose ou morte celular programada é um processo ativo, dependente de
energia, através do qual células vivas participam na sua própria destruição (COHEN,
1993). Células que passam por apoptose são caracterizadas por mudanças
morfológicas típicas, como redução do tamanho celular, condensação de cromatina
e formação de vesículas de membrana plasmática. Associados a esta morte celular
programada estão a expressão aumentada de uma série de genes e a fragmentação
do DNA genômico (WYLLIE, 1980). Mudanças na membrana plasmática das células
são um dos primeiros eventos que ocorrem quando a célula entra em apoptose. Nas
células apoptóticas, a fosfatidilserina, um fosfolipídio de membrana, é translocada do
folheto interno pra o folheto externo da membrana plasmática. A anexina V é uma
sonda sensível para identificar células entrando em apoptose, pois a exposição da
fosfatidilserina ocorre cedo no processo de apoptose. Já que a translocação da
fosfatidilserina para superfície celular externa também ocorre durante a necrose, a
anexina V é tipicamente usada em conjunção com um corante vital, tal como iodeto
de propídeo (PI), para distinguir células apoptóticas (positiva para anexina V e
negativa para PI) de necróticas (positiva para anexina V e para PI) (VERMES, 1995).
Como a apoptose leva a morte celular, células apoptóticas em cultura eventualmente
perdem a integridade da membrana e passam a ter marcação positiva para PI. Uma
vez que as células expõem a fosfatidilserina, esta permanece na superfície da célula
e as células que morreram marcam positivamente para anexina V e PI. Portanto, o
ensaio utilizado neste estudo não distingue células que já entraram em apoptose
daquelas que morreram por necrose, pois ambas se coram similarmente com
anexina V e PI.
A morte das células tumorais, por apoptose ou necrose, cultivadas na
presença de óleo de peixe (figura 7), foi 20 vezes maior do que à das células
cultivadas em meio de cultura RPMI ou na presença do veículo BSA. Muitos
estímulos, incluindo genotóxicos, estresse oxidativo, hormônios e citocinas, bem
como a retirada de fatores de crescimento, têm sido mostrados desencadearem a
apoptose (SANDSTROM et al, 1995).
A ação inibitória ou estática das dietas ricas em óleo de peixe sobre o
crescimento tumoral pode ocorrer via peroxidação lipídica (GONZALEZ, 1992). A
taxa de peroxidação lipídica neste estudo foi elevada em aproximadamente 4 vezes
na presença do óleo de peixe-BSA complexado no meio de cultura (figura 8), a qual
dá suporte ao papel da peroxidação lipídica em mediar a morte celular programada,
embora o mecanismo molecular preciso não esteja claro.
As reações de oxidação e redução nos sistemas biológicos são chamadas
reações redox e representam a base para diversos mecanismos bioquímicos. O
ambiente redox da célula tem importante papel na transdução de sinais, ativação de
enzimas, síntese de DNA e RNA, proliferação celular, diferenciação e apoptose.
Geralmente, enquanto a morte celular é iniciada por um ambiente oxidante da célula,
um
ambiente
redutor
é
importante
para
proliferação
celular
aumentada
(VOEHRINGER, 1999). Várias evidências têm mostrado que o balanço redox está
alterado em células tumorais quando comparado ao das células normais, o que pode
estar relacionado à estimulação oncogênica. Concentrações alteradas de enzimas
antioxidantes (superóxido desmutase, catalase, glutationa peroxidase) e de
antioxidantes não-enzimáticos (vitamina C, E, tioredoxina) bem como mudanças nas
vias de sinalização relacionadas, são evidentes em muitos tumores humanos
(MCELIGOT, YANG e MEYSKENS, 2005). O ambiente intracelular redutor no núcleo
e mitocôndria (mantido por elevadas concentrações de antioxidantes) não só facilita
o escape da apoptose mas também produz um potencial de proliferação através da
ativação de sinais de sobrevivência celular, mediados por fatores de transcrição
sensíveis ao redox (KERN & KEHRER, 2005). Espécies reativas de oxigênio
intracelulares e concentrações elevadas de produtos de peroxidação lipídica têm
sido associadas com apoptose (SANDSTROM et al, 1995). Estudos prévios
mostraram que a presença de hidroperóxidos resulta em marcado aumento na
concentração de Ca2+ intracelular, o qual é essencial para apoptose. A origem deste
aumento não está clara. Os hidroperóxidos lipídicos podem abrir canais de cálcio ou
agir diretamente como ionóforos para facilitarem a entrada do cálcio extracelular.
Alternativamente, eles podem estimular a liberação de cálcio das reservas
intracelulares (FORCE, 1991). O aumento da concentração de Ca2+ intracelular
poderia levar a ativação de vários sinais de transdução que culminam em morte
celular (TRUMP & BEREZESKY, 1995). Interessantemente, a expressão de Bcl-2
tem sido reportada inibir uma bomba de cálcio necessária para liberação do Ca2+ do
retículo endoplasmático (LAM, 1994). A habilidade da Bcl-2 em proteger as células
da citotoxicidade mediada pelo estresse oxidativo implica que esta proteína, de
alguma forma, reforça as defesas antioxidantes da célula (STEINMAN, 1995). Lee et
al (2001) mostraram que células
que superexpressam
Bcl-2 apresentam
concentrações relativamente elevadas de enzimas antioxidantes. Uma consequência
notável da superexpressão de Bcl-2 nas células é a diminuída peroxidação lipídica
nas membranas (HOCKENBERY et al, 1993). Sandstrom et al (1995) sugeriram que
a habilidade da Bcl-2 em bloquear a peroxidação lipídica poderia explicar sua
capacidade de inibir a apoptose mediada pelo estresse oxidativo. Quando as células
do tumor de Walker 256 foram cultivadas na presença do óleo de peixe-BSA
complexado, apresentaram atividade reduzida da enzima antioxidante catalase
(figura 9), o que sugere que os hidroperóxidos poderiam agir sobre estas células
levando à morte celular.
Tem sido sugerido que a ativação do fator de transcrição NF-B, conhecido
por regular a expressão de vários genes, é regulada pelo estado redox intracelular.
Estudos recentes mostraram o envolvimento do NF-B na regulação da expressão
de genes anti-apoptóticos e na promoção da sobrevivência celular. Ainda, a
regulação transcricional de enzimas antioxidantes, como a catalase e a superóxido
desmutase, é mediada, parcialmente, pelo NF-B (ZHOU, JOHNSON e RANDO,
2001). Interessantemente, a atividade de ligação ao DNA e de transcrição do NF-B
estão constitutivamente elevadas em células que superexpressam Bcl-2. A
habilidade da Bcl-2 em interagir com diferentes moléculas de sinalização, sugere
que concentrações alteradas desta proteína podem regular a atividade do NF-B via
modulação da função do I-B, o qual tem sua degradação aumentada em células
que superexpressam Bcl-2. É possível que a Bcl-2, direta ou indiretamente, module
a atividade da I-B por interagir com fatores celulares envolvidos na ativação de IKK
(DE MOISSAC, ZHENG E KIRSHENBAUM, 1999). Recentemente, vários ativadores
e reguladores da atividade da IKK têm sido identificados, dentre eles estão a
PKB/Akt, a qual pode ser modulada pela MAPK e ou estar envolvida na ativação de
MAPK (BOWIE & O’NEILL, 2000).
A atividade anti-apoptótica da Bcl-2 é antagonizada pela Bax, a qual é capaz
de formar heterodímeros com a Bcl-2. Assim, a razão Bax/Bcl-2 dentro da célula é o
fator determinante crítico para a propensão da célula entrar em apoptose (HAGUE et
al, 1997). O óleo de peixe-BSA complexado diminuiu a expressão da Bcl-2 (figura
12), mas não a da Bax (figura 13) quando comparada à das células cultivadas em
meio RPMI ou na presença do veiculo (BSA). Concentrações reduzidas de Bcl-2,
juntamente com concentrações normais de Bax, podem ser suficientes para alterar o
balanço a favor da apoptose nestas células. Estes resultados estão em
concordância com àqueles encontrados por outros autores (CHEN & ISTFAN, 2000
e CHIU & WAN, 1999). Chen & Istfan (2000) sugerem ainda que a expressão
diminuída de Bcl-2 pela adição de DHA, poderia aumentar a sensibilidade das
células à peroxidação lipídica e à morte celular programada. O mecanismo pelo qual
o óleo de peixe induz a diminuição da expressão de Bcl-2 ainda não é sabido, nós
aventamos a hipótese que seja através da regulação da expressão de proteínas
como PKB/Akt, uma vez que esta proteína participa da via anti-apoptótica
(PUGAZHENTHI, 2000). Esta hipótese deve ser testada.
Múltiplas vias de transdução de sinais intracelulares estão envolvidas na
transdução de sinais de crescimento em vários tipos de tumores (SHI et al., 2001;
TONG et al., 2005). Reddy (2001) relatou que as vias da MAPK, PI-3K e da PKC
têm papel crítico na regulação da diferenciação e proliferação de células de câncer
pancreático.
A PKB/Akt é uma quinase serina-treonina que é ativada em resposta a
citocinas e fatores de crescimento, cuja ativação ocorre através da translocação
para membrana e fosforilação de seus resíduos de treonina e serina (VIVANCO &
SAWYERS, 2002). Ela funciona diretamente para promover a sobrevivência celular
e proteger as células da morte celular apoptótica através da fosforilação e inativação
de componentes da maquinaria celular. Em adição, Akt pode, indiretamente,
promover a sobrevivência celular através da ativação de fatores de transcrição prósobrevivência tais como o NF-B (NICHOLSON & ANDERSON, 2002). Ainda,
Pugazhenthi et al (2000) mostraram que Akt parece promover a sobrevivência
celular por aumentar a expressão de Bcl-2 por ativação transcricional.
Outra quinase cuja ativação pode potenciar as funções anti-apoptóticas da
Bcl-2 e sobrevivência celular é a proteína ERK (XIA et al, 1995). A ERK é um
regulador
chave
do
comportamento
da
célula,
influenciando
proliferação,
diferenciação, senescência e sobrevivência das células (SEBOLT-LEOPOLD &
HERRERA, 2004). Além disso, vários estudos reportam que as quinases serinatreonina da família da MAPK podem ser reguladas por oxidantes (VALKO et al,
2006). No câncer, a cascata da Ras/Raf/MEK/ERK está envolvida no controle de
sinais de crescimento, sobrevivência celular e invasão. Esta via inclui vários protooncogenes e está desregulada em aproximadamente 30% dos casos de cânceres
(FANG & RICHARDSON, 2005). A presença do óleo de peixe-BSA complexado
reduziu significativamente a expressão da AKT (figura 10) e da ERK 1/2 (figura 11)
nas células tumorais.
A proteína GTPase Ras ativa tanto a cascata de sinalização da ERK
(CAMPBELL et al., 1998) quanto a da Akt (MARTE & DOWNWARD, 1997). Ácidos
graxos podem afetar a troca GTP/GDP por modularem a atividade e função de GAP,
a qual por sua vez regula a hidrólise de GTP a GDP e, portanto, o estado de
ativação da Ras (FEIG, 1994). Sermon e colaborados (1996) mostraram que o AA é
capaz de inibir a atividade da GAP, deixando a Ras ativada. A Ras, por sua vez,
estimula a fosfolipase A2 (PLA2), a qual catalisa a hidrólise do fosfolipídeo de
membrana AA, liberando-o para ser subsequentemente convertido em PGE2 pela
COX-2 (BOYLAN et al., 1990). Como a GAP desativa Ras, a substituição do AA, por
DHA e EPA na membrana celular, diminui a concentração da forma ativa de Ras
(ligada a GTP) (COLLETT et al, 2001).
Oncogenes, fatores de crescimento, citocinas e promotores tumorais
estimulam a transcrição da COX-2 via proteína quinase C (PKC) e sinalização
mediada pela Ras (SMITH, DEWITT & GARAVITO, 2000). Zhang et al. (2000)
mostraram que a ativação da ERK 1/2 estabiliza o RNAm da COX-2 além de
estimular sua transcrição.
Fukuda, Kelly e Semenza (2003) mostraram que a exposição à PGE2 induz
ativação da ERK em células de câncer de cólon. Muitas das funções celulares da
PGE2 são mediadas por uma família de receptores acoplados à proteína G,
conhecidos como EP1, EP2, EP3 e EP4 (BREYER et al., 2001). Tem sido proposto
que a estimulação do receptor EP4 pela PGE2 leva a fosforilação da ERK através de
um mecanismo dependente da PI-3K (FUJINO, XU & REGAN, 2003). O tratamento
com PGE2 provoca aumento significativo da fosforilação da ERK e Akt, a qual
também é substrato da PI-3K, mostrando que além do seu efeito anti-apoptótico
(TURINI & DUBOIS, 2002), PGE2 promove crescimento celular por ativar vias de
sinalização mitogênicas estabelecidas (POZZI et al., 2004). Ainda, a PGE2 tem sido
reportada induzir a expressão da Bcl-2 e a atividade anti-apoptótica em células de
câncer de cólon humano (SHENG et al., 1998), sugerindo uma ligação entre COX-2,
Bcl-2 e sobrevivência celular aumentada. Em células de tumor de Walker 256, a
substituição de AA pelos ácidos graxos presentes no óleo de peixe (EPA e DHA), foi
capaz de diminuir a expressão de COX-2 e conseqüentemente a produção de PGE2
(MUND, 2004).
O óleo de peixe, através de todas as vias aqui relatadas – aumento da
peroxidação lipídica, diminuição da expressão da enzima antioxidante catalase,
diminuição da expressão de Akt, ERK e Bcl-2 – promoveu a apoptose e redução da
proliferação celular tumoral. Todos estes mecanismos de ação do óleo de peixe
parecem interligados, e sua ação anti-tumoral parece ser a somatória de mudanças
na composição da membrana, alterações nas vias de transdução de sinais bem
como na expressão de genes que levam a sinais de proliferação e apoptose
(esquema 1).
Figura A
Figura B
Esquema 1. Vias de sinalização em células cuja membrana é rica em AGPI n-6
(Figura A) e n-3 (Figura B). A substituição por AGPI n-3 (EPA/DHA) altera
substancialmente as vias de transdução de sinais.
negativo. CAT = catalase.
indica estímulo positivo e
6. CONCLUSÕES
O óleo de peixe-BSA complexado, adicionado à cultura de células ascíticas
do tumor de Walker 256, foi capaz de diminuir a proliferação e aumentar a taxa de
apoptose e necrose destas células. Estas ações foram obtidas, possivelmente, pelo
aumento da taxa de peroxidação lipídica, diminuição da concentração da enzima
antioxidante catalase e ainda pela redução da expressão da proteína anti-apoptótica
Bcl-2 bem como das proteínas PKB/Akt e ERK 1/2, envolvidas na promoção da
sobrevivência celular.
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