Teste automático de Folsomia ccandida (Collembolas)
Background biológico
Com a quantidade crescente de legislação nacional e internacional sobre
proteção de ambiente e de solos, testes biol
biológicos de cunho eco-toxicológico
com organismos de solo se tornaram cada vez mais importantes.
A norma ISO 11267 “Soil quality – Inhibition of reproduction of collembolans
(Folsomia candida)) by soil pollutants
pollutants” usada como norma internacional para
teste de produtos químicos, forma a base do teste de Collembolas.
Considerando algumas caract
características
sticas especiais (Fraunhofer 2001b), esta norma
pode ser usada para testar solos contaminados.
Aplicação do teste de Collembolas
A norma pode ser usada para testes ag
agudos
udos e testes de reprodução crônica de
28 dias. Para o teste crônico, 10 animais
animais, com idade entre 10 e 12 dias,
dias são
colocados na amostra de solo e 28 dias depois o teste é abortado.
Para avaliação, o solo e os organismos são colocados em água com tinta para
melhorar
elhorar o contraste. Uma vez que Collembolas mortos perdem suas
características hidrofóbicas e são geralmente devorados por outros
Collembolas, praticamente só sobram organismos vivos flutuando na superfície
da água.
No final do teste existem mais ou menos 1.000 Collembolas por vaso que devem
então devem então ser contados. Isto significa até 20.000 Collembolas por
ensaio típico. Geralmente
eralmente a contagem é feita duas vezes uma vez que de
acordo com a norma não é permitido exceder um erro de contagem de 10%
(ISO1999).
Avaliação com o Scanalyzer e software da Lemnatec
Usando o Lemnatec Scanalyzer com software de Collembolas para avaliação dos
Collembolas após o período de teste, os resultados são obtidos de forma
rápida, reproduzível e de acordo com a norma ISO
ISO.. O software de Collembolas
foi projetado para uso conveniente e eficiente na prática laboratorial. Não é
necessário qualquer conhecimento ou know
know-how
how especial de processamento de
imagens para poder usar o sof
software.
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O uso do Lemnatec Scanalyzer garante condições constantes na obtenção das
imagens de alta qualidade. Por este motivo é sugerido o uso de uma câmera de
alta resolução de 1280 por 960 pixels. Caso a área de registro for reduzida é
possível usar câmeras com menor resolução e ainda assim obter imagens de boa
qualidade.
Usando o Scanalyzer com câmera de alta resolução, os Collembolas podem ser
colocados na água em vasos com diâmetro entre 10,5 a 8 cm e contados
automaticamente. Com vasos menores a resolução é aumentada e, portanto
melhorada a diferenciação da distribuição de tamanhos.
O sistema de iluminação do Scanalyzer foi projetado para garantir condições
constantes de iluminação, minimizando eventual refletância e tornando as
imagens digitais adequadas para a análise de imagens subseqüente.
Fig 1. Imagem original e imagem processada.
Com o software de processamento de imagens da Lemnatec, mesmo
Collembolas em clusters, leveduras, espumas e componentes de solo flutuantes
podem ser separados e os Collembolas quantificados corretamente e de forma
reproduzível. Para detecção efetiva dos Collembolas menores é recomendado
minimizar a presença de espuma e leveduras nas amostras.
Testes de validação confirmam um desvio entre avaliação automática e a
contagem visual menor que 10%. Por este motivo a avaliação automática é
perfeitamente confiável dentro dos requisitos da norma ISO.
Todos os resultados da análise de imagem são mostrados permitindo um
controle de qualidade eficiente atendendo também critérios de GLP. Objetos
que não podem ser separados automaticamente pela análise de imagem
(ocasionalmente partículas de levedura) podem ser manualmente removidos
dos cálculos. Todos os resultados e correções são também registrados no
sistema de auditoria. O usuário pode ainda ajustar parâmetros específicos da
análise de imagens para condições especiais sem necessidade de possuir knowhow avançado de processamento de imagens.
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Gerenciamento de dados
É possível montar modelos para medição de series contendo especificação dos
níveis de concentração, números repetidos e as concentrações usadas.
Opcionalmente pode ser fornecido um leitor de códigos de barras para a
identificação das diversas amostras. Após o término dos registros das imagens,
todas as imagens são analisadas automaticamente de acordo com os métodos
escolhidos. Todos os dados do registro das imagens, as análises e os resultados
da medição da serie são armazenados e protegidos de acordo com padrões GLP.
Todas as imagens, dados primários e dados analisados estão disponíveis em
múltiplos formatos para serem exportados à planilhas de cálculo.
Para avaliação dos valores EC pode-se usar o módulo de estatística BioStat.
Com a ajuda deste software atendendo critérios GLP, os valores EC e os
intervalos de incerteza são calculados e mostrados em formato de tabelas e
gráficos.
Em adição ao número total de animais, o software detecta também
automaticamente a distribuição de tamanhos dos Collembolas. Desta forma a
quantidade encontrada de animais adultos e jovens pode ser detectada de
acordo com as especificações da norma. A distribuição de tamanhos fornece
uma idéia sobre o fitness da população e a dinâmica da sua reprodução. Isto
facilita a detecção objetiva e reproduzível de “cada sintoma patológica” como
a norma exige. A distribuição de tamanhos define a quantidade e tamanho dos
animais do primeiro e segundo cluster e cria um novo ponto final ecotoxicológico (Krogh 1998).
A partir da informação de todos os tamanhos dos animais é derivado um
parâmetro de biomassa total. Isto fornece a oportunidade de usar o parâmetro
de biomassa total junto com a quantidade, como ponto final adicional para o
cálculo de valores de inibição (neste caso a somatório de todas as áreas visíveis
cobertas com Collembolas). Se o valor EC da área total de Collembolas difere
significativamente deste número, isto é um indicador importante dos efeitos
secundários do elemento de poluição, não representados por este número.
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Figura 2. Distribuição de tamanhos de uma população de controle. Em adição
aos animais adultos podem ser vistos dois clusters de Collembolas jovens.
Testes de precisão sobre a biomassa formada e os tamanhos dos organismos são
também muito importantes para modelos diferenciados de crescimento e
toxicidade como, por exemplo, o modelo DebTox (Nisbet 2000, Kooijman 2001).
Outros testes mostraram que um drift na distribuição de tamanhos sob
influência de substâncias e uma redução associada da biomassa total
representam um parâmetro adicional e importante de toxicidade. Este
parâmetro é muitas vezes mais sensível do que a contagem indiscriminada de
todos os organismos (Jenner 1989, Lemnatec 2000, Hammers-Wirtz 2000).
Por este motivo a avaliação analítica da imagem do teste com Collembolas
usando o Scanalyzer e software da Lemnatec permite uma quantificação
extensiva dos efeitos nos testes seja em pesquisa ou em processamento de
testes de rotina.
Situações especiais de alta resolução
Registros múltiplos de uma área grande podem ser feitos e usados como teste
de screening pelo deslocamento do vaso.
A resolução das imagens de uma Collembola singela pode ser aumentada
diminuindo a área de interesse ou pela troca da lente.
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Figura 3. Exemplos de cortes em imagens com maior resolução (esquerda:
50~40 mm tamanho normal da imagem, direita 30~25 mm tamanho total da
imagem)
Literatura de Referência
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Fraunhofer (2001a), Ökologische und genotoxikologische Beurteilung von
Böden und Substraten – Ringtestergebnisse Erich Schmidt Verlag
Fraunhofer (2001b), Endbericht zum Verbundvorhaben “Validierung und
praxisnahe Erprobung biologischer und ökotoxikologischer Tests zur
Beurteilung belasteter und sanierterBöden und Substrate“ IUCT
Schmallenberg
Hammers-Wirtz M, HT Ratte (2000), Offspring Fitness in Daphnia: Is the
Daphnia Reproduction Test appropriate for Extrapolating Effects on the
Population Level? Enviro. Toxicol. Chem. 19,.1856-1866
ISO (1999), Soil Quality – inhibition of reproduction of collembola
(Folsomia candida) by soil pollutants, ISO 11267:1999(E)
Jenner HA, JPM Janssen-Mommen (1989), Phytomonitoring of pulverized
fuel ash leachates by the duckweed Lemna minor, Hydrobiologica
188:189, 361-369
Kooijman SALM (2001), Quantitative aspects of metabolic organization: a
discussion of concepts Phil. Trans. R. Soc. Lons. B, 356, 331-349
Krogh HA, K Johansen, M Holmstrup (1998) Automatic counting of
collembolans for laboratory experiments Applied Soil Ecology 7, 201-205
LemnaTec (2000), Observation Parameters of the Duckweed Growth
Inhibition Test - Frond number - Total Frond Area - Dry weight,
LemnaTec papers LT 001
Nisbet RM, EB Muller, K Lika, SALM Kooijmann (2000), From molecules to
ecosystems through dynamic energy budget models, Journal of Animal
Ecology 69, 913-926
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