PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA
BIOLOGIA MOLECULAR
Aula 6
DNA
atgagagctagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctagctacgtcgtagctacgtagc
tactctgagatgctacgatcgatcgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcatgcatgcatgcta
Transcrição
Transcrito
primario
5`ucuguaugucuaugucaaugucugaagcuaucu-3`
RNAm, RNAt, RNAr, snRNAs
O GENE
Start
point
Promotor
Terminador
Região transcrita
atgagagctagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctagctacgtcgtagctacgtagc
………………………………………………………………………………………………………………………
tactctgagatgctacgatcgatcgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcatgcatgcatgcta
DNA
Transcrição
RNA
ucuguaugucuaugucaaugucugaagcuaucu
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTAS
RNApolimerase
-Complexo de subunidades
-Sintetiza todos os RNAs
-7000 cópias/célula
-Core + fator sigma =
Holoenzima (465 kDa)
O PROMOTER PROCARIOTA
Iniciador
Terminador
Região transcrita
atgagagctagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctagctacgtcgtagctacgtagc
………………………………………………………………………………………………………………………
tactctgagatgctacgatcgatcgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcatgcatgcatgcta
Promoter
PRIBNOW
BOX
TATA BOX
E.coli possui diferentes fatores SIGMA
Função: reconhecimento dos diferentes promotores
Etapas da Transcrição
1. Reconhecimento/ligação ao
promotor
2. Separação das cadeias de
DNA
3. Iniciação da polimerização
4. Elongação (polimerização)
5. Terminação
INICIAÇÃO
-DNA é separado
(bolha de transcrição)
-Velocidade: 40nt/seg
- Movimento da RNA
Pol gera tensão adiante
E relaxamento atrás
- Girase/ topoisomerase
Corrigem estas distorções
Direção da síntese
5’ > 3’
TERMINAÇÃO
Dois modos:
-Terminadores intrinsecos (+)
-Terminators Rho-dependent (-)
A MAIORIA DOS mRNAs PROCARIOTAS SÃO
POLICISTRÔNICOS
CISTRON = GENE
RNA monocistrônico
AUG
5’
STOP
ORF
Leader
3’
Tradução
Trailer
Proteína
Em bactérias, são uma minoria!
RNA policistrônico
Região Intergênica
(-1 a 40nt)
AUG
5’
Leader
ORF-1
STOP
AUG
ORF-2
STOP
3’
Tradução
Tradução
Proteína 1
Trailer
Proteína 2
Em bactérias, são uma maioria!
Geralmente codificam produtos c/ função relacionada
Transcrição e
Tradução são
simultâneos
DEGRADAÇÃO
ocorre
CONCOMITANTE/
Meia-vida: seg-min
Degradação
do mRNA
Duas etapas
- Clivagem (RNAse E)
- Degradação terminal
(exonuclease)
TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTAS
TRÊS RNA POLIMERASES (RNApol)
- RNApol I - rRNA(nucléolo) - é a mais abundante
- RNApol II - mRNA(nucleoplasma)
- RNApol III – tRNA + snRNAs (nucleoplasma) (-)
- Reconhecem promotores diferentes
- RNApol I e II – geralmente upstream
- RNApol III – alguns promotores downstream
-Necessitam vários fatores de transcrição (TFs)
para iniciação (reconhecimento dos promotores)
RNApol II
- Complexo enzimático
(8 - 14 subunid.) > 500kDa
- Possui atividade polimerase, mas
é incapaz de reconhecer /ligar no
promoter e iniciar a transcrição
- Subunidade maior: contém a
cauda CTD (7 aa [YSPTSPS] 26 –50
-Fosforilação do CTD: regulação
do início da transcrição
- Dois complexos enzimáticos:
- Iniciação;
- Elongação
PROMOTER BÁSICO
- Existe em virtualmente todos os genes
- Permite níveis basais de transcrição
- Start point: Inr (geralmente Py2CAPy5)
A Maioria dos PROMOTORES EUCARIOTAS possui outras
sequências regulatórias
Iniciação da Transcrição
Formação do
Complexo de
iniciação
- TFIID (TBP + TAFs)
-TAFs: ~ 20
- RNApol: ~10 sub
-Total: >1000kDa
Formação do Complexo
de iniciação
Complexo de iniciação
OUTRAS SEQUÊNCIAS REGULATÓRIAS
- Locais de ligação dos TFs
PROMOTERS E ENHANCERS
PROMOTERS
- Localizados próximos (distância fixa) do startpoint (<200nt)
- Posição (distância) e orientação são críticos
- Geralmente upstream
- São sítios de ligação de TFs
-São essenciais para transcrição basal
ENHANCERS
- Podem estar longe (vários kb do startpoint)
- Upstream ou downstream
- Posição e orientação não são críticos
- Sítios de ligação de TFs (< 100bp)
- Aumentam a eficiência de transcrição a partir do Promoter
- Não são essenciais para a transcrição basal
FATORES DE TRANSCRIÇÃO (TFs)
General factors - são necessários para iniciação em todos os promoters.
Formam com a RNApol II o complexo basal de transcrição.
Upstream factors - reconhecem pequenas sequências (sítios)upstream.
Atuam em qualquer promoter que tenha esses sítios, constitutivamente.
Aumentam a eficiência da transcrição.
Fatores induzíveis- Funcionam similar aos upstream, mas tem papel
regulador. São ativados ou sintetizados em tecidos específicos ou
em tempos específicos. São responsáveis pela regulação da expressão
gênica no tempo e no espaço (diferentes tecidos).
COMO OS ENHANCERS EXERCEM FUNÇÃO
NA TRANSCRIÇÃO À DISTÂNCIA???
Iniciação da Transcrição
Complexo de iniciação
Início da transcrição
- TFIIH possui atividades
ATPase, helicase, quinase
-Fosforilação da CTD da
RNApol determina o
Início da transcrição
-A fosforilação resulta na
Dissociação dos TFs
- A maioria dos TFs é
liberada antes do início
Da transcrição
ELONGAÇÃO
3’
CH2OH
A
T
OH
0-P
C
OH
0-P
C
OH
0-P
T
5’
Direção da síntese
5’ > 3’
Terminação
-Mecanismo pouco conhecido
- RNApolII passa do final
do gene
- 3’ end é gerado por clivagem
- Adição de poliA
Modificação do
transcrito primário
(em mRNA)
-5’ CAP
- Clivagem 3’
- Cauda poliAAAAAAA
-Splicing e exportação
5’ CAP
Cauda poliA
5’-augcuagcuacgaucgaucgaucgaucgaucgcauAAAAAAAAAA(até 200)
- Sintetizada logo após o fim da transcrição
- Poly-A – polimerase
- PolyAAA associa-se a PABP (múltiplas cópias)
- Virtualmente todos os mRNA vindos do núcleo tem poliA
-Função
- Estabilidade para o RNAm (PABP)
- Necessário p/ tradução (PABP tbém)
- Necessário p/exportação (?)
- Usos
A maioria dos genes eucariotas é
descontínua
Exons e íntrons
Média: 7 – 8 exons
Exons: 100-200bp
Introns: ~ 1-2kb
Remoção dos Introns
mRNA Splicing
RNA catalítico:
RIBOZIMA
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