UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ORGÂNICA
“SÍNTESE DE NOVAS AMIDINAS TRIAZÓLICAS
COM POTENCIAIS ATIVIDADES ANTAGONISTAS DO
NMDA SUBTIPO NR2B NO
SISTEMA NERVOSO CENTRAL”
Luana Monteiro Spíndola Marins
Niterói
2006
Luana Monteiro Spíndola Marins
“Síntese de Novas Amidinas Triazólicas com Potenciais
Atividades Antagonistas do NMDA subtipo NR2B no
Sistema Nervoso Central”
Orientador: Prof. Dr. Sergio Pinheiro
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química Orgânica da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito para a obtenção do título de
Mestre em Química Orgânica.
Niterói
10/03/2006
Esta Dissertação intitulada:
“Síntese de Novas Amidinas Triazólicas com Potenciais Antagonistas do
NMDA subtipo NR2B no Sistema Nervoso Central”
Apresentada por:
LUANA MONTEIRO SPÍNDOLA MARINS
Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
_________________________________________
Prof. Dr. Sergio Pinheiro – orientador
_________________________________________
Profa Dra Alice Maria Rolim Bernardino (GQO-UFF)
_________________________________________
Prof. Dr. Ayres Guimarães Dias (Instituto de Química- UERJ)
Trabalho realizado no Departamento de Química Orgânica do Instituto
de Química da Universidade Federal Fluminense, do sob a orientação do
Prof. Dr. Sergio Pinheiro, com o apoio do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
M 399 Marins, Luana Monteiro Spíndola
Síntese de novas amidinas triazólicas com potenciais
atividades antagonistas do NMDA subtipo NR2B no Sistema Nervoso
Central/ Luana Monteiro Spíndola Marins. ___
Niterói – RJ: [s.n], 2006
126 f.
Dissertação. ___ (Mestrado em Química Orgânica). ___
Universidade Federal Fluminense, 2006.
1. Doenças neurodegenerativas. 2. Excitotoxicidade. 3.
Antagonistas NR2B. 4. Amidinas Triazóicas. I. Título.
CDD 616.83
Agradecimentos
A minha família: Minha mãe, Maria das Graças da Silva Monteiro; meus irmãos, Christiane
e Lívia Monteiro Spíndola Marins e André do Nascimento Figueiredo; Minha madrinha,
Maria de Nazaré da Silva Monteiro e meus avós, Maria José da Silva Monteiro (in
memorium) e Celso de Souza Monteiro, pela dedicação, amor e carinho e por terem sempre
acreditado em mim.
À minha segunda família: Claus Henrique Bittencourt Muniz, Thiago Silva Torres e
Mônica Hanako Igarashi, por terem me apoiado ao longo destes últimos meses, e por serem
amigos maravilhosos.
Ao Prof. Dr. Sergio Pinheiro pelos anos de boa convivência e pela confiança.
Às amigas Fernanda da Costa Santos e Neide Mara de Menezes Epifanio, pelo
companheirismo desde a graduação.
Aos amigos Ronaldo Carneiro da Silva Júnior e André Carneiro da Silva pelo
companheirismo, pela ajuda neste trabalho e pelos ótimos momentos de descontração.
Ao mais novo amigo, Sandro Guimarães, por escutar meus choros e lamentações quando
nada parecia dar certo e levantar meu humor todas as vezes que pensava em desistir.
Aos amigos do LASA: Florence M.C de Farias, Marcela dos Anjos, Tatiana Lena e Sandra
Aparecida pela convivência durante este período.
Ao amigo Sandro José Greco, por ter me ensinado muito desde que comecei a dar meus
primeiros passos na área de pesquisa.
Ao amigo Leandro Ferreira Pedrosa, por todos esses anos de convívio e amizade; e todos os
amigos de longa data.
Ao Professor Roberto Paes de Carvalho e sua aluna de doutorado Jainne Ferreira pela
realização dos testes farmacológicos.
A todos do Programa de Pós-graduação em Química Orgânica
À Capes pela bolsa concedida.
“O que o cérebro faz o tempo todo, dormindo ou acordado, é criar imagens. Luz nada
mais é do que radiação eletromagnética. Cores não existem fora de nossa mente. Nem os
sons. O som é o produto da relação entre uma vibração externa e o cérebro. Se não
existisse cérebro, não haveria som, nem cores, nem luz, nem escuridão...”
Rodolfo Llinás
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
ÍNDICE
Página
Índice de Esquemas ............................................................................................................ i
Índice de Figuras ...............................................................................................................ii
Índice de Tabelas .............................................................................................................. iv
Índice de Espectros............................................................................................................ v
Lista de Abreviaturas......................................................................................................vii
Resumo ............................................................................................................................viii
Abstract ............................................................................................................................. ix
1. Introdução ..................................................................................................................... 1
1.1 O Sistema Nervoso Central .......................................................................................... 1
1.2. Neurotransmissão Central ........................................................................................... 4
1.3 Distúrbios Neurodegenerativos .................................................................................... 6
1.4. Glutamato .................................................................................................................... 9
1.4.1. Metabolismo e Liberação ................................................................................... 10
1.4.2. Ações/ Efeitos Fisiológicos ................................................................................ 10
1.4.3. Receptores Glutamatérgicos............................................................................... 12
1.4.3.1. Receptores Metabotrópicos ......................................................................... 14
1.4.3.2. Receptores Ionotrópicos .............................................................................. 18
1.4.3.2.1. Receptores Não – NMDA .................................................................... 18
1.4.3.2.2. Receptores NMDA ............................................................................... 20
1.5. Antagonistas NMDA ................................................................................................. 24
2. Objetivos e Justificativas ........................................................................................... 31
3. Química de Amidinas ................................................................................................. 35
3.1 Síntese de Amidinas ................................................................................................... 36
4. Metodologia e Estratégia Sintética............................................................................ 43
5. Resultados e Discussão ............................................................................................... 45
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
5.6.
5.7.
Obtenção do 2-fenil-2H-1,2,3-triazol-4-carbaldeído (1) ...................................... 45
Obtenção da 2-fenil-2H-1,2,3-triazol-4-carbonitrila (5)....................................... 46
Obtenção da (2-fenil-2H-1,2,3-triazol-4 il) metanamina (3)................................ 49
Obtenção da 3-amino-5-trifluormetil-1H-1,2,4-triazol (2)................................... 51
Tentativa de Síntese de Amidinas Triazólicas Via Método de Pinner ................. 52
Obtenção das Amidinas Triazólicas Via Método de Rouselet ............................. 55
Uso de sonicação para obtenção das amidinas ..................................................... 60
i
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
5.8.
Avaliação Farmacológica ..................................................................................... 62
6. Conclusões ................................................................................................................... 65
7. Experimentais ............................................................................................................. 68
7.1 Materiais e métodos................................................................................................... 68
7.2.
Fenil-D-glicosazona ............................................................................................. 70
7.3.
Fenil-D-glicosetriazol........................................................................................... 71
7.4.
2-Fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-carboxaldeído (1).................................................... 72
7.5.
2-Fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-carboxaldeído oxima (4)......................................... 73
7.6.
2-Fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-carbonitrila (5) ........................................................ 74
7.7.
C-(2-Fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-il)-metilamina (3) .............................................. 75
7.8.
3-Amino-5-trifluorometil-1H-1,2,4-triazol (2)..................................................... 77
7.9.
N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-benzamidina (II): via térmica 84 ...... 78
7.10.
N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-benzamidina (II):via sonicação... 79
7.11.
N-benzil-2-fenil-2H-[1,2,3]-4-carboxamidina (III): via térmica 84 .................. 80
7.12.
N-benzil-2-fenil-2H-[1,2,3]-4-carboxamidina (III): via sonicação .................. 81
7.13.
2-fenil-N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-2H-[1,2,3]-triazol-4carboxamidina (IV): via térmica 84 ................................................................................... 82
7.14.
2-fenil-N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-2H-[1,2,3]-triazol-4carboxamidina (IV): via sonicação................................................................................... 83
7.15.
Avaliação Farmacológica ................................................................................. 84
8. Referências Bibliográficas ......................................................................................... 85
9. Espectros .......................................................................... Erro! Indicador não definido.
ii
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Índice de Esquemas
Página
Esquema 1. Compostos triazólicos 1 e 2 em sínteses de substânias bioativas ..................... 33
Esquema 2. Amidinas pelo método de Pinner...................................................................... 37
Esquema 3. Amidinas via tioamidatos ................................................................................. 37
Esquema 4. Amidinas a partir de nitrilas: método via CuCl ................................................ 38
Esquema 5. Amidinas a partir de nitrilas: método via amidetos de cloroalumínio .............. 39
Esquema 6. Amidinas a partir de ésteres: método via amideto ............................................ 39
Esquema 7. Amidinas a partir de nitrila e Ln(F3CSO3)3 ...................................................... 39
Esquema 8. Amidinas via redução de amidoximas. ............................................................. 40
Esquema 9. Obtenção de amidinas a partir de oximas. ........................................................ 40
Esquema 10. Amidinas a partir de amidas:métiodo via triflatos de imínio.......................... 41
Esquema 11. Amidinas a partir de amidas: método via fluoroboratos de trietiloxônio. ...... 41
Esquema 12. Amidinas a partir de formamidas.................................................................... 42
Esquema 13. Obtenção de amidinas a partir de β-bromoestireno ........................................ 42
Esquema 14. Retroanálises para as sínteses de I e II............................................................ 43
Esquema 15. Retroanálises para as sínteses de III-V. .......................................................... 44
Esquema 16. Preparação do aldeído 1,2,3-triazólico 1......................................................... 46
Esquema 17. Reatividade dos 2-ariltriazóis 1-óxido ............................................................ 46
Esquema 18. Obtenção da nitrila 5 via N-óxido................................................................... 47
Esquema 19. Estratégia para a preparação da nitrila 5 ......................................................... 47
Esquema 20. Estratégia via método de Pinner para as sínteses das amidinas I e II. ............ 52
Esquema 21. O mecanismo de formação de imidatos. ......................................................... 53
Esquema 22. Perspectivas para as sínteses de I e V. ............................................................ 66
Esquema 23. Perspectivas para as sínteses de VI e VII........................................................ 66
i
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Índice de Figuras
Página
Figura 1. Divisão Anatômica do Sistema Nervoso ................................................................ 2
Figura 2. Mapa Funcional do Cérebro4 .................................................................................. 2
Figura 3. Alguns dos Principais Neurotransmissores............................................................. 6
Figura 4. Conformações do L-Glu e seus respectivos agonistas .......................................... 12
Figura 5. Receptores glutamatérgicos e suas respectivas subunidades 23............................. 13
Figura 6. Estrutura dos receptores metabotrópicos do glutamato ........................................ 15
Figura 7 Modelo de ação de receptores acoplados a proteina G. ......................................... 17
Figura 8. Distribuição dos receptores mGLU e seus respectivos eventos moleculares ....... 17
Figura 9. Agonistas não-NMDA .......................................................................................... 19
Figura 10. Mecanismo intracelular pelo qual NMDAR medeia neuroplasticidade e
apoptose................................................................................................................................ 21
Figura 11. Receptor NMDA fisiológico............................................................................... 22
Figura 12. Sítios moduladores do receptor NMDA.............................................................. 23
Figura 13. Receptores ionotrópicos não-seletivos................................................................ 25
Figura 14. Ifenprodil, primeiro antagonista seletivo NR1/NR2B ........................................ 26
Figura 15. Antagonistas Seletivos NR2B: protótipos e segunda geração. ........................... 27
Figura 16. Modelo Farmacofórico para os antagonistas NR2B ........................................... 28
Figura 17. Classes diversas de antagonistas NMDA/NR2B subunidade seletiva ................ 28
Figura 18. Cinamamidinas: novos protótipos de antagonistas seletivos para NR2B. .......... 29
Figura 19. Aril-amidinas: novos protótipos de antagonistas seletivos para NR2B .............. 30
Figura 20. Classificação de amidinas ................................................................................... 35
Figura 21. Formas tautoméricas das amidinas...................................................................... 35
Figura 22. Efeito das amidinas II e III na toxicidade neuronal induzida por glutamato em
culturas de células embrionárias de retina de pinto.............................................................. 64
ii
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Esquema 1. Compostos triazólicos 1 e 2 em sínteses de substânias bioativas ..................... 33
Esquema 2. Amidinas pelo método de Pinner...................................................................... 37
Esquema 3. Amidinas via tioamidatos ................................................................................. 37
Esquema 4. Amidinas a partir de nitrilas: método via CuCl ................................................ 38
Esquema 5. Amidinas a partir de nitrilas: método via amidetos de cloroalumínio .............. 39
Esquema 6. Amidinas a partir de ésteres: método via amideto ............................................ 39
Esquema 7. Amidinas a partir de nitrila e Ln(F3CSO3)3 ...................................................... 39
Esquema 8. Amidinas via redução de amidoximas. ............................................................. 40
Esquema 9. Obtenção de amidinas a partir de oximas. ........................................................ 40
Esquema 10. Amidinas a partir de amidas:métiodo via triflatos de imínio.......................... 41
Esquema 11. Amidinas a partir de amidas: método via fluoroboratos de trietiloxônio. ...... 41
Esquema 12. Amidinas a partir de formamidas.................................................................... 42
Esquema 13. Obtenção de amidinas a partir de β-bromoestireno ........................................ 42
Esquema 14. Retroanálises para as sínteses de I e II............................................................ 43
Esquema 15. Retroanálises para as sínteses de III-V. .......................................................... 44
Esquema 16. Preparação do aldeído 1,2,3-triazólico 1......................................................... 46
Esquema 17. Reatividade dos 2-ariltriazóis 1-óxido ............................................................ 46
Esquema 18. Obtenção da nitrila 5 via N-óxido................................................................... 47
Esquema 19. Estratégia para a preparação da nitrila 5 ......................................................... 47
Esquema 20. Estratégia via método de Pinner para as sínteses das amidinas I e II. ............ 52
Esquema 21. O mecanismo de formação de imidatos. ......................................................... 53
Esquema 22. Perspectivas para as sínteses de I e V. ............................................................ 66
Esquema 23. Perspectivas para as sínteses de VI e VII........................................................ 66
iii
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Índice de Tabelas
Tabela 1. Assinalamentos propostos para oxima 4............................................................... 48
Tabela 2. Assinalamentos propostos para amina 3............................................................... 50
Tabela 3. Assinalamentos para a amidina II......................................................................... 57
Tabela 4. Assinalamentos propostos para a amidina III...................................................... 59
Tabela 5. Efeito das amidinas II e III na toxicidade neuronal induzida por glutamato em
culturas de células embrionárias de retina de pinto.............................................................. 63
Tabela 6. Vias térmica e sonicação nas sínteses das amidinas II-IV.................................... 65
iv
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Índice de Espectros
Página
Espectro 1. Espectro de I.V (Pastilha) do aldeído triazólico 1. ...................................... 91
Espectro 2. Espectro de 1H RMN (300 MHz;CDCl3; ppm) do aldeído triazólico 1. ..... 92
Espectro 3. Espectro de I.V (Pastilha) da oxima 4. ........................................................ 93
Espectro 4. Espectro de 1H RMN (300 MHz;CDCl3; ppm) da oxima 4. ....................... 94
Espectro 5. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz;CDCl3; ppm) da oxima 4. ........... 95
Espectro 6. 13C RMN (75 MHz; CDCl3; ppm) da oxima 4. ........................................... 96
Espectro 7. 13C RMN-HETCOR (75 MHz; CDCl3; ppm) da oxima 4........................... 97
Espectro 8. Espectro de I.V (Pastilha) da nitrila 5.......................................................... 98
Espectro 9. Espectro de 1H RMN (300 MHz; CDCl3; ppm) da nitrila 5........................ 99
Espectro 10. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; CDCl3; ppm) da nitrila 5........ 100
Espectro 11. Espectro de I.V (filme) da amina 3.......................................................... 101
Espectro 12. Espectro de 1H RMN (300 MHz;CDCl3; ppm) da amina 3..................... 102
Espectro 13. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz;CDCl3; ppm) da amina 3......... 103
Espectro 14. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz;CDCl3; ppm) da amina 3Expansão....................................................................................................................... 104
Espectro 15. Espectro de 13C RMN (CDCl3; ppm) da amina 3.................................... 105
Espectro 16. Espectro de I.V (pastilha) da amina 2...................................................... 106
Espectro 17. Espectro de 1H RMN (300 MHz; CD3COCD3; ppm) da amina 2. .......... 107
Espectro 18. Espectro de I.V (Pastilha) da amidina II.................................................. 108
Espectro 19. Espectro de 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II. ......... 109
Espectro 20. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II.
...................................................................................................................................... 110
Espectro 21. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II –
Expansão....................................................................................................................... 111
Espectro 22. Espectro de 13C RMN (75300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II. .... 112
Espectro 23. Espectro de 13C RMN (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II. .......... 113
Espectro 24. Espectro de I.V (Pastilha) da amidina III. ............................................... 114
Espectro 25. Espectro de 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III. ........ 115
vi
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 26. Espectro de 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6 + 10 gotas de D2O; ppm) da
amidina III. ................................................................................................................... 116
Espectro 27. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III.
...................................................................................................................................... 117
Espectro 28. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III –
Expansão....................................................................................................................... 118
Espectro 32. Espectro de 13C RMN (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III .......... 119
Espectro 29. 13C RMN-HETCOR (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III. ........... 120
Espectro 30. 13C RMN-HETCOR (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III – Expansão
1. ................................................................................................................................... 121
Espectro 31. 13C RMN-HETCOR (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III – Expansão
2. ................................................................................................................................... 122
Espectro 33. Espectro de I.V (Pastilha) da amidina IV. ............................................... 123
Espectro 34. Espectro de 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina IV ......... 124
Espectro 35. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina IV.
...................................................................................................................................... 125
Espectro 36. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina IV –
Expansão....................................................................................................................... 126
vii
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Lista de Abreviaturas
AIDS
Síndrome da imunodeficiência adquirida
EAA
Aminoácidos excitatórios
ED50
Dose efetiva média (dose farmacologicamente ativa em 50% da
população exposta)
GABA
Ácido gama-aminobutírico
HSV I
vírus da herpes simplex
IV
Infravermelho
IC50
Concentração média inibitória (concentração da droga capaz de inibir
50% dos receptores)
iGluRs
Receptores glutamatérgicos ionotrópicos
J
Constante de acoplamento
KA
Ácido caínico
ki
Concentração capaz de ocupar 50% dos sítios do receptor
L-Glu
Glutamato ou ácido (S)-L-Glutâmico
Lit.
Literatura
LTD
Depressão de longa duração
LTP
Potencialização de longa duração
mGluRs
Receptores glutamatérgicos metabotrópicos
NMDA
N-metil-D-aspartato
NMDAR
Receptor glutamatérgico NMDA
NR
Subunidade Protéica do Receptor NMDA
ppm
Parte por milhão
RMN
Ressonância Magnética Nuclear
SAR
Relação estrutura-atividade
SNC
Sistema Nervoso Central
TCID
Dose infecciosa para cultura de tecidos
TMS
Tetrametilsilano
vii
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Resumo
Neste trabalho foram sintetizadas três novas amidinas portadoras dos sistemas 1,2,3e 1,2,4-triazol com potenciais atividades antagonistas do NMDA subtipo NR2B no sistema
nervoso central: N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-benzamidina (II), N-benzil-2fenil-2H-[1,2,3]-4-carboxamidina (III) e 2-fenil-N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3il)-2H-[1,2,3]-triazol-4-carboxamidina (IV).
Enquanto a amidina II foi preparada a partir da reação entre a benzonitrila e o 3amino-5-trifluorometil-1H-1,2,4-triazol (2) promovida por CuCl a 80oC, as amidinas III e
IV foram obtidas a partir das reações entre a 2-fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-carbonitrila (5) e a
benzilamina e a amina 2, respectivamente.
Quando as preparações de II, III e IV foram efetuadas empregando-se sonicação,
observou-se uma redução considerável do tempo reacional sem prejuízo dos rendimentos
químicos.
Os ensaios farmacológicos preliminares indicaram que as amidinas triazólicas II e
III possuem efeito neuroprotetor por pré-condicionamento. As amidinas II e III não
apresentaram efeito neurotóxico quando incubadas em culturas purificadas de neurônios e
fotorreceptores de embrião de pinto, mostrando-se efetivas na redução da excitotoxicidade
mediada pelo glutamato. Culturas pré-tratadas com a amidina II tiveram um aumento da
sobrevida neuronal em 48% quando comparadas a culturas expostas apenas ao glutamato,
enquanto que o pré-condicionamento com a amidina III levou a um aumento da sobrevida
neuronal em 60%.
viii
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Abstract
Three novel amidines containing the 1,2,3- and 1,2,4-triazole moiety with potential
NMDA/ NR2B antagonist activities in the central nervous system were synthesized: N-(5trifluormethyl-2H-[1,2,4]-triazole-3-yl)-benzamidine (II), N-benzyl-2-phenyl-2H-[1,2,3]-4carboxamidine (III) and 2-phenyl-N-(5-trifluormethyl-2H-[1,2,4]-triazole-3-yl)-2H-[1,2,3]triazole-4-carboxamidine (IV).
While amidine II has been prepared from reaction of benzonitrile and 3-amino-5trifluormethyl-1H-1,2,4-triazole (2) promoted by CuCl at 80oC, the compounds III and IV
were prepared from reactions of the 2-phenyl-2H-[1,2,3]-triazole-4-carbonitrile (5) with the
appropriate amines, namely benzylamine or amine 2, respectively.
In the syntheses II, III and IV carried out by sonication, faster reactions were
obtained without loose of chemical yield.
Biological activity of the prepared compounds was measured in purified cultures of
retinal neurons and photoreceptors. Initial experiments showed that amidines II and III
have neuroprotective effects without themselves inducing neurotoxicity. Pretreatment of
cultures with amidines II and III inhibited the cell death induced by glutamate:
neurotoxicity was reduced by 48 or 60% when amidine II or amidine III, respectively, was
present during glutamate exposure.
ix
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
1. Introdução
1.1 O Sistema Nervoso Central
O sistema nervoso, juntamente com o sistema endócrino, capacita o organismo a
perceber as variações do meio, a difundir as modificações que essas variações produzem e a
executar as respostas adequadas para que seja mantido o equilíbrio interno do corpo
(homeostase).
Enquanto o sistema endócrino controla as diversas funções do organismo
principalmente interferindo no metabolismo; o sistema nervoso produz e regula todos os
aspectos das funções do corpo humano, exercendo controle sobre quase todas as atividades
ou eventos que ocorrem a cada momento no organismo, possuindo uma complexidade
infinita (Figura 1).1 A habilidade de nosso Sistema Nervoso aprender, mudar e responder
ao meio-ambiente reflete a capacidade essencial dos neurônios modificarem dinamicamente
as intensidades de suas conexões.2 Bilhões de neurônios agrupados para diferentes funções
checam, constantemente, o meio interno da nossa anatomia e o universo exterior: luz, tato,
pressão, som, equilíbrio, imagens, concentrações de muitas substâncias, dor, emoção,
consciência. Grupos de neurônios interagem e transmitem a informação resultante a outros
grupos para que ela seja processada e armazenada. Mediante o mesmo processo, outros
neurônios regulam a contração dos músculos e a secreção das glândulas endócrinas e
exócrinas.
O cérebro, o centro de controle que armazena, computa, integra e transmite a
informação, contém ao redor de 1011 neurônios e cada um deles forma conexões, chamadas
sinapses, com até duzentos mil (200.000) outros neurônios.3 Por ser um órgão de enormes
variações e classificações anatômicas, até hoje existe uma grande dificuldade de
compreensão fisiológica e farmacológica do mesmo. Na Figura 2 é representado um mapa
Kufller S.W.; Nicholls J.G.; Martin A.R. From neuron to brain, 2nd Ed.; Sinauer: Massachussets, 1984.
Luján, R.; Shigemoto, R.; Lopez-Bendito, G. Neuroscience, 2005, 130, 567.
3
Lent, R. Cem bilhões de neurônios: conceitos fundamentais; Ed. Ateneu: Rio de Janeiro, 2001.
1
2
1
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
funcional do cérebro4 e, se levarmos em conta as funções desempenhadas por este órgão,
podemos dizer que o Sistema Nervoso Central (SNC) é a parte do organismo de maior
importância.5
Figura 1. Divisão Anatômica do Sistema Nervoso
Figura 2. Mapa Funcional do Cérebro
Da mesma forma, fármacos que atuam sobre o SNC têm valor terapêutico
inestimável no cotidiano das pessoas, podendo produzir efeitos tanto fisiológicos quanto
4
5
www.psicossomatica-sp.org.br acessado em 10/06/2004.
Planeta, C.S. & Lucia, R. de. Farmacologia Integrada; Ed. Ateneu: Rio de Janeiro, 1991.
2
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
psicológicos tais como o alívio da dor ou febre e a redução das crises epilépticas. No
domínio do humor e do comportamento, estes fármacos podem, por exemplo, agir no alívio
do stress e ansiedade exacerbada, reduzir os sintomas de distúrbios mentais como a
esquizofrenia, a depressão endógena e a mania. Por outro lado, o uso de fármacos que
afetam o SNC sem prescrição médica ou finalidade terapêutica é amplamente praticado
podendo afetar desfavoravelmente a vida das pessoas, quando seu uso leva à dependência
ou a eventos adversos graves como, por exemplo, a superdosagem letal. Além disso, a
escalada no consumo de substâncias de abuso tem gerado vários problemas sociais e
econômicos em todo mundo.6
As doenças que envolvem o SNC são numerosas e muitas não têm explicações
fisiopatológicas, de modo que as intervenções farmacológicas ainda representam um
desafio para o profissional da área médica. Desta forma, a qualidade das substâncias que
afetam o SNC e o comportamento coloca os pesquisadores frente a um extraordinário
desafio cientifico: a tentativa de entender as bases moleculares e celulares das funções
enormemente complexas e variadas do cérebro humano. Neste sentido, os farmacologistas
têm dois objetivos: utilizar fármacos na tentativa de elucidar os mecanismos que operam no
SNC normal e desenvolver novas substâncias apropriadas para corrigir efeitos
fisiopatológicos no SNC anormal. 6
Embora o conhecimento da anatomia, da fisiologia e da química do SNC esteja
longe de ser completo, a aceleração das pesquisas interdisciplinares sobre o SNC tem
levado a um progresso notável. Nos últimos anos, em especial na denominada “década do
cérebro” (1990´s), o desenvolvimento de diferentes estratégias tais como comportamental,
eletrofisiológica, neuroquímica e clínica produziram mudanças conceituais importantes no
conhecimento dos fármacos que atuam no SNC. Os avanços na elucidação dos mecanismos
de ação de fármacos forneceram meios para o desenvolvimento de novas substâncias mais
potentes e agentes terapêuticos mais seletivos com poucos efeitos adversos, como também
uma maior compreensão dos mecanismos moleculares da própria função neuronal. 6
6
Goodman & Gilman. As Bases Farmacológicas da Terapêutica. 9ª Ed.; McGraw-Hill: New York, 1996.
3
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Sabe-se atualmente que a maioria dos fármacos que afeta o SNC atua alterando
alguma etapa do processo de neurotransmissão, de modo que as ações destas substâncias
podem ser relacionadas com eventos sinápticos deste processo: enquanto alguns fármacos
agem de modo pré-sináptico, influenciando a produção, o armazenamento ou o término da
ação do neurotransmissor; outros podem ativar ou bloquear os receptores pós-sinápticos.
1.2. Neurotransmissão Central
Como visto anteriormente, o cérebro pode ser considerado como uma coleção de
sistemas neurais inter-relacionados que se auto e inter-regulam de forma dinâmica e
complexa. Desta forma, ao examinarmos os efeitos das drogas no SNC devemos dedicar
atenção especial aos princípios de organização dos neurônios.
Os neurônios apresentam características bioquímicas semelhantes às de outras
células vivas, além de atividades específicas como a de transmitir impulsos nervosos. Para
tanto, eles necessitam manter um gradiente iônico como também sintetizar e liberar
substâncias químicas conhecidas como neurotransmissores. Deste modo, cada neurônio,
em condições fisiológicas, sintetiza um determinado neurotransmissor que será liberado em
seus terminais. Nas sinapses, regiões microscópicas entre o terminal de um neurônio e a
superfície receptora de outro, a chegada de um impulso nervoso causa rápida liberação dos
neurotransmissores. Estas moléculas se difundem através da fenda sináptica e agem em
receptores específicos na membrana pós-sináptica alterando a atividade elétrica do
neurônio receptor. Cada sinapse funciona independentemente e apresenta um padrão de
atividade dinâmico, onde suas propriedades podem se modificar ao longo do tempo, em
resposta a estes estímulos ambientais. A essas modificações dá-se o nome de Plasticidade
Sináptica.7 Além disso, diversas modificações na eficácia da transmissão sináptica são
mediadas pelos receptores dos neurotransmissores. 2, 6
7
Bliss, T.V.P. & Collingridge, G.L. Nature 1993, 361, 31.
4
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Os neurotransmissores centrais formam um sistema múltiplo e complexo, alguns
desempenhando funções facilitatórias (neurotransmissores excitatórios) enquanto outros
desempenham funções inibitórias (neurotransmissores inibitórios), dependendo da
natureza do efeito que provoquem. A estimulação de neurônios inibitórios provoca uma
hiperpolarização da membrana pós-sináptica, denominado de “potencial inibitório póssináptico” (PPSI), enquanto que a ativação de neurônios excitatórios provoca a
despolarização da membrana denominada” potencial estimulatório pós-sináptico”
(PPSE).
Os neurotransmissores não estão distribuídos aleatoriamente no cérebro, mas, ao
contrário, estão localizados em estruturas específicas. A superposição desses diferentes
sistemas neuronais em um circuito neuronal mais amplo, dá ao SNC uma incrível dimensão
de modulação e especificidade2,
4, 6
Existem, na grande maioria dos neurônios, sinapses
inibitórias e excitatórias, de modo que os neutrotransmissores inibitórios e excitatórios
interagem modulando as funções nervosas de uma maneira balanceada. Desta forma, o
resultado das duas influências determinará se o neurônio aumentará ou diminuirá sua
velocidade de disparo, ou mesmo se gerará um potencial de ação. Com isto, o efeito geral
resultante deve-se a soma dos efeitos individuais dos vários neurotransmissores sobre o
neurônio. Conseqüentemente, qualquer manipulação que afete um ou mais componentes
destes sistemas, modifica este balanço que se manifesta através de alterações na função do
SNC.5
Aproximadamente 30 substâncias diferentes são conhecidas ou suspeitas de serem
neurotransmisssores (Figura 3). Os principais neurotransmissores cuja distribuição e
função em algumas áreas do SNC estão bem definidas são: acetilcolina, monaminas
(dopamina, noradrenalina, serotonina e histamina), aminoácidos inibitórios (ácido gamaaminobutírico, GABA, e glicina), aminoácidos excitatórios (ácidos L-glutâmico e Laspártico) e neuropeptídeos.
5
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
OH
O
N
+
O
N
Acetilcolina
HO2C
N
H
Histamina
NH2 H2N
Glicina
NH2 H2N
CO2H
GABA
N
H
Serotonina
NH2
HO2C
CO2H
Ácido L-Glutâmico
(Glutamato)
HO
NH2
HO
Dopamina
OH
HO
HO
NH2
Noradrenalina
Figura 3. Alguns dos Principais Neurotransmissores
1.3 Distúrbios Neurodegenerativos
Com poucas exceções, os neurônios são incapazes de se dividir ou sofrer
regeneração quando seus axônios são interrompidos. Por conseguinte, qualquer processo
patológico passível de provocar perda neuronal geralmente causa conseqüências
irreversíveis.8 Isto pode ser exemplificado pela comparação do cérebro de um indivíduo de
cem anos de idade com o cérebro de um adulto de aproximadamente cinqüenta anos
acometido pelo Mal de Alzheimer, como mostrado a seguir.
Indivíduo de 100 anos
8
Indivíduo com Mal de Alzheimer
Rang, H.P.; Dale, M.M.; Ritter, J.M.; Moore, P.K.; Farmacologia, 5a Ed.: Elsevier, 2003.
6
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Os distúrbios neurodegenerativos são caracterizadas pela perda neuronal de forma
progressiva e irreversível. Entre as doenças neurodegenerativas mais comuns estão a
doença de Alzheimer, na qual a perda de neurônios hipocampais e corticais leva a perda de
memória e das habilidades cognitivas; doença de Parkinson e doença de Huntington, onde a
perda de neurônios de estruturas dos gânglios da base levam a perda do controle dos
movimentos, e esclerose lateral amiotrófica (ELA), onde a fraqueza muscular resulta da
degeneração espinhal, bulbar e de neurônios corticais motores.5
À primeira vista, esta área não parece ser adequada para a intervenção
farmacológica e, com efeito, a terapia farmacológica tem atualmente muito pouco a
oferecer, exceto, no caso da doença de Parkinson. Entretanto, o fato das doenças
neurodegenerativas serem relativamente comuns em população de idade avançada (a
Doença de Parkinson é observada em cerca de 1% em indivíduos acima de 65 anos,
enquanto Doença de Alzheimer em 10% dessa população) levou a um trabalho intenso de
pesquisa nos últimos anos o que poderá ser traduzido em avanços terapêuticos em um
futuro não muito distante.8
Estudos recentes levaram a suposição de que um grande número de distúrbios
neuropsiquiátricos, que vão desde o retardo mental à esquizofrenia, pode ser visto como
interações de influências genéticas e ambientais com as características fisiológicas
intrínsecas (como estresse oxidativo e produção tóxica de radicais livres) de uma população
afetada de neurônios. Sabe-se que os fatores genéticos acometem o cérebro imaturo em
estágios críticos do desenvolvimento. Com relação aos fatores ambientais, um grande
empenho tem sido feito a fim de se elucidar os mecanismos pelos quais os mesmos podem
alterar o desenvolvimento do cérebro, levando a distúrbios neurocomportamentais que
podem ser expressos tanto na infância quanto na idade adulta.9, 10, 11
Olney, J.W.; Farber, N. V. Neuropsychopharmacology 1995, 13, 335.
Olney, J.W. NeuroToxicology 2002, 23, 659.
11
Rajendra, W.; Armugama, A.; Jeyaseelana, K. Brain Research Rev. 2004, 45, 125.
9
10
7
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
No inicio da década de 70 duas novas palavras, apoptose e excitotoxicidade, foram
introduzidas por dois diferentes grupos de pesquisa que estudavam os vários processos de
morte celular. 9, 12 Em 1972, Kerr introduziu o termo apoptose para se referir ao processo de
morte de células que possuíam características morfológicas específicas e ocorriam em uma
variedade de diferentes circunstâncias, todas com programação celular. Subseqüentemente,
estes autores, baseados em critérios ultraestruturais, propuseram que toda morte celular se
ajustaria a duas categorias as quais foram nomeadas “apoptose” e “necrose”.12
Em 1971, Olney introduziu o termo excitotoxicidade para se referir a um processo
agudo pelo qual o neurotransmissor endógeno glutamato leva a morte celular no SNC tanto
de roedores quanto de primatas.9
Como será mostrado mais adiante, em concentrações normais o glutamato é crucial
para as funções cerebrais como aprendizado e memória. Por outro lado, em altas
concentrações, o aumento da atividade celular causada pelo glutamato resulta em
superexcitação das células nervosas, o que eventualmente pode levar a morte celular.
Quando o glutamato causa danos celulares ele se torna uma excitotoxina e a teoria segundo
a qual o glutamato causa danos celulares é denominada Teoria Excitatória.9
A excitotoxicidade é um mecanismo crítico que contribui para neurodegeneração
durante isquemia e hipóxia. Atualmente acredita-se que um amplo número de doenças
neurodegenerativas agudas como Alzheimer, Parkinson e Huntington, esclerose lateral
amiotrópica e dementia decorrente da AIDS são causadas, no mínimo em parte, pela ação
excitatória do glutamato. Existem evidências crescentes de que durante qualquer tipo de
insulto cerebral, com exceção do dano neuronal direto, provavelmente ocorra uma mudança
no sistema glutamatérgico (liberação e recaptação) o que deve ocasionar o aumento da
sensibilidade neuronal a estímulos fisiológicos prévios levando a danos neuronais
secundários. Do mesmo modo, até mesmo a perda típica da memória, confusão e a suave
deteriorização que freqüentemente ocorre em idades avançadas devem ser causada pela
12
Kerr J.F.R.; Wyllie A.H.; Currie A.R. Brit. J. Cancer 1972, 26, 239.
8
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
excitotoxidade dos aminoácidos excitatórios (EAA). Da mesma forma, doenças agudas e
condições clínicas como danos cerebrais causados por derrame, isquemia cerebral (redução
do fluxo sanguíneo), hipóxia/ anóxia (exposição a CO2 / CN-, ou afogamento), traumatismo
craniano, choque hipoglicêmico, além de síndrome de abstinência, dor de cabeça, crises
epiléticas prolongadas são causadas também em parte pela excitotoxicidade mediada pelo
glutamato/ aspartato. Com isto, pesquisas têm sido cada vez mais focalizadas nos meios de
se combatar a excitotoxicidade.11, 13, 14
Os principais eventos da cascata desencadeada pelo aumento das concentrações de
EAA incluem superestimulação dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (os quais
serão vistos detalhadamente na seção 1.4.3.2), influxo de cálcio para o meio intracelular,
ativação de uma série de enzimas sensíveis ao cálcio como N-óxido sintetase (NOS),
produção de espécies reativas de oxigênio, destruição de mitocôndrias e subseqüente
apoptose ou necrose.13
1.4. Glutamato
Dos aminoácidos excitatórios, o ácido (S)-L-Glutâmico ou L-Glutamato (L-Glu) é
considerado como o principal neurotransmissor excitatório no SNC de mamíferos. Os
aminoácidos excitatórios (EAA) desempenham um papel fundamental em um grande
número de processos fisiológicos dentre as quais se destacam memória e aprendizado,
regulação neuroendócrina, controle motor e migração neuronal no cérebro em
desenvolvimento. Além disso, estão envolvidos com disfunção neuronal tanto aguda quanto
crônica, como epilepsia, esquizofrenia, isquemia, entre outras.15, 16
Parsons,C.G.; Danysz, W.; Quack G. Drug News Perspect. 1998, 11, 523.
Loftis, J. M.; Janowsky, A. Pharmacology & Therapeutics 2003, 97, 55.
15
Tristr D.G. Pharmaceutica Acta 2000, 74, 221.
16
Moloney, G.M. Nat. Prod. Rep. 1998, 205.
13
14
9
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
NH2
HO2C
CO2H
Ácido (S)-L-Glutâmico
(L-Glu ou Glutamato)
1.4.1. Metabolismo e Liberação
O glutamato tem uma distribuição ampla e bastante uniforme no SNC, onde sua
concentração é muito maior que a observada em outros tecidos. O glutamato nos neurônios
do SNC provém principalmente da glicose, através do ciclo de Krebs, ou da glutamina, que
é sintetizada por células gliais e captada por neurônios. De modo semelhante a outros
transmissores, o glutamato é armazenado em vesículas sinápticas e liberado por exocitose
cálcio-dependente.8
A ação do glutamato é interrompida principalmente pela sua captação mediada por
transportador nas terminações nervosas e nas células vizinhas da glia. Em algumas
circunstâncias como, por exemplo, despolarização por aumento de potássio intracelular,
esse transporte pode funcionar de modo inverso, constituindo uma fonte de liberação de
glutamato, processo este que pode ocorrer em condições patológicas.8
1.4.2. Ações/ Efeitos Fisiológicos
Os níveis neuronais de L-Glu são altos (10 mM) e constantes. Estão envolvidos em
vários processos bioquímicos, tais como o metabolismo energético, a síntese de ácidos
graxos, a regulação dos níveis de amônia, a composição de proteínas e peptídeos.17 Além
disso, o L-Glu pode ser encontrado em vesículas sinápticas com liberação Ca2+ dependente
ou como precursor do ácido gama aminobutírico (GABA) em sinapses inibitórias.
Teichberg V.I. Amino Acid Receptors. In: Schulster D., Levitzki A., Eds. Celular receptors for hormones
and neurotransmitters; New York: Willey, 1980.
17
10
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
O L-Glu participa da plasticidade sináptica produzindo mudanças de longa duração
na excitabilidade neuronal como a potencialização de longa duração, LTP (“long-term
potentiation”), da transmissão sináptica nos neurônios do hipocampo e córtex visual e
depressão de longa duração, LTD (“long-term depression”) no cerebelo e córtex visual, que
são fenômenos caracterizados por aumento ou redução na eficácia da comunicação
sináptica, respectivamente sendo os principais correlatos moleculares dos processos de
aprendizado e memória.8, 7, 18, 19 Outras demonstrações das ações do L-Glu nos neurônios
incluem os efeitos produzidos no desenvolvimento neuronal a partir da ativação dos
receptores para aminoácidos excitatórios.20 O L-Glu é o maior estimulante quimiotático
durante o desenvolvimento neuronal e sinaptogênese. A ativação dos receptores EAA
diminui seletivamente a síntese de DNA e a divisão celular nas células progenitoras
neuronais da zona ventricular do córtex cerebral embrionário. O L-Glu é também um dos
estimuladores para o início da migração no desenvolvimento do córtex cerebelar,
modulação do crescimento axonal e sobrevivência da formação sináptica de alguns
neurônios em cultura.
A importância do L-Glu como mediador de eventos neuropáticos foi demonstrada
ao mesmo tempo em que sua atividade como um neurotransmissor excitatório no SNC foi
estabelecida.8, 21 Como visto anteriormente, após estudos iniciais, ficou bastante claro que
este neurotransmissor fazia parte das etapas que levavam a neurodegeneração em uma
variedade de doenças incluindo isquemia, danos neuronais hiperglicêmicos, neuropatologia,
estados inflamatórios e neurodegenerativos associados à infecção viral no SNC,
neurodegeneração crônica associada ao mal de Alzheimer, Hunting e esclerose lateral
amiotrópica.
Todos os efeitos produzidos pela ação do L-Glu são decorrentes das alterações de
longa duração na função e na estrutura neuronal, trazidas tanto pela ativação persistente ou
inibição dos receptores do glutamato. Estas alterações que se iniciam pela ativação da
Mcnaughton B.L.; Douglas R. M. & Goddart G.V. Brain Res , 1978, 15: 277.
Levy W.B. & Steward O. Brain Res 1979, 175: 233.
20
LoTurco, J. J., Owens; D. F.; Heath, M. J., Davis, M. B. & Krisegstein, A. R. Neuron. 1995, 15, 1287.
21
Michaelis, E. K. Progr. Neurobiol., 1998, 54, 369.
18
19
11
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
superfície dos receptores para EAA, gerando mudanças na atividade metabólica, expressão
gênica e síntese protéica nos neurônios.
1.4.3. Receptores Glutamatérgicos
O Glutamato é uma molécula altamente flexível. Em 1974, Johnstons e
colaboradores propuseram que o L-Glu deveria existir em solução sob, pelo menos, duas
diferentes conformações (Figura 4): uma é denominada conformação extendida ou linear
(“extended conformation”) e outra conformação dobrada ou pregueada (“folded
conformation”) e, conseqüentemente, deveria haver, no mínimo, dois tipos de receptores
glutamatérgicos com diferentes sítios de reconhecimento.22 Estes autores também
propuseram que o ácido caínico (KA), um análogo da conformação pregueada, deveria
atuar em receptores diferentes daqueles em que um análogo da conformação extendida,
como o N-metil-D-aspartato (NMDA), atuaria. A idéia inicial de Johnstons foi fortalecelida
pelo o uso de vários outros análogos do L-Glu e D-aspartato, sendo estendida
posteriormente para definir os subtipos de receptores para EAA de maior importância.
NH2
HO2C
HO2C
CO2H
L-Glu: conformação linear
CO2H
L-Glu: conformação pregueada
CO2H
CO2H
NHCH3
HO2C
NH2
CO2H
NH
NMDA
KA
Figura 4. Conformações do L-Glu e seus respectivos agonistas
Nos últimos anos, avanços na biologia molecular dos receptores glutamatérgicos,
revelaram a grande complexidade de suas estruturas protéicas.21 Vinte e oito genes estão
agora claramente identificados para as subunidades especificas destes receptores e outras
22
Curtis, D. R. & Johnston, G. A.R. Nature, 1974, 248, 804.
12
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
cinco proteínas agem igualmente como subunidades do receptor ou estão associadas aos
receptores.
21
Os receptores glutamatérgicos podem ser divididos em duas classes gerais
(Figura 5): aqueles que formam canais iônicos ou ionotrópicos (iGluRs) e aqueles ligados
à proteína G ou metabotrópicos (mGluRs).11, 15, 23 Ambas as classes de receptores podem
ativar cascatas que determinam a sobrevivência ou a morte celular. Esta dicotomia parece
resultar da diferença de duração e magnitude da ação e os subseqüentes níveis de cálcio
intracelular. A ativação dos receptores metabotrópicos causa a mobilização de cálcio dos
seus estoques internos enquanto a ativação dos receptores ionotrópicos leva a
permeabilidades aos íons sódio, potássio e/ou cálcio.11, 23, 24
Figura 5. Receptores glutamatérgicos e suas respectivas subunidades
Tanto os receptores iGlu quanto os mGlu podem ser subdivididos com base na
homologia estrutural, especificidade de agonistas e inibição por antagonistas específicos. A
caracterização farmacológica e fisiológica destes receptores levou a definição de três
subtipos de receptores ionotrópicos, KA, AMPA e NMDA, e três grupos de receptores
metabotrópicos (mGlu1-3).15
23
24
Carobrez, A. P. Rev. Bras. Psiq. 2003, 25 (Supl II), 52.
Lu, J.; Goula, D.; Sousa, A. N.; &. Almeida, O.F. X. Neuroscience 2003, 121, 123.
13
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
A grande diversidade das montagens macromoleculares que vão resultar na
formação de várias combinações destas subunidades protéicas é o resultado do
desenvolvimento evolutivo que ofereceu aos neurônios a vantagem de receber sinais
extracelulares e traduzi-los em mensagens intracelulares. Por outro lado, esta abundância
leva a uma grande dificuldade na elucidação dos processos através dos quais cada neurônio
recebe os sinais do L-Glu no SNC. A complexidade de proteínas é ainda incrementada pela
variedade de cascatas de transdução intracelular que serão iniciadas pela ativação da
superfície dos receptores. Essas cascatas incluem, por exemplo, a ativação ou inibição de
enzimas, a liberação ou a inibição da liberação de mensageiros intracelulares como inusitol1,4,5-trifosfato (IP3), Ca
2+
, espécies reativas de oxigênio (ROS), espécies reativas de
nitrogênio (RNS), AMP cíclico, ou a formação e liberação de mensageiros transcelulares
como óxido nítrico (NO) e ácido aracdônico.21
As etapas de transdução intracelular ou intercelular ativadas pela ação do L-Glu nos
receptores de EAA eventualmente levam a eventos igualmente complexos na regulação de
genes, como a transcrição de fatores que alteram a expressão de proteínas neuronais. A
ativação de ambas as espécies de receptores e a liberação de segundos mensageiros são
importantes alvos terapêuticos. Assim, a necessidade da busca por uma intervenção
farmacológica altamente seletiva é tão clara quanto a importância dos receptores de EAA
na saúde e nas desordens neuronais.
1.4.3.1. Receptores Metabotrópicos
Os receptores metabotrópicos foram descobertos em 1985.25 Eles possuem
propriedades farmacológicas únicas e alto grau de variabilidade nos eventos de transdução
do impulso nervoso. Estes receptores controlam a atividade de enzimas membranares e
canais iônicos e diferem dos receptores ionotrópicos, tanto estrutural quanto
funcionalmente, consistindo em uma única cadeia polipeptídica que apresenta sete
25
Sladeczek, F., Pin, J. P., Recasens, M., Bockaert, J. & Weiss ,S. Nature 1985, 317, 717.
14
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
domínios transmembranares (Figura 6).26,
27
Ao contrário dos receptores ionotrópicos,
muito pouco se conhece a respeito das funções dos receptores metabotrópicos na
transmissão sináptica, LTP, aprendizado e desenvolvimento.28
Figura 6. Estrutura dos receptores metabotrópicos do glutamato
Conforme mostrado na Figura 5 (vide página 13), os receptores metabotrópicos
compreendem uma família de no mínimo oito receptores, mGlu1–mGlu8, acoplados a
proteína G e ligados a uma variedade de segundos mensageiros.29,
30, 31, 32
Eles são
classificados em três grupos de acordo com a homologia na seqüência de aminoácidos,
farmacologia e seqüência transducional que ativam: Grupo I (mGLUR1), contendo mGlu1 e
mGlu5, quais estão ligados a ativação da fosfolipase C; Grupo II (mGluR2), que
compreende mGlu2 e mGlu3; Grupo III (mGluR3) que inclui mGlu4, mGlu6, mGlu7 e
mGlu8. Os receptores metabotrópicos do grupos II e III estão negativamente acoplados a
adenilato ciclase.22, 29, 30, 31, 32
Pin, J. P., Fagni, L. & Bockaert, J. Curr. Drugs: Neurodegenerative Disorders 1993, 1, 111.
Schoepp, D. D. & Conn, P. J. TIPS 1993, 141, 13.
28
Höelscher, C.; Gigg, J.; O'Mara; S. M. Neurosc. Biobehav. Rev. 1999, 23, 399.
29
Abe, T., Sugihara, H., Nawa, H., Shigemoto, R., Mizuno, N. and Nakanishi, S. J. Biol. Chem. 1992, 267,
1336.
30
Nakanishi, S. Science 1992, 258, 597.
31
Tanabe, Y., Masu, M.; Ishii, T.; Sigemoto, R. & Nakanishi, S. Neuron 1992, 8, 169.
32
Duvoisin, R. M.; Zhang, C. & Ramonell, K. J. Neurosci 1995, 15, 3075.
26
27
15
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Cada receptor metabotrópico interage com um tipo específico de proteína-G, o que
lhe confere especificidade na resposta celular (Figura 7).33 Uma vez ativada, a proteína-G
age estimulando ou inibindo proteínas efetoras que, em geral, catalisam a síntese de
segundos mensageiros: cAMP, cGMP, diacil glicerol (DAG), IP3 (inositol trifosfato) e
ácido araquidônico (AA).
Durante a cascata de ativação celular, essas moléculas irão desencadear uma
variedade de processos bioquímicos, que podem incluir da abertura ou fechamento de
canais iônicos até a síntese protéica (Figura 8).34 Os eventos celulares, mediados por
segundos mensageiros, têm latências de milisegundos ou até minutos. Por tais
características, esse sistema atua na sinalização lenta, porém sustentada, modulando a
atividade de neurotransmissão rápida.
Robert S.; Feldman J.S.; Meyer L.F. Principles of neuropsycopharmacology; Ed. Sinauer Assoc.:
Massachussets, 1997.
34
Konradi, C.; Heckers S. Pharmacol. Ther. 2003, 97, 153.
33
16
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Figura 7 Modelo de ação de receptores acoplados a proteina G. Após a interação do agonista
com o receptor, a subunidade α da proteína-G troca uma molécula de GDP por uma de GTP ligada a sua
estrutura. Esta subunidade se dissocia das subunidades β e γ, e interage com proteínas efetoras que produzem
moléculas de segundo mensageiros e respostas celulares especificas. A atividade GTPásica da subunidade α
hidrolisa GTP em GDP, levando a sua reassociação com βγ e sua inativação.
Figura 8. Distribuição dos receptores mGLU e seus respectivos eventos moleculares
A ativação crônica dos mGluR pode levar a neurodegeneração. Acredita-se que
antagonistas dos mGluR possam desempenhar um papel limitante no dano relacionado a
17
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Acidente Vascular Cerebral, o que deve ser uma das mais interessantes possibilidades de
aplicação dos agentes dos mGluR com significante ganho.28 Certos aspectos do
desenvolvimento neuronal também são regulados pela ativação dos mGluR.21,
28
Estes
aspectos incluem o controle de hiperexcitabilidade durante a maturação neuronal e
sinaptogenesis e regulação do crescimento sináptico no desenvolvimento do córtex. Uma
vez que as área cerebrais estejam maduras, os mGluR continuam ativos na modulação da
reconexão, sinaptogenesis e no brotamento dos axônios durante o processo de plasticidade
sináptica.28
1.4.3.2. Receptores Ionotrópicos
Os receptores ionotrópicos são proteínas compostas de várias subunidades,
associadas à membrana plasmática e exibem considerável heterogeneidade na composição
de suas subunidades, refletindo-se na sua diversidade funcional.
Dos receptores ionotrópicos, existe uma clara distinção entre os receptores NMDA e
não-NMDA. A maior distinção é vista nos diferentes tempos de transmissão. Os receptores
não-NMDA são responsáveis por mediar a neurotransmissão sináptica rápida, enquanto os
receptores NMDA possuem um tempo de transmissão mais lento. Além disso, os receptores
NMDA necessitam da presença de um co-agonista, glicina; são bloqueados de modo
voltagem dependente por íons Mg2+ e modulados por Zn2+ e poliaminas. Os receptores nãoNMDA, por sua vez, não apresentam quaisquer das características acima. Esta separação
dos receptores NMDA dos demais grupos é ratificada pelo fato de haver uma clara
diferença estrutural entre eles.22, 16
1.4.3.2.1. Receptores Não – NMDA 35
Os receptores não-NMDA podem ser divididos em dois diferentes complexos:
receptores AMPA e receptores KA.15 Devido à ausência de agonistas e antagonistas
seletivos para os receptores KA, até o momento, o papel fisiológico destes receptores
35
Wolfgang, L. S. Progr. Neurobiol. 1998, 54, 721.
18
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
continua obscuro. Atualmente, a maioria dos bloqueadores para os receptores ionotrópicos
não-NMDA, por exemplo, a quinoxalidinona NBQX (2,3-diidroxi-6-nitro-7-sulfamoilbenzo[F]quinoxalina), demonstraram preferência pelos receptores AMPA, embora um
composto, NS-102 (5-nitro-6,7,8,9-tetraidrobenzo[G]indol-2,3-diona-3-oxima), demonstra
uma moderada preferência pelo receptor KA.
H
N
H2NO2S
O
O
O2N
N
H
O
O2N
NBQX
NOH
NS-102
Figura 9. Agonistas não-NMDA
Os receptores AMPA e KA são uns dos principais responsáveis pela resposta
glutamatérgica excitatória rápida no SNC de mamíferos, sendo associados primariamente
com
canais
voltagem-independentes.
Estes
receptores
quando,
ativados
pelo
neurotransmissor fisiológico L-Glu ou pelo L-aspartato, abrem canais catiônicos
permeáveis aos íons sódio e potássio. Por outro lado, a toxicidade promovida pela entrada
dos íons sódio e potássio, pode levar a morte celular, de modo que antagonistas
competitivos e não-competitivos do AMPA podem ser neuroprotetores (como demonstrado
em modelos de isquemia tanto focal quanto global), diferenciando-se quanto à existência de
efeitos colaterais: antagonistas não-competitivos seriam mais efetivos na presença de
concentrações tóxicas de glutamato do que os antagonistas competitivos. Além disso,
moduladores positivos do AMPA teriam efeito nootrópico.
A tecnologia de DNA recombinante identificou a presença de, no mínimo, 28 genes
que codificam as proteínas que formam os receptores glutamatérgicos Destas proteínas,
quatro (GluR 1-4) contêm sítios de ligação que possuem maior afinidade para AMPA que
para KA, enquanto cinco (GluR5-7, KA1 e KA2) possuem sítios de ligação no qual KA é
mais potente que o AMPA. Os receptores não-NMDA são compostos por cinco destas
subunidades protéicas, de modo que as nove diferentes proteínas identificadas até o
19
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
momento proporcionam um enorme número de possíveis composições para os receptores
não-NMDA. Desta forma, o desenvolvimento de drogas seletivas para as várias
subunidades ou para combinações de subunidades será de grande valor, não só para a
discriminação entre os receptores KA e AMPA e suas subunidades, mas também como
potenciais agentes terapêuticos com menores efeitos colaterais que os apresentados pelos
antagonistas não-NMDA disponíveis.
1.4.3.2.2. Receptores NMDA
O receptor NMDA possui uma cinética mais lenta que os receptores não-NMDA e
regula o influxo de cálcio e sódio. Esta cinética mais lenta da abertura de canais iônicos
permite tanto a soma das respostas do glutamato quanto a um grande influxo de cálcio na
célula, o que é critico para as funções do receptor.36
O receptor NMDA (NMDAR) regula um grande numero de processos fisiológicos e
patofisiológicos no SNC de mamíferos, estando fortemente implicado na neuroproteção,
neurodegeneração, potencialização de longa duração, memória e cognição (Figura 10). A
hipótese que a ativação aberrante dos receptores está relacionada a diversas desordens
neurológicas e neuropsiquiátricas como doença de Parkinson, Hunting, esquizofrenia,
alcoolismo e acidente vascular cerebral, gerou um considerável interesse nestes receptores
como alvo para novas terapias farmacológicas. 37, 38
Dodd, P.R.; Beckmann, A. M.; Davidson, M.S.; Wilce, P.A. Neurochem. Internat. 2000, 37, 509.
Kornberg, B. E.; Nikam, S. S.; Wright, J. L.; Kesten, S. R.; Meltzer, L. T.; Coughenour L.; Barr, B.;
Serpab, K. A. & McCormickb, J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004 , 14, 1213.
38
Roger, G.; Lagnel ,B.; Besret, L.; Bramoulle, Y.; Coulon, C.; Ottaviani, M.; Kassiou M.; Bottlaender, M.;
Valettea, H.;& Dolle , F. Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 5401.
36
37
20
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Figura 10. Mecanismo intracelular pelo qual NMDAR medeia neuroplasticidade e
apoptose. Após ativação pelo glutamato e o co-agonista glicina, o NMDAR abre canais de cálcio e sódio. O
influxo de cálcio ativa sinais transducionais como quinases e fosfolipases que fosforilam proteínas celulares
na sinapse (vide insert) e no núcleo. Dentre as proteínas fosforiladas estão os fatores de transcrição (TF), que
depois de ativados pela fosforilação levam a RNA polimerase para o DNA que promoverão a transcrição. O
RNA é transportado para fora do núcleo e traduzido em proteínas. As cascatas de ativação são especificas
para a intensidade do influxo de cálcio. Os gene induzidos por estas cascatas podem estar envolvidos tanto na
neuroplasticidade quanto nos mecanismos de morte celular, sendo a combinação de receptores e canais
ativados que determinarão o tipo de resposta molecular que o neurônio irá exibir.34
Do ponto de vista estrutural, o receptor NMDA funcional é composto de diferentes
combinações de múltiplas subunidades protéicas.17 Quatro ou cinco subunidades formam o
canal iônico que está usualmente bloqueado pelo magnésio de modo voltagem dependente.
No SNC de mamíferos são expressos cinco genes distintos: NR1, NR2A, NR2B, NR2C e
NR2D. O receptor fisiológico é um heterômero contendo uma subunidade NR1 (crítica para
a atividade plena do receptor) acoplada a pelo menos uma das diferentes subunidades NR2,
21
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
o que leva a uma grande heterogeneidade dos subtipos de receptor NMDA, além de uma
variedade de propriedades eletrofísicas e perfis farmacológicos (Figura 11). 22
Figura 11. Receptor NMDA fisiológico
A subunidade NR1 está presente durante todo o desenvolvimento e em todos os
níveis cerebrais e coluna vertebral, enquanto que as subunidades NR2 mostram localização
diferencial no desenvolvimento e localização regional, o que gera uma grande diversidade
de combinações de diferentes subunidades NR2 com a subunidade NR1. No cérebro do
mamífero adulto, as subunidades NR2A são largamente expressas, assim como as
subunidades NR1, enquanto que a expressão das subunidades NR2B é restrita ao
hipocampo e striatum; a subunidade NR2C é expressa no cerebelo e a subunidade NR2D no
mesencéfalo.39
O receptor NMDA funcional possui cinco sítios moduladores (Figura 12): (i) o sítio
de reconhecimento do glutamato, onde também se ligam os agonistas NMDA; (ii) o sítio de
ligação do magnésio, dentro do poro do canal; (iii) o sitio de ligação da fenciclidina (PCP),
onde também se ligam MK801 e cetamina; (iv) sítio da glicina que atua como co-agonista
modulando o sítio de reconhecimento do agonista e, (v) e o sítio modulador das poliaminas.
Além desses domínios, existem ainda, sítios de ligação para zinco, próton e agente óxido-
39
Kiss, L. Neurochem. Intern. 2005, 46, 453
22
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
redutores.36, 40 Após a ativação simultânea do receptor tanto por um agonista, no sítio do
glutamato, quanto por um co-agonista, no sítio da glicina, e a saída do magnésio, causada
pela simultânea despolarização parcial da membrana, ocorre um influxo de cálcio. Este
efeito é o elemento-chave no processo de potencialização de longa duração responsável
pelos efeitos farmacológicos do glutamato. 40
Figura 12. Sítios moduladores do receptor NMDA
Até o momento, quatro destes sítios são considerados como maiores alvos para
ligantes endógenos e exógenos: (i) o sítio do glutamato para agonistas e antagonistas
competitivos; (ii) o sítio da glicina para co-agonistas e os antagonistas correspondentes; (iii)
dois ou até três sítios de poliaminas (voltagem dependente e não-voltagem dependente)
para moduladores do receptor NMDA e (iv) sítio da fenilciclidina (PCP) para bloqueadores
do canal iônico (antagonistas não-competitivos). Todos estes moduladores possuem
farmacologia e propriedades únicas na modulação do receptor.
40
Tikonova, I.G.; Baskin, I. I.; Palyulin,V.A.; Zefirov, N.S. & Bachurin , S.O. J. Med. Chem. 2002, 45, 3836.
23
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
1.5. Antagonistas NMDA
Os NMDARs são os GluRs mais intensamente estudados, principalmente no
contexto de neurotoxicidade. O receptor NMDA sináptico, que responde a ativação
fisiológica (baixas doses) dos NMDAR, foram associados à promoção da sobrevivência
celular, podendo iniciar mecanismos neuroprotetores. Por outro lado, os NMDAR extrasinápticos, localizados nos corpos celulares, axônios e dendritos foram associados a
apoptose, causando neurodegeneração. Atualmente acredita-se que enquanto a ativação dos
NMDARs extra-sinápticos seja um evento raro em condições normais, o mesmo se torna
mais comum durante insultos celulares agudos ou situações patológicas quando os
transportadores de glutamato operam inversamente, aumentando as concentrações de
glutamato. Além disso, é sabido que enquanto a subunidade NR2A é predominantemente
encontrado em NMDARs sinápticos, as subunidades NR2B estão localizadas quase que
exclusivamente em sítios não sinápticos.24
Estudos pré-clínicos de largo espectro com antagonistas não-seletivos do NMDA,
como MK-8, Cetamina, PCP e CGS-19755 (Figura 13), forneceram evidências que estes
compostos possuem potencial terapêutico para tratar desordens neurológicas como
epilepsia, AVC, injúria cerebral traumática, mal de Alzheimer, Huntington, Parkinson, dor
crônica neuropática e desordens psiquiátricas como ansiedade e depressão.41,42
Adicionalmente, os receptores NMDA estão implicados na mediação tanto do ruído quanto
na perda da audição induzida por antibióticos aminoglicosídicos, assim como nas desordens
da retina e do nervo ótico. Por outro lado, estes estudos indicam uma forte tendência a
efeitos colaterais motores e cognitivos, enquanto que os estudos clínicos demonstraram
efeitos colaterais limitantes como distúrbio de percepção e alucinações. Deste modo,
devido aos efeitos terapêuticos promissores dos antagonistas do NMDA, esforços têm sido
41
42
Parsons, C. G.; Danysz, W.; Quack, G. Drug News Perspect. 1998, 11 , 523.
Nikam, S. S.; Meltzer, L. T. Curr. Pharm. Des. 2002, 8, 845.
24
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
feitos na tentativa de se desenvolver compostos que não demonstrem estes efeitos
indesejáveis.
PO3H2
NHMe
NH
N
Cl
O
Me
MK-8
Cetamina
PCP
N CO2H
H
CGS-19755
Figura 13. Receptores ionotrópicos não-seletivos
A descoberta da localização regional da subunidade NR2 representou a
possibilidade de substâncias que fossem seletivas para uma de suas subunidades
apresentarem algumas das diversas propriedades farmacêuticas dos antagonistas do
NMDA, sem proporcionar seus efeitos colaterais. Em particular, o fato das subunidades
NR2B estarem confinadas no proencéfalo e o nível reduzido destas subunidades no
cerebelo tem sugerido que agentes seletivos para este receptor podem significar um ganho
na janela terapêutica diminuindo os efeitos colaterais motores.43, 44
A identificação de que o Ifenprodil (Figura 14) era um antagonista seletivo para os
receptores NMDA que contêm as subunidades NR1/NR2B, trouxe uma possível base
mecanística para a melhora deste perfil. Por outro lado, embora seja um antagonista
subunidade seletivo para NR2, o Ifenprodil possui uma alta afinidade por outras classes de
receptores, como os receptores α1–adrenérgicos, levando a busca por outros antagonistas
mais seletivos para a subunidade NR2B.37,
42
Guzikowski A.P.; Tamiz , A. P.; Acosta- Burruel, M.; Hong-Bae, S. ; Cai, S.X.; Hawkinson, J. E., Keana , J. F.
W.; Kesten S. R.; Shipp, C. T.; Tran, M.; Whittemore , E. R.; Woodward, R. M.; Wright, J.L.; Zhou, Z. J. Med.
43
Chem. 2000, 43, 984.
44
McCauley, J.A.; Theberge, C.R.; Romano, J.J.; Billings, S.B.; Anderson, K.D.; Claremon, D.A.; Freidinger,
R.M.; Bednar, R.A.; Mosser, S.D.; Gaul, S.L.; Connolly, T.M.; Condra, C.L.; Xia, M.; Cunningham, M.E.;
Bednar, B.; Stump, G.L.; Lynch, J.J.; Macaulay, A.; Wafford, K.A.; Koblan, K.S.; Liverton, N.J. J. Med.
Chem. 2004, 47, 2089.
25
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
OH
N
HO
Ifenprodil
Figura 14. Ifenprodil, primeiro antagonista seletivo NR1/NR2B
Os protótipos Ifenprodil, Haloperidol e Eliprodil levaram ao desenvolvimento de
uma segunda geração de antagonistas NR2B, como o CP-101,606, EMD-95885 e Ro
25,6981, que demonstraram ser significantemente mais seletivos que os compostos iniciais
(Figura 15). Apesar das suas altas atividades in vitro (expressas pelos valores de IC50),
dentre eles apenas o EMD-95,885 mostrou considerável atividade in vivo, com boa
potência oral. 45
Roger, G.; Dolle F.; de Bruin , B.; Liu, X.; Besret, L.; Bramoulle, Y.; Coulon, C.; Ottaviani, M.;
Bottlaender; M., Valettea, H. & Kassioub, M. Bioorg. Med. Chem. 2004,12, 3229.
45
26
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
OH
OH
N
N
Cl
HO
(d, l)-Eliprodil
Ifenprodil
HO
Cl
F
O
N
F
isômero R: IC50 = 49,5 +_ 0,7nM ([3H]Ifenprodil)
isômero S: IC50 = 545 +_120nM ([3H]Ifenprodil)
racemato: IC50 = 86,2 +_ 10nM ([3H]Ifenprodil)
Haloperidol
OH
Ph
OH
N
OH
N
HO
HO
CP-101,606 (Taxoprodil)
Ro 25,6981
IC50 = 6 +_ 1nM ([ H]Ro 25,6981)
IC50 = 57 +_ 5nM(NMDA evoked Ca+2)
IC50 = 7 +_ 1nM ([3H]Ro 25,6981)
IC50 = 30 +_ 4nM (NMDA evoked Ca+2)
ED50: inativo (por administração oral)
ED50
3
O
20mg/Kg (inativo por administração oral)
O
N
H
N
O
F
EMD-95,885
IC50 = 8 +_ 1nM ([3H]Ro 25,6981)
IC50 = 48nM(NMDA evoked Ca+2)
ED50: 3,7mg/Kg (boa potência oral)
Figura 15. Antagonistas Seletivos NR2B: protótipos e segunda geração.
Os antagonistas do NMDA seletivos para a subunidade NR2B caem em diferentes
famílias estruturais. O motivo comum para estes antagonistas (Figura 16) parece ser a
amina terciária básica ligada a dois anéis aromáticos. Ambos os anéis parecem ser
importantes, sendo um apolar, denominado anel A e um doador de ligação de hidrogênio,
denominado anel B. A distância entre os dois anéis é importante: acredita-se que distância
ótima entre os anéis seja de 9-11 angstroms, porém em alguns casos, quando o anel B é
funcionalizado com uma hidroxila, pode ser de 17-18 angstroms.37,
42
A classe mais
populosa destes compostos pode ser descrita como uma porção doadora de ligação de
27
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
hidrogênio contendo um anel benzênico conectado ao nitrogênio de uma fenila ou
benzilpiperidina via um espaçador de 2 ou 3 átomos. É digno de nota que estes compostos
possuem, em sua maioria, uma porção fenólica ou um bioisóstero fenólico.44, 46
R
H
X
N
9-11A
Anel A
Anel B
Figura 16. Modelo Farmacofórico para os antagonistas NR2B.37
Mais recentemente, uma variedade de compostos como carboxamidas, aminoquinolinas, N-(fenilalquil)cinamidas e sulfóxidos também mostraram seletividade para a
subunidade NR2B, onde destaca-se o CI-1041 com boa potência oral (Figura 17). 44, 46,
H
N
OH
HN
N
OH
O
OH
Cl
47
N
H
N-(fenilalquil)cinamida
CO-101676 (Amina Acíclica ) Aminoquinolina
O
S
F
O
3
N
O IC50 = 4 +_ 1nM ([ H]Ro 25,6981)
N
IC50 = 8 +_ 1nM (NMDA evoked Ca+2)
H
ED50 = 2,4 mg/Kg (boa potência oral)
CI-1041 (Besonprodil)
Figura 17. Classes diversas de antagonistas NMDA/NR2B subunidade seletiva
Estes novos antagonistas do NMDA/ NR2B têm demonstrado eficácia em modelos animais
para neuroproteação, hiperalgia e Parkinson.e, em testes pré-clínicos demonstraram
potenciais terapêuticos para um grande número de indicações e parecem não possuir os
efeitos colaterais associados com os bloqueadores do NMDA, como MK-8 e PCP. Por
Borza, L.; Kolok, S.; Gere, A.; Agai-Csongor, E.; Agai, B.; Tárkányi, G.; Horváth, C.; Barta-Szalai, G.;
Bozó, E.; Kiss, C.; Bielik, A.; Nagy, J.; Farkas, S.; Dómany, G. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 3859.
47
Weber, C.; Bielik, A.; Szendrei, I.G.; Keserû, G.M.; Greiner, I. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 1279.
46
28
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
outro lado, apesar dos esforços empregados nesta área, o desenvolvimento clínico de
antagonistas de NMDA não tem sido satisfatório devido ao seu baixo índice terapêutico.
Mais recentemente, foram desenvolvidas (E)-N1-(benzil)cinamamidinas como
antagonistas do NMDA/NR2B subunidade específica que apresentaram maior afinidade e
seletividade melhorada frente a esta subunidade (Figura 18).42, 48, 49
OH
NH
N
N
H
HO
Ifenprodil
IC50 =66 nM
Ki = 9 nM ([3H]Ifenprodil)
IC50 = 50 nM
NH
OMe
N
H
Ki = 0,7 nM ([3H]Ifenprodil)
IC50 = 1,0 nM
Figura 18. Cinamamidinas: novos protótipos de antagonistas seletivos para NR2B.
Reconhecendo a possibilidade de que estiril-amidinas poderem agir como aceptores
de Michael, foi desenvolvida uma série de aril-amidinas como uma nova classe de
antagonistas do glutamato seletivo para as subunidades NR2B (Figura 19).42, 48, 49, 50 Por
outro lado, verificou-se que ao se retirar a porção estiril, praticamente abole-se a afinidade
por receptores NR2B. Entretanto, com adição de grupamentos OCF3 tanto a atividade
quanto seletividade para os receptores NR2B são retomadas, embora estes novos compostos
não tenham demonstrado boa biodisponibilidade oral. Os melhores resultados foram
conseguidos com a adição de um grupamento trifluorometano (CF3) na porção benzilica.
48
Curtis, N. R.; Diggle, H. J.; Kulagowski, J. J.; London, C.; Grimwood, S.; Hutson, P. H.; Murray, F.;
Richards, P.; Macaulay A.; Wafford, K. A. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 693.
49
Claiborne, C. F.; McCauley, J. A.; Libby, B. E.; Curtis, N. R.; Diggle, H. J.; Kulagowski, J. J; Michelson,
S. R.; Anderson, K. D.; Claremon, D. A.; Freidinger, R. M.; Bednar, R. A.; Mosser, S. D.; Gaul, S. L.;
Connolly, T. M.; Condra, C. L.; Bednar, B.; Stump, G. L.; Lynch, J. J.; Macaulay, A.; Wafford, K. A.;
Koblan, K. S.; Liverton, N. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 697.
50
Kiss, L.; Cheng, G; Bednar, B; Bednar, R.A; Benett, P.B; Kane, S.A; McIntyre, J.A; McCauley, J.A;
Koblan, K.S Neurochem. Internat. 2005, 46, 453.
29
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
NH
NH
N
H
Ki > 15 000 nM
([3H] Ifenprodil)
F3CO
OCF3
N
H
NH
F3CO
CF3
N
H
Ki = 1,2 nM ([3H] Ifenprodil)
Ki = 72 nM ([3H] Ifenprodil)
IC50 = 4,2 nM
Baixa Biodisponibilidade Oral
IC50 = 47 nM
Boa Biodisponibilidade Oral
Figura 19. Aril-amidinas: novos protótipos de antagonistas seletivos para NR2B
Estudos mostraram que estes novos compostos representam uma nova classe de
antagonistas NMDA/ NR2B subunidade seletiva não relacionada com o protótipo
Ifenprodil com potencial utilidade como agentes neuroprotetores.42
30
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
2. Objetivos e Justificativas
Recentemente, a busca por novos compostos com significativas afinidades para
receptores NMDA que contenham as subunidades NR1/ NR2B por pesquisadores da Merck
identificaram (E)-N1-(benzil)cinamamidinas A e aril-amidinas B (Quadro 1) como
candidatos promissores para o início de um programa de química medicinal,
particularmente porque estes compostos não possuem as porções fenólica e 4benzilpiperidina comuns a vários antagonistas NR2B descritas na literatra. ,49
Os novos compostos inicialmente desenvolvidos não mimetizam as 1ª e 2ª gerações
de antagonistas NMDA e aparentemente possuem relação estrutura atividade (SAR) bem
distinta destas. Estudos recentes mostram que esta nova série de compostos é obviamente
um avanço significativo nesta área, o qual tem se limitado à classe de benzil e
fenilpiperidinas por um longo tempo. Estes novos avanços têm aumentado a perspectiva do
desenvolvimento de potentes antagonistas NR2B como novos agentes terapêuticos no
tratamento de diversas indicações fisiopatológicas.
NH
Ar
N
H
R
Ar1
R1
A
R2
NH
N
H
R3
B
Quadro 1. Amidinas como antagonistas de terceira geração do NMDA
Este trabalho tem como proposta efetuar estudos visando as sínteses de novas
amidinas I-V portadoras de anéis 1,2,3- e/ ou 1,2,4-triazólicos visando as posteriores
avaliações destas substâncias como potenciais antagonistas seletivos do NMDA em
receptores que contenham as subunidades NR1/ NR2B no SNC (Quadro 2).
31
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
H
NH
Ph
NH
N
N Ph
N
N
H
I
H
NH
N
Ph N
N
N
H
Ph
N N
N
N
H
NH
N
CF3 Ph N
N
II
N N
CF3
N
N
H
Ph
III
NH
N
Ph N
N
IV
N
H
N
N Ph
N
V
Quadro 2. Novas amidinas triazólicas como potenciais antagonistas seletivos do NMDA.
Os precedentes descritos pelo grupo de pesquisadores da Merck (vide Quadro 1)
permitem aventar a possibilidade de que as novas amidinas triazólicas I-V objetivadas neste
projeto sejam isósteros das estruturas B e, desta forma, venham a comportar-se como
antagonistas seletivos do NMDA frente às subunidades NR1/ NR2B.
A opção pela utilização de compostos 1,2,3- e 1,2,4-triazólicos decorre do fato
destes sistemas serem encontrados em estruturas de muitas substâncias com importantes
propriedades biológicas. De fato, o anel 1,2,3-triazol está presente nas estruturas de um
grande número de nucleosídeos,51,
52
C-nucleosídeos e aciclonucleosídeos53,
compostos com atividades antibióticas56,
57, 58, 59, 60
54, 55
. Outros
e antivirais61 contendo o anel 1,2,3-
triazol também são reportados na literatura.
Talekar, R. R.; Wightman, R. H. Tetrahedron 1997, 53, 3831.
Alvarez, R.; Velazquez, S.; San-Felix, A.; Aquaro, S.; DeClerq, E.; Perno, C.F.; Karlsson, A.; Balzarini, J.;
Camarash, M.J. J. Med. Chem. 1994, 37, 4185.
53
Sallam, A. E. Carbohyd. Res. 1982, 108, 51.
54
Hanisch, G.; Henseke, G. Chem. Ber. 1968, 101, 2074.
55
El Sekily, M. A.; Mancy, S. Arabian J. Sci. Eng. 1993, 18, 405.
56
Dzhuraev, A. D.; Makshumov, A. G.; Karimukova, K. M. Russ. Pharmacol. Toxicol. 1991, 2, 140.
57
Yuldasheva, K. H.; Dzhuraev, A. D.; Makshumov, A. G.; Amanov, N. Russ.Pharmacol.Toxicol.1992, 3, 99.
58
Coultan, S.; François, I. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3117.
59
Bennet, I.; Broon, N. J. P.; Bruton, G.; Calvert, S.; Clarke, P. P.; Coleman, K.; Edmondson, R.; Edwards,
P.; Jones, D.; Osborne, N. F.; Walker, G. J. Antibiot. 1991, 44, 33.
60
Eby, P.; Cumming, M. D.; Phillips, O. A.; Czajkowski, D. P.; Singh, M. P.; Spevak, P.; Micetich, R. G.;
Maiti, S. N. Heterocycles 1995, 42, 663.
61
Godovikova, T. I.; Ignat’eva, E. L.; Khmel’nitskii, L. I. Chem. Heterocycl. Compd. 1996, 32, 580.
51
52
32
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Os compostos contendo o núcleo 1,2,4-triazólico, por sua vez, também são bastante
importantes em química medicinal e na agricultura. De fato, os principais agentes
fungicidas e bactericidas descritos na literatura são portadores do anel 1,2,4-triazol.62
Além do exposto, recentemente nosso grupo de pesquisas tem empregado núcleos
triazólicos buscando a obtenção de moléculas com atividades terapêuticas (Esquema 1).
Por exemplo, o aldeído 1,2,3-triazólico 1 foi empregado como matéria-prima na síntese de
substâncias ativas contra o vírus da herpes simplex (HSV I).63 Da mesma forma, a amina
1,2,4-triazólica 2 foi utilizada na obtenção de substâncias com atividades antimaláricas.64
O
N
Ph N
N
H
OH
H
1
H
N N
N Ph
N
F3C N NH
2
N
antiviral
(herpes simplex I)
2
H
N
N
E
F3C
N N CF3 t2
antimalárico
N N
Esquema 1. Compostos triazólicos 1 e 2 em sínteses de substânias bioativas
A opção pela presença de substituintes trifluorometilados (CF3) nas estruturas das
moléculas-alvo II e IV (vide Quadro 2) deve-se ao fato de que a incorporação de átomos de
flúor em fármacos permite a modulação simultânea de parâmetros eletrônicos, lipofílicos e
estéricos que podem influenciar criticamente suas propriedades farmacodinâmicas e
farmacocinéticas.65 Assim, a substituição bioisostérica de hidrogênio por flúor é uma
estratégia importante para a incorporação de um grupamento capaz de reforçar as interações
fármaco-receptor (modulação eletrônica), ajudando a absorção ou a passagem pela barreira
hematoencefálica (modulação lipofílica) e induzindo mudanças conformacionais que
alteram o metabolismo (parâmetros estéricos). Além disto, a presença do grupo CF3 em arilFerreira, V. F.; Souza, M. C. B. V.; Ferreira, M. L. G.; Cunha A. C. Heterociclos contendo o núcleo
triazólico: Métodos de Síntese, Reatividade e Atividade Biológica. In: Angelo da Cunha Pinto; Ricardo Bicca
de Alencastro. (Org.). Heterociclos (Volume I). 1 Ed. Rio de janeiro, 1999, v. 1, p. 29 e referências citadas.
63
Silva Júnior, R. C., em Novos análogos carbocíclicos de nucleosídeos (cans) derivados da nopinona: síntese
assimétrica e avaliação da atividade antiviral Dissertação de Mestrado, GQO-UFF, 2005.
64
Dutra, K. D. B., em Síntese e avaliação antimalárica de novos análogos triazolopirimidínicos da cloroquina,
Dissertação de Mestrado, GQO-UFF, 2004.
65
Ismail, F. M. D. J. Fluorine Chem. 2002, 118, 27.
62
33
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
amidinas é fundamental para é fundamental para a atividade e seletividade frente às
subunidades NR2B (Figura 19, página 30).
34
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
3. Química de Amidinas
O grupo funcional amidina é caracterizado por um carbono ligado a dois átomos
de nitrogênio, substituídos ou não. Elas são interessantes compostos nitrogenados
análogos de ácidos carboxílicos e ésteres que combinam uma ligação dupla C=N,
semelhante a um azametino, com uma ligação simples C-N com um parcial caráter de
dupla ligação, semelhante à função amida.66, 67
NR1
R
NR2R3
função amidina
De acordo com o padrão de substituição nos átomos de nitrogênio, as amidinas
são classificadas em cinco tipos (Figura 20): amidinas não substituídas (a), amidinas
monossubstituídas (b e c), amidinas simétricas dissubstituídas (d) amidinas não
simétricas dissubstituidas (e) e amidinas trissubstituidas (f).
NH
NR1
NH2 R
R
a
NH
NH2 R
b
NR1
NH
NHR2 R
NHR1 R
d
c
NR1
NR1R2 R
e
NR2R3
f
Figura 20. Classificação de amidinas
As amidinas monosubstituídas e dissubstituídas existem sob duas formas
tautoméricas, conforme é mostrado na Figura 21.
NH
R
NH2
NHR1
R
NR1
R
NR1
NHR1
NHR2
R
NR2
Figura 21. Formas tautoméricas das amidinas
A função amidina é um importante farmacóforo em química medicinal, sendo
encontrada como princípio ativo em diversos fármacos68 e nas estruturas de diversos
66
Shriner, R.L; Neumann, F.W. Chem. Rev. 1944, 35, 351.
Echevarria, A; Santos, LH; Miller, J & Mahmood, N. Bioorg.Med. Chem. Lett. 1996, 6, 1901.
68
Cesar, J.; Nadrah, K. & Dolenc M. S Tetrahedron Lett. 2004, 45, 7445.
67
35
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
produtos naturais.69,
70
Na quimica medicinal, um número importante de moléculas
biologicamente ativas incorporam a função amidina71. Diversas substâncias contendo
grupo amidínico têm apresentado atividade contra agentes patogênicos como
Leishmania sp.,72,, Trypanossoma sp.
73, 74
Plasmodium sp., Candida albicans,75 entre
outros. Acredita-se que esta atividade se deva em parte a semelhança da função amidina
com importantes purinas e pirimidinas biológicas.
Além de sua importância como grupamento farmacofórico, as amidinas são
também importantes intermediários em síntese orgânica, principalmente na obtenção de
compostos heterociclos. 68
3.1 Síntese de Amidinas
A obtenção de derivados amidínicos tem sido desenvolvida há vários anos,
resultando numa grande variedade de metodologias para sua síntese.76, Nesta seção
serão abordadas as principais metodologias de preparação desta classe de substância.
3.1.1 Obtenção de Amidinas a partir de Nitrilas
O acesso direto a amidinas a partir de nitrilas e aminas só pode ser efetuado se as
nitrilas forem substituidas por grupos eletroatratores, como Cl3C-CN.77 Assim, para a
síntese de amidinas a partir da reação entre nitrilas desativadas (aquelas onde o grupo
CN não é ligado a grupos eletroatratotres) e aminas, diversos métodos têm sido
desenvolvidos.
O método clássico para a obtenção de amidinas foi desenvolvido por Pinner e
consiste na reação de nitrilas desativadas com álcoois na presença de cloreto de
Hegarty, M. P.; Pound, A. W. Nature 1968, 217, 354.
Lloyd, H.A.; Fales, H. M.; Goldman, M.E.; Jerina, D. M.; Plowman, T. & Schultes, R. E. Tetrahedron
Lett. 1985, 26, 2623.
71
Lawson, EC; Kinney , W. A.; Luci, DK; Yabut, S. C.; Wisnoski, D.& Maryanoff, B. E. Tetrahedron
Lett. 2002, 43, 1951.
72
Croft, S. L.; Coombs; G. H. Trends Parasitol. 2003, 19, 502.
73
Dardonville, C.; Brun, R.; J. Med. Chem. 2004, 47, 2296.
74
Donkor, I. O.; Assefa, H.; Rattenti, D. Eur. J. Med. Chem. 2001, 36, 531.
75
Del Poeta, M.; Schell, W. A. Antimicrob. Agents Chemother. 1998, 42, 2503.
76
Santos, M. S. em Planejamento e Síntese de novos derivados Pirazólicos para avaliação da atividade
antileishmania Dissertação de Mestrado, GQO-UFF, 2005.
77
Grivas, J. C.; Taurins, A. Can. J. Chem. 1961, 39, 761.
69
70
36
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
hidrogênio para a formação de sais de imidatos, os quais reagem com aminas levando a
formação de amidinas N,N-dissubstituídas (Esquema 2).66, 78, 79
RCN
NH.HCl
EtOH abs
HCl (g)
R
NH
R1R2NH
R
OEt
NR1R2
Amidinas
N,N-dissubstituídas
Sais de
imidatos
Esquema 2. Amidinas pelo método de Pinner
O método de Pinner possui severas limitações, principalmente ligadas à
preparação dos imidatos. Por exemplo, benzonitrilas orto-substituídas não levam a
formação de imidatos em rendimentos aceitáveis; além disso, amidinas N,N’dissubstituídas não são formadas por este método.80
Uma da modificação do método de Pinner consiste na formação de tioimidatos a
partir de nitrilas desativadas e tióis, sob atmosfera ácida ( Esquema 3). Os tioimidatos
são convertidos à amidinas N,N-dissubstituídas ao reagirem com aminas, em
rendimentos variando de moderados a excelentes.81 Este método é particularmente
interessante por permitir a síntese de amidinas a partir de aminas pouco nucleofílicas
(como anilinas).
PhSH, HBr (g)
RCN
0
Et2O, 0 C, 30 min.
R= alquila ou arila
R
NH.HBr
R1R2NH
SPh
MeOH
T.A., 5h
Sais de
Tioimidatos
NH.HBr
R
NR1R2
Amidinas
N, N-dissubstituídas
Esquema 3. Amidinas via tioamidatos
Outros métodos para obtenção de amidinas a partir de nitrilas desativadas
consistem na formação de um intermediário mais reativo pela complexação destas
78
Roger, R.; Neilson, D.G.; Chem. Rev. 1961, 61, 179.
Gautier, J.A.; Miocque, M.; Farnoux, C.C. In. The Chemistry of Amidines and Imidates, Vol. 1; Patai,
S., Ed.; John Wiley & Sons: New York, 1975.
80
Weintraub, L.; Oles, S.R. ; Kalish, N. J. Org. Chem. 1968, 33,1679.
81
a) Baati, R.; Gouverneur, V.; Mioskowski, C. Synthesis 1999, 927. b) Schnur, R. C. J. Org. Chem.
1979, 44, 3726.
79
37
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
nitrilas com ácidos de Lewis (AlCl3, ZnCl2) a 150-200oC 82, 83 ou com sais de CuI (CuCl
ou CuBr).84 Por exemplo, Rousselet e colaboradores
84
descreveram um método
elegante para as preparações, em um pote, de amidinas substituídas a partir do refluxo
prolongado de nitrilas desativadas (CH3CN e Ph-CN) com aminas primárias e
secundárias na presença de CuCl em rendimentos de 80-100% (Esquema 4).
NH
R
NR1
NHR1 ou
R
R1NH2, CuCl
NHR1
Amidinas
Amidinas
N-substituídas N, N'-dissubstituídas
(80-90%)
(80-90%)
RCN
solvente, N2
CuCl, N2
80oC, 20h
80oC, 20h
NH
R1R2NH
R
NR1R2
Amidinas
N,N-dissubstituídas
(80-100%)
Esquema 4. Amidinas a partir de nitrilas: método via CuCl
A natureza dos produtos depende da estrutura da amina (primária ou secundária), da
razão amina/ CuCl e natureza do solvente:
• Aminas R1R2NH na razão amina/ CuCl = 1/ 1 fornecem amidinas N, N-dissubstituídas
quando as nitrilas são o próprio solvente da reação;
• Aminas R1NH2 na razão amina/ CuCl = 1/ 1,2 fornecem amidinas N-substituídas
quando as nitrilas são o próprio solvente da reação;
• Aminas R1NH2 na razão amina/ CuCl = 1/ 1 fornecem amidinas N, N’-dissubstituídas
em DMSO ou EtOH como solventes.
Outro
exemplo
de
intermediários
reativos
são
os
amidetos
de
alquilcloroalumínio, obtidos a partir de trimetilalumínio e o cloridrato da amina
correspondente ou ainda cloreto de amônio (Esquema 5). Estes intermediários reagem
com nitrilas desativadas ao refluxo por longos períodos de tempo para formar, após
hidrolise, amidinas N, N-dissubstituídas com rendimentos que variam de moderados a
excelentes (60-90%).85
82
Oxley and Short, J. Chem. Soc., 1946, 147.
Cooper, F. C. & Partridge, M. W. Org. Synth.Coll. Vol. 4, p.769; Vol. 36, p.64
84
Rousselet, G.; Capdavielle, P.; Maumy, M. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 6395.
85
Garigipati, R.S. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 1969.
83
38
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
RCN
MeAl(Cl)NR1R2
Tolueno, 80 0C
N
R
AlClMe
H2O
NHR1R2
NH
R
6-20h
NHR1R2
Amidinas
N,N-dissubstituídas
Esquema 5. Amidinas a partir de nitrilas: método via amidetos de cloroalumínio
Em uma metodologia análoga, no lugar das nitrilas, o éster correspondente são
comumente
empregados
(Esquema
6).
Estes
reagem
com
o
amideto
de
metilcloroalumínio, obtido in situ, para gerar a imina intermediária que, por metanólise,
fornece as amidinas não substituídas correspondentes, com rendimentos que variam de
43 a 87%.86
MeAl(Cl)NH2
O
R
OR2
Tolueno, 80 0C
Me
N Al Cl
R NH2
MeOH
T.A
NH.HCl
R
NH2
Esquema 6. Amidinas a partir de ésteres: método via amideto
O uso de nitrilas desativadas para ataques nucleofílicos também pode ser feito
pelo emprego de sais de lantânio III (trifluorometanossulfonato de lantânio III)como
catalisadores (Esquema 7). O íon Ln +3 irá promover a reação de aminas primárias com
nitrilas, gerando, amidinas alifáticas N-substituídas. Estas amidinas, por sua vez,
reagem com aminas primárias gerando amidinas N, N’-dissubstituídas, com
rendimentos superiores a 90%, quando uma razão molar nitrila:amina 1:2 for utilizada.87
RCN
R1NH2, Ln3+
80 0C
NH
R
NHR1
amidinas
N-substituídas
R1NH2
NR1
R
NHR1
amidinas
N,N'-dissubstituídas
R= Me, fenila, ; R1 = Alquila, fenila
Esquema 7. Amidinas a partir de nitrila e Ln(F3CSO3)3
86
Gielen, H.; Alonso-Alija, C.; Hendrix, M, Niewöhner, U. & Schauss, D. Tetrahedron Lett. 2002, 43,
419.
87
Forsberg, J. H.; Spaziano, V. T.; Balasubramanian, Liu, G. K.; Kinsley, S. A.; Duckworth, C. A.;
Poteruca J. J.; Brown, P. S.; Miller J. J. Org. Chem. 1987, 52, 1017.
39
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Mais recentemente, Cesar e colaboradores descreveram um método para a
síntese de amidinas não substituídas empregando a redução de amidoximas geradas a
partir de nitrilas desativadas suportadas em matriz polimérica (Esquema 8).88
P
O
NH2OH.HCl
P
O
N-OH
CN DIPEA, THF
EtOH, 60oC
NH2
12h
SnCl2. H2O
DMF, 80oC
40h
HO
TFA, T. A.
NH
NH2
P
O
NH
CH2Cl2, 1h
NH2
amidinas
Esquema 8. Amidinas via redução de amidoximas.
Amidinas podem ser sintetizadas, em rendimentos que variam de 66-85%, a
partir da redução de derivados de oxima com formiato de amônio e Pd/C como
catalisador em acido acético. (Esquema 9). 89
NOR1
R
HCOONH4
NH2 Pd/C, AcOH
NH
R
NH2
Esquema 9. Obtenção de amidinas a partir de derivados de oxima.
3.1.2 Obtenção de Amidinas a partir de Amidas
As conversões mais tradicionais de amidas terciárias em amidinas envolvem
ativação no átomo de oxigênio através de: (1) condensação de aminas terciárias com
aminas primárias na presença de agentes desidratantes; ou (2) ou adição de amidas
primárias a amidas terciárias pré-ativadas por anidrido tríflico.78,
88
Cesar, J.; Nadrah, K.; Dolenc, M. S. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 7445.
Anbazhangan, M.; Boykin, D.W.; Stephens, C. E. Synthesis 1979, 546.
90
Katritzky. A. R.; Huang, T.-B.; Voronkov, M. V. J.Org. Chem 2001, 66, 1043.
89
40
90
Por exemplo,
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Charette e Grenon mostraram o emprego deste reagente na conversão de amidas
terciárias em amidinas trissubstituídas intermediada por triflatos de imínio (Esquema
10).91
O
R
N
R2
OTf
Tf2O
R1
R
0oC, 2,5h
R
N+ 1
R2
3
_
N
R NH2
OTf
R
T.A., 20h
R3
R
N 1
R2
Amidinas
trissubstituídas
(34-84%)
Triflatos de imínio
Esquema 10. Amidinas a partir de amidas:métiodo via triflatos de imínio.
Amidas
secundárias
reagem
com
fluoroborato
de
tretiloxônio,
em
diclorometano, formando intermediários sais de imidatos. Estes, que podem ser isolados
e caracterizados, reagem facilmente com aminas primarias ou secundárias para gerar
amidinas em rendimento entre 71-90% (Esquema 11).82
O
R
N
H
R1
Et3O+BF4CH2Cl2
T. A., 1 noite
(78-97%)
OEt
R
_
R
N + 1 BF4
H
Sais de imidatos
R= arila, metila ; R1= H, metila; R2=H, metila
NR2
R2NH, EtOH
25oC, 3 dias
R
N
H
R1
Amidinas
N, N-dissubstituídas
(71-90%)
Esquema 11. Amidinas a partir de amidas: método via fluoroboratos de trietiloxônio.
Amidinas trissubstituídas são também obtidas por reações de acilanilidas com
um complexo tipo Vilsmeier (POCl3/ DMF), facilmente preparados a partir de
formamidas e pentóxido de fosforo (Esquema 12). Vários métodos têm substituído o
pentóxido de fósforo por outros agentes de acoplamento como SOCl2, POCl3 , PCl3. 92
91
92
Charette, A. B.; Grenon, M. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 1677.
a) Bésán, J.; Kulcsar, L. Kovacs, M. Synthesis 1980, 883. b) Pedersen, E. B. Synthesis 1979, 546.
41
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
O
O
R
NR22
H
NHR1
P2O5, T. A.
NR22
R
NR1
R= H, alquila ; R1= Alquila, arila; R2= alquila
Esquema 12. Amidinas a partir de formamidas.
3.1.3 Obtenção de cinamamidinas
As reações de acoplamento do (E)- β-bromoestireno com t-butilisonitrila e
aminas nas presenças de carbonato de cesio, cloreto de paladio II, dppf (1,1"bis(difenilfosfino)ferroceno) e tolueno constituem-se no método geral, alternativo ao
método de Pinner, para a formação de cinamamidinas com rendimentos entre 25-77%
(Esquema 13).93
t-BuNC,
Ph
t-Bu
N H
Br
PdCl2 (5 mol%)
dppf (10 mol%)
CsCO3, tolueno
65oC, 15 min.
Ph
N
N
Cinamamidinas
(25-71%)
Esquema 13. Obtenção de amidinas a partir de β-bromoestireno
93
Tetala, K. K. R.; Whitby, R. J.; Light, M. E.; Hurtshouse, M. B. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 6991.
42
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
4. Metodologia e Estratégia Sintética
As amidinas triazólicas I e II deverão ser obtidas a partir da reação entre a
benzonitrila e as aminas triazólicas 3 e 2, respectivamente (Esquema 14). Para tal, serão
consideradas a metodologia clássica desenvolvida por Pinner (via sais de imidato)
mostrada no Esquema 2 (vide página 37).78, 80, 81 Alternativamente, a condensação entre
a benzonitrila e as aminas 3 e 2 promovida por sais de CuI (vide Esquema 4, página 38)
será considerada por mostrar-se atraente aos objetivos deste trabalho.85
A amina 1,2,3-triazólica 3 deverá ser produzida pela reação de aminação
redutiva94 a partir do aldeído 1 já preparado em escalas multigramas em nosso
laboratório95 ou, alternativamente, por redução da oxima 4 (a ser preparada a partir de
1)96com Zn/ NH4Cl.97 Da mesma forma, a amina 2 também é preparada em escalas
multigramas em nosso laboratório.54 Cabe mencionar que, embora o grupamento amino
de 2 seja mais nucleofílica que o nitrogênio triazólico, tal nucleofilia não é bastante
acentuada, já que esta molécula é um análogo de anilina.54
H
NH
Ph
NH
N
N Ph
N
N
H
Ph
N N
CF3
N
N
H
II
I
NOH
N
Ph N
N
N
Ph N
N
NH2
H
H
N N
4
3
N
Ph N
N
H2N
N
CF3
2
CHO
NH
1
H2N
NHNH2.H2CO3
Esquema 14. Retroanálises para as sínteses de I e II.
94
Borch, R. F.; Bernstein, M. D.; Durst, H. D. J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 2897.
Silva Júnior, R. C.; Ferreira, V. F.; Pinheiro, S. Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 3719.
96
Lima, E.C. de em Síntese Enantiosseletiva da R-(-)-N-Benzil-4-Aminometil-2-Pirrolidona:
Caracterização da Quiralidade do Antípoda mais ativo do Nebracetam, Dissertação de Mestrado, NPPNUFRJ, 2005.
97
Jochins, J. Monatsh. 1963, 94, 677.
95
43
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
As amidinas triazólicas III-V, por sua vez, deverão ser obtidas a partir da reação
entre a nitrila 5 com a benzilamina e as aminas 2 e 3 empregando-se metodologias
idênticas às visualizadas para I e II (Esquema 15). A nitrila 5 deverá ser obtida a partir
do aldeído triazólico 1 por meio de uma seqüência intermediada pela desidratação da
oxima 4. 97, 98
H
NH
N
Ph N
N
NH
N
Ph N
N
N
H
Ph
N N
N
N
H
CF3
NH
N
Ph N
N
IV
III
N
N Ph
N
N
H
V
NOH
N
Ph N
N
CN
N
Ph N
N
5
H
4
Esquema 15. Retroanálises para as sínteses de III-V.
Uma vez sintetizadas, as novas substâncias I-V serão submetidas à avaliação das
suas possíveis atividades frente aos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA que
contenham as subunidades NR1/NR2B, através de colaboração com o Professor Dr.
Roberto Paes de Carvalho, do Instituto de Biologia da UFF.
98
Furniss, B. S.; Hannaford, A. J.; Smith, P. W. G & Tatchell, A. R Vogel´s Textbook of Pratical
Organic Chemistry. 5th Ed; Longman Scientifical & Technical: New York; 1989.
44
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
5. Resultados e Discussão
De forma a dar uma dinâmica adequada à leitura do texto, nas Seções 5.1-5.7
serão apenas discutidos os dados espectroscópicos fundamentais ao contexto, sendo que
as análises espectroscópicas completas que suportam as estruturas propostas serão
descritos em tabelas no final de cada tópico. Na seção 5.8 serão enfocadas as avaliações
farmacológicas das amidinas a serem sintetizadas.
5.1. Obtenção do 2-fenil-2H-1,2,3-triazol-4-carbaldeído (1)
O aldeído triazólico 1 vem sendo facilmente obtido em nosso laboratório através
de uma seqüência de três etapas a partir da D-(+)-glicose segundo procedimento
descrito na literatura (Esquema 16).63, 99, 100 A fenil-D-glicosazona foi obtida em 64%
de rendimento após recristalização em ETOH 60%, pela agitação da D-(+)-glicose com
fenilidrazina em etanol acidificado durante 4 dias. Este produto apresentou-se como um
sólido amarelo de ponto de fusão 206-207oC, cujo valor é compatível com o descrito na
literatura (207oC). Subseqüentemente, agitou-se a fenil D-glicosazona com sulfato de
cúprico sob refluxo por 3 horas para obter o fenil-D-glicosetriazol em 60% de
rendimento após duas recristalizações em água. Este composto apresentou-se como um
sólido branco de ponto de fusão 195-196oC, valor idêntico ao descrito na literatura. 63, 99,
100
O fenil-D-glicosetriazol foi posteriormente tratado com solução aquosa de periodato
de sódio sob agitação por 24 horas fornecendo o 2-fenil 1,2,3-triazol-4-carboxaldeído
(1) em rendimento de 86% após recristalização em EtOH/ H2O. Este produto se
apresentou como um sólido amarelo pálido de ponto de fusão 65-66oC (literatura
100
63, 99,
p.f. 68-70ºC) e odor adocicado. O espectro de infravermelho (I.V.) do aldeído 1
apresentou bandas características de carbonila aldeídica conjugada em 1697 cm-1 e de
vibrações de núcleo aromático em 1596 e 1488 cm-1 . No espectro de RMN 1H
observou-se o sinal simples do hidrogênio aldeídico em 10,22 ppm, o sinal simples do
hidrogênio triazólico em 7,80 ppm, além dos sinais dos hidrogênios aromáticos.
99
Hudson, C. S.; Hann, R. M. J. Org. Chem. 1944, 9, 23.
Regna, P. P. J. Am. Chem. Soc. 1947, 69, 246.
100
45
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
H
HO
H
H
Ph
N N
N
H
CHO
OH
H
OH
OH
CH2OH
NNHPh
NNHPh
HO
H
H
OH
H
OH
CH2OH
a
D-(+)-glicose
HO
H
H
b
Fenil-D-glicosazona
O
H
OH
OH
CH2OH
c
N
H
N
N Ph
1
Fenil-D-glicosetriazol
a) PhNHNH2, T. A., 4 dias, 64%. b) CuSO4. 5 H2O, refluxo, 3 h, 60%.
c) NaIO4 aq. T. A., 24 h, 86%.
Esquema 16. Preparação do aldeído 1,2,3-triazólico 1
5.2. Obtenção da 2-fenil-2H-1,2,3-triazol-4-carbonitrila (5)
Os compostos 1,2,3-triazólicos monossubstituídos podem ser obtidos através de
duas metodologias distintas. A primeira metodologia consiste na ciclização de
precursores apropriados, sendo limitada devido a difícil acessibilidade aos materiais de
partida. Como alternativa, podem-se empregar reações de substituição no núcleo
triazólico, o que é dificultada pela baixa reatividade deste núcleo.101, 102
Begtrup demonstrou que a reatividade do núcleo triazólico pode ser aumentada
pela função N-óxido, que ativa as posições C5 e C4 do núcleo triazólico frente a
nucleófilos e eletrófilos (Esquema 17).101, 102
4
N3
-
5
2 1N
N
Ar
+ _
O
4
N3
5
1N
2
N
4
+
O
Ar
N
5
+
3 2 1N
N
O
_
Ar
Esquema 17. Reatividade dos 2-ariltriazóis 1-óxido
Desta forma o 4-ciano-2-fenil-1,2,3-triazol (5) vem sendo obtido a partir de
fenil-hidrazina em uma metodologia que envolve cinco etapas (Esquema 18).101, 102
101
102
Beagtrup, M.; Holm, J. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1981, 503.
Beagtrup, M.; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1982, 2749.
46
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
NHNH2
1. Glioxal aq., AcOH, ref. 2 h
N
2. NH2OH. HCl, NaOH
3. CuSO4, Py, ref., 4 h
(67 %)
_
+
Me3O. BF4
P2O5, CH2Cl2
T. A., 3 dias
+ _
NO
N
Ph
_ KCN, CH CN
+
3
N N OMe BF
N
4
T. A., 3 dias
Ph
(94 %)
CN
N
N
N
Ph
5 (97%)
65 % global
Esquema 18. Obtenção da nitrila 5 via N-óxido.
A fim de se fazer uma simplificação experimental, visualizou-se uma rota
alternativa onde esta nitrila pudesse ser obtida a partir do aldeído triazólico 1, o qual
vem sendo sintetizado em escalas multigramas em nosso laboratório, através de uma
seqüência de reações mais simples.95 Desta forma, optou-se pelo emprego de uma
metodologia que envolve a obtenção da oxima triazólica 4 e posterior desidratação
(Esquema 19).
N
Ph N
N
CN
5
N
Ph N
N
NOH
CH
N
Ph N
N
4
CHO
1
Esquema 19. Estratégia para a preparação da nitrila 5
O tratamento do carboxaldeído 1 com cloridrato de hidroxilamina em CH2Cl2 a
temperatura ambiente por 18 h96 forneceu a oxima triazólica 4 em 87% de rendimento
como um sólido branco de ponto de fusão 140-1430C, após recristalização em hexano
(Equação 1).
N
Ph N
N
1
CHO
NH2OH HCl
Na2SO4, NaHCO3
CH2Cl2, T. A., 18 h
47
N
Ph N
N
NOH
CH
4 (87 %)
Eq. 1
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
O espectro de infravermelho de 4 apresentou uma banda em 3282 cm-1 referente
ao estiramento de ligação O-H e uma banda em 1500 cm-1 referente ao estiramento da
ligação C=N da função oxima, além da ausência da banda em 1697 cm-1 referente ao
estiramento da ligação C=O de aldeído conjugado de 1. Os espectros de 1H-RMN e 13CRMN apresentaram o padrão da porção triazólica, sendo importante destacar no
espectro de RMN 1H a 300 MHz, o sinal simples em 1,67 ppm referente ao hidrogênio
do grupamento hidroxila e o aparecimento do sinal simples em 8,55 ppm referente ao
hidrogênio ligado ao carbono da função oxima. Os demais assinalamentos estão
descritos na Tabela 1.
NOH
5
2 N
H 1
N
3 N 4
4
6
7
Correlações
1
H x 1H - COSY
C/H
δC
δH (m); J (Hz)
1
138,9
8,55 (s)
----
2
142,52
----
----
3
119,0
8,12 (s)
4
133,4
-----
-----
5
118,8
8,09-8,06 (m)
H6/ H7
6
129,3
8,54-7,47 (m)
H5/ H7
7
128,1
7,43-7,38 (m)
H5/ H6
Tabela 1. Assinalamentos propostos para oxima 4
A subseqüente desidratação da oxima 4 com anidrido acético sob refluxo por 1
hora forneceu a nitrila triazólica 5 em 70% de rendimento, após recristalização em
hexano (Equação 2). Esta substância apresentou-se como um sólido amarelo claro de
ponto de fusão 86-870C, valor este compatível com a literatura (890C).101, 102 O espectro
de infravermelho (I.V.) de 5 apresentou um banda em 2247 cm-1 característico de
nitrilas conjugadas, além do desaparecimento das bandas em 3281 cm-1 e 1500 cm-1
referentes ao estiramento das ligações O-H e C=NOH respectivamente. O espectro de
48
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
1
H-RMN a 300 MHz apresentou um singlete em 8,16 ppm devido ao hidrogênio
triazólico e sinais dos hidrogênios da porção benzênica, estando de acordo com o
descrito na literatura para esta molécula. 101, 102
NOH
CH (CH3CO)2O
N
Ph N
N
refluxo, 1 h
N
Ph N
N
CN
Eq. 2
5 (70 %)
4
5.3. Obtenção da (2-fenil-2H-1,2,3-triazol-4 il) metanamina (3)
A preparação direta de aminas a partir de compostos carbonilados tem sido feita
em bons rendimentos envolvendo a reação de aminação redutiva. A fim de se obter a
amina primária 1,2,3-triazólica 3, tratou-se o aldeído triazólico 1 com acetato de amônio
na presença de cianoboroidreto de sódio em metanol absoluto a temperatura ambiente
por 96h, obtendo-se como produto óleo amarelado em 80% de rendimento bruto
(Equação 3).94 Todas as tentativas de purificação de 3 por cromatografia em gel de
sílica (placa preparativa ou coluna “flash”) mostraram-se infrutíferas, de modo que a
caracterização de 3 obtido por esta via foi efetuada utilizando-se espectros brutos.
OHC
N
N Ph
N
1
NaBH3CN (7 eq.)
AcONH4, MeOH abs.
T. A., 96 h
H2N
N
N Ph Eq. 3
N
3 (80% bruto)
O espectro de infravermelho apresentou uma banda em 3395 cm-1 referente ao
estiramento de ligação N-H e uma banda em 1235 cm-1 referente ao estiramento da
ligação C-N, além do desaparecimento da banda em 1694 cm-1 referente ao estiramento
da ligação C=O de aldeído. No espectro de RMN 1H a 300 MHz foram observados um
sinal simples em 1,69 ppm referente aos hidrogênios do grupamento NH2 e o sinal
simples em 4,06 ppm referentes aos hidrogênios metilênicos.
Pelo fato de não ter sido possível a obtenção da amina primária 1,2,3-triazólica 3
em sua forma pura, partiu-se para a investigação de metodologias alternativas para esta
finalidade. Para tal, visualizou-se a reação de redução da oxima triazólica 4 preparada
anteriormente (vide Equação 1).
49
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
A redução da oxima 4 com zinco em amônia/ cloreto de amônio ao refluxo por 4
horas forneceu a amina primária 1,2,3-triazólica 3 como um sólido amarelo de ponto de
fusão 71-73ºC em 60% de rendimento, após purificação por cromatografia “flash” em
gel de sílica (Equação 4).
N
Ph N
N
4
NOH
CH
1. Zn, NH4Cl
NH4OH
N
N Ph
N
H2N
refluxo 4h
2. NaOH
Eq. 4
3 (60%)
A amina 3 teve sua estrutura confirmada por dados espectroscópicos. O espectro
de infravermelho apresentou uma banda em 3398 cm-1 referente ao estiramento de
ligação N-H e uma banda em 1214 cm-1 referente ao estiramento da ligação C-N. No
espectro de RMN 1H a 300 MHz é importante destacar o sinal simples em 4,06 ppm
referente aos hidrogênios metilênicos. Os demais assinalamentos estão descritos na
Tabela 2:
1
2 N
H2N
3
5
N
N
4
6
7
3
C/H
1
2
3
4
5
6
7
NH
δC
43,3
147,7
134,4
139,6
118,5
129,0
127,2
δH (m); J (Hz)
4,06(sl)
---7,72 (s)
----8,04 (d, 7,5)
7,48 (t; 7, 6Hz; 7,3 Hz; 1,9 Hz)
7,33 (tt; 7,6 Hz; 1,2 Hz)
1,69 (sl)
1
Correlações
H x 1H - COSY
-------H6/ H7
H5/ H7
H5/ H6
Tabela 2. Assinalamentos propostos para amina 3
Objetivando-se incrementar o rendimento químico da amina 3 para a obtenção
de quantidades apreciáveis desta substância, optou-se pela investigação do
cianoboroidreto de sódio modificado por zinco como agente redutor. Este reagente foi
50
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
preparado a partir da mistura de uma solução de cianoboroidreto de sódio em metanol e
solução de cloreto de zinco anidro em THF.103 Assim, o tratamento do aldeído 1 com
uma solução de NaBH3CN em ZnCl2 na presença de acetato de amônio em metanol à
temperatura ambiente forneceu a amina 3 em 75% de rendimento, após purificação por
cromatografia “flash” em gel de sílica (eluente: 5% acetato em n-hexano) (Equação 5).
A amina 3 assim obtida mostrou-se espectroscopicamente idêntica àquela produzida na
rota via oxima (vide Equação 4).
OHC
NaBH3CN / ZnCl2 2:1
N
N Ph
AcONH4, MeOH abs.
N
T. A., 96h
1
H 2N
N
N Ph Eq. 5
N
3 (75%)
5.4. Obtenção da 3-amino-5-trifluormetil-1H-1,2,4-triazol (2)
A preparação de amino-1,2,4-1H-triazóis substituídos, tem sido feita em bons
rendimentos envolvendo a reação de condensação entre aminoguanidinas e ácidos ou
ésteres.
104
O 3-amino-5-trifluormetil-1H-1,2,4-triazol (2) foi obtido em 91% de
rendimento, após sublimação, pela condensação do ácido trifluoracético com
bicarbonato de aminoguanidina, em tolueno sob refluxo por 20 horas (Equação 6). 105 O
produto foi obtido como um sólido branco de ponto de fusão 197°C (não corrigido),
compatível com a literatura (198°C).
105
O espectro na região do infravermelho de 2
apresentou bandas referentes às deformações axiais de N-H além de bandas
características do anel triazólico. O espectro RMN 1H mostrou os sinais simples largos
em 6,0 ppm (NH2) e 12,24 ppm (NH) e estão de acordo com os dados publicados na
literatura.
F3C
H
NH
O
OH + H2N
NHNH2.H2CO3
refluxo
Dean-Stark, 20h
103
104
105
N N
Tolueno
F3C
N
2 (91%)
Kim, S.; Ho Oh, C.; Suk Ko, J; Ahn K.H.; Kim, Y.J. J. Org. Chem. 1985, 50, 1927.
Fukaya, C. J. Med. Chem, 1996, 39, 3019.
Lopyrev, V. A.; Rakhmatulina, T. N. Zhurnal Obshchei Khimii 1984, 53,1684.
51
NH2
Eq. 6
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
5.5. Tentativa de Síntese de Amidinas Triazólicas Via Método de
Pinner
A fim de se obter as amidinas triazólicas tentou-se primeiramente empregar a
metodologia clássica desenvolvida por Pinner.
66, 76, 78
As primeiras sínteses testadas
foram aquelas visando a obtenção das amidinas triazólicas I e II, onde o tratamento da
benzonitrila com HCl gasoso anidro, em etanol absoluto produziria o intermediário
imidato e o posterior tratamento deste intermediário com as aminas apropriadas (2 e 3)
forneceria as amidinas correspondentes (Esquema 20).
NH
NH
Ph
N
N Ph
N
N
H
I
H
HCl
NH
OEt
Ph
N N
N
N
H
Imidato
CF3
II
Esquema 20. Estratégia via método de Pinner para as sínteses das amidinas I e II.
O tratamento da benzonitrila com etanol absoluto em HCl gasoso levou a
formação do imidato correspondente; contudo, em nossas mãos, este método mostrouse ineficiente, uma vez que após cinco dias de agitação não foi verificado o consumo
total da benzonitrila (Equação 7). Desta forma, este produto não pôde ser caracterizado.
NH
CN HCl (g), EtOH abs.
HCl
OEt
Eq. 7
t. A., 5 dias
Imidato (35 %)
Este fato pode ser explicado se examinarmos o mecanismo de formação do
imidato (Esquema 21): A primeira etapa da formação deste intermediário é a
protonação do nitrogênio da nitrila e a posterior adição nucleofílica do átomo de
oxigênio do álcool ao carbono da nitrila protonada, etapa esta favorecida quando este
sítio é bastante eletrofílico. Assim, conforme mostrado na literatura,
66, 76, 78, 80
em
reações onde a nitrila aromática não é substituída por um grupamento retirador de
elétrons no anel, a reação pode não ocorrer ou, como foi observado, ocorrer com baixos
rendimentos.
52
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
_
+
N H + Cl
N + H-Cl
nitrila protonada
NH
NH
HOEt
HCl
OEt
+ OEt
H
Imidato
Esquema 21. O mecanismo de formação de imidatos.
Mesmo não se tendo verificado o consumo total da benzonitrila, evidenciado
através de cromatografia em camada fina, o que acarretou na obtenção do imidato em
baixos rendimentos (35% bruto), optou-se por dar continuidade à reação de
transformação deste imidato nas amidinas triazólicas I e II objetivadas neste trabalho.
Para isto, o intermediário imidato foi reagido com a amina 1,2,3-triazólica 3 na
presença de trietilamina sob agitação durante 7 dias (Equação 8).49,
76
Contudo, este
procedimento não levou a formação da amidina triazólica I, e sim à uma mistura de
produtos de difícil separação; de fato, a cromatografia em camada fina indicou a
presença do intermediário imidato e de seu contaminante benzonitrila, além de outros
subprodutos não caracterizados.
NH
HCl
OEt
Et3N, EtOH
N
N Ph
T. A., 7 dias
N
+ H2N
mistura Eq. 8
complexa
3
Imidato
O métodode Pinner, em nossas mãos, também não se mostrou eficiente para a
produção da amidina triazólica II objetivada neste trabalho (Equação 9). Neste caso,
verificou-se que o aminotriazol 2 mostrou-se inerte frente ao imidato (ainda
contaminado com benzonitrila), uma vez que a mesma foi recuperada em sua totalidade.
NH
OEt
Imidato
H
HCl
N N
+
F3C
N
Et3N, EtOH
NH2
2
53
T. A., 7 dias
não reage Eq. 9
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Conforme já demonstrado na literatura, os 3-amino-1,2,4-triazóis são espécies
bastante estáveis e podem existir como mistura dos tautômeros 1H, 2H e 4H, conforme
é mostrado a seguir. 106, 107 Além disso, esta molécula é um análogo de anilina, de modo
que esta estabilidade poderia justificar a inércia de 2 na reação acima.
H
1N N2
R
1
HN N 2
1N N2
4
R
5 N 3 NH2
H
5 N 3 NH2
4
R
5 N 3 NH2
4
4H
2H
2a - R = CF3
2b - R = H
2c - R = CH3
1H
Resultados anteriores em nosso grupo referentes à reação de 2 com o
acetoacetato de etila para a produção da pirimidinona 6 (Equação 10) demonstram não
somente que o grupo NH2 de 2 é mais nucleofílico que o grupo NH, mas também que a
amina 2 é uma espécie pouco nucleofílica; realmente a conversão de 2 em 6 só foi
alcançada após 21 horas ao refluxo.
O O
H
OEt
N N
F3C
N
O
NH2
tolueno, 21h
refluxo
2
F3C
N N
N
Eq. 10
N
H
6 (77%)
A fim de se aumentar a energia da meio reacional, tentou-se empregar uma
metodologia empregada por Claiborne, onde uma solução etérea do imidato é sonicada
na presença da amina 2 para gerar a amidina triazólica II (Equação 11). Contudo,
mesmo nestas condições reacionais, a amina 2 foi recuperada em sua totalidade.
NH
H
HCl
OEt
+
Et3N, EtOH
N N
F3C
N
NH2
,8h
não reage Eq. 11
2
106
Allen, C. F. H.; Bielfuls, H. R.; Burness, D. M.; Reynolds, G. A; Tinker, J. F; Vanallan, J. A. J. Org.
Chem. 1959, 24, 787.
107
Bajwa, J. S.; Sykes, P. J. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1979, 3085.
54
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
5.6. Obtenção das Amidinas Triazólicas Via Método de Rouselet
Tendo em vista que não foi possível a obtenção das amidinas triazólicas I e II
por meio do método de Pinner, optou-se por utilizar uma metodologia onde se ativasse a
nitrila para adições nucleofílicas. Dentre os diversos métodos que consistem na
formação de um intermediário mais reativo pela complexação com diferentes ácidos de
Lewis como AlCl3, ZnCl2, CuCl ou CuBr com temperaturas de 80-150ºC, optou-se pela
utilização deste último, por ser uma método direto que se utiliza de condições mais
brandas.
Em 1990, Rouselet
descreveu uma metodologia onde sais de Cu (I) são
empregados a fim de se ativar nitrilas para adição nucleofílica (vide esquema 4, Seção
3.1). Nesta metodologia, no sentido de se evitar a obtenção de uma mistura dos produtos
N- e N,N’- dissubstituídos, a nitrila é empregada como solvente e o sal de cobre é
utilizado numa proporção de 1,2:1 em relação à amina. Posteriormente, Frutos108
demonstrou que utilizando esta proporção, foi possível obter amidinas N-substituídas
como únicos produtos. Em vista disso, nas reações a partir da benzonitrila, esta foi
utilizada como solvente, enquanto que para a nitrila 5 utilizou-se uma proporção nitrila:
amina = 1,25: 1.
A reação entre a benzoniltrila e a amina 2 na presença de cloreto cuproso (razão
CuCl: 2 = 1,25:1) ao aquecimento a 80oC por 20h forneceu a amidina triazólica
objetivada II, como único produto, na forma de um sólido amarelo de ponto de fusão
igual a 151ºC em 75% de rendimento após recristalização em etanol (Equação 12).
CN
H
H
N N
+ FC
3
N
NH
o
CuCl, 80 C
NH2
20 horas
2
108
Ph
N N
N CF3 Eq. 12
N
H
II (75%)
Frutos, R.P.; Gallou, I.; Reeves, D.; Xu, Yibo; Krishnamurthy, D.; Senanayake, C.H. Tetrahedron
Lett. 2005, 46, 8369.
55
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Devido ao fato de II ser pouco solúvel na maioria dos solventes orgânicos, a remoção
do cobre do meio reacional teve que ser feita através de extração com hidróxido de
amônio 3M, e não apenas através de precipitação com NaOH 50% conforme descrito na
metodologia de Rouselet.
84
Os sais de cobre, em meio amoniacal, formam um
complexo azul solúvel em água, [Cu(NH3)4]2+, que pode ser facilmente removido
através de extração. Para isto, ao meio reacional foi adicionado acetato de etila e a fase
orgânica foi lavada com solução NH4OH 3M até que não fosse mais observada a
presença de cobre no teste com ferrocianato de potássio.
O espectro de infravermelho de II apresentou uma banda em 3347 cm-1,
referente ao estiramento da ligação N-H, e uma banda em 1644 cm-1 referente ao
estiramento de ligação C=N de amidinas, não apresentando bandas características de
nitrilas. O espectro de RMN 1H a 300 MHz apresentou sinais múltiplos característicos
de hidrogênios de anel aromático em 7,70-7,64 ppm e 8,17-8,13 ppm, além de três
sinais largos em 8,22; 8,90 e 9,07 ppm atribuídos aos hidrogênios ligados aos átomos de
nitrogênio. O espectro de RMN 13C a 75 MHz apresentou os desdobramentos de sinais
característicos de compostos trifluorometilados: um quarteto centrado em 119, 8 ppm (J
= 269 MHz) referente ao carbono C1 e o quarteto centrado em 149,7 ppm (J = 37 MHz)
referente ao carbono C2. Os demais assinalamentos estão descritos na Tabela 3.
56
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
H
N
3
1
F3C
NH
N
2
N
N
4
5
6
7
8
H
II
Correlações
1
H x 1H - COSY
C/H
δC (m); J (Hz)
δH (m)
1
119, 8 (q, 269 Hz)
----
----
2
149,7 (q, 37 Hz)
----
----
3
160,7
----
----
4
160,4
-----
----
5
134,6
----
----
6
131,8
7,70-7,64 (m)
H7/H8
7
128,7
8,17-8,13(m)
H6
8
127,7
8,17-8,13 (m)
H6
NH
----
8,22(sl)
----
NH
----
8,90 (sl)
---
NH
----
9,07(sl)
----
Tabela 3. Assinalamentos propostos para a amidina II
Uma vez que a nitrila 5 é um sólido, ela não poderia ser empregada como
solvente segundo o procedimento de Rouselet, 84 conforme foi utilizado na preparação
da amidina II. Assim, a reação entre a nitrila 5 e a benzilamina na presença de cloreto
cuproso (razão CuCl: amina = 1,25:1) foi conduzida em DMSO como solvente a 80oC
por 20 horas (Equação 13). Este protocolo forneceu a amidina triazólica objetivada III
como um sólido branco de ponto de fusão igual a 120-121ºC em 73 % de rendimento,
após purificação por cromatografia preparativa em gel de sílica (eluente: 10% AcOEt/
n-hexano).
57
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
N
Ph N
N
5
CN
o
+ Ph
NH2
CuCl, 80 C
DMSO
20 horas
NH
N
Ph N
N
N
H
Ph Eq. 13
III (73 %)
Pelo fato de III ser solúvel em DMSO, não foi necessário realizar a extração
com solução de hidróxido de amônio 3M. No lugar disso, o cobre foi precipitado pelo
emprego de uma solução de NaOH 50% e filtrado do meio reacional.
O espectro de infravermelho de III apresentou uma banda em 3436 cm-1
referente ao estiramento da ligação N-H e uma banda em 1672 cm-1 referente ao
estiramento de ligação C=N de amidinas, além do desaparecimento da banda em 2247
cm-1 referente ao estiramento da ligação C-N da nitrila 5. O espectro de RMN 1H a 300
MHz apresentou o mesmo padrão da porção triazólica que 5. A incorporação da porção
benzílica foi evidenciada através do surgimento do sinal duplo em 4,63 ppm referente
aos hidrogênios metilênicos e de mais dois sinais múltiplos na região de aromáticos
(7,50-7,45 ppm e 7,40-7,34 ppm). Além disso, o aparecimento do sinal múltiplo em
9,33 ppm (que troca com D2O) referente aos hidrogênios ligados a nitrogênio, confirma
a presença do grupo amidina. No espectro de RMN13C, utilizando a técnica APT, é
válido destacar o aparecimento do sinal em 42,2 ppm referente ao carbono metilênico da
porção benzílica. Os demais assinalamentos estão descritos na Tabela 4.
58
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
2
1
3
NH
4
N
N
N
6
7
5
N 8
H
9
10
11
12
III
Correlações
1
H x 1H - COSY
C/H
δC (ppm)
δH (ppm,m); J (Hz)
1
128,6
7,60 (tt; 8,7; 1,2)
H2; H3
2
129,8
7,73 (ddd,8,7;7,5;1,7);
H1; H3
3
118,9
8,38 (ddd, 7,5; 3,2; 1,2)
H1; H2
4
139,2
-----
------
5
136,4
8,58 (s)
-----
6
144,2
----
-----
7
159,2
----
-----
8
42,2
4,63 (d; 6,3)
NH
9
138,9
-----
-----
10
128,4
7,50-7,45 (m)
11
127,4
7,50-7,45 (m)
12
126,9
7,40-7,34 (m)
NH
---
9,33 (m)
H8
Tabela 4. Assinalamentos propostos para a amidina III
A reação entre a nitrila 5 e a amina 2 na presença de cloreto cuproso (razão
CuCl: amina = 1,25:1) foi conduzida em DMSO como solvente a 80oC por 24 horas
(Equação 14). Este protocolo forneceu a amidina triazólica objetivada IV como um
sólido branco de ponto de fusão igual a 134-137ºC em rendimento muito baixo. Cabe
destacar que esta reação não foi otimizada.
N
Ph N
N
5
CN
+
H
N N
NH2
F3C
H
CuCl, 80oC
DMSO
24 horas
NH
N
Ph N
N
N
H
N N
N
IV (5 %)
2
59
CF3 Eq. 14
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Mesmo após tentativa de purificação por cromatografia preparativa em gel de
sílica (eluente: 10% AcOEt/ n-hexano), não foi possível obter-se IV em sua forma pura,
de tal forma que esta substância foi evidenciada por seus espectros brutos.
No espectro de I.V da fração mais polar obtida por cromatografia, pôde-se
observar o desaparecimento da banda em 2247 cm-1 referente ao estiramento da ligação
C-N da nitrila 5, assim como o aparecimento da banda em 1680 cm-1 referente ao
estiramento de ligação C=N de amidinas, o indicava a formação do produto. O espectro
de RMN 1H a 300 MHz apresentou o mesmo padrão da porção triazólica que a nitrila 5,
além de um sinal largo em 7,84 ppm, o qual foi atribuído aos hidrogênios ligados aos
átomos de nitrogênio.
5.7. Uso de sonicação para obtenção das amidinas
Uma vez que o insucesso na obtenção da amidina triazólica IV poderia ser
atribuído à pouca nucleofilia da amina 1,2,4-triazólica 2, realizou-se um estudo a
respeito do uso de ultrassom na obtenção das amidinas triazólicas II-IV. Cabe
mencionar que, ao melhor do nosso conhecimento, a sonicação ainda não foi empregada
nas reações de nitrilas com aminas visando às sínteses de amidinas pelo método de
Rouselet. Nessas reações, visando às sínteses de II-IV, a benzonitrila foi utilizada como
solvente, enquanto que a nitrila 5 foi utilizada numa proporção de 2:1 em relação as
aminas correspondentes.
A reação entre a benzoniltrila e a amina 2 na presença de cloreto cuproso (razão
CuCl: 2 = 2:1) empregando-se sonicação a 100oC por 5 horas forneceu a amidina
triazólica objetivada II, como único produto, na forma de um sólido amarelo em 70%
de rendimento após recristalização em etanol (Equação 15).
CN
H
H
N N
+ FC
3
N
NH
CuCl, 100oC
NH2
,5h
Ph
2
N N
N CF3 Eq. 15
N
H
II (70%)
Nesta reação foi observado que, com o uso de sonicação, o tempo reacional
diminuiu consideravelmente (de 20 para 5 horas), não havendo ganho em termos de
rendimento em relação ao procedimento por via térmica.
60
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
A reação entre a nitrila 5 e a benzilamina na presença de cloreto cuproso (razão
CuCl: amina = 2:1) em DMSO empregando-se sonicação a 100oC por 3 horas forneceu
a amidina triazólica objetivada III em 76 % de rendimento, (Equação 16).
84
Este
protocolo mostrou, assim, o mesmo perfil daquele observado anteriormente, com
redução do tempo reacional de 20 para apenas 3 horas.
NH
N
Ph N
N
CN
o
+ Ph
NH2
5
CuCl, 100 C
DMSO
,3h
N
Ph N
N
N
H
Ph Eq. 16
III (76 %)
A reação entre a nitrila 5 e a amina 2 na presença de cloreto cuproso (razão
CuCl: amina = 2:1) em DMSO, mesmo após 7 horas por sonicação a 100oC, forneceu a
amidina triazólica objetivada IV ainda em rendimento muito baixo (Equação 17).
84
Este protocolo também não foi otimizado.
N
Ph N
N
5
CN
+
H
N N
F3C
N
2
H
o
NH
CuCl, 100 C
NH2
DMSO
,7h
61
N
Ph N
N
N
H
N N
N
IV (4 %)
CF3 Eq. 17
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
5.8. Avaliação Farmacológica
As amidinas II e III (Quadro 3)foram avaliadas quanto a neurotoxicidade e
neuroproteação frente ao glutamato, utilizando-se para este fim, cultura de células
embrionárias de retina de pinto (oito dias), livres de contaminantes não-neuronais. Os
resultados estão resumidos na Figura 22 e Tabela 5.
H
NH
Ph
NH
N N
N
N
H
N
Ph N
N
CF3
N
H
Ph
III
II
Quadro 3. Moléculas avaliadas quanto a neurotoxicidade e neuroproteação frente ao
glutamato
5.8.1 Avaliacao do Efeito Neurotóxico das amidinas II e III
A fim de se avaliar a neurotoxicidade das amidinas I e II, as culturas purificadas
de neurônios e fotorreceptores de embrião de pinto de oito dias foram preparadas de
acordo com Adler109 e posteriormente foram avaliadas quanto à sua viabilidade em
cultura por um dia. Após este período, adicionou-se às placas de culturas 100 nM destas
substâncias e estas foram testadas por uma incubação de 48 horas.
Como se pode observar, as amidinas testadas não tem efeito sobre a viabilidade
celular o que demonstra que as mesmas não apresentaram neurotoxicidade. Na presença
da amidina II, a sobrevida neuronal diminui em apenas 15%, enquanto que na presença
da amidina III a sobrevida neuronal cai em 13% o que não representa neurotoxicidade.
5.8.2 Indução da morte celular pelo glutamato
A prolongada estimulação dos receptores glutamatérgicos dispara mecanismos
de morte celular que atingem diretamente os neurônios.110 A fim de se verificar se a
estimulação destes receptores seria deletéria para as células embrionárias de retina de
pinto em cultura, foi feita a incubação das culturas purificadas de neurônios com
Paes-de-Carvalho, R.; Dias, B.V.; Martins, R. A.; Pereira, M.R.; Portugal, C.C. & Lanfredi, C.
Neurochem. Int. 2005,46, 441.
110
Adler, R., Lindsey, J. D. & Elsner, C. L. J. Cell Biol. 1984, 99, 1173.
109
62
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
glutamato por 8 horas a 37ºC. Pelo fato das drogas a serem testadas posteriormente
serem solúveis em DMSO, foi feito também um controle utilizando-se este solvente.
Como se pode observar, sob estas condições, o tratamento com glutamato reduz
significantemente a viabilidade celular. Na presença deste agonista, o número de células
por campo cai de 45 para 8, ou seja, o glutamato diminui em aproximadamente 82% a
sobrevida neuronal.
5.8.3 Efeito do pré –tratamento com as amidinas II e III
A fim de se testar se as amidinas II e III protegem as células neuronais da
excitotoxicidade promovida pelo glutamato, as culturas do controle foram incubadas
com as respectivas amidinas (10nM) por 48h. Após este período, o agonista glutamato
(1mM) foi adicionado às culturas e o efeito protetor das amidinas II e III foi avaliado.
Sob estas condições, o efeito excitotóxico do glutamato foi reduzido consideravelmente.
A amidina II foi efetiva na redução da neurotoxicidade mediada pelo glutamato.
Como mostrado abaixo, porcentagem de neurônios remanescentes após a incubação na
presença de glutamato praticamente quadriplicou após o tratamento com a amidina II.
Resultados ainda mais promissores foram obtidos após incubação do glutamato em
células pré-incubadas com a amidina III, neste caso, houve um aumento da viabilidade
celular em 60%. Os resultados preliminares indicam que as amidinas triazólicas II e III
possuem efeito neuroprotetor por pré-condicionamento, o que pode significar potencial
efeito terapêutico nas neuropatias causadas por EAA.
Tabela 5. Efeito das amidinas II e III na toxicidade neuronal induzida por glutamato em
culturas de células embrionárias de retina de pinto.
63
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Figura 22. Efeito das amidinas II e III na toxicidade neuronal induzida por glutamato
em culturas de células embrionárias de retina de pinto. Onde: LM010 = Amidina II;
LM031 = Amidina III e G = Glutamato.
Os demais ensaios farmacológicos encontram-se em andamento. Dentre os
ensaios em curso, serão testados o efeito destas substâncias na captação de cálcio,
afinidade por receptores do tipo NMDA e suas subunidade, entre outros.
64
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
6. Conclusões
Neste trabalho foram desenvolvidas metodologias que permitiram as sínteses
eficientes da amina primária 1,2,3-triazólica 3 e da nitrila correspondente 5 a partir do
aldeído 1 (Quadro 4). As preparações de 3 e de 5 mostram-se atraentes pois o aldeído 1
é facilmente preparado em três etapas e em 33% de rendimento global a partir da Dglicose.
N
NH2
Ph N
N
3 (75 %)
CHO
N
Ph N
N
CN
N
Ph N
N
5 (61 % global)
1
Quadro 4. Amina e nitrila 1,2,3-triazólicas derivadas do aldeído 1.
Uma vez que o método de Pinner não se mostrou eficiente para a preparação da
amidina II, as sínteses das amidinas II-IV foram efetuadas segundo a adaptação da
metodologia de Rouselet para nitrilas heterocíclicas e análogos de anilina (Tabela 6).
Neste procedimento, a via térmica (entradas 1, 3 e 5) necessitou de elevados tempos
reacionais, conforme descrito por este autor.84 Por outro lado, os experimentos inéditos
via sonicação desenvolvidos neste trabalho (entradas 2, 4 e 6) mostraram-se mais
atraentes em termos de tempos reacionais e não resultaram em prejuízos de rendimentos
químicos. A preparação de IV deverá ser otimizada em futuro próximo.
entr.
nitrila
am ina
N N
CN
1
F 3C
2
4
5
6
Ph N
Ph N
N
CN
N
5
N
CN
N
5
H
NH 2
N
CuCl, 80 o C
o
CuCl, 100 C,
am idina
tem po
H
20 h
5h
NH
Ph
N
H
2
Benzonitrila
3
condições
Ph
NH2
Benzilam ina
N N
F 3C
CuCl, DM SO, 80 o C
20 h
CuCl, DM SO, 100 o C ,
3h
N N
N
2
CuCl, DM SO, 80 o C
24 h
CuCl, DM SO, 100 o C,
7h
70%
II
NH
Ph N
N
N
H
NH
Ph N
N
N
73 %
N
Ph
H
III
N
H
Tabela 6. Vias térmica e sonicação nas sínteses das amidinas II-IV.
65
75 %
CF 3
N
H
NH 2
%
76%
5%
N N
N
IV
CF 3
4%
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
A adaptação da metodologia de Rouselet, via sonicação, desenvolvida neste
trabalho deverá possibilitar as sínteses das novas amidinas triazólicas I e V a partir da
amina 3 (Esquema 22).
NH
Ph
NH
N
N Ph
N
N
H
N
N Ph
N
H2N
I
N
Ph N
N
N
N Ph
N
N
H
3
V
Esquema 22. Perspectivas para as sínteses de I e V.
Esta abordagem deverá também ser empregada nas sínteses das amidinas
conjugadas VI e VII a partir da nitrila α,β-insaturada 7 derivada do aldeído triazólico 1
por reação de Knoevenagel (Esquema 23).111
CHO
N
Ph N
N
1
N
Ph N
N
ref. 111
N
H
7
CF3
NH
N
Ph N
N
CN
N
N Ph
N
VI
NH N
N
Ph N
N
N
H
VII
N
N
H
Esquema 23. Perspectivas para as sínteses de VI e VII
As amidinas II e III foram avaliadas quanto ao efeito neurotóxico e quanto a
neuroproteação frente ao glutamato, ambas mostrando possuir efeito neuroprotetor sem
induzir, por si só, neurotoxicidade. Os melhores resultados foram os obtidos após
incubação do glutamato em células pré-condicionadas com a amidina III, havendo um
aumento da viabilidade celular em 60%. Os ensaios biológicos visando a elucidação do
mecanismo pelo qual estas moléculas exercem efeito neuroprotetor estão em
andamento.
111
DiBiase, S. A.; Beadle, J. R.; Gokel, G. W. Org. Synth. Coll. Vol. 7, p.108; Vol. 62, p.179
66
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Os ensaios preliminares mostraram-se extremamente promissores, uma vez que
indicam que amidinas triazólicas podem representar uma nova classe de substâncias
com promissor efeito neuroprotetor frente aos distúrbios iniciados pelo aumento da
atividade celular devido ao excesso de glutamato.
67
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7. Experimentais
7.1 Materiais e métodos
A remoção de água da benzonitrila foi efetuada por tratamento com CaCl2
anidro, sob atmosfera de nitrogênio, por uma noite, seguida de destilação à vácuo (~15
mmHg). A remoção de água do DMSO foi efetuada por tratamento com CaH2, sob
atmosfera de N2, por uma noite, seguido de destilação à vácuo (0,5 mmHg).112
Todas as reações foram acompanhadas por c.c.f. e a visualização das substâncias
foi efetuada por exposição à luz U.V. ou por revelação com solução de vanilina
sulfúrica (3g de vanilina +13 mL de H2SO4 98% em 100mL de etanol) em etanol e
aquecimento ou solução aquosa de ninidrina (100mg/50mL). As misturas de eluentes
utilizadas nos processos cromatográficos foram preparadas volume a volume, a partir de
solventes previamente destilados. A remoção parcial dos solventes, durante o
isolamento das reações ou ao final das colunas cromatográficas foi efetuada em
evaporador rotatório sob vácuo. Em todos os casos, a eliminação de traços de solventes
foi efetuada em um alto-vácuo a 0,5 mmHg.
As cromatografias de adsorção em coluna foram realizadas utilizando sílica gel
70-230mesh (60A) ou 230-400mesh (60A), em coluna “flash”. As análises em
cromatografia em camada fina (c.c.f.) foram realizadas utilizando cromatofolhas de
alumínio recobertas com sílica gel 60F254 (Merck, Darmstadt).
Os pontos de fusão foram determinados em aparelho Fischer-Johns e não foram
corrigidos. As reações de sonicação foram efetuadas em aparelho Cole-Parmer com
aquecimento a 100ºC.
Os espectros de absorção na região do infravermelho (I.V.) foram registrados em
espectrofotômetro Perkin-Elmer FT-IR modelos 1600 series e spectrum, utilizando
filme de CH2Cl2 ou pastilhas de KBr. Os valores para absorção foram registrados em
número de onda, sendo a unidade cm-1.
Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (1H-RMN) e de
ressonância magnética nuclear de carbono-13 (13C-RMN) foram registrados em um
112
Perrin D.R.; Amarego, N.L.F. Purification of Laboratory Chemicals; Pergamon Press: New York,
1980.
68
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
espectrofotômetro Varian Unity Plus (300 MHz). Os deslocamentos químicos (δ) estão
relatados em ppm em relação ao tetrametilsilano (TMS), utilizado como padrão interno.
As multiplicidades (s-singlete; sl-singlete largo; d-dublete; t-triplete; dd-duplo dublete;
ddd-duplo duplo dublete; q-quarteto; dq-duplo quarteto; m-multipleto) e a constante de
acoplamento (J) em Hertz (Hz) estão entre parênteses.
69
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.2. Fenil-D-glicosazona
H
HO
H
H
CHO
OH
H
OH
OH
CH2OH
D-(+)-glicose
H
PhNHNH2
T.A., 4 dias
NNHPh
NNHPh
HO
H
H
OH
H
OH
CH2OH
Fenil-D-glicosazona (64%)
Em uma solução aquosa (90mL) de ácido acético 5,78 N, dissolveu-se D-(+)-glicose
(9,82g) e adicionou-se uma solução de fenilidrazina (17 mL) em álcool etílico
(90mL). A mistura foi deixada sob agitação a temperatura ambiente por 4 dias. Ao
final da reação, o sólido amarelo intenso formado foi filtrado e recristalizado em
etanol 60% para fornecer a fenil-D-glicosazona (12,93g, 64%) como um sólido
amarelo de p.f. 206-207oC (lit. 100 :207oC).
70
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.3. Fenil-D-glicosetriazol
Ph
N N
N
H
NNHPh
NNHPh
HO
H
H
OH
H
OH
CH2OH
CuSO4. 5H2O
refluxo, 3 h
HO
H
H
H
OH
OH
CH2OH
Fenil-D-glicosetriazol (60%)
Fenil-D-glicosazona
Uma mistura de fenil-D-glicosasona (2,0 g), 10 mL de ácido sulfúrico 0,5 N, 180
mL de água, 120 mL de álcool isopropílico e 3,8 g de sulfato de cobre (II) foram
mantidos sob refluxo em banho maria por 3 h. A mistura foi filtrada a quente e o
filtrado teve seu volume reduzido a cerca de 100 mL em evaporador rotatório. Após
resfriamento, a mistura foi filtrada e o sólido obtido foi recristalizado 2 vezes em 100
partes de água, fornecendo o fenil-D-glicosetriazol (0,88 g, 60%) como cristais
incolores de p.f. 195-196oC (lit.100 :195-196oC).
71
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.4. 2-Fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-carboxaldeído (1)
Ph
N N
N
HO
H
H
H
OH
OH
CH2OH
NaIO4, H2O
T. A., 24 h
O
H
N
N
N Ph
1 (86%)
Fenil-D-glicosetriazol
Uma suspensão de fenil-D-glicosetriazol (0,5 g) em uma mistura de 50 mL de
água e 5 mL de solução aquosa de NaIO4 0,428 M (1,35 g; 3,35 eq.) foi agitada a 25oC
por 24 h. Os cristais resultantes foram removidos por filtração e lavados com água
gelada (3 x 10mL). Recristalização com uma mistura de 16 partes de EtOH e 32 partes
de água forneceu 3 (0,3 g, 86%) como um sólido branco de p.f. 65-66oC (lit.100: 6869oC).
I.V. (KBr; cm-1): 1697; 1596; 1488; 1364; 1315; 1219; 967; 760; 670.
RMN 1H (300 MHz, CDCl3, ppm): 10,23 (s);8,27 (s) 8,05 (ddd; 7,2 Hz; 3,0 Hz; 1,2
Hz); 7,54 (ddd; 7,5 Hz; 7,2 Hz; 1,8 Hz); 7,46 (tt; 7,5 Hz; 1,2 Hz).
72
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.5. 2-Fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-carboxaldeído oxima (4)
NOH
N
Ph N
N
1
CHO
NH2OH.HCl, NaHCO3
CH2Cl2, Na2SO4
T.A. 18h
N
Ph N
N
H
4 (87%)
À uma solução de 1 (0,30 g; 1,91 mmol) em CH2Cl2 (17,6 mL) foram adicionados
Na2SO4 (0,2936 g; 1,91 mmol), NH2OH.HCl (0,1468 g; 2,20 mmol) e NaHCO3 (0,2202
g; 2,20 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 18h e filtrada. O
solvente foi removido a pressão reduzida para fornecer 5 (0,28 g, 87%) após
recristalização em hexano como um sólido branco de p. f. 140-143oC (lit.113: 145oC).
I.V. (KBr, cm-1): 3282, 3012, 1560, 1500, 1343, 1330, 1316, 1038, 984, 968, 929, 823,
745.
RMN1H (300 MHz, CDCl3, ppm): 8,55 (sl); 8,12 (s); 8,09-8,06(m); 7,54-7,47 (m);
7,43-7,38 (m).
RMN13C (CDCl3, ppm): 142,52; 138,9; 133,4; 129,3; 128,1;119,0; 118,8.
113
El Khadem, H.; El-Shafei, Z. M.; Meshereki, M. H.; Shaban, M. A.; J. Chem. Soc; Org, 1966, 1, 91.
73
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.6. 2-Fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-carbonitrila (5)
NOH
N
Ph N
N
H
(CH3CO)2O
refluxo, 1 h
N
Ph N
N
CN
5 (70%)
4
Uma solução da oxima 4 (0,50 g; 2,65mmol) em anidrido acético (10 mL) bidestilado
foi aquecida ao refluxo por 2h. A solução quente foi vertida, com agitação constante,
em 50mL de água gelada e agitada vigorosamente por 30 minutos. A mistura foi
extraída com CH2Cl2 (3 X 5 mL). A fase orgânica foi lavada com NaHCO3 10% até pH
neutro, seca com Na2SO4 anidro e evaporada. Recristalização em hexano forneceu 5
(0,32 g, 70%) como um sólido branco de p. f. 86-87oC (lit.101: 89oC).
I.V (KBr, cm-1):3135, 2247, 1596, 1496, 1459, 1395, 1324, 1032, 970, 866, 761, 670.
RMN1H (300 MHz, CDCl3, ppm): 8,16 (1H, s); 8,12-8,08 (2H, m); 7,57-7,44 (3H, m).
74
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.7. C-(2-Fenil-2H-[1,2,3]-triazol-4-il)-metilamina (3)
a) Via aminação redutiva
OHC
NaBH3CN, ZnCl2 1N
N
N Ph
N
NH4OAc, MeOH abs.
T. A., 96h
1
N
N Ph
N
H 2N
3 (75%)
À uma solução do aldeído 1 (0,10 g; 0,58 mmol) e de acetato de amônio (3,65g; 58
mmol) em metanol absoluto (1,56 mL) foi adicionada, sob agitação, uma solução de
cianoboridreto de sódio (0,0366 g; 0,58 mmol) e de 0,58 mL cloreto de zinco (0,1 N em
Et2O) em metanol absoluto (2,7 mL). A mistura resultante foi agitada a temperatura
ambiente por 96 h e adicionada em NaOH 0,1N (3,9 mL). O metanol foi removido a
pressão reduzida e a solução aquosa foi extraída com acetato de etila (3 X 5 mL). As
fases orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl e secas com
Na2SO4 anidro. O acetato de etila foi removido a pressão reduzida e o resíduo obtido foi
purificado por cromatografia em coluna “flash” de gel de sílica (5%Acetato em nhexano) fornecendo 3 (0,075 g, 75%) como um sólido amarelo de p. f. 71-73oC.
b) Via redução da oxima 4
NOH 1. Zn, NH4Cl
NH4OH
H
refluxo 4h
N
Ph N
N
4
2. NaOH
H2N
N
N Ph
N
3 (60%)
Uma suspensão da oxima 4 (0,50 g; 2,65 mmol), Zn0 (795 mg; 12,15 mmol) e cloreto de
amônio (0,106 g; 1,98 mmol ) em amônia concentrada (13,25 mL) e etanol (5,3 mL) foi
aquecida ao refluxo durante 4 horas. Uma solução de NaOH 50% (0,2 mL) foi
adicionada e a mistura foi agitada por 10 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi
extraído com CH2Cl2 (3 X 6 mL). Secagem com Na2SO4 anidro, filtração e evaporação
75
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
do solvente forneceu 3 (0,12 g, 60%) como um sólido amarelado de p. f. 71-73oC após
cromatografia em coluna “flash” de gel de sílica (Acetato/ Hexano 5%) .
I.V. (KBr, cm-1):3399, 2936, 1597, 1497, 1463, 1414, 1356,1312, 1214, 1047, 1017,
967, 911, 853, 756, 690, 666.
RMN1H (300 MHz, CDCl3, ppm): 8,04 (d, 7,5); 7,72 (s); 7,48 (t; 7, 6Hz; 7,3 Hz; 1,9
Hz); 7,33 (tt; 7,6 Hz; 1,2 Hz); 4,06(sl).
RMN13C (CDCl3, ppm): 147,7; 139,6; 134,4; 129,0; 127,2; 118,5; 43,5.
76
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.8. 3-Amino-5-trifluorometil-1H-1,2,4-triazol (2)
F3C
H
NH
O
OH
+ H2N
N N
Tolueno
NHNH2.H2CO3
refluxo
Dean-Stark, 20h
F3C
N
NH2
2 (91%)
Uma mistura de bicarbonato de aminoguanidina (5,64g; 41,44mmol) e ácido
trifluoracético (4,0mL) foi mantida em agitação magnética por 20 minutos até
desprendimento completo de CO2. Adicionou-se tolueno (120mL) e a mistura reacional
foi aquecida ao refluxo sob agitação magnética por 20h em aparelhagem Dean-Stark
com condensador de refluxo. A reação foi acompanhada por CCF utilizando como
eluente a mistura 50% acetato de etila em n-hexano. Ao final da reação foi observada a
formação de um sólido branco, o qual foi filtrado sob vácuo e lavado com 10mL de
tolueno gelado. O produto obtido foi seco sob linha de auto vácuo e posteriormente
sublimado, fornecendo 2 (6,24 g, 91%) sob forma de cristais tipo agulha de p. f. 197oC
(lit.105 :198oC).
I.V (KBr, cm-1): 3941, 3357, 3055, 2846, 2712, 1643, 1582, 1551, 1489, 1451, 1363,
1218, 1199, 1143, 1108, 1057, 1009, 998, 844, 774, 761, 728, 706.
RMN 1H (300 MHz; acetona-d6, ppm): 6,0 (s) e 12,24 (s).
77
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.9.
N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-benzamidina (II): via
térmica 84
CN
H
H
N N
+ FC
3
N
NH
CuCl, 80oC
NH2
20 horas
2
Ph
N N
N CF3
N
H
II (75%)
À uma solução de CuCl (123,75 mg;1,25mmol) em 2 mL de benzonitrila foi adicionado
uma suspensão da amina 2 (152 mg;1 mmol) em benzonitrila (1mL) sob atmosfera de
N2. A mistura foi aquecida a 80ºC durante 20 horas. Ao término da reação foram
adicionados 2mL de acetato de etila e 4mL de NaOH 50% e a mistura foi agitada
vigorosamente por 30 minutos. A fase orgânica foi lavada com NH4OH 3M até teste
negativo pra cobre (II) com solução 0,1M de ferrocianeto de potássio. A fase orgânica
foi lavada com NH4Cl 5% (até pH neutro), com água (3 x 5mL), seca com Na2SO4
anidro, filtrada e evaporada. O resíduo foi purificado por recristalização em etanol
fornecendo II (191,3 mg; 75%) como um sólido amarelo de p. f. 151oC.
I.V (KBr, cm-1): 3346, 3203, 3061, 2920, 2851, 1645, 1578, 1530, 1510, 1466, 1447,
1216, 1181, 1145, 1034, 1008, 860, 771, 743, 697.
RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6, ppm): 9,07(sl); 8,90 (sl); 8,22(sl); 8,17-8,13 (m); 7,707,64 (m).
RMN13C (DMSO-d6, ppm): 160,7; 160,4; 149,7 (q, 37 Hz); 134,6; 131,8; 128,7; 127,7;
119, 8 (q, 269 Hz).
78
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.10.
N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-benzamidina (II):via
sonicação
CN
H
H
N N
+ FC
3
N
NH
o
CuCl, 100 C
NH2
,5h
2
Ph
N N
N
N
H
II (70%)
CF3
À uma solução de CuCl (123,75 mg;1,25mmol) em 2 mL de benzonitrila foi adicionado
uma suspensão da amina 2 (152 mg;1 mmol) em benzonitrila (1mL) sob atmosfera de
N2. A mistura foi deixada sob sonicação e aquecimento a 100ºC durante 5 horas. Ao
término da reação foram adicionados 2mL de acetato de etila e 4mL de NaOH 50% e a
mistura foi agitada vigorosamente por 30 minutos. A fase orgânica foi lavada com
NH4OH 3M até teste negativo pra cobre (II) com solução a 0,1 M de ferrocianeto de
potássio. A fase orgânica foi lavada com NH4Cl 5% (até pH neutro) seguida por
lavagem com água (3 x 5mL), seca com Na2SO4 anidro, filtrada e evaporada. O resíduo
foi purificado por cromatografia de placa preparativa em gel de sílica (eluente: 10%
AcOEt em n-hexano), seguida por recristalização em etanol para fornecer II (178,5 mg;
70%) como um sólido amarelo de p. f. 151oC.
79
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.11. N-benzil-2-fenil-2H-[1,2,3]-4-carboxamidina (III): via térmica 84
N
Ph N
N
CN
o
+ Ph
NH2
CuCl, 80 C
DMSO
20 horas
5
NH
N
Ph N
N
N
H
Ph
III (73%)
À uma solução da nitrila 5 (212,6 mg;1,25 mmol) e CuCl (123,75 mg;1,25mmol) em
DMSO (2mL) foi adicionado uma solução da benzilamina (107,16 mg; 1 mmol) em
DMSO (1mL) sob atmosfera de N2 e a mistura foi aquecida a 80ºC durante 20 horas. Ao
término da reação foram adicionados 2mL de acetato de etila e 4mL de NaOH 50% e a
mistura foi agitada vigorosamente por 30 minutos. O produto foi filtrado e os sólidos
lavados com acetato de etila (3 x 3 mL). A fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro,
filtrada e evaporada. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia preparativa
em gel de sílica (eluente: 10% AcOEt em n-hexano) fornecendo III (202,4mg; 73%)
como um sólido branco de p. f. 121-123oC.
I.V. (KBr, cm-1): 3280, 3033, 2919, 1658, 1595, 1553, 1497, 1455, 1322, 1227, 1153,
970, 756, 697, 667.
RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6, ppm): 9,33 (m); 8,58 (s); 8,38 (ddd, 7,5; 3,2; 1,2); 7,73
(ddd,8,7;7,5;1,7); 7,60 (tt; 8,7; 1,2); 7,50-7,45 (m); 7,40-7,34 (m); 4,63 (d; 6,3).
RMN13C (DMSO-d6, ppm): 159,2; 144,2; 139,2; 138,9; 136,4;129,8; 128,6; 128,4;
127,4; 126,9; 118,9; 42,2.
80
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.12. N-benzil-2-fenil-2H-[1,2,3]-4-carboxamidina (III): via sonicação
NH
CN
N
Ph N
N
5
o
+ Ph
NH2
CuCl, 100 C
DMSO
,3h
N
Ph N
N
N
H
Ph
III (76 %)
À uma solução da nitrila 5 (212,6 mg;1,25 mmol) e CuCl (123,75 mg;1,25mmol) em
DMSO (2mL) foi adicionado uma solução da benzilamina (107,16 mg; 1 mmol) em
DMSO (1mL) sob atmosfera de N2. A mistura foi deixada sob sonicação e aquecimento
a 100ºC durante 5 horas. Ao término da reação foram adicionados 2mL de acetato de
etila e 4mL de NaOH 50% e a mistura foi agitada vigorosamente por 30 minutos. O
produto foi filtrado e os sólidos lavados com acetato de etila. A fase orgânica foi seca
com Na2SO4 anidro, filtrada e evaporada. O resíduo resultante foi purificado por
cromatografia preparativa em gel de sílica (eluente: 10% AcOEt em n-hexano)
fornecendo III (210,7mg; 76%) como um sólido branco de p. f. 121-123oC.
81
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.13.
2-fenil-N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-2H-[1,2,3]triazol-4-carboxamidina (IV): via térmica 84
N
Ph N
N
CN
+
H
N N
F3C
5
N
H
CuCl, 80oC
NH2
DMSO
24 horas
NH
N
Ph N
N
N
H
N N
N
CF3
IV (5 %)
2
À uma solução da nitrila 5 (212,6 mg; 1,25 mmol) e CuCl (123,75 mg;1,25mmol) em
DMSO (2mL) foi adicionado uma solução da amina 2 (152mg; 1 mmol) em DMSO
(1mL) sob atmosfera de N2 e a mistura foi aquecida a 80ºC durante 20 horas. Ao
término da reação foram adicionados 2mL de acetato de etila e 4mL de NaOH 50% e a
mistura foi agitada vigorosamente por 30 minutos. O produto foi filtrado e os sólidos
lavados com acetato de etila (3 x 3 mL). A fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro,
filtrada e evaporada. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia preparativa
em gel de sílica (eluente: 10% AcOEt em n-hexano) fornecendo IV (16,1mg; 5%) como
um sólido branco de p. f. 121-123oC.
I.V. (KBr, cm-1): 3342, 2965, 2934, 2874, 1680, 1598, 1498, 1464, 1357, 969, 758.
RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6, ppm): 8,53 (s); 8,19 (d; 9,0); 7,84 (sl); 7,54 (t; 9,0; 6,0;
1,9); 7,61 (tt; 7,8; 1,2).
82
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.14.
2-fenil-N-(5-trifluorometil-2H-[1,2,4]-triazol-3-il)-2H-[1,2,3]triazol-4-carboxamidina (IV): via sonicação
N
Ph N
N
5
CN
+
H
N N
F3C
N
2
H
o
NH
CuCl, 100 C
NH2
DMSO
,7h
N
Ph N
N
N N
N
H
N
CF3
IV (4 %)
À uma solução da nitrila 5 (212,6 mg;1,25 mmol) e CuCl (123,75 mg; 1,25mmol) em
DMSO (2mL) foi adicionado uma solução da amina 2 (152 mg; 1 mmol) em DMSO
(1mL) sob atmosfera de N2. A mistura foi deixada sob sonicação e aquecimento a 100ºC
durante 7 horas. por Ao término da reação foram adicionados 2mL de acetato de etila e
4mL de NaOH 50% e a mistura foi agitada vigorosamente por 30 minutos. O produto
foi filtrado e os sólidos lavados com acetato de etila. A fase orgânica foi seca com
Na2SO4 anidro, filtrada e evaporada. O resíduo resultante foi purificado por
cromatografia preparativa em gel de sílica (eluente: 10% AcOEt em n-hexano)
fornecendo IV (12,6 mg; 4 %) como um sólido branco de p. f. 134-137ºC.
83
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
7.15. Avaliação Farmacológica
7.15.1 Preparo das Culturas Purificadas de Neurônios 109,110
As culturas purificadas de neurônios e fotorreceptores de embrião de pinto de 8 dias
foram preparadas de acordo com Adler
109,110
: As retinas foram dissecadas, incubadas
com tripsina a 0,1% e dissociadas. As células foram posteriormente suspensas em meio
de cultura basal de Eagle (BME) suplementado com 2,5 % de soro fetal bovino,
penicilina (100U/mL) e estreptomicina (100ug/mL), sendo acondicionadas em placas de
cultura de 35 mm pré-tratadas com poli-L-ornitina. A densidade celular foi de 8,3 x 102
células/mm2. As culturas foram incubadas a 37°C em atmosfera úmida com 5% de
CO2/95% ar, sem nenhuma troca de meio, e usadas após 3 dias de cultivo.
7.15.2 Tratamento com drogas 109,110
As células foram avaliadas quanto à viabilidade em cultura no primeiro dia. Em seguida
as drogas a serem testadas (amidina II e III) foram aplicadas às placas de cultura e
testadas por uma incubação de 48 horas. Após este tempo, adicionou-se glutamato
(1mM).
7.15.3 Contagem de células109,110
Após a fixação de células tratadas com glutamato por oito horas, realizou-se a contagem
celular onde foram consideradas apenas as células viáveis (apresentando neuritos). Em
cada placa de 35 mm, 10 campos foram contados utilizando microscópio invertido
Nikon no aumento de 400 vezes. Os resultados foram expressos em percentagem (%) da
placa controle.
84
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 1. Espectro de IV (Pastilha) do aldeído triazólico 1.
91
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 2. Espectro de 1H RMN (300 MHz;CDCl3; ppm) do aldeído triazólico 1.
92
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 3. Espectro de IV (Pastilha) da oxima 4.
93
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 4. Espectro de 1H RMN (300 MHz;CDCl3; ppm) da oxima 4.
94
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 5. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz;CDCl3; ppm) da oxima 4.
95
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 6. 13C RMN (75 MHz; CDCl3; ppm) da oxima 4.
96
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 7. 13C RMN-HETCOR (75 MHz; CDCl3; ppm) da oxima 4.
97
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 8. Espectro de IV (Pastilha) da nitrila 5.
98
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 9. Espectro de 1H RMN (300 MHz; CDCl3; ppm) da nitrila 5.
99
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 10. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; CDCl3; ppm) da nitrila 5.
100
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 11. Espectro de IV (filme) da amina 3.
101
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 12. Espectro de 1H RMN (300 MHz;CDCl3; ppm) da amina 3.
102
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 13. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz;CDCl3; ppm) da amina 3.
103
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 14. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz;CDCl3; ppm) da amina 3Expansão.
104
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 15. Espectro de 13C RMN (CDCl3; ppm) da amina 3.
105
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 16. Espectro de IV (pastilha) da amina 2.
106
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 17. Espectro de 1H RMN (300 MHz; CD3COCD3; ppm) da amina 2.
107
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 18. Espectro de IV (Pastilha) da amidina II.
108
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 19. Espectro de 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II.
109
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 20. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II.
110
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 21. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II
– Expansão.
111
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 22. Espectro de 13C RMN (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II.
112
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 23. Espectro de 13C RMN (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina II.
113
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 24. Espectro de IV (Pastilha) da amidina III.
114
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 25. Espectro de 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III.
115
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 26. Espectro de 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6 + 10 gotas de D2O; ppm) da
amidina III.
116
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 27. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina
III.
117
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 28. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina
III –Expansão.
118
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 29. Espectro de 13C RMN (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III
119
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 30. 13C RMN-HETCOR (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III.
120
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 31. 13C RMN-HETCOR (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III –
Expansão 1.
121
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 32. 13C RMN-HETCOR (75 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina III –
Expansão 2.
122
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 33. Espectro de IV (Pastilha) da amidina IV.
123
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 34. Espectro de 1H RMN (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina IV
124
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 35. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina
IV.
125
Dissertação de Mestrado de Luana Monteiro Spíndola Marins
Espectro 36. Espectro de 1H RMN-COSY (300 MHz; DMSO-d6; ppm) da amidina
IV – Expansão.
126