Universidade Estadual de São Paulo
Escola de Engenharia de Lorena
Separação e recuperação de
bioprodutos
Prof. Arnaldo Márcio Ramalho Prata
As etapas do processo fermentativo
até o final da fermentação são
denominadas linha ascendente ou
“up stream” e a etapa de recuperação
do produto e tratamentos de resíduos é
chamada linha descendente ou
“down stream”
Esquema geral do processo fermentativo
Preparo de inóculo
(microrganismo)
Preparo do meio
-tratamento da matéria-prima
- mistura de nutrientes
-ajuste de pH
- tratamento térmico
Esterilização
Fermentação
propriamente dita
(BIORREATOR)
Linha descendente
Processos à jusante
“downstream”
Recuperação do
produto
Produto
Ar
Linha ascendente
Processos à montante
“upstream”
Tratamentos de
resíduos
SEPARAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS
“Upstream”
“Downstream”
• Processos relacionados à etapa
de fermentação
• Microorganismo
• Meio de fermentação
• Fermentação
• Tecnologia utilizada para
recuperação e purificação de
bioprodutos
• Células microbianas
• Células animais
• Células vegetais
Definição: Separação do produto do meio
fermentado, colocando-o na forma mais pura possível
para a aplicação a que se destina.
o A etapa de recuperação de produto começa após
a determinação correta do final da fermentação.
o Esta deve levar em conta o máximo da produção
técnica e a máxima produção econômica.
o O produto de interesse pode estar no interior da
célula ou no meio de fermentação (lembrar que
há situações especiais).
SEPARAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS
Serão abordados os procedimentos envolvidos na
recuperação de bioprodutos do tipo insumos químicos e
biomoléculas e microrganismos, exemplificados a seguir:
Insumos químicos e biomoléculas
Álcoois
Polímeros
Ácidos orgânicos Vitaminas
Solventes
Aminoácidos
Antibióticos
Enzimas
Hormônios
Poliésteres
Microrganismos
o
o
o
o
o
Inóculo para processos fermentativos
Microrganismos fixadores de nitrogênio
Microrganismos para controle biológico
Vacinas
Probióticos
Exemplos de enzimas
Protease de Bacillus
Amilase de Bacillus
Glicoamilase
Glicose-isomerase
Renina microbiana
-amilase
Amilase fúngica
Glicose oxidase
Invertase
Lisozima
Penicilina acilase
Lactase
Lipase
Xilanase
É importante observar a escala de aplicação
dos diversos métodos de separação e
purificação de produtos biotecnológicos:
oEscala de laboratório, normalmente para produtos
destinados a estudos acadêmicos e aplicações
específicas
oEscala industrial, quando se busca a obtenção de
grandes quantidades de produto para fins comerciais
SEPARAÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BIOPRODUTOS
Tem como objetivo recuperar o produto desejado de forma eficiente,
segura e reproduzível
Está incluída num conjunto de atividades que estão envolvidas no
desenvolvimento de um produto
Avaliação econômica
Atendimento a exigências da legislação
Produção em larga escala
Conjunto de operações unitárias
Purificação
de
bioprodutos
Meio de cultivo com células
Clarificação
(Separação das células/meio)
Células
(produtos intracelulares)
Rompimento de células
Sobrenadante
(produtos extracelulares)
Remoção de fragmentos de
células
Fração sólida
Sobrenadante
Separação/Concentração
de moléculas
Purificação
Tratamentos finais
Processamento Upstream
Influência do processo de upstream sobre o
processo de downstream
Seleção MO
Característica
dos
microrganismos
Adaptação
MO
Preparação
de inóculo
Localização
do produto
Estágios de
préfermentação
Estabilidade
do produto
dentro das
células
Processo
fermentativo
Produção de
metabólitos
secundários
ou impurezas
Separação e purificação de bioprodutos
Etapa complexa
Características do meio
influenciam
São processos desafiadores
Não existe um
procedimento único
de recuperação de
produto
Cada processo apresenta suas
peculiaridades devido às características
específicas dos diferentes produtos e
dos microrganismos.
Operações envolvidas no processo de purificação de bioprodutos
Filtração convencional
Tamanho das partículas
Centrifugação
Tamanho e densidade das partículas
Filtração tangencial (Membranas)
Tamanho das partículas
Floculação
Hidrofobicidade de partículas
Homogeneização
Cisalhamento
Ultra-som
Cisalhamento
Moagem em moinho de bolas
Cisalhamento
Rompimento químico ou enzimático
Hidrólise, solubilização ou desidratação
de moléculas que compõem a parede ou
a Membrana Celular
Clarificação
Rompimento
celular
Purificação de
baixa
resolução
Purificação de
alta resolução
Tratamentos
finais
Precipitação
Solubilidade
Ultrafiltração (membranas)
Massa molar e raio hidrodinâmico de
moléculas
Extração em sistemas de duas fases
líquidas
Solubilidade, massa molecular
Cromatografia de troca-iônica
Tipo e densidade da biomolécula
Cromatografia de afinidade
Sítios específicos (adsorção)
Cromatografia de imunoafinidade
Sítios específicos (antigeno/anticorpo)
Cromatografia de interação hidrofóbica
Hidrofobicidade
Cromatografia de exclusão molecular
Massa molar
Membranas adsortivas
Massa molar e sítios específicos
Cristalização
Solubilidade e Características de
equilíbrio líquido-sólido
Liofilização
Características de equilíbrio sólidovapor
Secagem
Características de equilíbrio líquidovapor
Clarificação
Separação das células suspensas de um meio fermentado
Operações unitárias viáveis em escala industrial:
• Filtração convencional
• Filtração tangencial
• Centrifugação
A operação unitária adequada depende da faixa de dimensão da
partícula a ser removida:
Clarificação
Separação das células suspensas no meio fermentado
Filtração
Aplica-se à clarificação de grandes volumes
Realizada em condições não assépticas
Aplicado principalmente para fungos filamentosos: micélio com
densidade muito baixa
Clarificação
Filtração Convencional
Aplica-se à clarificação
de grandes volumes de
suspensões diluídas de
células, produtos
extracelulares e
situações que não
necessitam de assepsia.
Princípio de separação Filtração: tamanho da
partícula
(também forma e compressibilidade do material)
o
o
o
o
A suspensão, sob pressão, é perpendicularmente direcionada
a um meio filtrante (filtração convencional).
Aplica-se a suspensões diluídas de células.
“A fração volumétrica que atravessa o meio filtrante é
denominada filtrado e o depósito de sólidos (sobretudo células)
sobre o meio filtrante chama-se torta.”
Alguns tipos de filtro:
1. Rotatório (mais adequado para meios biológicos, pois não é afetado
pela compressibilidade da torta)
2. De pressão
3. Folha (disco) horizontal
Clarificação
Filtração Convencional
Equipamento utilizado:
Filtro Rotativo a Vácuo (FRV)
•
•
Tambor oco e rotativo (1 rpm),
coberto com uma malha metálica
filtrante, recoberta com terra
diatomácea.
• Capacidade de 0,1 a 0,2 m3.h
O tambor fica parcialmente submerso
em um recipiente que contém a
suspensão.
• Ocorre leve agitação para evitar a
sedimentação.
• Suspensão é alimentada pela parte
externa do tambor.
• A redução de pressão (vácuo), ocorre
no interior do tambor, promovendo a
filtração (formação da torta).
Clarificação
Filtração Tangencial: Microfiltração
A tensão de cisalhamento do
fluído minimiza o acúmulo de
células e seus fragmentos na
superfície das membranas.
Fluidos de alimentação escoam
tangencialmente à superfície
filtrante.
O fluxo de filtrado e o coeficiente
de retenção de solutos ou sólidos
são influenciados pela formação
de um gradiente de concentração
de células ou solutos próximos à
superfície da membrana e fouling
A formação do gradiente de concentração é reversível com a alteração das
condições de operação do processo, enquanto o fouling necessita de
controle de escoamento e pressão.
Clarificação
Filtração Tangencial: Microfiltração
Membrana de fibra oca
• Possuem elevada área
filtrante por unidade de
filtro.
• Bastante susceptíveis à
entupimentos.
Membrana tipo placa e quadro
• Possuem pequenas áreas
filtrantes por unidade de
volume.
• Podem ser aplicados em
regime turbulento.
• A limpeza é fácil.
Esquema de um Filtro de Pressão
Fatores que influenciam a velocidade de
filtração
- permeabilidade de leito
(K)
- área de filtração
(A)
- viscosidade do líquido
()
- espessura do leito
(L)
- resistência do leito de filtração
(L/K)
- compressibilidade da torta
(S)
- concentração celular do líquido
(X)
- diferença de pressão através do leito
(P)
- const. relacionada a tamanho e forma das células (’)
O tempo (t) necessário para a filtração de um volume V de suspensão
contendo células sujeitas à compres-sibilidade, sob uma determinada
pressão e através de uma área A é dado por:
 . ’ . X V2
t=
2 . P(1-S)
A2
Obs.: - S varia de 0 a 1,0
- Tortas de células microbianas podem ter S de até 0,8
- Para tortas rígidas, S = 0
Clarificação
Centrifugação
A centrifugação de meios fermentados é uma tecnologia já consolidada. Suas
vantagens sobre o processo de filtração são:
Processo completamente contínuo;
Alta capacidade para pequenos volumes;
Curto tempo de residência;
Equipamento esterilizável por vapor;
Limpeza e operação completamente automatizadas;
Processamento do produto em condições assépticas;
Processamento de microrganismos perigosos em sistema fechado;
Inexistência de custos com auxiliares de filtração, membranas e produtos químicos.
Clarificação
Centrifugação
Princípio de separação: diferença de densidade (também tamanho de
partícula e viscosidade)
Método que acelera o processo de sedimentação por ação de um campo
gravitacional centrifugo
Baseia-se na diferença de densidade entre a célula e o meio líquido, na
viscosidade do meio líquido, na força motriz e a distância radial desde o
centro da centrifuga até a célula e no diâmetro da particula.
Alguns tipos de centrífuga
a) Tubular; b) Câmara;
c) Disco;
d) Rolo
Clarificação
Centrifuga tubular
• Podem operar sob refrigeração
(13.000 a 17.000 x g)
• Capacidade limitada de volume
Aplica-se em suspensões de no
máximo 30 g/L de células
Centrífuga
tubular de alta
velocidade
Clarificação
Centrifuga de disco
Aplica-se em suspensões de no
máximo 250 g/L de células
• Atuam em valores menores de
centrifugação (5.000 a 15.000 x g)
• Permite processamento continuo
de 200 m3/h
• Discos aumentam a área de
sedimentação e reduzem o tempo
necessário para centrifugação
https://www.youtube.com/watch?v=dxTT_bP6IwI
Centrífuga de rolo (decanter)
https://www.youtube.com/watch?v=FhS5vN4r5LA
https://www.youtube.com/watch?v=w1E452YD1zw
https://www.youtube.com/watch?v=jGwBpGELngk
Fatores de aceleração das centrífugas mais comuns
Ultracentrífugas
Centrífugas tubulares
Centrífugas de câmara
Centrífugas de disco
Centrífugas de rolo
105 – 106 x g
13000 – 17000 x g
6000 - 11000 x g
5000 - 15000 x g
1500 – 4500 x g
Critério para ampliação: Fator de aceleração . tempo ==> . t
Se uma separação satisfatória é atingida com 3000xg
durante 5 minutos, o mesmo resultado pode ser
alcançado com 1500xg e 10 minutos, em escala industrial.
Obs.: Ultracentrífugas operam descontinuamente
normalmente têm baixa capacidade de processamento
e
O fluxo volumétrico de alimentação para uma
centrífuga pode ser determinado pela expressão:
Q = d2 . . g. . A
18 
Onde:
Q é o fluxo volumétrico de alimentação
 é a diferença de densidade (dens. Sólido – dens. do líquido)
g é a aceleração da gravidade
d é o diâmetro da partícula
 é o fator de aceleração
A é o equivalente de área do rotor
 é a viscosidade dinâmica do líquido
Cálculo de “g”:
N2 . R
g=
89500
Onde:
N é a velocidade ou frequência de rotação do eixo (rpm)
R é o raio da circunferência (cm)
Raio: distância entre o centro do eixo e o fundo do tubo ou
da câmara de sedimentação
Exemplo de aplicação para centrífuga
Uma determinada indústria apresenta uma produção de meio
fermentado igual a 180 m3/dia. (a) Considerando as características do
meio e da centrífuga a ser empregada, quantas unidades deste
equipamento você solicitaria ao departamento de compras da empresa,
de modo a garantir a separação das células do meio de fermentação,
sem risco de parar a produção? (b) Considere, agora, que foi estabelecido que serão compradas 8 centrífugas com equivalente de área igual
a 0,10 m2. Qual deve ser o fator de aceleração destas centrífugas?
Dados: Densidade do sólido = 1000 kg/m3
Densidade do líquido = 900 kg/m3
Viscosidade do líquido = 10-2 kg/m.s
Diâmetro da partícula = 0,01 mm
Fator de aceleração = 8000
Equivalente de área = 0,10 m2
Q = d2 .  . g .  . A
18 . 