REPLICAÇÃO DO
DNA EM
PROCARIOTOS E
EUCARIOTOS
1
O CICLO CELULAR E A
REPLICAÇÃO DO DNA EM
EUCARIOTOS
¾ Como acontece em procariotos?
CARACTERÍSTICAS UNIVERSAIS DO
MECANISMO DE REPLICAÇÃO DE DNA:
¾ SEMI-CONSERVATIVO
¾ BIDIRECIONAL
¾ SEMI-DESCONTÍNUO
2
MESELSON-STAHL (1958)
Modelo de replicação semi-conservativo
DEMONSTRAÇÃO DA
BIDIRECIONALIDADE DO
PROCESSO DE REPLICAÇÃO DO
DNA A PARTIR DA ORIGEM DO
SV40
3
A BOLHA E AS FORQUILHAS DE
REPLICAÇÃO DO DNA
PROCARIOTOS
EUCARIOTOS
Genoma pequeno e circular
Genoma grande e linear
Única origem de replicação
Múltiplas origem de replicação
biderecional
biderecional
Como são classificadas as enzimas
envolvidas na síntese de DNA,
chamadas “DNA-polimerases”?
4
TIPOS DE DNA POLIMERASES E SUAS RESPECTIVAS FUNÇÕES
DNA POLIMERASE DNA-DEPENDENTE
Envolvida em replicação, reparo e recombinação do DNA. Catalisa a adição de um desoxiribonucleotídeo ao terminal 3´ de uma cadeia preexistente, utilizando uma cadeia de DNA
complementar como molde . Portanto, depende de uma fita molde e de um primer.
DNA POLIMERASE RNA-DEPENDENTE
Transcriptase reversa
Envolvida na replicação de retrovírus. Descoberta por Temein e Baltimore, em 1970. Não apresenta
atividade exonuclease 3´-5´. Além da atividade DNA polimerase RNA dependente, apresenta também
as atividades RNAse H e DNA polimerase DNA-dependente. Catalisa a adição de desoxiribonucleotídeos ao terminal 3´ de uma cadeia de DNA preexistente, utilizando uma cadeia de RNA
complementar como molde e um primer exógeno específico. Num estágio seguinte, a fita híbrida DNA
DNARNA é convertida em DNA-DNA, por ação das atividades RNAse H e DNA polimerase DNAdependente. Portanto, depende de uma fita molde e de um primer.
Telomerase
Envolvida na manutenção do tamanho dos telômeros. Catalisa a adição de um desoxi-ribonucleotídeo
ao terminal 3´ de uma cadeia pré existente, utilizando uma seqüência de RNA complementar interna
(grupo prostético) como molde. Portanto, depende apenas de uma fita molde de DNA. Enzima
encontrada em células germinativas de eucariotos.
PIADA DE BIOLOGISTA MOLECULAR
5
CARACTERÍSTICAS DAS DNA POLIMERASES (parte 1)
1. Não são capazes de iniciar
síntese de novo. Precisam de
3’ OH livre fornecido pelo
iniciador (primer)
2. Necessidades de íons de Mg2+
3. Acrescentam nucleotídeos à
fita recém sintetizada
obedecendo
obedece
do o pa
pareamento
ea e to de
bases com a fita molde.
CARACTERÍSTICAS DAS DNA-POLIMERASES (parte 2)
4. Remoção de nucleotídeos:
atividade exonuclease (5’→ 3’) replicação, reparo de mutações
atividade exonuclease ((3’→ 5’)) revisão
5’
E i
Enzima
fi
fiell com
frequência de erro de
~ 10-5 a 10-6
3’
6
ATIVIDADES DA DNA POLIMERASE
EXONUCLEASE 3’ – 5’
POLIMERASE 5’ – 3’
Figure 5-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
REAÇÃO CATALISADA PELA DNA POLIMERASE
PIROPHOSPHATASE
Figure 5-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
7
A REPLICAÇÃO DO DNA
EM PROCARIOTOS
8
ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM
PROCARIOTOS:
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ TÉRMINO
O SITIO DE INICIO DE REPLICAÇÃO DO DNA, DENOMINADO
“ORIGEM DE REPLICAÇÃO” (ori-C).
(APRESENTA SEQUENCIAS CONSENSO ESPECÍFICAS)
9
FORMAÇÃO DO COMPLEXO DE INICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO
10
DESNATURAÇÃO DO DNA E
SÍNTESE DE UMA SEQUÊNCIA INICIADORA DE RNA
ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM
PROCARIOTOS:
PROCARIOTOS
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ TÉRMINO
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FORQUILHAS DE REPLICAÇÃO:
3`
¾ FITA CONTÍNUA
¾ FITA DESCONTÍNUA
5`
3`
3`
5`
3`
5`
5`
5’
3’
3`
3`
3`
3`
ASSOCIAÇÃO DO DNA COM A
DNA POLIMERASE III
(gama-loader)
(Beta-clamp)
12
O DÍMERO DE DNA POLIMERASE III NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
A REPLICAÇÃO SIMULTÂNEA DAS DUAS FITAS DE
DNA PELO DÍMERO DE DNA POLIMERASE III
13
PAPEL DAS “SSDNA-BINDING-PROTEINS”
Figure 5-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
SÍNTESE
Í
DESCONTÍNUA
Í
DA
FITA ATRASADA DE DNA:
¾ papel da DNA-POL I
¾ papel da DNA LIGASE
Figure 5-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
14
FORMAÇÃO DO
“SUPERCOILING” POSITIVO
NA FORQUILHA DE
Ç
REPLICAÇÃO
Figure 5-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Super-helicoidização
Super-helicoidização induzida por abertura
15
Figure 5-19a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM
PROCARIOTOS:
PROCARIOTOS
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ TÉRMINO
16
SEQUÊNCIAS TERMINADORAS DA REPLICAÇÃO DO DNA
RESOLUÇÃO DOS
CONCATÂMEROS DE
DNA
17
A REPLICAÇÃO DO DNA
EM EUCARIOTOS
EUKARYOTIC DNA POLYMERASES: PROPOSAL FOR A REVISED NOMENCLATURE. Peter M.
J. Burgers et.al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, No. 47, Issue of November 23, pp. 43487–43490, 2001.
GREEK
NAME
HUGO
NAME
CLASS
α (alpha)
POLA
B
β (beta)
POLB
X
γ (g
(gamma))
POLG
A
δ (delta)
POLD1
B
ε (epsilon)
POLE
B
ζ (zeta)
POLZ
B
η (eta)
POLH
Y
θ (theta)
POLQ
A
ι (iota)
POLI
Y
κ (kappa)
POLK
Y
λ (lambda)
POLL
X
μ (mu)
POLM
X
ς (sigma)
POLS
X
REV1L
Y
TDT
X
PROPOSED
MAIN
FUNCTION
DNA
POL1
replication
Base
excision
repair
Mitochondri
MIP1
al
replication
DNA
POL3
replication
DNA
POL2
replication
Bypass
REV3
synthesis
Bypass
RAD30, XPV
synthesis
OTHER
NAMES
mus308, eta
DNA repair
Bypass
synthesis
Bypass
synthesis
Base
POL4, beta2
excision
repair
Nonhomologous
end joining
Sister
TRF4, kappa chromatid
cohesion
Bypass
REV1
synthesis
Antigen
receptor
diversity
RAD30B
DinB1, theta
18
ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM
EUCARIOTOS:
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ TÉRMINO
ORIGENS (19) DE REPLICAÇÃO NO CROMOSSOMO III DE
LEVEDURA
UMA ORIGEM DE REPLICAÇÃO DE LEVEDURA
ORC – origin recognition complex
Abf1 – proteina que facilita a ligação de ORC
19
MECANISMO DE INÍCIO DA
REPLICAÇÃO DO DNA EM
EUCARIOTOS:
Única utilização de uma
origem de replicação por ciclo
celular
Cdc6 e Cdt1 - Helicase loading proteins
Figure 5-36 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
ETAPAS DA REPLICAÇÃO DO DNA EM
EUCARIOTOS:
EUCARIOTOS
¾ INÍCIO
¾ ALONGAMENTO
¾ TÉRMINO
20
REPLICAÇÃO DO DNA DE SV40: papel de FEN 1
REPLICAÇÃO DO DNA DE SV40
21
The Nobel Prize in Physiology or
Medicine 2009
"for the discovery of how chromosomes are protected by
telomeres and the enzyme
y
telomerase"
Elizabeth H. Blackburn
Carol W. Greider
Jack W. Szostak
REPLICAÇÃO DO TELÔMERO PELA TELOMERASE
Figure 5-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
22