Testes utilizados em
Imunologia Clínica –
Testes de Reagentes Marcados
Profa Alessandra Xavier Pardini
Imunologia Clínica
Alta sensibilidade
Boa especificidade
Direta – detecção de Ag
Indireta – detecção de Ac
Competição – amostra compete com reagente marcado
Custo mais alto – produção dos reagentes
Permitem automação completa ou não
Permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos
para um determinado Ag
Reagente marcado – Ag ou Ac
Sistema heterogêneo – lavagem – retira reagente não ligado
Reagente marcado
- Marcação não modifica interação Ag-Ac
- Alto custo
- Permite detecção de classes específicas de Ac para um determinado
Ag
- Tipo de marcador determina nome do teste
MARCADOR
Radioisótopo = RADIOIMUNOENSAIO
Fluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIA
Enzima = ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT
Radioimunoensaio
- Primeira técnica com reagente marcado
-desenvolvido em 1956 – detecção de Ac anti-insulina em pacientes
tratados com o hormônio
- radioisótopos - I125 ou I131 – ligação a resíduos de tirosina em
proteínas
- vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em
nano ou picogramas
- desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e
risco operacional – radiosótopos
- Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios
Princípio
quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não
marcado presente na amostra através de ligação específica
medida da resposta - contagem radioativa - tipo de radiação emitida
- radiações  e  - contador de cintilação
- radiação  - contador gama de cristal sólido
Realizado em 3 estágios
Estágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão
Estágio 2 – interpolação dos resultados
Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida)
interferente: fração não ligada
Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar sistema
com fase sólida
- Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou superfície
contínua (tubos, discos e placas)
Ac +
traçador +
Ag da
amostra
PEG
carbono
Tipos de Radioimunoensaio
Contador de radiação gama
cintiladores
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Princípio:
Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se
ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua
reatividade específica com o antígeno.
Fluorocromos
- São substâncias que, absorvem luz de um comprimento de onda
menor quando excitados com luz UV, emitem luz em
comprimento de onda maior (fluorescência).
- Características: estabilidade, grande capacidade de absorção,
absorção e fluorescência de luz no espectro visível, nenhuma
interferência com a reação imunológica.
Ac + fluorocromos - reatividade específica com o Ag
Fluoresceína FTIC
Texas Red
R-ficoeritrina
Excitação (nm) Emissão (nm)
495
524
595
620
565
574
- desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada,
dificuldade de automação
- vantagens: específica e reprodutível
- tipos – direta, indireta e citometria de fluxo
Cuidados:
- padronização adequada do conjugado fluorescente (titulação)
- treinamento do pessoal que realizará a leitura, sendo subjetiva,
deve ser padronizada para evitar erros que super ou
subestimem a fluorescência
Reagentes necessários
Ac marcados – alta especificidade – poli ou monoclonais
Ag ou amostras fixas em lâmina de vidro
Glicerina alcalina – pH 8,5 – montagem da com lamínulas –
melhoram a intensidade da emissão de fluorescência
Azul de Evans ou vermelho Congo – corantes de fundo – melhoram
a visualização da fluorescência
Lâmina de sílica não fluorescente e de espessura mínima
São fatores que interferem na imunofluorescência:
- a qualidade do vidro/lâmina/lamínula
- qualidade e tratamento dos Ag fixados antigenicidade e
acessibilidade
- temperaturas e tempo de incubação
- lavagens adequadas
- montagem da preparação em glicerina alcalina
- microscópio perfeitamente calibrado e limpo
- corantes: diminuem a coloração de fundo, facilitando a
leitura da fluorescência (azul de Evans)
Microscópio
- fonte de luz de alta intensidade
- lâmpada de mercúrio ou halogênio
- filtros de excitação (ativam a fluorescência)
- filtros de barreira (remover interferentes)
- microscópios de transiluminação
- microscópios de epiiluiminação (apresentam a vantagem de
combinar a luz transmitida para exame de contraste de fase,
análise da amostra em diferentes comprimentos de onda, no
caso de utilização de mais de um fluorocromo) (a luz UV não
tem chance de atravessar a ocular)
Microscópio de imunofluorescência com epiluminação
câmera
Fonte de luz
branca
Fluorescência
emitida
Filtro de
emissão
Filtro de excitação
Fibra óptica
lâmina
Fibra
óptica
Microscópio de imunofluorescência automatizado
Reação de Imunofluorescência
Reação de Imunofluorescência direta
Reação de Imunofluorescência indireta
Reação de Imunofluorescência de captura
Reação de Imunofluorescência amplificada com complemento
Reação de Imunofluorescência amplificada com sistema avidinabiotina
Imunofluorescência direta
Conjugado - Ac marcado com fluorocromo
Vantagens: alta sensibilidade e especificidade, possibilidade de localizar
componentes intracelulares com fluorocromos contrastantes
Desvantagens: um conjugado para cada Ag
Uso: imunohistoquímica – doenças renais e de pele
Conjugado
fluorescente
célula
Adenocarcinoma de glândula salivar humana
diiodeto de
propídio
ITCF
http://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/adenocarcinomahumansmall.html
Linfócitos infectados com HIV
ITCF
http://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/hivinfectedcellssmall.html
Imunofluorescência indireta
- Conjugado Ac antiimunoglobulina específico – classes
- Diluições seriadas – título de Ac – máxima diluição onde há
fluorescência
- Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada,
mesmo conjugado determina Ac produzidos em diferentes
doenças
- Desvantagens: custo do microscópio, subjetividade na leitura e
dificuldade de automação
Uso: detecção de Ac para Treponema pallidum (FTA-ABS),
Toxoplasma gondii, vírus da rubéola, citomegalovírus, vírus
herpes simples, Trypanosoma cruzi, Plasmodium
falciparum, auto-anticorpos.
Anticorpo
primário
Conjugado
fluoresncente
Citosol
Anticorpo
Reação primária
Antígeno
lavagem
Conjugado Anticorpo FITC
Reação secundária
lavagem
Microscópio de fluorescência
Fluorescência indireta para Sífilis
Fluorescência indireta para Chagas
Fluorescência indireta para HIV
Autoimune
anti-Células Epiteliais
CMV
Citometria de fluxo
Princípio:
análise individual e simultânea de componentes celulares através da
medição do desvio de luz incidente sobre uma célula e de sinais
fluorescentes emitidos pela mesma
Vantagens: permite detecção do tamanho relativo da célula, sua
granulação e de 2 a 7 emissões fluorescentes diferentes em milhares
de células por segundo
Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamento
Vários fluorocromos
Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes
infectados pelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias
Suspensão
de mistura
de células
Conjugado
fluorescente
Feixe de laser
Detector
Defletor
Células nãofluorescentes
Células
fluorescentes
Espalhamento de luz incidente pode ser de 2 tipos:
- baixo ângulo de dispersão – tamanho das células
- ângulo de dispersão de 90o – granulação das células
Fluorescência emitida por cada fluorocromo é detectada por
fotodetectores e convertida em sinais processados, quantificados
e analisados por um computador
Sinais de luz emitidos pelos fluorocromos são detectadas por um
sistema de canais, originado histogramas
Técnicas imunoenzimáticas
- Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugado
ENZIMA
- elevada especificidade
- fácil de ser obtida na forma purificada
- conjugação a Ag e Ac – sem interferências
- produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado,
mesmo com pequenas quantidades de enzima
- estável
- custo acessível
- vários tipos – fosfatase alcalina, peroxidase
- determina o tipo de substrato
SUBSTRATO CROMOGÊNICO
- ao serem consumidos por enzimas geram produtos coloridos
solúveis ou insolúveis
- quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual ou
comparação com padrão
- depende do tipo da enzima utilizada
Substrato
Produto
colorido
solúvel ou
insolúvel
PEROXIDASE
- substrato H2O2 ligado a um cromógeno
- cromógeno com produto solúvel - OPD ou TMB
- cromógeno com produto insolúvel - DAB ou 4-cloro-1-naftol
FOSFATASE ALCALINA
- cromógeno com produto solúvel - NPP
- cromógeno com produto insolúvel – BCIP ou NBT
enzima
Peroxidase
Fosfatase
alcalina
substrato
cromógeno
cor
nm
H2O2
OPD, TMB
DAB, 4CN
laranja, azul
marrom, violeta
492
P-NFF
5-B-4-C-3-IF
amarelo
lilás
450
SUBSTRATO FLUORIGÊNICOS
- emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima
- quantificação da luz emitida pelo produto - fluorômetro
FOSFATASE ALCALINA
- 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4metilumbeliferona)
 excitação
Emissão
Fluorescência
SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE
- amplificação de sinal hormônios e marcadores tumorais
- emitem brilho após serem consumidos pela enzima
- quantificação do brilho emitido pelo produto - luminômetro
FOSFATASE ALCALINA
- adamantildioexietano-fosfato que gera um ânion
(adamantildioexietano)
luminol
brilho
Ensaio heterogêneo
- etapa de lavagem – retira reagente marcado não ligado a fase
sólida
FASE SÓLIDA
- conhecido como suporte
- tubos, microplacas, micropartículas ou tiras
- partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno
- micropartículas – lavagem – decantação, centrifugação, adsorção
em fibra de vidro ou captura
- tipos: ELISA, dot – ELISA, IMUNNOBLOT
Immuno-Dot
Variação do ELISA conhecida como Dot-ELISA
fase sólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ou náilon
substrato cromógeno – forma produto estável e insolúvel –
mancha (dot)
pode-se usar conjugado radiativo – detecção por auto-radiografia
Vantagens: pequeno volume de amostra, teste rápido, com
sensibilidade e especificidade boas
Uso: emergência com suspeita de HIV e estudos epidemiológicos
Fracione o pente de acordo
com o número de amostras
Colocar o pente na
fileira B e incubar
Colocar as amostras e os
controles nos pocinhos da
fileira A
Incubar nas fileiras C, D e E.
Reação com substrato na fileira F
Colocar o pente na
fileira A e incubar
segundo as instruções
Ler os resultados e
comparar com o padrão
ELISA
- capaz de detectar < [ ] Ag e Ac
reagente ligado a uma enzima
imobilização em fase sólida placa de ploiestireno
Vantagens: > sensibilidade e especificidade, rapidez, baixo custo e
adaptação a diferentes graus de automação
tipos: direta, indireta, de captura e de competição
Uso: detecção de Ac para diversas doenças e Ag como partículas
virais, hormônios, proteínas tumorais e interleucinas
Determinação de Ag
ELISA direto de captura
ELISA direto de competição
Determinação de Ac
ELISA indireto
ELISA indireto de captura
ELISA indireto de competição
ELISA direto de captura
Incubação
Incubação
Adição do
substrato,
revelação e
leitura
Ag na
amostra
Ac fixado
na placa
Lavagem
Conjugado Ac marcado
conhecido como sanduíche
Após a adição de um reagente, realiza-se etapa de lavagem para
retira reagente não ligado
Vantagens:
Desvantagens:
Uso:
ELISA direto de competição
Vantagens
Desvantagens
Uso
ELISA indireto
Vantagens: único conjugado para vários sistemas
Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag
que sensibilizou a placa
Resultado
visual (qualitativo)
densidade óptica (DO)
(quantificação / espectrofotômetro)
Limiar de reatividade (“cut-off”)
Titulação (diluição em série)
Absorbância
Unidade padrão (absorbância transformada em unidade)
ELISA indireto de captura
Vantagens: único conjugado para vários sistemas
Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag
que sensibilizou a placa
ELISA indireto de competição
Vantagens: único conjugado para vários sistemas
Uso: detecção de Ac de classes determinadas de acordo com Ag que
sensibilizou a placa
Lavadora de microplacas
Leitora de microplacas
acoplada a
computador
Western Blotting
identificação de proteínas reconhecidas por Ac
separação das proteínas - PM - eletroforese em gel de
poliacrilamida
transferência eletroforética - nitrocelulose
incubação com amostras - presença de Ac específicos - complexo
formado – conjugado
Visualização = cromógeno - precipitado colorido
- teste confirmatório
Etapas
 preparação do gel (concentração poliacrilamida/gradiente)
 SDS (detergente aniônico/confere carga negativa)
 migração: pólo -  pólo +
 preparo da amostra (solubilização das proteínas)
 tampão corrida
 voltagem/amperagem
 transferência (semi-seco; “over-night”)
 membrana (nitrocelulose; PVDF)
Emprego: pesquisa de Ag ou Ac  diagnóstico
qual proteína está sendo reconhecida  diferentes
perfis  fase da doença