UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE-UNIVALE
FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – FACS
Ludimila Sampaio Cupertino Passos
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE E PERFIL CROMATOGRÁFICO DE EXTRATOS DO
FALSO JABORANDI (Piper aduncum)
Governador Valadares
2010
LUDIMILA SAMPAIO CUPERTINO PASSOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE E PERFIL CROMATOGRÁFICO DE EXTRATOS DO
FALSO JABORANDI (Piper aduncum)
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas da
Faculdade de Ciências da Saúde da
Univale, para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas. Área de
Concentração: Imunopatologia das doenças
infecciosas e parasitárias.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Loreto Peres
Co-orientador: Prof. Dr. Christian Fernandes
Governador Valadares
2010
Ao meu querido esposo Júnior.
À minha princesa Maria Júlia.
À minha família: Adalton, Iolanda, Bruno, Regina,
Gustavo, Bárbara,
Tia Alda, Tio Maninho, Tia Devany, Nathália,Livia.
AGRADECIMENTOS
A DEUS que me guiou nos caminhos dando força e persistência para alcançar meu
objetivo.
Ao meu orientador Prof. Dr. Rodrigo Loreto Peres pelo apoio, incentivo e
conhecimentos os quais foram muito importantes para a realização desse trabalho.
À Profª Drª Alda Maria Soares Oliveira pela implantação do Mestrado na UNIVALE,
pela confiança, incentivo, amizade e “boa conversa” sempre que nos encontramos.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Christian Fernandes por sua importante participação
na finalização de trabalho.
Ao Senhor Ezequias Pessoa Siqueira Filho, da Fundacão Oswaldo Cruz que
gentilmente se dispôs a colaborar com a construção deste trabalho.
Aos alunos de iniciação científica do laboratório de química da UNIVALE,
principalmente à: Cícero, Hemerson Garcia de Oliveira Silva e Paulo cuja ajuda foi
imprescindível na realização da parte experimental do trabalho.
À Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais, FAPEMIG, pelo suporte
financeiro.
Aos alunos do curso de mestrado pela amizade e boa convivência durante o período
de aulas do curso.
MUITO OBRIGADA!!
RESUMO
Desde a antiguidade o homem busca a cura de suas doenças através do uso de
plantas medicinais, na forma de chás, extratos, infusões, dentre outros. A cada dia
aumenta o interesse por medicamentos fitoterápicos, devido à ação terapêutica que
estes têm demonstrado, semelhante àquela dos medicamentos alopáticos sintéticos.
A espécie Piper aduncum, também conhecida como falso jaborandi ou pimenta de
macaco é nativa da Amazônia e pertence à família Piperaceae. Seu óleo essencial
possui atividade fungicida, moluscida, acaricida, bactericida e larvicida já
comprovados na literatura. No entanto, a sua atividade antiinflamatória ainda não
está bem caracterizada. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial
antioxidante, bem como a atividade antiinflamatória in vitro do Piper aduncum.
Foram utilizadas três técnicas diferentes para obtenção de extrato etanólico:
maceração, banho de ultrassom e decocção. A partir dos extratos secos foi feita a
identificação dos metabólitos secundários utilizando-se microextração em fase sólida
e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. A atividade
antioxidante foi avaliada por meio da reação com DPPH e monitoramento da
absorvância por espectrofotometria UV-Visível em 517 nm. A capacidade do extrato
da planta de se ligar ou inibir a liberação de NO (composto químico indicador de um
processo inflamatório), fornecido a partir de uma solução aquosa de nitroprussiato,
foi avaliada por espectrofotometria. A avaliação da atividade sequestrante de
radicais livres mostrou que existe uma relação dose versus resposta, sendo que
todos os extratos produziram uma redução de 90% dos níveis de DPPH em solução
na concentração de 15 mg/ml, equivalente ao BHT, um antioxidante sintético padrão.
Na avaliação da atividade inibitória da liberação de NO no meio, via nitroprussiato,
todos os extratos causaram inibição de 99%, tomando como base a decomposição
total do nitroprussiato. Os resultados obtidos indicam que os extratos etanólicos da
espécie Piper aduncum, empregados neste estudo, apresentam atividades
antirradicalar e antiinflamatória in vitro.
Palavras-chave: Piper aduncum. DPPH. Atividade antiinflamatória. Cromatografia
gasosa.
ABSTRACT
Since ancient times, the mankind has sought for the cure of its diseases through the
use of medicinal plants in the form of teas, extracts, infusions, among others. Day
after day, a concern increases over polyherbal formulations, due to the therapeutic
action that is similar to the synthetic allopathic medicines. Piper aduncum, also
known as falso jaborandi or pimenta de macaco is native of Amazon and belongs to
the Piperaceae family. Its essential oil has fungicidal, molluscicide, acaricide,
bactericide and larvicidal properties, already described in the literature. However, its
anti-inflammatory activity is not well established. Thus, the purpose of this study was
to asses the antioxidant potential and/or antiradical and in vitro anti-inflammatory
activity of Piper aduncum. Three different techniques for obtaining ethanol extract
were used: maceration, decoction and ultrasonic bath. From the dried extracts the
identification
of
secondary
metabolites
was
performed
using
solid
phase
microextraction and gas chromatography coupled to mass spectrometry. The
antiradical activity was evaluated through reaction with DPPH and monitoring the
absorbance by UV-Visible spectrophotometry at 517 nm. The ability of the extract to
bind or inhibit NO (a chemical indicator of inflammation) release, supplied from an
aqueous solution of nitroprusside, was evaluated by spectrophotometry. The
evaluation of radical scavenging activity showed that there was a dose versus
response relationship, and all extracts produced a 90% reduction in the levels of
DPPH solution at a concentration of 15 mg/ml, equivalent to BHT, a standard
synthetic antioxidant. All extracts caused inhibition of 99% (based on the total
decomposition of nitroprusside) when the inhibitory activity of NO release was
evaluated. The results indicate that ethanol extracts of Piper aduncum, used in this
study, have in vitro antiradical and anti-inflammatory properties.
Key words: Piper aduncum. DPPH. Anti-inflammatory activity. Gas chromatography.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos
secundários em plantas................................................................
19
Figura 2 - Ciclo biossintético............................................................................
20
Figura3 – Formação de.terpenos....................................................................
21
Figura 4 Perfil espectrofotométrico do DPPH radical e DPPH inativado...
23
Figura 5 - Estrutura química do TROLOX ......................................................
24
Figura 6 - Estrutura química do BHA...............................................................
24
Figura 7 - Estrutura química do BHT...............................................................
25
Figura 8 - Processo inflamatório .....................................................................
30
Figura 9 - .. Foto da planta adulta Piper aduncum..........................................
31
Figura 10 - Procedimentos gerais para obtenção de compostos biologicamente 34
ativos .......................................................................................................................
Figura 11 - Espectrofotômetro de varredura UV-Visível Femto modelo 800 XI
utilizado neste estudo..................................................................................
42
Figura 12 - Dispositivo da fibra de SPME: (A) posição com a fibra retraída na
agulha, (B) posição com a fibra exposta. No detalhe são mostradas as dimensões
43
típicas da região com recobrimento de 100 µm............................
Figura 13 - Processos de extração e dessorção em uma análise por
SPME...............................................................................................................
44
Figura 14 - Representação esquemática dos diferentes tipos
cromatografia...................................................................................................
Figura 15 - Esquema de um cromatógrafo a gás típico...................................
de
45
47
Figura 16 - Esquema dos principais componentes de um espectrômetro de
massas.............................................................................................................
49
Figura 17 - Cromatograma do extrato etanólico de Piper aduncum, obtido com a
técnica de banho de ultrassom.............................................................
61
Figura 18- Estrutura química do linalool..........................................................
62
Figura 19 - Cromatograma do extrato etanólico de Piper aduncum, obtido com a
técnica de decocção..............................................................................
64
Figura 20 - Cromatograma do extrato etanólico de Piper aduncum, obtido com a
técnica de maceração.................................................................................................. 66
Figura 21 - Atividade antioxidante do BHT,BHA, Trolox
frente ao
DPPH............................................................................................................................. 69
Figura 22 – Atividade antioxidante do Piper aduncum obtido com as diferentes
técnicas de extração e em diferentes concentrações................................................... 70
Figura 23 -.. Curva de calibração do nitrito...................................................................
71
Figura 24- Porcentagem de nitrito inibido na presença do extrato etanólico de
Piper aduncum......................................................................................................
73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Fontes endógenas e exógenas de geração de radicais livres........ 27
Tabela 2 - Os agentes de defesa antioxidantes............................................... 28
Tabela 3 - Solventes e os seus respectivos metabólitos secundários
extraídos.......................................................................................................... 38
Tabela 4 - Sensibilidade e seletividade dos detectores mais comumente
empregados em cromatografia gasosa............................................................ 48
Tabela 5 - Compostos encontrados no extrato etanólico de folhas do Piper
aduncum em diferentes métodos de extração................................................. 60
Tabela 6 - Metabólitos secundários identificados no extrato etanólico de P.
aduncum obtido através da técnica de banho de ultrassom............................ 61
Tabela 7 - Metabólitos secundários identificados no extrato etanólico de P.
aduncum obtido com a técnica de decocção................................................... 64
Tabela 8 - Metabólitos secundários identificados no extrato etanólico de
Piper aduncun obtido com a técnica de maceração........................................ 65
Tabela 9 – Atividade antioxidante do BHT, BHA e Trolox frente ao
69
DPPH....................................................................................................
Tabela 10 - Atividade antioxidante do P. aduncum em diferentes
concentrações, para as diferentes técnicas de extração................................. 70
Tabela11–Curva de calibracão do nitrito.........................................................
71
Tabela 12: Porcentagem de NO inibido na presença do extrato etanólico
de Piper aduncum.............................................................................................. 72
LISTA DE ABREVIATURAS
A – Absorbância
b – Caminho Óptico
c – Concentração da Espécie Absorvente
ε – Absortividade Molar
EM – Espectrometria de Massas
g – Grama
I – Intensidade da Radiação que Emerge da Amostra
Io – Intensidade da Radiação Monocromática que Incide na Amostra
K – Constante Característica do Soluto
Khz – Quilohertz
Mhz – Megahertz
Kg – Quilograma
Log – Logarítmo
M – Molaridade
m – Massa
mg – Miligramas
min – Minutos
ml – Mililitros
NaOH – Hidróxido De Sódio
nm – Nanômetros
µl – Microlitro
pH – Potencial Hidrogeniônico
Rf – Índice De Retenção
T – Transmitância
US – Ultrassom
UV – Ultravioleta
V – Volume
var – Variedade
VIS – Visível
λ – Comprimento De Onda
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 13
2 JUSTIFICATIVA...........................................................................................
15
3 OBJETIVOS.................................................................................................. 16
3.1 GERAIS...................................................................................................... 16
3.2 ESPECÍFICOS...........................................................................................
16
4 REVISÃO DA LITERATURA........................................................................ 17
4.1 FITOQUÍMICA............................................................................................ 17
4.2 METABÓLITOS DE ORIGEM VEGETAL..................................................
18
4.3 PLANTAS MEDICINAIS E ANTIOXIDANTE.............................................
21
4.3.1 Antioxidantes Sintéticos....................................................................
22
4.3.2 DPPH.....................................................................................................
22
4.3.3TROLOX.................................................................................................
23
4.3.4 BHT e BHA...........................................................................................
24
4.4.PROCESSO INFLAMATÓRIO..................................................................
25
4.4.1 Causas da Inflamação..........................................................................
26
4.4.2 Sinais Cardiais da inflamação ...........................................................
26
4.4.3 Formação de Radicais Livres .............................................................
26
4.4.4 Estresse Oxidativo................................................................................ 28
4.4.5. Radicais livres e o Processo Inflamatório...................................
29
4.5 FALSO JABORANDI (PIPER ADUNCUM).....................................
31
4.6.PREPARO DE MATERIAL VEGETAL..............................................
33
4.6.1 Critérios experimentais.....................................................................
33
4.6.2. Coleta................................................................................................
35
4.6.3 Conservação do material vegetal........................................................
36
4.6.4 Secagem e moagem.............................................................................. 36
4.6.5 Preparo do extrato................................................................................
37
4.6.6 Métodos de extração............................................................................
38
4.6.6.1 Métodos a frio: maceração e banho de ultrassom...............................
38
4.6.6.2 Método a quente: decocção................................................................. 39
4.7 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃÇO NA REGIÃO DO
ULTRAVIOLETA–VISÍVEL............................................................................... 40
4.8 PREPARO DE AMOSTRA - MICRO EXTRAÇÃÇO EM FASE SÓLIDA
(SPME)............................................................................................................. 42
4.9 CROMATOGRAFIA...................................................................................
44
4.9.1 Cromatografia gasosa..........................................................................
45
4.9.1.1 Equipamento........................................................................................
46
5 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 51
5.1 REAGENTES.............................................................................................
51
5.2 EQUIPAMENTOS......................................................................................
51
5.3 COLETA..................................................................................................... 52
5.4 SECAGEM E MOAGEM............................................................................
52
5.5 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO......................................................................
56
5.5.1 Monitoramento da saturação do solvente...........................................
53
5.5.2 Método a frio: maceração e banho de ultrasson..........................
54
5.5.3 Método a quente:decocção.................................................................
55
5.5.4. Condições cromatográficas de análise do extrato de Piper 55
aduncum.........................................................................................................
5.5.4.1 Preparo de amostras por micro extração em fase sólida (SPME).
55
5.5.4.2 Cromatografia gasosa e espectrofotometria de massas.....................
55
5.5.4.3 Análise dos dados brutos, utilizando o software AMDIS (Automated
Mass Spectral Deconvolution and Identification System)................................ 56
5.6 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIRRADICALAR E/OU ANTIOXIDANTE ...
56
5.6.1 Ensaios com radical livre estável 2-2 difenil-1- picrilhidrazil
(DPPH)............................................................................................................. 57
5.6.2 Ensaios com padrão antioxidante sintético TROLOX, BHA e BHT.. 57
5.7 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA......................................
57
5.7.1 Dosagem de óxido nítrico....................................................................
57
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES.................................................................
59
6.1 EXTRAÇÃO E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA........................................
59
6.1.1 Extrato etanólico obtido com banho de ultrassom...........................
60
6.1.2 Extrato etanólico obtido com em decocção....................................... 63
6.1.3 Extrato etanólico obtido com em maceração..................................... 65
6.2 ATIVIDADE SEQUESTRANTE DE RADICAIS LIVRES............................
66
6.3 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA......................................
70
6.3.1 Dosagem de óxido nítrico....................................................................
70
7 CONCLUSÃO...............................................................................................
74
8 PERSPECTIVAS PARA CONTINUIDAE DO TRABALHO.......................... 76
9 REFERÊNCIAS............................................................................................
77
13
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais e seus derivados têm sido, tradicionalmente, usados
em várias civilizações para o alívio de doenças, por mais de cinco milênios. O
estudo de plantas medicinais tem demonstrado ser de grande importância para o
desenvolvimento de novos fármacos utilizados na medicina moderna (CALIXTO,
2005 apud PISSINATE, 2006).
Assim, é comum encontrar pinturas rupestres de homens das cavernas
lambendo suas feridas, ou bebendo muita água e ficando nas proximidades de
fogueiras quando se tinha febre (LUENGO 2005).
Desde a antiguidade o homem procura encontrar meios para aliviar a dor, a
febre e outros distúrbios similares. Com a descoberta dos mecanismos da
fisiopatologia das doenças inflamatórias, abriu-se uma janela para a investigação de
substâncias medicamentosas que pudessem interromper o circuito desta sinalização
(LUENGO, 2005).
A inflamação tem uma história antiga e rica intimamente relacionada com
histórias das guerras, feridas e infecções. Trata-se de um mecanismo de defesa
natural do organismo a qualquer agressão eventualmente sofrida. Sua intensidade
mostra-se diretamente proporcional ao tamanho do trauma sofrido. A resposta
inflamatória costuma ser dividida em três fases: a inflamação aguda, a resposta
imune e a inflamação crônica (KATSUNG, 1998).
O uso de plantas medicinais no mundo, e especialmente na América do Sul,
contribui significativamente para os cuidados primários da saúde (CARDOSO, 1999).
Estudos para caracterização química, bioquímicos, farmacológicos e etnobotânicos
têm sido realizados com o objetivo de identificar os compostos químicos presentes
em várias espécies de plantas. O controle de doenças existentes em animais e
vegetais, com o uso de extratos de plantas medicinais, tem sido um desafio no Brasil
e no mundo. Os extratos de plantas apresentam em sua composição substâncias
efetivas contra patógenos de plantas e animais e são praticamente inofensivos ao
meio ambiente quando comparados com derivados sintéticos, podendo até superar
sua ação farmacológica (MIGUEL, 1999; STANGARLIN, 1999; PERES, 2009).
A exposição das plantas a fatores do ambiente, como variações em
temperatura, umidade e radiação, e a agentes biológicos, como fungos, bactérias,
14
vírus, nematóides, insetos e herbívoros, faz com que elas necessitem reagir contra
esses fatores de estresse. As plantas, diferentemente dos animais, não possuem
sistemas imunológicos para enfrentar certas situações adversas. Esse fato,
associado à sua imobilidade, fez com que elas aperfeiçoassem, ao longo do tempo,
em suas células, tanto defesas pré-formadas quanto induzidas (HAMMONDKOSACK, 2000 apud RIZZARD, 2003). Essas defesas protegem as plantas de tal
forma que podem levar à morte as células próximas ao local onde ocorre o dano ou
mesmo levar à autodestruição da planta toda (TAIZ, 1998 apud RIZZARD, 2003).
A defesa é o principal mecanismo no caso de resistência não específica, em
que as plantas sintetizam peptídeos, proteínas e metabólitos secundários, que
restringem a infecção por patógenos (HEATH, 2000 apud RIZZARD, 2003).
O Piper aduncum, conhecido popularmente como falso jaborandi, pimenta de
macaco entre outras sinonímias é uma planta nativa da Amazônia (MESQUITA,
2005). O seu óleo essencial possui várias atividades relatadas como fungicida
(BASTOS, 2004; SILVA, 2007) moluscida, acaricida, bactericida, larvicida e
inseticida (SILVA, 2007). O extrato preparado a partir das folhas tem sido usado no
controle de fungos do tipo Colletrotricum musae, causador da necrose de banana
(LOBATO, 2007) e contra o protozoário Leishmania amazonensis, causador da
leishmaniose cutânea (SANTOS, 1999). Além disso, esta espécie tem sido avaliada
quanto à sua atividade antiinflamatória, devido à presença de metabólitos
secundários da classe dos terpenos (VELLOSA, 2007).
15
2 JUSTIFICATIVA
No Brasil, um país de natureza exuberante e um verdadeiro império vegetal,
existem cerca de 120.000 espécies de plantas superiores, que até hoje são
estudadas de forma modesta quando comparada à riqueza de informações que
poderiam ser repassadas ao ser humano. Ao longo da história, as plantas medicinais
perderam a importância e passaram a ser utilizadas somente como terapia
alternativa no Brasil, bem como nos demais países em desenvolvimento, onde cerca
de 80% da população não tem acesso aos medicamentos. Trabalhos como este, de
aprofundamento dos estudos sobre plantas medicinais, são importantes, devendo
ser regionalizados, dando ênfase à necessidade de preservação do ecossistema
onde existem as espécies com potencial fitoterápico.
Muitas plantas possuem em sua composição química substâncias com
atividade antioxidante, que são de grande interesse em diversas áreas, como:
•
Indústria alimentícia, sendo usados na forma de conservantes.
•
Indústria farmacêutica, no estudo de novos fármacos com ação antioxidante,
gerando proteção do organismo contra o dano oxidativo. Podem ser usados
também como conservantes naturais dos medicamentos.
•
Na indústria de cosméticos podem ser usados como antioxidantes na
prevenção de doenças relacionadas à pele e como conservante de produtos.
Produtos naturais vêm tendo, atualmente, ampla aplicação terapêutica com
a difusão da idéia de que são mais seguros do que os medicamentos sintéticos e,
por serem fontes naturais de substâncias antioxidantes (VELLOSA, 2007). Os
antioxidantes são substâncias que reagem com radicais livres impedindo ou
diminuindo o estresse oxidativo (SOARES, 2005).
16
3. OBJETIVOS
3.1 GERAL
Avaliação do extrato alcoólico da planta Piper aduncum (Falso Jaborandi),
quanto à sua atividade antioxidante, antirradicalar e antiinflamatória.
3.2 ESPECÍFICOS
•
Preparo de extrato bruto e seco da planta.
•
Determinação do melhor método de extração a frio (maceração) e a
quente (decocção e banho de ultrassom).
•
Determinação do perfil cromatográfico dos compostos voláteis extratos
brutos obtidos.
•
Avaliação da atividade antioxidante e/ou antirradicalar utilizando o método
espectrofotométrico em presença de DPPH.
•
Avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro, utilizando nitroprussiato
como fonte de óxido nítrico.
17
4. REVISÃO DA LITERATURA
4.1 FITOQUÍMICA
Isso evidencia a importância e o crescimento da fitoterapia, seja em países
pobres, onde não existem alternativas, ou em países ricos, onde programas bem
direcionados buscam novas possibilidades para a saúde da população (CORDELL,
1995; YUNES, 2001). O desenvolvimento científico e tecnológico utilizado na
descoberta e posterior utilização de novos fitoterápicos para o uso medicinal e
agrícola provêm do entendimento das informações acumuladas historicamente,e
usadas pela etnobotânica (MACIEL, 2002).
O domínio de técnicas como isolamento, purificação/caracterização de
princípios ativos, estudo farmacológico envolvendo extratos/constituintes químicos
isolados, as possíveis conversões mecanísticas dos princípios ativos (oxi-reduções,
substituições eletrofílicas/nucleofílicas, eliminações, adições, etc.), a relação
estrutura/atividade e a dinâmica das formulações para produção de fitoterápicos
englobam as principais temáticas de conhecimento vinculadas a todo o processo de
obtenção de fitoterápicos (MACIEL, 2002).
Em relação à seleção de espécies vegetais para estudo fitoterápico,
abordagens aleatórias, quimiotaxonômicas (filogenéticas ou de acordo com a
presença de grupos funcionais específicos ou classes de substâncias de um gênero
ou família) e etnofarmacológicas (conforme ação terapêutica) têm sido empregadas
como ponto de partida para este estudo (MACIEL, 2002).
4.2 METABÓLITOS DE ORIGEM VEGETAL
Dá-se o nome de metabolismo ao conjunto de reações que estão
continuamente ocorrendo em cada célula. Portanto, os compostos químicos
formados,
degradados
ou
metabólitos (ZANOM, 2006).
simplesmente
transformados
são
chamados
de
18
Além do metabolismo primário, responsável pela produção de celulose,
lignina, proteínas, lipídios, açúcares e outras substâncias que realizam suas
principais funções vitais, as plantas também apresentam o chamado metabolismo
secundário, do qual resultam substâncias de baixo peso molecular, às vezes
produzidas em pequenas quantidades. Considera-se que uma das principais
funções do metabolismo secundário nas plantas seja a biossíntese de estruturas
complexas como alcalóides, terpenóides e derivados de fenilpropanóides. Tais
estruturas funcionariam como agentes defensivos na luta contra predadores, a
exemplo de microorganismos patogênicos, insetos e animais herbívoros. Além disso,
em diversas situações de estresses bióticos e abióticos, novas rotas biossintéticas
são iniciadas a partir de metabólitos primários, desencadeando a produção de
substâncias químicas com grande variabilidade estrutural. A riqueza de metabólitos
secundários nas plantas é também explicada pelo fato delas estarem enraizadas no
solo, não podendo se deslocar e, portanto, utilizar como resposta ao meio ambiente
as respostas possíveis dos animais.
Na figura 1, podem-se observar os fatores que vão determinar a produção de
metabólitos secundários por um planta, quais sejam, temperatura, índice
pluviométrico, sazonalidade, composição atmosférica, altitude, latitude, radiação UV,
ritmo circadiano, micronutrientes, macronutrientes, e idade da planta sendo o
conjunto estes fatores são chamados de edafoclimático. Alem destes a planta pode
ser destacado o atacaque por herbívoros e ataque de patógenos De acordo com
estes fatores uma planta pode produzir determinados metabólitos secundários.
Entretanto, um estudo detalhado é necessário para demonstrar a composição
química desta planta e suas possíveis aplicações terapêuticas. Desde o quarto
século a.C. existem relatos de normas para a coleta de plantas medicinais. Os
carrascos gregos, por ex., coletavam suas amostras do veneno cicuta (Conium
maculatum) pela manhã, quando os níveis de coniina são maiores. Variações
temporais e espaciais no conteúdo total, bem como as proporções relativas de
metabólitos secundários em plantas ocorrem em diferentes níveis (sazonais e
diárias; intraplanta, inter- e intraespecífica) e, apesar da existência de um controle
genético, a expressão pode sofrer modificações resultantes da interação de
processos bioquímicos, fisiológicos, ecológicos e evolutivos (ALVES, 2001).
19
Figura 1 – Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos
secundários em plantas. Fonte: ALVES, 2001.
Os metabólitos secundários produzidos pelos vegetais são formados por
vários caminhos biossintéticos que produzem moléculas dotadas de grande
diversidade de esqueletos e grupamentos funcionais, como ácidos graxos (gorduras)
e seus ésteres, hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos e cetonas, compostos
acetilênicos, alcalóides, compostos fenólicos e cumarinas. Os fenilpropanóides e,
especialmente, os terpenóides são os principais constituintes que estão envolvidos
nas
interações
planta-inseto.
Como
podemos
observar
na
natureza,
os
fenilpropanóoides se formamn a partir do ácido chiquímico, que conduz às unidades
básicas: ácido cinânico e ácido p-cumárico (ALVES, da glicose, pelos vegetais.
2001). A figura 2 refere-se às rotas de produção de metabólitos secundários a partir
da glicose, pelos vegetais.
20
Figura 2 - Ciclo Biossintético.
Fonte: SIMÕES, 2001.
Na figura 3, pode-se observar a formação dos metabólitos do tipo terpeno. O
primeiro composto na sequência é o ácido mevalônico, que dá origem ao pirofosfato
de isopentinila. Em seguida, tem-se a formação de compostos do tipo terpenos entre
os quais monoterpenos e sequiterpenos (ALVES, 2001).
Os metabólitos secundários do tipo sesquiterpenos, apresentados na figura 3,
aparecem em grandes concentrações em espécies do gênero Piper. O dilapiol, um
composto da classe dos terpenos, possui atividade antifúngica e encontra-se
presente no P. aduncum. Esta espécie tem sido utilizada em grande escala na
Amazônia com esta finalidade (ESTRELA, 2006; MESQUITA, 2005).
Além do dilapiol, o Piper aduncum possui em sua composição outros
compostos como β-pineno, espatulenol, óxido de linalool, nerolidol, cariofileno,
dentre outros compostos (MESQUITA, 2005).
21
Figura 3 – Formação de terpenos.
Fonte: ALVES, 2001.
4.3 PLANTAS MEDICINAIS E ANTIOXIDANTES
De acordo com Vellosa (2007), o uso de extratos vegetais no tratamento de
patologias é um hábito difundido no Brasil, o que pode ser explicado ao menos em
parte, pelo baixo custo e a crença de que tais produtos não possuem efeitos tóxicos.
De acordo com Vellosa (2007), o uso de extratos vegetais no tratamento de
patologias é um hábito difundido no Brasil, o que pode ser explicado ao menos em
parte, pelo baixo custo e a crença de que tais produtos não possuem efeitos tóxicos.
A prevenção de doenças por meio do consumo de frutas e verduras tem
auxiliado em doenças do tipo cardiovasculares e câncer. A prevenção que estes
alimentos têm promovido contra estas doenças tem sido atribuída à atividade
antioxidante (YEN, 2001). Devido ao potencial carcinogênico de antioxidantes
sintéticos, os antioxidantes naturais são alvos alternativos para minimizar ou retardar
os processos de deterioração oxidativa em alimentos e para desenvolvimento de
alimentos funcionais. Acredita-se que os compostos antioxidantes presentes nas
plantas podem prevenir doenças como mal de Alzheimer, câncer, envelhecimento
precoce, inflamações, dentre outras.
22
Alguns dos metabólitos secundários encontrados nas plantas que possuem
uma atividade antioxidante são compostos fenólicos, sendo estes compostos
classificados
da
seguinte
forma:
hidroxibenzóicos,
acetofenol,
fenilpropanóides,
naftoquinonas,
fenóis
ácidos
simples,
fenilacéticos,
xantonas,
bezoquinonas,
ácidos
estilbenzenos,
ácidos
hidroxicinâmicos,
antroquinonas,
flavonóides, isoflavonóides, lignanas, neolignanas, biflavonóides, ligninas e taninos
condensados ( BIANCHI, 1999; ÂNGELO, 2007).
4.3.1 Antioxidantes Sintéticos
Os antioxidantes são um conjunto heterogêneo de substâncias formadas por
vitaminas, minerais, pigmentos naturais e outros compostos vegetais e, ainda,
enzimas que bloqueiam o efeito danoso dos radicais livres. O termo antioxidante
significa que impede a oxidação de outras substâncias químicas, que ocorrem nas
reações metabólicas ou por fatores exógenos como as radiações ionizantes.
Antioxidantes são compostos que atuam inibindo e/ou diminuindo os efeitos
desencadeados pelos radicais livres e compostos oxidantes (SOARES, 2005).
Radicais livres (RL) e espécies reativas de oxigênio (ERO) desempenham
papel fundamental no metabolismo celular. No entanto, quando em excesso, podem
gerar estresse oxidativo, levando a alterações teciduais responsáveis por diversas
patologias, incluindo o câncer (DRÖGE, 2002). Antioxidantes são substâncias que
reagem com radicais livres impedindo ou diminuindo o estresse oxidativo e a
conseqüente destruição tissular (HALLIWELL, 1992). Entre os antioxidantes mais
conhecidos estão as vitaminas, principalmente C e E, e os flavonóides, entre os
quais pode-se citar a quercetina, rutina, hesperidina, naringina, e sakuranetina.
4.3.2. DPPH
Recentemente, Brand-Williams (1995) utilizou um método com uma
abordagem diferente do que tem sido citado pela literatura. O método tem por
23
objetivo avaliar a atividade antioxidante de compostos específicos ou extratos, sendo
que estes irão reagir com um radical livre estável DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazila)
em uma solução etanólica. Na sua forma radical, o DPPH absorve em 517 nm,
porém, após redução por um antioxidante (AH) ou por uma espécie radical (R), a
absorção diminui indicando a inativação do radical (mudança de cor de roxo para
amarelo) (figura 6). Assim, utilizando-se o radical livre DPPH, pode-se avaliar a
capacidade antioxidade do extrato em estudo frente a este radical.
Figura 4 - Perfil espectrofotométrico do DPPH radical e DPPH inativado.
4.3.3 Trolox
O Trolox (figura 7), cujo nome químico é 6-hidroxi-2-5-7-8-tetramethilcroman2-ácido carboxílico, é um derivado da vitamina E e possui potente propriedade
antioxidande. Além disso, apresenta permeabilidade celular e solubilidade em água
(SALGO, 1995).
O mecanismo de ação do efeito antioxidante do Trolox é semelhante ao da
vitamina E, ou seja, envolve a hidroxila (OH) fenólica e a remoção de radicais
peroxila (ALBERTINI, 1999).
24
Figura 5 - Estrutura química do Trolox.
Fonte:
SALGO, 1995.
4.3.4 BHT e BHA
Tanto o BHA quanto o BHT são antioxidantes sintéticos muito utilizados na
indústria de alimentos, cosméticos e medicamentos (RAMALHO, 2006).
O BHA é uma mistura dos isômeros 2-terc-butil-4-hidroxianisol e 3-terc-butil-4hidroxianisol (figura 8), enquanto o BHT (figura 9) é conhecido quimicamente como
3,5-di-terc-butil-4-hidroxitolueno.
Figura 8 – Estrutura química dos isômeros 2-terc-butil-4-hidroxianisol (a) e 3-terc-butil-4hidroxianisol (b), que compõem o antioxidante BHA.
25
Figura 9 – Estrutura química do BHT.
Como são potentes agentes antioxidantes o oxigênio reage preferencialmente
com estes compostos ao invés de oxidar os óleos e gorduras. O BHA é um
antioxidante mais efetivo na supressão da oxidação em gorduras animais que em
óleos vegetais. Como a maior parte dos antioxidantes fenólicos, sua eficiência é
limitada aos óleos insaturados de vegetais e sementes. Apresenta pouca
estabilidade frente a elevadas temperaturas, mas é particularmente efetivo no
controle de oxidação de ácidos graxos de cadeia curta, como aquelas contidas em
óleo de coco e palma.
O BHT tem propriedades similares ao BHA, contudo o BHT e o BHA são
sinergistas entre si. O BHA age como sequestrante de radicais peróxidos, enquanto
o BHT age como regenerador de radicais de BHA (RAMALHO, 2006).
4.4 PROCESSO INFLAMATÓRIO
A inflamação é o conjunto de alterações que ocorrem no organismo em
seqüência cronológica com a finalidade de restringir e posteriormente eliminar o
agente agressor (físico, químico, ou biológico) nocivo ao organismo. De acordo com
o tempo e as características dos exsudato são divididas em agudas e crônicas.
(SOUZA, 2003).
A inflamação consiste no recrutamento de leucócitos e na difusão de
proteínas do complemento para os locais de infecção, assim como na ativação dos
leucócitos para eliminar o agente infeccioso. Pode também ser responsável pelos
danos que surjam nos tecidos normais, sujeitos à infecção (ABBAS, 2007).
26
Em primeiro lugar, os neutrófilos e leucócitos são recrutados da corrente
sanguínea, através da ação de moléculas de adesão (quimiotaxia) produzidas em
resposta à infecção (ABBAS, 2007). Este recrutamento é feito através do TNF (fator
de necrose tumoral alfa) e IL-1 (citocina indutora de reação inflamatória), que atuam
sobre as células endoteliais, favorecendo o acúmulo de monócitos e macrófagos
(ABBAS, 2007). Esta reação é o componente principal da inflamação. Estas
moléculas efetoras destinam-se à fagocitose e eliminação dos agentes infecciosos
(ABBAS, 2007). Por sua vez, os macrófagos ativados induzem a produção de novas
citocinas, tanto como estímulo para a resposta inflamatória, como na indução de
uma resposta imunitária adquirida (ABBAS, 2007).
4.4.1 Causas da Inflamação
Todos os agentes que lesem as células e os tecidos provocam inflamação.
Assim, não só os microorganismos (vírus, bactérias, protozoários, helmintos)
causam inflamação, mas também, agentes mecânicos (trauma), físicos (calor,
diversas espécies de raios) e químicos (ácidos e bases) (FARIA, 2003).
4.4.2 Sinais cardiais da inflamação
Estes sinais foram descritos na era clássica, no segundo século d.C. pelo
enciclopedista romano Aulus Celsus, sendo citados rubor (eritema), calor
(temperatura elevada), tumor (edema) e dor (algia) (RUBIN, 2006).
4.4.3 Formação de Radicais Livres
Atualmente tem-se discutido muito a respeito da formação de radicais livres e
como estes podem causar algumas doenças como: processo inflamatório, câncer,
27
envelhecimento precoce, mal de Parkinson, dentre outras. Contudo, para se
compreender como estes radicais são formados é importante que se entenda o que
são radicais livres.
As camadas eletrônicas de um elemento químico são denominadas K, L, M e
N, e seus subníveis, s, p, d, f. De maneira simples, o termo radical livre refere-se a
átomo ou molécula altamente reativo, que contêm número ímpar de elétrons em sua
última camada eletrônica. É este não-emparelhamento de elétrons da última camada
que confere alta reatividade a esses átomos ou moléculas.
A formação destes radicais livres ocorre dentro das células através de
processos onde ocorrem reações de oxi-redução para que haja a compensação do
organismo buscando o equilíbrio fisiológico.
Bianchi (1999) cita (Tabela 1) algumas possíveis fontes geradoras de radicais
livres.
Tabela 1 - Fontes endógenas e exógenas de geração de radicais livres.
Endógenas
Exógenas
Respiração aeróbica
Ozônio
Radiação gama e ultravioleta
Perixomos
Medicamentos
Enzimas do citocromo P450
Dietas, cigarro
Fonte: BIANCHI, 1999.
Entre as principais formas reativas de oxigênio o radical superóxido (O2-)
apresenta uma baixa capacidade de oxidação, o radical hidroxila (OH-) mostra uma
pequena capacidade de difusão e é o mais reativo na indução de lesões nas
moléculas celulares. O peróxido de hidrogênio (H2O2) não é considerado um radical
livre verdadeiro, mas é capaz de atravessar a membrana nuclear e induzir danos a
molécula de DNA por meio de reações enzimáticas. A Figura 4 demonstra a redução
do oxigênio molecular na mitocôndria até a formação de água (ANDERSON, 1996).
28
4.4.4 Estresse Oxidativo
Mais de 95% do oxigênio consumido durante o metabolismo aeróbico é
utilizado nas mitocôndrias para produção de energia. (LEITE, 2003).
Segundo Husain (1987) a produção de radicais livres no interior de uma célula
ocorre durante a produção de energia, fagocitose, regulação de crescimento celular,
sinalização intracelular e síntese de substâncias biológicas importantes. Entretanto,
o excesso destes radicais apresenta efeitos nocivos, como: peroxidação dos
compostos lipídicos de membrana, agressão às proteínas dos tecidos e das
membranas, às enzimas, carboidratos e DNA. Desta forma, o excesso de radicais
livres está relacionado a várias patologias como:processo inflamatório, artrite,
câncer, dentre outras (HALLIWELL, 1992).
O excesso de radicais livres no organismo humano pode ser combatido por
antioxidantes produzidos pelo corpo ou através da dieta. Segundo Halliwell (1986),
“um antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixa
concentração comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou previne
significativamente a oxidação do mesmo”.
A tabela 2 exemplifica os principais antioxidantes que podem ser encontrados
na dieta (não enzimáticos) e os que são produzidos pelo organismo (enzimáticos)
em defesa contra os radicais livres.
Tabela 2 - Os agentes de defesa antioxidante
Não-enzimático
Enzimático
Alfa tocoferol
Beta-caroteno
L- cisteína
Vitamina C
Superproxidase (SOD)
Flavonóides
Catalase
Proteínas do plasma
NADPH-quinonaoxiredutase
Selênio
Glutationaperoxidase
Glutationa
Enzima de reparo
Clorofila
Curcumina
Fonte: BIANCHI, 1999.
29
Caso os radicais livres não consigam ser combatidos através destes
antioxidantes algumas doenças podem acometer os seres humanos. Dentre elas
pode-se citar: artrite, aterosclerose, diabetes, catarata, esclerose múltipla,
inflamação crônica, disfunção cerebral, cardiopatias, enfisema, envelhecimento,
câncer e doenças do sistema imune (Bianchi, 1999).
4.3.5 Radical Livre e Processo Inflamatório
Diferentes radicais livres podem estar relacionados a muitas doenças, porém
no processo inflamatório os radicais de interesse são os derivados do óxido nítrico.
Em 1980, foi demonstrado que o relaxamento vascular era induzido por
acetilcolina, sendo mediado por um fator humoral, mais tarde conhecido como fator
de relaxamento dependente do endotélio. Em 1987 foi demonstrado que este fator
de relaxamento era um radical livre, o óxido nítrico (NO) (CERQUEIRA, 2002).
Os radicais livres de nitrogênio podem ser divididos em: óxido nítrico (NO),
óxido nitroso (N2O3), ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2-), nitratos (NO3-) e
peroxinitritos (ONOO-). Entretanto, o interesse maior recai sobre o óxido nítrico (NO),
por estar presente no processo inflamatório pela ativação de macrófagos.
O óxido nítrico, um radical gasoso lipossolúvel, é uma espécie reativa do
nitrogênio que, em meio aquoso, reage com o oxigênio para formar outras espécies
reativas (MACMICKING, 1997).
O óxido nítrico pode ser oxidante ou redutor dependendo do meio em que ele
está e é rapidamente destruído pelo oxigênio, sendo que a sua oxidação produz
nitrito e nitrato. O NO tem o peso molecular menor que qualquer produto de
secreção celular de mamíferos; sua meia vida é curta e a especificidade de suas
reações é mínima. (CERQUEIRA, 2002).
A molécula do NO tem um elétron não pareado que reage facilmente com
oxigênio, radical superóxido, ou metais de transição, como ferro, cobalto, manganês
ou cobre. O NO tem alta afinidade com o grupo heme encontrado nas proteínas
intracelulares, como por exemplo, óxido nítrico-sintetase, ciclooxigenase e guanilato
ciclase, além de se ligar a grupos SH, formando tiol (CERQUEIRA, 2002).
30
O NO apresenta atividade citostática ou citocida contra uma notável amplitude
de microorganismos patogênicos (CERQUEIRA, 2002).
A figura 5 demonstra a sequência de eventos que ocorrem no processo
inflamatório a partir de uma lesão tissular. Durante este processo tem-se a formação
do radical livre NO.
Uma das respostas mais precoce após a lesão tecidual ocorre dentro da
microvasculatura, no nível do capilar e da vênula pós-capilar (RUBIN, 2006). Dentro
desta rede vascular encontram-se os componentes principais da resposta
inflamatória, como o plasma, as plaquetas, os eritrócitos e os leucócitos circulantes.
As alterações da parede vascular após lesão tecidual desencadeiam os seguintes
fenômenos: ativação de células endoteliais, perda da integridade vascular,
extravasamento de líquido e de componentes do plasma a partir do comportamento
intravascular e emigração dos eritrócitos e leucócitos dos espaços intraluminal até o
tecido extravascular (RUBIN, 2006). Conforme as reações tendem a ocorrer, podese evoluir para um processo inflamatório agudo ou crônico.
Figura 8 - Processo Inflamatório.
31
4.5 FALSO JABORANDI (Piper aduncum)
O falso jaborandi apresenta a seguinte classificação científica: família
Piperaceae, gênero Piper e espécie Piper aduncum. A figura 10 apresenta uma foto
da planta adulta.A família Piperaceae é pantropical, com espécies distribuídas pelas
Américas desde o México até o sudeste da Argentina (YUNCKER, 1972). Nesta
família encontram-se plantas de porte arbustivo, herbáceo ou arbóreo com mais de 3
metros de altura. O caule é articulado e nodoso, as folhas são inteiras, dorsiventrais,
alternas,
raramente
opostas
ou
verticuladas,
pecioladas
com
epicutas
(HUTCHINSON, 1973 apud ALBIEIRO,2005).
Figura 9 – Foto de uma planta adulta da espécie Piper
aduncum.
O gênero Piper L. possui muitas espécies que se caracterizam pelo uso
popular medicinal e pela importância econômica e comercial devido à produção de
óleos essenciais utilizados pela indústria de condimentos, farmacêutica e também de
inseticidas (SILVA, 2007). O gênero Piper é o que tem maior número de espécies,
32
próximo de 700, distribuídas em todas as regiões tropicais, das quais mais de 170
ocorrem no Brasil (YUNCKER, 1972; SILVA, 2007).
Uma característica marcante do gênero é a presença de estruturas de
conteúdo oleoso em altas concentrações. Os óleos extraídos de Piper hispidinervium
C.DC, apresentaram um teor de 98,12% de safrol, enquanto o óleo de Piper
callosum L. possui 64% deste composto (MAIA,1987apud ALBIEIRO ,2005).
A atividade biológica de espécies de Piper é muito diversificada e também
muito utilizada na medicina popular para tratamento de inúmeras doenças (VIEIRA,
1992). O óleo essencial possui ação fungicida, moluscida, acaricida, bactericida e
larvicida (FAZOLLIN, 2005). O extrato produzido com as folhas pode ser usado no
controle de fungos do tipo Colletrotricum musae (BASTOS, 2004).
A espécie Piper aduncum se apresenta como um arbusto de ampla
distribuição tropical, com ocorrência em solos areno-argilosos. É conhecida
popularmente como ”pimenta-de-macaco” e “aperta-ruão”. Esta espécie apresenta
alta rusticidade e elevada resistência às mudanças climáticas, sendo considerada
um planta oportunista que invade as áreas desflorestadas após exploração de
madeira (SOUZA, 2008). O uso medicinal do falso jaborandi tem sido relatado em
doenças ginecológicas e em desordens intestinais (VAN DEN BERG, 1993 apud
SOUZA, 2008), como diurético, antiblenorrágico, carminativo, excitante digestivo,
para males do fígado, no combate a erisipela e tratamento de úlceras crônicas
(COIMBRA, 1994). Extratos orgânicos de folhas de Piper aduncum apresentam
atividade moluscida, citotóxica e antibacteriana (ORJALA, 1993). O óleo essencial
do Piper aduncum apresentou atividade contra o fungo Clinipellis perniciosa,
causador da doença conhecida como “vassoura-de-bruxa”, que acomete culturas de
cacau e cupuaçu. Na concentração de 50 a 100 ppm inibiu 100% o crescimento e a
germinação deste fungo (BASTOS, 1997). O óleo essencial do P. aduncum
apresentou atividade inseticida e larvicida (FAZOLIM, 2007) contra fitófagos e
mosquitos
transmissores
de
dengue
e
malária
eliminando-os
em
baixas
concentrações (BERNARD, 1995). O extrato obtido com dicloroetano preparado a
partir de folhas e caule diminui o desenvolvimento de formas promastigotas de
Leishmania amazonensis pela redução da síntese de DNA (SANTOS, 1999).
O óleo essencial de Piper aduncum apresenta excelente rendimento (2,5 a
3,5%) e é rico em dilapiol (SOUZA, 2008). Nas doses de 1000 a 3000 mg/Kg,
33
demonstrou uma margem elevada de segurança, com efeitos tóxicos mínimos sobre
os parâmetros hematológicos e bioquímicos (SOUZA, 2008).
O Piper aduncum é uma planta de interesse econômico para a Amazônia e
que pode ser usada no controle de pragas. Na sua composição química a literatura
confirma a presença de metabolitos secundários do tipo terpenos, associando a
estes compostos possíveis atividades farmacológicas, tais como: inseticida, descrita
por Maia (1988), antifúngica, antiinflamatória, anti-hemorrágica, adstringente,
diurética e outras, descritas por diferentes autores ( VIEIRA, 1991; VERAS, 2009;
MORANDIM, 2008; SILVA, 2007).
Os terpenos do tipo canfeno, limoneno, β-cariofileno, quando presente na
composição de plantas têm demonstrado boa atividade antioxidante frente ao radical
livre DPPH (REBELO, 2009 ). A espécie Piper aduncum apresenta em sua
composição vários terpenos, como os citados anteriormente.
Na medicina popular o Piper aduncum tem demonstrado vários empregos. Na
forma de chá ou infusão de suas folhas é empregado como tônico, carminativo,
antiespasmódico, antihemorrágico e para afecções do fígado, vesícula e baço.
Também tem sido usado contra picada de cobra, estimulante e colagogo (MATOS,
2002). O seu uso para tratamento de reumatismo, artrite, diabete, inflamações
pulmonares, dores pulmonares, no estômago e para fortalecer os cabelos também
têm sido relatados (LORENZI, 2002).
4.6 PREPARO DO MATERIAL VEGETAL
4.6.1 Critérios experimentais
Embora uma planta possa conter centenas de metabólitos secundários, apenas os
compostos presentes em maior concentração são geralmente isolados e estudados
pela fitoquímica clássica. Assim, fica clara a necessidade de um trabalho de
colaboração mais ampla entre químicos e farmacólogos para a análise de extratos,
onde se obtém extratos semi-puros, frações e finalmente os compostos puros
(YUNES, 2001).
34
A investigação de substâncias de plantas incluiu várias etapas, que podem
ser classificadas da seguinte forma:
1) Escolha da planta a ser estudada;
2) Identificação botânica;
3) Avaliação prévia da composição química;
4) Isolamento e purificação dos constituintes principais;
5) Elucidação da estrutura molecular dos compostos puros e isolados, ou
seja, a determinação estrutural (MATOS, 1998).
A figura 11 ilustra algumas etapas básicas que devem ser seguidas quando
se procura obter princípios ativos de plantas.
Figura 10 - Procedimentos gerais para obtenção de compostos biologicamente ativos.
Fonte: YUNES, 1997.
35
Vários processos de seleção têm sido desenvolvidos ao longo da história da
fitoquímica, todos eles condicionados a objetivos específicos e técnicas postas à
disposição do pesquisador. O conhecimento da flora da região a ser estudada,
aliada à informação popular, também são fatores importantes que devem ser
considerados. Exsicatas devem ser depositadas em herbário para evitar possíveis
dúvidas acerca da origem correta das substâncias isoladas e identificadas (MATOS,
1998).
Para efeito de elaboração de critérios para os estudos de produtos naturais,
torna-se importante definir a espécie vegetal de interesse segundo sua classificação
etnofarmacológica e sua delimitação geográfica de amostragem, conforme a origem
ou fonte da espécie elencada. Questões demográficas e conseqüentemente
variáveis ambientais como fatores meteorológicos (umidade relativa, radiação solar,
ângulo solar zenital, sazonalidade, temperatura, pluviometria), assim como fatores
agro-físico-químicos (macro e micronutrientes do solo, a fertilidade, a presença de
possíveis contaminantes aquáticos, atmosféricos e nos solos) podem afetar os
equilíbrios entre as planta e seus constituintes. Fatores como a longevidade da
planta e a sazonalidade durante a coleta são condições que também podem implicar
em variações das razões das concentrações de diferentes princípios ativos de
interesse.
Escolhidas as espécies de interesse, assim como a localização geográfica de
coleta, uma identificação científica criteriosa faz-se necessária, uma vez que,
partindo-se de uma classificação errada, condena-se todo o processo de
caracterização química.
Considerando definidas as características etnofarmacológicas da planta de
interesse, diferentes procedimentos são empregados de modo a se obter uma
seqüência lógico-científica de fácil controle das variáveis intrínsecas e extrínsecas
do sistema (MATOS, 1998).
4.6.2 Coleta
A coleta de plantas medicinias precisa ser criteriosa, pois cada planta possui
o melhor horário para sua coleta. O material vegetal a ser coletado deve estar sem
36
fungos, sujeiras e sem rasuras. A coleta deverá ser feita em locais diversificados. No
caso de folhas, é importante coletar espécimes adultos (SIMÕES, 2004).
4.6.3 Conservação do material
A utilização do material vegetal fresco pode ser indispensável para a detecção
de alguns componentes específicos. Seu emprego traz a vantagem de evitar a
presença de substâncias oriundas do metabolismo de fenecimento vegetal. Por
outro lado, o material deve ser processado imediatamente ou conservado, até
análise, em temperatura igual ou inferior a 18 ºC negativos.
Já o emprego de material vegetal seco, empregado devido à sua maior
estabilidade química, exige cuidados especiais, afim de interromper os processos
metabólicos que ocorrem mesmo após a coleta da planta (SIMÕES, 2004).
4.6.4 Secagem e moagem
A moagem tem por finalidade reduzir mecanicamente o material vegetal a
fragmentos de pequenas dimensões, preparando-o assim, para a próxima etapa, a
extração. O aumento da área de contato entre o material sólido e o líquido extrator
torna mais eficiente a operação. A escolha das dimensões mais apropriadas
depende também da textura do órgão vegetal. Quanto mais rígidos forem os tecidos,
maior será o grau de divisão necessário. As metodologias utilizadas para reduzir de
tamanho o material vegetal são escolhidas conforme as características deste. Uma
divisão grosseira pode ser efetuada por seccionamento (através de tesoura, podões
ou facas), por impacto (redução a fragmentos por meio de choques repetidos
efetuados, por exemplo, em grau) e por rasuração (através de raspadores ou
processadores de alimentos) (SIMÕES, 2004).
37
4.6.5 Preparo do extrato
Antes do isolamento e purificação deve-se realizar a correta preparação dos
extratos brutos das plantas. Desta forma a escolha de um determinado método de
extração dependerá da textura e do conteúdo de água presente no material a ser
extraído, assim como o tipo de substância que se deseja isolar. Com uma extração
inicial que utiliza solventes de baixa polaridade obtêm-se compostos mais lipofílicos,
por outro lado com solventes alcoólicos obtêm-se um amplo espectro de material
polar e apolar. O procedimento clássico para obtenção de extratos orgânicos de
material vegetal seco e triturado é a extração por solventes de polaridade crescente,
sendo os principais hexano, clorofórmio e etanol ou metanol (para compostos mais
polares) e hexano, clorofórmio ou éter (para compostos apolares). Tais solventes
devem ser preferidos ao invés da água, pois são mais facilmente evaporados e
previnem o crescimento de microrganismos (MATOS, 1998).
A escolha do solvente dependerá do objetivo da extração, ou seja, extrair
todas as substâncias presentes na planta ou extrair somente as substâncias
desejadas de uma forma seletiva. O estudo da polaridade dos solventes a serem
utilizados durante os diferentes processos de extração é fundamental quando fatores
como a hidrofilicidade e hidrofobicidade dos constituintes das frações orgânicas
presentes nas plantas desejam ser qualitativa ou quantitativamente analisados.
Portanto, a utilização de solventes como éter de petróleo, hexano, benzeno,
clorofórmio, diclorometano na extração de compostos hidrofóbicos e de solventes
como metanol e etanol na extração de compostos hidrofílicos são geralmente
empregados, ou de forma isolada, ou de forma combinada, de modo a se obter
variadas polaridades para o sistema de extração. Em relação à extração de
derivados lipossolúveis ácidos ou básicos, estes podem ser obtidos geralmente com
a geração dos sais hidrossolúveis, ou com bases inorgânicas no caso dos ácidos, ou
com ácidos inorgânicos, no caso de bases. Em relação à escolha do solvente, devese levar em consideração a toxicidade do solvente e a estabilidade das substâncias
extraídas.
38
Na tabela 3 são listadas algumas substâncias e o tipo de solvente adequado à
sua extração (MATOS, 1998).
Tabela 3: Solventes e os seus respectivos metabólitos secundários extraídos
Solvente
Éter de petróleo, hexano
Substâncias extraídas
Lipídeos, ceras, pigmentos, furanocumarinas
Éter etílico, diclorometano, Bases alcaloídicas livres, antraquinonas livres,
clorofórmio
Acetato de etila, butanol
Etanol, metanol
Misturas hidroalcoólicas,
água
terpenos, heterosídeos cardiotônicos, esteróides
Geninas
de
flavonóides,
cumarinas
simples,
terpenos e esteróides
Heterosídeos de forma geral
Saponinas, taninos, flavonóides, açúcares
Água acidificada
Alcalóides
Água alcalinizada
Saponinas
Fonte: MATOS, 1998.
4.6.6 Métodos de extração
4.6.6.1 Métodos a frio
a) Maceração
A maceração consiste na extração do material vegetal em recipiente fechado
à temperatura ambiente por um período prolongado, sob agitação ocasional ou
contínua. Geralmente o líquido extrator consiste em etanol, metanol e soluções
hidroalcoólicas. Solventes muito voláteis devem ser evitados, bem como água ou
misturas hidroalcoólicas inferiores a 30% (SIMÕES, 2004).
39
b) Banho de Ultrassom
O ultrassom é constituído de ondas mecânicas com freqüência maior que 16
kHz, que se propagam em ciclos sucessivos de compressão e rarefação através de
qualquer meio material e que não podem ser sentida pelo homem (MASON, 1998
apud KORN, 2003). Os ultrassons possuem várias aplicações dentro da medicina,
engenharia, indústria de alimentos e laboratórios de análise química, sendo uma de
suas aplicações a extração de amostras (KORN, 2003).
Para a extração de amostras o banho de ultrassom emite ondas sônicas nos
sistemas, ocorrendo a formação de bolhas de cavitação na superfície dos sólidos. O
fenômeno de cavitação cresce e, sendo a pressão externa maior que a interna, as
bolhas de cavitação entram em colapso e a implosão das bolhas (SUSLIK, 1980;
apud KORN, 2003). Com a implosão das bolhas ocorre a liberação de uma grande
quantidade de energia para o meio, proporcionando na microzona onde ocorreu o
colapso, aumento de temperatura da ordem de alguns milhares de graus
centígrados e da pressão para centenas de atmosferas. A somatória destes fatores
é a responsável pela extração de metabólitos secundários das plantas (KORN,
2003).
4.6.6.2 Método a quente
Decocção
Consiste em manter o vegetal em contato durante certo tempo com um
solvente sob aquecimento. Costuma-se empregar este método com materiais
vegetais duros e/ou de natureza lenhosa (SIMÕES, 2004). A decocção pode ser
empregada no preparo de chás como o café, erva-mate, camomila, e também para o
preparo de amostra para análise fitoquímica de uma planta.
40
4.7 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETAVISÍVEL
A espectrofotometria na região ultravioleta-visível (UV-VIS) do espectro
eletromagnético é uma das técnicas analíticas mais empregadas, em função da
praticidade, custo relativamente baixo e grande número de aplicações desenvolvidas
(ROCHA, 1994).
Muitas moléculas orgânicas e grupos funcionais são transparentes em partes
da faixa espectral ultravioleta (UV), a qual compreende comprimentos de onda entre
190 e 400 nm, e visível (VIS), a região compreendida entre 400 nm e 800 nm, sendo
responsável pela cor das substâncias e objetos. Quando uma radiação contínua
passa através de um material transparente, que esteja em uma cela de amostra de
quartzo, uma parte da radiação pode ser absorvida. Se isto ocorre, a radiação
residual, quando é passada através de um prisma, produz um espectro com fendas
chamado de espectro de absorção. Como resultado da absorção de energia, átomos
ou moléculas passam de um estado de baixa energia (estado fundamental) para um
estado de maior energia (estado excitado). A radiação eletromagnética que é
absorvida tem energia exatamente igual à diferença entre os estados excitado e
fundamental. Como a energia absorvida é quantizada, o espectro que se origina de
uma única transição eletrônica deveria corresponder a uma linha única e discreta.
Isto não se confirma, já que à absorção eletrônica superpõem-se os subníveis
rotacionais, vibracionais e translacionais, originando bandas de absorção que
possuem posição correspondente ao comprimento de onda cuja energia é igual à
energia necessária para transição eletrônica (SKOOG, 2002).
A absorção de uma dada substância é muito afetada se ela contém grupos
cromóforos. Um cromóforo é um grupo funcional que tem absorção característica na
região do ultravioleta ou do visível. Estes grupos têm invariavelmente ligações
duplas ou triplas. Se o cromóforo estiver conjugado com outro grupo do mesmo tipo
ou diferente, a absorção é mais intensa e ocorre em comprimentos de onda maiores
(SKOOG, 2002; MENDHAM, 2002; HARRIS, 2005).
A lei de Lambert-Beer é a base matemática para medidas analíticas de
absorção da radiação por amostras no estado sólido, líquido ou gasoso, nas regiões
ultravioleta, visível e infravermelho do espectro eletromagnético. Para medidas de
41
absorção de radiação em determinado comprimento de onda, tem-se uma
proporcionalidade entre a absorção da luz, o caminho ótico percorrido pela luz, a
concentração e a absortividade molar dos constituintes dessa substância.
A absortividade molar (ε) é uma grandeza característica da espécie
absorvente, cuja magnitude depende do comprimento de onda da radiação incidente
(ROCHA, 1994; HARRIS, 2005).
A lei de Beer estabelece que a absorvância é proporcionalmente linear à
concentração da espécie absorvente. Ela se aplica à maioria das substâncias
quando a radiação é monocromática e as soluções estão suficientemente diluídas
(HARRIS, 2005).
A = log (I/I0) = k c b
Onde k é igual à constante característica do soluto, c é a concentração do
soluto, b é o comprimento do caminho óptico através da amostra e A é a
absorvância, I é a intensidade da luz uma vez tendo atravessado o meio, I0 é a
intensidade da luz incidente. Quando c é expresso em moles L-1 e o comprimento do
caminho óptico em centímetros, a expressão acima se torna,
A= ε b c
A intensidade de uma banda de absorção em um espectro no UV-VIS é
usualmente expressa como absortividade molar no máximo de absorção, εmáximo ou
log10(εmáximo).
A figura 12 apresenta a fotografia de um equipamento para realização de
análise por espectrofotometria no ultravioeta-visível.
42
Figura 11 – Fotografia do espectrofotômetro UV-Visível Femto
800 X utilizado neste estudo.
4.8 PREPARO DE AMOSTRAS – MICROEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
A microextração em fase sólida (SPME) é uma microtécnica, na qual os
processos de extração e concentração dos analitos ocorrem em escala dimensional
reduzida. O dispositivo mais comum de SPME consiste de um bastão de fibra óptica,
de sílica fundida de 100 µm de diâmetro, com 10 mm de uma das extremidades
recoberto com um filme fino de um polímero (figura 13), como polidimetilsiloxano
(PDMS), poliacrilato (PA) ou carbowax (CW), ou de um sólido adsorvente, como
carvão ativo microparticulado (Carboxen). As espessuras dos recobrimentos das
fibras comerciais variam de 7 µm a 100 µm e seus volumes de 0,03 µL a 0,7 µL
(FERNANDES, 2006).
43
Figura 12 - Dispositivo da fibra de SPME: (A) posição com a fibra retraída na
agulha, (B) posição com a fibra exposta. No detalhe são mostradas as dimensões
típicas da região com recobrimento de 100 µm. Fonte: FERNANDES, 2006.
A SPME baseia-se na sorção dos analitos em uma fibra com pequeno
diâmetro, revestida com um sorbente. Esta técnica possui duas etapas: partição dos
analitos entre a fibra extratora e a matriz e dessorção do extrato concentrado no
instrumento analítico (Figura 14). Na primeira etapa, a fibra recoberta com material
extrator é colocada em contato com a matriz ou com o headspace, permitindo que
haja partição dos analitos entre a matriz e a fibra. Posteriormente, a fibra contendo
os analitos é transferida para um instrumento para que ocorra a dessorção,
separação e quantificação dos mesmos.
44
Figura 13 - Processos de extração e dessorção em uma análise por SPME.
Fonte: FERNANDES, 2006.
4.9 CROMATOGRAFIA
A cromatografia é uma técnica de separação físico-química, fundamentada na
migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a
diferentes interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária.
Cada composto da mistura entra em contato com as duas fases alternadamente.
Essa alternância entre as duas fases ocorre com grande rapidez e acontece por um
número incontável de vezes durante o período em que a fase móvel atravessa a
fase estacionária. Isso significa que, enquanto estiver na fase móvel, o composto se
deslocará juntamente com ela, na mesma velocidade, e quando estiver na fase
estacionária, ficará parado. Cada composto, portanto, sofrerá um atraso no percurso
dependendo do período total em que ficar retido na fase estacionária. Se a
velocidade de migração dos compostos da mistura for diferente para todos, tem-se
uma separação destes compostos no fim do processo (SOARES, 2006).
A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna
a cromatografia uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação (DEGANI,
1998).
A cromatografia pode ser classificada em planar ou em coluna, conforme a
forma física em que se apresenta (figura 15). Como pode ser visualizado nesta
45
figura, a cromatografia em coluna pode ser de três tipos: a gás, com fluido
supercrítico e líquida, dependendo do tipo de fase móvel utilizada. Além disso, cada
um destes tipos se subdivide em outros modos, conforme a fase estacionária seja
líquida, sólida ou de fase ligada.
Figura 14 - Representação esquemática dos diferentes tipos de cromatografia. CP: cromatografia em
papel; CCD (TLC): cromatografia em camada delgada; CCD (HPTLC): cromatografia em camada
delgada de alta resolução; CGL: cromatografia gás-líquido; CGS: cromatografia gás-sólido; CGFL:
cromatografia gasosa de fase ligada; CSFL: cromatografia com fluido supercrítico; CLL: cromatografia
líquido-líquido; CLS: cromatografia líquido-sólido; CE: cromatografia de exclusão; CLFL:
cromatografia líquida de fase ligada; CTI: cromatografia de troca iônica; CB: cromatografia de
bioafinidade.
4.9.1 Cromatografia Gasosa
A cromatografia gasosa é uma técnica que separa gases e substâncias
voláteis por migração diferencial em um sistema que compreende uma fase
estacionária (líquida ou sólida) e uma fase móvel (gasosa) (SOARES, 2006). Sua
grande vantagem reside em seu alto poder de resolução, superior a qualquer outra
técnica cromatográfica (SOARES, 2006). É capaz de separar dezenas de
substâncias presentes em uma mesma amostra. Dependendo do detector
46
empregado, sua sensibilidade pode chegar a 10-12 g e, em alguns casos, a 10-14 g.
Os requisitos necessários para que um composto possa ser separado por esta
técnica é que sejam voláteis ou tornados voláteis por derivação química e sejam
termicamente estáveis.
Na cromatografia gasosa, a amostra líquida volátil ou gasosa é injetada por
um septo dentro de uma câmara aquecida, onde ela se evapora rapidamente. O
vapor é empurrado pelo gás de arraste e os constituintes fluem pela coluna onde
ocorre a separação. Em seguida, estes compostos separados alcançam o detector,
cuja resposta é mostrada num computador ou registrador. A coluna cromatográfica
deve estar aquecida o bastante para proporcionar uma pressão de vapor suficiente
para que os constituintes sejam eluídos num tempo razoável (Harris, 1999).
4.9.1.1 Equipamento
Um esquema de um cromatógrafo a gás típico está apresentado na figura 16.
Este sistema apresenta um reservatório de gás de arraste, controladores de vazão e
pressão para o gás de arraste, injetor de amostra, forno e termostato para o injetor,
coluna analítica, forno termoestatizado para a coluna, detector, forno e termostato
para o detector e dispositivo para processamento do sinal do detector.
Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta pureza e ser inertes em
relação à fase estacionária. Hidrogênio, nitrogênio e hélio são os mais usados
(DEGANI, 1998). Muitos cromatógrafos modernos são equipados com um controle
eletrônico programável do gás de arraste que entra na coluna Aumentando-se a
pressão de entrada aumenta-se a vazão da fase móvel, e assim o tempo de
retenção diminui. O bom desempenho da coluna e do detector dependerá do gás de
arraste, sendo que o hidrogênio e o nitrogênio têm melhor resolução que o hélio.
Entretanto, existem algumas restrições quanto ao uso do hidrogênio: quando usado
com um detector por espectrometria de massas pode danificar a bomba de vácuo a
óleo deste detector; além de poder reagir cataliticamente com compostos
insaturados presentes em superfícies metálicas (HARRIS, 1999).
47
Figura 15 Esquema de um cromatógrafo a gás típico.
O injetor é uma câmara de vaporização com temperatura controlada.
Geralmente, a temperatura é ajustada a 50 oC acima da temperatura da coluna para
garantir que nenhuma condensação ocorra. A temperatura do injetor deve ser tal
que garanta a volatilização e rápida da amostra, mas não tão alta que provoque
decomposição, rearranjos moleculares ou outras alterações na estrutura química
dos compostos injetados (SOARES, 2006). A injeção da amostra é feita através de
microseringas ou válvulas semelhantes às utilizadas na cromatografia líquida
(DEGANI, 1998).
A grande maioria das análises cromatográficas usa longas e estreitas colunas
capilares, feitas de sílica fundida e cobertas com poliimida (um polímero capaz de
resistir até 350 oC) para suportar e proteger da umidade atmosférica. O diâmetro
interno da coluna normalmente varia de 0,10 a 0,53 mm, e os comprimentos normais
são de 15 a 100 m (HARRIS, 1999). Estas colunas possuem uma fina película de
fase estacionária revestindo a parede interna deste tubo de sílica. Dependendo do
material utilizado, as fases estacionárias podem ter características polares ou
48
apolares. As fases do tipo polisiloxanos variam de apolares a medianamente
polares, enquanto as fases à base de polietilenoglicóis são polares.
A temperatura de uma coluna pode ser elevada durante a separação
(programação de temperatura) para aumentar a pressão de vapor do soluto e assim
diminuir o tempo de retenção dos últimos componentes a serem eluídos.
Após
os
componentes
de
uma
mistura
ser separados
na
coluna
cromatográfica, eles devem ser detectados na saída, onde podem ser identificados e
quantificados. Diferentes tipos de detectores podem ser utilizados na cromatografia
gasosa, cada um deles com características próprias de seletividade, sensibilidade,
faixa de linearidade, precisão e exatidão. A tabela 4 apresenta os principais
detectores empregados na cromatografia gasosa e suas características de
sensibilidade e seletividade.
Tabela 4 – Sensibilidade e seletividade dos detectores mais comumente empregados em
cromatografia gasosa.
Detector
Sensibilidade
Seletividade
Condutividade térmica
4 x 10-10 g/mL
Universal
Ionização em chama
2 x 10-12 g C/s
Compostos orgânicos
Fotométrico de chama
Captura de elétrons
Espectrômetro de massas
2 x 10-12 g P/s
1 x 10-10 g S/s
10-15 g/s
EI: 10-100 pg
NICI: 25 pg
PeS
Principalmente compostos
halogenados
Universal
EI = impacto de elétrons; NICI = ionização química negativa
Fonte: SOARES, 2006.
O espectrômetro de massas é um detector potente para análises qualitativas
e quantitativas de constituintes em cromatografia gasosa ou líquida Na
espectrometria de massas, as moléculas gasosas são ionizadas (geralmente para
formarem cátions), aceleradas por um campo elétrico, e então separadas de acordo
49
com sua razão massa/carga (m/z). O processo de ionização geralmente confere
energia suficiente para quebrar a molécula numa variedade de fragmentos.
Os instrumentos de espectrometria de massas possuem os seguintes
módulos (figura 17):
•
Sistema para introdução de amostra;
•
Fonte de íons para ionizar as moléculas da amostra;
•
Sistema de separação dos fragmentos ionizados de acordo com sua
relação m/z;
•
Detector para medir a abundância de cada fragmento ionizado gerado;
•
Sistema de vácuo para manter a fonte de íons, o sistema de separação
e o detector sob baixa pressão;
•
Sistema
para processamento do sinal, com capacidade para
armazenar dados e bibliotecas necessárias para comparação entre espectros,
e para emissão do espectro e do relatório contendo o espectro de massas.
Figura 16 – Esquema dos principais componentes de um espectrômetro de massas
(SOARES, 2006).
50
O espectro de massas é um histograma que mostra a abundância relativa de
cada íon que atinge o detector do equipamento, de acordo com a relação
massa/carga. O perfil característico e único conseguido para cada composto torna a
espectrometria de massas o método mais seguro para confirmação de identidade.
51
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 REAGENTES
•
Ácido o-fosfórico 85%. Labsynth, lote123924.
•
Álcool etílico hidratado 92,8%. Minas Açúcar S/A.
•
Nitroprussiato de sódio. Vetec, lote 003918.
•
Sulfanilamida. Vetec, lote 045308.
•
Dicloridrato de N(1-nafitil)-etilenodiamina. Fluka, lote 048093/1.
•
1,1,difenil-2-picril-hidrazila (DPPH). Sigma Aldrich, lote S43654-357.
•
Terc-butil-hidroquinona (BHT). Vetec.
•
Butil hidroxianisol (BHA). Cromoline Química Fina Ltda, lote 13708/07.
•
ácido
carboxílico
6-hidroxi-2-5-7-8-tetramethilcroman-2
Aldrich, lote S 33986-077.
•
Nitrito de sódio. Ecibra Reagentes Analíticos, lote15623.
5.2 EQUIPAMENTOS
•
Agitador Kline (Novatec Equipamentos para Laboratório).
•
Banho de ultrassom (Quimis).
•
Liquidificador (Arno).
•
Moinho de facas (Marconi - modelo 340).
•
Espectrofotômetro UV-Visível (Fento – modelo 700 plus).
•
Espectrofotômetro UV-Visível (Fento – modelo 800 XI).
•
Rotaevaporador (Fisatom).
•
Freezer (Brastemp – modelo 240 L).
•
Bomba de vácuo (Prismatec).
•
Cromatógrafo a gás (Shimadzu – modelo QP-5050A).
•
Fibra para SPME PDMS-DVB (Supelco).
(Trolox).
Sigma
52
•
Suporte para fibra SPME (Supelco).
•
Estufa de fluxo laminar (Nova Ética).
•
Balança (Bioprecisa – modelo FA2104N).
•
Manta aquecedora (Fisatom).
•
Evaporador centrífugo a vácuo Speedvac (ThermoSavant - modelo SC250).
•
Vidrarias para decocção.
•
Vidrarias para Soxleth.
5.3 COLETA
A planta foi colhida no Campus II da Univale, Governador Valadares, Minas
Gerais, Brasil. A coleta foi realizada entre 7:00 e 8:00 da manhã, no mês de agosto
de 2008, sendo colhidas as folhas adultas de sem fungos, buracos, presença de
fungos ou presença de larvas. Para a coleta teve-se o cuidado de colher em locais
diferenciados na copa da planta.
O Piper aduncum, possui aproximadamente 6 metros de altura, diâmetro de
25 cm a 10 cm do solo, as folhas que foram colhidas estavam a uma altura de +/- 2
metros de forma diversificada ao redor da planta. O local da coleta possui várias
árvores, um ambiente com muita sombra. O solo no qual foi coletada a planta
possui as seguintes características:
-Para 20 cm, o pH= 8,10. Fósforo 5,8%, potássio 82,45%, cálcio
3,2%,magnésio 0.9%,alumínio 0,1%, material orgânico 1,29 dag/kg.
-Para 40 cm, o pH = 7,60.P Fósforo 39,50%, potássio 79,80%, cálcio
1,7%,magnésio 0.3%,alumínio 0,15%, material orgânico 1,18 dag/kg.
5.4 SECAGEM E MOAGEM
Logo após a coleta, procedeu-se a secagem utilizando uma estufa de fluxo de
ar com temperatura de 40 °C ± 1 oC. A planta foi colocada em sacolas de papel
perfuradas e o tempo de secagem foi determinado pela constância dos pesos das
53
sacolas contendo as folhas do P. aduncum, ou seja, após o primeiro dia de secagem
pesou-se as sacolas e anotou-se o peso. A partir do quarto dia de secagem peso
das sacolas contendo as plantas tornou-se estável, estas foram retiradas da estufa.
As folhas, já secas, foram trituradas com o auxílio de um moinho de facas
(Marconi - modelo 340). O pulverizado foi armazenado em uma sacola opaca ao
abrigo da luz.
5.5 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO
5.5.1.Monitoramento da saturação do solvente.
Os métodos de escolha para preparação dos extratos foram:a frio maceração
e banho de ultrasson, a quente: decocção.Sendo que durante o período de extração
fez-se o monitoramento do processo de extração usando como referência a clorofila.
Fez-se o monitoramento da saturação do solvente utilizando a variação do
solvente utilizando a variação da concentração da clorofila em solução, como
parâmetro para determinar o fim da extração.Para este monitoramento utilizou-se
uma alíquota de 0,1ml de e 2,9ml de solvente no comprimento de onda 664nm.Estas
leituras eram feitas ate que as leituras ficassem estáveis ,considerou-se assim o fim
da extração pela saturação do solvente.
5.5.2 Métodos a frio
a) Maceração
Para este processo foi utilizado etanol, sendo empregados 15 g do pó da
planta e 250 ml deste solvente durante sete dias. Durante este período fez-se o
monitoramento da extração da seguinte forma: coletaram-se alíquotas de 0,1 ml de
extrato e 2,9 ml de solvente (etanol), e fez-se a leitura da absorvância no λ= 664nm
54
espectrofotômetro. As leituras feitas foram armazenadas e comparadas com a leitura
anterior até que estivesse constante, o que caracterizava o ponto final da extração.
Após este período o extrato foi levado ao evaporador rotativo para o completo
esgotamento do solvente, obtendo-se o extrato concentrado da planta. Este extrato
foi então transferido para um béquer com a boca protegida com papel e colocado em
estufa a 40º C com fluxo de ar até a secura do extrato.
A partir deste extrato seco da planta prepararam-se várias soluções
etanólicas nas seguintes concentrações: 1,5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 3,75 mg/ml; 1,875
mg/ml e 0,9875 mg/ml.
b) Banho de Ultrassom
Utilizou-se 15 g da planta pulverizada e 250 ml de etanol, colocados em um
béquer, que era inserido em um banho de ultrassom. Este processo foi realizado por
4 horas, na temperatura de 20 oC. Durante este período, fez-se o monitoramento
conforme descrito no método de maceração.
Em seguida, o extrato foi levado ao evaporador rotativo para o completo
esgotamento do solvente, obtendo-se o extrato concentrado da planta. O extrato
concentrado foi então transferido para um béquer tampado com papel filtro, e então
levado a estufa à 40º C com fluxo de ar até a secura do extrato.
A partir do extrato seco da planta prepararam-se várias soluções etanólicas
nas seguintes concentrações: 1,5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 3,75 mg/ml; 1,875 mg/ml e
0,9875mg/ml.
5.5.3 Método a quente
Decocção
Foram utilizados 15 g da planta em estudo colocados em um balão de vidro
55
aquecido em uma manta, foram colocados 250 ml de etanol. Com o aquecimento, o
solvente passava através da planta, extraindo os compostos. Este processo foi
realizado durante 5 horas. Durante este período fez-se o monitoramento conforme
descrito no item Maceração.
Após este período o extrato foi levado ao evaporador rotativo para o completo
esgotamento do solvente, obtendo-se o extrato concentrado da planta.
A partir deste extrato concentrado da planta prepararam-se várias soluções
etanólicas nas seguintes concentrações: 1,5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 3,75mg/ml; 1,875
mg/ml e 0,9875 mg/ml.
5.5.4 Condições cromatográficas de análise do extrato do Piper aduncum
5.5.4.1 Preparo de amostras por micro extração em fase sólida (SPME)
Transferiu-se 50 µl da solução de extrato seco da planta na concentração de
20 mg/ml para um frasco de vidro de 2 ml, sendo o solvente removido em um
evaporador centrífugo a vácuo (Speedvac ,modelo SC250, ThermoSavant, EUA) por
18 h a 30 °C e 10 milibar. O frasco foi fechado com uma tampa selada com septo
revestido de teflon (Supelco, EUA.) e colocado em um bloco de aquecimento
ajustado a 90 °C. A fibra de SPME (polidimetilsiloxano/divinilbenzeno - PDMS/DVB
65 µM, Supelco, EUA) foi inserida, por meio de um suporte manual através do septo,
no headspace, durante 30 minutos. Imediatamente depois desse tempo, a fibra foi
analisada por meio de injeção no cromatógrafo a gás. Antes da utilização, a fibra foi
pré-condicionada a 230 °C durante 30 minutos na porta do injetor do cromatógrafo.
5.5.4.2 Cromatografia gasosa e espectrometria de massas
As análises por cromatografia gasosa e espectrometria de massas foram
realizadas em um equipamento Shimadzu QP-5050A (Shimadzu, Japão), equipado
56
com uma coluna PTE-5 (30 m, 0,25 mm, 0,25 µM, Supelco, EUA). As seguintes
condições foram utilizadas para todas as análises: hélio como gás de arraste, na
vazão de 22,3 ml/min e temperatura do injetor mantida a 230 °C. A programação de
temperatura do forno foi a seguinte: 80 °C durante 3 minutos seguida de
aquecimento até 300 °C na velocidade de 7 °C/min, mantendo a 300 °C por 5
minutos. A injeção foi feita no modo split, com um razão de 1:10. O detector de
massas foi programado para fazer a varredura na faixa de m/z de 50 a 500, a uma
taxa de 2 varreduras por segundo. A aquisição e manipulação dos dados foram
feitas por meio do software CLASS 5000 Shimadzu.
5.5.4.3 Análise dos dados brutos utilizando o software AMDIS (Automated Mass
Spectral Deconvolution and Identification System)
Os arquivos dos dados obtidos na análise por cromatografia gasosa e
espectrometria de massas foram analisados pelo software Automated Mass
Deconvolution and Identification System (AMDIS) versão 2.1, fornecida pelo Instituto
Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST, EUA). A elucidação estrutural dos
compostos foi feita por meio do programa NIST MS Search 2.0 (NIST/EPA/NIH Mass
Spectral Library, versão 2002).
5.6 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIRRADICALAR E/OU ANTI-OXIDANTE
5.6.1 Ensaios com radical livre estável 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
No ensaio com DPPH, preparou-se uma solução na concentração de 0, 004%
de DPPH usando etanol como solvente, e realizou-se a leitura no espectrofotômetro
(FENTO 800XI) no comprimento de onda de 517 nm. A solução teve uma
absorbância de aproximadamente 1,4.
57
Para estas análises foram utilizados 300 µl do extrato etanólico de Piper
aduncum nas seguintes concentrações: 1,5 mg/ml, 7,5 mg/ml; 3,75 mg/ml; 1,85
mg/ml e 0,975 mg/ml. A estas soluções foram adicionados 2700 µl da solução de
DPPH. Estas amostras foram colocadas em cubetas e imediatamente inseridas no
espectrofotômetro sendo as leituras feitas no modo cinético de 5 em 5 minutos até o
tempo total de 30 minutos. Para cada concentração fez-se três replicatas.
5.6.2 Ensaios com padrões antioxidantes sintéticos Trolox, BHA e BHT
Para estas análises foram utilizadas as seguintes concentrações de BHT,
BHA e Trolox em etanol: 1,5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 3,75 mg/ml; 1,85 mg/ml e 0,975
mg/ml. Usou-se como padrão de calibração etanol puro, fornecendo-se assim o zero
de absorbância. Para verificar o efeito sequestrante de radicais livres usou-se 300 µl
da solução do antioxidante adicionado em uma cubeta de vidro. Nesta solução
adicionou-se mais 2700 µl da solução de DPPH que foi imediatamente inserido no
espectrofotômetro e lido no modo cinético com leitura de 5 em 5 minutos até o
tempo total de 30 minutos no comprimento de onda de 664 nm. A leitura de cada
concentração foi realizada em triplicata para melhor tratamento dos dados.
Após a aquisição dos dados foi construída uma curva do tipo “dose x
resposta” para avaliar a atividade antirradicalar.
5.7 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
5.7.1 Dosagem de óxido nítrico
Para a avaliação da capacidade de captação do óxido nítrico pelos extratos
da planta foi utilizada metodologia adaptada de YEN (2001), da seguinte forma: 4 ml
de solução dos extratos nas diferentes concentrações foram adicionados em um
tubo contendo 1 ml de solução de nitroprussiato de sódio (25 mM) deixando-se em
ambiente livre de luz durante 2 horas a 37 ºC. Da amostra incubada retirou-se uma
alíquota de 0,5 ml e adicionou-se 0,15 ml de uma solução de sulfanilamida a 1% em
58
ácido fosfórico 2,5% (solução A). Esta solução foi mantida ao abrigo da luz e em
repouso por 10 minutos e em seguida adicionou-se 0,15 ml de uma solução de
dicloridrato de N-(1-Naftil)-etileno-diamina 0,1% em ácido fosfórico a 2,5% (solução
B) para a formação do cromóforo que é medido em 543 nm. Para construção da
curva de calibração preparou-se uma solução padrão de nitrito de sódio a
1,725 mg/l.
Desta solução realizou-se uma diluição seriada, sendo obtidas oito
concentrações: 1,725 mg/l; 0,8625 mg/l; 0,43125 mg/l; 0,21562 mg/l; 0,10781 mg/l;
0,05390 mg/l; 0,02695 mg/l e 0,01347 mg/l utilizando-se os mesmos reagentes dos
extratos para medição no espectrofotômetro em 543 nm.
59
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES
6.1 EXTRAÇÃO E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
A tabela 5 apresenta os compostos encontrados no extrato etanólico de folhas
de Piper aduncum utilizando as três diferentes técnicas de extração, separados pela
cromatografia gasosa e identificados pela espectrometria de massas. Pode-se
observar que alguns compostos estavam presentes nas três técnicas, como:
cariofileno, nerolidol e α-cariofileno. O γ-elemeno foi identificado apenas quando se
utilizou maceração e decocção. Os demais metabólitos secundários foram
identificados nas técnicas de forma isolada, demonstrando a necessidade da
utilização de vários métodos de extração para uma análise confiável dos resultados.
Ao utilizar vários métodos de extração pode-se identificar um maior número
de compostos e a partir desta seleção, analisar quais as possíveis aplicações
cientifica que a compsicao química deste extrato pode apresentar.Sendo importante
observar para qual método apresenta o composto de interesse , o tem de retenção
na amostra e a porcentagem que esta apresenta na amostra em estudo.
60
Tabela 5 - Compostos encontrados no extrato etanólico de folhas do Piper aduncum em diferentes
métodos de extração.
Metabólitos
Secundários
Cariofileno
α-Calacoreno
α-Santaleno
γ-Elemeno
Cis-γ-cadineno
Falcarinol
Germacreno D
Linalool
Óxido de Linalool
Nerolidol
γ-Cadineno
β Elemeno
δ Cadineno
α Cariofileno
% dos metabólitos na amostra
Banho de
Maceração
Decocção
Ultrassom
6,78
7,56
5,53
NI
5,41
NI
NI
NI
5,63
14,48
NI
13,49
NI
NI
15,39
NI
6,06
NI
17,16
NI
NI
NI
8,0
NI
NI
4,34
NI
13,41
18,45
15,24
6,01
NI
NI
3,12
NI
NI
NI
NI
5,73
7,49
8,25
6,06
NI- Não Identificados
6.1.1 Extrato etanólico de Piper aduncum obtido com banho de ultrassom
O extrato etanólico de Piper aduncum preparado usando a técnica de banho
de ultrassom seguido de análise cromatográfica apresentou os seguintes
compostos, que estão descritos na tabela 6.
61
Tabela 6 - Metabólitos secundários identificados no extrato etanólico de P. aduncum obtido através
da técnica de banho de ultrassom.
Tempo de
Metabólito secundário
% na amostra
15,784
Nerolidol
18,45
13,803
α-Cariofileno
8,25
6,362
Linalool
8,00
13,137
Cariofileno
7.56
15,052
Falcarinol.
6.06
14,568
α-Calacoreno
5,41
5,79
Óxido de Linalool
4,34
retenção (min)
Na figura 18 está apresentado o cromatograma, onde se pode observar a
presença de 7 compostos majoritários (com porcentagem na amostra superior a
4%), nerolidol, α-cariofileno, linalool, cariofileno, falcarinol, α-calacoreno e óxido de
linalool. Estes compostos são classificados como terpenos, monoterpenos e
sesquiterpenos (RUDIGER, 2007; ARRUDA, 2005; FALCÃO, 2003).
Figura 17 - Cromatograma do extrato etanólico de Piper aduncum, obtido com a técnica de banho de
ultrassom.
O nerolidol, classificado como sesquiterpeno, é um composto muito utilizado
como agente flavorizante de alimentos. Atualmente tem sido avaliado em testes de
penetração cutânea como um medicamento contra várias espécies de leishmania. O
62
nerolidol inibiu o crescimento de Leishmania amazonensis, L. brasilienses, L.
chagasi e L. amazonensis amastigota e promastigota in vitro (ARRUDA, 2005).
Segundo Klopell (2007), o nerolidol tem apresentado ação antiúlcera. Para testes
feitos in vitro, o nerolidol apresentou atividade antiinflamatória e inibição da produção
de óxido nítrico (Rüdigera, 2007).
Os compostos α–cariofileno e cariofileno, classificados como sesquiterpenos,
apresentaram atividade antiinflamatória, segundo VALLILO (2006). Outros estudos
demonstraram que, in vitro, possuem atividade antitumoral (RÜDIGERA, 2007).
O terpeno linalool, demonstrou atividade antiinflamatória e inibição da
produção de óxido nítrico. Em testes feitos in vitro apresentou atividade antitumoral.
(RÜDIGERA, 2007). O linalool pode ser encontrado em pequenas quantidades
(0,0001%) em algumas marcas de tabaco, apenas pelo aroma que proporciona. A
atividade antiinflamatória de (-)-linalool, (±)-linalool e do acetato de linalil,
demonstrado pela diminuição de edema produzido artificialmente em ratos, sugeriu
que os óleos essenciais que contivessem estes compostos possuíssem efeitos
antiinflamatórios. No entanto, devido aos efeitos tóxicos, este composto tem sido
pouco utilizado. O linalool foi considerado alergênico segundo Brerchbill (2007), visto
ter sido considerado a causa frequente de alergias dermatológicas. A figura 19
demonstra a estrutura química do linalool.
Figura 19- Estrutura química do linalool.
Óxido de linalool, um sesquiterpeno, pode ser encontrado no mel de abelhas,
existindo um grande interesse na produção e comercialização deste composto na
indústria de cosmético mundial, pois é largamente usado na produção de perfumes.
Apresentou atividade antiinflamatória, inibição da produção de óxido nítrico e, testes
63
feitos in vitro, demonstraram possuir atividade antitumoral (RÜDIGERA, 2007).
Howard (2003) constatou atividade antimicrobiana e antifúngica para este
sesquiterpeno.
O α-calacoreno, metabólito secundário classificado como sesquiterpeno
(Rudger, 2007), ao ser testado para avaliar sua atividade antimicrobiana, inclusive
contra Candida krusei (que produz metabólitos tóxicos durante o processo
infeccioso, os quais podem ser fatais para imunodeficientes), demonstrou boa
atividade.
O falcarinol é um álcool graxo que apresenta função de defesa contra
doenças fúngicas. Ele demonstrou que tem potencial anticâncer muito semelhante
ao do beta caroteno, quando testado em células epiteliais de mamíferos. Outros
resultados apontam que o falcarinol é capaz de induzir dermatite de contato.
Experimentos com macrófagos demonstraram que o falcarinol reduz a produção de
óxido nítrico, sugerindo que este poliacetileno tem atividade antiinflamatória O
falcarinol demonstrou também atividade mosquiticida (CHRISTENSEN, 2006).
6.1.2 Extrato etanólico de Piper aduncum obtido com decocção
O extrato etanólico obtido com a técnica de decocção demonstrou a
existência de 6 compostos majoritários. Estes compostos, segundo RUDIGER
(2007), ARRUDA (2005) e FALCÃO (2003), têm, em comum, atividade
antiinflamatória. A tabela 7 apresenta os metabólitos secundários principais, bem
como seus tempos de retenção e suas porcentagens na amostra. A figura 20
demonstra o cromatograma obtido quando a amostra foi extraída por decocção.
64
Tabela 7 - Metabólitos secundários identificados no extrato etanólico de P. aduncum obtido com a
técnica de decocção.
Tempo de
Metabólito secundário
% na amostra
14,59
cis-γ-cadineno
15,39
16,06
Nerolidol
15,24
14,91
γ-Elemeno
13,49
13,93
α-Cariofileno
6,06
15,26
δ–Candineno
5,73
13,24
α-Santaleno
5,63
retenção (min)
Figura 19 - Cromatograma do extrato etanólico de Piper aduncum, obtido com a técnica de decocção.
O cis-γ-cadineno, sesquiterpeno que apresentou a maior porcentagem na
amostra, apresentou atividade antiinflamatória em alguns testes e inibição da
produção de óxido nítrico (RUDGER, 2007). Para testes in vitro, demonstrou
atividade antitumoral.
O γ-elemeno, classificado como sesquiterpeno, apresentou atividade
antiinflamatória,
analgésica,
antinociceptiva,
hepatoprotetora,
anti-prurido
e
gastroprotetora acordo com testes descritos na literatura (RÜDIGERA, 2007).
Falcão (2003) classificou o δ–Candineno como um polifenol do tipo
sesquiterpeno. Para Singh (2004), compostos fenólicos tem importante papel na
65
atividade antioxidante dos extratos e óleos. O δ–Candineno é considerado um
agente anticarcinogênico, sendo também bactericida (MACIEL, 2002).
O α-santaleno tem demonstrado atividade antinociceptiva, antiinflamatória e
inibidora da produção de óxido nítrico. In vitro demonstrou ter atividade antitumoral
(RÜDIGERA, 2007). Florão (2006) comprovou a possível atividade antimicrobiana
deste metabólito.
6.1.3 Extrato etanólico de Piper aduncum obtido com maceração
A tabela 8 apresenta os 7 compostos mais importantes encontrados no
extrato etanólico obtido por maceração. A figura 21 apresenta o cromatograma
referente ao extrato obtido por maceração, onde se pode verificar a presença dos 7
compostos majoritários. Estes compostos, segundo RUDIGER (2007), ARRUDA
(2005) e FALCÃO (2003), possuem atividade antiinflamatória.
Tabela 8 - Metabólitos secundários identificados no extrato etanólico de P. aduncum através da
técnica de maceração.
Tempo de
Metabólito secundário
% na amostra
14,59
Germacreno D
17,16
14,92
γ–elemeno
14,48
16,03
Nerolidol
13,41
13,94
α-Cariofileno
7,49
13,25
Cariofileno
6,78
15,25
δ–Cadineno
6,01
12,58
β-Elemeno
3,12
retenção (min)
66
Figura 20- Cromatograma do extrato etanólico de Piper aduncum, obtido com a técnica de maceração
O germacreno D (NAYICKIENE, 2006), classificado como sesquiterpeno,
demonstrou atividade antimicrobiana (CUNICO, 2007), fungicida e sinalizadora para
insetos (SOUZA, 2007). É produzido pela planta, como defesa, a partir de um ataque
de insetos ou fungos.
Este composto aparece somente no método de maceração e em altas
concentrações demonstrando que a planta em estudo pode ter sido atacada em
algum momento por insetos.
O δ-cadineno, um sesquiterpeno, tem demonstrado atividade anti-bactericida
e anti-carcinogênica (SOUZA, 2007). O β-elemeno, outro sesquiterpeno, também
tem demonstrado atividade antimicrobiana (Cunico, 2007).
6.2 ATIVIDADE SEQUESTRANTE DE RADICAIS LIVRES
Conservantes de alimentos e antioxidantes de cosméticos podem ser
potencialmente substituídos por extratos vegetais desde que a capacidade
antioxidante seja comprovada. Testes com o radical livre DDPH (WILLIANS, 1995)
tem sido utilizado com bastante freqüência para inferir atividade antioxidante. No
extrato do Piper aduncum observou-se mudanças gradativas no que tange ao modo
de extração.
67
Os resultados obtidos com os testes de atividade antirradicalar mediados por
DPPH reafirmam que a planta em estudo possui componentes com alta atividade
sequestrante de radicais livres. Segundo Rüdiger (2007) amostra de óleo essenciais
contendo sesquiterpenos conseguem inibir a acumulação de neutrófilos para
diferentes graus, e também o extravasamento de proteínas sem mudar as
características dos leucócitos. Desta forma, leva-se ao aumento potencial de uma
ação antiinflamatória.
O primeiro mecanismo de defesa contra os radicais livres é impedir sua
formação. Os antioxidantes são capazes de interceptar os radicais livres gerados
pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os
lipídios, os aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos
poliinsaturados e as bases de DNA, evitando a formação de lesões e perda da
integridade celular (BIANCHI, 1999).
Os compostos fenólicos são incluídos na categoria de interruptores de
radicais livres, sendo muito eficientes na prevenção da autooxidação. Os compostos
mais distribuídos na natureza com estas características são: flavonóides
(antocianinas, flavonóis e seus derivados) ácidos fenólicos (ácido benzóico,
cinâmico e seus derivados) e cumarinas (ÂNGELO, 2006).
A figura 21, e as tabelas 9 e 10, demonstram curva padrão, no qual foram
utilizados o extrato etanolico de Piper aduncum e antioxidantes sintéticos padrão, de
uso na indústria de cosmético, farmacêutica, alimentícia dentre outras, na presença
do radical livre DPPH (SINGH, 2004). Neste gráfico pode-se observar que mesmo
em diferentes concentrações o Trolox, o BHT e o BHA exibem uma atividade
antioxidante em poucos minutos de reação. Sendo a atividade antioxidante
demonstrada dor trolox maior que o BHA , maior que o BHT.
Para o BHT pode-se observar que as concentrações 0,0975mg/ml,
0,1875mg/ml, 0,375mg/ml, 0,75mg/ml, 1,5mg/ml o DPPH remanescente foi 62,39%,
44,87%, 24,69%, 9,28%, 5,12% respectivamente.
BHA pode-se observar que as concentrações 0,0975mg/ml, 0,1875mg/ml,
0,375mg/ml, 0,75mg/ml, 1,5mg/ml o DPPH remanescente foi 4,32%, 5,05%, 5,67%,
5, 46%,5,92% respectivamente.
Para o trolox pode-se observar que as concentrações 0,0975mg/ml,
0,1875mg/ml, 0,375mg/ml, 0,75mg/ml, 1,5mg/ml o DPPH remanescente foi 3,76%,
3,85%, 3,76%, 3,92%, 4,04% respectivamente.
68
A figura 21 demonstra a atividade do extrato etanólico de Piper aduncum
obtidos com as técnicas de decocção, maceração e banho de ultrassom, em
presença do radical livre DPPH, em um tempo de 30 minutos. Pode-se observar
que, em pequenas concentrações do extrato (por exemplo, 0,0975 mg/ml de
extrato), este já demonstra atividade sequestrante.
O Piper aduncum demonstrou uma atividade antioxidante frente ao radical
livre DPPH, considerando as concentrações: 0,0975mg /ml, 0,1875mg/ml,
0,375mg/ml, 0,75mg/ml, 1,5mg/ml apresentou uma variação para os diferentes
métodos de extração.
Para o método de extração do tipo decocção pode-se observar que as
concentrações 0,0975mg/ml, 0,1875mg/ml, 0,375mg/ml, 0,75mg/ml, 1,5mg/ml,
sendo
o
DPPH
remanescente
foi
25,3%,14,4%,
16,3%,
14,55%,
11,3%
respectivamente.Para o método de extração do tipo banho de ultrasson pode-se
observar que as concentrações 0,0975mg/ml, 0,1875mg/ml, 0,375mg/ml, 0,75mg/ml,
1,5mg/ml o DPPH remanescente foi 53,43%, 38,9%, 22,2%, 14,55%, 11,3%
respectivamente.
0,0975mg/ml,
Na
maceração
0,1875mg/ml,
pode-se
0,375mg/ml,
observar
0,75mg/ml,
que
as
concentrações
1,5mg/ml
o
DPPH
remanescente foi 77,9%, 42%, 30,02%, 14,55%, 11,3% respectivamente.
Este resultado pode estar relacionado com a composição química do extrato,
sendo identificados metabolitos secundário do tipo sesquiterpenos como nerolidol, αcariofileno, presentes na amostra dos três métodos, e para a atividade antioxidante
na decocção e banho de ultrassom estão em maior expressão no gráfico 23.
Para a maceração os resultados quanto a atividade antioxidante, dos três
métodos foi a de menor expressão. Apesar de possuir na sua composição
compostos em comum, foi identificado um composto que so apareceu na maceração
o Germacreno D numa concentração de 17,16% na amostra em analise. E segundo
a literatura, este é produzido pela planta mediante a ataques de insetos, sugerindo
uma possível atividade repelente para este composto (Souza,2007).
69
Figura 21 – Atividade antioxidante do Piper aduncum, BHT, BHA, TROLOX, frente ao DPPH.
Tabela 9 - Atividade antioxidante do do BHT,BHA, TROLOX, frente ao DPPH.
Concentração
Porcentagem remanescente de DPPH
(mg/ml)
BHT
BHA
TROLOX
1,5
5,12
5,92
4,04
0,75
9,28
5,46
3,92
0,375
24,69
5,67
3,76
0,1875
44,87
5,05
3,85
0,0975
62,39
4,32
3,76
A tabela 10 apresenta os resultados obtidos com a técnica de DPPH para as
diferentes técnicas de extração, para diferentes concentrações do extrato, de
maneira mais detalhada.
70
Tabela 10 - Atividade antioxidante do P. aduncum em diferentes concentrações, para as diferentes
técnicas de extração.
Concentração
Porcentagem remanescente de DPPH
(mg/ml)
Maceração
Decocção
Ultrassom
1,5
11,3
11,3
11,3
0,75
14,55
14,55
14,55
0,375
30,02
16,3
22,2
0,1875
42,00
14,4
38,9
0,0975
77,9
25,3
53,4
6.3 ANÁLISE DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
6.3.1 Dosagem de óxido nítrico
A faixa linear de trabalho foi determinada utilizando-se os pontos da tabela 10,
dos quais foram excluídas as concentrações dos extremos inferior e superior (0,1347
mg/ml; 0,2695 mg/ml; 8,625 mg/ml e 17,25 mg/ml). A retirada destes pontos para o
cálculo da equação da reta permitiu-nos obter uma correlação linear com R2 igual a
0,999, satisfazendo a Lei de Lambert–Beer e evitando os desvios de máximo e
mínimo de concentração.
71
Tabela 11 - Pontos para curva de calibração de nitrito.
Concentrações (mg/ml)
Absorbância
0,1347
0,040
0,2695
0,080
0,5390
0,146
1,0782
0,288
2,1562
0,550
4,3125
1,035
8,625
1,675
17,25
1,903
A figura 23 apresenta a curva de calibração do nitrito obtida com as
concentrações de 0,5390 mg/ml; 1,0782 mg/ml; 2,1562 mg/ml e 4,3125 mg/ml.
Curva de calibração do nitrito
1,2
Absorbância
1
0,8
0,6
y = 0,2343x + 0,0312
R2 = 0,9992
0,4
0,2
0
0
1
2
3
4
5
Concentração (mg/ml)
Figura 23 - Curva de calibração do nitrito.
O NO é considerado um importante regulador da função vascular pela sua
ação no controle do tônus vascular (MONCADA, 1991). Nenhum novo doador de NO
tem chegado ao mercado desde sua descoberta como mediador das funções
vasculares em 1980 (CERQUEIRA, 2002), o que estimula a procura por novos
72
fármacos ou novos compostos que possam de alguma maneira tornar os
medicamentos já existentes mais seguros.
Mesmo em uma concentração de extrato reduzida como 0,031 mg/ml,
verificou-se que o potencial de inibição para liberação de NO e conversão em NO2 é
consideravelmente alto. Estes resultados foram semelhantes para as três técnicas
de extração. Deve-se considerar que os extratos submetidos ao teste são extratos
brutos secos e não componentes isolados (tabela 11 e figura 27).
O fato do nitroprussiato ser um fármaco amplamente utilizado no controle da
pressão sanguínea em casos de emergência e urgências desperta vários interesses.
Entretanto, apesar de sua grande eficiência na liberação de NO no organismo é
extremamente tóxico por liberar também grupamentos ciano (CN). Segundo
Shishido (1998) em testes de estabilidade utilizando Polietilenoglicol (PEG300) com
o nitroprussiato observou-se aumento da estabilidade do complexo devido ao efeito
de “engaiolamento” (cage effect), proporcionando uma diminuição da energia nos
estados de transição principais dos ligantes CN fornecendo estabilidade frente ao
meio que está inserido, neste caso uma solução aquosa e solução de PEG300.
Outros estudos (VERAS, 2009) verificaram a participação do produto natural,
cinamaldeido que compõe cerca de 90% do óleo essencial de canela na
estabilização e liberação de NO de forma mais ordenada e menos tóxica. Como os
principais compostos encontrados no extrato de P. aduncum tem semelhança
estrutural seria possível prever que o extrato apresentasse atividade relativamente
alta. Veras (2009) ainda sugere que modificações estruturais nestes compostos
naturais podem ser um fator de melhora adicional na liberação controlada de NO.
Tabela 12 - Porcentagem de NO inibido na presença do extrato etanólico de P. aduncum.
Concentração
Maceração
Decocção
Ultrassom
0,500
74,24
79,97
778,6
0,250
73,541
71,87
74,4
0,125
54,329
62,47
61,32
0,062
47,603
49,13
50,46
0,031
39,614
50,58
44,44
(mg/ml)
73
Figura 24 - Porcentagem de nitrito inibido na presença do extrato etanólico de
P. aduncum.
74
7 CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos a partir do preparo de extratos etanólicos de
folhas de Piper aduncum pode-se concluir:
A utilização de três técnicas de extração demonstrou uma diversificação de
compostos encontrados conforme o método e atividade antioxidante .
O extrato etanólico de Piper aduncum,no método de decocção demonstrou ter
a
atividade
antioxidante
em
relação
aos
antioxidantes
sintéticos
usados
comercialmente. Na concentração de 0, 375 mg/ml de BHT tem-se 24,69% de DPPH
remanescente, sendo que para o método de Decoccao na concentração de
0,0975mg/ml tem-se 25,3% de DPPH remanescente.
O DPPH que sobra no tratamento com BHT foi 51,194% maior do que que
sobrou de DPPH em decocção na concentração de 0,0375 mg/ml.
O banho ultrasson na concentração de 0, 375mg/ml apresentou 22,2% de
DPPH remanescente, sendo que o BHT na mesma concentração demonstrou
24,69% de DPPH remanescente.
O DPPH que sobra no tratamento com BHT foi 11,22% maior do que que
sobrou de DPPH em banho de ultrassom na concentração de 0,0375 mg/ml.
A equivalência do extrato aos antioxidantes tradicionais nos levam a crer
numa potencial substituição destes compostos sintéticos pelo extrato de Piper
aduncum, necessitando de mais estudo quanto à fitossanidade e biosegurança.
Para concentrações abaixo de 0,5 mg/ml de extrato etanólico de Piper
aduncum, observou-se uma elevada atividade antirradicalar, pois o extrato
conseguiu impedir a liberação do NO, via nitroprussiato, em 74,24%.
As evidências cromatográficas juntamente com os dados obtidos nos testes
com DPPH e nitroprussiato, demonstram que o Piper aduncum tem um grande
potencial a ser explorado no que tange aos mecanismos de inflamação.
75
8 PERSPECTIVAS PARA CONTINUIDADE DO TRABALHO
Análise e separação dos constituintes do Piper aduncum;
Testes farmacológicos in vivo, in vitro e ex vivo;
Testes de bancada para determinação de tempo de prateleira de produtos que
utilizam antioxidantes com a função de conservantes;
Testes de fase 2 da atividade antiinflamatória;
Testes de fase clínica para a atividade antiinflamatória;
Avaliação do potencial antitumoral;
Avaliação do potencial leishmanicida;
Avaliação do potencial larvicida e pupicida para vetores de doenças negligenciadas
como: malária, dengue e leishmaniose.
76
REFERÊNCIAS
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Distúrbios do Sistema Imunológico. Segunda edição. São Paulo: Elsevier , 2007.
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Antonio; MOURÃO, Káthia Socorro Mathias. Morfoanatomia dos órgãos
vegetativos de Piper crassinervium H.B. & K. (Piperaceae). Acta Botânica
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ALBERTINI, R.; ABUJA, P. M. Proxidant and antioxidant properties of trolox C
Analogue of vitamin E, in oxidation of low-density lipoprotein. Free Radical
Research, Áustria v. 30, n. 3, p. 181-188, 1999.
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Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas. Santa Maria, Rio Grande do Sul.