GUILHERME AMARAL DE SOUZA
BIOFORTIFICAÇÃO DA CULTURA DO TRIGO
COM ZINCO, SELÊNIO E FERRO:
EXPLORANDO O GERMOPLASMA BRASILEIRO
LAVRAS – MG
2013
GUILHERME AMARAL DE SOUZA
BIOFORTIFICAÇÃO DA CULTURA DO TRIGO COM ZINCO,
SELÊNIO E FERRO: EXPLORANDO O GERMOPLASMA BRASILEIRO
Tese apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do Programa de PósGraduação em Ciência do Solo, área
de concentração em Fertilidade do
Solo e Nutrição de Plantas, para a
obtenção do título de Doutor.
Orientadores
Dra. Janice Guedes de Carvalho (in memoriam)
Dr. Mozart Martins Ferreira
Coorientador
Dr. Luiz Roberto Guimarães Guilherme
LAVRAS – MG
2013
Ficha Catalográfica Elaborada pela Coordenadoria de Produtos e
Serviços da Biblioteca Universitária da UFLA
Souza, Guilherme Amaral de.
Biofortificação da cultura do trigo com zinco, selênio e ferro :
explorando o germoplasma brasileiro / Guilherme Amaral de Souza.
– Lavras : UFLA, 2013.
112 p. : il.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Lavras, 2013.
Orientador: Janice Guedes de Carvalho.
Bibliografia.
1. Micronutrientes. 2. Segurança alimentar. 3. Variabilidade
genética. 4. Selenato. 5. Selenito. I. Universidade Federal de Lavras.
II. Título.
CDD – 631.81
GUILHERME AMARAL DE SOUZA
BIOFORTIFICAÇÃO DA CULTURA DO TRIGO COM ZINCO,
SELÊNIO E FERRO: EXPLORANDO O GERMOPLASMA BRASILEIRO
Tese apresentada à Universidade
Federal de Lavras, como parte das
exigências do Programa de PósGraduação em Ciência do Solo, área
de concentração em Fertilidade do
Solo e Nutrição de Plantas, para a
obtenção do título de Doutor.
APROVADA em 09 de Agosto de 2013.
Dra. Ana Rosa Ribeiro Bastos
Dr. André Rodrigues dos Reis
Dra. Cleide Aparecida de Abreu
Dr. Luiz Roberto Guimarães Guilherme
UFLA
Waseda University
IAC
UFLA
Dra. Janice Guedes de Carvalho (in memoriam)
Dr. Mozart Martins Ferreira
Orientadores
LAVRAS – MG
2013
À Maria Amaral Lourenço, minha avó, pelo apoio durante toda a minha vida
acadêmica.
Aos meus pais Vanderli e Helena, pelo amor, amizade e carinho demonstrados
nos momentos mais difíceis.
À Ariane, minha irmã, pelos momentos de motivação.
A todos que me apoiaram e torceram por mim durante esses anos.
OFEREÇO
À Fernanda, pelo carinho, paciência e amor.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus. pela vida e por mais essa oportunidade.
À Universidade Federal de Lavras e ao Departamento de Ciência do
Solo, pela oportunidade da realização do curso de Pós-Graduação.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), pelas bolsas de estudos, regular e sanduíche.
À Professora Dra. Janice Guedes de Carvalho (in memoriam), minha
orientadora, pelo apoio, orientação, amizade, incentivo e valiosos ensinamentos.
À Pesquisadora Dra. Ana Rosa Ribeiro Bastos e ao Dr. Paulo Jorge de
Pinho, pela orientação, sugestões, motivação e amizade durante todos esses
anos.
À Professora Dra. Li Li pela orientação, sugestões e amizade durante o
estágio em Ithaca.
Aos Professores Dr. Mozart Martins Ferreira e Dr. Luiz Roberto
Guimarães Guilherme, pelos ensinamentos e amizade que foram fundamentais
para a conclusão deste trabalho.
Ao Professor Dr. Alfredo Scheid Lopes, agradeço pelas conversas
sempre proveitosas e agradáveis.
À EMBRAPA CPAC e ao Pesquisador MSc. Júlio César Albrecht, que
gentilmente cederam as sementes de trigo utilizadas neste trabalho.
À EPAMIG e COOPADAP, instituições nas quais realizamos algumas
etapas do trabalho.
Aos membros da banca: Dr. Mozart M. Ferreira, Dra. Ana Rosa R.
Bastos, Dr. Luiz Roberto G. Guilherme, Dr. André Rodrigues dos Reis e Dra.
Cleide Aparecida de Abreu.
À Cornell University e Robert W. Holley Center for Agriculture and
Health – USDA/Ithaca, pelo suporte oferecido durante o estágio sanduíche.
Aos funcionários do DCS, USDA e Plant Breeding & Genetics, em
especial, aos grandes amigos Adalberto Ribeiro e José Roberto Fernandes, pela
amizade e companheirismo.
Aos amigos de República, Paulo Avelar, Thiago Reis e Fabrício Ávila,
pelo convívio e paciência.
Aos amigos de DCS: Paulo Avelar, Thiago Reis e Fabrício Ávila, Plínio,
Cláudio Soares, Murilo, Livia Coelho, Daniela Andrade, Veridiana, Ana Paula,
Geila, Fábio Ono, Fábio Satoshi, Camila, Fábio Aurélio, Cibelle, Éder, Viviane,
Inêz, Cleber, Cynthia, Guilherme Dinali, Guilherme Lopes, Enio, Bruno Soares,
Bruno Montoani, Silvio Ramos, Amanda, Evanise, Willian. Além daqueles que
contribuíram de forma direta e indireta para a realização desse trabalho.
MUITO OBRIGADO!
Sonhem...
Sonhem alto...
Mas lembrem-se que...
O que torna irrealizável um sonho, não é o sonho em si;
Mas sim, a inércia de quem sonha.
Alfredo Scheid Lopes
RESUMO
Nos últimos anos, há crescente preocupação de pesquisadores quanto à
qualidade nutricional dos produtos agrícolas colhidos, em decorrência do
incremento da produção de grãos e diminuição dos teores de nutrientes e outros
elementos nos mesmos. Como consequência, observa-se uma baixa qualidade
nutricional dos produtos que compõem a dieta básica da população,
principalmente em países em desenvolvimento. Diante desse cenário, justifica-se
o interesse pelos estudos da biofortificação, pois a desnutrição e a deficiência de
micronutrientes são dois dos maiores desafios agrícolas do século. O presente
trabalho foi dividido em dois artigos, o primeiro trabalhou-se com “seedlings”
de 20 acessos de trigo e, cujos objetivos foram: (i) avaliar os efeitos da aplicação
de Fe, Zn e Se, no crescimento e acúmulo de nutrientes; (ii) estudar os efeitos
dos tratamentos e suas interações com os demais nutrientes e (iii) definir
potenciais linhagens a serem utilizadas para biofortificação agronômica. Já no
segundo artigo, trabalhou-se com plantas de trigo, 20 acessos, até a produção de
grãos e objetivou-se: (i) avaliar os efeitos das aplicações de Zn e Zn+Se, nos
parâmetros agronômicos e teores de nutrientes, (ii) avaliar os efeitos dos
tratamentos e suas interações com outros nutrientes em parte aérea e grãos e, (iii)
com base nos resultados anteriores, definir quais os acessos são mais indicados
para estudos de campo, visando a biofortificação. Como resultados, de forma
geral, verificou-se que o germoplasma brasileiro mostrou-se diversificado e com
potencial para o melhoramento genético e agronômico, para o enriquecimento
com esses elementos. Os teores dos elementos aumentaram na parte aérea e
grãos de trigo, mas vale ressaltar que há diferentes respostas dos acessos, devido
à sua genética. Ademais, tanto em “seedlings” como em grãos, a aplicação de
selenito mostrou-se mais restritiva ao crescimento e desenvolvimento desses
germoplasmas de trigo que a de selenato, indicando que, para a biofortificação
da cultura do trigo, o melhor seria a utilização de fontes ligadas ao selenato.
Além disso, para o primeiro trabalho, verificou-se que as plantas foram mais
susceptíveis quando submetidas a doses de 150 µM de Fe, no entanto
incrementos foram observados em todos os acessos tratados com Zn. Como
recomendação para biofortificação com Fe são indicados os acessos: EMB 14;
EMB 34; EMB 38 e BRS 264; para Zn os acessos mais recomendados são:
EMB11; EMB 20; EMB 38 e BRS 264; e para Se os acesso indicados seriam:
EMB 10; EMB 14; EMB 38 e BRS 264. Para o segundo experimento,
considerando-se os parâmetros agronômicos, acúmulo de nutrientes e a interação
entre eles, os acessos recomendados seriam: BRS 207; BRS 254; BRS 264;
EMB 19 e EMB 33 para biofortificação com Zn e os acessos: Brilhante, BRS
264; Supera EMB 7; EMB 20; EMB 26; EMB 30 e EMB 33 para Zn+Se.
Entretanto, ressalta-se que cada espécie apresenta uma resposta a determinado
nutriente e/ou elemento, experimentos envolvendo outras culturas e espécies que
compõem a dieta de populações são recomendados para desenvolvimento dessa
técnica e amenização de problemas relacionados à segurança alimentar.
Palavras-chave: Micronutrientes. Segurança alimentar. Variabilidade genética.
Selenato. Selenito.
ABSTRACT
In recent years, there is a growing concern about the nutritional quality
of agricultural harvests, because selected approaches for grain production
increase have resulted in a decrease of nutrients levels in many crops. As a
consequence, there is a low nutritional quality of the products that are staple diet
compounds of the population, especially in developing countries. This scenario
justifies the current global interest on biofortification studies, as malnutrition
and micronutrient deficiency are two of the greatest challenges of the century.
This study was divided into two experiments, the first worked with 20 wheat
accessions in seedlings stage and whose objectives were: (i) evaluate the effects
of Fe, Zn and Se applications on growth and nutrient concentration; (ii) to study
the effects of treatments and their interactions with other nutrients and; (iii)
define potential accessions to be used for agronomic biofortification. In the
second experiment we worked with wheat plants, 20 accessions, until the mature
grain and aimed: (i) to evaluate the effects of Zn and Zn+Se addition in the
agronomic parameters and nutrient accumulation in shoot and grain; (ii) to study
treatment effects and their interactions with other nutrients in shoot and grain,
and; (iii) based in the previous results, define which access is most suitable for
field studies aimed at biofortification. As a result, in general, it was found that
the Brazilian germplasm showed to be diverse and presented a great potential for
genetic and agronomic enrichment with these elements. The content of the
elements increased in wheat shoots and grains, but it is noteworthy that there are
different responses of access due to their genotypic variation. In addition, for
both seedlings and grains, the application of selenite was more restrictive to
wheat growth and development than selenate. This result indicated that for
biofortification of wheat crop it would be best to use selenate sources.
Furthermore, for the first work, we found that wheat seedlings in general were
less tolerable to high Fe exposure (150 µM), but benefits from increased level of
Zn supply. In consideration of the nutrient concentration, plant growth and the
interaction with other nutrients for the potential of increasing nutrient contents in
grains among these wheat lines, EMB 14, EMB 34, EMB 38 and BRS 264
appeared to be appropriate for a biofortification program with Fe; many lines
such as EMB 11, EMB 20, EMB 38 and BRS 264 for Zn; and EMB 10, EMB
14, EMB 38 and BRS 264 for Se. For the second experiment, taking into
consideration the agronomic parameters, nutrient content, and potential of
increasing nutrients in these wheat lines we indicate the accessions BRS 207;
BRS 254; BRS 264; EMB 19 and EMB 33 for biofortification with Zn; many
lines such as Brilhante; BRS 264; EMB 7; EMB 26 and EMB 30 appeared to be
appropriate for Zn+SeO4; and Brilhante; BRS 254; Supera; EMB 20 and EMB
33 for Zn+SeO3. However, as each species has a specific response to nutrient
and / or element, experiments involving other cultures and species that are staple
food are recommended for developing this technique in order to overcome
current issues related to food safety.
Keywords: Micronutrients. Food security. Genetic variability. Selenate. Selenite.
SUMÁRIO
1
2
2.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.4
2.5
2.5.1
2.5.2
2.5.3
2.6
3
PRIMEIRA PARTE
INTRODUÇÃO ..............................................................................
REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................
Por que biofortificar plantas? .......................................................
Zinco (Zn) em solos, plantas e humanos: um histórico de
deficiências ......................................................................................
O Zn nos solos .................................................................................
O Zn nas plantas: teores, mecanismos de absorção e atuação ....
O Zn e seus efeitos na nutrição humana .......................................
Selênio (Se) em solos, plantas e humanos: uma potencial
preocupação ....................................................................................
O Se nos solos .................................................................................
O Se nas plantas: teores, mecanismos de absorção e atuação.....
O Se e seus efeitos na nutrição humana .......................................
Interações Zn x Se em plantas, humanos e animais ....................
Ferro (Fe) em solos, plantas e humanos: os problemas além do
solo ....................................................................................................
O Fe nos solos ..................................................................................
O Fe nas plantas: teores, mecanismos de absorção e atuação ....
O Fe e seus efeitos na nutrição humana ........................................
A cultura do trigo ...........................................................................
CONSIDERAÇÕES GERAIS .......................................................
REFERÊNCIAS .............................................................................
SEGUNDA PARTE – ARTIGOS
ARTIGO 1 Evaluation of germplasm effect on Fe, Zn and Se
content in wheat seedlings ...............................................................
ARTIGO 2 Evaluation of zinc and selenium supplementation and
their interaction in wheat plants and grain ………………………...
14
17
17
20
20
21
24
25
25
27
28
30
31
31
32
34
35
38
40
50
79
14
PRIMEIRA PARTE
1 INTRODUÇÃO
A crescente produção de alimentos para satisfazer o consumo mundial
fez com que a busca por produtividade elevada resultasse, em alguns casos, na
perda de qualidade nutricional, principalmente após a Revolução Verde.
Portanto, surge um novo desafio para a agricultura que consiste em melhorar a
qualidade nutricional dos alimentos visando à nutrição humana, principalmente,
quanto aos micronutrientes, ferro (Fe), zinco (Zn) e selênio (Se). Embora a
produção de alimentos tenha acompanhado o crescimento populacional,
problemas de deficiências nutricionais atingem grande parte da população
mundial, especialmente mulheres grávidas, adolescentes e crianças.
Estima-se que, aproximadamente, um terço da população sofra com
algum risco de deficiência de Fe e que, quase a mesma proporção, pode ser
deficiente em Zn. Segundo a Organização da Nações Unidas, além das
supracitadas, as deficiências de iodo (I), Se e vitamina A são as que causam
maior preocupação em países em desenvolvimento. A principal razão é que,
nesses países, a maioria das pessoas possuem uma dieta composta por alimentos
de origem vegetal. Além disso, a biodisponibilidade dos minerais nos vegetais é,
geralmente, baixa quando comparadas aos alimentos de origem animal. Desse
modo, surge a necessidade de novas estratégias para promover aumentos nos
teores e/ou biodisponibilidade de micronutrientes em alimentos. Aumentar os
teores de nutrientes em culturas como arroz, trigo, milho, soja e feijão seria um
grande passo para a solução do problema, já que essas culturas são as principais
fontes desses nutrientes em muitas populações que se encontram sob algum tipo
de risco de deficiência nutricional.
Nutrição de plantas e saúde humana são temas de elevada interface e não
devem ser analisados isoladamente. A grande maioria dos elementos
15
comprovadamente essenciais aos homens e aos animais também desempenha
funções importantes no metabolismo vegetal e, em muitos casos, seus
mecanismos de ação são similares. A escolha desse tema se deve ao fato de que
pesquisadores em Ciência do Solo, aliados a outras ciências, podem e devem
produzir alimentos com qualidade e em quantidade, por meio de novas técnicas,
mantendo a sustentabilidade do solo e suprindo as demandas da sociedade.
Nos últimos 100 anos, a agricultura brasileira apresentou grande
desenvolvimento, obtendo expressivos aumentos em produtividade. Tal fato, só
foi possível devido às inovações tecnológicas, as pesquisas e a difusão das
mesmas. Sem desmerecer outros fatores, as pesquisas em fertilidade do solo,
principalmente as de uso eficiente de corretivos e fertilizantes, se destacam entre
as mais importantes. No entanto, solos do Brasil possuem baixa fertilidade
natural, decorrente da gênese do solo e alto grau de intemperismo que ocorre nas
regiões tropicais. Como consequência, reporta-se a baixa disponibilidade de
nutrientes (e.g. nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, boro e Zn) e,
portanto, sérias limitações à produção de alimentos nessas áreas. Apenas como
exemplo, o uso adequado de corretivos e fertilizantes correspondem a um
aumento de 50% na produção e produtividade. Por isso, intervenções no sistema,
por meio do manejo da fertilidade do solo se faz necessário para o adequado
suprimento das plantas, com esses nutrientes, e a consequente garantia de
elevadas produtividades. Adicionalmente, a adição de fertilizantes pode
aumentar os teores de nutrientes nas plantas e, portanto adicionar quantidades
maiores dos mesmos na cadeia alimentar.
A cultura do trigo possui grande importância nas dietas. Estima-se que,
cerca de 30% da população mundial, alimenta-se com algum produto derivado
dessa cultura e, portanto, estudos que a envolvam são fundamentais para o
desenvolvimento agrícola e sustentável de países como o Brasil. Ressalta-se, que
mesmo importando quase 50% do trigo, o governo brasileiro tem estimulado
16
pesquisas e incentivando produtores a aumentarem as áreas cultivadas visando à
autossuficiência do país com esse grão. As interações entre micronutrientes
podem afetar a absorção e a biodisponibilidade, por uma série de fatores. Os
elementos em estudo, Se e Zn, não pertencem ao mesmo grupo periódico e nem
competem pela absorção das plantas, mas será que há interação entre eles?
Haverá efeito sinérgico para absorção de plantas? É possível biofortificar essas
culturas, com esses elementos?
Sabe-se que pesquisas envolvendo variação genética de espécies
cultivadas e biofortificação ainda são escassas e diante disso, para tentar
responder a algumas dessas questões, objetivou-se, neste trabalho], avaliar o
efeito de Zn e Se, bem como a interação entre esses elementos, em
germoplasmas brasileiros de trigo.
17
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Por que biofortificar plantas?
As plantas são o começo da cadeia alimentar e aumentos na absorção de
nutrientes e seus acúmulos no tecido vegetal promovem melhorias nas dietas
animais e humanas (PALMGREN et al., 2008). A dieta considerada adequada
para seres humanos é composta por, pelo menos, 22 nutrientes, sendo a maior
parte desses fornecida por vegetais, principalmente cereais que, se produzidos
em áreas deficientes, produzem grãos com teores inadequados e/ou
desbalanceados para a ingestão humana ou animal (ALLOWAY, 2009; WHITE;
BROADLEY, 2005, 2009). Por si só, essa seria uma boa razão para intensificar
os estudos de biofortificação, seja ela genética ou agronômica.
A produção sustentável de alimentos seguros e nutritivos é um objetivo
da agricultura moderna. Contudo, nos últimos anos, esforços se concentraram
em aumentar a produtividade das culturas. Porém, a qualidade das mesmas foi
deixada de lado e a concentração de minerais tornou-se relevante, pois grande
parte da população mundial sofre com a desnutrição e deficiência de ferro (Fe),
zinco (Zn), selênio (Se), iodo (I) e vitamina A (WELCH; GRAHAM, 2002;
WHITE; BROADLEY, 2009; WORLD HEALTH ORGANIZATION - WHO,
2002). Zhang et al. (2012) afirmam que o aumento em produtividade, sem
qualidade nutricional, pode agravar a desnutrição. A explicação seria a baixa
concentração de determinados nutrientes no grande volume produzido
(GARVIN; WELCH; FINLEY, 2006; ZHANG et al., 2012). Para exemplificar,
pela Figura 1, apresentam-se os efeitos do aumento de produtividade e a
diminuição nos teores de Fe e Zn, em plantas de trigo e a variação nos teores de
Fe, Zn e Se, nos últimos 100 anos (GARVIN; WELCH; FINLEY, 2006).
18
Figura 1 A) Teores de Fe e Zn em plantas de trigo em função da produtividade;
B) Teores de Fe, Zn e Se, em plantas de trigo, nos últimos 100 anos.
Adaptado de Garvin, Welch e Finley (2006).
A biofortificação é o processo pelo qual ocorre o aumento do teor de
nutrientes, em produtos agrícolas a serem colhidos e/ou posterior a essa etapa, na
industrialização, visando o enriquecimento do produto final com determinado
elemento (GÓMEZ-GALERA et al., 2010; WELCH, 2005; WHITE;
BROADLEY, 2005). Culturas biofortificadas podem conter características
agronômicas e nutricionais melhores em relação às que não passaram por esse
processo (WELCH; GRAHAM, 1999). A biofortificação faz sentido, pois é
parte de um enfoque que considera um sistema alimentar integrado, visando
19
reduzir a desnutrição e tem como alvo a população mais necessitada. É
cientificamente viável e efetiva em termos de custos, 20 dólares por pessoa,
além de complementar outras intervenções para o controle das deficiências de
Fe, Zn, I, Se e vitamina A. Ainda, devem-se considerar os benefícios
(viabilidade, vigor das mudas, estandes mais uniformes, melhor uso da água e
mais resistência a doenças) e retornos econômicos aos produtores (BOUIS et al.,
2011; BOUIS; WELCH, 2010; WELCH, 2005). É, portanto, o primeiro passo
que possibilitará uma melhoria na nutrição e saúde de famílias carentes de
maneira sustentável (HARVASTPLUS, 2004). Para aumentar os teores de
nutrientes em plantas, é preciso compreender os processos fisiológicos e
moleculares que fundamentam os estudos em Nutrição Mineral de Plantas
(CAKMAK, 2008; GRUSAK, 2002; WHITE; BROADLEY, 2009).
A fortificação industrial bem como a suplementação por meio de
medicamentos tem sido um dos melhores processos para o controle de
deficiências de micronutrientes em crianças, em todo o mundo. No entanto, os
altos custos e riscos de intoxicações causados por uma superdose são maiores
nesse caso (ZANCUL, 2004).
O restrito acesso das populações aos alimentos ricos em micronutrientes,
a presença em proporções inadequadas de inibidores e antinutrientes nas dietas,
além da baixa biodisponibilidade dos minerais, são causas atribuídas às
deficiências desses elementos na população (FOOD AND AGRICULTURE
ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS - FAO, 2000; LONG; BA;
SMITH, 2004). Estima-se que três bilhões de pessoas apresentam alguma
deficiência de Fe, Zn, I, Se e vitamina A (GRAHAM; WELCH; BOUIS, 2001;
WHO, 2002). De acordo com o Copenhagen Consensus 2008, deficiências de
Zn e vitamina A são e devem ser tratadas como prioridades em países em
desenvolvimento (www.copenhagenconsensus.com). Portanto, esses elementos
estão como prioridades no combate à desnutrição humana (GRAHAM;
20
WELCH; BOUIS, 2001). Outros minerais, como cálcio (Ca), magnésio (Mg) e
cobre (Cu) podem ser deficientes na dieta de algumas populações (WELCH;
GRAHAM, 2004; WHITE; BROADLEY, 2005).
O Brasil ainda não possui resultados confiáveis sobre tal assunto, além
disso, as diferenças econômica e social entre as pessoas que aqui vivem,
dificulta um estudo mais abrangente que correlacione toda a população nacional.
Assume-se que a deficiência de Fe é a mais generalizada, principalmente entre
crianças e gestantes, além disso, as deficiências de Zn e Se devem ser
semelhantes ao padrão internacional, ou seja encontram-se deficientes
(MORAES, 2008).
2.2 Zinco (Zn) em solos, plantas e humanos: um histórico de deficiências
2.2.1 O Zn nos solos
O Zn é um metal de transição com número atômico 30, pertencente ao
grupo II B, da tabela periódica. É o 23º elemento mais abundante na crosta
terrestre e apresenta-se sob a forma Zn+2, sendo adsorvido na superfície das
partículas do solo com argilas, matéria orgânica e óxidos de Fe (MALAVOLTA,
2006). Os teores médios desse elemento nos solos encontram-se entre 60 e 89
mg kg-1 (BROADLEY et al., 2007; KABATA-PENDIAS, 2011). Contudo, os
valores na solução do solo são baixos e estão diretamente relacionados com a
textura do solo, pH, matéria orgânica, atividade microbiana e concentrações de
fósforo e elementos catiônicos (ALLOWAY, 2009).
Os valores naturais de Zn, nos solos, variam de acordo com a rocha de
origem e de fontes de deposições, tais como vulcões, queimadas naturais e
deposição de poeira. Contudo, as atividades antropogênicas e o cultivo
continuado desses solos têm aumentado de forma considerável os teores de Zn
21
nos mesmos (ALLOWAY, 2008; BROADLEY et al., 2007). Além disso, é
sabido que práticas agrícolas podem aumentar os teores de Zn nos solos (e.g.
adubação, calagem, rotação de culturas, cultivo mínimo e plantio direto), embora
outras, tais como calagem e adubação fosfatada possam agravar a deficiência
(GRAHAM et al., 2007). Rassalta-se que outros fatores podem afetar a
disponibilidade de Zn nos solos, como por exemplo: a faixa de disponibilidade
de Zn encontram-se entre pH 5,0 e 6,0; solos arenosos apresentam menor poder
tampão, portanto se receberem doses de corretivos e o pH for elevado a 6,0,
pode-se desenvolver deficiência;
pode ocorrer a imobilização de Zn pela
matéria orgânica, colóides do solo e por microrganismos; baixas temperaturas e
excesso de umidade podem agravar a deficiência, no entanto os sintomas
desaparecem posteriormente (ABREU; LOPES; SANTOS, 2007; LOPES, 1999;
LOPES; GUILHERME, 1994). Embora as melhorias no manejo dos solos
tenham sido adotadas pelos agricultores, estima-se que 50% dos solos cultivados
com grãos são deficientes em Zn (ALLOWAY, 2008, 2009).
Adicionalmente, solos de regiões tropicais possuem alta fixação de P, do
que resulta a necessidade do uso de adubações fosfatadas corretivas, que podem
induzir à deficiência de Zn (ALLOWAY, 2009; LOPES, 1999; RAIJ, 2004).
Recentemente, tem-se atribuído grande importância à inibição não competitiva e
interações entre P e Zn em solos, onde incrementos na adubação de P induzem
ao sintoma de deficiência de Zn nas folhas. Contudo, há um efeito de diluição de
Zn nas plantas, que ocorre devido à maior produção de matéria seca provocado
pelo acréscimo de P (ALLOWAY, 2009; KABATA-PENDIAS, 2011;
MALAVOLTA, 2006).
2.2.2 O Zn nas plantas: teores, mecanismos de absorção e atuação
22
A essencialidade de Zn para as plantas foi determinada em 1926 em
estudo realizados com plantas de beterraba e girassol (SOMMER; LIPMAN,
1926).
O Zn é o segundo elemento mais encontrado nos organismos e o único
metal a participar dos seis grupos enzimáticos (BROADLEY et al., 2007).
Devido a essas características, está envolvido na síntese dos ácidos nucléicos,
DNA e RNA, sendo ainda um cofator enzimático que atua nos mecanismos de
transcrição que compõem enzimas essenciais para o crescimento e diferenciação
celular (HÄNSCH; MENDEL, 2009; MAYER; PFEIFFER; BEYER, 2008).
Sendo assim, o Zn é um elemento crucial para vários processos metabólicos na
planta, tais como a fotossíntese, síntese proteica, manutenção da integridade da
membrana, metabolismo de auxina e reprodução. Além disso, atua na redução a
formação de radicais livres por atuar em inibidores como a NADPH oxidase,
indutor da metalotioneína, integrante da Cu-Zn-SOD, entre outras (CAKMAK,
2000; HÄNSCH; MENDEL, 2009; MAYER; PFEIFFER; BEYER, 2008).
A absorção de Zn pelas plantas é feita na forma de Zn+2, contudo ainda
discute-se se a absorção é passiva ou ativa, embora trabalhos relatem que a
absorção
do
elemento
é
feita
metabolicamente
(ALLOWAY,
2008;
MALAVOLTA, 2006). A concentração desse nutriente nas plantas varia
conforme a espécie, contudo os teores para a maioria das espécies variam de 20
a 120 mg kg-1 de matéria seca (MALAVOLTA, 2006). Os teores foliares
considerados adequados para as cultivares nacionais de trigo variam entre 20 e
40 mg kg-1 (MALAVOLTA, 2006; MALAVOLTA; VITTI; OLIVEIRA, 1997).
Scheeren et al. (2011) avaliaram 180 cultivares de trigo em três locais e
verificaram que os teores médios desse elemento nos grãos foi de 32 mg kg-1,
sendo a faixa de variação entre 21 e 55 mg kg-1.
Os sintomas típicos da deficiência são relatados como encurtamento de
internódios e produção de folhas novas pequenas, cloróticas e lanceoladas. Os
23
sintomas de toxidez são raros e, no geral, são reportados como sendo diminuição
da área foliar, seguida de clorose (MALAVOLTA, 2006; MALAVOLTA;
VITTI; OLIVEIRA, 1997). Assim como descrito anteriormente, o pH,
adubações com P, baixos teores de Zn e elevadas concentrações de elementos
catiônicos são fatores limitantes à absorção do Zn, promovendo a deficiência
desse em plantas.
O efeito da deficiência de Zn, em solos e plantas, ocorre em todo o
mundo. Contudo, estudos evidenciam a resposta de plantas quando adubadas
com Zn (CAKMAK, 2008; GRAHAM; WELCH; BOUIS, 2001), que varia de
acordo com a espécie e genótipo (ALLOWAY, 2008; CAKMAK, 2008).
Segundo os autores, genótipos eficientes conseguem absorver Zn de solos com
baixos teores, produzindo mais matéria seca e grãos. Por outro lado, plantas
cultivadas em solos deficientes nesse elemento podem ter sua produtividade
reduzida drasticamente (ALLOWAY, 2008).
Plantas de trigo durum, cultivadas em solos com baixos teores de Zn
disponíveis, apresentaram menores concentrações que plantas cultivadas em
locais onde a disponibilidade desse nutriente era maior (CAKMAK; PFEIFFER;
MCCLAFFERTY, 2010). A aplicação de Zn foliar e/ou no solo, em trigo,
aumentou a produtividade e elevou os teores desse nutriente nos grãos de 11
para 22 mg kg-1; a combinação Zn foliar e aplicação no solo elevaram os teores
para 27 mg kg-1 (CAKMAK et al., 2010). Hussain et al. (2012) verificaram que a
aplicação de Zn em solos aumentou a produção de grãos, a concentração de Zn
nos grãos e a bioacessibilidade em 29%, 95% e 74% respectivamente. Os
autores observaram que aplicações foliares e em solos, em diferentes épocas perfilhamento e início do florescimento -, podem aumentar os teores de Zn nos
grãos, contudo, quando aplicado no solo esses teores foram inferiores a 9 mg kg1
de Zn.
24
2.2.3 O Zn e seus efeitos na nutrição humana
A essencialidade do Zn em humanos foi determinada em 1955, ao se
relacionarem problemas cutâneos à decorrente deficiência de Zn (MAFRA;
COZZOLINO, 2004). Tal qual ocorre para plantas, o Zn é essencial para o
organismo de animais, incluindo o homem, desempenhando funções metabólicas
e fisiológicas para o crescimento e desenvolvimento normal dos organismos. O
Zn atua como agente anti-inflamatório, no sistema oxidativo, prevenindo
doenças como: câncer, distúrbios neurológicos e doenças autoimunes. Além
disso, estudos mais aprofundados relacionados à deficiência de Zn, bem como
sobre a forma de suplementação com esse elemento, são necessários (CESAR;
WADA; BORGES, 2005; JOMOVA; VALKO, 2011; MAFRA; COZZOLINO,
2004).
Em países em desenvolvimento, a deficiência de Zn está listada como o
quinto fator de risco para a saúde humana, logo após o tabagismo, e no mundo
encontra-se na 11ª posição (WHO, 2002). Em geral, cerca de 1,4% das mortes
no mundo são atribuídas à carência de Zn, sendo 1,4% nos homens e 1,5% nas
mulheres (WHO, 2006). Contudo, as informações a respeito da deficiência de
Zn, em âmbito mundial, ainda são escassas e não muito precisas (HESS et al.,
2009).
No Brasil, os valores diários de ingestão para adultos correspondem a 11
e 8 mg dia-1, respectivamente para homens e mulheres (MAFRA; COZZOLINO,
2004). De acordo com os dados da Pesquisa de orçamentos familiares 2008-209
(POF 2008-2009), há uma prevalência de inadequação de 24% para homens e
22% para mulheres. Vale ressaltar que esses valores foram determinados em
função de hábitos alimentares da população nacional. No entanto, os valores
relacionados a Zn foram obtidos a partir de dados norte-americanos e da tabela
25
brasileira de composição de alimentos (INSTITUTO BRASILEIRO DE
GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA - IBGE, 2011).
Os três fatores responsáveis pela deficiência de Zn, em países de baixa
renda, são a ingestão inadequada na dieta ou uma dieta composta,
principalmente, de vegetais. Outros fatores podem agravar essa deficiência,
principalmente em crianças onde há amamentação com baixa quantidade de
nutrientes e sob o risco de doenças, que induzem a perdas excessivas ou
prejudicam a utilização de Zn em estados fisiológicos, como o crescimento, a
infância e a gravidez (HESS et al., 2009; MAFRA; COZZOLINO, 2004). É
sabido que Zn e cádmio (Cd) possuem interações em solos, plantas e animais, no
entanto, autores divergem a respeito se essas são sinérgicas ou antagônicas
(KABATA-PENDIAS, 2011). Dados recentes mostram que pessoas que
apresentam baixa renda, são fumantes e/ou encontram-se em contato com a
fumaça desses cigarros são mais susceptíveis à intoxicação por Cd (TYRRELL
et al., 2013). No entanto, com uma diversificação alimentar e incrementos de
alimentos com maiores teores de Zn, pode ocorrer uma menor toxidez causada
pelo Cd, em parte da população, devido ao antagonismo entre Zn e Cd.
2.3 Selênio (Se) em solos, plantas e humanos: uma potencial preocupação
2.3.1 O Se nos solos
O Se pertence ao grupo dos calcogênios (grupo 16 da tabela periódica) e
está naturalmente presente sob 5 formas de oxidação (FERNÁNDEZ
MARTÍNEZ; CHARLET, 2009; ZHANG et al., 2008). Os teores disponíveis
desse elemento nos solos são baixos, na faixa de 0,05 e 1,5 mg kg-1. Entretanto,
áreas seleníferas podem apresentar concentrações acima de 1.200 mg kg-1
(KABATA-PENDIAS, 2011).
26
Assim como relatado para o Zn, os teores de Se no solo são controlados
principalmente pelo material de origem. Contudo, outros fatores como pH,
potencial redox, a forma química ou espécies de Se, a textura e mineralogia do
solo, o teor de matéria orgânica e a presença de íons competitivos exercem
influência nesses teores (KABATA-PENDIAS, 2011; QIN; ZHU; SU, 2012). Os
aumentos nas concentrações de Se nos solos ocorrem devido a deposições
atmosféricas, principalmente em áreas litorâneas e com altas atividades
vulcânicas, volatilização e queima de vegetação selenoferrosas e atividades
antropogênicas, tais como industrialização e aplicações via fertilizantes
(KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001). O principal programa de fertilização
de Se, em solos, ocorreu entre os anos de 1984 a 1990 na Finlândia onde, em
área de produção de grãos, foram aplicadas, via fertilizante, doses anuais de 8 g
ha-1 e 3 g ha-1 de selenato de sódio para produção de grãos e pastagens,
respectivamente (ARO; ALFTHAN; VARO, 1995).
Em condições naturais, as principais formas de Se são o selenito (Se+4) e
selenato (Se+6). O primeiro é adsorvido na superfície das partículas do solo com
maior afinidade que o segundo, especialmente em baixo pH e na presença de
óxido de Fe e matéria orgânica. Dessa forma, o selenito é menos biodisponível
que o selenato, sendo esse mais solúvel, móvel e facilmente disponibilizado para
a absorção de plantas em solos neutros a alcalinos (KABATA-PENDIAS, 2011).
Estima-se que as formas de Se adsorvidas pelo solo ficam na faixa de 15
a 40% do seu teor total e que o Se orgânico varia de 4 a 22% do teor total
(KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001). A adsorção de Se em solos pode ser
reduzida por fosfatos e sulfatos, especialmente em solos ricos em óxidos de Fe e
Mn (KABATA-PENDIAS, 2011; KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001).
Os teores de Se em solos brasileiros são baixos, o que pode evidenciar a
carência desse elemento em algumas regiões do país (FERREIRA et al., 2002).
Para determinar os teores de Se em solos de cerrado de Minas Gerais e Goiás,
27
sob vegetação nativa (n=90) e duas profundidades (0-20cm e 80-100cm),
Carvalho (2011) verificou que os teores desse elemento variaram entre <22 a 81
µg kg-1. Vale ressaltar que esse bioma corresponde a 23% da área total do país e
onde se concentram as principais áreas agrícolas do país. Em amostras de solos
coletadas no estado de São Paulo (n=58), camada de 0-20cm, Gabos (2012)
verificou que os teores de Se nesses solos variaram entre <0,08 a 1,61 mg kg-1,
sendo que a média ficou próxima a 0,19 mg kg-1 de Se.
2.3.2 O Se nas plantas: teores, mecanismos de absorção e atuação
Para plantas, o Se não tem sua essencialidade comprovada, no entanto,
há extensos relatos a respeito do seu efeito benéfico. Encontram-se, por
exemplo, estudos relatando que, em baixas concentrações, esse elemento pode
aumentar a atividade antioxidande nas plantas, levando a uma maior produção e
produtividade (DJANAGUIRAMAN et al., 2005; LI; MCGRATH; ZHAO,
2008; RAMOS et al., 2010).
O Se do solo determina a sua concentração em grãos e tecidos vegetais
(LI et al., 2008). Apesar disso, a quantidade de Se nos solos e nas culturas
depende de uma série de fatores como, por exemplo, geológicos, geográficos,
pH do solo, potencial redox, matéria orgânica, competições iônicas - como
ocorre com o sulfato - umidade, temperatura e textura do solo (CUBADDA et
al., 2010). Aliás, tanto a absorção quanto o acúmulo desse pelas plantas não
dependem apenas do teor no solo, mas também da forma com que o elemento se
encontra (LI et al., 2008). O Se é absorvido pelas plantas tanto na forma de
selenito como de selenato. A absorção do primeiro se dá de forma passiva e,
provavelmente, os transportadores de fosfato estão envolvidos, enquanto o
selenato é absorvido de forma ativa e utiliza os transportadores de sulfato nos
processos (LI; MCGRATH; ZHAO, 2008; ZHU et al., 2009).
28
As culturas respondem diferentemente à adubações com selenato e
selenito. Para a maioria das culturas, o selenato apresenta aspectos menos tóxico
que o selenito (LI; MCGRATH; ZHAO, 2008; ZHU et al., 2009). Aplicações de
Se em vasos com solo na forma de selenato de sódio, em doses maiores que 2,6
mg kg-1, mostraram-se tóxicas para o trigo, pois reduziram o crescimento em
10%, quando comparadas com a dose controle de 2,0 mg kg-1 (LYONS;
STANGOULIS; GRAHAM, 2005). A aplicação de um grama de Se por hectare,
em solos do Reino Unido, aumentou a concentração de 16 para 26 ng kg-1 de Se
em grãos de trigo (BROADLEY et al., 2010). Segundo os autores, a aplicação
de 10 g de Se por hectare aumentaria em 10 vezes a concentração de Se nos
grãos de trigo, considerando-se os níveis atuais nos solos da Grã-Bretanha.
Aplicações foliares na Austrália - até 330 g ha-1 de Se - não foram tóxicas para o
trigo (LYONS et al., 2005). No entanto, Ducsay e Ložek (2006) afirmam que a
dose de 10 g ha-1 de Se é suficiente para se elevar a níveis satisfatórios os teores
desse elemento, para a cultura do trigo.
Devido à sua importância e essencialidade para humanos, aplicações de
Se, visando a biofortificação agronômica de plantas, têm sido amplamente
difundidas na literatura, nos últimos anos (LYONS, 2010; LYONS et al., 2005;
LYONS; STANGOULIS; GRAHAM, 2003).
2.3.3 O Se e seus efeitos na nutrição humana
Ao contrário do que acontece para as plantas, o Se é essencial para
animais e humanos. Sua essencialidade foi comprovada em 1957, quando esse
promoveu a defesa hepática de ratos deficientes em vitamina E (ZENG, 2009).
O Se presente na dieta animal, incluindo a do homem, tem sua origem nos
vegetais e grãos, seja pelo consumo “in natura” ou pelo consumo de carnes
(BITTERLI; BAÑUELOS; SCHULIN, 2010).
29
Estima-se que 15% da população mundial seja deficiente em Se e a
principal razão é a baixa ingestão desse nutriente (WHITE; BROADLEY, 2005).
Portanto, é grande o interesse de pesquisadores em estudos envolvendo esse
nutriente e seus efeitos para a saúde humana, atualmente. Sabe-se que o Se atua
como cofator enzimático e no controle da eliminação de radicais peróxidos do
organismo. Além disso, possui atividades anti-inflamatórias, químio-preventivas
e antivirais (PAPPAS et al., 2008).
A baixa ingestão de Se está ligada ao desenvolvimento de doenças
cardiomiopáticas (doença de Keshan-Beck), hipotireoidismo e redução da
atividade do sistema imunológico. No geral, essas doenças são relatadas em
áreas onde as concentrações desse elemento nos solos são baixas, como China,
Tibete e Sibéria (ELLIS; SALT, 2003; ZENG, 2009). Ademais, a suplementação
com Se diminuiu a incidência de câncer de colo, próstata e pulmão. Contudo,
mais estudos são necessários para que se comprove uma correlação entre o Se e
o câncer em humanos (WHANGER, 2002). Por outro lado, o Se tornou-se
conhecido por seus efeitos tóxicos em animais e humanos (ELLIS; SALT, 2003;
FORDYCE et al., 2010).
No Brasil, não existem levantamentos sobre a deficiência de Se na
população, mas reporta-se que os teores ingeridos sejam baixos em relação ao
padrão internacional (MORAES, 2008). No entanto, a POF 2008-2009 inferiu,
para esse nutriente, os níveis de ingestão diários para adultos e os valores
encontram-se entre 98 e 76 µg dia-1, respectivamente para homens e mulheres.
Assim como acontece para Zn, os teores de Se na POF 2008-2009 foram
determinados a partir da ingestão média desse elemento em função dos hábitos
alimentares e nos teores desse elemento presentes na base de dados norteamericana (IBGE, 2011). Para o Se, esses dados têm que ser analisados com
certa ressalva, pois os teores desse elemento na alimentação entre os dois países,
são muito diferentes. A ingestão diária recomendada de Se deve ser 55 µg dia-1,
30
contudo, concentrações inferiores a 25 µg dia-1 têm sido reportadas (ZENG,
2009). Portanto, para prevenção, indica-se a adição desse elemento em dietas,
via suplementação em sais inorgânicos, principalmente selenato de sódio, ou
formas orgânicas enriquecidas com Se (LYONS; STANGOULIS; GRAHAM,
2003; WANG et al., 2011). Além disso, vale ressaltar que a disponibilidade
desse nutriente pode variar de acordo com a forma mineral e/ou iônica (WANG
et al., 2011).
2.4 Interações Zn x Se em plantas, humanos e animais
Interações entre micronutrientes podem afetar a absorção e a
biodisponibilidade, por uma série de fatores. Elementos quimicamente
semelhantes podem concorrer por sítios de transporte de proteínas, mecanismos
de absorção e por compostos quelatizantes, facilitando ou não a absorção
(SANDSTRÖM, 2001). Embora não sejam quimicamente similares, Zn e Se são
essenciais para o bom funcionamento do organismo animal e realizam funções
semelhantes, a de antioxidantes (BETTGER, 1993).
Em humanos, a interações Zn x Se têm sido amplamente estudadas nas
áreas biomédicas (BLESSING et al., 2004; DANSCHER; STOLTENBERG,
2005). Blessing et al. (2004) estudando os efeitos de compostos de Se na
atividade de proteinas do DNA (“zinc fingers”), verificaram que essas proteínas
são altamente reativas com compostos oxidantes de Se, o que poderia afetar a
expressão gênica, reparação do DNA e, consequentemente, uma desestabilidade
genômica. Estudos revelam ainda que a metationeína é oxidada pela glutationa
peroxidase, com presença de formas orgânicas de Zn, sugerindo assim um
controle da reação redox por esse metal (JACOB; MARET; VALLEE, 1999).
Para animais, os efeitos de Zn, Se e a sua combinação (Zn x Se) foram
avaliados em ratos sob diabetes induzida e concluiu-se que a suplementação de
31
dietas com Zn, Se e a combinação Zn x Se aumentou o peso, facilitou a absorção
de glicose, preveniu o estresse oxidativo, reduziu a peroxidação lipídica e
preservou as funções hepáticas nos ratos (UKPERORO et al., 2010). Por outro
lado, House e Welch (1989) verificaram, em solução nutritiva, que em plantas
de trigo submetidas a doses de Zn e Se, os teores do primeiro não afetaram o
segundo e vice-versa. Os mesmos autores, ao estudarem a bioacessibilidade de
Zn e Se em ratos, alimentados com o trigo, verificaram que Se possui efeito
antagônico na absorção de Zn e o contrário também foi observado. A literatura
relata ainda que o Se inibe a taxa de crescimento de tumores de câncer em ratos,
contudo, a aplicação de ZnCl2 inibe o efeito protetor do Se contra os tumores
(NORDBERG; ANDERSEN, 1981; SCHRAUZER; WHITE; SCHNEIDER,
1976).
2.5 Ferro (Fe) em solos, plantas e humanos: os problemas além do solo
2.5.1 O Fe nos solos
O Fe é um metal de transição com número atômico 26, pertencente ao
grupo VIII, da tabela periódica. É o segundo metal mais importante e um dos
principais constituintes da crosta terrestre, sendo assim, o micronutriente com os
maiores teores em solos, em torno de 5% (KABATA-PENDIAS, 2011;
MALAVOLTA, 1980). No entanto, em solos brasileiros, esses teores podem
ultrapassar a 10%. Dessa forma, quando a deficiência de Fe aparece é devida a
uma diminuição da disponibilidade ou na absorção e não pela falta do elemento
(MALAVOLTA, 1980).
Em solos, está presente nas formas de materiais primários (e.g. silicatos,
óxidos e carbonatos), secundários e adsorvidos pela matéria orgânica ou argilas.
As concentrações na solução do solo são baixas e as formas predominantes são
32
Fe+2; Fe(OH)+2; Fe(OH)2+; Fe(OH)4- e Fe+3 (ABREU; LOPES; SANTOS, 2007).
De forma geral, a disponibilidade de Fe é maior em solos com baixo pH, sendo
que aumento de uma unidade de pH reduz a disponibilidade de Fe em 1000
vezes. Além disso, fatores como: baixos teores de Fe; presença de P, Cu, Mn e
Zn; matéria orgânica e encharcamento podem reduzir a disponibilidade desse
elemento (MALAVOLTA, 1980, 2006).
De certa forma, a coloração dos solos está relacionada com a presença
de óxidos de Fe. Por exemplo, as colorações amarelas em regiões temperadas se
devem a presença de goetita - óxidos mais hidratados, enquanto as cores
vermelhas, mais comuns em regiões áridas, são devidas à hematita – óxido não
hidratado (DECHEM; NACHTIGALL, 2006).
2.5.2 O Fe nas plantas: teores, mecanismos de absorção e atuação
A essencialidade de Fe para as plantas começou em 1844, quando
Eusèbe Gris observou que a aplicação de Fe reduziu a clorose em folhas de
parreirais. Apesar disso, a determinação desse critério foi feita em 1860 por
Julius von Sachs, em experimentos conduzidos em solução nutritiva
(ROMHELD; NIKOLIC, 2007).
A principal função do Fe é a de componente enzimático sendo que a
maioria participa de processos de oxirredução. Além disso, o Fe participa dos
dois principais grupos proteicos, as hemoproteínas onde participam de processos
da respiração (e.g. catalase, peroxidase, superóxido dismutase e citocromos) e
Fe-S proteínas, atuando em processos fotossintéticos
nitrogenase
e
sulfato
redutase)
(DECHEM;
(e.g. ferredoxina,
NACHTIGALL,
2006;
KOBAYASHI; NISHIZAWA, 2012; ROMHELD; NIKOLIC, 2007).
A absorção de Fe é feita sob as formas dos íons Fe+2, Fe+3 e quelatizado.
Contudo, a eficiência de absorção desse elemento está ligada à forma como ele
33
encontra-se presente em solos e na eficiência de raízes em reduzir o Fe+3 para
Fe+2
(MALAVOLTA,
2006).
Aparentemente,
esse
processo
é
feito
metabolicamente e há dois mecanismos diferentes envolvidos, um específico
para dicotiledôneas (Estratégia I) e outro para gramíneas (Estratégia II)
(BROADLEY et al., 2012; DECHEM; NACHTIGALL, 2006; KOBAYASHI;
NISHIZAWA, 2012). Ainda, elevadas concentrações de metais catiônicos (e.g.
Cu, Mn e Zn) podem reduzir a disponibilidade de Fe para as plantas devido à
inibição competitiva (BROADLEY et al., 2012; MALAVOLTA, 2006).
As concentrações desse elemento na planta variam de acordo com a
espécie, no entanto, para a maioria os teores encontram-se entre 10 a 1.500 mg
kg-1 de matéria seca (DECHEM; NACHTIGALL, 2006; KABATA-PENDIAS,
2011). Por se tratar de um elemento pouco móvel na planta, os sintomas típicos
de deficiência aparecem em folhas novas, as quais caracterizam-se por
apresentarem uma rede verde fina das nervuras sobre um fundo amarelo-claro. O
que é explicado pela baixa síntese de clorofila e, com a evolução dos sintomas,
as folhas podem apresentar um branqueamento (MALAVOLTA, 2006;
MARSCHNER, 1995).
Em decorrência dos elevados teores de Fe encontrados nos solos,
principalmente os brasileiros, problemas relativos à toxidez são mais comuns
que os de deficiências, sobretudo em solos sob inundação. Entretanto, em solos
alcalinos, a presença de metais catiônicos e adubações com excesso de P são
fatores limitantes à absorção de Fe, promovendo a deficiência desse em espécies
vegetais (ABREU; LOPES; SANTOS, 2007; DECHEM; NACHTIGALL,
2006). Por esses motivos e os diferentes mecanismos de absorção de Fe
(Estratégia I ou Estratégia II), recomendações de adubação, principalmente via
foliar, são indicadas.
Trabalhos envolvendo adubação com Fe são escassos e, no geral,
envolvem temas relativos à biofortificação ou à mobilidade desse nutriente nas
34
plantas. Scheeren et al. (2011) avaliaram 180 cultivares de trigo em três locais e
verificaram que os teores médios desse elemento nos grãos foi de 33 mg kg-1,
sendo a faixa de variação entre 22 e 56 mg kg-1. Em experimentos de casa de
vegetação, com trigo, foi verificado que 77% do Fe foi translocado da parte
aérea para os grãos, na maturação (GARNETT; GRAHAM, 2005). Além disso,
aplicações foliares de Fe indicam o incremento de produtividade nos teores e no
transporte desse nutriente, na parte aérea e nos grãos (CAKMAK; PFEIFFER;
MCCLAFFERTY, 2010; HABIB, 2009; ZHANG et al., 2010).
2.5.3 O Fe e seus efeitos na nutrição humana
Assim como descrito para Zn e Se, o Fe também é essencial para
humanos. Está envolvido em atividades metabólicas e enzimáticas, crescimento
celular, reações da cadeia respiratória, síntese de DNA e funções do sistema
imunológico.
Estima-se que 60% da população mundial seja carente desse nutriente, o
que a torna a principal preocupação e a mais estudada no que se refere à saúde
humana (GURZAU; NEAGU; GURZAU, 2003; WHITE; BROADLEY, 2009;
WHO, 2006). O sintoma mais comum dessa deficiência é a anemia, mas também
afeta o crescimento e o desenvolvimento, o sistema imune e as funções neurais
(ARREDONDO; NÚÑEZ, 2005; WHITTAKER, 1998). Dentre os principais
grupos de risco encontram-se as mulheres grávidas, recém-nascidos, crianças e
adolescentes (WHO, 2002).
Assim como descrito anteriormente para Zn e Se, a deficiência de Fe
também ocorre devido aos baixos teores bioacessíveis presentes nos alimentos
que compõem a dieta básica (LYNCH, 2011). Ainda, a forma química presente,
as células mucosas e da parede do intestino, bem como a quantidade ingerida,
influenciam nos teores adquiridos do elemento (GURZAU; NEAGU; GURZAU,
35
2003). No entanto, políticas públicas visando o enriquecimento de farinhas e
féculas de cereais com esse nutriente vêm sendo implementadas em diversas
partes do mundo, principalmente em países em desenvolvimento (MANNAR;
GALLEGO, 2002), fato que não ocorre para Zn e Se.
No Brasil, de acordo com dados da POF 2008-2009, os níveis de
ingestão de Fe para adultos encontram-se entre 13,5 e 10,1 mg dia-1,
respectivamente para homens e mulheres. Mais uma vez, destaca-se que a
composição de Fe nos alimentos foram determinadas de acordo com hábitos
alimentares e utilizando-se as tabelas norte-americana e nacional de composição
de alimentos (IBGE, 2011). A ingestão diária recomendada para homens é de 8
mg kg-1 e para mulheres 18 mg dia-1, no entanto, se a mesma é gestante ou
lactante os valores são, respectivamente, 27 e 9 mg dia-1 (BORTOLINI;
FISBERG, 2010). Segundo os autores, o cálculo mulheres adultas levaram em
consideração as perdas referentes ao período fértil.
Para gestantes,
consideraram-se as perdas basais de Fe, tais como os depositados no feto e
tecidos relacionados e para a expansão da massa de hemoglobina. Para as
lactantes, os cálculos basearam-se no fato de que, após seis meses de
aleitamento, a menstruação retorna ao ciclo normal.
Para prevenção, indica-se a adição desse elemento em dietas, bem como
ingestão de carnes e vitaminas A e C que são facilitadores da absorção de Fe
(BORTOLINI; FISBERG, 2010). Ressalta-se ainda, que a presença de
antinutrientes (fosfatos, fitatos e polifenóis), a forma química e a quantidade
absorvida afetam a disponibilidade de Fe (BORTOLINI; FISBERG, 2010;
GURZAU; NEAGU; GURZAU, 2003).
2.6 A cultura do trigo
36
Dentre os cerais, o trigo (Triticum aestivum) é a cultura mais importante
(PENG; SUN; NEVO, 2011), não só por ser a primeira espécie domesticada pelo
homem, mas também por compor 30% dos carboidratos presentes na dieta
humana (SHEWRY, 2009; WELCH et al., 2005).
O primeiro cultivo tritícola ocorreu na região do Mediterrâneo há,
aproximadamente, 10 mil anos atrás, quando o homem deixou de viver
exclusivamente da caça e coleta de alimentos. De acordo com os autores, os
primeiros cultivos foram compostos por plantas diploides (einkorn) e
tetraploides (emmer), selecionadas a partir de populações selvagens onde se
procuraram as melhores características produtivas. A partir desse momento, o
cultivo de trigo se intensificou e o melhoramento genético propiciou grande
evolução nas cultivares e produtividade da cultura. Atualmente, as linhagens
híbridas hexaploides correspondem a 95% do trigo cultivado no mundo
(SHEWRY, 2009; TOUSSAINT-SAMAT, 2009).
O trigo é o segundo cereal mais produzido no mundo e, em condições
ideais, lavouras de clima temperado, produzem de 8 a 10 t ha-1 (BRASIL, 2013;
BRUM; HECK, 2005; SHEWRY, 2009). Por outro lado, as lavouras brasileiras
possuem produtividades médias entre 3 e 4 t ha-1 (BRUM; HECK, 2005). No
Brasil, o trigo é cultivado durante o inverno e primavera, ocupando três regiões
do país: Sul (RS, SC e PR), Sudeste (SP e MG) e Centro Oeste (MS, GO e DF).
O cultivo desse cereal em áreas do cerrado vem crescendo e só é possível,
principalmente pelo uso da irrigação (CAIERÃO, 2013; DALMAGO et al.,
2013) e melhoramento genético feito na Embrapa Cerrados.
A estimativa da produção mundial para o ano de 2013 é de 701 milhões
de toneladas, sendo os principais produtores China, Índia e Rússia (FAO, 2013).
Segundo a FAO (2013), o consumo mundial desse cereal apresenta crescimento
de 2,1% ao ano, enquanto a produção 1,5%. A produção nacional, para o ano de
2013, está estimada em 6 milhões de toneladas, gerando um déficit entre 4 e 5
37
milhões de toneladas, em relação ao consumo (COMPANHIA NACIONAL DE
ABASTECIMENTO - CONAB, 2013). Em 2009, o Ministério da Agricultura
criou políticas de incentivo para produção de trigo visando à autossuficiência do
país nesse cereal e, um aumento gradativo na produção foi verificado no ano
seguinte. No entanto , o próprio ministério estima aumento anual de 1,3% no
consumo nacional (BRASIL, 2011). No ano de 2011, apesar de não figurar entre
os maiores produtores de trigo, o Brasil ocupou o 18º lugar no comércio mundial
desse cereal (FAO, 2013).
38
3 CONSIDERAÇÕES GERAIS
Temas referentes à segurança alimentar estão tornando-se frequentes na
literatura científica mundial, destacando-se, dentre eles, a biofortificação, a
qualidade alimentar e a contaminação de alimentos por metais e compostos
orgânicos. Portanto, faz-se necessário que o Brasil, como grande produtor de
alimentos do mundo, esteja atento às questões futuras, principalmente no tocante
à qualidade dos produtos produzidos.
Nas duas etapas desse trabalho,
foram abordados apenas a
biofortificação com Fe, Zn e Se na cultura do trigo, cultura da qual o país
importa quase 50% do total consumido. Os impactos iniciais desse trabalho
serão, a priori, internos; 1) na qualidade de vida dos brasileiros, visto que as
cultivares utilizadas são nacionais e, 2) na balança comercial agrícola nacional,
uma vez que toda a nossa produção é aqui consumida. Entretanto, vale ressaltar
que, para várias culturas há a tendência que se pague por qualidade do produto
colhido. Assim, num futuro bem próximo, acredita-se que, para grãos destinados
ao consumo humano, minimamente processados ou “in natura” - casos de trigo,
milho, soja, arroz, feijão, etc. - as empresas comecem a pagar por qualidade e os
nutrientes presentes podem ser o diferencial a favor do agricultor brasileiro.
Estudos envolvendo biofortificação com elementos como K, Ca, Mg, B,
Cu, Fe, Mn, Zn, Cr, Se e I são necessários, não apenas para contribuir com a
qualidade do produto final, mas também pensando nos efeitos benéficos à saúde
humana. Ressalta-se que, além de enriquecer os alimentos com determinados
elementos, faz-se necessário reduzir a quantidade de antinutrientes (e.g. fitatos,
polifenóis, fibras e metais tóxicos ), fator tão importante quanto o
enriquecimento com alguns nutrientes.
39
Para serem adotadas políticas públicas de interesse nacional, como é o
caso da biofortificação, são necessárias outras medidas, tais como: mapeamento
da deficiência de nutrientes na população brasileira e distribuição geográfica
dessas, além de incentivos à agricultura regional para que se desenvolvam
produtos adaptados à determinada região. Entretanto, como mencionado
anteriormente, há evidências de que a população brasileira seja carente nos
elementos abordados nesse trabalho, o que justificaria qualquer esforço
envolvendo o enriquecimento de culturas com alguns elementos.
Finalmente, o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE)
lançou a Pesquisa Nacional de Saúde 2013 (PNS) para saber como está a saúde e
o estilo de vida do brasileiro. Serão escolhidos, aleatoriamente, 25% dos
entrevistados, maiores de 18 anos, para coleta de medidas antropométricas e de
pressão arterial. Além disso, serão coletados amostras de sangue e urina onde se
analisarão diabetes, colesterol, anemias, doenças renais e sódio. Uma questão
pode ser levantada: Não seria um bom momento para se analisar os teores de
nutrientes nessas amostras que estão sendo coletadas? Quando será realizado
outro sistema de coleta de abrangência nacional para que se tenham essas
informações? Mais uma vez, pesquisa e política pública encontram-se distantes,
o que gerará um enorme atraso para solução de problemas nutricionais dos
brasileiros.
40
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SEGUNDA PARTE
Artigo 1
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Evaluation of germplasm effect on Fe, Zn and Se content in wheat seedlings
Guilherme Amaral de Souzaa,b,c, Janice Guedes de Carvalhoc, Michael Rutzkea,
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37200-000, P.O. Box: 3037.
d
Embrapa Cerrados (CPAC), BR 020 km 18, Planaltina, DF, Brazil, CEP 73310-
970, P.O. Box: 08223.
* Corresponding authors: Email: [email protected]; Tel: +1-607-255-5708; Fax:
+1-607-255-1132
E-mails:
[email protected] (G.A. Souza); [email protected] (J.G. Carvalho);
[email protected] (M.A. Rutzke); [email protected] (J.C. Albrecht);
[email protected] (L.R.G. Guilherme); [email protected] (L. Li).
52
Abstract
Micronutrients are essential for human health and crucial for plant survival. The
capacity of food crops in acquiring mineral nutrients affects plant growth and
potentially the yield and nutrient content in edible tissues/organs. In this study,
we selected 20 wheat (Triticum aestivum L.) accessions and evaluated genotypic
variations of the young seedlings in response to iron (Fe), zinc (Zn), and
selenium (Se) treatments. Wheat accessions exhibited different growth responses
to these minerals and possessed various abilities to accumulate them. Wheat
seedlings in general were less tolerable to excess of Fe and benefits from
increased levels of Zn supply. They were sensitive to selenite and profited from
selenate treatment at low dosages. Limited mineral interactions were observed
between Fe or Zn with other nutrients. In contrast, selenate supply enhanced Fe,
Zn, sulfur (S), molybdenum (Mo), magnesium (Mg), calcium (Ca) and
manganese (Mn) content in wheat seedlings, supporting its beneficial role in
promoting plant growth; Selenite supplement reduced Zn, S, Mo, Mg, Ca and
Mn levels in the plants, consisting with its detrimental role in inhibiting seedling
growth. Based on nutrient content accumulated, plant growth, and mineral
interaction, a number of accessions such as EMB 38 and BRS 264 appeared to
be excellent lines for breeding wheat cultivars with better plant health and
potential to accumulate essential micronutrients in edible grains.
Keywords
Wheat (Triticum aestivum L.), iron, zinc, selenium, mineral interaction.
53
1. Introduction
Micronutrient malnutrition is a well-known human health problem,
which affects more than 3 billion people in the world [1]. Deficiencies in iron
(Fe), zinc (Zn), and selenium (Se) are common and estimated to affect
approximately 60%, 30%, and 15%, respectively, of the world population [2].
Biofortification of crops with enhanced mineral content provides a
complementary strategy in conjunction with dietary diversification, mineral
supplementation, and food fortification to address the worldwide micronutrient
deficient problem [2,3]. Micronutrients are important not only for human health,
but also for plant nutrition. Fe and Zn are essential micronutrients for the
survival and proliferation of all plants. Although the essentiality of Se to plants
has not been established yet, Se is considered a beneficial element in promoting
plant growth in some plant species [4,5].
Iron is indispensable for a variety of cellular functions in plants,
participating in photosynthesis, respiration, chlorophyll biosynthesis, DNA
synthesis, and hormone synthesis [6,7]. Fe is the second most abundant metal in
soils and has extremely low solubility, especially in aerated alkaline soils [8].
Plants develop two distinct strategies for iron acquisition [7]. Graminaceous
plants, such as wheat, use Strategy II to acquire Fe by secreting Fe-chelator
compounds, mugineic acid family phytosiderophores. While low Fe availability
causes leaf interveinal chlorosis, excess level of Fe is toxic to plants, believing
to be due to the generation of oxidative stress [6,9]. Increase of Fe content in
plants by fertilization is not very effective due to Fe insolubility in soil and low
mobility of Fe in phloem [10].
Zinc serves as a cofactor in over 300 enzymes and is a structural
component in many proteins, including a large number of transcription factors
54
[6,11,12]. It is estimated that approximately 50% of the cereal-grown area in the
world have Zn-deficient soils. Zn level is dependent on available Zn pools and it
status in plants directly correlates with plant growth, crop yield and nutritional
quality [13]. Zn toxicity in crop plants are rare and Zn fertilization has been
shown to be an effective approach to enhance Zn levels in leaves and in grains
[10,13].
Selenium is uptake by plants from soils mainly as selenite (SeO3-2) and
selenate (SeO4-2). Selenate is transported by an active process that is mediated by
sulfate transporters. Selenite uptake appears to occur passively and phosphate
transporters are believed to be involved in this process [5,14]. Most crops are
sensitive to Se and respond differently to SeO4-2 and SeO3-2 fertilizations. While
Se at high dosages inhibits plant growth, a number of studies have demonstrated
that Se at low dosages enhances plant growth [15,16]. Selenium shares similar
chemical properties with sulfur (S) and uses S uptake and assimilation pathways
[5]. Thus, it is not surprised to find that high levels of Se fertilization suppress S
accumulation [17]. However, studies have shown a synergistic instead of
antagonistic relationship between Se and S metabolism at low dosages of Se
supplement [18].
Wheat is the major staple crop that provides approximately 30% of food
source for a large number of people worldwide. Improving the nutritional quality
of wheat grain is highly important to help combat the global micronutrient
deficiency problem. Toward this goal and to gain a better understand mineral
nutrition in wheat plant, we evaluated the genotypic variation in response to the
supplement of Fe, Zn and Se, the three trace elements whose deficiencies cause
a major health problem worldwide. It is known that plants with high nutrient
value in the leaf tissues can improve their growth, and consequently with a
potential to increase yield as well as mineral content in edible grains [2,3]. We
examined 20 wheat accessions from the wheat breeding program at Embrapa
55
Cerrados CPAC, Planaltina, Brazil. The effects of Fe, Zn, and Se supply on
wheat seedling growth and nutrient content were investigated in order to provide
the information for selection of wheat accessions with substantial capacity to
acquire minerals and for crop biofortification with these micronutrients.
Interactions among nutrients are known to impact plant nutrient status, plant
health and yield [19,20]. The effects of Fe, Zn, and Se treatments on other
nutrient accumulation in these wheat germplasm were also examined to provide
a general view of mineral interactions in wheat plants.
2.1 Wheat germplasm, seedling growth, and mineral treatment
A population of bread wheat (Triticum aestivum L.) was selected from
Embrapa Cerrados (CPAC) breeding program (Planaltina, GO, Brazil) and used
in this study. This population included 20 accessions of 15 varieties and 5
cultivars. These lines were selected because they have high grain production in
Central Brazil and contain good quality to bread industry. Their origin and
pedigree are listed in Table 1. Seeds of each wheat variety or cultivar were
surface-sterilized in 0.5% NaOCl for 15 minutes, rinsed in distilled milli-Q
water, and germinated in a chamber at 20oC for 3 days on moistened filter paper.
The uniform 3-day-old young seedlings with roots of approximately 3 cm long
were transplanted into 2.2 L pots containing modified Johnson’s nutrient
solution for wheat [21], which consisted of 1 mM KNO3, 1 mM Ca(NO3)2, 0.05
mM NH4H2PO4, 0.25 mM MgSO4, 0.1 mM NH4NO3, 12.5 µM H3BO3, 0.1 µM
Na2MoO4, 0.1 µM NiSO4, 0.4 µM MnSO4, 1.6 µM CuSO4, 96 µM Fe(NO3)3, 10
µM ZnSO4, 128 µM H3HEDTA, and 2 mM MES buffer (pH 6.0). ZnSO4 and
Fe(NO3)3
were
equilibrated
with
H3HEDTA
(N-2-
hydroxyethylethhylenediamine-N,N’,N’-triacetic acid) before adding to the
nutrient solution. H3HEDTA was used as micronutrient buffer.
56
Seedlings were grown with aeration in a greenhouse at 20oC (±2oC)
under 16-h day length. Four days after transplant, these plants were either grown
in the nutrient solution (control) or exposed to the nutrient solution with addition
of 54 µM Fe(NO3)3 (totaling 150 µM Fe), 40 µM ZnSO4 (50 µM Zn), 10 µM
Na2SeO4 or 10 µM Na2SeO3. The additional Fe and Zn concentrations were used
to achieve a final 50% free Fe activity (in consideration of potential Fe toxicity)
and maximal free Zn activity in the culture solutions based on the calculation of
using the GEOCHEM-EZ program [22]. A concentration at 10 µM of selenate
and selenite was commonly used in nutrient solutions for non Se accumulator
[14,15]. The solutions were changed twice each week. Following 10 days of
treatments, a total of 400 plants (20 lines x 5 treatments x 4 repeats) were
harvested individually and washed in distilled water. Shoots and roots were
separated and dried at 65°C for 72 h.
2.2 Mineral analysis
Total mineral contents in the samples were determined using an
inductively coupled plasma-emission spectrometer (model ICAP 61E trace
analyzer, Thermo Electron, San Jose, CA). Individual dried shoot sample (200
mg) was weighed and pre-digested with 4 mL of concentrated HNO3/HClO4
(60/40% v/v) at room temperature overnight. The samples were then heated to
120ºC for 2 hours, followed by at 195ºC for 30 min. The samples were cooled to
room temperature and diluted with milli-Q water to 20 mL. Blank and an
internal standard Yttrium was used to substantiate the accuracy of the analytical
results obtained. The experimental samples were prepared and analyzed
following a rigid quality assurance/quality control (QA/QC) to ensure accurate
and reliable analytical data.
57
2.4. Statistical analysis
All quantitative data on plant growth were mineral nutrient contents
were subjected to statistical analysis by one way analysis of variance (ANOVA).
The data were submitted to variance analysis by the Scott-Knott test at a level of
5% of probability, using the statistical analysis software SISVAR [23].
3. Results
3.1. Wheat accessions possess different growth responses to mineral treatments
Fe, Zn and Se are not only essential for human nutrition, but also exert
profound effects on plant growth and development [2,3,10]. To examine the
growth responses of these 20 selected wheat accessions to the application of
these minerals, the shoot and roots of each wheat line were separately harvested
and dried. Their biomasses were measured.
As shown in Figure 1A, these wheat lines exhibited up to 2-fold
difference in their shoot biomass when they grew in the control nutrient solution.
They responded differently to the additional supply of Fe and Zn as well as to
supplement of selenate (SeO4-2) and selenite (SeO3-2) in the nutrient solution (p ≤
0.05). When the wheat lines were exposed to additional Fe, a general inhibition
of shoot growth was observed in most of the lines. Four lines (EMB 30, EMB
34, Brilhante, and Supera) appeared to tolerate additional Fe supply with no
inhibition on their shoot growth, and two lines (i.e. EMB 38 and BRS 264) were
benefited by additional level of Fe fertilization with enhanced growth (Fig. 1A).
Zn fertilization has been shown to enhance plant growth [13]. When the wheat
lines were exposed to additional Zn, an enhancement of shoot growth was
observed in half of these lines and an up to 2-fold increase in biomass was
58
noticed in line EMB 19 and EMB 30 (Fig. 1A). Slight suppression of plant
growth was observed in four lines (EMB 9, EMB 10, EMB 15, EMB 26). Plants
respond differently to different form of Se and selenate is generally less toxic
than selenite to plant growth [14,18]. When these wheat lines were grown in the
nutrient solution containing 10 µM Na2SeO4, the plant growth was unaffected in
some lines, and enhanced (EMB 7, EMB 14, EMB 19, EMB 30, EMB 38 and
BRS 264) or suppressed (EMB 15, EMB 20, EMB 26, EMB 33, EMB 34, BRS
207, BRS 254, Supera) in the other lines (Fig. 1A). However, when the wheat
varieties and cultivars were exposed to 10 µM Na2SeO3, a general inhibition of
plant growth was observed in nearly all lines except line EMB 5 and line EMB
30. An average of 36% suppression of growth was noticed. These results
indicate that wheat lines exhibited genetic variation for shoot growth in response
to mineral treatments. Each line responded differently to Fe, Zn and Se
treatments, indicating a different capacity in uptake, assimilation and use of
these nutrients within the plant.
Root dry matter of these wheat lines in response to Fe, Zn and Se
treatments were also investigated. A similar response pattern as shoot growth
was observed for root growth of these wheat lines when they were exposed to
various mineral treatments (p ≤ 0.05, Fig. 1B). Fe supplement at the dosage
applied generally inhibited root growth, while additional Zn supply stimulated
root growth. SeO4-2 treatment had minimum effects on root growth in some lines
and increased the root biomass in half of the other lines. A general reduction of
root growth was observed in SeO3-2 treated plants, consisting with that selenite is
more toxic to plant growth than selenate.
3.2. Wheat accessions exhibit a range of capacity in the accumulation of
minerals
59
To examine the responses of wheat cultivars and varieties to additional
Fe and Zn as well as to different form of Se treatment, the total mineral content
in the wheat seedlings were determined by ICP. The wheat lines accumulated
different levels of Fe when they grew in the nutrient solution (Fig. 2A). An up to
3-fold variation was observed between wheat lines accumulating high and low
level of Fe. The supplement of additional Fe caused an increased level of Fe
content in half of these lines and an over 50% increase of Fe content was found
in line EMB 10 and line EMB 11. The results showed genetic variation among
these wheat lines in term of Fe concentration and capacity to accumulate Fe.
Zinc concentration also exhibited an over 2-fold variation among these
wheat lines (Fig. 2B). The supplement of additional Zn dramatically increased
Zn content in all lines. An up to 3-fold enhancement of Zn level was observed,
indicating high capacities of these wheat lines to take up and accumulate Zn.
The total Zn levels showed over 2-fold differences between accessions
containing high and low levels of Zn. Wheat accessions derived from parental
crossing with BRS 264 showed high capacity to accumulate Zn.
Selenium was undetected in seedlings of the wheat lines that grew in the
control nutrient solution. When the seedlings of these wheat lines were exposed
to SeO4-2 and SeO3-2, the total Se levels showed 4- and 2-fold difference,
respectively, between lines containing high and low level of Se (Fig. 2C). The
SeO4-2-treated wheat seedlings contained a range of 3- to 7-fold more total Se
than the SeO3-2-treated ones, consistent with previous reports that plants
accumulate more Se when treated with SeO4-2 than SeO3-2 [14,18].
3.3. Interaction among mineral elements
To investigate whether supplement of one element affected the
accumulation of macronutrients (P, K, Ca, Mg, and S) and micronutrients (B,
60
Cu, Fe, Mn, Mo, and Zn), we measured these mineral content in response to Fe,
Zn, SeO4-2 and SeO3-2 treatments and examined their interactions. A general
overview of these mineral element interactions in these wheat lines is
summarized in Table 2. P and K along with N are the primary macronutrients
and high demand by plants. In general, P level did not change much in response
to Fe, Zn and Se treatments in most of the wheat lines (Fig. 3A). The same is
true for K level (Fig. 3B). Ca level was increased in half of these wheat lines
following treatments with Fe and Zn, and in over half of them with SeO4-2
treatment. Ca content was dramatically suppressed by SeO3-2 in all accessions
with an average of 33% reduction (Fig. 3C). Mg content was enhanced by Fe
and SeO4-2 in about half or over half of these lines, respectively, and inhibited by
SeO3-2 treatment in half of the lines (Fig. 3D). S level was not affected by
additional Fe and Zn supply in these wheat lines (Fig. 3E). Se is known to effect
S uptake and assimilation [5]. S concentration was dramatically enhanced with
an average of 200% increase by SeO4-2 at the dose applied for all wheat lines and
inhibited by SeO3-2 in majority of these wheat lines (Fig. 3E).
Examination of micronutrient content in these wheat lines revealed that
in general B level did not change much in response to Fe, Zn and Se treatments
(Fig. 3F). Cu level was also not affected by Fe, Zn and Se treatments in almost
all the lines (Fig. 3G). While Fe content in most wheat lines was increased by
additional supply of Fe to the nutrient solution, Fe level was stimulated by SeO42
supplement in over half of the wheat lines (Fig. 3H). Fe content was
suppressed by Zn treatment and was unaffected by SeO3-2 treatment in majority
of the lines (Fig. 3H). Mn level was enhanced in about half of wheat lines
exposed to Zn and SeO4-2 and dramatically reduced when plants were treated
with SeO3-2 with an average of 43% reduction (Fig. 3I). Mo concentration was
generally not affected by further addition of Fe and Zn, but enhanced with an
average of 71% increase by SeO4-2 in all wheat lines and suppressed by SeO3-2 in
61
about half of the lines (Fig. 3J). Zn content was dramatically enhanced with
additional Zn supply in all wheat lines (Fig. 3K). While Zn level was not
generally affected by Fe application, SeO4-2 caused a slight increase of Zn in half
of the wheat lines, and suppressed by SeO3-2 in majority of the lines (Fig. 3K).
4. Discussion
The new focus of plant breeding programs has been the development of
genotypes with high nutrient content [10,24]. Genetic factors along with
physiological factors determine crop nutrient uptake and subsequently the
potential productivity and quality of food crops; and these factors vary among
plant species, cultivars, tissues and organs [2,24]. Fe and Zn are essential
micronutrients for plant growth and development. Fe and Zn deficiencies are
widespread among plants grown in calcareous soils. Their deficiencies lead to
serious loss of crop production and nutritional quality. While Se is considered to
be non-essential for plants, Se at low dosages promotes plant growth.
Exploration of germplasm variation and understanding of physiological basis in
response to Fe, Zn and Se treatments are critical for breeding crop varieties with
better capacities to utilize these minerals not only for better plant health and
growth, but also for a potential of better crop nutritional quality [13,25,26].
The wheat accessions examined exhibited 2-fold difference in their
capacity in utilization of nutrients for shoot and root growth. An overall
correlated shoot and root growth was observed with these accessions. While
only a few lines showed tolerance to additional levels of Fe, a general inhibition
of shoot and root growth by excess Fe was observed. These results are consistent
with other reports showing that wheat varieties have different capacity in
utilization of Fe and high dosages of Fe suppress plant growth [25,27,28]. When
these wheat lines were exposed to additional Zn supply, an enhanced shoot and
62
root growth was observed in half of wheat accessions. Zn fertilization has been
shown to enhance plant growth [13]. Wheat plants cultivated with six Zn doses
(0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4 mg Zn kg-1 soil) increase shoots and roots dry
matter [29], while wheat seedlings grown under Zn-deficient conditions reduce
the shoot and roots biomass [30]. Up to 2-fold wheat genotypic variation in
utilization of Zn was observed here, which is agreeable with previous studies
[30]. Wheat accessions responded differently to different forms of Se. While the
growth of these wheat lines was either stimulated/suppressed or unaffected when
exposed to 10 µM SeO4-2, a general suppression of growth was found following
treatment with the same concentration of SeO3-2. These results are consistent
with previous studies showing that SeO4-2 is less toxic than SeO3-2 to plant
growth [14,15]. Genetic variations among crop germplasm in response to SeO4-2
treatment are also reported in previous studies. Filek et al. [31] showed that
SeO4-2 treatment causes a reduced growth in Polish wheat and an increased
biomass in Finnish wheat. Although wheat lines exhibited genetic variation for
shoot growth in response to Fe, Zn and Se treatments, each line responded
differently to these mineral treatments, showing a different capacity in uptake,
assimilation and use of these nutrients.
The wheat accessions exhibited 2- to 4-fold variation in total Fe, Zn, and
Se content. The additional Fe and Zn supply increased Fe and Zn levels in half
and all wheat lines, respectively, indicating a range of capacity of wheat lines in
accumulating these mineral elements. Enhanced Fe levels following Fe
treatment in some plants were also described previously [25,27,28]. Similarly,
increased Zn concentration following Zn supply were observed in wheat [32].
SeO4-2 supply was more effective than SeO3-2 in inducing Se content in wheat
seedlings. Plants treated with SeO4-2 contained over 4-fold more total Se than
those treated with same concentration of SeO3-2. These results are consistent
63
with previous reports that plants accumulate more Se when treated with selenate
than selenite [14,18].
Interactions among mineral elements affect plant nutrient status and
consequently plant health and yield [19,20]. Despite of numerous studies,
nutrient interactions are complex and still not well understood. Here we showed
that the primary macronutrients P and K levels were generally not affected by
additional Fe and Zn supplement and Se treatment in these wheat lines, although
Zn has been shown to reduce P transfer from roots to shoots but enhance the
transfer from shoots to grain in other studies [33]. In contrast, interactions
between other macronutrients with Fe, Zn and Se were observed. Ca and Mg
interacted positively with Fe, Zn and SeO4-2 in half of these wheat lines. Ca
content was dramatically suppressed by SeO3-2 in nearly all lines, showing
strong antagonistic interaction. No general interaction between S and Fe or Zn
was noticed. S status in plants is known to be affected by Se supplementation
[17,18,34]. The S levels were dramatically enhanced for all wheat lines at the
SeO4-2 dosage used, demonstrating a synergic interaction between SeO4-2 and S.
Similar results were observed in lettuce and Arabidopsis when Se was supplied
at low dosages [18,35]. On the other hand, SeO3-2 suppressed S accumulation in
most of the wheat lines with antagonistic relationship as demonstrated in other
studies [14,18,36].
Micronutrients in plants have gained a lot of attention recently due to
their essential roles in plant growth and their contribution to human health
[2,3,37]. Micronutrients B and Cu exhibited no interaction with Fe, Zn and Se in
majority of these wheat lines. In contrast, Fe level in most of these wheat lines
was reduced by additional Zn supplement with an antagonistic effect between Fe
and Zn. The result is consistent with those studies showing interaction between
Fe and Zn [20]. Fe content in these wheat seedlings was generally enhanced by
SeO4-2 treatment, showing a synergistic effect of selenate treatment on Fe
64
accumulation. A slight enhancement in Fe content by SeO4-2 was also reported in
wheat [31]. Mn and Mo contents were also enhanced by SeO4-2 treatment but
suppressed by SeO3-2 in half of these wheat lines. Interaction between Se and
Mo is also reported in previous studies [34]. Noticeably, strong antagonistic
interaction between Mn and SeO3-2 and synergistic interaction between Mo and
SeO4-2 were observed in all these wheat lines. Interestingly, while interaction
was observed between Fe and Zn with additional Zn supplement, Zn levels in
wheat seedlings appeared not affected by additional Fe treatment in all these
wheat lines. Previous studies in wheat plants show that Fe application decreased
Zn uptake [19,20]. The discrepancy might be due to the nutrient status of wheat
plants growing in nutrient solution vs. in soil. A slight increase and a general
suppression of Zn level by SeO4-2 and SeO3-2, respectively, were observed. Zn
concentration is also found to be enhanced in wheat when selenate is applied
[31]. It appears that supplement of SeO4-2 at proper dosages caused synergic
effects on the accumulation of several minerals, whereas supply of SeO3-2
reduced the content of these elements in majority of the wheat lines. The
synergic or antagonistic effects of different Se forms may contribute to the
increased or decreased wheat seedling biomasses in these SeO4-2 or SeO3-2
treated plants.
5. Conclusions
Plant mineral status affects plant growth and health, potentially the
yield and nutritional quality in edible tissue. By examination of these selected
wheat accessions, we found that the wheat accessions showed genotypic
variations in response to Fe, Zn and Se treatments. Thus, the study will be
helpful in selecting and developing cultivars with better plant health and
potentially high ability for consequent accumulation of essential micronutrients
in wheat grains. Moreover, we found that wheat seedlings in general were less
65
tolerable to high levels of Fe exposure, but benefits from increased levels of Zn
supply. While the wheat seedlings showed suppressed growth when exposed to
SeO3-2, they exhibited positive response to SeO4-2 treatment, likely owing to the
synergistic effects of SeO4-2 in stimulating other mineral element uptake for
better plant health. SeO4-2 exerted strong synergic interactions with S and Mo,
whereas SeO3-2 had strong antagonistic interactions with Ca and Mn wheat
seedlings. In consideration of the nutrient concentration, plant growth and the
interaction with other nutrients for the potential of increasing nutrient contents in
grains among these wheat lines, EMB 14, EMB 34, EMB 38 and BRS 264
appeared to be appropriate for a biofortification program with Fe; many lines
such as EMB 11, EMB 20, EMB 38 and BRS 264 for Zn; and EMB 10, EMB
14, EMB 38 and BRS 264 for Se.
Acknowledgement
G.A.S. is grateful to the CNPq, CAPEs and FAPEMIG, all from Brazil,
for financial support and scholarship. We thank Leon Kochian, Jon Hart, and
Jon Shaff for their technical advice, and Embrapa CPAC for sending the wheat
seeds. This work was partially supported by the USDA-ARS base fund. USDA
is an equal opportunity provider and employer. Mention of trade names or
commercial products in this publication is solely for the purpose of providing
specific information and does not imply recommendation or endorsement by the
U.S. Department of Agriculture.
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70
Table 1
List of the 20 wheat accessions including 15 varieties and 5 cultivars in the
study.
Varieties
Parents
Cultivars
Parents
EMB 1
BRS 207 / CPAC 91161
Brilhante
Brilhante = PF 8640 /
BR 24
EMB 5
CPAC 8947 / CPAC 8886
BRS 207
Seri 82 / PF 813
EMB 7
Brilhante / CPAC 961114
BRS 254
BRS 264*3 / ANA 75
EMB 9
BRS 207 / CPAC 9548
BRS 264
Buck Buck / Chiroca //
TUI
EMB 10
BRS 207 / CPAC 9548
Supera
PF 9099 / OR 1
EMB 11
CPAC 93175 / Graneiro Inta
EMB 14
CPAC 93175 / Graneiro Inta
EMB 15
CPAC 93175 / Graneiro Inta
EMB 19
BRS 207 / TB 951
EMB 20
IAPAR 17 / BRS 264
EMB 26
CPAC 96306 / CPAC 9985
EMB 30
CPAC 96306 / CPAC 9985
EMB 33
PF 81627 / BRS 264 // PF
990607
EMB 34
Taurum/ BRS 207 // PF 8190 /
BR 18
EMB 38
PF 013452 / BRS 207
#
The varieties that have the same parents represent different lines selected
from F2 crossing.
71
Table 2
Overview of interactions between elements in the wheat lines and their increase/decrease percentages.
Nutrient Interactions
Treatment
Fe
Zn
P
K
Ca
Mg
S
B
Cu
-
-
½I
½I
-
-
-
Fe
Mn
Mo
Zn
-
-
-
-
-
½I
-
-
-
-
D
½I
-
-2
-
-
I
I
I*
-
-
I
½I
I*
½I
SeO3-2
-
-
D*
½D
D
-
-
-
D*
½D
D
SeO4
Nutrient interactions (average %)
Fe
3.8
8.3
17.0
12.7
3.1
-4.0
4.5
39.9
-8.2
-2.2
8.7
Zn
-1.0
4.7
10.0
-2.5
9.3
1.8
-7.2
-19.2
23
12.1
154.7
SeO4-2
-5.8
0.2
21.5
18.6
199.7
0.6
5.7
23.8
21.3
71.3
29.3
SeO3-2
3.4
-1.4
-33.3
-10.6
-23.2
2.1
9.7
5.5
-43.1
-14.4
-24.1
(I) Increase level, (D) Decrease level and, (-) no affect.
*strong antagonistic or synergistic interaction was observed in nearly all wheat lines examined.
Negative numbers represents a reduction in the nutrient concentration.
72
0 .4
C o n tro l
Fe
a
S e O 4 -2
Zn
S e O 3 -2
a
-1
Shoot dry matter (g plant )
A
a
b
0 .3
a
c
0 .2
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c
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b
a
b
a
d
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c
c
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b
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c
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c
b
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b
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b
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a
d
c
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0 .1
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b
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d
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b b
c
c
b
b
c
b
b
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b
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c
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Fe
a
b
a
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b b
c
d
c
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c
c
b ba
c
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bb
b
a
b b
c
c
c c
d d
d
d
d
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aa
c
c
c c
c
c
b
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C o n tro l
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1
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EM
B1
B9
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B5
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B1
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Root dry matter (g plant-1)
B
B1
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1
B1
B1
EM
B1
0
EM
B9
EM
EM
B7
EM
B5
EM
EM
B1
0 .0 0
Fig. 1. Effect of Fe, Zn and Se treatments on shoot (A) and root (B) dry
matter in seedlings of wheat varieties and cultivars. Values shown are mean
± SE (n=4). Different letters above the column indicate significant difference
at
p
≤
0.05
for
treatments.
60
b
B9
B1
0
EM
B1
1
EM
B1
4
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EM
B3
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EM
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5
B1
B1
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EM
C ontrol
EM
1
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B1
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0
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B1
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EM
B9
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EM
B7
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a
EM
100
B7
B5
B1
100
EM
b
EM
EM
EM
40
EM
B5
20
EM
B
B1
Fe Content (µg plant-1 DW)
A
EM
Zn Content (µg plant-1 DW)
73
Fe
a
a
a
a
b
a
a
a
a a
a
b
b
20
0
Zn
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
0
74
Se Content (µg plant-1 DW)
160
SeO 4 -2
C ontrol
140
SeO 3 -2
a
120
a
a
100
a
a
a
a
60
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
80
a
40
a
b
20
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
a
b
b
b
b
b
b
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64
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S2
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B3
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EM
EM
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3
B3
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EM
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EM
5
B1
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EM
EM
1
4
EM
B1
0
B1
EM
B9
B1
EM
B7
EM
B5
EM
EM
EM
B1
0
Fig. 2. Effect of Fe, Zn and Se treatments on Fe (A), Zn (B), and Se (C)
content in seedlings of wheat varieties and cultivars. Values shown are mean
± SE (n=4). Different letters above the column indicate significant difference
at
p
≤
0.05
for
treatments.
75
P relative concentration (%)
A
160
Fe
S e O 4 -2
Zn
a
a
140
S e O 3 -2
a
a
b
a
120
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B
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B2
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EM
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EM
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EM
EM
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77
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Fig. 3. Relative concentration of nutrients in wheat seedlings of 20 lines in
response to Fe, Zn, and Se treatments. The relative nutrient concentrations
were calculated by dividing the mineral contents following nutrient
treatment with those in control solution. P (A), K (B), Ca (C), Mg (D), S (E),
B (F), Cu (G), Fe (H), Mn (I), Mo (J) and Zn (K). Values shown are mean ±
SE (n=4). Different letters above the column indicate significant difference
at p ≤ 0.05 for treatments.
79
Artigo 2
Evaluation of zinc and selenium supplementation and their interaction
in wheat plants and grain
Artigo apresentado na íntegra, conforme submetido à revista Journal of
Agriculture and Food Chemistry.
80
Evaluation of zinc and selenium supplementation and their interaction
in wheat plants and grain
Guilherme A. Souzaa,b,c, Jonathan J. Harta, Shree K. Giria, Janice G.
Carvalhoc, Júlio César Albrechtd, Luiz Roberto G. Guilhermec, Leon V.
Kochiana, Li Lia,b,*
a
Robert W. Holley Center for Agriculture and Health, USDA-ARS, Cornell
University, Ithaca, NY 14853, USA.
b
Department of Plant Breeding and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY
14853, USA.
c
Soil Science Department at Federal University of Lavras, Lavras, MG,
Brazil, 37200-000, P.O. Box: 3037.
d
Embrapa Cerrados (CPAC), BR 020 km 18, Planaltina, DF, Brazil,CEP
73310-970, P.O. Box: 08223.
*Corresponding author:
Li Li
Robert W. Holley Center for Agriculture and Health, USDA-ARS
Cornell University
Ithaca, NY 14853
USA
Tel: +1-607-2555708
Fax: +1-607-2551132
E-mail: [email protected]
81
Abstract
Humans require many micronutrients for metabolism maintenance and these
can be provided in an appropriated diet. The low Zn dietary intake and poor
dietary diversity are reported as the mainly reasons for this micronutrient
malnutrition in human. Zn and Se are not only crucial for human, but also
exert profound effects on plant growth and development. In this study, we
selected 20 wheat (Triticum aestivum L.) accessions and evaluate genotypic
in response of enhancements in Zn and Se in culture solution. Plant
micronutrient status affects plant growth and potentially the yield, as well as
nutritional quality in edible parts. Taking into consideration the agronomic
parameters, nutrient content, and potential of increasing nutrients in these
wheat lines we indicate the accessions BRS 207; BRS 254; BRS 264; EMB
19 and EMB 33 for biofortification with Zn; many lines such as Brilhante;
BRS 264; EMB 7; EMB 26 and EMB 30 appeared to be appropriate for
Zn+SeO4; and Brilhante; BRS 254; Supera; EMB 20 and EMB 33 for
Zn+SeO3.
Keywords: Selenate, selenite, biofortification, nutrient content, Triticum
aestivum L.
82
1. Introduction
Micronutrient malnutrition is a well-known human health problem,
which justifies any effort concerning food enrichment with such elements.
Nowadays, nearly 3 billion people worldwide are affected by micronutrient
deficiencies, including iron (Fe), zinc (Zn), iodine (I), and selenium (Se)
1–3
.
Earlier agricultural programs, e.g., the 1960´s Green Revolution, have
focused on increasing grain production, without paying attention to nutrient
and vitamin contents in most crops. Consequently, the new challenges for
agriculture in the world are quality and safety of staple food 3–5. Genetics and
physiological factors determine the nutrient uptake and consequently the
productivity and quality, yet these factors are likely to change among plant
species, cultivars, tissues and organs
3,6
. Some studies suggest that it is
possible to increase the nutrient content in plants while maintaining high
plant yields
6–8
. Moreover the nutritional value of many crops can be
increased via mineral fertilization with important nutrients such as Zn, Se,
copper (Cu) and nickel (Ni)9. In fact, improving the micronutrients content
of many important crops using different biofortification strategies has been
the subject of many studies 7,8,10.
Zinc (Zn) is an essential element for plants, humans and animals.
This element plays roles in over 300 enzymes and is a cofactor in thousands
of proteins, including transcription factors
11–13
. At least 50% of grains areas
in the world are under Zn-deficient soils, and Zn status in plants are
correlated with plants growth, nutritional quality and crop yield8,14.
Germplasms have different capacities to accumulate nutrients showing the
possibility to enhance staple food quality with some essential elements 10. In
wheat grains, at least a 2-fold variation in Zn concentration have been
observed
7,15
. However, Zn concentration in cultivated wheat is lower than
primitive and wild wheat lines, suggesting more potential for plant breeding
8
.
Selenium (Se) is an essential element for humans and animals and
83
also an important component of antioxidant systems
shown beneficial effects
17
15,16
. In plants, Se has
, but the essentiality is not determinate. Plants
uptake Se from soils mainly as selenite (SeO3-2) and selenate (SeO4-2).
Selenate is actively transported in a process mediated by sulfate transporters
while selenite is passively transported and it is believed that phosphate
transporters preside over the process
18–20
. Wheat grains cultivated in
different Australian soils showed 144-fold variation in Se concentration, but
much of this variation was associated with spatial variation in soil selenium,
but much of this variation was associated with spatial variation in soil
selenium 15,21.
Wheat is the major staple crop that provides approximately 30% of
food source for a large number of people worldwide. Plants with increased
ability to acquire mineral elements improve their growth, and consequently
increase yield as well as mineral concentrations in edible grains
3,10
. From
the wheat breeding program at Embrapa Cerrados CPAC, Planaltina, Brazil,
we selected 20 wheat accessions to evaluate the genotypic variation and
nutrient interaction in response to Zn and Se supplements. The effects of Zn
and Se fertilizations on wheat grains and nutrient content were investigated
in order to provide the information for selection of wheat accessions with
substantial capacity to acquire minerals and for crop biofortification with
these micronutrients. Interactions among nutrients are known to impact plant
nutrient status, plant health and yield
22,23
. The effects of Zn and Se
treatments on other nutrient accumulations in these wheat germplasms were
also examined to provide a general view of mineral interactions in wheat
plants.
2. Materials and methods
2.1 Wheat germplasm and plants growth
84
For this study a population of bread wheat (Triticum aestivum L.)
was selected from the Embrapa Cerrados breeding program (Planaltina, GO,
Brazil). This population included 20 accessions with 15 varieties and 5
cultivars (Table 1), which are important cultivars and lines with potential to
grown in Brazil.
Seeds of each wheat variety or cultivar were surface-sterilized in
0.5% NaOCl for 15 minutes, rinsed in distilled milli-Q water, and
germinated in a chamber at 18oC for 3 days on moistened filter paper. The 3day-old young seedlings with roots of approximately 3 cm long were
transplanted into 10.0 L pots containing nutrient solution. The nutrient
solution consisted of 1 mM KNO3, 1 mM Ca(NO3)2, 0.05 mM NH4H2PO4,
0.25 mM MgSO4, 0.1mM NH4NO3, 12.5 µM H3BO3, 0.1 µM Na2MoO4, 0.1
µM NiSO4, 0.4 µM MnSO4, 1.6 µM CuSO4, 96 µM Fe(NO3)3, 10 µM
ZnSO4, 128 µM H3HEDTA, and 2 mM MES buffer (pH 6.0). ZnSO4 and
Fe(NO3)3
were
equilibrated
with
H3HEDTA
(N-2-
hydroxyethylethhylenediamine-N,N’,N’-triacetic acid) before adding to the
nutrient solution. The H3HEDTA was used as micronutrient buffer 24.
Wheat plants were grown with aeration in a greenhouse at 15-20 ºC
under 16-h day length. When plants started blooming, the treatments were
applied. These plants were either grown in nutrient solution (Control) or
exposed to the nutrient solution containing, 50 µM ZnSO4 (Zn), 50 µM
ZnSO4 + 10 µM Na2SeO4 (Zn+SeO4) and 50 µM ZnSO4 + 10 µM Na2SeO3
(Zn+SeO3). The speciation program GEOCHEM® was used to calculate the
solution activity. The nutrient solution was changed every week. A total of
240 plants (20 lines x 4 treatments x 3 replicates) were harvested at maturity
and washed in distilled water. Shoots (including glume), roots and grains
were separated and dried at 65ºC for 72h. Flag leaves were collected to
determinate the mineral content in shoots.
2.2. Nutrients content in flag leaves and grains
85
Total mineral contents in the samples were determined using an
inductively coupled plasma-emission spectrometer (model ICAP 61E trace
analyzer, Thermo Electron, San Jose, CA). Individual dried flag leaves (200
mg) and grain (500 mg) samples were weighed and predigested with 4 mL
(10 mL) of concentrated HNO3/HClO4 (60/40% v/v) at room temperature
overnight. The samples were then heated to 120ºC for 2 hours, followed by
195ºC for 30 min. The samples were cooled at room temperature and diluted
with milli-Q water to 20 mL. All samples were analyzed in triplicate. Blank
and an internal standard yttrium were used to substantiate the accuracy of the
analytical results obtained. After that, we calculated the Zn efficiency of
lines to shoot and grain dry matter and content under Zn normal (control) to
Zn addition (50 µM). We also calculated the Zn accumulation (%) to grains
and shoots of these wheat accessions.
The experimental samples were prepared and analyzed following a
rigid quality assurance/quality control (QA/QC) to ensure accurate and
reliable analytical data.
2.3. Statistical analysis
All quantitative data on plant growth and mineral nutrient contents
were subjected to statistical testing by one way analysis of variance
(ANOVA). The data were submitted variance analysis by the Scott-Knott
test or Test F, for Se content, at a level of 5% of probability, using the
statistical software SISVAR 25.
3. Results and Discussion
3.1. Grains production
Micronutrients, such as Zn and Se, are not only crucial for humans,
but also wield intense effects on plant development
3,9,10
. To examine the
86
responses of Zn, Se and their interaction in these selected germplasms,
individual parts of each wheat line were separately harvested and died and
their biomasses measured.
These wheat lines showed up to 4-fold differences in their grain
production when comparing the treatments applied in the nutrient solution
(the values ranged from 6.1 to 31.3, p ≤ 0.05) (Figure 1A). When these
wheat lines were treated with additional Zn, 50 µM, a general tolerance was
observed in most of the lines. Enhancements were observed of up to 37% in
these lines. However, four lines (EMB 15, EMB 30, BRS 207 and BRS 264)
appeared not to tolerate Zn supplementation and showed a slight reduction in
their grain production. Zn fertilization has been shown to enhance plant
growth and grain yield, along with an increase in Zn bioavailability in grains
8,26,27
. Although Se is considered to be non-essential for plants, Se at low
dosages promotes plant growth
28,29
. When plants were treated with
additional Zn and different forms of Se, singular responses were noticed.
Grain production in wheat lines grown in culture solution with selenate in
the presence of Zn (Zn+SeO4) showed a general suppression in comparison
with those plants that received 50 µM Zn (Fig. 1A). Nevertheless, in 3 wheat
lines (EMB 30, BRS 207 and BRS 264) enhancements were observed in
grain yield at an average of 12%, 90% and 23%, respectively. Previous
studies have reported genetic variations among crop germplasm in response
to SeO4 treatment
30
. A response pattern similar to Zn+SeO4 was observed
for wheat plants exposed to Zn and selenite (Zn+SeO3) (p ≤ 0.05, Fig. 1A).
However, a general reduction was observed in comparison with Zn-treated
plants, showing that selenite is more toxic than selenate, which is in
accordance with results reported previously 18,28.
The grains weight of 100 seeds in response of these wheat lines to
Zn and Se supplementation were also researched and a genetic variation in
these germplasms was observed (Figure 1B). When wheat plants were
treated with Zn, most of the lines responded positively or were unaffected as
to their grain weight of 100 seeds. A 21% average weight increase was
87
observed. These results are in agreement with those reporting yield increases
following Zn fertilization
8,27
. Most of the wheat lines treated with Zn+SeO4
showed a decrease in the grain weight of 100 seeds. However 3 lines (EMB
5, EMB 30 and BRS 264) presented enhancements, an average of 14%,
when SeO4 was applied with Zn. A previous work showed no effect on
production yield in winter wheat receiving liquid or granular Se
fertilization31 diverging from the results found in this present work.
Generally, grain weights were not affected when Zn+SeO3 was applied in
nutrient solution. Nevertheless, 5 lines (EMB 5, 15, 19, 26 and 30) increased
the grain weight of 100 seeds, an average 16%. These results suggest that Zn
increases the number of grains and, despite Se being more toxic and
reducing the grain production, when applied with Zn it makes the grains
heavier.
3.2. Different capacity of wheat accessions to concentrate nutrients in shoots
(flag leaves)
The total nutrient content was investigated in wheat leaves in
response to the addition of Zn and different forms of Se, selenate and
selenite application. Wheat plants exposed to treatments showed different
capacity to concentrate minerals in shoots (flag leaves) (Figure 2). When
additional Zn was applied in culture solution, the Zn content in leaves
increased in all lines (Fig. 2A). The Zn level increase observed was up to 4fold, implying a high capacity of these lines to take in and accumulate Zn.
Increases in Zn concentration following Zn addition were observed in wheat
seedlings and potato
32,33
. SeO4 in presence of additional Zn did not affect,
enhanced or suppressed the Zn content in wheat leaves, showing the
different capacity of these lines to uptake and assimilate Se
18,19
. However,
some lines (EMB 1, EMB 14, EMB 19 and BRS 264) increased the Zn
content in the flag leaves up to 1-fold when SeO4 was supplied in nutrient
solution. Plants exposed to Zn+SeO3 showed a general inhibition of Zn
88
content, exhibiting the highest selenite toxicity. These results agree with
those reported in previous works
33,34
. Despite this evidence, some lines
increased Zn content in leaves and, the cultivar Brilhante enhanced the Zn
concentration to over 4-fold. Differences in Fe, Zn, Cu, Mn and Se
concentrations and mineral localization in hard red wheat genotypes and
Triticum species have been reported previously 5,35,36.
Se was not detected in shoots (flag leaves) of wheat lines that grew
under the Control and Zn in nutrient solution treatments (Fig. 2B). However,
when these wheat lines were exposed to SeO4 and SeO3 with additional Zn,
the total Se content exhibited different capacity to concentrate Se, while the
SeO4-treated showed increases in Se content up to 1-fold, plants SeO3treated enhanced up to 2-fold. Wheat plants exposed to SeO4 contained over
41-fold more than SeO3-treated wheat plants, consistent with previous
reports that plants accumulate more Se when treated with SeO4 than SeO3
18,28,34
The interactions and effects on nutrient content are well-documented
and Zn is known to influence P assimilation and uptake 16,22 as is reported for
Se and S 19. The P content in wheat plants was relatively consistent among
wheat lines in the Control treatment (Fig. 2C). However, Zn-treated plants
showed unaffected, increased or inhibited P content. These results are in
agreement with those reported for potatoes 32. On the other hand, a general
inhibition of P content in wheat leaves was observed in Se-treated plants.
SeO3 had lower effect on P content than SeO4, suggesting a possibility of
phosphate transporters in this process 18,19.
Sulfur content was rather consistent among wheat lines grown in
culture solution and had a response pattern similar to P content when they
were exposed to Zn. However, when SeO4 was applied, S content increased
for all wheat accessions to over 12-fold, exhibiting a strong stimulation of S
by selenate at the dose added. A 3-fold variation in S levels was observed in
these wheat accessions. S deficient wheat plants increased the Se content in
grains up to 6.4-fold 37. By contrast, the S contents were reduced in nearly all
89
wheat accessions when the plants were SeO3-treated. These results confirm
that Se forms imposed opposite effects on S content in wheat plants, as
shown in other studies 18,28.
3.4. Different capacity of wheat accessions to concentrate nutrients in grains
To investigate the responses of wheat lines to additional Zn as well
as to different Se forms, the total mineral content in wheat grains were
determined. The wheat accessions showed different capacity to concentrate
Zn when they grew in culture solution (Fig. 3A). The Zn supplementation
increases the Zn content in all wheat lines. Increases in Zn concentration
following Zn fertilization were observed in wheat
26,27
. When SeO4 was
added in the culture solution, the plants were unaffected, increased or
suppressed as to the Zn levels (p ≤ 0.05). An average increase of 27% in Zn
concentration was observed. On the other hand, an inhibition of Zn
concentration was detected in almost all accessions of wheat grains SeO3treated, except lines EMB 9 and EMB 20. These results confirm the
differences among lines, pointing out the genotypes that could be used in
plant breeding, taking into account specific Zn target contents, e.g., that
establish by HarvestPlus Program at 33 mg Zn kg-1 (www.harvestplus.org).
Se was undetected in wheat grains under Control and Zn treatments
in culture solution and showed a 2.4-fold difference between lines with high
and low Se levels in Se-treated plants (Fig. 3B). In general, plants
accumulate more Se when SeO4 is added in nutrient solution than SeO3. The
small differences between SeO3 and SeO4 found in this study agree with
those reported in rice Se-treated grains
34
. However a high suppression
occurs in grains in comparison with leaves (Fig. 2B), agreeing with those
results found for rice and wheat
34,38
. By contrast, Se levels that were
analyzed in cultivated spring wheat crop showed grain Se content higher
than shoots
39,40
. Broadley et al.31 reported that 10 g Se ha-1 could increase
10-fold the Se concentration in wheat grain.
90
Phosphorous content in wheat grains was relatively consistent
among wheat lines in culture solution. Zn-treated wheat plants were
unaltered or showed a slight suppression in grain P levels for nearly all
accession except cultivars BRS 254 and BRS 264 (p ≤ 0.05) (Fig. 3C).
Interactions between these two elements have been reported in the literature
16,22
. When Se was applied in nutrient solution with additional Zn, a general
inhibition was observed. While SeO4 did not affect or it inhibited P content
in some lines, the SeO3-treated increased in P content (EMB 7, EMB 9,
EMB 20 and Supera, p ≤ 0.05). These results suggest that SeO4 is more toxic
than SeO3 to P levels, confirming the results found for leaves in which
phosphate transporters act on this process 18,19.
A similar pattern of P content result was found for S levels in wheat
plants for all treatments (Fig. 3D). While SeO4 exhibited enhancements, did
not affect or resulted in a low suppression, SeO3 showed a general inhibition.
These results confirm the affinity of selenate with sulphate transports 18,19.
3.3. Zn efficiency of wheat accessions Zn and Se-treated
To evaluate the Zn efficiency we considered the treatment control as
Zn deficient. In this study, an extreme genetic diversity was found for Zn
efficiency ratios, which showed different responses to the lines and
treatments. Apparently, SeO3-treated plants showed the biggest mean values
for shoot and grain dry matter and Zn concentration. Shoots of wheat SeO3treated plants improved the Zn efficiency and, under this treatment the
highest means values of 100%, 96% and 129%, respectively were observed,
for Zn, Zn+SeO4 and Zn+SeO3 (Table 2). The line EMB 20 was more
efficient in using Zn, however this line showed the lowest shoot dry matter
production value, 31% in comparison with the control (data not shown).
These results are similar to those reported for diploid, tetraploid and
hexaploid wheat 41. A response pattern similar to shoots was observed for Zn
efficiency in grain production, while Zn and Zn+SeO4 showed mean values
91
of 88% and 109%, the Zn+SeO3 treatment showed 114%. In spite of the
higher values for Zn efficiency, the lines of the Zn+SeO3 treatment that
showed highest in Zn efficiency, showed the lowest values for grain
production. Wheat experiments, in Zn-deficient soils, showed seed Zn
content enhancements, however the high Zn efficiency was not associated
with high dry matter or Zn efficiency 42.
The Zn efficiency for nutrient concentration in shoots and grains has
a similar pattern as the abovementioned (Table 3). However, in 50 µM Zn,
the line having the highest Zn efficiency was EMB 33. When we evaluated
the grain concentrations, the most efficient Zn use line was EMB 11
Zn+SeO3-treated, which showed the lowest Zn concentration values. Despite
SeO3 reducing the shoot and grain production, the highest Zn efficiency was
observed under this treatment.
3.4. Interaction among nutrients in wheat grains Zn- and Se-treated
To examine the effect of Zn and Se addition in wheat grains,
cultivated in culture solution upon the accumulation of the other minerals,
we measured treatment responses in terms of the relative concentration of a
number of minerals (Supplementary Figure S1). Adding the treatments in
culture solution resulted in a slight reduction in P concentration in all wheat
lines (Fig. S1A), which agrees with similar results reported for wheat
seedlings in culture solution
33
. The P-Zn interaction is well-known and
documented and Zn supplementation decreases P levels in grains and viceversa
16,22
. In spite of the P-Zn interaction, the treatment Zn+SeO4 showed
the lowest values for relative P concentration in almost all lines. On the other
hand, this treatment increased the Zn concentration in the grains, which
explains the P reduction due to the antagonism between these nutrients
16,22
(Fig. 3A). In general, K concentrations (Fig. S1B) and Ca (Fig. S1C) were
not affected by the treatments. The relative concentration of Mg (Fig S1D) in
wheat grain was similar to those reported for P. Sulfur concentration the
92
grain showed different response in each treatment; while half of the lines Znand Zn+SeO4-treated showed a small enhancement in the relative
concentration of S, Zn+SeO3 reduced S concentration in all lines, with the
exception of EMB 30 (Fig. S1E). S and Se have a synergic interaction
28,33
,
but Se added with Zn was not sufficient to increases the S content in grains.
When we examine micronutrients, they showed different responses in each
treatment. Boron (Fig. S1F) was not affected by Zn or Se addition, whereas
the nutrients Cu (Fig. S1G), Fe (Fig. S1H), Mn (Fig. S1I) and Mo (Fig. S1J)
had suppression in their relative concentration when the treatments were
applied. The treatment Zn+SeO3 was apparently more toxic to Mn levels in
wheat plants. In general, Zn supplementation increases Zn concentration in
all treatments and lines (Fig. S1K). A two-fold increase was observed in
some lines. Apparently, some lines, like EMB 5; 7; 9; 30 and BRS 264, were
stimulated with SeO4 addition, showing different germplasm responses and,
the possibility to work these elements together. On the other hand, SeO3
decreases Zn concentration in most lines.
Conclusions
The treatments affected the mineral status and quality, growth and
yield in wheat tissues. These wheat lines showed genotypic variations in
response to Zn, Zn+SeO4 and Zn+SeO3 treatments exhibiting differences in
Zn efficiency. Thus, the study will be useful to develop and select cultivars
with better plant ability to concentrate micronutrients in edible parts. Taking
into consideration the agronomic parameters, nutrient content, and potential
of increasing nutrients in these wheat lines we indicate the accessions BRS
207; BRS 254; BRS 264; EMB 19 and EMB 33 for biofortification with Zn;
many lines such as Brilhante; BRS 264; EMB 7; EMB 26 and EMB 30
appeared to be appropriate for Zn+SeO4; and Brilhante; BRS 254; Supera;
EMB 20 and EMB 33 for Zn+SeO3.
Abbreviations
93
Fe, iron; Zn, zinc; Se, selenium; I, iodine; Cu, copper; Ni, nickel;
H3HEDTA,
N-2-hydroxyethylethhylenediamine-N,N’,N’-triacetic
acid;
MES, 2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid; Na2SeO4, sodium selenate;
Na2SeO3, sodium selenite; Zn+SeO4, zinc (50 µM) + selenate (10 µM);
Zn+SeO3,
zinc
(50µM)
+
selenite
(10
µM);
QA/QC,
quality
assurance/quality control; P, phosphorous; S, sulfur; K, Potassium; Ca,
Calcium; Mg, Magnesium; B, Boron; Fe, Iron; Mn, Manganese; Mo,
Molybdenum.
Acknowledgement
Authors are thankful to Embrapa CPAC, which kindly sent the
wheat seeds. We thank Dr. Michael Rutzke and Dr. Eric Craft for analyzing
ICP-MS. G.A.S. is grateful to Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) for granting the doctorate scholarships
(regular and sandwich program).
94
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99
Funding sources
G.A.S. is grateful to CNPq, FAPEMIG and CAPES for financial
support. This work was partially supported by the USDA-ARS base fund.
USDA is an equal opportunity provider and employer. Mention of trade
names or commercial products in this publication is solely for the purpose of
providing specific information and does not imply recommendation or
endorsement by the U.S. Department of Agriculture.
100
Figure captions
Figure 1. Effect of treatments on grain dry matter (A) and weight of 100
grains (B) in wheat varieties and cultivars. Values shown are mean ± SE (n =
3). Different letters above the column indicate significant difference at p ≤
0.05 by Skott-Knott test.
Figure 2. Effect of treatments on Zn (A), Se (B), P (C) and S (D) content in
wheat shoots. Values shown are mean ± SE (n = 3). Different letters above
the column indicate significant difference at p ≤ 0.05 by Skott-Knott test.
Figure 3. Effect of treatments on Zn (A), Se (B), P (C) and S (D) content in
wheat grains. Values shown are mean ± SE (n = 3). Different letters above
the column indicate significant difference at p ≤ 0.05 by Skott-Knott test.
Supplemental Figure S1. Relative content of nutrients in wheat grains of 20
lines in response to Zn and Zn+Se treatments. The relative nutrient
concentrations were calculated by dividing the mineral contents following
nutrient treatment with those in control solution. P (A), K (B), Ca (C), Mg
(D), S (E), B (F), Cu (G), Fe (H), Mn (I), Mo (J) and Zn (K). Values shown
are mean ± SE (n=3). Different letters above the column indicate significant
difference at p ≤ 0.05 for treatments.
101
Table 1 – List of wheat accessions used in the experiment (15 varieties and 5
cultivars).
Varieties
Parents
Cultivars
Parents
EMB 1
BRS 207 / CPAC 91161
Brilhante
Brilhante = PF 8640 / BR 24
EMB 5
CPAC 8947 / CPAC 8886
BRS 207
Seri 82 / PF 813
EMB 7
Brilhante / CPAC 961114
BRS 254
BRS 264*3 / ANA 75
EMB 9
BRS 207 / CPAC 9548
BRS 264
Buck Buck / Chiroca // TUI
EMB 10
BRS 207 / CPAC 9548
Supera
PF 9099 / OR 1
EMB 11
CPAC 93175 / Graneiro Inta
EMB 14
CPAC 93175 / Graneiro Inta
EMB 15
CPAC 93175 / Graneiro Inta
EMB 19
BRS 207 / TB 951
EMB 20
IAPAR 17 / BRS 264
EMB 26
CPAC 96306 / CPAC 9985
EMB 30
CPAC 96306 / CPAC 9985
EMB 33
PF 81627 / BRS 264 // PF 990607
EMB 34
Taurum / BRS 207 // PF 8190 / BR 18
EMB 38
PF 013452 / BRS 207
#
The varieties that have the same parents represent different lines selected
from F2 crossing.
102
Table 2 – Effects of the treatments on the Zn use efficiency (%) of shoot and
grain dry matter of wheat accession.
Dry matter (%)*
Shoot
Grain
Accessions
Zn
Zn+SeO4
Zn+SeO3
Zn
Zn+SeO4
Zn+SeO3
EMB 1
81
103
94
67
94
83
EMB 5
63
91
92
66
99
89
EMB 7
99
110
92
102
121
95
EMB 9
77
121
132
71
134
131
EMB 10
49
69
55
80
121
117
EMB 11
87
61
204
99
96
177
EMB 14
141
137
142
68
89
81
EMB 15
115
92
111
128
157
139
EMB 19
80
94
71
48
82
45
EMB 20
106
129
322
97
114
132
EMB 26
82
136
120
98
154
95
EMB 30
113
105
117
127
114
127
EMB 33
85
94
115
46
65
82
EMB 34
59
54
66
54
95
64
EMB 38
146
92
183
88
109
142
Brilhante
86
91
89
81
120
120
BRS 207
167
68
135
137
75
121
BRS 254
92
55
81
83
96
82
BRS 264
167
101
210
137
111
175
Supera
105
118
142
92
135
187
Mean
100
96
129
88
109
114
*The values are means of 3 replicates.
103
Table 3 - Effects of the treatments on the Zn accumulation of shoot and grain
concentrations of wheat accession.
Zn accumulation (%)*
Shoot
Grain
Accessions
Zn
Zn+SeO4
Zn+SeO3
Zn
Zn+SeO4
Zn+SeO3
EMB 1
110
50
40
51
54
69
EMB 5
30
31
56
63
47
75
EMB 7
26
39
64
62
52
98
EMB 9
40
28
43
61
47
62
EMB 10
30
34
83
53
59
80
EMB 11
30
36
116
51
64
116
EMB 14
71
35
41
41
39
58
EMB 15
27
26
74
59
67
68
EMB 19
49
22
83
64
60
94
EMB 20
45
37
52
57
59
62
EMB 26
31
26
51
42
45
73
EMB 30
23
24
31
67
59
81
EMB 33
154
130
108
34
32
41
EMB 34
49
43
74
45
51
72
EMB 38
28
25
26
62
70
85
Brilhante
59
55
11
63
62
82
BRS 207
18
32
24
48
85
77
BRS 254
29
27
77
61
67
75
BRS 264
25
13
26
78
57
72
Supera
25
29
14
63
79
79
Mean
45
37
55
56
58
76
*The values are means of 3 replicates.
104
Figures
Fig. 1
A
35
C o n tro l
Z n+ S eO 4
Zn
Z n+S eO 3
a
Grain dry matter (g)
30
b
a
a
25
a
a
cc
b
c c
a
20
a
b
a
a
15
aa
a
b
10
a
a
b b
b b
b
b
b
c
c aaa
b
c
b
c
aa a
aa
b
a
cc
b
d
a
b
b
b
b
a
c
c
c
a
a
a a
c b b
b
b
c
b
c c
b
a
a
a
a
c
b
c
b
5
6
a
64
pe r
Su
S2
54
BR
BR
BR
S2
07
e
S2
8
an t
B3
Br
EM
EM
ilh
3
4
B3
0
B3
EM
EM
EM
B3
0
6
B2
9
EM
EM
Z n+S eO 4
Zn
Zn+S eO 3
a
5
100 grain weight (g)
B2
B1
C o n tro l
EM
4
5
B1
1
B1
B1
EM
EM
EM
B9
B1
0
B7
EM
EM
EM
EM
B
B5
B1
0
4
a
a aa
a
b b
3
b
b
b
aa
a
b
c
b
aa a
a
a a
b
bb
b
b
a
b
c
a
b
c
a
b
b
c
c
c c
c
a a
a
a
b b
a aa
cc
aa a a a
b
b
bb
a a
b
bbb
c
b
a
a
a a
b
a
b
b b
c
2
1
ra
64
pe
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B5
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B1
0
Figure 1. Effects of treatments on grain dry matter (A) and weight of 100
grains (B) in wheat varieties and cultivars. Values shown are mean ± SE (n =
3). Different letters above the column indicate significant difference at p ≤
0.05 by Skott-Knott test.
8
c
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Fig. 2
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Figure 2. Effects of treatments on Zn (A), Se (B), P (C) and S (D) content in
wheat shoots (flag leaves). Values shown are mean ± SE (n = 3). Different
letters above the column indicate significant difference at p ≤ 0.05 by SkottKnott test.
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Fig. 3
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Figure 3. Effects of treatments on Zn (A), Se (B), P (C) and S (D) content in
wheat grains. Values shown are mean ± SE (n = 3). Different letters above
the column indicate significant difference at p ≤ 0.05 by Skott-Knott test.
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5
B1
1
EM
EM
B1
0
B1
B9
B1
EM
EM
B5
B7
EM
EM
EM
B1
0
Z n+ S eO 3
a
a
a
150
a
a
a
a
a
100
a
b
a
a
a
a
b
a b
b
a a
a
a
a
b
a
b
b
50
a
a
a
a
a
a
b
b
a
a
aa
bb
a
a
a
a
a
a
a
a
a a
b
a
b
b
b
c
b
a
c
K
400
BR
Su
p er
a
64
S2
S2
BR
BR
S2
54
07
e
8
an t
B3
il h
EM
EM
Br
3
B3
EM
EM
4
0
B3
Zn+SeO 4
Zn
B3
0
6
EM
EM
B2
9
B1
EM
B2
4
5
EM
EM
B1
1
B1
EM
B1
0
B1
B9
EM
EM
B5
B7
EM
EM
EM
B1
0
Z n+S eO 3
Zn relative content (%)
a
a
300
a
a
a
a
200
a
b
b
b
b
b
b a
a
b
b
a a
a
a a
a
aa
c
b
c
b
c
b
b
b
b
c
a
a
b
c
a
a
aa
a
b
c
100
a
a
a
a
a
a
b
a
a
b
b
bb
b
a
p er
Su
BR
S2
64
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S2
BR
BR
S2
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an t
il h
B3
Br
4
B3
EM
EM
3
B3
EM
0
B3
EM
0
6
B2
EM
B2
EM
9
B1
EM
4
5
B1
EM
1
B1
EM
0
B1
EM
B1
B9
EM
EM
B5
B7
EM
EM
EM
B1
0
Supplemental Figure. Relative content of nutrients in wheat grains of 20
lines in response to Zn and Zn+Se treatments. The relative nutrient content
113
were calculated by dividing the mineral contents following nutrient
treatment with those in control solution. P (A), K (B), Ca (C), Mg (D), S (E),
B (F), Cu (G), Fe (H), Mn (I), Mo (J) and Zn (K). Values shown are mean ±
SE (n=3). Different letters above the column indicate significant difference
at p ≤ 0.05 for treatments.