Biomembranas 2006/2007
Estudos de permeabilidade passiva de lipossomas em meios isosmóticos
com um não-electrólito
Preparação dos lipossomas
Concentração final de lípido total: 23,35 mM; vol. final: 2 mL
a) DPPC (96%); di-hexadecil-fosfato (di-cetil-fosfato) (4%)
b) DPPC (66%): colesterol (30%); di-hexadecil-fosfato (di-cetil-fosfato) (4%)
Adicionar as quantidades adequadas dos componentes a balões de 50 mL; dissolver com
clorofórmio (5 mL); secar em evaporador rotativo; secar em exsicador com alto vácuo pelo
menos duas horas; ressuspender em 2 mL de cloreto de colina 50 mM acima da
temperatura de transição de fase do DPPC (43 °C) (com esferas de vidro; LMLVs – Large
MultiLayered Vesicles).
Ensaio
Utilizar 30 µL de suspensão por ensaio em 2,5 mL de solução isosmótica de
não-electrólito (glicerol ou etilenoglicol 100 mM). ( Pré-equilibrar meio e lipossomas à
temperatura desejada)
Determinar a velocidade inicial de variação da turbidez (medida a 420 nm) pela tangente à
curva respectiva; fazer gráficos desse valor em função de: temperatura, composição dos
lipossomas e não-electrólito.
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Biomembranas 2006/2007
Preparação de lipossomas de DPPC para estudos de fluorescência
Pesar a massa de DPPC (dipalmitoil fosfatidilcolina) necessária para preparar 15 mL de
solução 345 µM (MM 734,1) para um balão esmerilado de 50 mL.
Dissolver em clorofórmio (± 5 mL) e evaporar em evaporador rotatório (≤ 37 °C) para
formar um filme lipídico uniforme.
Secar em alto vácuo (exsicador) cerca de 4 horas.
Reconstituir em 5 mL de tampão acima de 45 °C (TRIS-maleato 10 mM; KCl 50 mM, pH
7,0) com a ajuda de 2 esferas de vidro e/ou sonicação.
Transferir para tubo rolhado e “sonicar” em banho acima dos 45 °C.
Diluir para o volume final adequado; distribuir pelos tubos (3 mL/cada); adicionar a
sonda a um deles; adicionar droga a outro(s); adicionar a mesma quantidade do solvente
respectivo ao branco.
Relação sonda/lípido: DPH - difenilhexatrieno (2 mM em DMF (dimetilformamida)) 1/200.
Colocar num banho termostatizado com agitação (pulga magnética) acima da transição de
fase do lípido (≥ 45 °C) durante a noite.
Efeito da temperatura nos parâmetros físicos da membrana
Testar às seguintes temperaturas (valores aproximados): 24, 28, 32, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41,
42, 43, 44, 46, 48, 50 ˚C.
Polarização de fluorescência de DPH
Parâmetros instrumentais:
excitação: 336 nm; fenda: 5 nm
emissão: 450 nm; fenda: 5 nm
Leituras: (0 ° corresponde a polarização vertical; 90 °, a horizontal)
(subtrair os valores dos brancos)
Factor correcção G - filtro de excitação a 90 ˚; I=g - f. emissão a 90 ˚; I+g - f. emissão a 0 °.
G = I+g / I=g
Valores - f. excitação a 0 ˚; I= - f. emissão a 0 °; I+ - f. emissão a 90 °.
P = (I= - I+ · G) / ((I= + I+ · G) - polarização de fluorescência
r = (I= - I+ · G) / ((I= + 2 · I+ · G) - anisotropia de fluorescência
Gráfico da variação de P em função da temperatura
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