UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS – UEA
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS – FMT-AM
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
DETECÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA CÉRVICE UTERINA DE
PACIENTES HIV POSITIVAS E EM PORTADORAS DE AIDS
PEDRO MAURICIO DE SOUZA
MANAUS
2004
PEDRO MAURICIO DE SOUZA
DETECÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA CÉRVICE UTERINA DE
PACIENTES HIV POSITIVAS E EM PORTADORAS DE AIDS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação da Universidade do Estado do
Amazonas, para obtenção do grau de Mestre
em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr. SINÉSIO TALHARI
Co-orientadora: Profa CRISTINA MARIA BORBOREMA DOS SANTOS
MANAUS
2004
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
SOUZA, Pedro Mauricio
Detecção do Papilomavírus humano (HPV) na cérvice uterina de pacientes
HIV positivas e em portadoras de AIDS / Pedro Mauricio de Souza – Manaus – AM:
UEA; FMT-AM; 2004.
114 p.: il.
Dissertação (Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas)
1. HPV 2. PCR 3. HIV 4. Câncer de colo uterino I. Título
iii
PEDRO MAURICIO DE SOUZA
DETECÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA CÉRVICE UTERINA DE
PACIENTES HIV POSITIVAS E EM PORTADORAS DE AIDS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação da Universidade do
Estado do Amazonas, para obtenção do
grau de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
BANCA EXAMINADORA:
Spartaco Astolfi Filho (Doutor)
Universidade Federal do Amazonas-UFAM
Luiz Carlos de Lima Ferreira (Doutor)
Universidade Federal do Amazonas-UFAM
Sinésio Talhari (Doutor)
Universidade Federal do Amazonas-UFAM
Manaus, 25 de novembro de 2004.
iv
Este trabalho foi desenvolvido na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas-FMTAM,
com
recursos
parcialmente
providos
pela
Superintendência da Zona Franca de Manaus através do convênio nº 035/2002.
v
Aos filhos Pedro Junior, Joyce
Christina
e
Victor
Fernando,
companheiros de todas as viagens,
cujo caráter considero o meu melhor
trabalho.
vi
O esforço é grande e o homem é pequeno,
E eu, navegador, deixei
Este padrão ao pé do areal moreno
E para deante naveguei.
A alma é divina e a obra, imperfeita
Este padrão signala ao vento e aos céus
Que, da parte ousada, é minha a parte feita:
O por-fazer é só com Deus.
Fernando Pessoa
7
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Professor-Doutor Sinésio Talhari, criterioso e exigente na busca
pelo conhecimento, parceiro e amigo nas incertezas do caminho.
Ao Professor-Doutor Spartaco Astolfi Filho, cujo exemplo em compartilhar o
conhecimento, ao abrir as portas da Biologia Molecular da UFAM para um projeto
extra-muros, só dignifica aquela instituição.
À Professora-Doutora Edith Suzana Elizabeth Fanta, da Universidade Federal do
Paraná, valorosa companheira de expedições antárticas, pelo apoio incondicional a
este projeto.
À Professora Cristina Borborema dos Santos, pelo empenho e dedicação ao
colaborar neste projeto, e pela paciência de ensinar a um pesquisador afeito à
clínica e à cirurgia, os segredos da manipulação genética e da biologia molecular.
À Professora-Doutora Graça Barbosa, pela inestimável compreensão e por ter
acreditado neste projeto.
Ao Professor-Doutor Worney Silva Miranda Braga, pelas revisões e tratamento
estatístico dos dados deste projeto.
À Professora Marilaine Martins, a fonte em que bebi da esperança de chegar a um
resultado final.
À Professora Júnia Dutra, colaboradora que não desanimou mesmo quando as
reações insistiam em não dar certo, e pacientemente me ajudou a recomeçar
quantas vezes o tempo nos permitiu.
À Dra. Leny Passos, ao Doutor Silas Guedes de Oliveira e à Dra. Alba Montarroyos
e por extensão à todos da SUSAM, minha casa, pela condescendência nas horas
subtraídas e dedicadas a este projeto.
Ao Excelentíssimo Sr. Dr. Wilson Duarte Alecrim, atual Secretario de Saúde, por
cujas mãos, iniciei esta pós-graduação.
Às pacientes HIV positivas da FMTAM, que com seu carinho e seu sorriso confiante,
extraído de condições adversas, me legaram a lição maior deste trabalho: a de que
viver é a mais importante das conquistas.
8
RESUMO
O papilomavírus humano (HPV), associado a doenças imunodepressoras, tais como
a ocasionada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), tem sido apontado como
agente causal de neoplasias intra-epiteliais, entre elas o câncer de colo uterino. No
presente estudo, procurou-se detectar o HPV no colo uterino de pacientes HIV
positivas, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR) e os métodos
clássicos como a colpocitologia e a colposcopia; estes achados foram
correlacionados com os níveis de células T-CD4+ das pacientes. Nos casos em que
foi detectado o HPV procurou-se, ainda, identificar o sorotipo infectante, via
seqüenciamento do DNA viral, por comparação das seqüências de nucleotídeos
encontradas e as armazenadas no Gene Bank. Dentre as 70 pacientes estudadas,
detectou-se o HPV, por PCR, em 10 pacientes (14,2%); em 6 destas amostras
conseguiu-se identificar o sorotipo de HPV, respectivamente os sorotipos 6, 16 (em
duas amostras) e 53, 58, 70, nas demais. A colpocitologia revelou efeitos citopáticos
compatíveis com o HPV em 13 pacientes (18,5 %) e a colposcopia permitiu
visualizar as lesões indicativas de acometimento pelo HPV em 19 pacientes (27,1
%). A contagem de células T-CD4+ foi inferior a 200/mm3 em 16 pacientes,
caracterizando serem portadoras de AIDS, enquanto que as 54 restantes
apresentavam T-CD4+ acima de 200/mm3. Os achados indicativos da presença do
HPV consubstanciados pela colpocitologia (13), pela colposcopia (19) e os achados
de certeza da presença do DNA-HPV obtidos por PCR (10), apresentaram
distribuição uniforme e foram significativamente mais presentes no segmento que
apresentou contagens de células T-CD4+ abaixo de 200/mm3. A abordagem
estatística destes resultados, demonstrou significativa elevação do risco relativo das
pacientes com T-CD4+ abaixo de 200/mm3 serem portadoras do HPV, permitindo
concluir pela validade destes métodos no rastreamento do papilomavírus.
Palavras chaves: papilomavirus humano, reação em cadeia da polimerase, vírus da
imunodeficiência humana.
9
ABSTRACT
Human Papilomavirus (HPV) associated with immunologic deficiency as related to
human immunodeficiency virus (HIV) has been pointed as responsible for intraepithelial neoplasia such as womb cervix cancer. This study intended to find HPV in
the womb cervix of HIV positive women by PCR (polymerase chain reaction). The
research of HPV was made also through current procedures such as colpocitology
(Papanicolaou) and colposcopy linking these findings with T-CD4+ cells levels. When
HPV was detected its identification was tried by DNA sequencing procedure, by
comparison with HPV stored nucleotides sequences on Gene Bank. In the study of
70 patients with HIV the HPV was found in 10 (14,2%) and 6 sorotipes was identified.
Colpocitology revealed celular effects of HPV in 13 pacients and colposcopy
allowed to view HPV injuries in 19. T-CD4+ countdown was low than 200/mm3 in 16
patients while in the other 54 the CD4 was above 200/mm3. The statistical approach
to these data conduces to a significant increased relative risk to be infected by HPV
in the group that shows T-CD4+ cells bellow 200/mm3 and allows to conclude by
validity of this methods on papilomavirus research.
Keywords:
Human papilomavirus, Human Imunodeficiency virus, Polymerase
chain reaction.
10
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ......................................................................................................
1.1 Etiologia ...........................................................................................................
1.2 Epidemiologia ..................................................................................................
1.3 Patogênese .....................................................................................................
1.4 Diagnóstico ......................................................................................................
01
02
02
04
06
2 OBJETIVOS .......................................................................................................
2.1 Objetivo geral ..................................................................................................
2.2 Objetivos específicos ......................................................................................
11
11
11
3 METODOLOGIA .................................................................................................
3.1 Tipo de estudo .................................................................................................
3.2 População de estudo .......................................................................................
3.3 Declaração de consentimento e ficha de triagem ...........................................
3.4 Coleta de material ...........................................................................................
3.5 Extração de DNA .............................................................................................
3.6 PCR controle do material extraído ..................................................................
3.7 Amplificação do DNA-HPV por PCR ...............................................................
3.8 Eletroforese em gel de agarose ......................................................................
3.9 Purificação das amostras ................................................................................
3.10 Reação para seqüenciamento ......................................................................
3.11 Precipitação do produto da reação de seqüenciamento ...............................
3.12 Eletroforese de seqüenciamento ...................................................................
3.13 Alinhamento das amostras seqüenciadas .....................................................
3.14 Análise das seqüências nucleotídicas ...........................................................
12
12
12
13
13
14
15
16
17
18
18
19
19
21
21
4 RESULTADOS ...................................................................................................
4.1 Distribuição das pacientes ..............................................................................
4.2 Resultados da PCR .........................................................................................
4.3 Resultados do seqüenciamento e identificação dos sorotipos de HPV ..........
4.4 Resultados de colpocitologia ...........................................................................
4.5 Resultados de colposcopia .............................................................................
4.6 Análise conjunta dos resultados e testes de significância ..............................
22
22
23
24
25
26
27
5 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 31
5.1 Considerações gerais ...................................................................................... 31
5.2 Importância dos métodos de detecção do HPV .............................................. 32
11
CONCLUSÃO ........................................................................................................ 35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 36
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ............................................................................ 38
ANEXOS ...............................................................................................................
40
1. INTRODUÇÃO
O vírus do papiloma humano (HPV) é um DNA-vírus não cultivável, do grupo
Papovavírus. Atualmente são conhecidos mais de 80 tipos, sendo divididos em três
grupos de acordo com o potencial de oncogenicidade. O grupo de vírus de alto risco
oncogênico (subtipos 16, 18, 31, 33 e 45), quando associados a outros co-fatores
como, por exemplo, a imunodepressão, têm relação direta com o desenvolvimento
das neoplasias intra-epiteliais e do câncer invasor do colo uterino. (1)
A infecção pelo papilomavírus humano (HPV), conhecida desde os
primórdios da medicina, através de sua manifestação mais evidente, o condiloma
acuminado, foi descrita pela primeira vez por Hunter, que em 1786 caracterizou as
verrugas genitais como lesões da sífilis. Em 1838, Ricord reconheceu estas lesões
como doença não relacionada à Lues. Anos mais tarde em 1954, ao se observar
verrugas vulvares em mulheres de soldados que combateram na Coréia, e que
apresentavam verrugas penianas, evidenciou-se a infectividade sexual.
(2)
Atingindo
proporções epidêmicas em algumas regiões, a infecção pelo HPV representa um
autêntico desafio em termos de saúde pública, pois afeta milhões de indivíduos em
todo o mundo. Atualmente, a infecção pelo HPV é a doença sexualmente
transmissível (DST) viral mais freqüente na população sexualmente ativa.(3)
1.1 ETIOLOGIA
O papilomavírus é membro da família Papovaviridae (vírus produtores de
vacúolos), consistindo num vírion icosaédrico com 72 capsômeros. Seu genoma é
uma dupla hélice circular de DNA, possuindo cerca de 7900 pares de bases e a
2
análise da seqüência de nucleotídeos é a base do método de classificação dos
vários subtipos virais, já tendo sido descritos mais de 80 sorotipos diferentes. (4)
Um genoma de HPV é considerado como representativo de um novo tipo
quando suas seqüências de genes E6, E7 e L1, (em torno de um terço do genoma),
diferem em mais de 10 % de qualquer tipo de HPV previamente conhecido. (5)
Os tipos de HPV variam no seu tropismo tecidual, nas suas associações a
lesões diferentes e no seu potencial oncogênico. De acordo com a homologia da
seqüência de DNA e associação a lesões clínicas, eles podem ser agrupados em:
•
Tipos mucosos
•
Tipo cutâneos
•
Tipos cutâneos associados à epidermodisplasia verruciforme
Embora alguns tipos de HPV possam acometer sítios diversos, nosso
interesse, neste trabalho, estará voltado para os tipos mais comumente associados
às lesões das mucosas, especialmente a mucosa genital.
1.2 EPIDEMIOLOGIA
Por ser doença de notificação não compulsória, a real prevalência
é
desconhecida em nosso meio. Em 1996, o “Centers for Disease Control (CDC)”,
estimava em 500 mil a 1 milhão de casos novos de infecção pelo HPV por ano nos
Estados Unidos. Referia, também, neste ano, 80 mil novos casos de síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS), 200 a 500 mil casos de herpes, 100 mil casos de
sífilis e 800 mil casos de gonorréia naquele país. Na ocasião, os índices de HPV
eram superados apenas pela infecção por Clamídia (4 milhões) e Tricomoníase (3
milhões).
(6)
3
Mais recentemente, com o desenvolvimento da técnica da reação em cadeia
da polimerase (polymerase chain reaction-PCR), descobriu-se que as infecções pelo
HPV podem ser muito mais comuns, atingindo desde portadoras assintomáticas até
pacientes com câncer cervical invasivo. A prevalência de DNA-HPV, em geral,
considerando diferentes populações femininas do mundo, tem variado entre 4% e
75%, segundo a técnica de PCR.
(7)
Nos Estados Unidos e na Inglaterra, a incidência de verrugas genitais
aumentou de 2,5 a 8 vezes durante as duas últimas décadas. Entre os americanos,
a incidência de condiloma acuminado aumentou de 13 para 106 casos por 100.000
entre o início dos anos 50 e o final dos anos 70. Segundo estudos realizados em
mulheres sexualmente ativas com citologia oncótica normal, a prevalência do DNAHPV variou entre 3,7% e 47,9%, atingindo até 98% em citologias que apresentavam
discariose grave.
(8)
O interesse pelo HPV tem aumentado desde a primeira identificação das
seqüências de DNA (tipos 16 e 18) nas biópsias de câncer cervical. Atualmente, a
relação causal entre o HPV e o câncer de cérvice está bem estabelecida.
(9)
Segundo a Agência Internacional para a Pesquisa do Câncer (IARC), dos
mais de 80 tipos conhecidos de HPV, somente 30 parecem infectar a genitália.
(10)
As verrugas genitais são mais comuns em pessoas sexualmente ativas, entre 20 e
24 anos, independentemente do tipo de HPV. Após esta faixa etária, a prevalência
declina gradativamente. Estudos realizados em países desenvolvidos detectaram
menos de 10% de positividade ao HPV em indivíduos no grupo de 40 anos. Em
crianças com 2 a 11 anos, que sofreram abuso sexual, os índices de DNA-HPV
atingem 33%, aproximando-se dos encontrados em adolescentes sexualmente
ativas, pós-menarca (19% - 33%). (11)
4
Com o desenvolvimento da técnica de PCR para detecção do DNA viral, os
estudos epidemiológicos redesenharam o perfil da infecção cérvico-vaginal pelo
HPV. Entretanto, nem todos têm reproduzido uniformemente os mesmos resultados.
No Brasil, alguns estudos utilizando a técnica de PCR encontraram
diferentes taxas de prevalência. Em estudo de caso-controle realizado em São
Paulo, observou-se presença de 17% de DNA-HPV no grupo controle e de 84% no
grupo com câncer de colo uterino.
(9)
No Amazonas, a única publicação existente relacionada ao HPV na cérvice
uterina, refere o achado de 32 amostras positivas para o DNA-HPV por PCR em 83
pacientes com câncer de colo uterino (39,8%), atendidas na Fundação Centro de
Controle de Oncologia de Manaus, com prevalência do subtipo 16. (12)
1.3 PATOGÊNESE
A inoculação viral ocorre nas camadas mais profundas dos epitélios
pavimentosos previamente traumatizados, especialmente pelo microtraumas que
ocorrem durante o ato sexual. (6)
Conforme o recente Consenso Brasileiro de HPV, a história natural da
infecção pelo HPV pode ser dividida nas seguintes fases: (1)
•Fase 0: Inoculação
•Fase I: Incubação
•Fase II: Fase precoce
•Fase III: Fase tardia
5
1. Fase 0 – INOCULAÇÃO
O vírus penetra no novo hospedeiro através de microtraumatismos. A seguir,
os vírions progridem até a camada basal, atravessando a membrana citoplasmática.
O genoma viral é transportado para o núcleo, onde é traduzido e transcrito. Duas
classes de proteínas são codificadas: proteínas transformadoras, que induzem
funções na célula hospedeira e proteínas reguladoras, que controlam a expressão
dos genes virais.
2. Fase I - INCUBAÇÃO
O período de incubação do papilomavírus varia de 2-3 semanas a 8 meses
e parece estar relacionado com o estado imunológico individual. A evolução da
doença é, por vezes, imprevisível. Remissões espontâneas são observadas com
freqüência, sobretudo quando são instituídos melhores cuidados de higiene, bem
como quando se elimina parte da lesão. Como o contato sexual não produz verrugas
genitais em todos os casos, fica claro que a imunidade celular ou outros fatores
locais influenciam decisivamente na transmissão do vírus.
De fato, pacientes
imunodeprimidos, além de apresentarem maior incidência da doença, costumam
responder mal às terapêuticas instituídas. A progressão da fase de inoculação para
a de expressão ativa depende de três fatores: da permissividade celular, do tipo de
vírus e do estado imunológico do hospedeiro.
3. Fase II – FASE PRECOCE
Aproximadamente, três meses após o surgimento das primeiras lesões,
inicia-se resposta imune adquirida que pode conter a infecção (regressão) ou ser
insuficiente para eliminá-la (fase de expressão ativa).
6
As evidências da importância da imunidade celular na contenção das
infecções pelo HPV são:
a) Aumento da incidência durante a gravidez;
b) Alta freqüência em transplantados e imunocomprometidos;
c) Aumento da freqüência, gravidade e recidivas em indivíduos HIVpositivos, principalmente nos que desenvolvem AIDS.
4. Fase III – FASE TARDIA
Em torno de nove meses após o aparecimento das primeiras lesões, os
pacientes podem apresentar dois tipos de situação clínica:
a) Os que continuarão em remissão e potencialmente infectantes para seus
parceiros sexuais; e
b) Os que recidivarão, expressando doença ativa.
1.4 DIAGNÓSTICO
A infecção pelo HPV se manifesta de diversas formas e o diagnóstico pode
ser feito através da simples inspeção da genitália, nos casos de condilomatose
vulvar; pelo exame ginecológico, através da inspeção das paredes vaginais e do
colo uterino ou utilizando-se propedêutica subsidiária, como a colpocitologia,
colposcopia, histopatologia e métodos mais sofisticados de biologia molecular – a
hibridização in situ, a captura híbrida e a reação em cadeia da polimerase (PCR). (5)
Dependendo dos recursos utilizados na sua caracterização, a doença
ocasionada pelo HPV é classicamente observada sob três formas distintas: (5)
Forma Clínica: ocorre com menor freqüência, sob a forma de verrugas na
genitália, por vezes de aparência exuberante, sendo detectadas ao exame
7
convencional, à vista desarmada. São mais freqüentes na região vulvar, e aparecem
como tumorações múltiplas, sésseis, amolecidas, de superfície irregular. São menos
freqüentes nas paredes vaginais e no colo do útero. Nesta localização, acometem
preferencialmente a zona de transformação, como áreas não coráveis ao teste de
Schiller (zona iodo negativa).
Os condilomas acuminados são geralmente consignados pelos HPV dos
tipos 6 e 11 e porisso, raramente se relacionam aos processos neoplásicos
malignos.
Forma Subclínica: diagnosticada apenas com métodos subsidiários,
especialmente a colposcopia. É bem mais freqüente que a anterior. Os achados
colposcópicos preditivos da infecção pelo HPV consistem numa micropapilomatose
difusa, geralmente pruriginosa. No achado mais característico, o epitélio acetobranco, formado por áreas aparentemente normais ao exame colposcópico não
alargado, tornam-se nítidamente esbranquiçadas após a aplicação de ácido acético.
A colpocitologia é outro método rastreador, pois permite visualizar os efeitos
citopáticos determinados pelo vírus. A alteração mais evidente é a coilocitose,
caracterizada por células superficiais e intermediárias, com halo claro, peri-nuclear;
podendo haver disceratose e discariose. (5)
Forma Latente: consiste na presença do DNA viral, sem quaisquer
evidências clínicas ou subclínicas da infecção. Além de ser a mais freqüente, por
seu caráter insidioso, é comparada por epidemiologistas à porção submersa de um
iceberg. É assintomática, não infectante e não relacionada diretamente à
oncogenicidade enquanto não evoluir para uma das outras formas. Somente é
diagnosticada, através da detecção da seqüência gênica do DNA dos diversos tipos
8
de HPV. A amplificação em cadeia de um curto segmento de porção do vírus,
consegue detectar com segurança a sua presença. (5)
Indivíduos imunodeprimidos parecem manter o DNA-HPV de forma
persistente. (13) Em lavados cérvico-vaginais de dois grupos de mulheres (124 HIVpositivas e 126 HIV-negativas), a prevalência estimada do HPV foi de 42,8% no
primeiro grupo e de 13,4% no segundo.
(13)
Os condilomas acuminados e as formas subclínicas de infecção pelo HPV
estão entre as doenças anogenitais mais comuns em pacientes HIV positivas. Têm
transmissão sexual e são causados pelo HPV, principalmente pelos tipos 6, 11, 16,
18, 31, 33 e 35.
Nos
(14)
pacientes
com
AIDS
ocorre
alteração
da
imunidade
celular,
representando importante fator de risco para a infecção pelo HPV e para o
desenvolvimento de lesões da região anogenital, além de modificar a história natural
da infecção por HPV preexistente.
(15)
Essas lesões são mais agressivas e difíceis
de erradicar em pacientes com AIDS, embora os tipos de HPV sejam os mesmos da
população soronegativa.
(15)
Apresentam, no entanto, evolução mais rápida, tanto
nas suas formas exofíticas como nas alterações precursoras de câncer do trato
genital inferior (neoplasias intra-epiteliais cervical, vulvar, vaginal, etc.).
(18)
Dados da literatura indicam maior prevalência de infecção pelo HPV nesta
população quando comparada à dos soronegativos.
(16)
O risco de a paciente com
AIDS desenvolver câncer do colo uterino encontra relação direta com o grau de
imunodeficiência causada pelo HIV no momento da infecção pelo HPV. Já está
demonstrado que as lesões intra-epiteliais não estão diretamente associadas ao HIV
per se, mas ao grau de imunossupressão que ele desencadeia.
(16)
9
Através da análise de casuísticas recentes pode-se observar maior
prevalência do HPV em pacientes HIV positivas ou com AIDS, embora os resultados
variem de 5,6% a 75,6% de positividade, conforme a população estudada e a
metodologia empregada. (1)
O total de células T-CD4+ influencia na associação entre as duas viroses,
visto que doentes com valores inferiores a 200/mm3 apresentam maior incidência de
infecção pelo HPV.
(16)
Os indivíduos HIV positivos têm maior possibilidade de desenvolver
neoplasias intra-epiteliais ou invasoras que a população soronegativa. A progressão
das lesões provocadas pelo HPV para neoplasia é inversamente proporcional ao
estado imunológico do paciente. O “Centers for Disease Control (CDC)”, há quase
uma década, classifica as pacientes HIV positivas com câncer invasivo de colo
uterino como portadoras de AIDS, independentemente do número de células TCD4+.
(18)
O tempo de evolução para o desenvolvimento do câncer invasivo do colo
uterino é de aproximadamente uma década; entretanto, nas pacientes HIV positivas,
esse período pode diminuir para um ou dois anos.
(18)
A relação HPV/HIV é clara quanto ao desenvolvimento de neoplasias intraepiteliais, embora o mecanismo de interação entre as duas infecções não seja
inteiramente conhecido.
No Brasil, segundo a International Agency for Research on Cancer – (IARC),
há uma incidência de 24.445 casos anuais de câncer do colo uterino, com 8.815
casos de morte por esta doença. (17)
Estima-se que a região norte tenha apresentado ocorrência de 1.120 casos
em 2002, sendo 305 (27,2%), com êxito letal segundo o Instituto Nacional do Câncer
- INCA. Ainda, segundo dados do INCA, para o ano de 2002, no estado do
10
Amazonas a incidência para o câncer de colo uterino foi de 23,94/100.000
habitantes e a taxa de mortalidade situou-se em 6,47/100.000 habitantes.
(18)
Dentre as mulheres brasileiras, o câncer cervical tem representado o
problema de saúde mais freqüente, sendo a infecção pelo HPV, o principal
fator de risco para o desenvolvimento desta enfermidade.
Considerando a alta incidência do câncer cervical, a maior suscetibilidade
das pacientes imunocomprometidas para as alterações intra-epiteliais precursoras
deste câncer e o reconhecido papel de alguns subtipos de HPV como agentes
facilitadores desta neoplasia, procuramos, neste trabalho, identificar a coinfecção
HPV/HIV. Inicialmente, através do exame ginecológico das pacientes participantes
do estudo, subsidiado por propedêutica preditiva da presença do HPV, como a
colpocitologia e a colposcopia, seguidas da PCR, correlacionando-a ao grau de
imunossupressão. Nas amostras que revelaram a presença do HPV, procurou-se
identificar, via seqüenciamento de DNA, os subtipos prevalentes.
No estado do Amazonas, segundo a Coordenação Estadual de DST/AIDS,
foram notificados desde 1986, 1610 casos de AIDS; deste total, 411 são mulheres.
Atualmente, 845 pacientes de ambos os sexos, estão cadastrados para
acompanhamento de HIV/AIDS na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
Até o presente momento, não dispomos de dados relativos à coinfecção HIV/HPV
destas mulheres. Portanto, conhecer o tipo (oncogênico ou não) do HPV é
importante para o prognóstico destas pacientes. Este é o principal objetivo deste
trabalho.
11
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a presença do Papilomavírus Humano (HPV) e seus subtipos no
colo uterino de pacientes portadoras do vírus da imunodeficiência humana (HIV),
utilizando a colposcopia, a colpocitologia e a técnica da reação em cadeia da
polimerase (PCR).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1
Avaliar
a
validade
dos
exames
clínico-ginecológico,
colpocitológico e colposcópico como métodos subsidiários em relação à
PCR, na observação de indícios ou evidências de HPV.
2.2.2 Correlacionar a associação do HPV com os níveis de células TCD4+
das pacientes;
2.2.3 Orientar adequadamente as pacientes em relação à necessidade
de exames periódicos para a prevenção do carcinoma de colo de útero.
12
3. METODOLOGIA
3.1 TIPO DE ESTUDO
Trata-se de estudo prospectivo, em que se fez avaliação clínico-ginecológica
de pacientes HIV-positivas ou portadoras de AIDS, coleta de secreção cérvicovaginal para PCR e colpocitologia, seguida de colposcopia.
3.2 POPULAÇÃO DE ESTUDO
A população alvo do presente estudo foi de pacientes portadoras do vírus
HIV, da demanda espontânea, atendidas na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas, no período de Janeiro a Setembro de 2004. As pacientes foram divididas
em dois grupos, segundo a contagem de linfócitos T-CD4+. Foi constituído um grupo
de pacientes com contagens de T-CD4+ acima de 200/mm3 e outro, com doentes
que apresentavam células T-CD4+ abaixo de 200/mm3. De acordo com o Ministério
da Saúde são definidos como portadores de AIDS, os pacientes com células T-CD4+
abaixo de 200/mm3. O trabalho foi desenvolvido com 70 mulheres HIV positivas que
fazem acompanhamento ambulatorial na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas (FMTAM), em Manaus. Estes casos, segundo a Coordenação Estadual
de DST/AIDS, correspondem a 18,24% da população feminina, notificadas como
portadoras do HIV. Foram incluídas as pacientes que aceitaram participar do projeto.
A distribuição da população do estudo em dois grupos, de acordo com
a contagem de células T-CD4+ mais recente, teve por finalidade estabelecer,
no momento da inclusão no trabalho, aquelas que efetivamente apresentavam
13
o diagnóstico de AIDS, ou seja, com CD4 abaixo de 200/mm3 e as portadoras
assintomáticas de HIV.
O atendimento consistiu em anamnese dirigida das pacientes, com
ênfase nos aspectos ginecológicos de suas queixas principais, seguida de
explanação detalhada dos objetivos do estudo e dos procedimentos a que a
paciente seria submetida. Estas informações tinham, também, por finalidade,
obter o consentimento para inclusão no projeto.
3.3 DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO E FICHA DE TRIAGEM
As pacientes foram previamente esclarecidas quanto aos benefícios e
riscos que envolviam a sua participação nos grupos e após consentirem,
assinaram Declaração de Consentimento
(Anexo A) e responderam a
Questionário Padrão de Identificação (Anexo B), ficando-lhes assegurada a
inteira confidencialidade dos dados ali registrados.
3.4 COLETA DE MATERIAL
Os procedimentos foram hierarquizados de forma a não interferirem
nos resultados subseqüentes, seja pelo uso de corantes ou pela insuficiência
de material para coletas posteriores. Assim, estabeleceu-se a seqüência de
iniciarem-se os procedimentos pela inspeção da genitália externa, à procura
de indícios ou lesões evidentes de condilomatose, seguida de exame
especular, com inspeção das paredes vaginais e do colo uterino. A seguir,
procedeu-se à coleta de material da endocérvice para posterior análise e
detecção
de
colpocitologia
DNA-HPV.
oncótica
Posteriormente,
(Papanicolaou).
coletou-se
Por
último,
material
foi
para
a
realizada
a
14
colposcopia, com videocolposcópio, sendo feita a colposcopia convencional
e a colposcopia alargada, após tratamento com ácido acético e posterior
embrocação do colo com solução de Lugol.
As amostras foram coletadas com o auxílio de escova do tipo citobrush, devidamente acondicionadas em microtubos de 1,5 mL contendo 400
µL de solução tampão TE ( Tris-HCl 50mM pH 8,0 e EDTA 1mM ) e mantidas a 20ºC. A seguir foram encaminhadas ao Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Federal do Amazonas, para serem submetidas à extração do
DNA e os procedimentos para a detecção de HPV e seqüenciamento do DNA.
Para a realização da colpocitologia (Papanicolaou), fez-se esfregaço de
ectocérvice e de endocérvice. Este material foi analisado pelo serviço de Anatomia
Patológica da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
3.5 EXTRAÇÃO DE DNA
Para a extração do DNA, foram adicionados 400 µL de “TPK”a 400 µL da
amostra coletada, descrita no item anterior. A solução de “TPK” consiste em mistura
de 900µL de TE (Tris HCl 50mM + EDTA 1mM pH 8,0) + 100µL de Tween 20 a 20%
+ 20µL de proteinase K µ10 mg/mL. Essa mistura foi levada ao banho–maria a 55ºC
por 1 hora e depois, fervida por 10 minutos, conforme a técnica descrita por Bauer &
Manos em 1998. (19)
As pacientes apresentando colo uterino com zona de erosão, friável ao
toque da escova, apresentaram sangue nas amostras; isto exigiu que a extração do
DNA fosse realizada pelo método que utiliza o Fenol-Clorofórmio, conforme descrito
por Sambrook. (20)
15
Para a extração por Fenol-Clorofórmio, utilizou-se 200 µL da preparação
acima citada, aos quais foram adicionados 200 µL de Fenol e homogeneizados por
10 minutos, seguindo-se 10 minutos de centrifugação a 14.000 r.p.m. Coletou-se o
sobrenadante (cerca de 200 µL) e adicionou-se 200 µL de solução de fenolclorofórmio-álcool isoamílico. Após ser homogeneizado por 10 minutos, centrifugouse por 10 minutos. Coletou-se o sobrenadante (cerca de 150 µL) e adicionou-se 150
µL de clorofórmio hidratado. Agitou-se suavemente por 10 minutos e centrifugamos
por mais 10 minutos. Coletou-se o sobrenadante (cerca de 100µL) e adicionou-se
1/10 deste volume, de NaCl 5M, ou seja, 10 µL de NaCl 5M mais 1000 µL de etanol
absoluto com 2 µL de glicogênio, que é utilizado apenas para facilitar a visualização
do “pellet”, que consiste em DNA precipitado e sedimentado. Esta mistura deve
então ser bem homogeneizada. Deixou-se precipitando a menos 70 ºC durante 3
horas. Centrifugou-se então a 12.000 g, a 4ºC por 15 minutos. O sobrenadante foi
descartado com o auxílio de uma micropipeta. A seguir, lavou-se o “pellet” com 500
µL de etanol a 70 % gelado. Centrifugou-se a 10.000 g por 5 minutos. Descartou-se
o sobrenadante com cuidado para não perder o concentrado de DNA. Deixou-se
secar e ressuspendeu-se o “pellet” em 30 µL de TE (Tris HCl + EDTA). Deixou-se na
geladeira por uma noite para dissolver bem. Deve-se conservar esta amostra de
DNA extraído em congelador, a menos 20 ºC.
3.6 PCR CONTROLE DO DNA EXTRAÍDO
Paralelamente à PCR, que utilizou os iniciadores (primers) MY09 e MY11, foi
feita a reação de amplificação para controle do DNA da amostra em estudo. Foram
utilizados os iniciadores que amplificam uma região de microsatélite do cromossomo
15, de 170 pares de bases. (21)
16
3.7 AMPLIFICAÇÃO DO DNA-HPV POR PCR
A amplificação por PCR foi realizada com os iniciadores específicos
degenerados MY09 e MY11, que têm como alvo a região L1, porção altamente
conservada de diversos tipos do HPV, segundo técnica originalmente descrita
por Bauer & Manos em 1998.(25) Estes primers promovem a amplificação de
fragmentos de 450 pares de bases de, pelo menos, 25 tipos distintos de HPV
que infectam o trato genital. (13)
As reações de PCR foram realizadas com 35 ciclos de amplificação em
aparelho termociclador Eppendorf - Mastercycler Gradient, conforme o
seguinte programa: 1 minuto à 95ºC para desnaturação, 1 minuto à 55ºC para
anelamento e 1 minuto à 72ºC para a síntese. Após os 35 ciclos, seguiram-se 5
minutos a 72ºC para extensão. (19)
Na tabela 1 são apresentadas as sequências de bases orgânicas nitrogenadas
componentes dos iniciadores MY 09 e MY 11.
Tabela 1: Descrição dos iniciadores MY 09 e MY 11
OLIGONUCLEOTÍDEOS DNA ALVO
5' → 3'
MY11
ACIMA HPV L1
GCMCAGGGWCATAAYAATGG
MY09
ABAIXO HPV L1
CGTCCMAARGGAWACTGATC
W = A + T; R = A + G; M = A + C; K = G + T; Y = C + T.
O sistema de PCR foi composto de: 31µL de água Milli-Q; 5,0µL de Tp 10x
(500mM KCl e 100mM Tris-HCl (pH 8,5)); 1,5µL de MgCl 2 50mM; 1,0µL do
“pool” de dNTP (10mM); 3,0µL do primer MY09 (5pmol); 3,0µL do primer MY11
(5pmol); 0,5µL da Enzima Taq polimerase 5U/µL e 5,0µL da solução contendo a
17
amostra de DNA, totalizando um volume final de 50µL, conforme a técnica de
Bauer & Manos, 1998. (19)
3.8 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese, em gel de
agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio (1,0µg/ml) por vinte minutos,
para posterior visualizalização sob luz ultravioleta. Para as fotografias, utilizouse equipamento da Pharmacia Biotech, Image Master VDS FTI-500. Na figura 1,
o gel de agarose fotografado, evidencia maior positividade para a presença de
DNA-HPV, para as amostras cuja extração do DNA foi realizada pelo fenolclorofórmio, independentemente da concentração de DNA contida na amostra.
1 µL de DNA-HPV
BR
06
12
13
12
FC
2 µL de DNA-HPV
13
M
06
12
13
3 µL de DNA-HPV
12
FC
13
FC
06
12
13
12
FC
BR: branco (sem DNA); FC: fenol-clorofórmio; M: marcador
Figura 1: Fotografia de gel de agarose, corado com brometo de etídio, com
amostras positivas em diferentes concentrações de DNA-HPV.
18
3.9 PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras que revelaram a amplificação do fragmento de 450 pb
foram submetidas à purificação em colunas “QIAquick PCR Purification Kit –
QIAGEN”, para seqüenciamento. Para a purificação das amostras de PCR
adotou-se os seguintes procedimentos:
a) Adicionou-se 5 volumes do tampão PB para cada volume de amostra
amplificada;
b) Colocou-se o volume total com o “QIAquick spin column” em tubo
Eppendorf de 2 ml;
c) Para ligar o DNA, aplicou-se a amostra do “QIAquick” e centrifugou-se por
60 segundos;
d) Descartou-se o líquido que fluiu da coluna e colocou-se o “Qiaquick” de
volta no mesmo tubo;
e) Lavou-se com 750 ml de tampão PE e centrifugou-se novamente por 60
segundos;
f) Para isolar o DNA, adicionou-se 50 µL do tampão EB.
3.10 REAÇÃO PARA SEQUENCIAMENTO
As amostras foram seqüenciadas utilizando-se o primer MY09 ou o
MY11, em seqüenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biociences).
Para o seqüenciamento foi utilizado o seguinte sistema de reação: 5,0µL do
DNA; 4,0 µL do pré – mix DYEnamic ET – terminator Kit; 1,0µL do primer
MY09 ou MY11, 5 pmol/µL, tendo sido realizado o seguinte programa: 95ºC por
25 segundos;
19
95ºC por 15 segundos; 50ºC por 20 segundos; 60ºC, por 1 minuto, repetidos
por 30 ciclos de amplificação.
3.11
PRECIPITAÇÃO
DO
PRODUTO
DA
REAÇÃO
DE
SEQUENCIAMENTO
Após a reação de seqüenciamento foi realizada a precipitação. Ao
produto da reação de seqüenciamento foi adicionado 1µL de acetato de
amônia e 40µL de etanol absoluto. Este sistema foi misturado, utilizando-se o
agitador por alguns minutos e incubado durante vinte minutos à temperatura
ambiente. A placa necessita ser envolvida em papel alumínio para evitar a
incidência de luz.
Após incubação, a placa foi centrifugada a 4.000 rpm por quarenta minutos,
em centrífuga refrigerada 5804R da Eppendorf. O sobrenadante foi descartado.
3.12 ELETROFORESE PARA SEQÜENCIAMENTO
A decodificação de seqüência nucleotídica do fragmento amplificado
foi realizada em seqüenciador automático MegaBace 1000 (Amersham
Biociences – Pharmacia). A eletroforese capilar em gel de poliacrilamida foi
realizada segundo as recomendações padrão do fabricante. Para injeção
utilizou-se 2,5KV por 80 segundos. A corrida processou-se a 6KV, por 350
minutos, sob temperatura de 44ºC.
Na figura 2 é apresentado um quadro demonstrativo das amostras
submetidas à eletroforese para seqüenciamento. As cores verde e amarelo,
significam que o seqüenciamento foi satisfatório para posterior análise e
identificação do tipo de HPV.
20
Figura 2: Quadro demonstrativo emitido pelo MegaBace, com as amostras
passíveis de análise e identificação (score card).
21
3.13 ALINHAMENTO DAS AMOSTRAS SEQUENCIADAS
Para o alinhamento das seqüências de nucleotídeos obtidas foi utilizado o
programa de computador CLUSTAL W (BioEdit).
3.14 ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS
Para a confirmação e identificação do tipo do HPV, foi realizada
comparação de todas as seqüências nucleotídicas das amostras seqüenciadas,
submetendo-as ao Banco de Dados Mundial de Nucleotídeos – GeneBank. Utilizouse o programa BLAST, conforme procedimento proposto por Altschul em 1997,
através do site: www.ncbi.nlm.nih.gov
22
4. RESULTADOS
4.1 DISTRIBUIÇÃO DAS PACIENTES
Foram estudadas 70 pacientes, 54 HIV positivo assintomáticas, com células
T-CD4+ acima de 200/mm3 e 16 pacientes com AIDS, apresentando células T-CD4
+ abaixo de 200/mm3. Na tabela 5 são apresentados os dados relativos à contagem
de células T-CD4+.
Tabela 5: Avaliação das pacientes estudadas, segundo a contagem de células TCD4+.
CONTAGEM DE T-CD4+
Acima de 200/mm
PACIENTES
PERCENTUAL
3
54
77,1 %
3
16
22,9 %
70
100 %
Abaixo de 200/mm
TOTAL
Para a pesquisa das células T-CD4+, considerou-se o resultado mais
recente, existente no prontuário, no momento da inclusão no estudo. Na figura 5 são
apresentados os casos com AIDS e as portadoras de HIV, assintomáticas.
23
CD4<200
23%
CD4>200
77%
Figura 5: Distribuição dos dois grupos de pacientes HIV +, segundo a contagem de
células T-CD4+.
4.2 RESULTADOS DA PCR
Entre as 70 pacientes investigadas, 10 foram positivas para o HPV pela
PCR. As amostras positivas foram as de número 06, 12, 13, 24, 25, 39, 48, 49 e 52,
totalizando 14,2% das amostras investigadas. Na figura 3 são apresentadas
fotografias de gel de agarose, sob luz ultra-violeta, relativas às amostras positivas.
BR
06
12
13
25
BR
29
39
48
49
52
Figura 3: Resultados de amostras com PCR positiva para a presença do DNA-HPV
24
Dentre as 10 amostras positivas para a presença do DNA-HPV, 7
pertenciam ao grupo com células T-CD4+ abaixo de 200/mm3 e as outras 3, ao
grupo com células T-CD4+ acima de 200/mm3.
4.3
RESULTADOS
DO
SEQÜENCIAMENTO
E
IDENTIFICAÇÃO
DOS
SOROTIPOS DE HPV
A identificação dos sorotipos de HPV, feita por comparação das seqüências
de nucleotídeos encontradas nas amostras positivas, com os dados armazenados no
Gene Bank, permitiu identificar 6 sorotipos de HPV (Tabela 2).
Tabela 2: Relação das amostras positivas para o HPV por PCR e os sorotipos
identificados. O grau de coincidência entre a amostra seqüenciada e os dados do
Gene Bank, fornecido pelo programa, está expresso em percentagem.
AMOSTRA POSITIVA
PARA O DNA-HPV
TIPO DE HPV
CONFIABILIDADE
06
12
13
24
25
29
39
48
49
52
Não identificado
70
Não identificado
Não identificado
16
68
Não identificado
56
16
58
97 %
99 %
95 %
96 %
92%
95%
Na figura 4 é possível visualizar, dentre as amostras positivas pela PCR,
os percentuais de sorotipos de HPV mais prevalentes.
25
Sorotipo 16
20%
Sorotipo N.I.
40%
Sorotipo 53
10%
Sorotipo 70
10%
Sorotipo 68
10%
Sorotipo 58
10%
Figura 4: Identificação dos sorotipos de HPV nas amostras PCR positivas.
4.4 RESULTADOS DE COLPOCITOLOGIA
Na tabela 3 são apresentados os resultados de colpocitologia, com os
achados sugestivos da presença do HPV e a quantificação das amostras
encontrados. As lâminas com presença de sangue ou outros materiais que
inviabilizaram o exame, estão descritas como material inadequado. Outros dados do
exame colpocitológico como as alterações celulares benignas, os aspectos
inflamatórios e os achados de flora microbiológica embora tenham sido considerados
no tratamento clínico das pacientes, não foram avaliados, por não terem relação com
os objetivos deste trabalho.
Tabela 3: Resultados de colpocitologia oncótica em 70 pacientes
ALTERAÇÕES CELULARES BENIGNAS E ACHADOS DE
MICROBIOLOGIA
ALTERAÇÕES EM CÉLULAS ESCAMOSAS
Efeito citopático compatível com HPV
Atipias indeterminadas (ASCUS)
NIC I (Displasia leve)
NIC II (Displasia moderada)
NIC III (Displasia acentuada-Carcinoma in situ)
MATERIAL INADEQUADO PARA EXAME
TOTAL
46
13
1
1
1
8
70
26
Entre as 13 amostras indicativas para a presença do HPV, 9 pertenciam ao
grupo de pacientes com células T-CD4+ abaixo de 200/mm3 e as outras 4, ao grupo
de doentes com células T-CD4+ acima de 200/mm3 .
4.5 RESULTADOS DE COLPOSCOPIA
Epitélio aceto-branco, indicativo da presença do HPV, foi encontrado em 19
pacientes. Os resultados estão listados na tabela 4. Os casos em que o exame não
pôde ser realizado encontram-se assinalados como colposcopia insatisfatória.
Tabela 4: Resultados de colposcopia, com os achados sugestivos da presença do
HPV
ACHADOS COLPOSCÓPICOS NORMAIS
24
ACHADOS COLPOSCÓPICOS ANORMAIS
Epitélio Aceto-Branco
Epitélio Iodo-Negativo
Mosaico
Vasos Atípicos
Leucoplasia
Pontilhado
COLPOSCOPIA INSATISFATÓRIA
TOTAL
19
16
1
1
9
70
Entre os 19 exames sugestivos de lesões induzidas pelo HPV, 14
pertenciam ao grupo com células T-CD4+ abaixo de 200/mm3 e os outros 5, ao
grupo com células T-CD4+ acima de 200/mm3 .
27
4.6 ANÁLISE CONJUNTA DOS RESULTADOS E TESTES DE SIGNIFICÂNCIA
De acordo com a análise conjunta dos resultados da PCR, colpocitologia e
colposcopia, pode-se observar na tabela 6, certa uniformidade na distribuição dos
dados, que apresentam pouca dispersão em torno da média de 14 (x=14).
Tabela 6: Análise conjunta dos resultados de PCR, colpocitologia e colposcopia.
PARÂMETRO
PCR
COLPOCITOLOGIA
COLPOSCOPIA
MÉDIA
Pacientes
10
13
19
14
Na figura 6 estão representados em conjunto, os resultados positivos para a
presença do HPV, evidenciando-se a distribuição uniforme destes dados.
70
70
60
50
40
30
19
20
13
10
10
0
TOTAL
COLPOSCOPIA
CITOLOGIA
PCR
Figura 6: Total de pacientes estudadas, com exames sugestivos de HPV na
colposcopia e colpocitologia e total de casos com PCR positiva.
Na tabela 7 são descritos os achados, segundo os laudos de colpocitologia e
de colposcopia, das pacientes cujas amostras foram positivas pela PCR.
28
Tabela 7: Achados de colpocitologia e de colposcopia nas amostras positivas à PCR
PACIENTES
ACHADOS CITOLÓGICOS
ACHADOS COLPOSCÓPICOS
PCR
SOROTIPO
06
Efeitos citopáticos
compatíveis com HPVmetaplasia escamosa
Condilomatose vulvar – lesão
aceto-branca às 6 h – zona iodo
negativa no lábio posterior
+
Não
identificado
12
Efeitos citopáticos
compatíveis com HPV –
inflamação-Metaplasiadisplasia leve - NICI
Epitélio vaginal hiperceratósico
sugestivo de condiloma, lesão
aceto-branca às 12 h,
compatível com LSIL
+
70
13
Esfregaço normal
Colo epitelizado, JEC 0, Schiller
negativo
+
Não
identificado
24
Inflamação, metaplasia
escamosa.
Lesão aceto-branca no lábio
inferior
+
Não
identificado
25
Inflamação, metaplasia
escamosa, efeitos
citopáticos compatíveis
com HPV, lactobacilos –
NIC III
Extensa lesão aceto-branca em
torno do orifício externo do colo,
presença de vascularização
atípica
+
16
29
Inflamação, efeitos
citopáticos compatíveis
com HPV, lactobacilos
Lesão aceto-branca no lábio
posterior,
+
68
39
Inflamação, metaplasia
escamosa, efeitos
citopáticos compatíveis
com HPV
Lesão aceto-branca peri-orificial
+
Não
identificado
48
Inflamação, lactobacilos,
esfregaço hemorrágico
Lesão aceto-branca, em placas,
às 15 e 19 h
+
53
49
Inflamação, metaplasia
escamosa, coilocitose
Lesão aceto-branca
comprometendo o lábio anterior
+
16
52
Inflamação, células
binucleadas, coilocitose
Gardnerella vaginalis
Colo parcialmente retirado por
conização. Sem achados
colposcópicos significativos
+
58
Na correlação entre os resultados obtidos e a contagem de linfócitosT-CD4+
das pacientes, verificamos significativa concentração de resultados positivos para o
29
HPV no segmento com células T-CD4+ abaixo de 200/mm3 . A correlação entre os
métodos de pesquisa do HPV e a contagem de células T-CD4 + das pacientes pode
ser observada na figura 7.
70
PCR
60
COLPOCITOLOGIA
50
PCR
COLPOSCOPIA
40
CITO
TOTAL
COLP
30
TOTAL
20
10
0
CD4<200
CD4>200
TOTAL
Figura 7: Comparação entre a detecção do HPV e a contagem de células T-CD4+
das pacientes.
Na análise estatística dos exames positivos para o HPV, através do
utilitário “StatCalc” do programa “EpiInfo”, obtivemos os seguintes resultados:
Esta análise é apresentada na tabela 8.
Tabela 8: Razão de prevalência do HPV segundo os resultados de PCR,
colpocitologia e colposcopia, para o segmento com células T-CD4+ abaixo de
200/mm3 .
MÉTODO DE
DIAGNÓSTICO
OR
(ODDS-RATIO)
RAZÃO DE
PREVALÊNCIA
INTERVALO DE
CONFIANÇA A
95%
P-VALOR
PCR
13,22
7,88
2,30<RR<27,00
0,0006
COLPOCITOLOGIA
16,07
7,59
2,59<RR<21,43
0,00005
COLPOSCOPIA
68,60
9,45
4,02<RR<22,23
0,0000000
30
Através da análise pelo StatCalc, verifica-se que as pacientes com T-CD4+
menor que 200/mm3 têm, aproximadamente, 8 vezes mais chances de serem
portadoras de HPV, segundo os resultados da PCR (risco relativo de 7,88). Este
resultado é confirmado pela razão de prevalência obtida, analisando-se os
resultados de colpocitologia (risco relativo de 7,59).
Também, os resultados da
colposcopia indicam ser o HPV em torno de 9 vezes mais freqüente no grupo mais
imunodeprimido (risco relativo de 9,45).
31
5. DISCUSSÃO
5.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
O encontro de 10 pacientes com HPV (14,2 %), através da PCR, situa-se
dentro de ampla e variada faixa de achados da literatura mundial, que vão de 4,79%,
com populações hígidas, a 98% em pacientes com neoplasia cervical invasiva.
Alguns comentários sobre a metodologia empregada e a população estudada em
nossa investigação parecem-nos ser importantes.
Ao trabalharmos com os “primers” MY 09 e MY 11, devemos levar em conta
que estas sondas amplificam uma significativa quantidade de tipos de HPV, mas não
todos.
(20 )
O segmento populacional estudado consistiu de pacientes portadoras de HIV
que fazem, regularmente, acompanhamento clínico-laboratorial e terapêutico.
Encontram-se sob controle tanto das intercorrências, como dos seus níveis de
células T-CD4 +. Julgamos importante recente trabalho de Carrasco, que aponta
para a diminuição da incidência do HPV nas pacientes que utilizam ou utilizaram
drogas anti retro-virais. (22)
A detecção do HPV na cérvice uterina das pacientes HIV positivas se
fundamentou em quatro parâmetros – a PCR, a colpocitologia e a colposcopia (como
métodos de diagnóstico) e o estado imunológico das pacientes, configurado na
contagem de células CD4, (como medida da suscetibilidade destas ao HPV).
Apesar de constituirem métodos e procedimentos diferentes, totalmente
independentes e realizados em épocas e locais diferentes, observou-se significativa
32
uniformidade da positividade para o HPV, na PCR, colpocitologia e colposcopia,
situando-se em média, em torno de 14, a positividade para o HPV pelos diferentes
métodos. Os procedimentos da PCR, para detecção e seqüenciamento, foram
realizados no Laboratório de Biologia Molecular da UFAM; os exames de
colpocitologia foram efetuados na FMTAM, ao longo do corrente ano, e a
colposcopia fez-se durante o exame clínico da paciente.
Ao correlacionarmos os resultados com os níveis de células T-CD4+,
observamos que os três métodos revelaram maior positividade no segmento mais
imunologicamente comprometido, isto é, nas pacientes que apresentaram CD4
abaixo de 200.
Estatisticamente, demonstrou-se que as pacientes com menor taxa de
linfócitos T-CD4+ apresentaram risco 7 a 9 vezes maior de serem portadoras de
HPV que as outras, HIV positivo, com CD4 acima de 200. Estes dados estão de
acordo com a literatura mundial que aponta maior suscetibilidade à infecção pelo
HPV nas pacientes com maior imunodepressão.
5.2 IMPORTÂNCIA DOS MÉTODOS DE DETECÇÃO DO HPV
As técnicas clássicas para o diagnóstico do HPV na cérvice uterina
compreendem o exame citológico e histopatológico em biópsias colposcopicamente
orientadas para a coleta de área com aspecto anormal. As técnicas de biologia
molecular, ainda não universalmente disponíveis, permitem comprovar com maior
segurança os achados destes exames rotineiros. Além disso, permitem identificar o
sorotipo de HPV, um aspecto fundamental para o prognóstico das pacientes, haja
vista que alguns são potencialmente oncogênicos. Em nosso estudo houve
concomitância dos indícios da presença do HPV pelos métodos tradicionais e a
33
PCR. Julgamos importante ressaltar que na sorotipagem detectou-se o HPV 16 em
duas pacientes, confirmando os achados de Castro, que pesquisou HPV em
pacientes da Fundação Cecon, em Manaus, onde também o HPV 16 foi prevalente.
Como sabemos, este HPV é altamente oncogênico.
(11)
Na colpocitologia são observadas as alterações celulares benignas, tais
como as reações inflamatórias, metaplasia escamosa e achados de flora
microbiológica eventualmente presentes, como a colonização da mucosa por fungos,
parasitos e bactérias. Embora todos estes aspectos tenham sido avaliados e
considerados no tratamento ginecológico das pacientes pesquisadas, de acordo com
os objetivos do presente trabalho, procuramos nos ater às alterações em células
epiteliais, especialmente nas células escamosas, ou seja, aqueles que representam
os efeitos citopáticos do HPV nestas células, sendo portanto, indicativos de sua
presença na amostra estudada.
A colposcopia revelou lesões associadas ao comprometimento pelo HPV em
19 pacientes, confirmando dados da literatura sobre a alta sensibilidade deste
exame para as alterações induzidas pelo HPV, conferindo a este método um valor
inquestionável para o diagnóstico presuntivo de papilomavirose do colo, ao lado do
método mais custo-específico que é a colpocitologia. (5)
Bastante ilustrativo da validade dos métodos acima aludidos é o da paciente
protocolada sob número 25, pertencente ao grupo com AIDS, que já havia evoluído
para carcinoma “in situ”: apresentou todas as evidências que estes métodos
oferecem ao ginecologista para o diagnóstico. Os exames laboratoriais realizados
rotineiramente e a sorotipagem do HPV são fundamentais para o acompanhamento
destas pacientes – o diagnóstico precoce, como o que se verificou nesta doente
34
possibilitará a cura da neoplasia, evitando-se as graves conseqüências dos tumores
invasivos.
35
6. CONCLUSÃO
No presente trabalho verificou-se que:
a) Os métodos diagnósticos presuntivos da presença do HPV na cérvice
uterina comumente utilizados, a colpocitologia e a colposcopia,
apresentaram resultados uniformes, confirmados em sua maioria,
através da PCR.
b) As doentes portadoras de HIV/AIDS, apresentando contagens de
linfócitos T-CD4+ abaixo de 200/mm3 são, significativamente, mais
propensas à infecção pelo HPV.
c) O sorotipo HPV-16, de alto potencial oncogênico, foi prevalente nas
amostras positivas para o DNA-HPV, ressaltando a importância da
identificação do sorotipo infectante na prevenção do câncer de colo
uterino.
Os resultados obtidos no presente trabalho, com demonstração de
significativa incidência de HPV, inclusive com sorotipos altamente oncogênicos,
sugerem que as pacientes HIV positivo ou com AIDS sejam rigorosamente
acompanhadas pelo ginecologista. Sempre que possível, deve-se fazer a PCR e a
sorotipagem nos casos com PCR positiva.
36
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 CONSENSO BRASILEIRO DE HPV. São Paulo: 1999.
2 BARRET, T. J.; SILBAR, J. D.; McGINLEY, J. Genital warts: a venereal
disease. JAMA, 154:333. 1954.
3 CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Sexually transmitted
diseases treatment guidelines. MMWR; 51 (RR-6). 2002.
4 CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Guidelines for
treatment of sexually transmitted diseases. MMWR; 47 (RR-1). 1998.
5 GROSS, E. G.; BARRASSO, R. Infecção por Papilomavírus Humano – Atlas
Clínico de HPV. Porto Alegre: Artmed, 1999.
6 CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Sexually transmitted
diseases treatment guidelines. MMWR; 51 (RR-6). 2002.
7 NONNENMACHER, B. et al. Identificação do papilomavírus humano por
biologia molecular em mulheres assintomáticas. Rev. Saúde Pública, São Paulo,
v. 36, n. 1, p. 95-100, fev. 2002.
8 SCHIFFMAN, M.H. et al. Epidemiologic evidence showing that Human
papillomavirus infection causes most cervical intraepithelial neoplasia. J. Natl.
Cancer Inst; v. 85, p. 958-64, jun. 1993.
9 ELUF-NETO J. et. al. Human papillomavirus and invasive cervical cancer in
Brazil. Br. J. Cancer; v.69, p. 114-9. 1994.
10 INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER (IARC);
Monography on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Lyon, WHO,
(IARC-Monographs in Human papillomavirus, vol 64). 1995.
11 CASTRO, M.M.; Detecção do Papilomavírus Humano-HPV em esfregaços
endocervicais de mulheres que procuram serviços de citologia em Manaus.
Manaus: UFAM, 2002. Dissertação (Mestrado em Genética e Evolução),
Universidade Federal de São Carlos/UFAM, 2002.
12 VERNON, S. D. et. al.; Human papillomavirus infection and associated
disease in persons infected with Human immunodeficiency virus. Clin. Infect.
Dis, Aug. 21: 121-4, 1995.
13 VERNON, S. D.; Human papillomavirus, Human immunodeficiency virus
and cervical cancer: newly recognized association ? Infect. Agents Dis. Dec; 1:
319-24, 1992.
37
14 PIPER, M. A. et. al.; Association of Human papillomavirus with Human
immunodeficiency virus and CD4 cell count in women with high or low
numbers of sex partners. Sex Transm. Infect. Aug. 75:253-7, 1999.
15 TUFFI, V. H. B.; MARQUES, J. A.; CARVALHO, F. M.; SOUEN, J. S.;
Contribuição ao estudo da relação do Papilomavírus Humano com o
Carcinoma invasivo da vulva. Rev. Gin. & Obstet., 8(2):58-64, 1997.
16 SUN, X. W. et. al.; Human papillomavirus infection in women infected with
the Human immunodeficiency virus. N. Eng. J. Med.; 337: 1343-49, 1997.
17 INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON
CANCER (IARC);
Monography on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Lyon, WHO,
(IARC-Monographs in Human papillomavirus, vol 64). 1995.
18 MINISTÉRIO DA SAÚDE; Implantando o Viva Mulher - Programa Nacional
de Controle do Câncer do Colo do Útero e Mama, Rio de Janeiro - Instituto
Nacional de Câncer, Coordenação Nacional de Controle do Tabagismo, Prevenção e
Vigilância do Câncer, 2000.
19 BAUER, H. M.; MANOS, M. M.; PCR Detection of genital human
papillomavirus. In: Applications - Viral Pathogens, pp: 407-413, 1998.
20 SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T.; Molecular Cloning: a
laboratory Manual. New York, 2ª Edição. Cold Spring Harbor Lab. USA, 1989.
21 PONTES, I.; Desenvolvimento de novos marcadores microssatélites para
análise genética em humanos.57p. Dissertação (Mestrado em Genética e
Evolução), Universidade Federal de São Carlos-Universidade Federal de
Amazonas, Manaus, 2003.
22 CARRASCO, S.; Coquetel anti-AIDS pode combater o vírus HPV. Jornal da
Paulista-UNIFESP, São Paulo, out. 2001.
38
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
1 ALEIXO NETO, A.; Aspectos epidemiológicos do câncer cervical. Revista
de Saúde Pública, 25:326-333,1991.
2 AMORTEGUI, A. J. & MEYER, M. P.; In situ hybridization for the diagnosis
and typing of human papillomavirus. Clin Biochem, 23:301,1990.
3 ANDERSON, S. M. Human Papillomavirus & Cervical Cancer, Advanced
Laboratory, 2001.Disponível no site: http.//www.advanceforal.com.
4 BARRET, T J; SILBAR, J D; McGINLEY, J.; Genital warts: a venereal
disease. JAMA; 154:333, 1954.
5 BAUER, H. M.; TING, Y.; GREER, C. E.; CHAMBERS, J. C.; TASHIRO, C. J.;
CHIMERA, J.; REINGOLD, A.; MANOS, M. M.; Genital human papillomavirus
infection in female university students as determined by a PCR-based method.
265(4):472-77, 1991.
6 BERUMEN, J.; MIRANDA, E. I.; ZAFRA, G.; CASAS, L.; SEGURA,
ORDOÑES, R. M.; AGUIRRE, J.; MARTINES, M.; ROSAS, A.; IBARRA,
PEDRAZA, L.; SAAD, A.; MARROQUÍM, A.; GUTIÉRREZ, M.; MARTINEZ,
GARIGLIO, P.; Epidemiologia molecular de canceres de alta incidencia
México. Gaceta Médica de México, 133(1):35-41, 1997.
E.;
V.;
A.;
en
7 BOLLEN, L. J.; TJONG-A-HUNG, S. P.; VAN DER VELDEN, J.; BROUWER, K.;
MOL, B. W.; KATE, F. J; SCHEGGET, J.; Human papillomavirus
deoxyribonucleic acid detection in mildly or moderately dysplastic smears: a
possible method for selecting patients for colposcopy. Am. Journal Obstet.
Gynecol., 177(3):548-53, 1997.
8 DÔRES, G. B.; RIBALTA, J. C. L.; MARTINS, V. N.; FOCCHI, J.; NOVO, N. F.;
JULIANO, Y.; STAVALE, J. N.; LIMA, G. R.; Diagnóstico da infecção
cervicovaginal por papilomavírus humanos. Valor da colposcopia, citologia e
da histopatologia como métodos diagnósticos. Revista Paulista de Medicina,
109(3):102-108, 1991.
9 FERREIRA, M. E. & GRATAPAGLIA, D.; Introdução ao uso de marcadores
moleculares RAPD e RFLP em Análise Genética. 1ª Edição. Brasília. p.39, 1995.
10 FISHER, S. G.; Epidemiology: a tool for the study of human papillomavirus Related carcinogenesis. Intervirology, 37:215-225, 1994.
11 CASTRO, M.M.; Detecção do Papilomavírus Humano-HPV em esfregaços
endocervicais de mulheres que procuram serviços de citologia em Manaus.
Manaus: UFAM, 2002. Dissertação (Mestrado em Genética e Evolução),
Universidade Federal de São Carlos/UFAM, 2002.
39
12 GOMES, D. H.; BIDOIA, C.C. G.; IRIE, M. M. T.; SUZUKI, L. E.; CONSOLARO,
M. E. L. & KANESHIMA, E. N. Padronização da técnica da reação em cadeia da
polimerase (PCR) para o diagnóstico da infecção pelo Papilomavírus humano
(HPV) em amostras endocervicais de pacientes portadoras de lesões précancerosas atendidas no LEPAC/UEM de Maringá-PR. RBAC, 34(2):89-93, 2002.
13 MATIOLI, S. R. Biologia Molecular e Evolução. Editora Holos. Ribeirão PretoSP. 202 pp, 2002.
14 MUÑOZ N. et. al.; Epidemiologic classification of Human papillomavirus
types associated with cervical cancer. N. Engl. J. Med; 348: 518-27. Feb. 6, 2003.
15 MORROW & TOWNSEND, D. E.; Premalignant and related disorders of the
lower genital tract. In: Synopsis of ginecologic oncology. 3ª ed., John Wiley &
Sons, 1987.
16 NORONHA, V. et.al.; Papilomavirus humano associado a lesões de cérvice
uterina. Ver. Soc. Bras. Méd. Trop. V. 32 n.3, 1997.
17 PIPER, M. A. et. al.; Association of Human papillomavirus with Human
immunodeficiency virus and CD4 cell count in women with high or low
numbers of sex partners. Sex Transm. Infect. Aug. 75:253-7, 1999.
18 ROMANCZUC, H.; & HOWLEY.; Disruption of either the E1 or the E2
regulatory gene of human papillomavirus type 16 increases the viral
immortalization capacity. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 89: 3159, 1993.
19 SCHNEIDER, A.; MEINHARDT, G.; DE-VILLERS, E. M.; GISSMANN, L.;
Sensitivity of the cytologic diagnosis of cervical condyloma in comparison with
DNA-HPV hybridization studies. Diag. Cytopathol., 3:250-55, 1987.
20 SHEPHERD, P.S.; ROWE, A.J.; CRIDLAND, J.C.; COLETART, T.; WILSON, P.;
LUXTON, J.C.; Proliferative T cell responses to human papillomavirus type 16
L1 peptides in pacients with cervical dysplasia. Journal of General Virology.
77:593-602, 1996.
21 SUN, X. W. et. al.; Human papillomavirus infection in women infected with
the Human immunodeficiency virus. N Eng J Med; 337: 1343-49, 1997.
22 VANDENVELDE, C.; DE FOOR, M.;VAN BEERS, D.; HLA-DQB1*3 and cervical
intraepithelial neoplasia grades I-III. Lancet. 341:442, 1993.
40
ANEXOS
ANEXO A - DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO
"DETECÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO-HPV
NA CÉRVICE
UTERINA DE MULHERES SOROPOSITIVAS PARA O VÍRUS DA
IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV), ATENDIDAS NA FUNDAÇÃO DE
MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS"
OBJETIVO: O presente trabalho tem por objetivo a detecção do
Papilomavírus Humano (HPV), em esfregaços endocervicais de mulheres
portadoras do HIV, na cidade de Manaus. Com o propósito de dar início ao
trabalho, faz-se necessário o consentimento das pacientes, que aqui
declaram doar o material objeto de investigação, de livre e espontânea
vontade e conscientes do objetivo fim, pelo que comprova a DECLARAÇÃO
abaixo:
"Estou ciente de que participarei de um grupo de pacientes que farão
parte de um projeto de investigação científica, o qual tem por finalidade
estimar a prevalência de infecção por Papilomavírus Humano (HPV),
declarando-me portanto, voluntária. Para tal, permitirei a coleta do material
endocervical, o qual será submetido ao teste colpocitológico e método PCR,
(exame ginecológico conhecido como “preventivo”),
não havendo
necessidade de outros testes laboratoriais nem de hospitalização, visto que
todos os procedimentos necessários serão realizados em apenas uma
ocasião. Através dos resultados dos referidos testes será feita uma
avaliação das mulheres desses grupos que são portadoras de algum tipo de
HPV, resultados estes os quais terei o direito de conhecer, sendo-me
notificada qualquer informação julgada importante. Como participante do
grupo terei a oportunidade de ser beneficiada com o exame citológico e/ou
colpocitológico, que é de suma importância para o acompanhamento da
saúde da mulher. Reservo-me ainda, ao direito de deixar de participar do
grupo investigado a qualquer momento, sem que isto incorra para mim
prejuízos de qualquer natureza. Tenho ciência de que os registros e/ou
resultados do estudo em questão serão divulgados ao meio científico e
autoridades de saúde pública, para que se busquem soluções em prol da
saúde da população.
41
Deixo registrados alguns dados referentes à minha saúde e condições
de vida, constantes de questionário que ficará de posse da equipe
investigadora, sendo que as declarações que faço são de caráter
confidencial, e como tal serão mantidas em sigilo, bem como minha
identidade. Caso haja necessidade de contatar-me, ligar para o telefone
______________________.
Após ter recebido todas as informações acima citadas, de maneira
clara, concordo com minha participação no estudo".
Nome da paciente
Assinatura da paciente
Data
Nome do pesquisador
Assinatura do
pesquisador
Data
42
ANEXO B - FICHA DE ATENDIMENTO
“DETECÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) NA CÉRVICE UTERINA DE
MULHERES SOROPOSITIVAS PARA O VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA
(HIV) ATENDIDAS NA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS”
DADOS CLÍNICOS DE PARTICIPANTE DO PROJETO
NOME:_________________________________________________________
N° DO PRONTUÁRIO:______________IDADE_______TEL:_______________
ENDEREÇO: ____________________________________________________
HIV +:___/___/___
ÚLTIMO CD4:___/___/___ VALOR__________________
INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS:_____________________________________
ÚLTIMA MENSTRUAÇÃO:___/____/____COLPOCITOLOGIA:____/____/____
DADOS DE EXAME GINECOLÓGICO:________________________________
_______________________________________________________________
COLPOSCOPIA:__________________________________________________
PESQUISA DE HPV:____/____/____ RESULTADO: ___ SUBTIPO: ________
OBSERVAÇÕES: