Área: Microbiologia do solo: Estruturas das comunidades bacterianas, T-RFLP, solo tropical.
ESTRUTURA DAS COMUNIDADES BACTERIANAS EM RIZOSFERA DE
Vigna unguiculata (L.) Walp. DE TERRA PRETA DA AMAZÔNIA
Rosineide Cardoso de Souza1; Rogério Eiji Hanada1; Fabiana Cannavan2; Siu Mui Tsai2
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Av. André Araújo, nº 2936 – Bairro: Petrópolis Manaus/AM E-mail:[email protected]
2
Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Av. Centenário, 303
Piracicaba, São Paulo – Brasil.
Resumo – A região da rizosfera está dentre os ambientes que apresenta maior dinâmica populacional de
micro-organismos, o que torna a determinação qualitativa das estruturas das comunidades de microorganismos presente nesse ambiente um fator de grande importância. Dentre esses micro-organismos, as
bactérias apresentam habilidades de colonizar a região da rizosfera de culturas consideradas importantes
na agricultura. O feijão caupi, (Vigna unguiculata (L.) Walp.), é uma cultura de grande importância para
os agricultores familiares da região Norte, porém, poucos estudos têm sido realizados para identificar as
comunidades bacterianas presentes nas raízes. A Terra Preta da Amazônia (TPA) ou Terra Preta de Índio
caracteriza-se como um solo antrópico e apresenta maior diversidade bacteriana em relação ao seu solo de
origem (solo adjacente ADJ), proporcionando condições para abrigar uma microbiota com capacidade de
aumentar o processo de produção de culturas por meio de metabólitos bioativos. Esse estudo teve como
objetivo avaliar as estruturas das comunidades bacterianas de solos rizosféricos de feijão caupi e
compará-los com os solos não rizosférico (TPA e ADJ). Para tanto, foi utilizado a técnica de
Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição Terminal (T-RFLP), do gene 16S rRNA
bacteriano. Os resultados obtidos revelaram que as estruturas das comunidades bacterianas em solos
rizosféricos de feijão caupi apresentaram diferenças estatísticas quando comparados entre solos
rizosféricos e não rizosféricos de TPA. Por sua vez, as comunidades do solo adjacente foram
contrastantes para ambos os solos TPA.
Palavras-chave: Estruturas das comunidades bacterianas, T-RFLP, solo tropical.
Introdução
As comunidades bacterianas presentes nos solos de Terra Preta da Amazônia (TPA) apresentam
uma grande variedade de genes bacterianos, que ainda são desconhecidos, as quais poderão contribuir
quanto à aplicação na biotecnologia e no desenvolvimento de uma agricultura sustentável. Atualmente há
um grande interesse em conhecer as comunidades bacterianas da rizosfera, principalmente, descobrir as
funções delas nesse ecossistema. Sabe-se que o tipo de planta é um fator determinante na estrutura das
comunidades microbiana do solo, pois as plantas são os maiores fornecedores de formas específicas de
compostos e fontes de energia para a manutenção dessas comunidades (GARBEVA; van VEEN; van
ELSAS, 2004; BREMER et al., 2007). Além disso Grayston et al. (1998); Benizri (2002); Baudoin et al.
(2003); Richardson et al. (2009) mencionam que a quantidade e a qualidade dos exsudatos liberados pela
raiz também alteram a química do solo e influenciam na comunidade bacteriana que coloniza a rizosfera.
Esta associação é comum entre os grupos das leguminosas, o Feijão Caupi (Vigna unguiculata
(L.) Walp.). Uma cultura de relevância, por ser de grande importância socioeconômica em algumas
regiões do Brasil como, Norte e Nordeste (FREIRE, 2005). Essa leguminosa também apresenta benefícios
ecológicos para os solos, como na recuperação destes por meio de compostos naturais nitrogenados, além
do aumento da produção de biomassa.
No entanto, são poucos os estudos sobre a estrutura das comunidades bacterinas em solos
rizosféricos de Terra Preta da Amazônia. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo avaliar as
1
estruturas das comunidades bacterianas em solos rizosféricos de feijão caupi e compará-los com solos não
rizosféricos de Terra Preta e seus respectivos solos adjacentes.
Material e Métodos
O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, localizada no Instituto Nacional de Ciências
da Amazônia – INPA Manaus –AM, utilizando sementes de feijão caupi. As sementes foram cedidas pelo
Laboratório de Sementes de Genética e Melhoramento de Hortaliças do INPA/AM. As mesmas foram
tratadas, por meio de imersão total, com álcool 70% durante 10 minutos e secas sobre papel toalha. Em
seguida foram semeadas 5 sementes por vaso e 15 dias após a germinação foi realizado desbaste deixando
2 plantas por vaso. Aos 50 dias após a semeadura procedeu-se a coleta do solo rizosférico e as amostras
foram armazenado em tubos de eppendorf e mantido a -20°C até o momento da extração do DNA.
O DNA dos solos rizosféricos e não rizosféricos foi extraído em triplicata utilizando-se o Kit
Power Soil DNA ExtractionTM (MoBio, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções indicadas pelo
fabricante. A verificação da qualidade e quantidade do DNA foi feita em gel de agarose 1%. A reação de
amplificação do gene 16S rRNA de Bacteria foi feita utilizando o conjunto de primers: 27F e 1492R
(EWARD et al., 1989; WOESE et al., 1990). Para posterior detecção dos amplicons utilizando a técnica
de T-RFLP em sequenciador automático o primer 27F foi marcado com 6-carboxyfluorescein (6-FAM)
na extremidade 5’.
Após a obtenção do produto da PCR, foi feita a purificação dos fragmentos amplificados
utilizando o Kit GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare) seguindo as instruções do
fabricante. Os produtos de PCR purificados foram digeridos com as enzimas de restrição MspI e HhaI e
posteriormente precipitados em acetato de sódio/EDTA e etanol absoluto. A determinação do
comprimento dos Fragmentos Terminais de Restrição (T-RFs) foi realizada no sequenciador capilar
automático modelo ABI PRISM 3130 XL GeneticAnalyzer (AppliedBiosystems). Para a análise de
Fragmentos Terminais de Restrição (T-RFs), o produto de digestão precipitado foi ressuspendido em
formamida Hi-Di e padrão de comprimento GeneScan 500 ROX (AppliedBiosystems).
Os dados de T-RFLP foram analisados a partir dos arquivos gerados pelo programa Data
Collection Software do sequenciador, no programa Peak Scanner 1.0 (AppliedBiosystems) para
determinação do comprimento dos fragmentos terminais de restrição através de comparação com os
fragmentos do padrão de comprimento (TROTHA et al., 2002). Os dados foram exportados para uma
planilha eletrônica Excel (Microsorft) sendo convertidos em uma matriz onde cada coluna representa uma
amostra e cada linha representa um tamanho de T-RF específico, essa matriz foi utilizada para posterior
análise multivariada. A avaliação dos T-RFs de bactéria obtidos pelo T-RFLP foi realizada pela análise
em escala multidimensional (multidimensional scaling, MDS), utilizando o coeficiente de similaridade de
Bray-Curtis. Posteriormente, uma análise de similaridade (ANOSIM) foi realizada para determinar
diferenças estatísticas entre as amostras estudadas (CLARKE, 1993).
Resultados e Discussão
No presente estudo foram analisadas algumas propriedades químicas dos solos rizosféricos de
Feijão Caupi, de solos de Terra Preta de Índio (TPA) e dos solos adjacentes (ADJ) que podem ser
visualizados na Tabela 1. Com base na caracterização dos atributos químicos do solo os resultados
indicaram altos teores de Ca, P e Mg, e elevados valores de CTC, pH, SB em amostras de solos
rizosféricos e TPA quando comparados aos solos adjacentes. Contudo o solo de TPA apresenta uma alta
fertilidade, o que pode caracterizar como uma fonte de germoplasma microbiano.
2
Tabela 1 – Características químicas dos solos rizosférico de Terra Preta da Amazônia e de seus solos adjacentes
Atributos químicos
Solo rizosférico TPA
Solo não rizosférico (TPA)
Solo adjacente (ADJ)
1
2
3
1
2
3
1
2
3
pH
5,2
5,9
5,0
5,4
5.2
5,0
4,0
4,1
4,5
M.O.
47
58
43
56
52
51
36
31
32
P
299
497
265
413
525
588
18
9,0
10
S
6,0
4,0
6,0
5
4
4
<3
<3
<3
K
2,4
1,1
0,5
0,8
1.1
1,3
0,6
1,6
1,5
Ca
79
146
82
145
130
140
16
14
22
Mg
6,0
9,0
6,0
13
17
11
3,0
3,0
4,0
Al
0
0
0
0
0
0
10
8,0
3,0
H+Al
47
25
52
42
52
52
28
71
58
SB
87
156,3
88,5
158,8
148,1
152,3
20
18,1
27,4
Fe
105
51
106
173
213
246
112
115
126
Ca, Mg, Al, potencial de acidez (H+Al), soma de bases (SB) e capacidade de troca catiônica (CTC) são representados em mmolc/dm-3; matéria
-3
-3
orgânica (MO) em g/dm ; o fósforo em mg/dm e pH em CaCl2
Com base na discriminação automatizada dos T-RFs foram feitas análises de agrupamento
usando a análise de MDS. A análise de MDS é uma técnica de ordenação utilizada em análises ecológicas
que tem por objetivo descrever a estrutura de uma matriz complexa, reduzindo a dimensionalidade da
matriz de dados e ordenando os objetos num gráfico. A análise de MDS dos perfis de T-RFs foi feita com
três diferentes ambientes estudados, conforme apresentado na Figura 1. A representação bidimensional da
análise de MDS foi validada por níveis de Stress 0,04. Os resultados revelaram agrupamentos ao nível de
similaridade de 55% entre as amostras estudadas, mostrando ainda alta similaridade entre as replicas
amostras analisadas.
2D Stress: 0,04
Hatahara
Rizosférico
Não rizosférico
Adjacente
Figura 1- Análise de MDS baseada nos T-RFs discriminados para o gene 16S rRNA de
Bacteria. Solos rizosférico, solo de Terra Preta da Amazônia e solo adjacente.
Em revisões realizadas por Garbeva, van Veen e van Elsas (2004), o tipo de planta e o tipo de
solo influenciam a comunidade microbiana do solo de uma forma complexa. Os autores mencionam,
ainda, que ambos os fatores são determinantes em moldar a estrutura desses micro-organismos. No
entanto, algumas espécies de plantas como as leguminosas liberaram compostos orgânicos fato que
contribui para a diversidade de micro-organismos presentes nesse ecossistema.
Para testar a diferença na composição das comunidades bacterianas, a análise de similaridade
ANOSIM e a porcentagem de dissimilaridade SIMPER (ambos os testes calculados com base no
coeficiente de similaridade de Bray-Curtis) foram realizadas utilizando o programa Primer 6 (Playmouth
Marine Laboratory, Primer E, Reino Unido). ANOSIM é um teste estatístico baseado em permutação,
análogo ao teste ANOVA, o qual avalia a diferença entre grupos de amostras de diferentes locais e
tratamentos experimentais (YANNARELL; TRIPLETT, 2004; DANOVARO et al., 2006). Os resultados
apresentaram valores de R global acima de 0,927. Essa diferença estrutural de comunidades bacterianas
pode estar relacionada com o histórico do uso da terra Grossman et al., (2010), assim como os atributos
químicos do solo (NAVARRETE et al., 2010).
3
Os dados de T-RFLP foram correlacionados com valores das propriedades químicas dos solos e
ordenados utilizando Análise de Redundância (RDA). As ordenações espaciais definidas para a
comunidade bacteriana combinada com os atributos químicos dos solos são mostradas na Figura 2.
Análise de RDA dos perfis de T-RFLP mostrou que as comunidades bacterianas dos diferentes ambientes
estudados diferem em estruturas e essas diferenças e estão diretamente relacionadas aos atributos
químicos dos solos, pois estes explicam 74% e 7,2% da variabilidade total dos dados. Entre os atributos
1.0
analisados, o P, Al e Fe são os que mais estão relacionados com a variabilidade dos dados.
Axis 2 (7,2%)
B
H+Al
m
Al
S
Mn
Zn
Cu
pH P
V
MO Ca SB
K
Mg
Fe
Terra Preta
-1.0
TPI Rizosfera
Adjacente
-1.0
Axis 1 (74,0%)
1.0
Figura 2 – Analise de Redundância (RDA) das estruturas de comunidades de
bacterianas determinadas pela técnica molecular de T-RFLP.
O teor de Al demonstrou ser um atributo de elevada correlação com a variabilidade dos solos
ADJ. Em estudo realizado em solos da Amazônia Ocidental, a diversidade de comunidades bacterianas
apresentou correlação com a acidez do solo, atributos como pH, Al e saturação de bases (JESUS et al.,
2009). O Al é considerado tóxico para as plantas e micro-organismos (WOOD 1995; JONER et al., 2005,
e pode ser um fator limitante para algumas espécies bacterianas e principalmente para as plantas.
A carência de P disponível nos solos da região amazônica para as plantas tem sido atribuída
como a principal dificuldade para os cultivos agrícolas (LEHMANN et al., 2001). Provavelmente em
função disso, os altos teores de P em TPA consistem na principal razão do elevado potencial produtivo
desses solos antrópicos (LEHMANN et al., 2004). De maneira geral, os teores de P apresentaram
correlação com a comunidade bacteriana nos diferentes solos estudados.
A baixa solubilidade do ferro se torna um problema para os organismos que requerem esse metal
para sua sobrevivência e vive em ambiente aeróbio. Para combater essa baixa solubilidade, os microorganismos desenvolveram um sistema de transporte com elevada afinidade por ferro, moléculas de baixa
massa molar, conhecidos como sideróforos (NEILANDS, 1984). Os sideróforos são peptídeos de síntese
não ribossômica com altíssima afinidade por ferro, produzidos e secretados por micro-organismos,
incluindo as bactérias presentes na rizosfera, auxiliando no crescimento da planta, pois aumentam a
disponibilidade de ferro próximo à raiz ou inibem a colonização das raízes por patógenos
(NEILANDS,1995; HOWELL,1980; LUCA et al., 1988). Estudos realizados por Fedrizzi (2006), por
meio de bioprospecção, detectou a presença de sideróforos e de compostos antimicrobianos ativos em
solos de TPA.
4
Conclusões
O emprego da técnica molecular de T-RFLP, revelou que a ação antropogênica nos diferentes
ambientes estudados tem efeito sobre as estruturas das comunidades bacterianas. Os resultados obtidos
nesses estudos revelaram que as estruturas das comunidades bacterianas em rizosfera de feijão Caupi
apresentaram diferenças significativas, comparando solos TPA com seu solo adjacente ADJ. Estes
resultados confirmam que a interação de plantas, microrganismos e tipo de solo contribuem para moldar a
comunidade dos microrganismos do solo.
Referências
BIEDERMANN,G.;SCHINDLER,P. On the solubility of precipitated iron (III) hydroxide Acta Chimica Scandinavica ,
Copenhagen, 1957. Vol. 11, p. 731-740.
BAUDOIN, E.; BENIZRI, E.; GUCKERT, A. Impact of artificial root exudates on the bacterial community structure in
bulk soil and maize rhizosphere. Soil Biology and Biochemistry, 2003. 35: p. 1183-1192.
BREMER, C.; BRAKER, G.; MATTHIES, D.; REUTER, A.; ENGELS, C.; CONRAD, R. Impact of plant functional
group, plant species, and sampling time on the composition of nirK-type denitrifier communities in soil. Applied and Environmental
Microbiology, Baltimore, v. 73, p. 6876-6884, 2007.
BENIZRI, E.; DEDOURGE, O.; DIBATTISTA E LEBOEUF, C.; PIUTTI, S.; NGUYEN, C.; GUCKERT, A. Effect of
maize rhizodeposits on soil microbial community structure. Applied Soil Ecology, 21: 261-265. energia (GARBEVA; van VEEN;
van ELSAS, 2004; BREMER et al., 2007).
CLARKE, K.R. Non-parametric multivariate analysis of changes in community structure. Australian Journal of Ecology,
Canberra, v. 18, p. 117-143, 1993.
DANOVARO, R.; LUNA, G.M.; DELL’ANNO, A.; PIETRANGELI, B. Comparison of two fingerprintings techniques,
terminal restriction fragment length polymorphism and automated ribosomal intergenic spacer analysis, for determination of
bacterial diversity in aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology, Baltimore, 2006. v. 72, p. 5982-5989,
EDWARDS, U.; ROGALL, T.; BLOCKER, H.; EMDE, M.; BOTTGER, E.C. Isolation and direct complete nucleotide
determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Research, London, 1989.v.
17, p. 7843-7853.
FREIRE FILHO, F. R.; LIMA, J. A. de A. & RIBEIRO, V.Q. (Org.). Feijão caupi: avanços tecnológicos. Brasília, DF:
Embrapa Informação Tecnológica. 2005. 519, p.
FEDRIZZI, S.M.G. Produção de metabolitos antimicrobianos e sideróforos de isolados provenientes de Terra Preta
Antropogênica da Amazônia Ocidental. Dissertação de mestrado, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Piracicaba, São Paulo.
2006. 115 pp.
GRAYSTON, S.J.; WANG, S.; CAMPBELL, C.D.; EDWARDS, A.C. Selective influence of plant species on microbial
diversity in the rhizosphere. Soil Biology and Biochemistry, 1998. 30: 369-378.
GARBEVA, P.; VAN VEEN, J.A.; VAN ELSAS, J.D. Microbial diversity in soil: selection of microbial populations by
plant and soil type and implications for disease suppressiveness. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 42, 2004. p. 24370.
HOWELL, C.R. Stipanovic, controlo f Rhizoctonia solanion cotton seedlings by Pseudomonas flurescens and antibiotic
produced by the bacterium. Phytopathology, Saint Paul, v.69, 1980. P. 480-482.
JESUS, E.C.; MARSH, T.L.; TIEDJE, J.M.; MOREIRA, F.M.S. Changes in land use alter structure of bacterial
communities in Western Amazon soils. The ISME Journal, New York, 2009. v. 3, p. 1004-1011.
JONER, E.J.; ELDHUSET, T.D.; LANGE, H.; FROSTEGARD, A. Changes in the microbial community in a forest soil
amended with aluminum in situ. Plant and Soil, Dordrecht, 2005. v. 275, p. 295–304.
LEHMANN, J.; CRAVO, M.S.; MACEDO, J.L.V.; MOREIRA, A.; SCHROTH, G. Phosphorus management for
perennial crops in central Amazonian upland soils. Plant and Soil, Dordrecht, 2001. v. 237, p. 309–319.
LEHMANN, J.; CAMPOS, C.V.; MACEDO, J.L.V.; GERMAN, L. Sequential fractionation and sources of P in
Amazonian Dark Earths. In: GLASER, B.; WOODS, W.I. (Ed.). Amazonian Dark Earths: explorations in time and space. Berlin:
Springer, 2004. p. 113-123.
LUCA, DE N. G.; WEXLER, M.; PEREIRA, M.J.; YEOMAN, K.H.; JOHNSTON, A.W.B. Is the fur gene of Rhizobium
leguminosarum essential? FEMS microbiology Letters, Amsterdam, 1988. v.168, p.289-295.
Melo, I.S. Potencialidades de utilização de Trichoderma spp. no controle biológico de doenças de plantas. In: Bettiol, W.
Controle Biológico de Doenças de Plantas. Campinas: EMBRAPA/CNPDA 199. p.135-156.
NAVARRETE, A. A.; CANNAVAN, F. S.; TAKETANI, R. G.; TSAI, S. M. A molecular survey of the diversity of
microbial communities in different Amazonian agricultural model systems. Diversity, Bethesda, 2010.v. 2, p. 787-809.
ROSENBLUETH, M.; MARTINEZ-ROMERO, E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Molecular
Plant and Microorganisms Interactions, 2006. 8: 827-837.
RICHARDSON, A. E.; BAREA, J.M.; MCNEILL, A.M.; PRIGENT-COMBARET, C. Acquisition of phosphorus and
nitrogen in the rhizosphere and plant growth promotion by microorganisms. Plant and Soil, 2009. v.321, 305-339.
YANNARELL, A.C.; TRIPLETT, E.W. Within- and between-lake variability in the composition of bacterioplankton
communities: investigations using multiple spatial scales. Applied and Environmental Microbiology, Baltimore, 2004. v. 70, p. 214223.
WOESE, C.R.; KANDLER, O.; WHEELIS, L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains
Archaea, Bacteria and Eucarya. Proceedings of National Academy of Science of the USA, Washington, 1990. DC, v. 87, p. 45764579.
WOOD, M. Mechanism of aluminum toxicity to soil bacteria and possible ecological applications. Plant and Soil,
Dordrecht, 1995. v. 171, p. 63–69.
NEILANDS, J.B. Siderophore of bacteria and fungi. Microbiological Sciences, Oxford, 1984. v.1, p.9-14.
5