microRNAs E CÂNCER
Genética Humana Molecular
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
CLASSES DE RNA
RNA não codificadores
RNA
codificador
(ncRNA)
Codifica proteínas:
RNA
funcionais
mRNA (3%)
Não traduzidos:
tRNA (15%)
rRNA (70%)
lncRNA: 200 nt ~100 kb,
expressão tecido-especifica,
regulação alterada em
várias doenças e câncer
RNA pequenos
snRNA(small nuclear):
processamento de RNA transcritos
(spliceossomo)
snoRNA (small nucleolar):
modificação do rRNA
miRNA (micro): regulação da
expressão gênica
siRNA(small interfering): defesa do
genoma contra vírus e transposons
ncRNA longos
lncRNA: conteúdo no
genoma humano varia de
~7000 - 23,000
•Função: imprinting e
inativação do X
•Representa um enorme
componente da rede
celular normal que pode
ser alterada na biologia
do câncer.
Gibb et al. Molecular Cancer 2011, 10:3
Compreende um grupo de vias
relacionadas mecanisticamente que
produzem moléculas de ncRNA pequenas,
as quais modulam a expressão protéica via
degradação do mRNA ou repressão da
tradução.
SILENCIAMENTO GÊNICO
RNA de interferência
iRNA
mecanismo exercido por moléculas de RNA
complementares a mRNA, o qual inibe a
expressão gênica na fase de tradução ou
dificulta a transcrição de genes específicos
miRNA
(microRNA)
siRNA (small
interfering RNA)
microRNA - Histórico
•Ambros et al (1993): descobriram o gene lin-4 (small nonprotein-coding RNA)  regulação do desenvolvimento larval
de Caenorhabditis elegans
•Identificação de 2.588 microRNAs (miRNAs) maduros em
humanos  20-22 nucleotídeos  não codificadores de
proteínas
•Reguladores negativos da expressão gênica
•Regulam >60% de RNAm: função em processos como
desenvolvimento, diferenciação, proliferação celular,
apoptose e resposta a estresse
•Presentes em: C. elegans, D. melanogaster, plantas e
mamíferos (humanos)
•miRNA: implicados em vários cânceres humanos  tanto
perda como ganho de miRNA  contribuem para o
desenvolvimento do câncer
Andrew Fire e Craig C. Mello (2006): Prêmio Nobel em Fisiologia ou
Medicina sobre RNA interference em C. elegans, publicado em 1998.
O que são microRNAs?
•Pequenos RNAs endógenos fita simples não
codificadores de proteínas, com tamanho de ~ 19-25
nucleotídeos.
•Potentes reguladores pós-transcricionais.
•Função:
-proliferação
-diferenciação
-apoptose
-carcinogênese: duplo papel (oncogênese e supressor
tumoral)
miRNA x siRNA
miRNA
•Derivam de loci genômico distintos,
agrupados em cluster: (introns, exons,
regiões intergênicas)
•Processados a partir de RNAs em
grampos: precursor forma alças 
dupla hélice c/hairpin; forma madura:
linear (fita sem alças)
•Apenas a fita madura 3’ incorporada
ao RISC, a outra 5’ degradada (?)
siRNA
•Derivam de mRNA de
transposons, vírus ou DNA
heterocromático
•Processados a partir de grandes
duplexes
•Ambas cadeias são aproveitadas
no RISC
•Raramente conservados
•siRNA endógenos especificam
autosilenciamento (silenciamento
do mesmo locus) que o originou
•Permanece intacto após cisão do
mRNA alvo (pode se ligar em outras
Não se distinguem pela sua
regiões)
composição química ou mecanismo de
•Conservado entre os organismos
ação, diferenciam pela origem e alvos.
Comparação entre miRNA x siRNA
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101007/100705.pdf
NOMENCLATURA dos miRNA
miRBase (Griffitis-Jones et al., 2006)
•Os genes que codificam os miRNA são denominados com o prefixo de
três letras maiúsculas, hifenização (-) e itálico, seguida de um único
número de identificação
Ex: MIR -156 no Arabidopsis e mir-1 na Drosophila.
Humanos: hsa-mir-605
•Os precursores miRNA (pré-miRNA) também recebem a designação mir
(letras minúsculas, sem itálico)
• As formas maduras dos miRNA são designadas miR (sem itálico)
Ex: miR-1, miR-89, miR-278
•miRNA originados de cópias parálogas, com sequencias maduras
idênticas, acrescenta-se um hífem e um número
Ex.: miR-7-1, miR-7-2 e miR-7-3 (localizados nos cromossomos
9, 15 e 19)
•miRNA maduros cuja sequência difere em uma ou em duas posições
(homólogos) são designados com sufixos com letras pequenas
Ex: miR-1a e miR-1b
Biogênese do microRNA
Gene miRNA (localizado em introns, região
intergênica, exons)
miRNA: gerado pela transcrição de um longo
precursor (pri-miRNA)  pela RNA pol II
(pre-miRNA)
60-100 nt.
processado
para
produzir um
segundo
precursor
Transportado (Exportina 5) 
citoplasma processado RNase
III(Dicer)  remoção hairpin
miRNA duplex
(~22nt) 
complexo RISC 
fita simples linear
Ligação 3’UTR
RNAm  inibição
tradução
Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:2859–287
PRODUÇÃO E PROCESSAMENTO DO miRNA
Apenas uma fita madura (guia 3’) é incorporada ao
RISC, outra (passenger 5’) degradada. (?)
Sequência seed: região de 2-8nt do final 5’ do
miRNA, importante p/ reconhecimento e
silenciamento do mRNA
Ambas as fitas podem se ligar ao
RISC, usa-se os sufixos -5p ou -3p
has-miR-133a-5p
has-miR-133a-3p
Beezhold et al. Molecular Cancer 2010, 9:134
ANIMAÇÃO miRNA - NATURE
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm
BIOGENÊSE DOS miRNA e siRNA
verde: cadeia passenger
azul: cadeia guia
Preto: seq. clivada
a)pri-miRNA forma
hairpin  reconhecido
DGCR8 (doublestranded RNA-binding
protein) e clivagem 11pb
distante pela Drosha
b-c)pre-miRNA e siRNA
são clivados pela Dicer
 formando miRNA
duplex
d)complexo DicerdsRBP retem o produto
maduro  levado p/ Ago
(efetor de RISC-RNAinduced silencing
complexes)
Current Opinion in Structural Biology 2010, 20:90–97
e) após ligação ao
duplex a cadeia
passenger (verde) é
removida e a guia
(azul) permanece
ligada a Ago
f-g) RISC ativado
dirige-se p/o mRNA
alvo
miRNA x siRNA
REGULAÇÃO POR miRNA
•1 miRNA pode regular ~200 mRNA (múltiplos
alvos)
•1/3 dos genes estão sob controle dos miRNA.
Ex.: genes de fatores de transcrição
•Genes de miRNA: banco de dados
www.sanger.ac.uk/
> 2.588 miRNA em humanos
•70% dos genes de miRNA localizados em introns
e exons
•30% localizados em regiões intergênicas
Mecanismos de Regulação pelos miRNA
Três processos:
1- clivagem endonucleolítica: requer
complementaridade perfeita ou quase
perfeita ao mRNA (observado em plantas,
raro em mamíferos, devido interação
incompleta entre miRNA-mRNA)
2- degradação do mRNA por deadenilação:
repressão da tradução da proteína;
3- inibição do início da tradução
(característico de animais)
MECANISMOS DE
SILENCIAMENTO GÊNICO
PTGS
TGS
(Postranscriptional gene silencing)
(Transcriptional gene silencing)
•Atua em nível do mRNA através do
mecanismo dependente de Argonauta-2
(Ago-2)
•Atua em nível de DNA e pode
resultar em silenciamento a longo
tempo (plantas e animais)
•Referido como RNA de interferência
(RNAi)
•Envolve mudanças na cromatina
mediada por ncRNA na região
promotora resultando em transcrição
reduzida de genes alvos
•siRNA atua para recrutar Ago-2 para o
mRNA alvo pela complementaridade da
sequência
•Resulta na clivagem ou repressão
traducional do mRNA alvo
•Modificações da cromatina:
metilação do DNA e histonas nas
regiões do lócus-alvo
•Consequente diminuição da expressão
gênica
•Observado em plantas, drosophila,
levedura e humanos
•Depende da presença continua do siRNA
•Utilização com siRNA sintéticos
NATURE|Vol 457|22 January 2009|doi:10.1038/nature077
MECANISMOS DE SILENCIAMENTO GÊNICO
Mecanismos: ligação na região
3’UTR do RNAm (a)
•pós-transcricional (PTGS):
-clivagem direta do RNAm:
miRNA é complementar ao
RNAm  degradado após
clivagem p/RISC
-repressão da tradução e
degradação RNAm: miRNA com
pareamento incompleto
DGCR8: cofator de DROSHA
XPO5: exportinA-5 (transporte ao citoplasma)
RISC (RNA-induced silencing complex)
PROCESSOS DE INIBIÇÃO DA TRADUÇÃO
1- Competição pelo 5’ CAP: miRNAs podem interferir no reconhecimento do
5’CAP. A proteína AGO apresenta domínio semelhante ao da proteína de ligação ao
5’CAP, assim competindo com 5’CAP
2-Inibição da montagem dos ribossomos: AGO2 pode associar-se a eIF6 (fator de
iniciação da tradução) e a unidade ribossomal maior, impedindo a montagem do
ribossomo (subunidade maior e menor)
3-Deadenilação seguida pelo bloqueio da iniciação da tradução: impede a
circularização do mRNA (pela interação do 5’CAP e cauda poli –A), que é essencial
para a iniciação da tradução
4-Dissociação prematura de ribossomos: miRNAs levam a desmontagem
antecipada dos ribossomos
5-Redução da velocidade de elongação durante a síntese proteica: miRNA reduz
o número de ribossomos interagindo com o mRNA
6-Proteólise durante a fase de elongação: miRNAs promovem a degradação da
cadeia polipeptídica nascente no ribossomo, durante a fase de elongação
Mecanismos de repressão mediado por miRISC
(Topo) RNAm não
reprimidos recrutam
fatores de iniciação e
ribossomos e formam
estruturas que aumentam
tradução.
Esquerda (superior):
Ligação de RISC ao
RNAm  pode reprimir
iniciação pelo
reconhecimento do 5-cap;
Esquerda (inferior): ou
recrutamento de
60S/eIF6.
Direita: reprimir estágio pós-iniciação da tradução  retirada dos ribossomos
prematuramente; ou promover degradação do RNAm induzindo deadenilação e
remoção do 5-cap
Abaixo: Alternativamente: pode induzir deadenilação do RNAm  inibir
circularização do RNAm
Modelo de silenciamento gênico do tipo TGS
siRNA sintético
ou miRNA
endógeno
Recrutamento de
Ago-1promotor
Plasmídeo
expressando shRNA
ou RNA antisense
Recrutamento de HDAC-1,
DNMT3A, HMT
cromatina fechada
transcrição inativa
BioTechniques 48:ix-xvi (The RNA World June 2010) doi 10.2144/000113
microRNA e Câncer
Descoberta de miRNA câncer: Calin et al. (2002)
LLC (leucemia linfocítica crônica): del(13q14)  dois genes de
miRNA: miR-15-a e miR-16-1  perda em 70% de LLC 
evento precoce (iniciador)  função de gene supressor de
tumor
•Maioria dos miRNA localizados em regiões envolvidas em
alterações cromossômicas:
-deleções,
-Amplificação,
-mutação (afeta o processamento dos miRNA),
-Metilação DNA e modificações histonas: função na regulação
da expressão dos miRNAs (Ex.: miR-127 geralmente silenciado
em células cancerosas)
www.nature.com/reviews/genetics
OCTObER 2009 | VOLuME 10
Mapa de miRNA envolvidos em alterações em câncer: 13q14 (miR-15-a e miR-161)- deletada em LLC; 7q32 (miR-29-a e miR-29b) deletada em SMD e LMA; 3p2 (let-7glet-7a1); 9q22.3 (let-7f-1, let-7d) em tumores sólidos (pulmão, urotelial, mama, etc.
Função dos miRNA como supressor tumoral x oncogene
Sequenciamento dos miRNA: evidenciado deleções, mutações
(inclusive na linhagem germinativa  forma familial de LLC)
Membros da família let-7
regula negativamente
Oncogene RAS e outros
oncogenes: CDK6, CCND2,
Perda de let-7  expressão > de RAS
Câncer de pulmão
CICLINA D
miR-15-a e miR-16-1 alveja
oncogene BCL2 (inibidor
apoptose)
miR-155 e miR-17-92:
amplificados em vários
linfomas de células B,
câncer pulmão, mama, etc
Perda desses miRNAs  disfunção de
oncogenes celulares
miR-17-92 (13q31) promove proliferação,
inibe apoptose, induz agiogênese, e coopera
c/ MYC  desenvolvimento de linfomas e
câncer pulmão
Overexpression miR-155  pobre
prognóstico em adenocarcinoma pulmão
miRNAs encontrados na circulação (nanovesículas – exossomos): biomarcador não invasivo
www.nature.com/reviews/genetics
OCTObER 2009 | VOLuME 10
miRNA: Reguladores de Mudanças
Epigenéticas
miRNA
Regula enzimas
envolvidas na
metilação DNA de
genes supressores
Família miR-29
alveja
DNMT3A, DNMT3B e
DNMT1
causando desmetilação
Células AML: introdução de miR29 causou perda de expressão das
DNMTs, do oncogene MCL1 e
reativação de p16
Linhagem de câncer de pulmão:
introdução de miR-29 causou
desmetilação do promotor de genes
supressores  reativação gênica e
perda de tumorigenicidade
Expressão de microRNA em Câncer
Profile MicroRNAs from Cancer and Normal Tissues.
A susbset of the MicroRNA primers were used in this study to confirm published
findings of 9 different MicroRNAs in 5 separate tumor vs. Normal RNA samples.
Aplicação no prognóstico, progressão da doença e resposta a terapia
Terapia baseada em miRNA ou antimiRNA
miRNA podem estar deletados ou hiper expressos no câncer
-miRNA (ou siRNAs) podem ser consideradas drogas para
silenciamento gênico: induzir apoptose e /ou parada do ciclo
celular em células cancerosas com desregulação de miRNA
-anti-miRNA (antagomir): bloquear a atividade de miRNA
endógenos
Introdução de miRNA nos tumores:
-diretamente nos tumores (fígado, medula, baço e rim)
- ou utilização de vetores
RNA interferência – Terapia por miRNA
-introduzidos em vetores: adenovírus, vírus adenoassociados (AAV), retrovírus, lipossomos, injeção do
RNA, nanopartículas
Camundongos:
Triagem clínica: alvos
-miR-15a e miR-16-1: tratamento da
leucêmia
-IL-10: tratamento da
preeclâmpsia
-miR-26a: inibição da proliferação
celular e indução de apoptose em
hepatocarcinoma
-VEGF e VEGFR-1:
degeneração macular
-família miR-29: suprimir câncer de
pulmão e leucêmia (LMA)
-BCR-ABL: LMC
Riscos: miRNA/siRNA introduzidos exogenamente podem sequestrar
componentes da maquinaria celular envolvidos no silenciamento gênico
 reduzindo acessibilidade da maquinaria p/os miRNA endógenos
Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia
devido o tamanho e carga negativa, não atravessam
facilmente a membrana celular
Vetores não virais:
-conjugados de colesterol
-nanopartículas de polications
ligadas a transferrina
-Anticorpos carregados
positivamente
Vetores virais:
-lentivírus: contra Ras
(camundongo); doenças
neurodegenerativas
-SNALP: bicamada lipídica
conjugada com polietileno glicol
difusível
-Adenovírus: sistema
nervoso central  injeção
direta contra transcrito de
ataxia espinocerebelar
(camundongo)
-MEA: partículas
policonjugadas dinâmicas
Riscos: imunogenicidade
viral; mutações insercional
Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia
-grupos de colesterol aumenta
estabilidade do siRNA.
Ex: entrega intravaginal
(camundongo) siRNA contra
HSV-2
Nanopartículas de polication podem
introduzir os siRNA em células específicas
através de ligantes de superfície
(transferrina)  ao receptor das células
alvos. Ex.: sarcoma Ewing (Ews-Fli1,
mice); contra CCND1 em leucócitos
camundongo
Anticorpos especificos com
protaminas (carga +)  entrega dos
siRNA p/células específicas via
receptor. Ex.: contra gene gag HIV
Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia
Permite siRNA ser absorvido
pelas células e liberado por
endossomos. Ex.: siRNA contra
APOB  fígado (primatas)
Similar aos SNALPS, mas
menores, contêm um ligante
que permite entrega para as
células alvos
Triagens clínicas para tratamento de doenças
-Bevasiranib: contra VEGF  degeneração macular (crescimento de vasos atrás
da retina)  perda visual. Tratamento  melhora da visão sem efeito colateral.
Também em fase II para tratamento de edema macular diabética
-Alnylan Pharmaceuticals: contra genes implicados na hipercolesterolemia,
doença de Huntington, hepatite C
-Doenças alvo p/tratamento: AIDS, Parkinson, degeneração macular, diabetes
tipo 2, obesidade, hipercolesterolemia, artrite reumatóide, doenças respiratórias e
câncer
TERAPIA – ANTAGONISTAS DE miRNA (AMOs)
-inibir miRNA oncogênicos utilizando antagonistas de miRNA:
•anti-miRs, locked-nucleic acids (LNA) ou antagomiRs: são
oligos com sequencias complementares aos miRNAs endógenos
•Alteram a configuração do miRNA impedindo o processamento
por RISC, ou degradam miRNA endógenos
•Substituição do miRNA: reintrodução de um “miRNA mimético”
supressor tumoral para restaurar uma perda de função
Cancer Res. Author manuscript; available in PMC 2011 September 15.
TERAPIA – ANTAGONISTAS DE miRNA (AMOs)
- Miravirsen (SPC3649): antagonizar miR-122  para tratar
hepatite C crônica  redução dos níveis de colesterol do
plasma, sem toxicidade.
- liga-se a alça do precursor do miR-122 bloqueando o
processamento pelas enzimas Dicer e Drosha
-2010: foi a primeira droga alvejando miRNA em triagem
clínica e atualmente encontra-se em fase II
2010: antagomir alvejando o pró-metastático miR-10b 
antagonizar metástase em modelo murino de câncer de mama
- antagomir alvejando miR-155 em modelo murino de linfoma
Cancer Res. Author manuscript; available in PMC 2011 September 15.
APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS
Terapêutica baseada
inibição miRNAS:
na
-uso de drogas inibidoras:
-empresa Regulus e SanafiAventis: mólécula moduladora
do oncomiR miR-21, que tem
como alvo os genes supressores
PTEN e PDCD4 (glioblastoma,
câncer de pâncreas, mama)
-Miravisen (teste clínico fase
3): tratamento da hepatite C –
inibição do miR-122 em células
do fígado (alveja duas regiões
do RNA viral,
levando a
redução da contagem viral)
Terapêutica baseada na
reposição de miRNAs:
-empresa Mirna Therapeutics:
modulador que mimetiza o
miR-16 (alveja BCL2, controle
da apoptose)
-droga MRX34: modulador
mimetizador do miR-34 (alveja
genes reguladores do ciclo
celular, como MYC, MET RRAS,
CCND1). Modelo animal de
câncer pulmonar (única dose
induziu apoptose e redução da
massa tumoral em 60%).
Próxima fase, teste clínico em
pacientes com câncer hepático
miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS
miRNAs exercem papel importante no desenvolvimento de muitas doenças:
marcadores progresso, prognóstico e avaliação da resposta ao tratamento
miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS
-diminuição de miRNAs expressos no hipocampo: falha na
Epilepsias
Doença de
Alzheimer
maquinaria de maturação dos miRNAs e diminuição na
expressão da enzima Dicer (formação dos miRNAs
maduros). Ex.:miR-206, miR-347
-Enquanto outros apresentam expressão aumentada após
a crise epilética: Ex.: miR-132, miR-134
-desregulação dos miRNAs em cérebros de pacientes
relacionados com a progressão da doença: miR-9, miR-29,
miR-34, miR-106, miR-107 (regulam genes chaves
envolvidos na DA).
-miR-107: ( mais relevante) baixa expressão nos estágios
iniciais da doença no lobo temporal, correlacionado com
alta expressão de BACE1 (enzima beta secretase 1)
-miR-29: casos esporádicos de DA - tem sítios de ligação
para o gene BACE1 (sua perda é correlacionada com alta
expresão desse gene)
-miR-153: contribui para a regulação pós-transcricional
dos genes APP/APLP2
miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS
-distúrbio neurodegenerativo, perda da cognição e
Doença de
Huntington
alterações psiquiátricas, perda progressiva de neurônios do
córtex e corpo estriado
-expansão do códon CAG no gene HTT (proteína
huntingtina)
-miR-200: alterado no córtex de camundongos mutantes de
HTT nas fases iniciais da doença (comprometimento de
genes envolvidos na plasticidade e sobrevivência neuronal)
-hopexpressão : miR-146a, miR-125b, e miR-150
-hiperexpressão: miR-34b
-desregulação da Dicer, Drosha e Exportina-5
Outras Doenças
-Esquizofrenia
-Autismo
-Doenças Cardiovasculares
Doenças autoimunes ou inflamatórias
crônicas
miRNA COMO BIOMARCADORES DE
DIAGNÓTICO E PROGNÓSTICO
Padrão de expressão dos miRNAs:
assinatura
potencial
para
a
classificação, diagnóstico, prognóstico
e resposta terapêutica
-Utilização de biópsias, fluidos
biológicos como soro, plasma,
urina, escarro, etc
•Diabetes: níveis séricos do miR-23a (sensibilidade de 79,2% e
especificidade de 75%) capaz de discriminar pacientes com
diabetes do tipo 2
•Epilepsia: níveis séricos do miR-106-b-5p (melhor preditor com
sensibilidade de 80,3% e especificidade de 81,2%)
•Esclerose múltipla: desregulação de miRNAs em linfócitos T
isolados do sangue
•Doença de Alzheimer: níveis séricos do miR-342-3p apresentou
melhor sensibilidade 81,5% e especificidade 70,1%
PRINCIPAIS MODULADORES DE miRNAs EM
DESENVOLVIMENTO
-273 testes clínicos registrados na plataforma clinicaltrials
-49% das patentes relacionadas a tecnologias para modulação
de miRNAs e novas técnicas de administração dos moduladores
de miRNAs.
Segurança da Terapia
-Um único miRNA pode regular os níveis de centenas de
proteínas  consequências de hipoexpressão ou expressão
ectópica
-relatos de mortes em camundongos  devido em parte a
saturação do fator de transporte” exportina 5”, que transporta o
miRNA do núcleo p/ citoplasma
-utilização de menor concentração possível de siRNA que
forneça eficácia terapêutica
-siRNA alteram a expressão de genes alvos e não alvos
-Outras barreiras: toxicidade associada a entrega; pobre
transfecção, pouco conhecimento da biodistribuição, liberação
sistêmica, degradação na circulação, sequestração endossomal e
estimulação da resposta imune celular