Universidade Federal do Rio de Janeiro
ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA POR MUTAÇÃO DE PROTEÍNA
TIPO OmpA E FORMAÇÃO DE BIOFILMES EM Leptospira spp.
Paula Carvalhal Lage Von Buettner Ristow
2008
ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA POR MUTAÇÃO DE PROTEÍNA TIPO OmpA
E FORMAÇÃO DE BIOFILMES EM Leptospira spp.
Paula Carvalhal Lage von Buettner Ristow
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de
Pós-Graduação
em
Ciências
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof.
Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em
Ciências Biológicas (Microbiologia)
Orientadores: Leila de Souza Fonseca e Walter Lilenbaum
Rio de Janeiro
Maio, 2008
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Ristow, Paula Carvalhal Lage von Buettner
Atenuação da virulência por mutação em proteína tipo OmpA e formação de
biofilmes em Leptospira spp./ Paula Carvalhal Lage von Buettner Ristow - Rio
de Janeiro, 2008
xxi, 111f
Tese [Doutorado em Ciências (Microbiologia)]
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo
de Góes, 2008.
Orientadores: Leila de Souza Fonseca e Walter Lilenbaum
Referências bibliográficas:f 87
1. Leptospira 2. Leptospirose 3. Proteína OmpA. 4. Fator de virulência 5.
Mutagênese por transposição 6. Biofilme. I.Fonseca Leila de Souza,
Lilenbaum Walter. II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes,
Doutorado em Ciências (Microbiologia). III. Atenuação da virulência por
mutação em proteína tipo OmpA e formação de biofilmes em Leptospira spp.
iv
Aos que se aventuram pelos
mistérios da ciência e se encantam
com a maravilha do eterno
aprender e ensinar.
v
La chance ne sourit qu'aux esprits
bien préparés.
Louis Pasteur (1822
1895)
vi
AGRADECIMENTOS
À minha família por estar ao meu lado sempre, me apoiando, me dando
coragem, força, alegrias e amor para eu seguir os meus caminhos! Obrigada
aos meus pais, Arno e Fátima; avós paternos, Arno e Ally Odete; Ana Augusta;
meus irmãos Roberta, Eduardo e Luiz Augusto. Aos meus avós Aventino
Fernandes e Maria de Lourdes, o amor de vocês está sempre em meus
pensamentos.
À Leila de Souza Fonseca, orientadora e incentivadora; quem me
ensinou que somos nós que fazemos os nossos próprios limites; obrigada pelo
aprendizado e por ter me dado a liberdade e a confiança que eu precisava para
realizar o Doutorado.
Ao orientador e amigo Walter Lilenbaum, quem me formou desde o
princípio e me incentivou em todos os meus planos e sonhos. Obrigada pela
sua confiança, respeito e por todos os ensinamentos.
Ao Mathieu Picardeau, chefe da Unidade de Espiroquetas do Instituto
Pasteur; obrigada pela oportunidade de trabalhar na sua equipe, por todo o
aprendizado, sua confiança em meu trabalho e sua amizade (À Mathieu
Picardeau, responsable de l Unité de Biologie des Spirochètes; je te remercie
pour
l oportunité
de
travailler
dans
ton
équipe
de
recherche,
tout
l apprentissage, ton soutien, ta confiance et ton amitié).
À Pascale Bourhy, grande amiga, obrigada por tudo que você me
ensinou no laboratório, por sempre me incentivar e pelas horas agradáveis e
descontraídas - inesquecíveis! - que passamos juntas. (À ma chère amie
Pascale Bourhy, merci infiniment pour tout ce que tu m as
appris au
laboratoire, pour ton soutien constant et pour les heures agréables et
décontractées
inoubliables ! - qu on a passé ensemble).
Ao Neio Lúcio Fernandes Boéchat, quem tanto me incentivou e muitas
vezes me guiou em minha carreira, me abrindo tantas portas. Obrigada!
Ao amigo Walter Oelemann, obrigada por me ensinar os primeiros
passos da biologia molecular e pelo seu apoio!
À Equipe de Pesquisa da Unidade de Biologia de Espiroquetas, Viviane
Morel, Júlio Croda, Laurence Salaun, Hélène Louvel, muito obrigada pelo
aprendizado, incentivo e amizade. (À l équipe de recherche de l Unité de
vii
Biologie de Spirochètes, Viviane Morel, Júlio Croda, Laurence Salaun, Hélène
Louvel, merci beaucoup pour vos conseils, encouragements et amitiés).
Às Equipes dos Centros Nacionais de Referência de Leptospirose e
Borreliose, Pascale Bourhy, Danielle Postic, Guy Baranton, Elisabeth Ferquel,
Muriel Cornet, Viviane Morel, Délphine Chaumet, Martine Garnier, Natasha
Sertour, por sua ajuda quotidiana e agradável companhia. Obrigada
especialmente à Solange Coueille, secretária da Unidade de Biologia de
Espiroquetas, pela sua acolhida no Instituto Pasteur e sua preciosa ajuda. (Aux
Equipes des Centres Nationaux de Référence de la Leptospirose et de la
Borreliose, Pascale Bourhy, Danielle Postic, Guy Baranton, Elisabeth Ferquel,
Muriel Cornet, Viviane Morel, Délphine Chaumet, Martine Garnier, Natacha
Sertour, je vous remercie de votre aide quotidienne et votre agréable
compagnie. Un grand merci à Solange Coueille, sécretaire de l Unité de
Biologie des Spirochètes, pour ton accueil chaleureux à Pasteur et ta précieuse
aide).
À Isabelle Saint Girons, Diretora de Ensino, Diretora do Conselho
Científico e ex-responsável pela Unidade de Espiroquetas do Instituto Pasteur,
obrigada por me receber no Instituto Pasteur e pelo seu apoio constante. (À
Isabelle Saint Girons, Directrice de l'Enseignement, Directrice de l'Evaluation
Scientifique et ancienne responsable de l Unité des Spirochètes de l Institut
Pasteur, je vous remercie de votre accueill à l Institut Pasteur et votre soutien
constant).
Ao Michel Huerre, responsável pela Unidade de Pesquisa e Expertise
em Histotecnologia e Patologia do Instituto Pasteur, agradeço pelo entusiasmo
em me ensinar patologia! Obrigada Patrick Ave pelo seu profissionalismo e
simpatia. (À Michel Huerre, responsable de L Unité de Recherche et
d Expertise en Histotechnologie et Pathologie, merci pour votre enthousiasme à
m apprendre la pathologie ! Merci Patrick Ave pour ton professionalisme et ta
sympathie).
À Sophie Kerneis pela amizade, ajuda e pelas agradáveis
e por vezes
difíceis também! - horas passadas em frente ao microscópio eletrônico. À Marie
Christine Prévost, responsável pela Unidade de Microscopia Eletrônica do
Instituto Pasteur, Christine Schmitd, Stéphanie Guadagnini e Martin Sachse
pela grande ajuda na microscopia do difícil biofilme de leptospiras. (À Sophie
viii
Kerneis pour ton amitié, ton aide et pour les heures agréables
aussi !
parfois dificilles
passées au microscope électronique. À Marie Christine Prévost,
responsable de l Unité de Microscopie Electronique de l Institut Pasteur,
Christine Schmitd, Stéphanie Guadagnini et Martin Sachse pour votre grande
aide et vos conseils pour la microscopie élecétronique du biofilm des
leptospires).
Ao Albert Icksang Ko, por todos os seus incentivos, seriedade e espírito
crítico construtivo.
Ao Jean Marc Ghigo, responsável pela Unidade de Genética de
Biofilmes do Instituto Pasteur, e Christophe Beloin pelas idéias e o apoio ao
projeto biofilme de leptospiras . (À Jean Marc Ghigo, responsable de l Unité de
Génétique des Biofilms, et Christophe Beloin pour vos idées et votre soutien au
projet «biofilm des leptospires »).
Ao Ivo Boneca, responsável pelo Grupo de Biologia e Genética da
Parede Bacteriana do Instituto Pasteur, agradeço pelo agradável aprendizado e
pela aventura de trabalhar com o desconhecido peptideoglicano de leptospiras.
Obrigada Mériem, Mathilde e Sophie pela amizade e ajuda no laboratório do
Ivo! (À Ivo Boneca, responsable du Groupe de Biologie et Génétique de la
Paroi Bactérienne, je te remercie pour ton apprentissage agréable et pour
l aventure de travailler avec le méconnue peptidoglycane des leptospires. Merci
Mériem, Mathilde et Sophie, pour votre amitié et votre aide au laboratoire
d Ivo!)
Agradeço pela dedicação e gentileza de todos que participam do projeto
estrutura de Loa22 : Ahmed Ahouz, Isabelle Miras, Jacques Bellalou et
Vincent Bondet. Os cristais de Loa22 serão os mais lindos! (Merci pour le
devouement et la gentillesse de tous ceux qui participent au projet «structure
de Loa22 » : Ahmed Ahouz, Isabelle Miras, Jacques Bellalou et Vincent
Bondet. Les cristaux de Loa22 seront les plus beaux!).
Ao Nobuo Koizumi por nos ceder gentilmente o soro anti-Loa22 e o
plasmídio para a produção de Loa22 recombinante. (To Nobuo Koizumi for the
generous gifts of Loa22 antiserum and plasmid for the production of
recombinant Loa22).
Obrigada aos que me ajudaram e incentivaram no Instituto Pasteur:
Françoise Guinet, Evelyne Couture-Tosi, Jean Michel Alonso. Também à Hervé
ix
Bourhy, Elisabeth Carniel, Michel Popoff, Agnès Fouet, Pierre Goossens,
Michèle Mock e suas equipes. (Je tiens à remercier tous ceux qui m ont aidé et
soutenu à l Institut Pasteur : Françoise Guinet, Evelyne Couture-Tosi, Jean
Michel Alonso. Aussi à Hervé Bourhy, Elisabeth Carniel, Michel Popoff, Agnès
Fouet, Pierre Goossens, Michèle Mock et leurs équipes).
À equipe do Laboratório de Preparação do Instituto Pasteur: Isabelle,
Françoise, Patrick, Sophie, muito obrigada! (À l équipe du Laboratoire de
Préparation : Isabelle, Françoise, Patrick, Sophie, un grand merci !)
Aos meus queridos amigos do Instituto de Microbiologia: Ana Carolina,
Carla, Eliane, Elis, Juliana, Silvana, Marlei e Simone, obrigada pelas
conversas, carinho e grande incentivo sempre!
Às amigas Anne Derbise, Najla, Maria Ágata et Sophie Davison, vocês
foram fundamentais para a minha sanidade mental! Muito obrigada pelas
nossas conversas, cafés, carinho e apoio! (Aux amies Anne Derbise, Najla,
Maria Agata et Sophie Davison, vous étiez essentielles pour ma santé mentale!
Merci infiniment pour les discussions, les cafés, notre amitié et le soutien!)
Às amigas Fernanda, Íris e Silvia, obrigada pelo incentivo em todas as
horas!
Ao Rafael Duarte e a Equipe do Laboratório de Micobactérias do Instituto
de Microbiologia UFRJ, obrigada pelo incentivo e amizade.
Aos professores do Instituto de Microbiologia, Agnes Figueiredo, Ana
Paula Colombo, Ângela Castro, Ângela Hampshire, Beatriz Meurer, Bernadete
Teixeira, Clarissa Palatnick, Cáudia Paiva, Kátia Neto, Lígia Peçanha, José
Mauro Peralta, Lúcia Teixeira, Marcelo Bozza, Márcia Giambiaggi, Maria Bellio,
Regina Domingues, Maulori Cabral, Rosalie Coelho, Thaís Souto Padron e
todos os outros não citados aqui, obrigada pela excelente formação que vocês
proporcionam aos alunos do curso de Microbiologia e exemplo.
À Thaís Souto Padron pela ajuda e confiança em vários momentos do
meu doutorado. Muito obrigada!
À Safira Farache e Luciana, obrigada pelo trabalho e ajuda em todos
estes anos!
Ao Instituto de Microbiologia da UFRJ e seus funcionários, obrigada pelo
suporte.
Aos amigos da Equipe do Laboratório de Bacteriologia do Instituto
x
Biomédico da UFF, obrigada pelo incentivo de todos.
Agradeço aos órgãos financiadores CNPq, CAPES, Pasteur-Fiocruz e
Pasteur-Weizmann, que possibilitaram a realização deste trabalho.
xi
RESUMO
Paula Carvalhal Lage von Buettner Ristow
Atenuação da virulência por mutação de proteína tipo OmpA e formação de
biofilmes em Leptospira spp.
Orientadores:
Leila de Souza Fonseca e Walter Lilenbaum
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio
de Janeiro UFRJ, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Doutor
em Ciências (Microbiologia).
A leptospirose é uma zoonose de alta morbidade em humanos e animais
e um importante problema de saúde pública. Causada por bactérias do gênero
Leptospira, a doença apresenta diversas formas clínicas e é especialmente
importante em países em desenvolvimento. Os mecanismos de patogenicidade
e persistência de leptospiras são pouco conhecidos até o momento. Com o
objetivo de identificar genes envolvidos na patogenia da leptospirose,
caracterizou-se um mutante de Leptospira interrogans serovar Lai, interrompido
no gene loa22 que codifica para a Loa22, uma lipoproteína putativa. A Loa22
tem tamanho de 22 KDa e possui domínio C-terminal do tipo OmpA. O mutante
não expressou a proteína Loa22 pelos métodos ELISA e western-blot, e
demonstrou um fenótipo de atenuação de virulência nos modelos animais
cobaio e hamster, não mais levando estes animais ao óbito. O mutante foi
complementado com o gene loa22 selvagem e teve a expressão da proteína e
o fenótipo de virulência restaurados. Loa22 é expressa in vivo e está exposta
na superfície bacteriana. A proteína Loa22 é o primeiro fator de virulência
geneticamente definido em Leptospira sp.. Um segundo aspecto deste trabalho
visou caracterizar a formação de biofilmes em Leptospira spp.. Suportes de
vidro e poliestireno foram testados para a formação de biofilmes em Leptospira
spp.. Ensaios de microscopia óptica e eletrônica revelaram a arquitetura dos
biofilmes, onde leptospiras estavam envoltas em uma matriz extracelular. O
teste de quantificação da formação de biofilme em placas de poliestireno foi
utilizado para Leptospira biflexa e demonstrou que a formação de biofilme é
tempo-dependente. A formação de biofilmes é compatível com a vida aquática
de leptospiras saprófitas e pode se revelar importante para a sobrevivência e
persistência no meio ambiente, assim como para a colonização de hospedeiros
por leptospiras patogênicas.
Palavras-chave: Leptospira, leptospirose, proteína OmpA, fator de virulência,
mutagênese por transposição, biofilme.
Rio de Janeiro
Maio de 2008
xii
ABSTRACT
Paula Carvalhal Lage von Buettner Ristow
Virulence attenuation by knockout of an OmpA-like protein and biofilm formation
in Leptospira spp.
Orientadores:
Leila de Souza Fonseca e Walter Lilenbaum
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio
de Janeiro UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em
Ciências (Microbiologia).
Leptospirosis is a zoonotic disease that is a cause of high morbidity and
mortality in humans and animals and an important public health problem.
Caused by bacteria of Leptospira genus, this disease presents diverse clinical
manifestations and is especially important in developing countries. The
pathogenic and persistence mechanisms of leptospires are largely unknown.
With the purpose of identifying virulence genes of leptospires, a mutant of
Leptospira interrogans serovar Lai, disrupted in loa22 gene encoding Loa22, a
putative lipoprotein, was characterized. Loa22 has 22 KDa and a predicted Cterminal OmpA-domain. The mutant strain did not express Loa22 and its
virulence was attenuated in the guinea pig and hamster models of leptospirosis,
whereas the genetically complemented strain was restored in Loa22 expression
and virulence. Loa22 is expressed in vivo and is exposed on the cell surface.
Loa22 protein is the first genetically defined virulence factor in Leptospira. A
second aspect of this work aimed to characterize biofilm formation in Leptospira
spp.. Glass and polystyrene supports were used to test for biofilm formation in
Leptospira spp.. Light and electronic microcopy assays revealed the
architecture of biofilms, where leptospires were embedded in an extracellular
matrix. Biofilm quantification was performed for Leptospira biflexa in polystyrene
plates and showed that biofilm formation is time-dependent. The formation of
such biofilms is consistent with the aquatic life of saprophytic strains in water
and may be important for survival and persistence in the environment, as well
as colonization of the host by pathogenic strains.
Key-words: Leptospira, leptospirosis, OmpA protein, virulence factor,
transposition mutagenesis, biofilm.
Rio de Janeiro
Maio de 2008
xiii
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................1
1.1. Aspectos gerais............................................................................................1
1.2. Genética e patogenia de leptospiras..........................................................10
1.3. Leptospira spp. no contexto dos biofilmes bacterianos..............................17
2. OBJETIVOS..................................................................................................20
3. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................21
3.1. PROJETO 1: ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM L. interrogans..........21
3.1.1. Condições de cultivo................................................................................21
3.1.2. Construção das cepas mutantes.............................................................22
3.1.2.1. Extração de DNA..................................................................................25
3.1.2.2. Ligation Mediated PCR (LM-PCR)........................................................25
3.1.3. Confirmação dos genótipos.....................................................................26
3.1.4. Southern blot............................................................................................26
3.1.5. Curvas de crescimento............................................................................28
3.1.6. Eletroforese e Western blot.....................................................................28
3.1.7. Ensaio imunoenzimático (ELISA)............................................................29
3.1.8. Localização de Loa22 por Imunofluorescência........................................29
3.1.9. Fracionamento de proteínas por triton X-114..........................................30
3.1.10. Infecção experimental em animais........................................................32
3.1.11. Exame anatomopatológico....................................................................33
3.2. PROJETO 2: FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR Leptospira spp..........33
3.2.1. Cepas bacterianas e condições de cultivo...............................................33
3.2.3. Formação de biofilmes em tubos de vidro...............................................34
3.2.4. Formação de biofilmes em placas de poliestireno...................................35
3.2.5. Microscopia óptica dos biofilmes.............................................................35
3.2.6. Microscopia eletrônica dos biofilmes.......................................................36
3.2.7. Mutagênese sítio-dirigida em L. biflexa...................................................37
4. RESULTADOS..............................................................................................40
4.1. PROJETO 1: ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM L. interrogans..........40
4.1.1. Mutação e complementação de loa22 em L. interrogans serovar Lai.....40
xiv
4.1.2. Genótipos e fenótipos..............................................................................40
4.1.3. Expressão de Loa22 por ELISA e Western-blot......................................41
4.1.4. Características da proteína Loa22...........................................................41
4.1.5. Localização de Loa22 por imunofluorescência........................................42
4.1.6. Extração de proteínas com o triton X-114...............................................43
4.1.7. Estudos de virulência...............................................................................43
4.1.8. Histopatologia..........................................................................................45
4.1.9. Expressão in vivo de Loa22.....................................................................46
4.2. PROJETO 2: FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR Leptospira spp..........47
4.2.1. Formação de biofilmes em superfícies abióticas por leptospiras
patogênicas e saprófitas....................................................................................47
4.2.2. Análise microscópica dos biofilmes.........................................................48
4.2.3. Quantificação da formação de biofilme....................................................50
5. TABELAS E FIGURAS.................................................................................52
6. DISCUSSÃO..................................................................................................75
6.1. PROJETO 1: ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM L. interrogans..........75
6.2. PROJETO 2: FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR Leptospira spp..........80
7. CONCLUSÕES..............................................................................................85
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................87
9. ANEXO: PUBLICAÇÕES............................................................................111
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
A
A
alg1
alg2
AP
BLAST
BP
BSA
CID
crio-MEV
D
DL50
DNA
DO
ELISA
EMJH
flaB
GLP
Hap1
Himar 1
Fase aquosa
Absorbância
Gene alginato 1
Gene alginato 2
Cepa de alta passagem
Basic Local Alignment Search Tool
Cepa de baixa passagem
Albumina sérica bovina
Coagulação intravascular disseminada
Microscopia eletrônica de crio-varredura
Fase detergente
Dose letal 50%
Deoxiribonucleic acid / ácido deoxirribonucléico
Densidade óptica
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay / ensaio imunoenzimático
Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris
Gene flagelina B
Glicoproteínas
Hemolysis-associated protein 1 / proteína 1 associada à hemólise
Haematobia irritans mariner 1 transposon / transposon mariner de
Ig
kDa
Km
KmR
LB
LCR
LE
LE1
Lens
Haematobia irritans 1
Imunoglobulina
Kilodaltons / quilodaltons
Canamicina
Resistência à canamicina
Luria-Bertani
Líquido cefalorraquidiano
Leptospira
Leptospira 1
Leptospiral endostatin proteins / proteínas de leptospiras do tipo
Ligs
LipL21
endostatina
Immunoglobulin like proteins / proteínas do tipo imunoglobulina
lipoprotein of Leptospira with 21 kDa / lipoproteína de Leptospira com
LipL32
21 kDa
lipoprotein of Leptospira with 32 kDa / lipoproteína de Leptospira com
LipL36
32 kDa
lipoprotein of Leptospira with 36 kDa / lipoproteína de Leptospira com
LipL41
36 kDa
lipoprotein of Leptospira with 41 kDa / lipoproteína de Leptospira com
LiL46
41 kDa
lipoprotein of Leptospira with 46 kDa / lipoproteína de Leptospira com
LM-PCR
LPS
46 kDa
Ligation mediated PCR
Lipopolissacarídeo
xvi
mA
MaGe
MAT
Mb
MET
MEV
OM A
OM B
Omp
ORF
PBS
PC
PCR
PG
q.s.p.
rpm
Spc
SpcR
SDS
Sph
Sph2
SPHS
SpLip
S1a
S1b
TNE-PI
MiliAmpere
Magnifying Genomes
Microscopic agglutination test / teste de soroaglutinação microscópica
Megabase
Microscopia eletrônica de transmissão
Microscopia eletrônica de varredura
Outer membrane primer A / iniciador membrana externa A
Outer membrane primer B / iniciador membrana externa B
Outer membrane protein / proteína de membrana externa
Open reading frame / secção aberta de leitura
Phosphate buffered saline / tampão fosfato salino
Cilindro protoplasmático
Reação da polimerase em cadeia
Peptideoglicano
Quantidade suficiente para
Rotações por minuto
Espectinomicina
Resistência à espectinomicina
Sódio dodecil sulfato
Sphingomyelinase / esfingomielinase
Sphingomyelinase 2 / esfingomielinase 2
Síndrome Pulmonar Hemorrágica Severa
Spirochaetal lipoproteins / lipoproteínas de espiroquetas
iniciador espectinomicina 1 a
iniciador espectinomicina 1 b
Tris NaCl EDTA protease inhibitor buffer / tampão Tris NaCl EDTA
TNFU
x
inibidor de protease
Tumor necrosis factor
Unidade
Vezes
/ fator de necrose tumoral
xvii
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1. Isolamento da cepa mutante loa22- a partir de sangue, rins e fígado
coletados de cobaios infectados com a cepa mutante loa22-. As amostras
foram cultivadas em meio de cultura líquido EMJH sob agitação.....................52
Tabela 2. Leptospira spp. usadas no estudo e suas capacidades de formar
biofilme em crescimento estático em meio líquido EMJH. As cepas foram
cultivadas em tubos de vidro por dois meses a 30°C. Aqui estão apresentados
os resultados de três experimentos independentes..........................................53
Figura 1. Mapa físico do vetor plasmidial contendo o sítio de restrição Sal I,
usado para gerar a cepa complementada loa22- / loa22+..................................54
Figura 2. Genótipos das cepas 1 (L. interrogans serovar Lai selvagem), 2
(mutante loa22-), 3 (complementada loa22-/+ TK1) e 4 (complementada loa22-/+
TK2) em PCR específico para o gene loa22.....................................................55
Figura 3. Southern-blot utilizando sondas específicas para a espectinomicina
(SpcR) e canamicina (KmR). Linhas: 1, cepa L. interrogans Lai selvagem; 2,
cepa mutante loa22-; 3, cepa complementada loa22- / loa22+...........................56
Figura 4. Curvas de crescimento das cepas selvagem e mutantes avaliadas
em meio de cultura líquido EMJH sob agitação, a partir de uma solução inicial
bacteriana de 104/ mL. Teste realizado em triplicata.........................................57
Figura 5. ELISA com antígenos bacterianos totais das cepas selvagem (Lai
wt), mutante (loa22-) e complementadas (loa22-/+ TK1 e loa22-/+ TK2) e
anticorpos anti-Loa22........................................................................................58
Figura 6. Western-blot de proteínas totais com anticorpos específicos para
Loa22. Linhas 1: proteína Loa22 recombinante (controle), 2: marcador de peso
molecular, 3: cepa L. interrogans Lai selvagem, 4: cepa mutante loa22-, 5: cepa
complementada loa22- / loa22+ TK2...................................................................59
Figura 7. Sequência de nucleotídeos de Loa22 (acima) e de aminoácidos
(abaixo), onde estão representadas a região N-terminal com resíduos
carregados positivamente (MVKK), a região H (ILNLILLGAIAF)
ILNLILLGAIAF e a lipobox
(SFTLC), além da sequência putativa de associação ao peptidoglicano
(NIFYSELRANAVKQAL)...................................................................................60
Figura 8. Imunofluorescência das cepas L. interrogans Lai selvagem (Lai wt) e
mutante loa22- com anticorpos anti-Loa22, LipL31 (lipoproteína de membrana
xviii
interna, não exposta na superfície bacteriana) e LipL32 (lipoproteína de
membrana externa, exposta na superfície bacteriana). F: fluoresceína, Alexa
para Loa22 e Isotiocianato de fluoresceína para LipL31 e LipL32. D: DAPI,
usado para documentar a presença de leptospiras...........................................61
Figura 9. Western-blot das frações protéicas da cepa L. interrogans serovar Lai
selvagem após extração com triton X-114. T: antígenos totais; PC: cilindro
protoplasmático; D: fração detergente; A: fração aquosa. Linhas, 1: marcador
de peso molecular; 2 a 5: anticorpos anti-LipL31, LipL32, LipL41 e GroEL
(proteínas controle); 6 a 9: anticorpos anti-Loa22.............................................62
Figura 10. Curvas de sobrevivência de cobaios. No experimento 1, três grupos
de 14 cobaios foram infectados com 2 x 108 bactérias de L. interrogans serovar
Lai cepa selvagem (Wt), mutante (loa22-) e complementada (loa22- / loa22+). No
experimento 2, grupos de 8 cobaios foram infectados com 4 x 10 8 bactérias de
cada cepa testada.........................................................................................63
Figura 11. Curvas de sobrevivência de hamsters. No experimento 3, três
grupos de 10 hamsters foram infectados com 108 bactérias de L. interrogans
serovar Lai cepa selvagem (Wt), mutante (loa22-) e complementada (loa22- /
loa22+). No experimento 4, grupos de 10 hamsters foram infectados com 5 x
107 bactérias de cada cepa testada. .................................................................64
Figura 12. A: cobaio infectado com a cepa selvagem L. interrogans serovar Lai
apresentando icterícia cutânea e conjuntival. B: aspecto macroscópico dos
tecidos subcutâneos (coluna esquerda) e pulmões (coluna direita) de cobaios,
seis dias após a infecção. Observa-se icterícia subcutânea e hemorragias
subcutânea e pulmonar nos animais infectados com as cepas selvagem (Wt) e
complementada (loa22-/+) e ausência de alterações patológicas para os animais
infectados com a cepa mutante loa22- (loa22-)..................................................65
Figura 13. Histopatologia dos tecidos de cobaios infectados com as cepas L.
interrogans serovar Lai (Wt), mutante (loa22-), complementada loa22-/+ TK2, ou
meio de cultura EMJH (controle). Linhas 1 e 4: hematoxilina eosina, 200 x; 2 e
5: Wartin-Starry, 1.000 x (as setas indicam as leptospiras); linhas 3 e 6:
imunohistoquímica com anticorpos anti LipL32, 200 x (leptospiras visualizadas
em vermelho). Linhas 1, 2 e 3: secções renais; linhas 4, 5 e 6: seções de
fígado.................................................................................................................66
xix
Figura 14. Expressão in vivo da proteína Loa22 em secção de fígado de cobaio
infectado com a cepa selvagem L. interrogans serovar Lai (acima) e em rim de
cobaio infectado com a cepa complementada loa22- / loa22+ (abaixo).
Imunohistoquímica com anticorpos específicos para Loa22, magnificação de
1.000 x...............................................................................................................67
Figura 15. Biofilmes formados por Leptospira. A: L. interrogans serovar Lai
cultivado em tubo de vidro contendo 10 mL de meio EMJH a 30°C por 10 dias
em repouso (um mililitro de cultura foi retirado para fazer a foto). B: Coloração
por cristal violeta de biofilme formado por L. biflexa serovar Patoc em placa de
poliestireno com dois dias de incubação...........................................................68
Figura 16. Formação de biofilme por L. biflexa em lâminas de vidro em
microscopia óptica de contraste de fase (200 x). A: bactérias isoladas aderidas
à superfície de vidro com 1 h de incubação. B: com 24 h, agregados celulares
formam uma rede aderida à superfície na interface ar-líquido. C: em 48 h,
observa-se a formação de microcolônias em organização estelar, formando um
biofilme denso na interface ar-líquido e rico em material amorfo. D: ainda em 48
h, abaixo da interface ar-líquido, L. biflexa forma um biofilme menos denso. E: a
partir de 72 h, observa-se diminuição da densidade do biofilme e áreas
ausentes de células ou matriz na interface ar-líquido, como evidenciado nesta
imagem do biofilme com 96 h de incubação. F: o biofilme em película de L.
biflexa apresenta alta densidade celular e de matriz com quatro dias de
incubação...........................................................................................................69
Figura 17. Microscopia eletrônica de varredura do biofilme de L. biflexa aderido
à superfície de vidro com 48 h de incubação (A, B e C) ou tipo película, com
quatro dias (D). Observa-se uma rede complexa de leptospiras formando
microcolônias (A, ponta de seta). As células estão densamente agregadas de
forma aleatória e embebidas em uma matriz extracelular (C e D, setas)..........70
Figura 18. Microscopia eletrônica de varredura de L. interrogans formando
biofilme em superfície de vidro. Com oito dias de incubação as células estão
firmemente aderidas à superfície, formando microcolônias (A) cobertas e
embebidas em uma densa camada de material extracelular ou matriz (B, C e
D). Em D, a área quadrada de B é mostrada em maior magnificação..............71
Figura 19. Morfologia dos biofilmes de L. biflexa e L. interrogans em superfície
de vidro. A: Crio-microscopia de varredura de criofratura do biofilme de L.
xx
biflexa após crescimento por 48 h (barra de escala: 10 µm). B e C: Microscopia
eletrônica de transmissão de biofilme de L. interrogans com oito dias (barras de
escala: B, 10 m e C: 2 m)..............................................................................72
Figura 20. Quantificação da produção de biofilme em placas de poliestireno por
coloração com cristal violeta. Os biofilmes formados pelos mutantes de L.
biflexa alg1, alg2 e flaB foram comparados com o biofilme formado pela cepa
selvagem e controle com meio de cultura EMJH. O biofilme produzido foi
medido quantitativamente em espectrofotômetro em A600nm. As barras de erro
são desvios-padrão derivados de dois experimentos em duplicata..................73
Figura 21. Curvas de crescimento das cepas selvagem L. biflexa (wt) e
mutantes flaB, alg1 e alg2 em meio de cultura líquido EMJH sob agitação, a
partir de uma solução inicial de 105 bactérias / mL. Teste realizado em
triplicata..............................................................................................................74
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos gerais
A leptospirose é uma doença infecto-contagiosa que acomete os animais
domésticos, silvestres e o homem, sendo classificada como uma importante
zoonose (LEVETT, 2001). A doença é causada por diferentes espécies do
gênero Leptospira e é responsável por quadros clínicos graves em humanos e
animais, bem como por importantes perdas econômicas na pecuária (RAMOS,
SOUZA & LILENBAUM, 2006; McBRIDE et al., 2005). Embora a leptospirose
seja amplamente distribuída e ocorra de forma endêmica em várias partes do
globo, como na América do Sul e no Sudeste Asiático (KO et al., 1999, LARAS
et al., 2002), os conhecimentos acerca da biologia e patologia das leptospiras
ainda são limitados (PICARDEAU et al., 2008).
O ano de 2007 marcou os cem anos da descoberta das leptospiras. Em
1907, Stimson observou pela primeira vez esta bactéria em cortes histológicos
de rins corados pela prata de um paciente com diagnóstico de febre amarela.
As leptospiras formavam agregados nos rins e individualmente apresentavam
forma de ponto de interrogação, sendo por isso denominadas como
Spirochaeta interrogans (FAINE et al., 2000). Vinte e um anos antes, em 1886,
o médico alemão Adolf Weil descrevia pela primeira vez a leptospirose, como
uma doença infecciosa que causa esplenomegalia, nefrite e icterícia ; e assim
a forma grave da doença em humanos foi denominada Doença de Weil (FAINE
et al., 2000). O primeiro isolamento de leptospiras patogênicas foi feito por
Inada e colaboradores, em 1916, no Japão, em meio de cultura de Noguchi.
Estes pesquisadores realizaram estudos clássicos de infecção experimental,
comprovando os Postulados de Koch, e proteção passiva em cobaios,
distribuição da bactéria nos tecidos, características morfológicas das
leptospiras, bem como do papel do rato como reservatório (FAINE et al., 2000).
A leptospirose é historicamente uma doença ocupacional. Na China, foi
denominada icterícia dos plantadores de arroz . Em outras partes do mundo,
como Austrália e Europa, esta foi denominada doença dos cortadores de
cana , doença dos criadores de suínos e doença dos trabalhadores de
esgotos . No Japão a doença era conhecida como febre outonal. Há relatos de
2
leptospirose na França e Alemanha durante a Primeira Grande Guerra. Nos
anos 1930-40, diversas formas clínicas da leptospirose foram observadas.
Outras leptospiras, além da Icterohaemorrhagiae que causava icterícia e
nefrite, tais como Canicola, Pomona e Grippothyphosa, foram descobertas.
Nesta época evidenciou-se também a importância da doença nos animais
domésticos (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001).
Leptospiras (do grego leptós, fino, pequeno, delicado e speira, espira)
são bactérias helicoidais de 6 a 20 µm de comprimento e 0,1 µm de diâmetro,
com um ou ambos os terminais em forma de gancho. Mesmo possuindo
estrutura celular semelhante a das bactérias Gram-negativas, como a presença
de membrana externa, as leptospiras possuem características singulares de
parede, tais como o peptidoglicano ligado à membrana citoplasmática (HAAKE,
2000). Estas espiroquetas não se coram pelos métodos usuais de coloração,
sendo visualizadas em microscopia de campo escuro, em microscópio óptico
de campo claro a contraste de fase ou em preparações impregnadas pela
prata. São microrganismos extremamente móveis por possuírem dois
endoflagelos polares, um em cada terminal, localizados no periplasma
bacteriano. Realizam movimentos de rotação ao longo do seu eixo e de
translação, movendo-se rapidamente em linha reta ou arcos. São aeróbios e
crescem em condições ótimas de temperatura de 28 a 30ºC e pH 7,2 a 7,6. De
difícil cultivo, as leptospiras necessitam meios especiais, enriquecidos com
albumina bovina, soro de coelho, vitaminas B1 e B12. A sua principal fonte de
energia são os ácidos graxos de cadeia longa, sendo a amônia e o ferro
nutrientes essenciais. O meio de cultura mais utilizado para o seu cultivo é o
meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (ELLINGHAUSEN &
McCULLOUGH, 1965; JOHNSON & HARRIS, 1967), que contém ácido oléico,
soro albumina bovina como detoxificante e tween 80 como fonte de carbono.
As leptospiras possuem tempo de geração longo, variando de três horas para
espécies saprófitas a 8-18 horas para espécies patogênicas, e o crescimento
em meio de cultura pode variar de dois a 30 dias (FAINE et al., 2000).
As leptospiras são bastante sensíveis ao ressecamento, desinfetantes,
extremos de temperatura e pH inferior a 6,8 ou superior a 8,0 (FAINE et al.,
2000). No entanto, sobrevivem na água e em cultura por longos períodos
(TRUEBA et al., 2004), bem como em solos, lama, coleções de água doce e
3
rios (HENRY & JOHNSON, 1978). As espécies saprófitas sobrevivem e se
multiplicam na água e solo, sendo ubiquitárias (PICARDEAU et al., 2008). Já
as patogênicas são os agentes da leptospirose e podem sobreviver no
ambiente, mas preferencialmente encontram-se no hospedeiro, onde se
multiplicam (FAINE et al., 2000).
As leptospiras pertencem à Ordem Spirochaetales, a qual faz parte de
um filo bacteriano único, Spirochaetes, que reagrupa os agentes infecciosos de
outras importantes doenças como o Treponema pallidum, que causa a sífilis, e
a Borrelia burgdorferi, que causa a doença de Lyme. A família Leptospiraceae
compreende o gênero Leptospira, o qual é composto por bactérias saprófitas e
patogênicas. A taxonomia e a classificação das leptospiras são bastante
complexas e vêm sofrendo diversas alterações ao longo dos últimos anos. Até
1989 o gênero Leptospira era classificado de acordo com a sorologia, baseada
na variabilidade dos lipopolissacarídios de parede, e o fenótipo bacteriano,
sendo dividido em dois grandes grupos, Leptospira biflexa sensu lato, contendo
as espécies saprófitas isoladas do ambiente aquático e Leptospira interrogans
sensu lato, contendo as cepas patogênicas (BHARTI et al., 2003). A
diferenciação fenotípica entre os dois grupos pode ser realizada através da
capacidade das saprófitas crescerem a 13ºC, crescerem na presença de 8azaguanina a 225 mg / L e formarem células esféricas na presença de NaCl a
1M (JOHNSON & ROGERS, 1964; JOHNSON & HARRIS, 1967; WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2003). A classificação sorológica permitiu identificar
diversos serovares, de acordo com a aglutinação sorológica (FAINE et al.,
2000). Os serovares relacionados antigenicamente foram agrupados em
sorogrupos, os quais não fazem parte da taxonomia, mas são extremamente
úteis para a compreensão da epidemiologia e diagnóstico da doença. Existem
mais de 250 serovares agrupados em 24 sorogrupos (LEVETT, 2001).
A classificação fenotípica vem sendo substituída pela genotípica,
baseada em hibridização DNA-DNA, a qual agrupou as leptospiras em diversas
espécies genômicas, que correspondem a grupos de cepas com similaridades
no DNA. Até o momento, foram identificadas 14 espécies denominadas e
quatro genomospécies não denominadas, com cepas contendo 70% ou mais
de relação DNA-DNA (YASUDA et al., 1987; PEROLAT ET AL., 1998;
BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2005; MATTHIAS et al., 2008). As
4
leptospiras patogênicas compreendem Leptospira alexanderi, Leptospira
borgpetersenii, L. interrogans, Leptospira kirschneri, Leptospira noguchii,
Leptospira santarosai, Leptospira weilii e Leptospira genomospecies 1. O grupo
das leptospiras intermediárias compreende Leptospira broomii, Leptospira
fainei, Leptospira inadai e a recentemente descoberta Leptospira licerasiae
(MATTHIAS et al., 2008); e o das saprófitas compreende L. biflexa, Leptospira
meyeri, Leptospira genomospecies 3, Leptospira genomospecies 4, Leptospira
genomospecies 5 e Leptospira wolbachii (BRENNER et al., 1999; LEVETT et
al., 2005; MATTHIAS et al., 2008). O maior problema da classificação
genotípica é a dicotomia em relação à classificação sorológica, pois um mesmo
serovar pode representar mais de uma espécie genômica, como é o caso do
serovar Hardjo, que faz parte das espécies L. interrogans, L. borgpetersenii ou
L. meyeri (BRENNER et al., 1999). Sendo assim, a classificação sorológica
ainda é aceita na microbiologia clínica e epidemiologia (BHARTI et al., 2003).
A epidemiologia da leptospirose é bastante complexa. Trata-se de uma
doença que acomete humanos e animais, tem distribuição mundial em áreas
urbanas e rurais e tem sua ocorrência ligada a fatores ambientais e climáticos.
A forma grave da doença acomete mais de 500.000 humanos por ano no
mundo, constituindo um importante problema de saúde pública (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 1999). A leptospirose ocorre principalmente em
países tropicais e subtropicais e possui caráter endêmico nas Américas do Sul
e Central, Índia e Sudeste Asiático (KURIAKOSE, EAPEN & PAUL, 1997; KO
et al., 1999, LARAS et al., 2002, JOHNSON et al., 2004; DIAS et al., 2007).
Nestes países, diante da grande população vivendo em condições de pobreza,
sem acesso a saneamento básico e infra-estrutura, com cerca de um bilhão de
pessoas vivendo em comunidades como as favelas, há um maior risco para o
surgimento de doenças como a leptospirose (KO et al., 1999; RILEY et al.,
2007). Fatores climáticos, entre eles o calor e o índice pluviométrico, são
responsáveis pelas epidemias de leptospirose observadas nas estações
chuvosas e após fortes inundações (KO et al. 1999). Em epidemias, o número
de casos pode chegar a 100 / 100.000 habitantes, ou 0,1% da população
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2007). No Brasil, a leptospirose humana é
uma doença de notificação compulsória, muito embora apenas 3.000 casos da
5
doença, um número provavelmente subestimado, sejam declarados por ano
(TASSINARI et al., 2004).
Os roedores são os reservatórios principais de leptospiras, sendo o rato
de esgoto ou Rattus norvegicus fundamental para a transmissão da doença no
meio urbano (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003). No Brasil o Rattus
norvegicus é o reservatório de L. interrogans serovar Copenhageni, o serovar
responsável pelas epidemias urbanas da doença (KO et al., 1999). Existe uma
grande diversidade de reservatórios ou hospedeiros de manutenção de
leptospiras, compreendendo animais silvestres e domésticos, como caninos,
bovinos, suínos, caprinos e ovinos. Cada serovar tende a ser mantido por um
hospedeiro animal específico, sendo então este serovar considerado adaptado
à determinada espécie animal. As associações de reservatórios e serovares
mais conhecidas são: cães e serovar Canicola, bovinos e serovar Hardjo,
suínos e serovar Pomona, roedores e serovar Icterohaemorrhagiae ou serovar
Copenhageni ou serovar Lai. A taxa de infecção em ratos varia segundo os
autores de 10% (JOHNSON et al., 2004) a 33% (LILENBAUM et al., 1993).
ELLIS, O'BRIEN & CASSELLS (1981) isolaram o serovar Hardjo dos rins de 57
vacas em um total de 200 examinadas, caracterizando os bovinos como os
hospedeiros de manutenção do serovar Hardjo.
Os reservatórios animais são cronicamente infectados nos rins pelos
diferentes serovares de Leptospira (LEVETT, 2001). Desta forma, a
transmissão da leptospirose ocorre através da eliminação de leptospiras na
urina ou secreções destes animais, contaminando coleções de água e solo,
sendo a água o principal veículo de transmissão da doença (McBRIDE et al.,
2005). Acredita-se que as leptospiras sejam eliminadas em altas concentrações
na urina de ratos, visto que foi demonstrado que ratos experimentalmente
infectados eliminaram 107 bactérias / mL de urina (NALLY et al., 2005). O
estado de portador renal dos hospedeiros de manutenção é então um elemento
chave na transmissão da leptospirose. As leptospiras naturalmente tendem a
formar agregados na água, o que pode estar relacionado à sua manutenção no
meio ambiente (TRUEBA et al., 2004). As vias de transmissão clássicas da
leptospirose são através do contato com a pele lesada e mucosa. O
conhecimento dos serovares e seus hospedeiros de manutenção são
essenciais para a compreensão da epidemiologia da doença em uma dada
6
região (LEVETT, 2001). O homem é sempre um hospedeiro incidental no ciclo
da leptospirose, sendo sensível à doença (FAINE et al., 2000).
A
enfermidade
nos
animais
domésticos
apresenta
diversas
manifestações clínicas, dependendo da espécie animal, do serovar infectante e
do ambiente envolvidos. Serovares adaptados tendem a causar doença crônica
e por vezes subclínica nos hospedeiros de manutenção; enquanto que
serovares não adaptados causam doença aguda e grave. Os animais de
criação, como suínos, bovinos, caprinos e ovinos, desenvolvem problemas
reprodutivos, como abortamento, infertilidade, natimortalidade e aumento do
intervalo entre cios; o que causa importantes perdas econômicas (LILENBAUM
& SOUZA, 2003; RAMOS, SOUZA & LILENBAUM, 2006). Pode haver uma
queda importante da produção de leite uma vez que a infecção é introduzida
em um rebanho, caracterizando a milk drop syndrome (PEARSON, MACKIE &
ELLIS, 1980). Os casos agudos em bovinos e suínos são mais raros,
acometendo
principalmente
animais
jovens,
sendo
caracterizados
por
prostração, febre, anemia e icterícia (FAINE et al., 2000).
Os
eqüinos
são
comumente
infectados
pelos
sorogrupos
Grippothyphosa e Australis (HARTSKEERL et al., 2004) e apresentam
igualmente distúrbios reprodutivos (LÉON et al., 2006), que podem ser
acompanhados de uveíte recorrente. A uveíte é causada pela presença de
leptospiras ou anticorpos específicos nas câmaras oculares, e pode evoluir
para a cegueira. Os eqüinos acometidos tornam-se muito sensíveis à luz,
desenvolvendo síndrome conhecida como cegueira noturna ou moon blindness
(BLOOD & RADOSTITS, 1991).
Os cães quando infectados com o serogrupo Icterohaemorrhagiae
desenvolvem hepatonefrite aguda, num quando clínico grave semelhante à
Doença de Weil humana, onde apresentam febre, vômitos, prostração,
hemorragias oculares, melena, icterícia, e podem ir a óbito. A infecção pelo
serovar Canicola pode provocar doença aguda clássica denominada Doença
de Stuttgart, levando ao vômito e choque cardiovascular, ou nefrite crônica,
onde os cães tornam-se portadores e reservatórios deste serovar (FAINE et al.,
2000).
As leptospiroses animais apresentam caráter endêmico no Rio de
Janeiro, onde diversos inquéritos sorológicos foram realizados, demonstrando
7
soroprevalência de 66% em cães e suínos (LILENBAUM et al., 2002b; RAMOS,
SOUZA & LILENBAUM, 2006); 46,9% em bovinos (LILENBAUM & SOUZA,
2003); e 11% em caprinos (LILENBAUM et al., 2007a). LILENBAUM et al.
(2007b) isolaram leptospiras pertencentes ao sorogrupo Grippothyphosa de
caprinos pertencentes a rebanhos com histórico de infertilidade.
Assim como os animais domésticos, os animais silvestres, de vida livre
ou criados em cativeiro são portadores de diversos serovares de leptospiras.
No Brasil já foram encontrados anticorpos para os serovares Tarassovi, Wolffi e
Bataviae em gambás (LINS & LOPES, 1984); Javanica, Ballum, Tarassovi e
Grippothyphosa em cobras (SANTA ROSA et al., 1980), Bataviae, Castellonis e
Grippothyphosa em roedores (LINS & LOPES, 1984). A doença foi
diagnosticada em felinos do zoológico do Rio de Janeiro, sendo encontrados
anticorpos para o serovar Pomona (LILENBAUM et al., 2004). No mesmo
zoológico, um tamanduá com sintomas clássicos da doença exibiu forte reação
imunológica para o serovar Icterohaemorrhagiae (MONTEIRO, FEDULLO &
ALBUQUERQUE, 2001) e outros mamíferos exibiram reações positivas para os
serovares Copenhageni, Pomona e Icterohaemorrhagiae (LILENBAUM et al.,
2002a).
A leptospirose humana possui um espectro de apresentações clínicas
muito diversas. Formas benignas da doença tendem a ter cura espontânea,
enquanto formas agudas e graves podem levar ao óbito. Os sintomas iniciais
da doença humana são em geral inespecíficos e semelhantes aos da gripe,
como febre, dores de cabeça e dores musculares. A leptospirose grave ou
Doença de Weil é uma febre hemorrágica de alta letalidade, de 5 a 25%. Além
de hemorragias, a leptospirose grave é caracterizada por insuficiência renal e
hepática, sendo icterícia, febre e dores musculares os principais sintomas (KO
et al., 1999; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1999; YANG, WU & PAN,
2001). São cada vez mais relatados os casos de doença grave com
acometimento pulmonar, caracterizando a Síndrome Pulmonar Hemorrágica
Severa (SPHS), a qual pode atingir altíssimas taxas de letalidade, de mais de
50% (RIOS-GONÇALVES et al., 1992; TREVEJO et al., 1998; SEGURA et al.,
2005; GOUVEIA et al., 2008). No Brasil, as formas graves da leptospirose
urbana são causadas por leptospiras do sorogrupo Icterohaemorrhagiae, sendo
L. interrogans Copenhageni o serovar de maior importância (KO et al., 1999).
8
A leptospirose humana esporádica ocorre em caso de atividades
ocupacionais de risco (lixeiros, veterinários, agricultores, magarefes, militares,
pessoal de laboratório) ou em contato com água contaminada em rios e lagos
(PERRA et al., 2001; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003; MEITES et al.,
2004). Desta forma, casos isolados ou surtos epidêmicos de leptospirose
podem ocorrer também em países de clima temperado (LEVETT, 2001).
Importantes epidemias foram relatadas na Nicarágua (TREVEJO et al., 1998),
Índia (JENA, MOHANTI & DEVADASAN, 2004) e Brasil (KO et al., 1999).
Outras epidemias associadas à prática de atividades aquáticas de lazer na
Costa Rica (CENTER FOR DISEASES CONTROL, 1997), ou esportivas, no
Eco Challenge na Malásia (SEJVAR et al., 2003), e em um triatlon em Illinois
(MORGAN et al., 2002), foram relatadas.
O diagnóstico de referência da leptospirose é o teste de aglutinação
microscópica (microscopic agglutination test ou MAT), no qual o soro suspeito é
testado com uma bateria de antígenos bacterianos representativos dos
serovares presentes em cada região. Os anticorpos anti-leptospiras aglutinam
às bactérias, possibilitando a visualização destes aglutinados em microscópio
de campo escuro (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003). O teste é
considerado específico e sensível na fase imune da doença, permitindo a
titulação sorológica e a identificação do serogrupo ou do serovar infectante,
sendo uma importante ferramenta clínico-epidemiológica. O teste possui,
porém, baixa sensibilidade na fase inicial da doença (CRODA et al., 2007), bem
como em casos crônicos, onde os títulos de anticorpos podem ser muito baixos
(ELLIS, O'BRIEN & CASSELLS, 1981). A MAT é uma técnica de difícil
execução e é realizada apenas em laboratórios especializados. Para a MAT, é
necessário o uso de bactérias e a interpretação é subjetiva, sendo necessárias
amostras pareadas para a confirmação do aumento do título de anticorpos e
diagnóstico da doença (LEVETT, 2001). O diagnóstico definitivo da
leptospirose, em uma segunda etapa, pode ser feito por cultura a partir de
amostras clínicas como sangue, líquido cefalorraquidiano (LCR), urina e
tecidos. A cultura de leptospiras é difícil e pouco sensível. É fastidiosa,
podendo necessitar até 16 semanas de incubação, utiliza meios de cultivo
enriquecidos, como o EMJH, e frequentemente ocorre contaminação (BHARTI
et al., 2003). A reação da polimerase em cadeia (PCR) também pode ser usada
9
para a confirmação diagnóstica em amostras clínicas, através da amplificação
de genes conservados em leptospiras patogênicas (BRANGER et al., 2005a,
MERIEN et al., 2005). O desenvolvimento de um novo método diagnóstico para
a leptospirose, que seja simples e capaz de identificar as fases iniciais da
doença, é uma necessidade real e deve ser encarado como uma prioridade na
pesquisa em leptospiras (CRODA et al., 2007).
O controle da leptospirose é um tanto complicado e depende da região
específica de ocorrência da doença. Baseia-se principalmente em saneamento
básico, higiene e controle de roedores. O tratamento da leptospirose é
realizado com penicilina G, doxiciclina e ampicilina (YANG, WU & PAN, 2001;
BHARTI et al., 2003). Em caso de animais de criação é utilizada a
dihidroestreptomicina
(GERRITSEN
et
al.,
1994),
embora
ELLIS,
MONTGOMERY & CASSELLS (1985) tenham demonstrado a manutenção de
leptospiras no útero de vacas experimentalmente infectadas por 83 dias após
duas aplicações deste antibiótico.
As vacinas anti-leptospíricas existentes são compostas de uma
suspensão bacteriana morta do (s) serovar (es) prevalente (s) na região e
possuem alguns importantes inconvenientes, como aparecimento de efeitos
colaterais, proteção de curta duração, necessitando revacinação repetida para
manter a imunidade, e proteção incompleta contra outros serovares não
presentes na formulação. Não há um completo entendimento sobre o
mecanismo de imunidade protetora das vacinas. O lipopolissacarídeo parece
conferir uma parte da imunidade humoral protetora (FAINE et al., 2000;
LEVETT, 2001), havendo também a participação da resposta celular (NAIMAN
et al., 2001). A vacinação em humanos é feita apenas em alguns países como
França, Cuba e Japão, restrita a pessoas expostas a atividades ocupacionais
de risco. A vacinação em medicina veterinária é usada de rotina para cães,
inclusive no Brasil, sendo considerada importante para a prevenção da forma
grave da doença; assim como em rebanhos em áreas endêmicas. Acredita-se,
no entanto, que a vacina não é capaz de prevenir a leptospirúria (BOLIN &
ALT, 2001), assim como não é capaz de proteger em casos de grande
exposição à bactéria (ANDRÉ-FONTAINE et al., 2003). Ainda, a vacinação em
animais deve ser feita uma ou até duas vezes por ano (FAINE et al., 2000). Um
dos desafios da pesquisa atual em leptospirose é identificar frações ou
10
subunidades bacterianas conservadas, que confiram imunidade protetora de
longa duração e imunidade cruzada contra diversos serovares de leptospiras
(BHARTI et al., 2003; BRANGER et al., 2005b; SILVA et al., 2007).
1.2. Genética e patogenia de leptospiras
Durante os últimos anos, evidenciou-se um extraordinário progresso no
estudo da biologia molecular de espiroquetas do gênero Leptospira (BULACH
et al., 2000; VIJAYACHARI et al., 2004; MERIEN et al., 2005), porém, o
conhecimento da genética deste intrigante e importante grupo de bactérias
ainda é incipiente se comparado ao de outras espécies bacterianas. Os
avanços no conhecimento da biologia das leptospiras são dificultados pela
ausência de ferramentas genéticas adequadas e eficientes para o seu estudo
(ARTIUSHIN et al., 2004; LOUVEL, SAINT GIRONS & PICARDEAU, 2005).
O sequenciamento genético completo de três cepas patogênicas de
Leptospira (REN et al., 2003; NASCIMENTO et al., 2004; BULACH et al., 2006)
e de uma saprófita, L. biflexa (PICARDEAU et al., 2008), trouxe novas
perspectivas para o estudo de leptospiras. O genoma de L. interrogans serovar
Lai, uma leptospira que é altamente invasiva e causa doença grave, consiste
de dois cromossomos circulares, um grande de 4,33 Mb e um pequeno de 0,35
Mb. O seu genoma possui conteúdo G-C médio de 36% e aproximadamente
4.700 sequências abertas de leitura ou open reading frames (ORFs), dentre as
quais mais de 50% não exibem similaridades com proteínas de função
conhecida ou proteínas de outros organismos (REN et al., 2003). BOURHY et
al. (2007) descreveram a presença de uma região fágica de 54 kb com
características de ilha de patogenicidade que pode se excisar do genoma de L.
interrogans serovar Lai, formando um plasmídio circular. Já L. borgpetersenii
Hardjo, que infecta bovinos, possui uma perda genômica de 700 kb em relação
a L. interrogans, o que hipoteticamente pode tornar este microrganismo menos
adaptado à vida fora do hospedeiro (BULACH et al., 2006). O genoma de L.
biflexa possui 3,9 Mb e um plasmídio circular (PICARDEAU et al., 2008). A
genômica comparada de membros patogênicos e saprófitas de Leptospira
deverá revelar conhecimentos fundamentais sobre a virulência e biologia
destas espiroquetas.
11
O sequenciamento dos genomas de leptospiras também contribuiu para
estudos de transcrição global ou microarrays. Estes estudos demonstraram
haver diferenças na expressão de genes de quimiotaxia, motilidade e proteínas
de membrana externa, entre outros, quando temperaturas de cultivo ambientais
e fisiológicas foram comparadas (LO et al., 2006; QIN et al., 2006). A análise
transcricional também foi utilizada para a triagem de genes que codificam para
proteínas de membrana externa, as quais podem ser candidatas ao
desenvolvimento de novas vacinas (YANG et al., 2006b). Estudo recente
revelou que a osmolaridade fisiológica teve importância na regulação de vários
genes, inclusive de fatores de virulência em potencial como ligB, sph2 e lfhA
(lenA) (MATSUNAGA et al., 2007).
Apesar do conhecimento dos genomas de leptospiras ter gerado uma
base para o esclarecimento da patogenia da leptospirose, a identificação de
fatores de virulência de leptospiras ainda permanece especulativa, pois apenas
estudos in vitro e in silico foram realizados até o momento (LEE et al., 2000;
ARTIUSHIN et al., 2004; NALLY et al., 2007). O insucesso em manipular
geneticamente bactérias do gênero Leptospira e a falta de ferramentas
genéticas para as espécies patogênicas impossibilitaram a realização de
estudos que comprovem os postulados moleculares de Koch para genes de
virulência (FALKOW, 1988); e as pesquisas na área não elucidaram o papel de
determinantes putativos de virulência (PICARDEAU, BRENOT & SAINT
GIRONS, 2001; BOURHY et al., 2005).
O primeiro passo rumo à manipulação genética de leptospiras ocorreu
com o isolamento dos fagos LE de leptospiras não patogênicas aquáticas dos
esgotos de Paris (SAINT GIRONS et al., 1990). A análise dos fagos LE revelou
que estes infectam apenas leptospiras saprófitas, não se replicando em cepas
patogênicas. Um grande avanço na manipulação genética de leptospiras
ocorreu dez anos depois, com o desenvolvimento de um plasmídio replicativo
E. coli-L. biflexa, contendo a origem de replicação do profago LE1, sendo o
primeiro relato de transferência genética em L. biflexa (SAINT GIRONS et al.,
2000).
PICARDEAU, BRENOT & SAINT GIRONS (2001) realizaram a
recombinação homóloga pela primeira vez em L. biflexa, gerando o mutante
flaB deficiente para a síntese de flagelina e endoflagelo. Utilizando a mesma
12
técnica, foram descritos mutantes para os genes recA, trpE, metY, metX e
metW (TCHAMEDEU KAMENI et al., 2002; BAUBY, SAINT GIRONS &
PICARDEAU, 2003; PICARDEAU, BAUBY & SAINT GIRONS, 2003).
RUBIN et al. (1999) demonstraram que transposons de eucariotos da
família mariner realizam transposição com baixa especificidade em uma ampla
gama de bactérias. O elemento transposável Himar1 é um elemento móvel da
família dos transposons mariner isolado da mosca do chifre Haematobia
irritans (LAMPE, CHURCHILL & ROBERTSON, 1996). Himar1 possui algumas
características que o tornaram um bom candidato para a inserção aleatória em
L. biflexa e L. interrogans (BOURHY et al., 2005; LOUVEL, SAINT GIRONS &
PICARDEAU, 2005): não precisa de fatores associados ao hospedeiro
(LAMPE, CHURCHILL & ROBERTSON, 1996), realiza transposição tanto em
eucariotos quanto procariotos e, com a exceção do dinucleotídio TA, não tem
requerimentos específicos para a sua inserção (HAYES, 2003). Um sistema de
mutagênese aleatória foi desenvolvido em L. biflexa, possibilitando a criação de
uma biblioteca de mutantes e a pesquisa de genes de metabolismo em
leptospiras saprófitas (LOUVEL, SAINT GIRONS & PICARDEAU, 2005). Neste
sistema, um plasmídio suicida (CHIANG & RUBIN, 2002) carreia o transposon
Himar1, o qual se insere de maneira aleatória no genoma bacteriano,
interrompendo um gene. Esta ferramenta foi usada para caracterizar sistemas
para a aquisição de ferro em leptospiras (LOUVEL, SAINT GIRONS &
PICARDEAU, 2005).
A primeira transferência genética em uma espécie patogênica de
Leptospira foi realizada por transposição aleatória de Himar1 em L. interrogans
serovar Lai (BOURHY et al., 2005). Se comparada com a bactéria saprófita, a
eficiência de transformação em L. interrogans é baixa (100 colônias / µg DNA
plasmidial para L. interrogans versus 5.000 colônias / µg DNA plasmidial para
L. biflexa). A baixa eficiência de transformação em leptospiras patogênicas
pode ocorrer devido à competência celular e mecanismos de recombinação e /
ou restrição do DNA que diferem entre leptospiras saprófitas e patogênicas
(BOURHY et al., 2005). Recentemente PICARDEAU (2008) realizou a
transferência genética em leptospiras por conjugação, sendo o primeiro relato
de conjugação em espiroquetas. Usando uma cepa doadora de E. coli e
13
plasmídio que tem uma ampla gama de hospedeiros, transferiu Himar1 para L.
biflexa e L. interrogans (PICARDEAU, 2008).
A dinâmica da patogenia da leptospirose é complexa e multifatorial. A
motilidade e morfologia das leptospiras favorecem a sua penetração através da
pele lesada e mucosas. Após a infecção segue-se uma rápida disseminação da
bactéria na corrente sanguínea do hospedeiro, ocorrendo multiplicação ou
leptospiremia com duração média de 3 a 10 dias. Este período compreende a
primeira fase da doença, dita não imune, onde se manifesta uma
sintomatologia branda e inespecífica. Após esta fase, ocorre o desenvolvimento
de anticorpos específicos pelo sistema imune e as leptospiras irão se localizar
nos órgãos alvo, como rins, fígado, pulmões e musculatura esquelética,
provocando a sintomatologia clássica. O lúmen dos túbulos renais, área do
organismo onde os anticorpos estão em níveis baixos, parece ser o local
preferencial da colonização por leptospiras. Uma vez a infecção instalada, pode
haver a evolução para uma doença aguda em hospedeiros sensíveis, bem
como
o
desenvolvimento
de
imunidade
protetora
e
eliminação
do
microrganismo, ou desenvolvimento do estado de portador crônico (FAINE et
al., 2000). Em ratos, hospedeiros resistentes à infecção, as leptospiras
disseminam-se por todos os tecidos durante a primeira semana de infecção,
sendo apenas encontradas nos rins após este período. Este fato sugere que as
leptospiras encontrem nos rins um escape do sistema imune (ATHANAZIO et
al., 2008).
Os rins colonizados por leptospiras apresentam nefrite túbulo-intersticial,
com a presença de focos inflamatórios, necrose tubular e hemorragias. As
leptospiras são encontradas em grande número nos túbulos contorcidos
proximais, glomérulos e interstício (BARNETT et al., 1999; NALLY et al., 2004;
YANG et al., 2006a). O quadro de insuficiência renal provoca azotemia,
aumento de creatinina, oligúria ou anúria, alterações do sedimento urinário,
proteinúria, glicosúria, natriurese e caliurese (KO et al., 1999; DAHER,
OLIVEIRA NETO & RAMIREZ, 2002; NALLY et al., 2004; ANDRADE et al.,
2007).
A presença de leptospiras no fígado leva a um dano hepatocelular,
provocando lesões hepáticas típicas tais como perda da arquitetura tecidual,
focos de necrose hepatocitária, focos de inflamação, presença de células de
14
Kupffer aumentadas e eventualmente presença de células apoptóticas
(MERIEN et al., 1998; NALLY et al., 2004, YANG et al., 2006a). As leptospiras
localizam-se em sinusóides e canalículos biliares, levando à colestase e
provocando um aumento de bilirrubina sérica, contribuindo para o quadro de
icterícia (DA SILVA et al., 2002). Observa-se aumento das transaminases
hepáticas, gama glutamil transferase e fosfatase alcalina (DA SILVA et al.,
2002; PEREIRA et al., 2005).
O dano pulmonar principal na leptospirose ocorre devido às intensas
hemorragias intra-alveolares (NALLY et al., 2004; PEREIRA et al., 2005; YANG
et al., 2006a), levando à insuficiência respiratória (GOUVEIA et al., 2008).
Raras leptospiras são visualizadas nos pulmões (NALLY et al., 2004; YANG et
al., 2006a), sugerindo outro mecanismo de patogenia que não a ação direta do
microrganismo. A presença de depósitos em membranas alveolares de cobaios
sugere um processo auto-imune como etiologia da hemorragia pulmonar
observada na leptospirose (NALLY et al., 2004).
A lesão tecidual primordial da leptospirose parece ser a lesão endotelial,
levando às hemorragias nos tecidos (LEVETT, 2001). As hemorragias são uma
importante complicação da leptospirose e contribuem para a letalidade da
doença (DAHER, OLIVEIRA NETO & RAMIREZ, 2002; WAGENAAR et al.,
2007). Hemolisinas putativas podem estar implicadas na lesão endotelial, como
Hap1 (hemolysis-associated protein 1) ou LipL32 (lipoprotein of Leptospira with
32kDa) (LEE et al., 2000; HAAKE et al., 2000), Sph (sphingomyelinase) (LEE
et al., 2002) e Sph2 (ARTIUSHIN et al., 2004). A hemólise apresenta vantagens
para a bactéria, disponibilizando ferro e ácidos graxos que são essenciais para
o seu crescimento. A fonte de ferro mais abundante no hospedeiro é o heme e
leptospiras são capazes de usar heme e hemoglobina in vitro (LOUVEL et al.,
2006). Hemorragias, anemia hemolítica, hemoglobinemia, hemoglobinúria e
icterícia são achados decorrentes da hemólise e lesão endotelial (DAHER,
OLIVEIRA NETO & RAMIREZ, 2002; WAGENAAR et al., 2007). A
trombocitopenia é comumente observada nas formas graves da leptospirose,
podendo ocorrer em decorrência de hemorragias, citotoxicidade e agregação
plaquetária (NICODEMO et al., 1989; YANG et al., 2006a; WAGENAAR et al.,
2007). A ocorrência de coagulação intravascular disseminada (CID) permanece
15
controversa na patogenia da leptospirose (NALLY et al., 2004, YANG et al.,
2006a, WAGENAAR et al., 2007).
Embora os mecanismos de virulência em leptospiras ainda sejam
obscuros, acredita-se que o envelope bacteriano possua macromoléculas
fundamentais para a interação bactéria-hospedeiro, entre elas proteínas,
lipoproteínas e lipopolissacarídeo (LPS) (CULLEN et al., 2005). As várias
etapas da patogenia da leptospirose, incluindo a adesão, a invasão, a
sobrevivência no sangue, no interstício ou no interior de células, a agressão e o
escape do sistema imune, ainda são pouco conhecidas. BAROCCHI et al.
(2002) demonstraram que leptospiras são capazes de realizar translocação
rápida em células renais, sem alterações de citoesqueleto, propondo que este
seja um mecanismo usado para a rápida evasão do sistema imune e
disseminação pelos tecidos. Leptospiras foram visualizadas em fagossomos de
células infectadas, mesmo havendo a fusão do fago-lisossomo (LIU et al.,
2007).
As leptospiras podem ser encontradas em íntima relação com as
membranas celulares (BAROCCHI et al., 2002; NALLY et al., 2004), sugerindo
que possuam mecanismos específicos de adesão. Algumas proteínas putativas
de adesão foram descritas, incluindo uma proteína ligadora de fibronectina
(MERIEN et al., 2000), as Ligs (immunoglobulin like proteins) (MATSUNAGA et
al., 2003) e as Lens (leptospiral endostatin proteins), as quais aderem a vários
componentes da matriz extracelular (BARBOSA et al., 2006; STEVENSON et
al., 2007).
A lesão tecidual na leptospirose é caracterizada por dano celular, que
pode estar acompanhado ou não da presença de leptospiras, levando à
hipótese de existirem importantes fatores tóxicos envolvidos na patogenia
(NICODEMO et al., 1989). O LPS da membrana externa é responsável pela
especificidade e variabilidade de serovares, assim como pela atividade
endotóxica. No entanto, o LPS de leptospiras é diferenciado: é menos tóxico
que o de bactérias Gram negativas e ativa macrófagos através de receptores
Toll do tipo 2 (WERTS et al., 2001). Glicoproteínas (GLP) são toxinas
possivelmente envolvidas na leptospirose (ALVES et al., 1992; DIAMENT et al.,
2002). A proteína Sph é citotóxica e hemolítica, formando poros em células de
mamíferos (LEE et al., 2002).
16
O peptideoglicano (PG) ou muropeptídeo bacteriano tem funções
essenciais na célula, como proteção da lise osmótica e morfologia. Como
resultado da divisão celular, fragmentos pequenos de muropeptídeo podem ser
liberados, constituindo um fator de virulência devido ao seu efeito tóxico e
imuno-estimulador (BONECA, 2005). Embora pouco estudado, o PG de
leptospiras estimula a liberação de TNF- , estimula a fagocitose por leucócitos
e a mitogênese de linfócitos (CINCO et al., 1993; CINCO et al., 1996).
Lipoproteínas são componentes fundamentais das membranas de
eubactérias. Suas funções são variadas na célula, desde funções estruturais a
adesinas, transportadores, enzimas ou toxinas, podendo ter um importante
papel em interações com o hospedeiro e virulência (CULLEN, HAAKE &
ADLER, 2004). Segundo o algoritmo SpLip, específico para a análise de
sequências de lipoproteínas de leptospiras, o genoma de L. interrogans
apresenta 4,6% de genes que codificam lipoproteínas (SETÚBAL et al., 2006).
Algumas lipoproteínas foram descritas em leptospiras, como LipL21, LipL32,
LipL36, LipL41, LiL46 e Ligs (HAAKE et al., 1998; HAAKE et al., 2000, CULLEN
et al., 2003; CULLEN et al., 2005; MATSUNAGA et al., 2003; MATSUNAGA et
al., 2006).
A resposta imune inata e adquirida contra leptospiras parece ser
estimulada por componentes da membrana externa, como LPS, proteínas e
lipoproteínas (FAINE et al., 2000). A resposta humoral é específica para o
serovar infectante e anticorpos específicos opsonizam leptospiras, as quais são
fagocitadas por macrófagos (MÉRIEN, BARANTON & PEROLAT, 1997;
LEVETT, 2001). WANG et al. (1984) observaram resistência à fagocitose por
neutrófilos. LPS e LipL32 ativam macrófagos através de interação com os
receptores Toll do tipo 2 (WERTS et al., 2001), com a produção de interferon
gama (KLIMPEL, MATTHIAS & VINETZ 2003). Proteínas do tipo Omp (outer
membrane protein) e glicoproteínas também estão envolvidas no estímulo da
resposta celular (YANG, WU & PAN, 2001; DIAMENT et al., 2002).
Grande parte dos conhecimentos de patogenia em leptospirose é
baseada em estudos utilizando modelos animais experimentais, como cobaios,
hamsters e camundongos knock-outs para genes da imunidade inata (MILLER,
ALLEN & WILSON, 1974; DA SILVA et al., 1995; NALLY et al., 2004; NALLY et
al., 2005; VIRIYAKOSOL et al., 2006). Muitas diferenças são encontradas
17
quanto à sensibilidade destes animais em relação à infecção, o que explica a
heterogeneidade de protocolos e doses infectantes usadas. Cobaios e
hamsters jovens infectados com leptospiras do sorogrupo Icterohaemorrhagiae
apresentam leptospirose aguda que mimetiza a doença grave, com a presença
de icterícia e hemorragias (MILLER, ALLEN & WILSON, 1974; DA SILVA et al.,
1995; NALLY et al., 2004; NALLY et al., 2005).
Recentemente, ratos Wistar foram usados como modelo de leptospirose
crônica, possibilitando reproduzir as relações parasito-hospedeiro que ocorrem
em uma espécie reservatório natural e resistente à doença (DE FARIA et al.,
2007; ATHANAZIO et al., 2008). No modelo proposto, a colonização renal por
leptospiras do sorogrupo Icterohaemorrhagiae ocorreu entre os dias sete e
nove pós-infecção, sem, no entanto, provocar alterações histopatológicas. A
lesão mais proeminente observada em ratos cronicamente infectados foi a
nefrite intersticial. No mesmo estudo, ratos selvagens capturados em área
urbana endêmica para a leptospirose apresentaram nefrite intersticial crônica
em 55% dos casos, embora estes incluíssem animais com cultura positiva e
negativa de leptospiras, sugerindo um importante background de alterações
patológicas nestes animais (DE FARIA et al., 2007). Animais resistentes, como
os ratos, apresentam dose de colonização renal em 50% dos casos de 104
leptospiras; enquanto que animais sensíveis, como os hamsters, têm uma DL50
de menos de 50 leptospiras, usando a mesma cepa infectante (ATHANAZIO et
al., 2008).
1.3. Leptospira spp. no contexto dos biofilmes bacterianos
O paradigma tradicional de bactérias vivendo em vida livre ou
planctônica tem sido revisto. Os procariotos são cada vez mais encontrados em
biofilmes, os quais podem ser definidos como comunidades de microrganismos
aderidos a uma superfície, associados a uma matriz extracelular produzida por
estes microrganismos. Esta forma de vida bacteriana parece ser parte
integrante do ciclo celular e da ecologia de muitos procariotos e representa
uma forma protegida de crescimento, permitindo às bactérias sobreviverem em
ambientes hostis (HALL-STOODLEY, COSTERTON & STOODLEY, 2004). Nos
biofilmes, os microrganismos podem tornar-se mais resistentes a antibióticos
18
(DRENKARD & AUSUBEL, 2002; LEE et al., 2007) e estão protegidos do
sistema imune (FUX et al., 2005). A formação do biofilme começa com a
adesão de bactérias planctônicas a uma superfície, seja ela biótica (tecidos
animais e vegetais) ou abiótica (plástico, vidro, metal, mineral). As células
aderidas produzem então uma matriz extracelular, que consiste principalmente
de exopolissacarídios (SUTHERLAND, 2001), e se multiplicam, formando
microcolônias aderidas à superfície e cobertas pela matriz. A partir desta
microcolônia um biofilme maduro pode se desenvolver. No estágio final da
formação do biofilme, as células podem se desprender do biofilme e retornarem
à forma de vida planctônica ou morrerem (HALL-STOODLEY, COSTERTON &
STOODLEY, 2004).
Os biofilmes na natureza podem ser formados por uma única espécie
microbiana (OGGIONI et al., 2006) ou podem ser polimicrobianos (DOWD et
al., 2008). São encontrados em uma variedade de ecossistemas: industrial
(PENEAU, CHASSAING & CARPENTIER, 2007), aquático (ISLAM et al., 2007)
e em hospedeiros durante infecções, como nos casos clássicos de
Pseudomonas aeruginosa colonizando os pulmões de pacientes com fibrose
cística (LAM et al., 1980; PIER et al., 2004) e Yersinia pestis colonizando o
intestino de pulgas vetores da peste (JARRETT et al., 2004). Dentre a ordem
Spirochaetales, apenas Treponema, um gênero filogeneticamente distante das
leptospiras, participa da formação de biofilmes dentais ou placas dentárias
(PASTER et al., 2001), e forma biofilmes in vitro (VESEY & KURAMITSU,
2004). Embora SINGH et al. (2003a) tenham demonstrado a presença de
Leptospira spp. em unidades de tratamento dental por sequenciamento de
rDNA 16S, a formação de biofilmes por este gênero bacteriano não foi
demonstrada até o presente.
A leptospirose é transmitida pela eliminação de leptospiras na urina de
animais reservatórios, contaminando o ambiente (McBRIDE et al., 2005). As
leptospiras saprófitas e patogênicas tendem naturalmente a formar agregados
em coleções de água (TRUEBA et al., 2004; GANOZA et al., 2006).
Experimentos com ratos Wistar cronicamente infectados por L. interrogans
demonstraram que as leptospiras formam densos agregados nos túbulos
contorcidos proximais dos rins destes animais. Estes agregados formam-se a
19
partir de sete a nove dias pós-infecção e persistem ao longo do tempo,
indicando colonização renal estabelecida nos ratos (ATHANAZIO et al., 2008).
Os avanços em transferência genética em Leptospira anteriormente
citados (BOURHY et al., 2005; LOUVEL, SAINT GIRONS & PICARDEAU,
2005) possibilitaram que se apliquem hoje estratégias genéticas para a
identificação de determinantes de virulência em leptospiras. A identificação de
fatores de virulência contribuirá para uma melhor compreensão da patogênese
da leptospirose, assim como para o desenvolvimento de novas estratégias
vacinais, de diagnóstico ou tratamento da doença. A formação de agregados
por leptospiras (TRUEBA et al., 2004; GANOZA et al., 2006; ATHANAZIO et
al., 2008), assim como a capacidade de persistir no meio ambiente (TRUEBA
et al., 2004), são argumentos fortes para a realização deste estudo de
caracterização de biofilmes em leptospiras.
20
2. OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram:
- Caracterizar a deleção e a complementação do gene loa22 em L. interrogans
serovar Lai
- Caracterizar a formação de biofilmes in vitro em Leptospira spp.
21
3. MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi realizado sob orientação da Profa. Leila de Souza
Fonseca, IMPPG-UFRJ e do Prof. Walter Lilenbaum, Instituto Biomédico, UFF.
Foi realizado doutorado sanduíche na Unidade de Biologia de Espiroquetas do
Instituto Pasteur, Paris, sob a orientação do Prof. Mathieu Picardeau, no
período de setembro de 2005 a julho de 2007. A infecção experimental em
hamsters e a imunofluorescência foram realizadas em colaboração com Albert
Icksang Ko, no Laboratório de Patologia e Biologia Molecular do Centro de
Pesquisas Gonçalo Moniz, CPqGM, FIOCRUZ, Salvador. A histologia e
imunohistoquímica foram realizadas em colaboração com Michel Huerre, na
Unidade de Pesquisa e Expertise em Histotecnologia e Patologia do Instituto
Pasteur, Paris. Os ensaios de microscopia eletrônica foram realizados em
colaboração com Marie-Christine Prévost na Plataforma de Microscopia
Eletrônica do Instituto Pasteur, Paris.
3.1. PROJETO 1: ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM L. interrogans
3.1.1. Condições de cultivo
L. interrogans serovar Lai cepa Lai 56601 (doação do National Institute
for Communicable Disease Control and Prevention, ICDC China CDC) e outras
cepas de Leptospira foram cultivadas a 30°C em meio de cultura líquido EMJH
(Johnson e Harris, 1967; Ellinghausen e McCullough, 1965) sob agitação, ou
em EMJH sólido com 1% de agar. Cepas de alta passagem (AP) referem-se
àquelas sub-cultivadas em meio líquido EMJH por mais de dez vezes. Cepas
de baixa passagem (BP) são aquelas sub-cultivadas em meio líquido EMJH por
menos de dez vezes e inoculadas periodicamente em cobaios ou hamsters
para a manutenção da virulência. Escherichia coli foi cultivada em meio de
cultura Luria-Bertani (LB) sob agitação a 37°C. Quando necessário os
antibióticos espectinomicina (Spc) ou canamicina (Km) (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, Estados Unidos) foram adicionados ao meio de cultura na
concentração de 50 µg / mL.
22
O cultivo de cepas isoladas de animais experimentais foi realizado em
meio de cultura líquido EMJH sob agitação a 30°C. Para a coleta de sangue
realizou-se a anestesia do animal com uma mistura de 50 µL de quetamina
(Rhône Mérieux, Toulouse, França) e 50 µL de xilazina (Bayer, Puteaux,
França) por via intramuscular. Aproximadamente 0,5 a 1 mL de sangue foram
coletados por punção intra-cardíaca e 0,5 mL foram imediatamente inoculados
em tubo de 10 mL de EMJH (tubo primário) em câmara de fluxo laminar. Para o
cultivo a partir dos tecidos, os animais foram eutanasiados com CO 2. Em
câmara de fluxo laminar, a necropsia foi realizada utilizando-se instrumentos
estéreis e foram coletados aproximadamente 1 g de órgãos como fígado, rins,
baço e pulmão. Os tecidos foram colocados individualmente em placas de Petri
estéreis, triturados com bisturis estéreis e aproximadamente 1 g inoculado em
10 mL de EMJH (tubo primário). Os tubos primários foram homogeneizados
vigorosamente e deixados em repouso por 20 min. Em seguida, foram
realizadas três diluições sucessivas de 1 mL a partir do tubo primário. Os tubos
foram observados por inspeção visual (observação de turbidez) e ao
microscópio de campo escuro nos dias um, quatro e semanalmente para o
crescimento de leptospiras.
3.1.2. Construção das cepas mutantes
Foi realizada mutagênese aleatória por inserção do transposon mariner
Himar 1 em L. interrogans serovar Lai cepa Lai 56601 BP utilizando-se o
plasmídio pMSL (BOURHY et al, 2005). O plasmídio pMSL contém a
transposase hiperativa C9 (LAMPE, CHURCHILL & ROBERTSON, 1996)
ligada a um promotor forte de espiroquetas flgB de B. burgdorferi (STEWART
et al., 2004). Os terminais repetidos invertidos do transposon Himar 1
flanqueam o cassete de resistência à espectinomicina (SpcR) (BAUBY, SAINT
GIRONS & PICARDEAU, 2003). Este plasmídio é derivado do plasmídio
pSC189 (CHIANG & RUBIN, 2002), não é replicativo em Leptospira spp.,
possui 6,63 Kb e contém a origem de replicação do plasmídio pGEM-7Zf+
(Promega Corporation, Madison, WI, Estados Unidos).
A
transformação
por
transposição
aleatória
foi
realizada
por
eletroporação. Uma cultura de 40 mL de L. interrogans serovar Lai cepa Lai
23
56601 BP foi crescida até a fase exponencial, centrifugada a 4.000 rpm por 20
min, lavada uma vez com água estéril e concentrada para ter aproximadamente
1011 bactérias / mL. As células competentes foram então acrescidas de 100 a
500 ng do plasmídio, a mistura foi transferida para cubetas de eletroporação de
0,2 cm de diâmetro e eletroporada a 1.8-kV, 200- , pulso elétrico de 25 µF em
eletroporador Gene Pulser (BioRad Laboratories, Richmond, CA, Estados
Unidos). Rapidamente após a eletroporação, a mistura foi transferida para tubo
tipo Falcon contendo 1 mL de EMJH e incubada por 24 h a 30°C. A cultura foi
então repicada para EMJH sólido contendo espectinomicina e incubada a 30°C
por
quatro
a
seis
semanas.
Colônias
transformantes
resistentes
a
espectinomicina foram repicadas para EMJH líquido e o seu DNA foi extraído.
Foi realizada a LM-PCR para a amplificação do sítio de inserção do transposon
e posterior sequenciamento (descritos no ítem 4.1.2.2. a seguir).
Com base no sequenciamento do sítio de inserção do transposon foi
possível localizar os genes interrompidos no genoma de L. interrogans serovar
Lai utilizando os programas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) e MaGe (Magnifying Genomes
https://www.genoscope.cns.fr/agc/mage/). Dentre os 15 clones mutantes
gerados por eletroporação, sete foram enviados para sequenciamento. Dentre
estes clones, apenas um apresentou inserção do transposon em um possível
gene de interesse, o LA0222, também chamado de loa22, o qual foi
selecionado para posterior caracterização. A cepa mutante gerada foi
denominada cepa loa22-.
Para a complementação, o gene selvagem loa22 da cepa selvagem L.
interrogans serovar Lai cepa Lai 56601 BP foi amplificado por PCR usando os
iniciadores OM A (5 -AGTCGACGGTTTTGGTGGGATGGATAG-3 ) e OM B
(5 -AGTCGACAGACGTTGAGTTGCCACAGC-3 ),
desenhados
com
o
Programa DNA Strider (Commissariat à L Énergie Atomique, Saclay, França).
Estes iniciadores se localizam na região promotora e 100 pb após o códon de
parada, respectivamente, permitindo a amplificação de todo o gene, e contém
os sítios de restrição para a enzima Sal I, destacados acima em negrito. Para a
amplificação por PCR foi feita uma mistura de reação contendo: 5 µL de
tampão 10 x (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Inglaterra), MgCl2 25 mM,
dNTPs 100 µM, 2 µL de DNA; 2,5 U de Taq polimerase (Amersham), 50 pmol
24
de cada iniciador e H20 q.s.p. para 50 µL. Realizou-se um ciclo de
desnaturação a 95°C / 5 min, seguido de 35 ciclos de amplificação consistindo
de desnaturação a 95°C / 20 s, anelamento a 55°C / 20 s e extensão a 72°C /
1min30s, seguidos de extensão final a 72°C por 10 min. Utilizou-se marcador
de peso molecular de 200 a 10.000 pb (Eurogentec, Angers, França). Os
produtos da PCR, com aproximadamente 1,5 Kb, foram visualizados sob luz
ultra-violeta em gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio (Eurobio,
Paris, França).
O produto amplificado de loa22 (5 µL) foi digerido com 20 U da enzima
Sal I (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 2 µL de
tampão de digestão (Invitrogen) e H2O q.s.p para 20 µL, durante 2 h a 37°C, e
purificado usando-se o kit QIAquick PCR Purification (Qiagen GmbH, Hilden,
Alemanha). Em seguida, este produto foi clonado no sítio de restrição Sal I do
plasmídio pCR2.1 (Invitrogen). Para isso, 5 µL do plasmídio foram digeridos
com Sal I (como descrito acima) e foi feita a ligação do plasmídio ao produto
amplificado por uma noite em temperatura ambiente, contendo 3 µL do produto
amplificado; 1 µL do plasmídio; 400 U de ligase (New Englad Biolabs, Hitchin,
Hertfordshire, Inglaterra); 1,5 µL de tampão de ligação (New England Biolabs) e
H2O q.s.p para 15 µL. Foi realizada a transformação de 100 µL de E. coli
competentes com 5 µL da ligação através de choque térmico (15 min no gelo,
40 s a 42°C, 2 min no gelo), com incubação em LB Spc / Km. O plasmídio foi
purificado utilizando-se o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen), novamente
digerido por Sal I e o gene loa22 foi clonado no sítio de restrição Sal I do
plasmídio pSHT, contendo o transposon Himar 1 e cassete de resistência à
canamicina (KmR) (Figura 1). O plasmídio pSHT foi digerido por Sal I e ligado
ao produto amplificado como descrito acima, gerando o plasmídio pSHTLoa22.
Foi realizada a transformação de 100 µL de E. coli XL-10 ultracompetentes
(Stratagene, Amsterdam, Holanda) com 15 µL da ligação como descrito acima.
Uma cultura de 40 mL da cepa mutante loa22- foi eletroporada por
pSHTLoa22 seguindo o mesmo protocolo descrito anteriormente neste ítem.
Colônias transformantes resistentes à canamicina foram repicadas para meio
líquido EMJH e o seu DNA extraído. O local do sítio de inserção aleatória do
transposon
Himar
1
foi
identificado
por
LM-PCR
conforme
descrito
anteriormente neste item. Dois clones transformantes foram selecionados,
25
cepas loa22- / loa22+ denominadas TK1 e TK2. TK1 exibiu sítio de inserção do
transposon na posição 1.079.614 (entre os genes LA1074 and LA1075) e TK2
na posição 84.051 (no gene LA0071), ambos no cromossoma grande (CI) de L.
interrogans.
3.1.2.1. Extração de DNA
Uma cultura de leptospiras de 10 mL foi centrifugada a 4.000 rpm por 15
min e lavada em tampão Tris-EDTA (Tris 10 mM pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1
mM) a 14.000 rpm por 5 min. O sedimento foi ressuspendido em 250 µL de
tampão sucrose (sucrose 25%, Tris 25%) e adicionado de 25 µL de EDTA 0,5
M. As células foram colocadas no gelo por 5 min e adicionadas de 5 µL de
solução de proteinase K a 20 mg / mL (Sigma-Aldrich) e 40 µL de SDS 10%
(Prolabo, Paris, França). A mistura foi então incubada a 56°C por uma hora.
Em capela química, adicionou-se 300 µL de fenol (Prolabo) e 300 µL de
clorofórmio (Prolabo) e centrifugou-se a 15.000 x g por 5 min a 4°C. A fase
superior foi recuperada e adicionou-se 400 µL de clorofórmio, centrifugando-se
novamente. A fase superior foi recuperada e adicionou-se 50 µL de NaOAc 3 M
e 1,25 mL de etanol. O DNA foi precipitado a -20°C por 20 minutos e a solução
centrifugada a 15000 x g por 15 min a 4°C. O sedimento foi lavado em 1 mL de
etanol e o sedimento seco por 30 min. O DNA foi ressuspendido em Tris-EDTA
e dialisado por 30 min em membrana de 0,22 µm (Millipore, Molsheim, França).
3.1.2.2. Ligation Mediated PCR (LM-PCR)
O sítio de inserção do transposon foi identificado através da amplificação
por LM-PCR das regiões flanqueadoras do transposon. Realizou-se a digestão
de 12,5 µL de DNA dos clones de Leptospira em 1,5 µL de tampão NeB4 10x
(New England Biolabs) e 1 µL de enzima EcoR I, incubando-se a 37°C por 2h.
A ligação ao adaptador EcoR I foi realizada adicionando-se 10 µL de DNA
digerido a 1 µL do adaptador EcoR I (5'-AATTGCTCGTGC-3'), 400 U de ligase
(New England Biolabs) e 2 µL de tampão de ligação (New England Biolabs) e
H2O q.s.p. para 20 µL. A PCR foi realizada utilizando-se 2,5 U de Taq
polimerase AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados
26
Unidos) e 100 µM de cada iniciador. Os seguintes pares de iniciadores foram
usados:
LKgD
5'-TAGAGTATTCCTCAAGGCACGAGC-3'),
(5'-TTTATAATCACCGTCATGGTC-3')
ou
LKgD
e
e
LMR
LMR
1
2
(5'-GCGTCTAGGCGGCCGCGAAG-3'). O iniciador LKgD é específico para o
adaptador e os iniciadores LMR1 e LMR2 são direcionados upstream e
downstream do transposon, respectivamente. Foram adicionados à mistura de
PCR: 5 µL de tampão 10x, MgCl2 25mM, dNTPs 100 µM, 2 µL de DNA e H20
q.s.p. para 50 µL. A amplificação realizou-se com um ciclo de desnaturação a
94°C / 5 min, seguido de 35 ciclos de amplificação consistindo de desnaturação
a 94°C / 30 s, anelamento a 51°C / 30 s e extensão a 72°C / 2 min, seguidos de
extensão final de 10 min a 72°C. Os produtos da PCR foram visualizados em
gel de agarose 1% sob luz UV, purificados (kit QIAquick Gel Extraction,
Qiagen) e seqüenciados utilizando-se o iniciador LKgD na Genome Express
(Meylan, França).
3.1.3. Confirmação dos genótipos
A confirmação dos genótipos foi feita através de PCR utilizando os
iniciadores
S1
a
(5 -TTGTTGTGGTGCGGAAGTCG-3 )
e
S1
b
(5 -GGTCCCGAACAAGCAGAAGG-3 ), localizados nas regiões de loa22 que
flanqueiam o transposon. A mistura de reação e o ciclo de PCR estão descritos
acima no item 4.1.2..
3.1.4. Southern Blot
O Southern blot foi usado para verificar a presença dos cassetes de
resistência Spc e Km nas cepas testadas. O DNA das cepas selvagem L.
interrogans serovar Lai cepa Lai 56601, mutante loa22- e complementada
loa22- / loa22+ TK2 foi extraído como descrito no item 4.1.2.1. acima e 10 µg
foram digeridos com 30 U de enzima de restrição EcoR I em volume total de 30
µL, a 37°C por uma noite. Foram adicionados 5 µL de tampão de corrida de
eletroforese às amostras. A eletroforese foi realizada em gel agarose a 0,8%
contendo solução de brometo de etídio (Eurobio), utilizando marcador de peso
molecular de 200 a 10.000 pb (Eurogentec). O gel foi submerso em 2 L de
27
tampão 1 x TBE com 0.5 µg / mL de brometo de etídio. A eletroforese foi
realizada a 40 Volts, 35 mA por uma noite. Realizou-se a depurinação em 500
mL de solução HCl 0,2 M por 10 min. Para a desnaturação, o gel foi submerso
em 500 mL de solução de 1.5 M NaCl / 0.5 N NaOH por duas vezes de 15 min.
A neutralização foi feita em tampão Tris 1 M, NaCl 1.5 M; pH 7,5.
Para a transferência, a membrana de Nylon (Hybond N+, Amersham) foi
submersa em água e montada em sistema de transferência junto com o gel. A
transferência foi feita sob vácuo em tampão de transferência 20 x SSC (NaCl 3
M; citrato de sódio 0,3 M; pH 7,0) a 50 mbar por uma hora. A membrana foi
lavada em tampão 5 x SSC por 5 min e em seguida o DNA foi fixo por
tratamento em luz UV. A membrana foi seca em temperatura ambiente. Para a
pré-hibridização, a membrana foi embebida em 20 mL de tampão de préhibridização (Rapid-Hyb, Amersham) e incubada em forno de hibridização
(Hybaid, Franklin, MA, Estados Unidos) a 60°C por 1-2 h. As sondas usadas
consistiram dos produtos de amplificação específicos para os cassetes de
resistência
à
Spc
ou
Km,
(5 -ATTTCCTATTAAGGTTGAAC-3 )
utilizando
os
e
iniciadores
Spc
Spc
1
2
(5 -ATTGAGAGAAGTTTCTATAG-3 ); Km 1 (5 -GTCGATACTATGTTATACGC3 ) e Km 2 (5 - TTAGATGTCTAAAAAGCTTG 3 ), respectivamente. As sondas
foram marcadas por radioatividade, usando 25-50 ng de cada sonda e
32
P (kit
MegaPrime, Amersham). Para a hibridização, as sondas foram adicionadas à
solução de pré-hibridização e as membranas foram incubadas por uma noite a
60°C em forno de hibridização. Realizaram-se duas lavagens de 15 min em
100 mL de 2 x SSC / 1% SDS a 60°C. Em seguida realizaram-se duas
lavagens de 15 min em 1 x SSC / 1% SDS e finalmente duas lavagens de 15
min em 100 ml de 0.1 x SSC / 1% SDS, ambas a 60°C. Para a detecção, a
membrana foi submetida à autoradiografia com filme de Raio-X (Kodak, Massy,
França) a -80°C por um dia.
28
3.1.5. Curvas de crescimento
As cepas L. interrogans serovar Lai selvagem, mutante loa22- e
complementada loa22- / loa22+ TK2 foram crescidas em EMJH sob agitação até
DO420nm de 0,4. A partir desta cultura primária realizou-se contagem das
bactérias em câmara de Petroff-Hausser (Hausser Scientific, Horsham, PA,
Estados Unidos) e diluição em 10 mL de EMJH contendo 104 bactérias / mL,
sendo este tubo usado para realizar a curva de crescimento. Durante 15 dias,
em períodos determinados de tempo, foi retirado 1 mL do tubo e feita a leitura
em espectrofotômetro a DO420nm (seis leituras). Foram realizadas três curvas de
crescimento.
3.1.6. Eletroforese e Western-blot
Para avaliar a expressão de Loa22 nas cepas do estudo, realizou-se
Western-blot com proteínas totais e anticorpos específicos anti-Loa22. As
proteínas totais foram extraídas conforme descrito no item 4.1.9. abaixo, até a
etapa em que o sedimento correspondendo às proteínas totais de 10 9 bactérias
é ressuspendido em tampão de corrida. As proteínas foram separadas por
SDS-PAGE uni-dimensional em gel de poliacrilamida a 12,5% (Acri / Bis 37.5:1
40%, BioRad) em tampão de eletroforese (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS
0.1%; pH 8,3; BioRad). A eletroforese foi realizada em voltagem constante de
120 V por aproximadamente 2 h utilizando padrão de peso molecular de 6 a
175 KDa (New England Biolabs). Os géis foram corados com Coomassie Azul
Brilhante (BioRad) (20 min no corante, seguidos de lavagens sucessivas de 2030 min em solução de descoloração), ou
transferidos para membrana de
nitrocelulose. A transferência foi realizada usando membrana de nitrocelulose
(Hybond ECL, Amersham) em tampão de transferência (Tris 24 mM, glicina 200
mM, 200 mL de etanol, 700 mL de H2O; pH 8,3) sob amperagem constante de
350 mA por 1h30min.
As membranas foram bloqueadas com PBS-leite (5% de leite desnatado,
pH 7,2) por uma hora em temperatura ambiente e incubadas por uma noite a
4°C com os anticorpos primários específicos anti-Loa22 (doados por Nobuo
Koizumi; Koizumi & Watanabe 2003) diluídos em tampão PBS-leite a 1:3.000.
29
As membranas foram lavadas cinco vezes em PBS-leite e incubadas por uma
hora com os anticorpos secundários de cabra anti-camundongo conjugados à
fosfatase alcalina e diluídos em PBS-leite a 1:5.000 (Promega). As membranas
foram lavadas por três vezes em PBS-leite e duas vezes em PBS (pH 7,2). A
revelação foi realizada com o kit NBT / BCIP (Nitroazul de tetrazolio / 5-bromo4-cloro-3-indolil fosfato, Promega).
3.1.7. Ensaio imunoenzimático (ELISA)
Realizou-se ELISA para avaliar a expressão de Loa22 nas cepas
testadas. Para o preparo dos antígenos bacterianos, L. interrogans e L. biflexa
(controle negativo) foram cultivadas em EMJH até DO420 de 0,4. A
concentração bacteriana foi então ajustada para 109 bactérias / mL em 20 mL
de EMJH e foram adicionados 40 µL de formaldeído a 37%. Os frascos foram
incubados por 2 h em temperatura ambiente e fervidos em banho-maria por 30
min. O pH foi ajustado a 9,6; as culturas centrifugadas a 8.000 x g por 20 min e
os sedimentos ressuspendidos em 10 mL de tampão bicarbonato 0,05 M. As
placas de poliestireno de 96 poços (Immulon, Dynatech Laboratories Inc.,
Chantilly, VA, Estados Unidos) foram adsorvidas por uma noite a 4°C com
50µL da solução de antígenos bacterianos totais por poço. As placas foram
lavadas com tampão PBS e os poços bloqueados com 50 µl de PBS-leite por
45 min a 37°C. Os poços foram então incubados por 45 min a 37°C com 50 µL
de soro anti-Loa22 diluído 1:800 em PBS-leite, lavados e incubados por 1 h a
37°C com 50 µL de anticorpos IgG de ovelha anti-camundongo conjugados à
peroxidase em diluição 1:2.500 (Promega). Após lavar os poços, 50 µL do
substrato
2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina
sulfonato
(ABTS)
(Roche
Diagnostics, Meylan, França) foi adicionado e as placas incubadas no escuro
em temperatura ambiente por 25 min. A absorbância foi medida em leitor de
ELISA (Labsystems Multiskan MS, Helsinki, Finlândia) a 405 nm.
3.1.8. Localização de Loa22 por Imunofluorescência
Suspensões bacterianas de 107 leptospiras foram ressuspendidas em 1
mL de tampão PBS e lavadas duas vezes com centrifugação a 3000 rpm por
30
10 min. O sedimento foi ressuspendido em 100 µL de PBS e 10 µL da
suspensão
foram
distribuídos
para
cada
poço
das
lâminas
de
imunofluorescência pré-tratadas com poli-L-lisina (Sigma-Aldrich). As lâminas
foram incubadas por 1 h em câmara úmida. Para a marcação de proteínas de
superfície de leptospiras, as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS
contendo 2% de albumina sérica bovina (BSA) e incubadas 1 h com anticorpo
específico para Loa22 diluído 1:100 em PBS-BSA. Controles foram realizados
com soro específico para as lipoproteínas LipL32 (localizada na membrana
externa), LipL41, LipL31 (localizada na membrana externa) e a proteína
citoplasmática GroEL. As lâminas foram lavadas com PBS-BSA e em seguida
tratadas com metanol frio para a fixação das leptospiras, seguido de incubação
por 10 min a -20°C. Para a marcação de proteínas totais realizou-se o
tratamento com metanol antes da incubação com o anticorpo específico, o que
permitiu a permeabilização da membrana bacteriana. As lâminas foram então
lavadas e incubadas por 1 h a 37°C com anticorpo IgG anti-camundongo
conjugado à Alexa (Molecular Probes, Eugene, Oregon, Estados Unidos) para
Loa22 e com anticorpo IgG anti-rato conjugado ao isotiocianato de fluoresceína
(Jackson Immuno Research Laboratories, Newmarket, Suffolk, Inglaterra) para
as outras proteínas. As lâminas foram lavadas duas vezes com PBS-BSA e
incubadas com 1 µg / mL de 4'-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Molecular
Probes) por 1 h em temperatura ambiente. Depois de lavadas, as lâminas
foram montadas utilizando solução anti-fading e visualizadas em microscópio
de fluorescência.
3.1.9. Fracionamento de proteínas por triton X-114
Para esta etapa foi realizado um protocolo adaptado de HAAKE et al.
(1991). Todas as etapas foram realizadas a 4°C ou em gelo, a não ser quando
especificado. Uma cultura fresca de leptospiras, contendo bactérias íntegras e
móveis, foi crescida em 40 mL de EMJH até DO420nm de aproximadamente 0,4.
Realizou-se a contagem bacteriana em câmara de Petroff-Hausser (Hausser
Scientific) e uma diluição bacteriana em 40 mL de EMJH para obter 108
bactérias / mL (número total de bactérias de aproximadamente 4 x 109). A
cultura foi centrifugada a 5.000 rpm por 20 min a 4 C e o sedimento
31
ressuspendido
em
tampão
PBS-MgCl2
5
mM
gelado.
Repetiu-se
a
centrifugação e o sedimento foi ressuspendido em 8 mL de PBS-MgCl2 5 mM
gelado. Este volume foi dividido em quatro tubos e estes centrifugados por
8.000 x g por 10 min a 4 C. Um dos sedimentos (correspondendo a proteínas
totais de 109 bactérias) foi ressuspendido em 100 µL de tampão de corrida de
proteínas [Tris-HCl 0,25 M pH 6,8; ditiotreitol 200 mM (Sigma-Aldrich); SDS
4%, glicerol 20% (Prolabo), azul de bromofenol 0,1 mM (BioRad)], sonicado
três vezes por 10s e guardado a 4°C até a utilização. Os outros sedimentos
foram ressuspendidos em 900 µL de tampão TNE-PI [NaCl 150 mM; Tris-Cl 10
mM pH 8,0; EDTA 2 mM; inibidor de proteases 0,25% (v / v) (Sigma-Aldrich)] e
100 µL de triton X-114 10% (Calbiochem, La Jolla, CA, Estados Unidos) gelado
e os tubos homogeneizados por 30 min a 4 C. Os tubos foram centrifugados a
10.000 x g por 10 min a 4 C, os sedimentos (correspondendo às frações de
cilindro protoplásmico ou PC) foram lavados uma vez com PBS- MgCl2 5mM
gelado (10.000 x g por 10 min a 4 C), ressuspendidos em 100 µL de tampão de
corrida e guardados a 4 C até a utilização. Os sobrenadantes foram
transferidos para novos tubos, adicionados de 20 µL de CaCl 2 1M e 100 l de
triton X-114 10% gelados e incubados 10 min a 37 C em banho-maria. Os
tubos foram centrifugados em temperatura ambiente a 5000 rpm por 10 min
para separar as frações detergentes (D) e aquosas (A), e as frações A foram
cuidadosamente transferidas para novos tubos. Para a lavagem das frações,
adicionou-se 200 µL de triton X-114 10% gelado nas frações A e 800 µL de
tampão TNE-PI gelado nas frações D. Os tubos foram incubados 10 min a 37 C
e centrifugados em temperatura ambiente a 5.000 rpm por 10 min. As frações A
foram transferidas para novos tubos e descartou-se a fase superior A das
frações D. As frações A e D foram precipitadas com acetona gelada,
adicionando-se um volume para as frações A e três volumes para as frações D.
Os tubos foram homogeneizados em vortex e em homogeneizador a 4 C por
uma noite. Os tubos foram centrifugados a 14.000 x g por 20 min a 4 C, os
sobrenadantes removidos, os sedimentos ressuspendidos em 100 µL de
tampão de corrida e guardados a 4°C até a utilização.
A eletroforese e western-blot foram realizados como descrito acima no
item 4.1.6.. Os anticorpos primários usados foram os anticorpos específicos
anti-Loa22 (como descrito no ítem 4.1.6.) e específicos para as proteínas
32
controle LipL32, LipL41, LipL31 e GroEL (doados por A. I. Ko) diluídos a
1:10.000. Como anticorpos secundários foram usados anticorpos de cabra anticamundongo (diluição 1: 5.000) e anti-rato (diluição 1: 2.500) conjugados à
fosfatase alcalina (Promega).
3.1.10. Infecção experimental em animais
Cobaios Hartley machos com duas a três semanas de idade (Charles
River Laboratories, L'Arbresle, França) e hamsters dourados sírios machos
com cinco a oito semanas de idade (CPqGM, FIOCRUZ, Salvador, Brasil)
foram mantidos em infectório, recebendo água e comida ad libitum. As injeções
foram realizadas por via intraperitoneal usando cepas de Leptospira de baixa
passagem diluídas em 1 mL de EMJH ou, no caso dos animais controle, 1 mL
de meio de cultura EMJH. Culturas de L. interrogans serovar Lai cepas
selvagem, mutante loa22- e complementada loa22-/+ foram crescidas em 40 mL
de EMJH. Quando atingiram DO420nm de aproximadamente 0,4; realizou-se a
contagem bacteriana em câmara de Petroff-Hausser (Hausser Scientific) e
padronizou-se o inóculo para 2 x 108 bactérias / mL e 4 x 108 bactérias / mL
para os cobaios (experimentos 1 e 2, respectivamente) e 108 bactérias / mL e 5
x 107 bactérias / mL para os hamsters (experimentos 3 e 4, respectivamente). A
DL50 de L. interrogans serovar Lai nos cobaios e hamsters utilizados foi de
aproximadamente 108 e 107 leptospiras, respectivamente. Os animais foram
monitorados diariamente para sinais clínicos característicos da leptospirose
como prostração, icterícia e morte. Os animais sobreviventes foram
sacrificados 21 dias após a infecção. Os protocolos de experimentação animal
foram aprovados pelos Comitês de Ética e Experimentação Animal do Instituto
Pasteur e da Fundação Oswaldo Cruz.
O teste exato de Fisher foi usado para determinar diferenças
significativas na mortalidade dentre os grupos inoculados com as cepas
selvagem versus mutante loa22- e selvagem versus complementada loa22- /
loa22+. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. Curvas de
sobrevivência foram construídas com o Programa GraphPad Prism 4 Software
systems (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, Estados Unidos).
33
3.1.11. Exame Anatomopatológico
Cobaios infectados com 2 x 108 bactérias / mL de L. interrogans serovar
Lai cepas selvagem, mutante loa22- e complementada loa22-/+ ou meio de
cultura EMJH foram usados para a histopatologia. Para os grupos infectados
com a cepa mutante loa22- e EMJH, três cobaios foram sacrificados nos dias 6
e 21 pós-infecção. Para os grupos infectados com as cepas selvagem e
complementada loa22-/+, os tecidos foram coletados no dia da morte (cinco a
seis dias pós-infecção). Foi realizada necropsia detalhada dos animais e os
tecidos foram coletados em formol tamponado a 10% e processados de acordo
com o processamento histopatológico de rotina. Cortes de 5 µm foram então
coradas com hematoxilina-eosina e impregnação pela prata de Wartin-Starry
(BANCROFT, COOK & TURNER, 1994). Para a imunohistoquímica, a parafina
foi removida dos cortes de tecido, os quais foram então tratados em tampão
citrato pH 6,0 a 98°C por uma hora. O bloqueio foi realizado com 1,5% de BSA
em temperatura ambiente por 20 min. Os tecidos foram então incubados com
anticorpos específicos para Loa22 (diluição 1:1.000), LipL32 (diluição 1:6.000)
ou soro pré-imune de camundongo (diluição 1:1.000) por uma noite a 4°C. As
amostras foram tratadas por 30 min com peróxido de hidrogênio e em seguida
incubadas por 30 min com anticorpos de cabra anti-camundongo ou anti-rato
marcados com peroxidase (Dako Cytomation, Glostrup Dinamarca) em
temperatura ambiente. A revelação foi feita com kit AEC (3-amino-9etilcarbazole) (Sigma-Aldrich). As lâminas foram lidas às cegas em relação ao
status de infecção dos animais.
3.2. PROJETO 2: FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR Leptospira spp.
3.2.1. Cepas bacterianas e condições de cultivo
As cepas utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 2. A saprófita
L. biflexa serovar Patoc cepa Patoc 1 (Instituto Pasteur, França) e a patogênica
L. interrogans serovar Lai cepa Lai 56601 (doação do National Institute for
Communicable Disease Control and Prevention, ICDC China CDC) foram
usadas como modelo para o estudo da formação de biofilme por serem cepas
34
bem caracterizadas no laboratório e por terem seus genomas seqüenciados
(REN et al., 2003; PICARDEAU et al., 2008). A maioria das cepas utilizadas faz
parte da coleção do Centro Nacional de Referência da Leptospirose do Instituto
Pasteur, Paris, França. Cepas adicionais isoladas de humanos (cepas L1130,
L1 133 e Eco Challenge), cães (cepas Hook e Kito) e ratos (cepas R 59 e R 61)
foram doadas por Albert Ko, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação
Oswaldo Cruz, Salvador, Brasil. Todas as cepas foram cultivadas sem agitação
a 30°C em EMJH líquido (ELLINGHAUSEN & MCCULLOUGH, 1965;
JOHNSON & HARRIS, 1967) contendo 1% de soro-albumina bovina.
Para todos os experimentos de formação de biofilme, as cepas de
Leptospira foram repicadas ao menos duas vezes em meio líquido EMJH sem
agitação. Culturas em fase exponencial (com aproximadamente 108 bactérias /
mL) foram contadas em câmara de Petroff-Hausser (Hausser Scientific) e
foram realizadas diluições em EMJH para obter suspensão bacteriana inicial de
106 bactérias / mL, a qual foi usada como inóculo ou suspensão inicial em
todos os experimentos. Quando um inóculo inicial diferente foi utilizado, este foi
detalhado no texto. Todos os testes de formação de biofilme foram realizados
em culturas sem agitação.
3.2.2. Formação de biofilmes em tubos de vidro
A formação de biofilme foi testada em tubos de vidro com 10 mL de meio
líquido EMJH. A lista de cepas testadas encontra-se na Tabela 2. Os tubos
foram incubados a 30°C por um período de dois meses e as culturas foram
observadas diariamente para a formação de biofilmes aderidos à superfície do
vidro na interface ar-líquido ou biofilmes em películas, isto é, películas que
cobrem a superfície líquida do meio de cultura (Tabela 2). A produção de
biofilmes por L. biflexa foi também analisada em meio pobre em nutrientes.
Para este propósito, foi inoculado 1 mL de cultura de L. biflexa em fase
exponencial em tubo de vidro contendo 9 mL de água mineral natural nãocarbonada comercial (pH 6,8; conteúdo de minerais [em mg L-1]: 2,7 Na+; 0,9
K+; 7,1 Ca+2; 2 Mg+2; 2 Cl-; 6.6 SO4-2; 2 NO3-; 24 HCO3-), esterilizada em filtro
35
Millipore. A formação de biofilme foi observada por duas semanas. Para avaliar
a influência da temperatura sob a formação de biofilmes, biofilmes de L. biflexa
e L. interrogans foram crescidos a 21, 30 e 37°C, visando reproduzir,
respectivamente,
a
temperatura
do
ambiente,
temperatura
ótima
de
crescimento de leptospiras e temperatura do hospedeiro.
3.2.3. Formação de biofilmes em placas de poliestireno
A formação de biofilme foi medida em placas de poliestireno tratadas
para cultivo celular de 12 poços (Corning Incorporated, Corning, NY, Estados
Unidos) contendo 700 µL de suspensão de L. biflexa, mutantes alg1 (gene
LEPBIa2006, ver ítem 4.2.6.), alg2 (LEPBIa2008, ver ítem 4.2.6.), flaB (gene
LEPBIa1589; PICARDEAU, BRENOT & SAINT GIRONS, 2001) ou meio de
cultura EMJH (controle negativo). As placas foram seladas para evitar
dessecação durante o período de incubação. Em diferentes momentos, as
placas foram retiradas da incubação, a cultura líquida foi aspirada com pipeta e
os poços rinsados uma vez com água destilada para remover células não
aderidas ao biofilme ou planctônicas. O biofilme aderido à superfície de
poliestireno foi seco por 15 min sob lâmpada quente e fixado por 20 min com
900 µL solução de acetato de sódio a 2%. A solução de acetato de sódio foi
removida com pipeta e o biofilme foi novamente seco em lâmpada quente por
15 min. As células foram coradas com 900 µL de solução aquosa de cristal
violeta 1% por 20 min. A solução de cristal violeta foi então removida e os
poços rinsados delicadamente com água destilada três vezes para retirar o
excesso de corante. Após isto, 1 mL de solução de etanol-acetona (v:v 80:20)
foi adicionado aos poços para remover o corante retido nas células do biofilme.
Esta mistura foi transferida para cubetas de espectrofotômetro e foi feita a
leitura em absorbância (A) de 600 nm.
3.2.4. Microscopia óptica dos biofilmes
36
Lâminas de vidro 76 x 26 mm (Menzel-Glaser GmbH, Fisher Scientific,
Braunschweig, Alemanha) foram incubadas em tubo tipo Falcon de 50 mL
submersas em 25 mL de suspensão de L. biflexa. As lâminas foram retiradas
da incubação em diferentes momentos (1, 6, 16, 24, 40, 48, 64, 72, 160, e 190
horas) e rinsadas com água destilada para retirar bactérias planctônicas não
aderidas ao biofilme. Em seguida, as lâminas foram secas, fixadas pelo calor e
visualizadas em microscópio de contraste de fase Nikon modelo Microphot FXA
(Nikon Inc., Melville, NY, Estados Unidos) em magnificação de 200x.
3.2.5. Microscopia eletrônica dos biofilmes
Lamínulas de vidro 18 x 18 mm (Menzel-Glaser) foram usadas como
suporte para a formação de biofilme. As lamínulas foram colocadas em posição
vertical em poços de placas de poliestireno de 12 poços (Corning) e incubadas
com 2 mL de suspensão bacteriana em concentração inicial de 106 bactérias /
mL para L. biflexa e 5 x 106 bactérias / mL para L. interrogans, sendo
incubadas por dois e oito dias, respectivamente. As lamínulas foram removidas
e rinsadas uma vez em água destilada. Para a microscopia eletrônica de
varredura (MEV), as lamínulas contendo os biofilmes de L. biflexa e L.
interrogans aderidos foram fixadas em solução de glutaraldeído 2,5 % / tampão
cacodilato 0,1 M a 4°C por uma hora e por uma noite, respectivamente. O
biofilme em película de L. biflexa foi crescido em 10 mL de meio líquido EMJH
por 72 h a 30°C, colocado com uma alça de platina sobre uma lamínula de
vidro, seco por 10 min em temperatura ambiente e fixado em solução
de
glutaraldeído 2,5% / tampão cacodilato 0,1 M a 4°C por uma hora. As amostras
fixadas foram, em seguida, rinsadas três vezes em tampão cacodilato 0,2 M,
pós-fixadas com tetraóxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato 0,2 M por 15
min e lavadas em água. As amostras foram, por duas vezes, tratadas com
ácido tânico 0,2% por 20 min, rinsadas em água e tratadas por tetraóxido de
ósmio 0,5% em tampão cacodilato 0,2 M por 5 min. As amostras foram
gradualmente desidratadas em banhos de etanol, dissecadas, evaporadas em
37
carbono e observadas em microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM
6700F (Jeol Ltd.,Tókio, Japão).
Para a crio-microscopia eletrônica de varredura (crio-MEV), após lavar
as lamínulas em água, as mesmas foram submersas em nitrogênio líquido,
crio-fraturadas e sublimadas por 20 min a -95°C, sendo então metalizadas com
cromo por 120 seg. As amostras foram observadas em microscópio eletrônico
de varredura JEOL JSM 6700F.
Para a microscopia eletrônica de transmissão (MET), os biofilmes foram
fixados em solução de glutaraldeído 1,6% / tampão Sorensen (NA 2HPO4 0,1 M;
KH2PO4 0,1 M; pH 7,2) e rinsados três vezes por 10 min em tampão Sorensen.
Os biofilmes foram pós-fixados em tetraóxido de ósmio 1% / tampão Sorensen
por uma hora, lavados em água, desidratados em banhos sucessivos de etanol
e embebidos em Epon. Secções ultrafinas foram observadas em microscópio
eletrônico de transmissão JEOL JEM 1010 (Jeol Ltd.,Tókio, Japão).
3.2.6. Mutagênese sítio-dirigida em L. biflexa
A mutagênese sítio-dirigida em L. biflexa serovar Patoc cepa Patoc 1 foi
realizada como descrito por LOUVEL & PICARDEAU (2007). A transformação
por eletroporação, neste caso, permitiu a inserção de um alelo inativo
(interrompido por um cassete de resistência a antibiótico) que substituiu a cópia
selvagem deste gene por recombinação homóloga. Os genes LEPBIa2006 e
LEPBIa2008 foram escolhidos para serem inativados por codificarem,
respectivamente, para uma proteína putativa precursora na biossíntese de
alginato e uma proteína putativa poli ( -D-manuronato) O-acetilase, sendo o
alginato e o manuronato polissacarídios que podem estar envolvidos na
biossíntese de biofilmes bacterianos (PIER et al., 2004). O plasmídio suicida
pGEM7Z-f+ (Promega) foi usado para a construção de plasmídios contendo os
genes LEPBIa2006 e LEPBIa2008 interrompidos por cassete de resistência à
espectinomicina (SpcR). O cassete SpcR foi amplificado por PCR utilizando-se
os iniciadores Spc Cla I a (5 -CCATCGATGGCCCGAGCTTCAAGG-3 ) e Spc
Cla I b (5 -CCATCGATGGAAAGTAAGCACCTG-3 ). A PCR foi feita como
descrita no item 4.1.2.. Em seguida, 5 µL do produto de amplificação foram
38
digeridos com a enzima de restrição Cla I (Invitrogen) como descrito
anteriormente no item 4.1.2.
As metades direita (par de iniciadores 1) e esquerda (par de iniciadores
2) dos genes alvo LEPBIa2006 e LEPBIa2008 foram amplificadas. O par de
iniciadores
1
utilizados
para
o
gene
LEPBIa2006
foi:
2006
E
(5 -GGAATTCTCATAACGTTTGG-3 , contendo sítio de restrição para EcoR I
em negrito) e 2006 C1 (5 -CCATCGATGGCCGATATTCTTCATG-3 , com sítio
de restrição para a Cla I em negrito). Para o par de iniciadores 2: 2006 C2
(5 -CCATCGATGGTCTTTATCACACTGG-3 , com sítio de restrição para a Cla I
em negrito) e 2006 B (5 -CGGGATCCCGAAAGGAAACTTGTTCG-3 , com sítio
de restrição para BamH I em negrito). Os iniciadores 1 utilizados para o gene
LEPBIa2008 foram: 2008 E (5 -AGGAATTCGTTGTTTCGAATCG-3 , com sítio
de
restrição
para
EcoR
I
em
negrito)
e
2008
C1
(5 -CCATCGATGGATTACCGCCTAGCGG-3 , com sítio de restrição para a Cla
I
em
negrito);
e
para
o
par
de
iniciadores
2:
2008
C2
(5 -CCATCGATGGCAGGTTTTAATGAAG-3 , com sítio de restrição para a Cla
I em negrito) e 2008 B (5 -CGGGATCCCGTTCACTAAGATTCGG-3 , com sítio
de restrição para BamH I em negrito). A PCR foi realizada conforme descrito no
item 4.1.2..
Os produtos de PCR (5 µL) foram submetidos à digestão dupla com as
enzimas EcoR I e Cla I ou BamH I e Cla I (Invitrogen) (digestão descrita no item
4.1.2.). Os produtos da PCR foram purificados usando o kit QIAquick PCR
Purification (Qiagen) e ligados ao cassete de resistência à espectinomicina e
plasmídio derivativo pGEM7Z-f+ (digerido com as enzimas EcoR I e BamH I).
Para a ligação utilizou-se 3 µL de cada produto amplificado e 1,5 µL do cassete
e procedeu-se como descrito no item 4.1.2.. Em seguida, foi realizada a
transformação de 75 µL E. coli XL-10 ultracompetentes (Stratagene) com 5 µL
da ligação como descrito no item 4.1.2.. O plasmídio carreando o alelo
inativado era formado então de um cassete SpcR entre as metades direita e
esquerda (
0,5 kb de tamanho) do gene alvo, introduzindo uma deleção
gênica parcial. Estes plasmídios, não replicativos em Leptospira spp., foram
então submetidos a irradiação UV por 15 s e foi feita a eletroporação em L.
biflexa. Realizou-se a eletroporação de L. biflexa serovar Patoc cepa Patoc 1
conforme descrito anteriormente no item 4.1.2.. Colônias resistentes à
39
espectinomicina foram repicadas para meio EMJH líquido, o DNA extraído e
testado por PCR para a confirmação da troca alélica (duplo crossing-over).
Para esta PCR utilizaram-se os iniciadores mais externos da construção
descritos acima; para LEPBIa2006, o par de iniciadores 2006E e 2006B e para
LEPBIa2008, o par 2008E e 2008B. A PCR foi realizada como descrito no item
4.1.2., sendo utilizado tempo de alongamento de 2 min 30s. Os produtos de
amplificação tiveram tamanho aproximado de 2,5 Kb.
Foram realizadas curvas de crescimento das cepas selvagem L. biflexa
serovar Patoc cepa Patoc 1 e mutantes flaB, alg1 (LEPBIa2006) e alg2
(LEPBIa2008) conforme descrito previamente no item 4.1.5., a partir de cultura
primária contendo 105 bactérias / mL. Foram feitas leituras diárias durante sete
dias em espectrofotômetro a DO420nm. Foram realizadas três curvas de
crescimento.
40
4. RESULTADOS
4.1. PROJETO 1: ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM L. interrogans
4.1.1. Mutação e complementação de loa22 em L. interrogans serovar Lai
A partir da eletroporação realizada em L. interrogans serovar Lai cepa
Lai 56601 utilizando o plasmídio pMSL carregando o transposon Himar 1 com
o cassete de resistência para a espectinomicina, gerou-se um clone com
inserção do transposon no gene LA0222. O gene LA0222 codifica para uma
proteína de 195 aminoácidos relatada por KOIZUMI & WATANABE (2003)
como Loa22, uma lipoproteína putativa de 22-kDa com domínio OmpA (Figura
7). Sendo assim, denominou-se a proteína como Loa22 e o seu gene loa22. O
gene LA0222 ou loa22 localiza-se na posição 220.548 do cromossoma maior
de L. interrogans serovar Lai. LA0222 possui 99 e 95% de identidade com os
ortólogos de outras leptospiras patogênicas como LIC10191 de L. interrogans
serovar Copenhageni e LBL_2925 / LBJ_0158 de L. borgpetersenii serovar
Hardjobovis, respectivamente.
Como não há vetor plasmidial replicativo disponível para leptospiras
patogênicas (BOURHY et al., 2005), a cópia selvagem do gene que codifica
Loa22 foi re-introduzida na cepa mutante loa22- espectinomicina resistente por
mutação
aleatória
utilizando-se
um
transposon
canamicina
resistente
carreando loa22. Dentre os clones transformados, uma cepa complementada
foi selecionada para os estudos, a cepa denominada loa22- / loa22+ TK2.
4.1.2. Genótipos e fenótipos
A PCR utilizando os iniciadores S1a e S1b específicos para loa22
revelou a presença de um produto de amplificação de 200 pb para L.
interrogans serovar Lai selvagem conforme o esperado para a amplificação do
gene selvagem. Para a cepa mutante loa22-, observou-se um produto de 1.500
pb relativo à inserção do cassete de espectinomicina no gene e para a cepa
complementada loa22- / loa22+ TK2, duas bandas equivalentes ao gene
interrompido (1.500 pb) e o selvagem (200 pb) (Figura 2). O southern-blot
41
utilizando sondas específicas para espectinomicina e canamicina confirmou a
presença de uma banda de aproximadamente 3,5 Kb correspondendo ao
cassete de espectinomicina para a cepa mutante loa22-. Duas bandas foram
visualizadas para a cepa complementada loa22- / loa22+ TK2, uma
correspondendo ao cassete de espectinomicina (3,5 Kb) e a outra ao cassete
de canamicina (aproximadamente 6 Kb), confirmando a presença dos dois
transposons carreando cassetes de resistência (Figura 3).
A inativação e complementação de loa22 em L. interrogans não afetou a
morfologia celular ou a motilidade das cepas estudadas. As cepas selvagem,
mutante loa22- e complementada loa22-/+ TK2 apresentaram crescimento
similar em meio líquido EMJH como evidenciado na curva de crescimento
(Figura 4), indicando que a manipulação genética não alterou o crescimento in
vitro.
4.1.3. Expressão de Loa22 por ELISA e Western-blot
O ELISA com antígenos totais bacterianos e anticorpos específicos para
Loa22 demonstrou expressão da proteína nas cepas selvagem L. interrogans
serovar Lai e complementadas loa22-/+ TK1 e TK2. A cepa mutante loa22apresentou leituras de DO no ELISA próximas de zero, confirmando a ausência
de expressão da proteína (Figura 5).
O Western-blot confirmou os resultados obtidos no ELISA, havendo
presença de uma banda com peso molecular aproximado de 20 kDa para as
cepas selvagem L. interrogans serovar Lai e complementadas loa22-/+ TK2, e
ausência desta banda para a cepa loa22-, confirmando a ausência de
expressão (Figura 6).
4.1.4. Características da proteína Loa22
A proteína Loa22 exibe estrutura bipartida, com domínio N-terminal
(resíduos 1 - 77) não relacionado a outros domínios protéicos procariotas ou
eucariotas, seguido de domínio OmpA C-terminal (resíduos 78 - 186)
(programa BLAST). De acordo com SpLip (SETÚBAL et al., 2006), um
algoritmo para a predição de lipoproteínas de espiroquetas, Loa22 é uma
42
possível lipoproteína. Possui região de peptídio sinal (resíduos 1-20) com Nterminal contendo aminoácidos carregados positivamente (resíduos MVKK),
seguidos de região H hidrofóbica (resíduos ILNLILLGAIAF), e região lipobox
(resíduos SFTLC) com um resíduo Leu atípico anterior a Cys (Figura 7). Loa22
apresenta um motivo putativo de associação ao peptidoglicano bacteriano
(resíduos NIFYSELRANAVKQAL), conforme citado anteriormente por Koizumi
e Watanabe (2003), que segue o consenso NX2LSX2RAX2VX3L estabelecido
por KOEBNIK (1995). Utilizando-se LipoP (JUNCKER et al., 2003), um
algoritmo para a predição de lipoproteínas em Eubacteria Gram negativas,
Loa22 é uma provável lipoproteína com sítio de clivagem entre os resíduos Lys
e Cys, 20 e 21, respectivamente.
A análise da seqüência de aminoácidos C-terminal de Loa22 revelou
que outras proteínas de L. interrogans (LA4337, LA3685, LA0056, LA3615, e
LB328) têm homologia de sequência com proteínas membro da família OmpA.
Estas proteínas putativas OmpA, incluindo Loa22, têm entre 46 e 59% de
similaridade de seqüência no domínio C-terminal, mas têm heterogeneidade
significativa na seqüência de aminoácidos no domínio N-terminal.
4.1.5. Localização de Loa22 por imunofluorescência
Os ensaios de imunofluorescência demonstraram que Loa22 está
exposta na superfície de L. interrogans, indicando a sua presença na
membrana externa. Anticorpos anti-Loa22 marcaram a superfície das cepas
selvagem L. interrogans serovar Lai e complementada loa22-/+ TK2, mas não
marcaram a superfície da cepa mutante loa22- (Figura 8). Os experimentos
controle realizados com anticorpos específicos para as lipoproteínas de
superfície LipL32 e LipL41 demonstraram a marcação da superfície das cepas
selvagem, mutante e complementada, demonstrando a capacidade do método
em marcar proteínas de superfície anteriormente descritas (HAAKE &
MATSUNAGA, 2002). Já utilizando os anticorpos específicos para as proteínas
LipL31 e GroEL, associadas à membrana interna (HAAKE & MATSUNAGA,
2002), não observou-se marcação da superfície em leptospiras intactas; mas
quando estas foram previamente permeabilizadas com metanol, observou-se
marcação (Figura 8).
43
4.1.6. Extração de proteínas com o triton X-114
Com o objetivo de observar o comportamento da proteína Loa22 frente à
extração com o detergente aniônico triton X-114, realizou-se a extração de
proteínas com uma técnica classicamente usada no estudo de lipoproteínas de
leptospiras. O western-blot com anticorpos específicos para a proteína revelou
que Loa22 foi encontrada na fração de cilindro protoplasmático (PC), a qual é
insolúvel em triton X-114 (Figura 9). O uso de marcadores específicos das
diferentes frações bacterianas, como os anticorpos específicos contra as
proteínas LipL32 (controle de fase detergente), LipL31 e GroEL (controles de
fração PC) e LipL41 (presente em todas as frações) confirmou não haver
contaminação entre as frações (derivada de contaminações durante a
realização da extração ou durante a deposição das amostras no gel).
4.1.7. Estudos de virulência
Cobaios e hamsters, por reproduzirem a leptospirose aguda grave, são
os animais experimentais padrão para o estudo da doença (BHARTI et al.,
2003; McBRIDE et al., 2005) e foram usados para avaliar a virulência das
cepas selvagem, mutante loa22- e complementada loa22-/+ TK2 (Figuras 10, 11
e 12). Em dois experimentos, quando inoculados com a cepa selvagem nas
doses 2 x 108 e 4 x 108, 10 / 14 e 8 / 8 cobaios foram a óbito, respectivamente
(Figura 10). Estes cobaios desenvolveram a leptospirose aguda com sinais
característicos como prostração e icterícia (Figura 12) e foram a óbito 4 a 6
dias após a infecção (experimentos 1 e 2, Figura 10).
Quando os cobaios foram inoculados com a cepa mutante loa22observou-se atenuação da virulência pois as doses usadas para o desafio não
provocaram sinais clínicos durante o período de observação de 21 dias e não
levaram os animais a óbito (Figura 10). A diferença de mortalidade de acordo
com o teste de Fisher foi significativamente menor para os animais desafiados
com loa22- em comparação à cepa selvagem (0% vs. 71% e 0% vs. 100% nos
experimentos 1 e 2, respectivamente, com P = 0,00015 para ambos).
Quanto ao isolamento da cepa mutante loa22- de amostras de animais
infectados com a cepa mutante loa22-, esta foi isolada do sangue no dia 3 pós-
44
infecção em 4 / 4 cobaios infectados com 2 x 108 bactérias em experimentos
separados. Ainda, foi isolada dos rins de 5 / 7 cobaios sacrificados 21 dias
após a infecção (Tabela 1). No entanto, estas culturas renais necessitaram um
maior período de incubação, de mais de duas semanas, para tornarem-se
positivas, o que sugere que havia um reduzido número de bactérias viáveis
nestas amostras renais. Surpreendentemente, a cepa não foi isolada do fígado
de animais infectados com a cepa mutante e sacrificados aos 21 dias (Tabela
1). Estes achados indicaram que embora a cepa mutante loa22- não induza
doença, foi capaz de causar bacteremia e colonização tecidual após a infecção.
A subseqüente re-infecção e re-isolamento da cepa mutante loa22- do
sangue ou tecidos de cobaios infectados (por sete vezes no total) não levou à
recuperação da virulência da cepa.
A complementação de loa22 restaurou o fenótipo de virulência da cepa
mutante loa22-. Cobaios infectados com a cepa loa22-/+ TK2 nas doses 2 x 108
e 4 x 108 bactérias apresentaram 43 e 75% de mortalidade, respectivamente
(Figura 10). Os óbitos ocorreram 5 a 9 dias após a infecção. Não houve
diferença significativa entre as taxas de mortalidade causadas pela infecção
com as cepas selvagem e complementada loa22-/+ TK2. As cepas
complementadas loa22-/+ TK2 usadas na infecção e re-isoladas de cobaios
tiveram seus genótipos confirmados por PCR e Southern-blot, confirmando que
a restauração da virulência não foi devido à contaminação com a cepa
selvagem.
Hamsters foram desafiados com as cepas selvagem, mutante loa22- e
complementada loa22-/+ TK2 para confirmar os resultados obtidos em cobaios.
A infecção com 108 e 5 x 107 bactérias da cepa selvagem levou a óbito 100% e
90% dos animais, respectivamente, nos dias 7 a 15 pós-infecção (Figura 11,
experimentos 3 e 4, respectivamente). Diferentemente do que se observou em
cobaios, a cepa mutante loa22- causou a morte de 1 / 10 hamsters em ambos
experimentos, no dia 8 pós-infecção (Figura 11). A necropsia de um destes
animais (do experimento 4) revelou a presença de sinais de leptospirose como
causa mortis. No entanto, as taxas de mortalidade foram significativamente
menores nos hamsters infectados com a cepa mutante loa22- em comparação
à cepa selvagem (10% vs. 100%, p = 0.00011 e 10% vs. 90%, p = 0.001 para
os experimentos 3 e 4, respectivamente). A infecção com a cepa
45
complementada loa22-/+ TK2 levou a óbito 60% (6 / 10) e 80% (8 / 10) dos
hamsters nos experimentos 3 e 4, respectivamente, indicando que a
complementação de loa22 restaurou parcialmente a virulência. Os óbitos de
hamsters infectados com a cepa complementada loa22-/+ TK2 ocorreram 7 a 21
dias após a infecção. Não houve diferença estatisticamente significativa entre
as taxas de mortalidade causadas pelas cepas selvagem e complementada em
hamsters.
4.1.8. Histopatologia
À necropsia de cobaios infectados com a cepa selvagem nos dias 5 e 6
pós-infecção observou-se lesões macroscópicas tipicamente associadas à
leptospirose (Figura 12). Durante o exame macroscópico, os animais
apresentaram icterícia subcutânea e das serosas, aumento do tamanho dos
rins, hemorragia difusa renal e hemorragia multifocal pulmonar, no estômago e
intestinos. Observou-se esplenomegalia, assim como icterícia hepática, ascite
e hemotórax. Nenhum destes achados, a não ser a esplenomegalia, foi
encontrado nos cobaios infectados com a cepa mutante loa22-. A cepa
complementada loa22-/+ TK2 provocou o mesmo espectro de lesões descritas
para a cepa selvagem (Figura 12).
À coloração de hematoxilina-eosina, secções de pulmões, rins, baço e
fígado de cobaios infectados com a cepa selvagem L. interrogans serovar Lai
revelaram alterações histológicas típicas da leptospirose (Figura 13). Secções
dos rins apresentaram hemorragia nos espaços de Bowman, lúmen dos túbulos
renais
e
interstício,
além
de
necrose
tubular
e
focos
inflamatórios
linfoplasmocitários. As alterações patológicas eram acompanhadas de um
grande número de leptospiras, reveladas pela coloração de Wartin Starry, em
todo o parênquima renal e formando aglomerados no espaço de Bowman e
túbulos (Figura 13).
Secções de fígado apresentaram inflamação periportal com a presença
principalmente de linfócitos e plasmócitos, perda da arquitetura hepática e
aumento do calibre dos canalículos biliares. A distorção dos canalículos biliares
foi acompanhada da presença maciça de leptospiras nos canalículos biliares e
sinusóides, em estreita relação com a membrana hepatocitária (Figura 13).
46
Secções de baço apresentaram hemorragias e necrose focal da polpa
vermelha. Pulmões apresentaram hemorragia intra-alveolar associada à
infiltração
intersticial
de
células
inflamatórias,
principalmente
polimorfonucleares e mononucleares. Poucas leptospiras foram encontradas
nos espaços alveolares e interstício pulmonar de secções pulmonares coradas
com Wartin-Starry.
A infecção com a cepa mutante loa22- produziu resposta inflamatória e
lesão tecidual reduzidas ou ausentes em cobaios necropsiados seis dias pósinfecção (Figura 13). A histologia dos órgãos dos cobaios infectados com a
cepa mutante loa22- foi considerada sem alterações dignas de nota e
assemelhou-se a dos animais controle inoculados com meio de cultura EMJH.
Secções de fígado apresentaram leve infiltrado inflamatório periportal, sem
necrose ou hemorragia. Os rins, baço e pulmões apresentaram ausência ou
ocasional infiltrado inflamatório leve. Não foram encontradas leptospiras nos
tecidos de cobaios infectados com a cepa mutante loa22- corados por WartinStarry necropsiados seis e 21 dias pós-infecção (Figura 13).
A infecção com a cepa complementada loa22-/+ TK2 gerou achados
patológicos típicos da leptospirose aguda, similares aos descritos acima para a
cepa selvagem, em secções coradas por hematoxilina-eosina e Wartin-Starry
(Figura 13).
Foi realizada imunohistoquímica com anticorpos específicos para a
lipoproteína de membrana externa LipL32 dos tecidos de animais infectados
com as cepas selvagem, loa22- e loa22-/+. A imunohistoquímica confirmou os
achados de Wartin-Starry, demonstrando importante número de leptospiras nos
rins, fígado, baço e pulmões dos animais infectados com as cepas selvagem e
complementada loa22-/+ e ausência de leptospiras visíveis nos tecidos de
animais infectados com a cepa mutante loa22- (Figura 13).
4.1.9. Expressão in vivo de Loa22
Foi realizada imunohistoquímica com anticorpos específicos para a
proteína Loa22 em secções de rins e fígado de cobaios infectados com as
cepas selvagem e complementada loa22-/+ TK2, demonstrando que a proteína
Loa22 é expressa nestes órgãos durante a leptospirose aguda (Figura 14).
47
4.2. PROJETO 2: FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR Leptospira spp.
4.2.1. Formação de biofilmes em superfícies abióticas por leptospiras
patogênicas e saprófitas
Inicialmente observou-se que o patógeno L. interrogans serovar Lai cepa
Lai 56601, quando crescido em condição estática, formava um halo aderido à
parede do tubo de vidro na interface ar-líquido (região de transição do ar dentro
do tubo com o meio de cultura líquido) em aproximadamente 10 dias a 30°C
(Figura 15). Para o saprófita L. biflexa serovar Patoc cepa Patoc 1, quando
incubado nestas mesmas condições, observou-se que as células aderiram
fortemente à superfície de vidro após dois dias de incubação, formando o
mesmo tipo de halo. Ainda para L. biflexa, observou-se a formação de um
segundo tipo de biofilme, o biofilme em película, uma película flutuante que se
forma na interface ar-líquido após 4-5 dias de incubação (Tabela 2). Assim,
uma ampla variedade de cepas, patogênicas e saprófitas, foram testadas em
meio líquido rico EMJH quanto à capacidade de formar biofilmes aderidos a
tubos de vidro ou em películas flutuantes (Tabela 2). Um total de 90% das 30
cepas testadas, representando sete espécies de Leptospira, foram capazes de
formar biofilmes. O tempo médio para formação de biofilmes para as cepas
saprófitas foi de três dias, enquanto que para as cepas patogênicas foi de 20
dias. Apenas uma minoria das cepas (três) formou biofilme do tipo película e
três cepas não formaram biofilmes em tubos em três diferentes experimentos
(Tabela 2). Quando se avaliou a capacidade de cepas patogênicas virulentas
de baixa passagem (BP) e de alta passagem (AP) formarem biofilmes em
tubos, observou-se que as cepas BP (isoladas de animais inoculados
experimentalmente) mantiveram o fenótipo de formação de biofilme. O mesmo
foi observado para as cepas de alta passagem (Tabela 2).
A temperatura de incubação não pareceu exercer uma importante
influência na formação de biofilmes, já que se observou a formação de
biofilmes de L. biflexa nas diferentes temperaturas testadas de 21, 30 e 37°C.
Já para a cepa patogênica L. interrogans, observou-se a formação de biofilme
48
apenas a 30 e 37°C. Não houve crescimento ótimo a 21°C, impossibilitando a
observação do biofilme desta cepa nesta temperatura.
L. biflexa formou biofilme em meio pobre em nutrientes, como foi
observado quando esta cepa foi incubada em tubo de vidro contendo água
mineral natural. Neste caso, a formação de biofilme ocorreu com oito dias de
incubação, um retardo de seis dias em relação ao biofilme em meio rico EMJH.
L. biflexa formou biofilmes em diferentes superfícies plásticas como
placas de poliestireno e lâminas de poliolefina Thermanox e Permanox (Nunc,
Naperville, IL, Estados Unidos). As placas de poliestireno de 12 poços foram
usadas neste estudo devido a sua maior superfície de adesão e maior
facilidade em manipular os biofilmes. O biofilme de Leptospira demonstrou ter
estrutura frágil e a sua manipulação foi dificultada quando placas de 96 poços
foram testadas, havendo muita perda de material, sendo por este motivo as
placas de 12 poços escolhidas para a realização de todo o estudo. Nas placas
de poliestireno o biofilme se desenvolveu no fundo e nos bordos dos poços
(Figura 15). L. interrogans formou biofilme em placas de poliestireno, porém
estes se mostraram pouco aderidos e não resistiram às lavagens, não sendo
possível a sua demonstração nesta superfície abiótica.
4.2.2. Análise microscópica dos biofilmes
Em um primeiro momento, avaliou-se a microscopia do biofilme de L.
biflexa usando microscopia óptica de contraste de fase em diferentes períodos
de tempo. Os biofilmes foram crescidos em lâminas de vidro e as lâminas
retiradas da incubação e observadas em tempos determinados. A formação de
biofilme por L. biflexa em lâminas de vidro está ilustrada na Figura 16. L.
biflexa aderiu à superfície de vidro de uma maneira tempo-dependente,
cobrindo completamente a lâmina como nos biofilmes típicos. Inicialmente
observou-se a aderência de bactérias individuais planctônicas à superfície de
vidro (Figura 16 A), sendo seguida da formação de uma rede bacteriana
estruturada aderida à superfície na interface ar-líquido (Figura 16 B). A
produção máxima de biofilme aconteceu com 48 h de incubação, quando as
49
bactérias foram observadas cobertas por denso material amorfo semelhante à
matriz extracelular (Figura 16 C). Com o aumento do tempo de incubação, a
partir de 72 h observou-se a diminuição da espessura e da área de cobertura
do biofilme, indicando perda de material (Figura 16 E). Observou-se ainda que
L. biflexa forma um biofilme mais denso na região de interface ar-líquido em
comparação a um biofilme menos denso abaixo desta região (Figura 16 C e D).
O aspecto microscópico do biofilme em película assemelha-se ao do biofilme
fortemente aderido a lâmina (Figura 16 E).
Para confirmar os resultados obtidos com a microscopia ótica e melhor
elucidar a arquitetura do biofilme de leptospiras, realizou-se a microscopia
eletrônica de varredura (MEV). Biofilmes densos foram observados aderidos às
lamínulas de vidro. Os biofilmes consistiam de bactérias associadas a material
amorfo, com uma maior densidade de material na interface ar-líquido da
lamínula (Figuras 17 e 18). Para L. biflexa, observou-se uma rede de bactérias
que servia como esqueleto para o desenvolvimento posterior do biofilme com o
tempo. Com 48 h de incubação, observou-se a formação de microcolônias
(Figura 17 A) e, em maior magnificação, de aglomerados de células cobertos e
entremeados por material amorfo ou matriz-like (Figuras 17 B e C). Para L.
interrogans, com oito dias de incubação, os biofilmes eram formados por
grandes aglomerados de células, em formato de montanhas, com a camada
mais superficial coberta de uma matriz extracelular (Figura 18 A). Dois tipos de
arquitetura de biofilme foram observados: o biofilme de L. interrogans consiste
de aglomerados de células individualizados cobertos de material amorfo
extracelular e o biofilme de L. biflexa consiste de uma rede complexa de
microcolônias menores interligadas por bactérias e material extracelular
(Figuras 17 e 18).
Buscando outras estratégias para estudar a arquitetura do biofilme,
realizou-se a técnica de microscopia eletrônica de transmissão (MET), que
estabiliza os biofilmes, pois estes são embebidos em uma resina, e a técnica
de crio-varredura (crio-MEV). A crio-MEV permite a análise do biofilme no seu
estado mais natural possível, pois as amostras não são tratadas quimicamente
como na MEV convencional e ao contrário, são imediatamente congeladas em
nitrogênio líquido. Esta técnica é recomendada para amostras altamente
50
hidratadas e frágeis, como biofilmes e cápsulas bacterianas. As técnicas de
MET e crio-MEV demonstraram que os biofilmes de Leptospira formam
estruturas multicelulares e em várias camadas, medindo aproximadamente 5 a
14 µm e 10 a 30 µm de espessura para L. biflexa e L. interrogans,
respectivamente (Figura 19). As bactérias estão separadas por espaços
vazios , os quais podem corresponder a espaços para o trânsito de água,
oxigênio e nutrientes, funcionando como espécies de canais (Figura 19). Os
controles de MET, MEV e crio-MEV realizados com bactérias planctônicas
(culturas crescidas sob agitação e onde não houve formação de biofilme)
revelaram algumas espiroquetas aderidas à superfície, com ausência de
bactérias em arquitetura em rede semelhante a do biofilme.
4.2.3. Quantificação da formação de biofilmes
A formação de biofilmes foi quantificada através da coloração por cristal
violeta das células aderidas às placas de poliestireno de 12 poços, a 30°C e em
condições estáticas de crescimento. A biomassa de biofilme formada no fundo
e bordos do poço atingiram uma A600nm máxima de 2 com 48 h de incubação
(Figura 20). Em seguida, a biomassa diminuiu, chegando aos valores de
absorbância mínimos em 72 h de incubação (Figura 20).
Com o objetivo de estudar genes que possam influenciar na formação
de biofilmes, avaliou-se a capacidade de formação de biofilmes de alguns
mutantes de L. biflexa. Para estudar os papéis do flagelo e motilidade, o
mutante flaB (PICARDEAU, BRENOT & SAINT GIRONS, 2001), o qual é
defeituoso para a síntese de endoflagelo e tem motilidade reduzida, foi testado
em placas de poliestireno. O mutante flaB foi capaz de formar biofilme, porém
com um retardo de 48 h (Figura 20), o que também foi observado em curvas de
crescimento in vitro (Figura 21). Para avaliar a influência do alginato na
formação de biofilmes, analisou-se a formação de biofilmes dos mutantes alg1
(LEPBIa2006) e alg2 (LEPBIa2008), putativos para a biossíntese de alginato. A
média de biomassa de biofilme produzida pelas cepas mutantes foi similar a da
cepa parental. No entanto, para o mutante alg1, a biomassa de biofilme
51
máxima foi atingida com um retardo de 24 h comparado a cepa parental (Figura
20). A cepa alg1 exibiu crescimento in vitro semelhante ao da cepa parental, já
a cepa alg2 exibiu crescimento mais intenso que a cepa parental (Figura 21).
52
5. TABELAS E FIGURAS
Tabela 1. Isolamento da cepa mutante loa22- a partir de sangue, rins e fígado
coletados de cobaios infectados com a cepa mutante loa22-. As amostras
foram cultivadas em meio de cultura líquido EMJH sob agitação.
Amostra Dia da coleta após infecção
Sangue
3
Rins
21
Fígado
21
*Longo período de incubação.
Culturas positivas / totais
3/ 4
5/ 7*
0/ 7
53
Tabela 2. Leptospira spp. usadas no estudo e suas capacidades de formar
biofilme em crescimento estático em meio líquido EMJH. As cepas foram
cultivadas em tubos de vidro por dois meses a 30°C. Aqui estão apresentados
os resultados de três experimentos independentes.
Espécie
Serovar a
Cepa b
Formação de biofilme c
Aderido
Saprófitas:
L. biflexa
L. meyeri
Patogênicas:
L. borgpetersenii
L. borgpetersenii
L. borgpetersenii
L. borgpetersenii
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. kirschneri
L. kirschneri
L. kirschneri
L. noguchi
L. weillii
Película
Patoc
Semaranga
Patoc 1
Veldrat Semarang 173
+
+
+
-
Castellonis
Hardjobovis
Sejroe
Tarassovi
Autumnalis
Australis
Bratislava
Bataviae
Canicola
Hebdomadis
Copenhageni
Copenhageni
Copenhageni
Copenhageni
Lai
Lai
Icterohaemorrhagiae
Pomona
Pyrogenes
Saxkoebing
Wolffi
Canicola
Canicola
Grippothyphosa
Grippothyphosa
Grippothyphosa
Australis
Hebdomadis
Castelon3 AP
Sponselee AP
M84 AP
Mitis Johnson AP
Akiyami A AP
Ballico AP
Jez-Bratislava AP
Van Tienen AP
Utrecht IV AP
Hebdomadis AP
L1 130 BP
L1 130 AP
R 59 BP
R 61 BP
56601 AP
56601 BP
Verdun AP
Pomona AP
Salinem AP
Mus24 AP
3705 AP
L1 133 BP
Kito EFS BP
Moskva V AP
RM52 BP
RM52 AP
HooK EFS2 BP
Eco Challenge BP
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
a: quando sublinhado, apenas está indicado o sorogrupo da cepa estudada (serovar não
identificado); b: AP, cepa alta-passagem; BP, cepa baixa-passagem; c: Formação de biofilme
na interface ar-líquido. Símbolos: -, não forma biofilme; +, forma biofilme.
54
Ph10
C9
KmR
pS HT
7.50 kb
Sal I
ori
pGEM
-7Zf+
oriR6K
PflgBb
SpcR
Figura 1. Mapa físico do vetor plasmidial contendo o sítio de restrição Sal I,
usado para gerar a cepa complementada loa22- / loa22+.
55
1
2
3
4
1500 -
200 -
Figura 2. Genótipos das cepas 1 (L. interrogans serovar Lai selvagem), 2
(mutante loa22-), 3 (complementada loa22-/+ TK1) e 4 (complementada loa22-/+
TK2) em PCR específico para o gene loa22.
56
SpcR
kb
1
2
KmR
3
1
2
3
85432-
Figura 3. Southern-blot utilizando sondas específicas para a espectinomicina
(SpcR) e canamicina (KmR). Linhas: 1, cepa L. interrogans Lai selvagem; 2,
cepa mutante loa22-; 3, cepa complementada loa22- / loa22+.
57
Curvas de crescimento das cepas L. interrogans Lai selvagem
(wt ), mutante (loa22 - ) e complementada (loa22 -/+ ).
0,8
DO 400 nm
0,6
0,4
wt
loa22loa22-/+
0,2
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
-0,2
Tempo (horas)
Figura 4. Curvas de crescimento das cepas selvagem e mutantes avaliadas
em meio de cultura líquido EMJH sob agitação, a partir de uma solução inicial
bacteriana de 104 / mL. Teste realizado em triplicata.
58
2
1,8
1,6
1,4
A405 nm
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Lai wt
loa22-
loa22-/+ TK1
loa22-/+ TK2
Antígenos bacterianos
Figura 5. ELISA com antígenos bacterianos totais das cepas selvagem (Lai
wt), mutante (loa22-) e complementadas (loa22-/+ TK1 e loa22-/+ TK2) e
anticorpos anti-Loa22.
59
25 kDa
25 kDa
1
2
3
4
5
Figura 6. Western-blot de proteínas totais com anticorpos específicos para
Loa22. Linhas 1: proteína Loa22 recombinante (controle), 2: marcador de peso
molecular, 3: cepa L. interrogans Lai selvagem, 4: cepa mutante loa22-, 5: cepa
complementada loa22- / loa22+ TK2.
60
ATGGTCAAAAAGATTTTGAATCTGATTCTGCTCGGTGCAATTGCATTTTCATTCACTCTCTGCTCCTC
TGCTGAAAAAAAAGAGGAATCCGCAGCTCCTGAGCCTTCAACGCAAGAGCAATCCGCAGCTGCAAA
CAGAAATGTTGACGTCAATTCTCCGGAAGCGATCGCAGATTCTTTAAACGAAAAACTAAAAGATTTCC
GATATCCAGACGGTTTAACTCGTCCTGGATTTAGTTATAAAAAAGCGGATGTTACCCCTGGTGATTTC
AGCGAGTGGTCTAAAACAAACGCTCCTGTAATCAAAGAAGGTCTTAGAAAACTTCCAGATAGTTACG
CTCTTGAAATTACAGGACACACCGATGCGATCGGTCCCGAACAAGCAGAAGGTGCTAAAAAAGGAA
ATATTTTTTACTCTGAGCTTCGTGCAAATGCAGTTAAACAAGCTTTAATCAAACAAGGGATTCCAGCA
AATCGTATCGTTACTAAAGGTGCCGGTTCTTCCGAGCCAGTTTCTGGTCTTGATGCGAAAGATGCTA
AAAATAGAAGAGTCACTTTCCGTTTTGCGACTTCCGCACCACAACAATAA
1 MVKKILNLIL
ILNLIL
LGAIAFSFTL
LGAIAF
CSSAEKKEES
AAPEPSTQEQ SAAANRNVDV NSPEAIADSL
61 NEKLKDFRYP DGLTRPGFSY KKADVTPGDF SEWSKTNAPV IKEGLRKLPD
SYALEITGHT
121 DAIGPEQAEG AKKGNIFYSE LRANAVKQAL IKQGIPANRI
VSGLDAKDAK
VTKGAGSSEP
181 NRRVTFRFAT SAPQQ
Figura 7. Sequência de nucleotídeos de Loa22 (acima) e de aminoácidos
(abaixo), onde estão representadas a região N-terminal com resíduos
carregados positivamente (MVKK), a região H (ILNLILLGAIAF)
ILNLILLGAIAF e a lipobox
(SFTLC), além da sequência putativa de associação ao peptidoglicano
(NIFYSELRANAVKQAL).
61
loa22-
Lai wt
Loa22
LipL31
LipL32
Loa22
LipL31
LipL32
F
Permeabilizado
D
F
Superfície
D
Figura 8. Imunofluorescência das cepas L. interrogans Lai selvagem (Lai wt) e
mutante loa22- com anticorpos anti-Loa22, LipL31 (lipoproteína de membrana
interna, não exposta na superfície bacteriana) e LipL32 (lipoproteína de
membrana externa, exposta na superfície bacteriana). F: fluoresceína, Alexa
para Loa22 e Isotiocianato de fluoresceína para LipL31 e LipL32. D: DAPI,
usado para documentar a presença de leptospiras.
62
Figura 9. Western-blot das frações protéicas da cepa L. interrogans serovar Lai
selvagem após extração com triton X-114. T: antígenos totais; PC: cilindro
protoplasmático; D: fração detergente; A: fração aquosa. Linhas, 1: marcador
de peso molecular; 2 a 5: anticorpos anti-LipL31, LipL32, LipL41 e GroEL
(proteínas controle); 6 a 9: anticorpos anti-Loa22.
63
Sobrevivência (%)
Experimento 1: sobrevivência de cobaios infectados com 2x108 leptospiras.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
p=0,00015
Wt
loa22
loa22-/loa22+
NS
0
5
10
15
20
25
Tempo (dias)
Sobrevivência (%)
Experimento 2: sobrevivência de cobaios infectados com 4x108 leptospiras.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Wt
loa22loa22-/loa22+
p=0,00015
NS
0
5
10
15
20
25
Tempo (dias)
Figura 10. Curvas de sobrevivência de cobaios. No experimento 1, três grupos
de 14 cobaios foram infectados com 2 x 108 bactérias de L. interrogans serovar
Lai cepa selvagem (Wt), mutante (loa22-) e complementada (loa22- / loa22+). No
experimento 2, grupos de 8 cobaios foram infectados com 4 x 10 8 bactérias de
cada cepa testada.
64
Sobrevivência (%)
Experimento 3: sobrevivência de hamsters infectados com 108 leptospiras.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Wt
p=0,00011
loa22loa22-/loa22+
NS
0
5
10
15
20
25
Tempo (dias)
Sobrevivência (%)
Experimento 4: sobrevivência de hamsters infectados com 5x107 leptospiras.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Wt
p=0,001
loa22loa22-/loa22+
NS
0
5
10
15
20
25
Tempo (dias)
Figura 11. Curvas de sobrevivência de hamsters. No experimento 3, três
grupos de 10 hamsters foram infectados com 108 bactérias de L. interrogans
serovar Lai cepa selvagem (Wt), mutante (loa22-) e complementada (loa22- /
loa22+). No experimento 4, grupos de 10 hamsters foram infectados com 5 x
107 bactérias de cada cepa testada.
65
A
B
Wt
loa22-
loa22-/+
Figura 12. A: cobaio infectado com a cepa selvagem L. interrogans serovar Lai
apresentando icterícia cutânea e conjuntival. B: aspecto macroscópico dos
tecidos subcutâneos (coluna esquerda) e pulmões (coluna direita) de cobaios,
seis dias após a infecção. Observa-se icterícia subcutânea e hemorragias
subcutânea e pulmonar nos animais infectados com as cepas selvagem (Wt) e
complementada (loa22-/+) e ausência de alterações patológicas para os animais
infectados com a cepa mutante loa22- (loa22-).
66
Wt
loa22-
Controle
TK2 loa22-/+
1
2
3
4
5
6
Figura 13. Histopatologia dos tecidos de cobaios infectados com as cepas L.
interrogans serovar Lai (Wt), mutante (loa22-), complementada loa22-/+ TK2, ou
meio de cultura EMJH (controle). Linhas 1 e 4: hematoxilina eosina, 200 x; 2 e
5: Wartin-Starry, 1.000 x (as setas indicam as leptospiras); linhas 3 e 6:
imunohistoquímica com anticorpos anti LipL32, 200 x (leptospiras visualizadas
em vermelho). Linhas 1, 2 e 3: secções renais; linhas 4, 5 e 6: seções de
fígado.
67
Figura 14. Expressão in vivo da proteína Loa22 em secção de fígado de cobaio
infectado com a cepa selvagem L. interrogans serovar Lai (acima) e em rim de
cobaio infectado com a cepa complementada loa22- / loa22+ (abaixo).
Imunohistoquímica com anticorpos específicos para Loa22, magnificação de
1.000 x.
68
A
B
interface
ar-líquido
Figura 15. Biofilmes formados por Leptospira. A: L. interrogans serovar Lai
cultivado em tubo de vidro contendo 10 mL de meio EMJH a 30°C por 10 dias
em repouso (um mililitro de cultura foi retirado para fazer a foto). B: Coloração
por cristal violeta de biofilme formado por L. biflexa serovar Patoc em placa de
poliestireno com dois dias de incubação.
69
A
B
C
D
E
F
Figura 16. Formação de biofilme por L. biflexa em lâminas de vidro em
microscopia óptica de contraste de fase (200 x). A: bactérias isoladas aderidas
à superfície de vidro com 1 h de incubação. B: com 24 h, agregados celulares
formam uma rede aderida à superfície na interface ar-líquido. C: em 48 h,
observa-se a formação de microcolônias em organização estelar, formando um
biofilme denso na interface ar-líquido e rico em material amorfo. D: ainda em 48
h, abaixo da interface ar-líquido, L. biflexa forma um biofilme menos denso. E: a
partir de 72 h, observa-se diminuição da densidade do biofilme e áreas
ausentes de células ou matriz na interface ar-líquido, como evidenciado nesta
imagem do biofilme com 96 h de incubação. F: o biofilme em película de L.
biflexa apresenta alta densidade celular e de matriz com quatro dias de
incubação.
70
A
B
C
D
Figura 17. Microscopia eletrônica de varredura do biofilme de L. biflexa aderido
à superfície de vidro com 48 h de incubação (A, B e C) ou tipo película, com
quatro dias (D). Observa-se uma rede complexa de leptospiras formando
microcolônias (A, ponta de seta). As células estão densamente agregadas de
forma aleatória e embebidas em uma matriz extracelular (C e D, setas).
71
A
B
C
D
Figura 18. Microscopia eletrônica de varredura de L. interrogans formando
biofilme em superfície de vidro. Com oito dias de incubação as células estão
firmemente aderidas à superfície, formando microcolônias (A) cobertas e
embebidas em uma densa camada de material extracelular ou matriz (B, C e
D). Em D, a área quadrada de B é mostrada em maior magnificação.
72
A
B
C
Figura 19. Morfologia dos biofilmes de L. biflexa e L. interrogans em superfície
de vidro. A: Crio-microscopia de varredura de criofratura do biofilme de L.
biflexa após crescimento por 48 h (barra de escala: 10 µm). B e C: Microscopia
eletrônica de transmissão de biofilme de L. interrogans com oito dias (barras de
escala: B, 10 m e C: 2 m).
73
3,5
3
2,5
A600nm
DO 600
2
1,5
1
0,5
0
24
48
72
Tempo (horas)
96
120
Tempo (horas)
L. biflexa selvagem
EMJH
Mutante alg1
Mutante alg2
Mutante flaB
Figura 20. Quantificação da produção de biofilme em placas de poliestireno por
coloração com cristal violeta. Os biofilmes formados pelos mutantes de L.
biflexa alg1, alg2 e flaB foram comparados com o biofilme formado pela cepa
selvagem e controle com meio de cultura EMJH. O biofilme produzido foi
medido quantitativamente em espectrofotômetro em A600nm. As barras de erro
são desvios-padrão derivados de dois experimentos em duplicata.
74
Curvas de crescimento das cepas L. biflexa selvagem (wt ) e
mutantes flaB , alg1 e alg 2
1,2
DO 420 nm
)
1
wt
flaB
alg1
alg2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
0
50
100
150
200
Tempo (horas)
Figura 21. Curvas de crescimento das cepas selvagem L. biflexa (wt) e
mutantes flaB, alg1 e alg2 em meio de cultura líquido EMJH sob agitação, a
partir de uma solução inicial de 105 bactérias / mL. Teste realizado em triplicata.
75
6. DISCUSSÃO
6.1. PROJETO 1: ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA EM L. interrogans
O recente sequenciamento dos genomas de duas espécies patogênicas
de Leptospira levou à identificação de genes que codificam principalmente para
proteínas
e
podem
ter
algum
papel
na
virulência
da
leptospirose
(NASCIMENTO et al., 2004; REN et al., 2003; BULACH et al., 2006). Um
destes genes, loa22, codifica para Loa22, uma lipoproteína com domínio Cterminal do tipo OmpA (KOIZUMI & WATANABE, 2003). NALLY et al. (2007)
demonstraram que Loa22 tem sua expressão aumentada durante a infecção
em cobaios. GAMBERINI et al. (2005) demonstraram que esta proteína é
reconhecida pelo soro de pacientes convalescentes de leptospirose. Neste
estudo, verificou-se que a proteína também é reconhecida por soros de
pacientes com doença aguda e vacinados (dados não demonstrados). Loa22 é
uma
proteína
conservada
em
leptospiras
patogênicas
(KOIZUMI
&
WATANABE, 2003, GAMBERINI et al., 2005), o que sugere que ela possa ter
importância na patogenia da leptospirose. Um estudo de microarray identificou
o gene loa22 como candidato vacinal (YANG et al., 2006b).
O papel do gene loa22 não havia sido estudado até o momento devido
às dificuldades inerentes à manipulação genética em leptospiras, bem como à
impossibilidade de se realizar mutagênese sítio-dirigida em leptospiras
patogênicas. Foi demonstrado que o transposon mariner Himar 1 permite a
mutação aleatória no patógeno L. interrogans (BOURHY et al., 2005). Em
busca de genes que poderiam ter algum papel na patogênese da leptospirose e
utilizando a mutagênese aleatória, identificou-se um mutante com inserção de
Himar 1 no gene loa22. Através da análise das cepas mutante loa22- e
complementada loa22- / loa22+ TK2 foi possível demonstrar que o gene loa22 é
necessário para a virulência de L. interrogans em cobaios e hamsters e satisfaz
os Postulados Moleculares de Koch como fator de virulência (FALKOW, 1988),
sendo o primeiro fator de virulência descrito em leptospiras.
A complementação do fenótipo de virulência da cepa loa22- através da
inserção cromossômica de loa22 demonstrou que a atenuação de virulência
ocorreu devido a inativação do gene loa22 e não devido a uma mutação
76
secundária. As cepas selvagem e mutantes apresentaram morfologia celular,
bem como crescimento in vitro semelhantes, demonstrando que loa22 não é
fundamental para o crescimento in vitro de L. interrogans. A infecção com a
cepa complementada não levou a óbito a totalidade dos animais inoculados,
embora não tenha havido diferença estatística significativa nas taxas de
mortalidade de animais infectados com as cepas selvagem e complementada.
A incapacidade de restaurar completamente a virulência (100% de letalidade)
para a cepa complementada não pareceu ser devido à instabilidade da
construção genética, pois a complementação foi o resultado da inserção
estável do inserto no cromossoma. A cepa complementada loa22- / loa22+ TK2,
usada ao longo deste estudo, quando re-isolada de animais infectados
expressou Loa22 em western-blot e ELISA. Ainda, a infecção com uma outra
cepa complementada, denominada loa22- / loa22+ TK1, para a qual o gene
loa22 foi complementado em um outro sítio de inserção, demonstrou letalidade
semelhante à cepa loa22- / loa22+ TK2 em estudos de virulência em cobaios
(óbito de 6 / 8 cobaios com a dose infectante de 4 x 108 bactérias / mL).
As causas da incapacidade de restaurar totalmente a virulência nas
cepas complementadas permanecem especulativas. É possível que o gene
loa22 complementado esteja sujeito a algum tipo de regulação e não alcance o
nível ótimo de expressão necessário para a máxima virulência. Uma outra
explicação poderia ser que as cepas complementadas passaram por mais
repiques in vitro que a cepa selvagem, devido às transformações por
eletroporação e passaram também por repique para meio de cultura sólido.
Vale ressaltar que, de toda forma, as cepas complementadas usadas para os
experimentos de virulência eram cepas de baixa passagem, ou seja, foram
inoculadas nos animais, re-isoladas e, após poucas (menos de dez) passagens
in vitro, usadas para os experimentos de virulência com um número
significativo de animais.
A infecção com L. interrogans produz infecção letal em hamsters e
cobaios e reproduz a apresentação clínica da forma grave da leptospirose
humana, com icterícia e hemorragia pulmonar (LEVETT, 2001; BHARTI et al.,
2003; McBRIDE et al., 2005). A perda de loa22 comprometeu a capacidade das
leptospiras causarem doença clínica e morte em cobaios e hamsters. Ainda, os
tecidos de cobaios infectados com loa22- apresentaram aspecto normal ou
77
apenas levemente alterado, semelhante aos tecidos de animais controle.
Embora a cepa loa22- tenha sido isolada do sangue coletado no terceiro dia
pós-infecção e dos rins coletados 21 dias pós-infecção, leptospiras não foram
detectadas por imunohistoquímica dos tecidos, sugerindo que a perda de loa22
reduziu a viabilidade de leptospiras nos tecidos durante a infecção. Este fato
também indica que havia muito poucas bactérias nos tecidos, compatível com o
longo tempo de incubação destas culturas. Pode-se observar, no entanto, que
a cepa loa22- foi capaz de realizar bacteremia e colonização renal. A ausência
de
patologia
tecidual
observada
em
animais
infectados
com
loa22-
possivelmente reflete uma diminuição na inflamação causada por um menor
número de leptospiras. A proteína Loa22 poderia influenciar a patogenia da
leptospirose em vários momentos da infecção, como na capacidade de
disseminação das leptospiras no hospedeiro após a infecção, adesão às
células e estabelecimento de infecção persistente, o que poderia explicar o fato
da cepa mutante loa22- não atingir número suficiente nos tecidos para produzir
manifestações clínicas e patologia. A via de inoculação utilizada para a
infecção experimental em cobaios e hamsters, intraperitoneal, pode não refletir
as condições encontradas durante a infecção natural (ATHANAZIO et al.,
2008). Estudos futuros, utilizando outras vias de inoculação, como a
subconjuntival ou subcutânea, são desejáveis para determinar o papel de
Loa22 nos estágios iniciais da infecção.
O processo de infecção do hospedeiro por um patógeno é complexo e
multifatorial. Observou-se neste estudo que a perda do genótipo loa22 estava
associada com a perda completa de virulência em cobaios. No entanto, em
hamsters, a infecção com o mutante loa22- provocou taxa de mortalidade
reduzida (10 vs 100%, cepa mutante vs selvagem, respectivamente), porém
não levou à perda completa da capacidade de causar doença letal. As
diferenças observadas podem ser devido a diferenças de susceptibilidade
intrínsecas de cobaios e hamsters frente a L. interrogans serovar Lai usada
neste estudo.
A estrutura de Loa22 é composta de um domínio C-terminal OmpA de
aproximadamente 110 aminoácidos. Este domínio OmpA se refere ao domínio
C-terminal da OmpA de E. coli, uma proteína principal de membrana externa
desta espécie. Ortólogos deste domínio OmpA são encontrados em proteínas
78
de várias espécies bacterianas. As predições da estrutura deste terminal OmpA
variam de um domínio globular contendo um motivo putativo associado ao
peptidoglicano, o qual é localizado no periplasma (KOEBNIK, 1995; GRIZOT &
BUCHANAN, 2004) a um domínio contendo uma proporção significativa de
folhas
anti-paralelas associadas à membrana externa (RAWLING, MARTIN &
HANCOCK, 1995; SINGH et al., 2003b). O domínio N-terminal da OmpA de
E.coli foi cristalizado como uma porina em estrutura de
-barril, a qual
acredita-se seja inserida na membrana externa (PAUTSCH & SCHULZ, 1998).
No entanto, esta região N-terminal não apresenta similaridade de seqüência
significativa em relação a Loa22. Como não há similaridade de seqüência na
região N-terminal entre Loa22 e outras proteínas do tipo OmpA, estas proteínas
podem apresentar estruturas distintas.
A seqüência N-terminal de Loa22 apresenta regiões compatíveis com a
estrutura de lipoproteínas, como sugerem os algoritmos SpLip (SETÚBAL et
al., 2006) e LipoP (JUNCKER et al., 2003). Ao realizar a extração de proteínas
com o detergente triton X-114, Loa22 foi encontrada na fração de cilindro
protoplasmático ou PC, sendo insolúvel neste detergente. KOIZUMI &
WATANABE (2003), usando um protocolo similar, demonstraram a localização
desta proteína na fase detergente hidrofóbica. Porém, estes autores não
testaram todas as frações de extração (total, cilindro protoplasmático,
detergente e aquosa), bem como não realizaram controles de contaminação de
frações (como, por exemplo, o uso de controles com os anticorpos anti-LipL32
e GroEL, proteínas encontradas na membrana externa e citoplasma,
respectivamente), demonstrando que os resultados não são comparáveis. A
extração pelo método do triton X-114 foi realizada exaustivamente neste estudo
e sempre foram encontrados os mesmos resultados, sugerindo que Loa22
encontra-se ligada ao cilindro protoplasmático. A técnica foi realizada também
com culturas bacterianas em início e fim de fase exponencial, bem como com
diferentes concentrações de triton X-114 (0,1 e 2%), obtendo sempre a
presença de Loa22 na fração PC (dados não demonstrados). Loa22 possui
uma região descrita como de ligação ao peptideoglicano bacteriano (KOEBNIK,
1995), o que poderia explicar a sua interação com o PC. As diferenças quanto
à extração por triton X-114 entre os resultados deste estudo e o de KOIZUMI &
WATANABE (2003) podem ser explicadas por interações de Loa22 com a
79
membrana externa. Eventualmente, dependendo das condições de extração,
Loa22 poderia ser liberada do cilindro protoplasmático e ser encontrada na
fração detergente.
Nossos resultados, de acordo com a imunofluorescência, demonstram
que Loa22 está exposta na superfície de L. interrogans, o que sugere que esta
proteína pode estimular o sistema imune do hospedeiro, bem como ser um
fator de virulência ligado à membrana externa. O papel de Loa22 durante a
patogênese permanece indeterminado. Proteínas OmpA de E. coli e outras
bactérias parecem ter papéis multifuncionais na fisiologia e patogênese
bacterianas. Em bactérias Gram-negativas, OmpA funciona como adesina
(DABO, CONFER & QUIJANO-BLAS, 2003; SHIN et al., 2005; TORRES et al.,
2005) e induz a produção de citocinas por células dendríticas (JEANNIN et al.,
2005; TORRES et al., 2006). BARBOSA et al. (2006) demonstraram que a
proteína Loa22 recombinante apresenta capacidade limitada de adesão in vitro
a componentes da matriz extracelular como fibronectina plasmática e
colágenos do tipo I e IV, sugerindo que o domínio de Loa22 exposto na
membrana externa possa agir como adesina. Lipoproteínas de espiroquetas
podem agir como potentes mediadores da resposta inflamatória (CULLEN,
HAAKE & ADLER, 2004). Loa22 poderia então induzir manifestações clínicas
por induzir resposta imune no hospedeiro.
Foi proposto que proteínas da família OmpA têm um papel importante na
estabilização da estrutura do envelope bacteriano (KOEBNIK, 1995). Loa22,
contendo o motivo preditivo de associação ao peptidoglicano no domínio Cterminal (KOIZUMI & WATANABE, 2003), poderia formar uma ponte de ligação
entre o cilindro protoplasmático, entre a camada de peptidoglicano e a
membrana externa. Embora a cepa mutante loa22- tenha sido recuperada de
cobaios por isolamento do sangue e rins, não conhecemos ainda o papel desta
proteína na patogênese da leptospirose. Embora in vitro não tenham sido
observadas diferenças quanto ao crescimento das cepas testadas, não
sabemos se a ausência desta proteína na membrana pode afetar a estabilidade
da membrana externa in vivo.
O papel específico de Loa22 nas várias etapas da infecção, como a
sobrevivência da bactéria in vivo, o estímulo ao sistema imune, a adesão
durante a colonização ou a capacidade de invasão dos tecidos, permanece
80
especulativo e será objeto de futuros estudos. Uma melhor compreensão do
papel de Loa22, assim como estudos da sua estrutura e da sua utilização como
uma vacina de subunidade protéica poderão contribuir para o desenvolvimento
de novas estratégias de controle da leptospirose em humanos e animais.
6.2. PROJETO 2: FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR Leptospira spp.
O gênero Leptospira possui mais de 16 espécies patogênicas e
saprófitas (LEVETT, 2001). Embora saibamos que estas espiroquetas
sobrevivam em ambientes ou habitats diversos, não há um conhecimento
profundo sobre muitos aspectos da sua biologia, em particular a capacidade de
formar biofilmes. Os biofilmes bacterianos são estruturas complexas de uma
arquitetura bastante
dinâmica,
produzidos
por
inúmeras
espécies
de
microrganismos (HALL-STOODLEY, COSTERTON & STOODLEY, 2004).
No presente estudo, ambas as cepas patogênicas e saprófitas de
Leptospira foram capazes de formar biofilmes em superfícies abióticas quando
cultivadas em culturas estáticas. A progressão da formação de biofilme em
Leptospira assemelha-se a de outros biofilmes descritos na literatura, em um
processo que pode ser caracterizado em três etapas: (i) aderência de células
planctônicas individuais à superfície; (ii) maturação do biofilme, a qual
compreende a expansão para microcolônias e produção de matriz, com a
formação de uma estrutura tri-dimensional; e (iii) parcial ou completa perda do
biofilme por retorno à vida planctônica ou morte celular (HALL-STOODLEY,
COSTERTON & STOODLEY, 2004). A maioria das cepas testadas exibiu o
fenótipo de formação de biofilme quando cultivadas em um suporte abiótico de
vidro, sob condição estática e em temperatura ótima de 30°C, indicando que
este possa ser um fenótipo comum a estas espiroquetas. Os biofilmes foram
mais densos na região de interface ar-líquido, possivelmente pelas leptospiras
serem bactérias extremamente móveis e aeróbias obrigatórias. A diferença de
tempo para a formação de biofilmes em cepas saprófitas e patogênicas reflete
as taxas de crescimento destes dois grupos de leptospiras (FAINE et al., 2000).
Leptospiras podem perder a sua virulência depois de repetidas
passagens in vitro (HAAKE et al., 1991). Quando se avaliou a capacidade de
cepas patogênicas de baixa (BP) e alta passagem (AP) formarem biofilmes em
81
tubos, não foi possível tirar conclusões sobre a influência deste parâmetro, pois
tanto cepas BP quanto AP formaram biofilmes. Interessantemente, as três
cepas que não formaram biofilmes em tubos eram AP.
A formação de biofilmes por L. biflexa em placas de poliestireno foi
quantificada através da coloração por cristal violeta e também refletiu as três
etapas da formação do biofilme descritas acima, com um pico de formação em
48 h. O aumento de absorbância relativo à coloração por cristal violeta e à
produção de biofilme está correlacionado com o crescimento bacteriano no
meio de cultura e diminuiu na fase estacionária de crescimento. Os biofilmes de
L. interrogans mostraram-se menos aderentes em placas de poliestireno e não
resistiram às lavagens para eliminar bactérias planctônicas, mesmo se feitas
delicadamente. O lento crescimento de cepas patogênicas, bem como o
sistema utilizado de formação de biofilme em condições estáticas, podem ter
influenciado na adesão bacteriana a este suporte. Provavelmente um sistema
de crescimento de biofilmes em fluxo-contínuo poderia ser mais adequado para
a caracterização dos biofilmes de Leptospira spp..
A microscopia eletrônica do biofilme demonstrou tratar-se de um
material complexo, composto de uma rede de bactérias e material amorfo ou
matriz extracelular. Na MEV, as amostras são preparadas por fixação, coradas
e secas antes de serem observadas sob alto vácuo. Em outros biofilmes
bacterianos, a matriz é essencialmente composta de água, contendo também
polissacarídeos,
proteínas
e
ácidos
nucléicos
(HALL-STOODLEY,
COSTERTON & STOODLEY, 2004). A dessecação das amostras pode então
alterar a morfologia do biofilme. Por isso foram usadas outras técnicas de
microscopia eletrônica, como a crio-MEV e a MET, as quais revelaram uma
arquitetura tri-dimensional do biofilme, além das dimensões prováveis do
fenômeno in vitro. As técnicas de MEV e MET mostraram diferenças na
arquitetura do biofilme da cepa patogênica L. interrogans e saprófita L. biflexa
nas condições testadas. Estas diferenças podem estar correlacionadas com
diferenças filogenéticas ou de fisiologia entre cepas patogênicas e saprófitas.
Porém, podem apenas ser diferenças inerentes aos métodos utilizados nas
condições in vitro.
82
Os constituintes da matriz do biofilme de leptospiras ainda serão objetos
de estudos posteriores. Em biofilmes bacterianos, os polissacarídeos são o
segundo principal componente da matriz, após a água (HALL-STOODLEY,
COSTERTON & STOODLEY, 2004). O exopolissacarídeo alginato, um
polímero dos ácidos manurônico e glicurônico, parece ser o principal
polissacarídeo encontrado em biofilmes formados por P. aeruginosa (PIER et
al., 2004). Os genomas de Leptospira, incluindo o da saprófita L. biflexa
serovar Patoc cepa Patoc 1 (PICARDEAU et al., 2008), sugerem a presença de
inúmeros genes para a síntese de polissacarídeos (BULACH et al., 2006;
NASCIMENTO et al., 2004; REN et al., 2003). Existem aproximadamente 30
genes que codificam para as enzimas glicosil transferase putativas, as quais
sintetizam levanas e dextranas, nos genomas de Leptospira. Existem 11 genes
putativos para a biossíntese de alginato em L. biflexa e oito em L. interrogans,
mas surpreendentemente não há genes para a síntese de alginato em L.
borgpetersenii. Embora a cepa L. borgpetersenii de nossa coleção tenha
produzido biofilme em tubos, a ausência de genes putativos para a síntese de
alginato poderia contribuir à hipótese da capacidade reduzida desta espécie em
sobreviver no meio ambiente (BULACH et al., 2006). Os
genes
alg1
(LEPBIa2006) e alg2 (LEPBIa2008) de L. biflexa exibem 41 e 66% de
similaridade com o gene putativo para a proteína AlgJ de biossíntese de
alginato em Pseudomonas syringae e uma O-acetiltransferase de alginato de
Bacillus anthracis, respectivamente. Podemos hipotetisar que a ausência de
um fenótipo diferente quanto à formação de biofilmes para estes mutantes
pode ser devido à redundância funcional de outros genes de biossíntese de
alginato. Ao contrário do que já foi relatado para biofilmes de bactérias
flageladas como E. coli (WOOD et al., 2005), não foi observada diferença de
fenótipo quanto à formação de biofilme para o mutante flaB (gene LEPBIa1589;
PICARDEAU, BRENOT & SAINT GIRONS, 2001), o qual é deficiente em
síntese de endoflagelo; demonstrando que a integridade do endoflagelo de
leptospiras, o qual é localizado no periplasma bacteriano, bem como a
motilidade, não são essenciais para a formação de biofilme.
Foram feitas outras tentativas de mutagênese sítio-dirigida em L. biflexa
para os genes LEPBIa0352 (acil-UDP-N-acetilglucosamina O-acetilase),
LEPBIa0878 (N-acetilneuraminato-9-fosfato-sintase), LEPBIa1191 (proteína
83
flagelar FlgE), LEPBIa2001 (glicosiltransferase), LEPBIa2017 (transportador
ATPase do tipo ABC) e LEPBIa2041 (regulador de transcrição); porém não foi
possível a obtenção de eventos de recombinação homóloga para estes genes
(dados não demonstrados), impossibilitando a avaliação da sua importância
para a formação de biofilme.
Recentemente, foram identificados por triagem em meios de cultura
contendo diferentes fontes de ferro, mutantes de L. biflexa incapazes de usar
determinadas fontes de ferro para o seu metabolismo (LOUVEL, SAINT
GIRONS & PICARDEAU, 2005; LOUVEL et al., 2006). Usando uma estratégia
similar, como através da triagem por formação de biofilme em placa de
poliestireno, poderíamos identificar mutantes incapazes de formar biofilme e
assim identificar genes essenciais para a formação de biofilmes. Cerca de 250
mutantes de L. biflexa obtidos por mutagênese aleatória foram testados usando
um teste de triagem preliminar, porém não foram encontradas diferenças
flagrantes quanto ao fenótipo de formação de biofilmes (dados não
demonstrados).
L. interrogans é um importante patógeno para humanos e animais, mas
não foi previamente considerada como uma espécie bacteriana capaz de
formar biofilmes. As bactérias em um biofilme permanecem próximas entre si,
criando-se um ambiente onde se encontram protegidas de estresses
ambientais, como exposição aos raios UV, toxicidade a metais, variações de
pH, desidratação, ação de antibióticos e do sistema imune. Além disso,
bactérias crescendo sobre uma superfície encontram uma estabilidade no
ambiente de crescimento, o qual pode também ter funções catalíticas devido à
proximidade entre as células (HALL-STOODLEY, COSTERTON & STOODLEY,
2004). Biofilmes formados por múltiplas espécies de microrganismos podem
favorecer a transferência genética entre os microrganismos (WANG, CHI &
KURAMITSU, 2002).
Foi demonstrada a associação entre a leptospirose humana grave e a
exposição a altas concentrações de leptospiras em ambiente aquático, como
coleções de água doce (GANOZA et al., 2006). A formação de biofilmes pode
contribuir para a sobrevivência de leptospiras em água (TRUEBA et al., 2004).
Neste estudo, água mineral natural foi usada para a formação de biofilme por
L. biflexa. A capacidade de cepas patogênicas sobreviverem em ecossistemas
84
aquáticos através da formação de biofilmes pode ser um importante fator para
a sobrevivência destas cepas no ambiente e a sua transmissão. A colonização
dos túbulos contorcidos proximais dos rins de ratos experimentalmente
infectados com leptospiras patogênicas está associada à formação de
agregados (ATHANAZIO et al., 2008), possivelmente reproduzindo o que
ocorre durante a colonização de animais reservatórios. Logo, a formação de
biofilmes poderia também ter um papel importante na manutenção do estado
de portador renal em reservatórios.
Muitas são as perspectivas futuras para o estudo dos biofilmes de
Leptospira. A determinação da sua estrutura e composição será de
fundamental importância e experimentos em sistemas de fluxo contínuo
certamente melhorarão as condições de crescimento de biofilmes de cepas
saprófitas e patogênicas. A elucidação de mecanismos de colonização dos rins
de reservatórios animais, a saber, se tal processo se dá via formação de
biofilmes poderá contribuir definitivamente para uma melhor compreensão da
patogênese da leptospirose. A pesquisa de biofilmes em ambientes naturais
aquáticos será importante para a compreensão de mecanismos de persistência
e sobrevivência de leptospiras no meio ambiente.
85
7. CONCLUSÕES
De acordo com os objetivos determinados, as conclusões deste estudo
são:
- A proteína Loa22 foi identificada como o primeiro fator de virulência em
leptospiras. A interrupção do gene loa22 no genoma de L. interrogans serovar
Lai por mutação aleatória levou a atenuação da virulência, o que foi verificado
através da ausência de doença e óbito em cobaios e hamsters. A
complementação do gene restaurou o fenótipo de virulência, levando os
animais a óbito.
- Os animais infectados com a cepa mutante loa22- não apresentaram lesões
histopatológicas nos tecidos, enquanto que os animais infectados com a cepa
complementada loa22- / loa22+ TK2 apresentaram o amplo espectro de lesões
típicas da leptospirose, assim como os animais infectados com a cepa
selvagem.
- Loa22 é uma proteína expressa na superfície bacteriana e é reconhecida em
testes sorológicos pelo soro de pacientes.
- Loa22 possui características de lipoproteína e domínio C-terminal do tipo
OmpA com região putativa de ligação ao peptideoglicano.
- Uma ampla gama de espécies patogênicas e saprófitas de leptospiras foram
capazes de formar biofilmes in vitro.
- Os biofilmes de Leptospira possuem arquitetura complexa, com várias
camadas bacterianas interpostas e substância amorfa extracelular que interliga
as bactérias.
- Os biofilmes foram observados fortemente aderidos às superfícies abióticas
de vidro ou poliestireno ou em forma de película flutuante.
- A dinâmica de formação dos biofilmes de Leptospira seguiu as etapas já
descritas na literatura, de adesão de células planctônicas, maturação do
biofilme e destacamento das células.
- Dois tipos diferentes de arquitetura foram observados para os biofilmes das
cepas saprófita e patogênica.
- As tentativas de identificação de genes importantes para a formação de
biofilme, incluindo a análise dos genes alg1 e alg2, não resultaram em
86
diferenças claras de fenótipo, levando à conclusão de que outros genes devem
estar implicados no processo, resultando em redundância genética.
- O endoflagelo de leptospiras não foi necessário à formação do biofilme em L.
biflexa, como se constatou através da análise do mutante flaB.
87
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Patrick Ave4, Isabelle Saint Girons1, Albert I. Ko3,5, Mathieu Picardeau1*
1 Unité de Biologie des Spirochètes, Institut Pasteur, Paris, France, 2 Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Goes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, Brazil, 3 Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Brazil, 4 Unité de Recherche et d’Expertise Histotechnologie et Pathologie, Institut
Pasteur, Paris, France, 5 Division of International Medicine and Infectious Disease, Weill Medical College of Cornell University, New York, New York, United States of America
Pathogenic mechanisms of Leptospira interrogans, the causal agent of leptospirosis, remain largely unknown. This is
mainly due to the lack of tools for genetic manipulations of pathogenic species. In this study, we characterized a
mutant obtained by insertion of the transposon Himar1 into a gene encoding a putative lipoprotein, Loa22, which has
a predicted OmpA domain based on sequence identity. The resulting mutant did not express Loa22 and was
attenuated in virulence in the guinea pig and hamster models of leptospirosis, whereas the genetically complemented
strain was restored in Loa22 expression and virulence. Our results show that Loa22 was expressed during host
infection and exposed on the cell surface. Loa22 is therefore necessary for virulence of L. interrogans in the animal
model and represents, to our knowledge, the first genetically defined virulence factor in Leptospira species.
Citation: Ristow P, Bourhy P, Weykamp da Cruz McBride F, Pereira Figueira C, Huerre M, et al. (2007) The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS
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speculative. The lack of genetic tools to manipulate pathogenic Leptospira spp. has prevented testing of Koch’s
molecular postulates [12] and researchers have been unable
to elucidate the role of these determinants in virulence.
We recently provided evidence of gene transfer in L.
interrogans, which involved the transposition of a transposon
of eukaryotic origin [13]. This advance has now made it
possible to apply genetic approaches to the identification of
virulence determinants and vaccine candidates in pathogenic
Leptospira spp. In this study, we characterized a mutant of the
pathogen L. interrogans, which we obtained by random
transposon mutagenesis. This mutant exhibited transposon
insertion in a gene, loa22, which was described by Koizumi et
al. [14] as encoding for a lipoprotein (Loa22) of 22 kDa with a
C-terminal OmpA domain. Previous studies suggested that
this protein may play an important role in infection [14–17].
Herein, we show that the mutant loa22 strain is avirulent in
animal models, therefore demonstrating that Loa22 is
essential for in vivo infection of pathogenic leptospires.
Introduction
Leptospira interrogans is a spirochete responsible for leptospirosis. This disease, which is considered the most geographically widespread zoonosis, has emerged as a major
public health problem in developing countries [1–3]. Numerous mammalian species, including rodents, excrete the
pathogen in their urine and serve as reservoirs for transmission. Humans are usually infected through contact with
contaminated water or soil. Leptospirosis imparts its greatest
burden on poor rural farming and urban slum populations in
developing countries [1–3]. More than 500,000 cases of severe
leptospirosis occur each year, with a mortality rate of 5% to
20% [4]. Little is understood of Leptospira pathogenesis, which
in turn has hampered the identification of new intervention
strategies.
Leptospires are highly motile bacteria that are able to
penetrate skin and mucous membranes and rapidly disseminate to other tissues shortly after infection. In susceptible
hosts such as humans, systemic infection produces severe
multi-organ manifestations, including jaundice, acute renal
failure, and severe hemorrhage in the lungs and other organs.
However, in animal reservoirs such as the domestic rat,
infection produces chronic and persistent asymptomatic
carriage in the renal tubules [1–3].
The virulence mechanisms, and more generally the
fundamental understanding of the biology of the causative
agents of leptospirosis, remain largely unknown. To date,
only a few proteins have been identified as putative virulence
factors. Pathogenic leptospires have been shown to express
adhesins [5,6], hemolysins [7], and many lipoproteins prominent in leptospires and other spirochetes that could play a
role in host–cell interactions [8]. The recent completion of
the genome sequence of pathogenic Leptospira strains [9–11]
has provided a basis for understanding the pathogenesis of
leptospirosis. However, to date, the role of putative virulence
factors that were identified in the genome sequence remains
PLoS Pathogens | www.plospathogens.org
Results
Disruption and Complementation of loa22 in L.
interrogans Serovar Lai
Plasmid pMSL [13] was used to deliver the spectinomycinresistant Himar1 transposon into L. interrogans serovar Lai
strain Lai. One of the transposon mutants exhibited an
insertion in a putative gene, LA0222, encoding a protein (195
Editor: Michael R. Wessels, Children’s Hospital Boston, United States of America
Received April 9, 2007; Accepted May 17, 2007; Published July 13, 2007
Copyright: Ó 2007 Ristow et al. This is an open-access article distributed under the
terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted
use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author
and source are credited.
Abbreviation: ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay
* To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected]
0894
July 2007 | Volume 3 | Issue 7 | e97
Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
Author Summary
McCullough-Johnson-Harris (EMJH) medium, indicating that
genetic manipulation did not alter growth in vitro.
The spirochetes, which include medically important pathogens such
as the causative agents of Lyme disease, syphilis, and leptospirosis,
constitute an evolutionarily unique group of bacteria. Leptospirosis
is a zoonotic disease that causes a high rate of mortality and
morbidity in humans and animals throughout the world each year.
The year 2007 marks the centenary of the discovery of the causative
agent of leptospirosis, Leptospira interrogans. Until now, the genetic
obstacles posed by leptospires (principally, the difficulties in
generating targeted mutants) have hampered the identification of
virulence genes. In this study, we describe an avirulent mutant in a
pathogenic Leptospira that was obtained via disruption of loa22, a
gene that encodes an outer membrane protein containing an OmpA
domain. This mutation resulted in an avirulent mutant in the guinea
pig model, and reintroduction of loa22 into the mutant restored
Leptospira’s ability to kill guinea pigs. Our results therefore indicate
that loa22 is a virulence determinant that is, to our knowledge, the
first identified for this pathogen.
Loa22 Is a Surface-Exposed Protein
Immunofluorescence studies found that Loa22 is a surfaceexposed moiety (Figure 2). Antiserum to Loa22 labeled the
surface of live wild-type and complemented TK2 strains but
did not label the surface of the mutant loa22 strain. In
control experiments, antisera to LipL32 (Figure 2) and
LipL41 (unpublished data) labeled the surface of wild-type,
mutant loa22, and TK2 strains, indicating that the labeling
method was able to detect previously described surfaceexposed LipL32 and LipL41 [20], but not Loa22, in the
mutant loa22 strain. The procedure specifically detected
antibodies bound to the leptospiral surface: antisera to
LipL31, a previously described lipoprotein associated with
the inner membrane [20] (Figure 2), and cytoplasmic heatshock protein GroEL (unpublished data) did not label live
leptospires in this procedure, although the antisera strongly
labeled fixed, permeabilized leptospires (unpublished data).
These results indicate that Loa22 is a surface-exposed
component of the leptospiral outer membrane as previously
suggested [14].
amino acids in length) that was reported by Koizumi et al. [14]
to be Loa22, a 22-kDa Leptospira lipoprotein with an OmpA
domain; we will therefore refer to this protein henceforth as
Loa22. The L. interrogans serovar Lai protein (LA0222)
exhibits 99% and 96% similarity with orthologs in the
pathogens L. interrogans serovar Copenhageni (LIC_10191)
and L. borgpetersenii serovar Hardjobovis (LBL_2925 /
LBJ_0158), respectively.
The protein Loa22 exhibits a bipartite structure, which
includes an N-terminal domain (residues 1–77) that is
unrelated to other eukaryotic or prokaryotic protein domains, followed by an OmpA domain (residues 78–186).
According to SpLip [18], an algorithm for the prediction of
spirochetal lipoproteins, Loa22 is a possible lipoprotein with
an atypical Leu residue prior to Cys or a probable lipoprotein
with a cleavage site between residues 20 and 21, as indicated
by the LipoP algorithm for lipoprotein prediction in Gramnegative eubacteria [19]. C-terminal amino acid sequence
analysis of Loa22 revealed that other proteins of L. interrogans
(LA4337, LA3685, LA0056, LA3615, and LB328) have
sequence homology with members of the OmpA family.
These L. interrogans putative proteins, including Loa22, share
between 46% and 59% sequence similarity in their Cterminal domain, but they have significant amino acid
sequence heterogeneity in their N-terminal domains.
Because there is no replicative plasmid vector available for
pathogenic Leptospira, we reintroduced the wild-type copy of
the gene encoding Loa22 into the spectinomycin-resistant
mutant strain by using a kanamycin-resistant transposon
carrying loa22 (Figure 1C). Transposition within the chromosome is random, so we identified the transposon insertion
sites in several transformants and selected one strain, TK2,
for further studies (Figure 1A and 1B). Enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) (Figure 1D) and immunoblot
analysis (unpublished data) confirmed the absence of detectable Loa22 in the mutant loa22 strain, whereas the protein
was expressed in the wild-type and complemented strains
(Figure 1D). Inactivation of L. interrogans loa22 did not affect
cell morphology and motility. The wild-type, loa22, and TK2
strains had similar cell growth kinetics in liquid EllinghausenPLoS Pathogens | www.plospathogens.org
Virulence of the Mutant loa22 Strain Is Attenuated in
Experimental Animal Models
The guinea pig and hamster, the standard experimental
models for leptospirosis [1,2], were used to evaluate the
virulence of the wild-type, mutant loa22, and complemented
strains (Table 1). In two experiments, ten of fourteen and
eight of eight of the guinea pigs died when inoculated with
intraperitoneal challenges of 2 3 108 and 4 3 108 wild-type
bacteria, respectively. Infected guinea pigs developed leptospirosis with characteristic signs such as prostration and
jaundice (Figure 3), and died within 4 to 6 d after the infection
(Table 1).
In contrast, the mutant loa22 strain demonstrated loss of
virulence, as reflected by the inability of challenge doses of 2 3
108 and 4 3 108 bacteria to produce death in guinea pigs (14
and eight animals, respectively) (Table 1). The difference in
mortality was significantly lower for animals challenged with
the loa22 than those challenged with the wild-type strains
(0% versus 71% and 0% versus 100% in experiments 1 and 2,
respectively, p , 0.05). Guinea pigs infected with the loa22
strain did not demonstrate clinical signs of leptospirosis
during the 21-d follow-up period. The mutant loa22 strain
was isolated from blood at post-challenge day 3 in four of four
infected guinea pigs that were infected with 2 3 108 bacteria
in a separate experiment. In addition, the loa22 strain was
isolated from the kidneys of five of seven guinea pigs killed at
post-challenge day 21 (experiment 1, Table 1). However,
cultures of kidneys from animals infected with the loa22
mutant required an incubation period of more than 2 wk to
test positive for the bacteria, suggesting that the number of
viable leptospires in these tissues was low. In addition, when
cultures of livers of guinea pigs infected with the wild-type
strain were positive for infection, we were not able to isolate
the loa22 strain by culture of liver tissues from seven guinea
pigs killed at post-challenge day 21. These findings indicated
that although the mutant did not induce disease, it was able to
cause bacteremia and colonization following infection.
Sequential in vivo passaging and re-isolation of the loa22
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Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
Figure 1. Disruption and Complementation of loa22 in L. interrogans
(A and B) Analysis of chromosomal DNA from the parental (lane 1), mutant loa22 (lane 2), and complemented TK2 strains (lane 3) by PCR with primers
S1a and S1b (A) and Southern blot of EcoRI-digested DNA probed for hybridization with the spectinomycin (SpcR)- and kanamycin (KmR)-resistant
cassettes (B). Primers S1a and S1b are located in the flanking sequences of the insertion site of the spectinomycin-resistant transposon into loa22. This
analysis revealed that there was an insertion of 1.3 kb in the mutant loa22 strain and that an additional copy of loa22 was present in the
complemented strain.
(C) Schematic representation of the genotype of the parental (wt), mutant, and complemented strains. Arrowheads in white indicate the position of
EcoRI sites.
(D) ELISA of plates with total bacterial antigens and Loa22 antiserum (serum dilution 1:800).
doi:10.1371/journal.ppat.0030097.g001
among guinea pig groups challenged with the wild-type and
TK2 strains. DNA was extracted from TK2 strains that were
used to challenge guinea pigs and TK2 strains that were reisolated from guinea pigs during autopsy. Southern blot and
PCR analyses demonstrated that these isolates had the
complemented loa22 genotype and the spectinomycin and
kanamycin cassettes (unpublished data), indicating that the
observed restoration in virulence was not due to contamination of inoculating cultures with the wild-type strain.
strain from blood or tissues of infected guinea pigs (seven
cycles in total) failed to recover a virulent isolate that could
induce clinical disease or death in guinea pigs.
Complementation of loa22 restored the virulence phenotype of the mutant loa22 strain in the guinea pig infection
model. Challenge doses of 2 3 108 and 4 3 108 of TK2 bacteria
caused death in 43% and 75%, respectively, of the inoculated
animals (Table 1). Deaths occurred 5 to 9 d after challenge.
There were no significant differences between the death rates
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Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
Figure 2. Surface Localization of Loa22
Surface immunofluorescence assay was performed with L. interrogans wild-type strain (wt), mutant loa22 (loa22), and mutant loa22 complemented
with wild-type loa22 (TK2). Strains were labeled with antibodies against Loa22 and the following lipoproteins: LipL32, a surface-exposed lipoprotein
[20], and LipL31, a lipoprotein that is associated with the inner membrane and not surface-exposed [20]. Alexa and fluorescein isothiocyanate (FITC)–
conjugated secondary antibodies were used to detect surface-bound antibodies to Loa22 and LipL32 and LipL31, respectively. A DAPI counterstain was
used to document the presence of leptospires. A photomicrograph is shown from one of three representative experiments.
doi:10.1371/journal.ppat.0030097.g002
Hamsters were challenged with wild-type, mutant loa22,
and TK2 strains to confirm the findings observed in the
guinea pig model. Inoculation with 108 and 5 3 107 wild-type
bacteria induced death in 100% and 90%, respectively, of the
animals (Table 1, experiments 3 and 4, respectively). In
contrast to what was observed in the guinea pig model,
challenge with mutant loa22 bacteria caused death in one of
ten hamsters in the two experiments. Autopsy evaluation
performed in experiment 4 found that the hamster died from
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manifestations of leptospirosis. However, death rates were
significantly lower (10% versus 100%, p ¼ 0.00011; and 10%
versus 90%, p ¼ 0.001 for experiments 3 and 4, respectively)
for hamsters challenged with loa22 than those challenged
with wild-type strains. Challenge with the TK2 strain
produced death in 60% (six of ten) and 80% (eight of ten)
of the hamsters in experiments 3 and 4, respectively,
indicating that as in the guinea pig model, complementation
of loa22 in the mutant strain partially restored virulence.
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Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
Table 1. Virulence of L. interrogans Serovar Lai Strain Lai and Its Derivatives in the Guinea Pig and Hamster Infection Models
Experiment
Bacterial
Straina
Number of
Animals Infected
Number of Animals
That Died
Time to Death
(Days)
p-Valueb
Experiment 1: Guinea pigs; challenge dose, 2 3 108
wt
loa22
TK2
wt
loa22
TK2
wt
loa22
TK2
wt
loa22
TK2
14
14
14
8
8
8
10
10
10
10
10
10
10
0
8
8
0
6
10
1
6
9
1
8
5,5,5,5,5,5,5,5,5,6
—
5,5,5,6,6,7,8,9
4,4,4,4,4,4,4,4
6,6,6,7,8,8
7,7,7,7,7,7,7,7,7,8
8
9,10,12,17,20,21
7,7,7,7,7,7,8,9,15
8
7,7,8,8,9,9,10,14
—
0.00015
NS
—
0.00015
NS
—
0.00011
NS
—
0.001
NS
Experiment 2: Guinea pigs; challenge dose, 4 3 108
Experiment 3: Hamsters; challenge dose, 108
Experiment 4: Hamsters; challenge dose, 5 3 107
wt, wild-type strain; loa22, mutant loa22; TK2, complemented strain.
Fisher test was performed to determine if there was a significant difference in mortality between the wt and other strains.
NS, nonsignificant.
doi:10.1371/journal.ppat.0030097.t001
a
b
Mutant loa22 Strain Does Not Produce Tissue Pathology
in the Guinea Pig Model
hemorrhage was observed in kidneys, and multi-focal
hemorrhage was seen in lungs, stomachs, and intestines
(unpublished data). Splenomegaly was observed, as well as
jaundice of the liver and subcutaneous, ascites, and hemothorax. None of these findings was observed, except for
Necropsy evaluation of guinea pigs infected with wild-type
strain at post-challenge days 5 and 6 found macroscopic
lesions associated with leptospirosis (Figure 3A). Diffuse
Figure 3. Gross Examination of Infected Guinea Pigs
Left panel: Guinea pigs infected with the wild-type (A) and complemented strains (C) with clinical findings of jaundice and hemorrhages that are absent
in guinea pigs infected with the mutant loa22 strain (B).
Right panel: Lungs of a guinea pig infected with mutant loa22 did not exhibit macroscopic hemorrhage (B), in contrast with lungs of guinea pigs
infected with the wild-type (A) and complemented strains (C). Tissues were observed 6 d post-inoculation.
doi:10.1371/journal.ppat.0030097.g003
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Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
Figure 4. Livers and Kidneys from Guinea Pigs Infected with the Wild-Type Strain and Mutant loa22 Strain
All images are from guinea pigs 6 d post-inoculation. The right panels show normal livers (A–C) and kidneys (D and E). Tissues were stained by
hematoxylin and eosin (3200, [A and D]), Warthin–Starry (31000, [B and E]) and immunohistochemistry with antiserum specific to LipL32 (3200, [C]). Left
panel, wild-type strain (wt); middle panel, mutant loa22 strain.
(A–C) Livers of wt-infected animals exhibit important periportal lymphoplasmocitary inflammatory infiltration, loss of parenchymal architecture, and
increase of biliary canalicules in comparison with a normal aspect of mutant loa22. Distortion of liver cords is related to numerous leptospires along
cell membranes of hepatocytes (arrow, [B]) in wt-infected animals.
(D and E) Kidneys of wt-infected animals present hemorrhages in Bowman’s spaces, lumen of renal tubules, and interstitium (D). A large number of
leptospires is seen in Bowman’s space (arrow), sometimes forming a cap (E). Histology of kidneys infected with mutant loa22 was considered as normal
(D and E).
doi:10.1371/journal.ppat.0030097.g004
with polymorphonuclear and mononuclear cells was a
prominent finding in lung sections (unpublished data).
However, infection with mutant loa22 strain produced
markedly reduced or absent inflammatory responses and
tissue pathology in guinea pigs on post-challenge day 6
(Figure 4). Liver tissues demonstrated mild parenchymal
dystrabeculaton and periportal infiltrates without focal
necrosis or hemorrhage (Figure 4A, middle panel). Kidneys,
spleens, and lungs from mutant-infected animals exhibited
sparse or absent inflammatory infiltrates. Infection with the
TK2 strain, in which loa22 was complemented, produced
splenomegaly, in necropsies of guinea pigs infected with the
mutant loa22 strain (Figure 3B). Infection with the TK2
strain, in which loa22 was complemented, produced the
complete spectrum of gross lesions observed in infections
with wild-type strain (Figure 3C).
Hematoxilin and eosin staining of sectioned lung, kidney,
spleen, and liver from guinea pigs infected with the wild-type
strain demonstrated characteristic histopathologic findings
for leptospirosis (Figure 4). Spleens were hemorrhagic, with
focal necrosis in the red pulp (unpublished data). Intraalveolar hemorrhage associated with interstitial infiltration
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Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
and 4C, left panel) and kidneys (Figure 4E, left panel) of
guinea pigs infected with the wild-type strain at postchallenge day 6. Sparse numbers of leptospires were found
in the interstitial and alveolar spaces of the lungs. In contrast,
leptospires were not detected in tissues of guinea pigs
infected with the loa22 strain at post-challenge days 6
(Figure 4B, 4C, and 4E, middle panel) and 21. In sectioned
kidneys and livers from guinea pigs infected with the
complemented TK2 strain (Figure 5), immunohistochemical
analyses identified leptospires in numbers similar to those
observed for wild-type infections. Antiserum to Loa22 stained
all wild-type (Figure 6) and TK2 (unpublished data) leptospires found in kidney and liver sections, demonstrating that
this protein is expressed during acute leptospirosis.
Discussion
The recent completion of the genome sequences of
pathogenic Leptospira strains has led to the identification of
putative determinants that may play a role in virulence [9–
11]. One such determinant, loa22, is up-regulated during host
infection [17] and encodes a lipoprotein with an OmpA
domain [14] that is strongly recognized by sera from human
leptospirosis patients [15]. Furthermore, Loa22 is conserved
among pathogenic Leptospira [14–16], suggesting that it may
play a specific role in disease pathogenesis. However, its role
has not been elucidated until now, because targeted mutagenesis was not previously feasible in pathogenic Leptospira.
Recently, we showed that the Himar1 mariner transposon
permits random mutagenesis in the pathogen L. interrogans
[13]. In search of mutants that might be affected in virulence,
we identified an L. interrogans mutant exhibiting Himar1
insertion into loa22. By analysis of the loa22 strain, we now
show that Loa22 is required for virulence of the pathogen
within animal models and fulfills the molecular Koch’s
postulates [12] as a virulence factor.
Complementation of the virulence phenotype of the loa22
strain by chromosome insertion of loa22 demonstrated that
the virulence defect was due to the inactivation of loa22 and
not to a second-site mutation. Transcriptional data and
sequence analysis of the transposon insertion sites in the
mutant and complemented strains further confirm that
Himar1 insertion did not affect another gene that could be
involved in virulence (unpublished data). The parental and
Figure 5. Histopathologic sections on Liver, Kidney, and Lung of Guinea
Pigs Infected by Complemented Strain TK2 6 d Post-Inoculation
Left panel: Hematoxylin and eosin staining (3200) of infected guinea
pigs. Right panel: Immunochemistry with antiserum specific for LipL32
(3200; except [C], 31,000). Pictures of histopathology were similar
between animals infected with wild-type and complemented strains.
(A) The liver has a great loss of architecture and areas of necrosis and
inflammatory infiltration, which are both associated with the presence of
numerous leptospires.
(B) Kidneys present hemorrhages, tubular necrosis, and inflammatory
infiltration, with leptospires mainly located in Bowman’s spaces and
proximal tubules.
(C) Lungs have marked intra-alveolar hemorrhages with inflammatory
infiltrates, and few leptospires are present within septal membranes and,
sometimes, in macrophages ([C], right panel).
doi:10.1371/journal.ppat.0030097.g005
similar pathological findings as observed for the wild-type
strain (Figure 5).
Silver staining and immunohistochemistry demonstrated
the abundant numbers of leptospires in the livers (Figure 4B
Figure 6. In Vivo Expression of Loa22 in Liver and Kidney of Guinea Pigs Infected with L. interrogans Serovar Lai
(A) Liver, (B) kidney. Histopathologic sections were stained by immunochemistry using Loa22 antiserum (31,000). Intact organisms were found in biliary
ducts (A) and in large number in Bowman’s spaces and proximal tubules (B). Scale bar ¼ 20 lm.
doi:10.1371/journal.ppat.0030097.g006
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Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
rates (10% versus 100%, mutant versus wild-type strain,
respectively) but did not lead to complete loss in the ability to
produce a lethal infection. The observed differences may
reflect intrinsic differences in susceptibility of the two animal
models to infection with the strain L. interrogans serovar Lai,
which was used in this study.
Our results demonstrate that Loa22 is exposed on the
surface of L. interrogans, confirming the localization of the
protein to the outer membrane [14]. The structure of Loa22 is
composed of a C-terminal OmpA domain of approximately
110 amino acids. This OmpA domain refers to the C terminus
of Escherichia coli OmpA, a major outer membrane protein of
E. coli. Orthologs of the OmpA domain are found in proteins
from a wide range of bacterial species. Predictions for the
structure of this C-terminal OmpA domain have ranged from
that of a globular domain containing a predicted peptidoglycan-associating motif that is located in the periplasm
[22,23], to a domain containing a significant proportion of
anti-parallel b sheets that are associated with the outer
membrane [24,25]. The N-terminal domain of E. coli OmpA
was crystallized as a b-barrel–structured porin, which is
believed to be inserted into the outer membrane [26].
However, this N-terminal region has no significant sequence
similarity to Loa22. Because there is no sequence similarity
between Loa22 and other OmpA-like proteins in this Nterminal region, these proteins may be structurally distinct.
The role of Loa22 during pathogenesis remains to be
determined. The OmpA protein of E. coli and other Gramnegative bacteria are believed to play a multifunctional role
in bacterial physiology and pathogenesis. In Gram-negative
bacteria, OmpA has been shown to be an adhesin [27–29] and
to induce cytokine production by dendritic cells [30,31]. In a
recent study, recombinant Loa22 was shown to bind in vitro
to a limited extent with components of the extracellular
matrix such as plasma fibronectin and collagen types I and IV
[5], suggesting that the surface-exposed domain of Loa22
may, in fact, act as an adhesin. Furthermore, the lipopeptide
moieties of spirochetes are potent mediators of the inflammatory response [8]. Loa22, which has a lipobox sequence,
may therefore induce severe disease manifestations by
eliciting the host immunopathogenic responses.
Proteins of the OmpA family have been proposed to play a
role in the stabilization of the envelope structure [23]. Loa22 ,
which includes a predicted peptidoglycan-associating motif
in its C-terminal domain [14], may form a bridge linking the
protoplasmic cylinder, including the peptidoglycan layer, and
the outer membrane. Although the loa22 strain was
recovered from the animal, we cannot rule out that the
absence of this protein in the membrane may affect several
steps in host infection, such as the stability of the outer
membrane, survival of the leptospiral pathogen in vivo, and
the ability to penetrate tissues during dissemination or
adhere during colonization.
In conclusion, this study identified the first virulence
factor, to our knowledge, in pathogenic Leptospira and will
form the basis for further investigation of the role that Loa22
plays in leptospiral pathogenesis. Furthermore, Loa22 is
expressed on the leptospiral surface, suggesting that immunization with this protein may elicit bacteriocidal or pathogenesis-blocking immune responses. Bacterin-based vaccines
have been used in some countries but they present a number
of disadvantages, including adverse reactions, short duration
mutant strains of L. interrogans showed similar cell morphology and growth characteristics in vitro, which demonstrates
that loa22 is not essential for in vitro growth. Although there
was no statistical difference in death rates among animals
challenged with wild-type and complemented strains, infections with the complemented strain did not cause death in all
animals. The inability to restore complete virulence (100%
lethality) in the complemented strain did not appear to be
due to instability of the construct, because the complemented
strain resulted from chromosome insertion. The complemented strain that was re-isolated from animals expressed
Loa22. In addition, infection with another strain, TK1, for
which the loa22 gene was complemented at another chromosomal site, caused death rates in guinea pigs (six of eight
guinea pigs; challenge dose: 4 3 108 bacteria/ml ), which was
not significantly different from results obtained for infections
with the TK2 strain (Table 1). The complemented strains were
subjected to more in vitro passages than the wild-type strain
due to electroporation-mediated transformation followed by
plating onto solid medium. Leptospires are known to lose
their virulence phenotype with prolonged in vitro culture
passages [21], although the mechanism for this loss is not well
understood. It is also possible that the complemented loa22
gene did not attain the optimal level of expression required
for the virulence phenotype.
Infection with L. interrogans produces a lethal infection in
the standard hamster and guinea pig model and mimics the
clinical presentation of severe leptospirosis in humans (i.e.,
jaundice and pulmonary hemorrhage) [1–3]. Loss of loa22
attenuated the ability of leptospires to cause clinical disease
in addition to death in guinea pigs and hamsters. Consistent
with the lack of disease manifestations, mildly abnormal or no
pathologic changes were observed in tissues of guinea pigs
infected with the loa22 strain. Although the loa22 strain was
recovered by culture isolation from blood on post-challenge
day 3 and in kidneys of guinea pigs during the 21-d postinoculation period, immunohistochemical analysis did not
detect leptospires in these tissues, suggesting that loss of the
loa22 genotype reduced the pathogen burden in tissues
during infection. The lack of tissue pathology observed in
loa22-infected animals presumably reflects decreased inflammation elicited by lower numbers of leptospires. Loa22 may
influence one of several virulence steps during infection, such
as the ability to disseminate throughout the host after
inoculation, adhere to host cells, and establish persistent
infection, which may, in turn, explain the finding that mutant
loa22 strain did not achieve sufficient numbers in tissues to
produce disease manifestations and pathology. The standard
inoculation method used in animal models of leptospirosis—
intraperitoneal injection—may not reflect conditions encountered during natural infection, because leptospires enter
the host by penetrating breaks in the skin or traversing the
mucosal membranes. Further studies that use subconjunctival
or subcutaneous challenge routes will need to be performed
to determine whether Loa22 plays a role in the initial steps of
infection.
The process of host infection by pathogens is usually
complex and multifactorial. We observed that loss of loa22
genotype was associated with complete loss of virulence in the
guinea pig model, as indicated by the inability to induce
death in these animals. In hamsters, infection with the mutant
loa22 strain was associated with significantly reduced death
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July 2007 | Volume 3 | Issue 7 | e97
Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
anti-rat IgG antibodies conjugated to fluorescein isothiocyanate
(Jackson ImmunoResearch Laboratories, http://www.jacksonimmuno.
com/) for 1 h at 37 8C. The slides were washed twice with PBS-BSA and
incubated with 1 lg/ml DAPI (Molecular Probes) for 1 h at room
temperature. The slides were mounted in anti-fading solution after
washing and before visualization of stained organisms with fluorescence microscopy.
Animal infections. Golden Syrian male hamsters, 5 to 8 wk old, and
Hartley male guinea pigs (Charles River Laboratories, http://www.
criver.com/), 2 to 3wk old, were used for this study. Animals were
maintained under standard conditions according to institutional
guidelines. Water and food were given ad libitum. All animal
infections were performed with intraperitoneal injection of lowpassage strains in 1 ml of EMJH medium. Negative control animals
were injected intraperitoneally with 1 ml of EMJH medium. Animals
were monitored daily for characteristic signs of leptospirosis (i.e.,
prostation and jaundice) and survival. Surviving animals were killed
after a 21-d post-challenge follow-up period. The 50% lethal dose
(LD50) for L. interrogans serovar Lai in 2- to 3-wk-old guinea pigs and
5- to 8-wk-old hamsters was approximately 108 and 107 leptospires,
respectively. Protocols for animal experiments were prepared
according to the guidelines of the Animal Care and Use Committees
of the Institut Pasteur and Fundação Oswaldo Cruz.
Histopathology. Guinea pigs were inoculated with 2 3 108 bacteria
of wild-type, mutant loa22, and complemented strains of L.
interrogans serovar Lai strain Lai or EMJH alone. For mutant loa22
strain and EMJH control group infections, three guinea pigs were
killed 6 and 21 d post-inoculation. For wild-type and TK2 strain
group infections, tissues were collected at the day of death (5 or 6 d
post-inoculation). Tissues (liver, kidneys, spleens, and lungs) were
fixed in 10% buffered formaldehyde, embedded in paraffin, and
sectioned according to routine histological procedures to produce 5lm sections that were then stained with hematoxylin and eosin and
Warthin–Starry silver impregnation [36]. For immunohistochemistry,
paraffin was removed from the sections with xylene and ethanol.
Tissues were then treated in citrate buffer (pH 6) at 98 8C for 1 h and
nonspecific sites were blocked by incubation of sections with 1.5%
BSA at room temperature for 20 min. Tissues were incubated with
6,000- and 1,000-fold dilution of LipL32 [37] and Loa22 [14] antisera,
respectively, overnight at 4 8C. Samples were treated with 0.3%
hydrogen peroxide for 30 min at room temperature, then incubated
at room temperature for 30 min with goat anti-mouse or anti-rabbit
antibodies conjugated to peroxidase (Dako Cytomation, http://www.
dako.com/). Enzyme reactions were developed using AEC (3-Amino-9ethylcarbazole) staining kit (Sigma). The pathologist viewed the
histopathological preparations without knowing the infection status
of the animals.
of efficacy, and lack of protection against serovars not
included in the vaccine preparations [1–3]. A better understanding of the role of Loa22 may facilitate identification of
defined and more effective subunit vaccine candidates for
leptospirosis.
Materials and Methods
Bacterial strains and growth conditions. L. interrogans serovar Lai
strain Lai 56601 (gift from the National Institute for Communicable
Disease Control and Prevention, ICDC China CDC) and other
Leptospira strains were grown at 30 8C in EMJH [32,33] liquid medium
or on 1% agar plates. E. coli was grown in Luria-Bertani (LB) medium.
When necessary, spectinomycin or kanamycin was added to culture
media at 50 lg/ml.
Construction of mutant and complemented strains. Random
insertion mutagenesis was carried out in low-passage L. interrogans
serovar Lai strain Lai 56601 with plasmid pMSL as previously
described [13]. After 4 to 6 wk of incubation, spectinomycin-resistant
transformants were inoculated in liquid medium. Genomic DNA was
then extracted, and the transposon insertion site of each transformant was identified by ligation-mediated PCR as previously
described [34]. Among the transformants, we selected a mutant with
an insertion into loa22, also called LA0222, at position 220548 in the
large chromosome (CI) of L. interrogans for further characterization.
For complementation, loa22 was amplified with primers OMIA (59AGTCGACGGTTTTGGTGGGATGGATAG-39) and OMIB (59-AGTCGACAGACGTTGAGTTGCCACAGC-39) and cloned into the SalI
restriction site of the kanamycin-resistant transposon carried by
plasmid pMKL, resulting in plasmid pMKLoa22. The mutant loa22
strain was then electrotransformed by pMKLoa22, and the transposon
insertion site of some transformants was identified as described
above. Two transformants, strains TK1 and TK2, were further studied;
one, strain TK1, exhibited the kanamycin-resistant transposon at
position 1079614 (between LA1074 and LA1075), and the other, strain
TK2, at position 84051 (into LA0071) of the large chromosome of L.
interrogans. Confirmation of genotypes was performed by using PCR
with primers S1a (59-TTGTTGTGGTGCGGAAGTCG-39) and S1b (59GGTCCCGAACAAGCAGAAGG-39), which are located in the flanking
sequences of the transposon inserted into loa22, and Southern blots.
Enzyme-linked immmunosorbent assay (ELISA). L. interrogans
strains were grown in EMJH until the culture reaches an optical
density at 420 nm (OD420) of 0.4. L. biflexa was also used a control.
Concentrations were adjusted to 109 bacteria/ml in a volume of 20 ml
of EMJH, and 40 ll of 37% formaldehyde was added, then incubated 2
h at room temperature and boiled for 30 min. After adjusting pH at
9.6, cultures were centrifuged at 8,000g for 20 min and pellets were
resuspended in 10 ml of 0.05 M bicarbonate buffer. Ninety-six–well
flat-bottom polystyrene assay plates (Immulon, VWR, http://www.vwr.
com/) were coated overnight at 4 8C with 50 ll of total bacterial
antigen.
Plates were washed three times with phosphate buffered saline
(PBS) (pH 7.2) and wells were blocked with 50 ll of 5% nonfat milk
PBS for 45 min at 37 8C. Plates were incubated 45 min at 37 8C with 50
ll of an 800-fold dilution of mouse polyclonal antiserum to Loa22
[14] diluted in milk PBS, washed, and incubated for 1 h at 37 8C with
50 ll of a 2,500-fold dilution of horseradish peroxidase–conjugated
sheep affinity–purified antibody specific to mouse immunoglobulin G
(IgG) (Promega, http://www.promega.com/). After washing of the
plates, 50 lL of ABTS peroxidase substrate (Roche, http://www.
roche.com/) was added, and the plates were incubated in the dark at
room temperature for 25 min. Optical density was measured using an
ELISA reader (Labsystems Multiskan MS; Thermo Scientific, http://
www.thermo.com/) at 405 nm.
Localization of Loa22 by immunofluorescence. Surface immunofluorescence labeling was performed according to a modified
protocol of Cullen et al. [35]. Suspensions of 107 live leptospires in
10 ll of PBS were placed onto poly-L-lysine–coated (Sigma, http://
www.sigmaaldrich.com/) slides for 1 h in a humidified chamber. The
slides were washed twice with PBS with 2% bovine serum albumin
(PBS-BSA) and were incubated for 1 h with antisera (diluted 1:100 in
PBS-BSA) to recombinant Leptospira proteins. After incubation with
mouse antiserum to Loa22 [14] and rat antisera to LipL32, LipL41,
LipL31, and GroEL, the slides were washed gently with PBS-BSA.
Leptospires were fixed by applying cold methanol and incubating the
slides for 10 min at 20 8C. The slides were then washed and
incubated with donkey anti-mouse IgG antibodies conjugated to
Alexa dye (Molecular Probes, http://probes.invitrogen.com/) or goat
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Supporting Information
Accession Numbers
The Entrez Genome (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?
db¼Genome) accession numbers for the genes and gene products
discussed in this paper are L. borgpetersenii serovar Hardjobovis
(NC_008508 and CP000348), L. interrogans serovar Copenhageni
strain Fiocruz L1–130 (AE016823), and L. interrogans serovar Lai strain
Lai 56601 (NC_004342).
Acknowledgments
We are thankful to N. Koizumi for the generous gifts of Loa22
antiserum and plasmid construct for production of Loa22 recombinant and to G. P. Zhao for providing the Lai sequenced strain. We are
thankful to L. S. Fonseca and W. Lilembaum for their support and
encouragement. This work is part of the doctoral thesis of P. Ristow
at the Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil.
Author contributions. PR, PB, MH, ISG, AIK, and MP conceived
and designed the experiments. PR, PB, FWdCM, CPF, PA, and MP
performed the experiments. PR, AIK, and MP wrote the paper.
Funding. This work was supported by the French Ministry of
Research ‘‘ANR Jeunes Chercheurs’’ (n805-JCJC-0105–01), Fiocruz–
Pasteur scientific cooperation program, Brazilian National Research
Council (300861/1996, 420067/2005, 554788/2006), and the National
Institutes of Health/US (TW00919). PR was supported by a fellowship
from the CAPES, Brazil, and the Fiocruz–Pasteur scientific cooperation program.
Competing interests. The authors have declared that no competing
interests exist.
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Virulence Attenuation in Leptospira interrogans
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MÉMOIRE
LA LEPTOSPIROSE: LES DÉFIS ACTUELS D’UNE ANCIENNE MALADIE
LEPTOSPIROSIS: CURRENT CHALLENGES OF AN OLD DISEASE
Par Paula RISTOW(1)(2)
(mémoire présenté le 26 avril 2007)
RÉSUMÉ
La leptospirose, maladie infectieuse atteignant l’homme et les animaux, est considérée comme la zoonose la plus répandue dans le monde ; chaque année, elle est responsable de graves épidémies dans
les pays tropicaux et en voie de développement. Son agent causal, Leptospira interrogans, est un spirochète de forme hélicoïdale, extrêmement mobile. Le tableau clinique varie du fait de la diversité
du genre Leptospira et d’une épidémiologie complexe. Les leptospiroses animales touchent plusieurs
espèces de mammifères qui développent majoritairement des formes chroniques de la maladie et
deviennent ainsi des réservoirs de l’agent infectieux. La forme humaine ou maladie de Weil, dont le
taux de mortalité est élevé, est provoquée par les leptospires du sérogroupe Icterohaemorrhagiae.
La vaccination de l’homme et des animaux a des effets limités car les vaccins utilisés sont spécifiques
du sérovar et n’offrent qu’une protection de courte durée. Le test de microagglutination (MAT) présente des inconvénients comme l’impossibilité d’identifier la phase précoce de la maladie mais des
progrès diagnostiques sont encore envisageables. En effet, le récent séquençage du génome des leptospires et le développement d’outils génétiques spécifiques marquent le début de l’ère post-génomique dans la recherche sur les spirochètes. Nos efforts portent actuellement sur la compréhension
des mécanismes de virulence des leptospires, ainsi que sur la mise au point de tests diagnostiques et
de vaccins plus performants. L’Unité de Biologie des Spirochètes, de l’Institut Pasteur de Paris, vient
d’identifier un facteur de virulence des leptospires, une protéine de la famille OmpA, Loa22, exposée à la surface de la bactérie. La protéine Loa22 est un candidat pour le développement d’un vaccin.
Mots-clés : leptospirose, épidémiologie, facteur de virulence, génétique, protéine OmpA, Loa22.
SUMMARY
Leptospirosis is an infectious disease which affects man and animals, and is considered as the most
common zoonosis worldwide. Every year, it is responsible for serious epidemics in tropical and developing countries. The pathogen is Leptospira interrogans, an extremely mobile and helicoidal spirochete. The clinical presentation of leptospirosis varies due to the diversity within the genus Leptospira
and its complex epidemiology. Several mammal species may develop leptospirosis, mainly in its chronic
form, and thus act as reservoirs for the disease. Human leptospirosis, or Weil’s disease, has a high mortality rate and is caused by Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae. The vaccination
of man and animals has limited effects because vaccines are specific to the serovar and induce only
a short-term immunity. The microagglutination test (MAT) used for the diagnosis of leptospirosis also
has limitations, such as the inability to identify the early stage of the disease. However, progress is
expected in diagnostic procedures, as the recently sequenced genome of Leptospira and the development of specific genetic tools mark the beginning of the post-genomic era in research on spirochetes. Our efforts are currently turned towards the understanding of leptospiral virulence mechanisms, as well as the development of more effective vaccines and diagnostic tests. The Spirochetes’
Biology Unit at Institut Pasteur, Paris, has just identified the first leptospiral virulence factor, Loa22,
a protein of the OmpA family exposed on the cell surface of the bacteria. Loa22 is a candidate for
the development of a vaccine.
Key words: leptospirosis, epidemiology, virulence factor, genetics, OmpA protein, Loa22.
(1) Chercheuse à l’Unité de Biologie des Spirochètes, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris CEDEX 15.
(2) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes. CEP: 21941-902. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. E-mail: [email protected]
Bull. Acad. Vét. France — 2007 - Tome 160 - N°4 www.academie-veterinaire-defrance.org/
267
MÉMOIRE
DE LA MÉSOPOTAMIE À L’INSTITUT
PASTEUR DE MARTIN ET PETTIT
La leptospirose est une zoonose à multiples facettes, causée par
les bactéries du genre Leptospira. Dans cette revue, nous traiterons des particularités métaboliques et pathogéniques des leptospires, depuis leur découverte par Stimson en 1907 jusqu’à l’ère
post-génomique et les récentes avancées de la recherche dans
le domaine.
La leptospirose a été décrite pour la première fois en 1886, de
manière claire et irréfutable, par le médecin allemand Adolf
Weil, dans un article intitulé : « Au sujet d’une maladie infectieuse caractéristique qui provoque splénomégalie, néphrite et
ictère». Suite à la description de la forme grave de la leptospirose
humaine causée par le sérogroupe Icterohaemorrhagiae, elle a
été nommée Maladie de Weil (Faine et al. 1999).
Stimson, en 1907, a observé pour la première fois les leptospires
sur des coupes histologiques de rein, traitées par imprégnation
argentique de Levaditi, et provenant d’un patient chez lequel avait
été diagnostiquée par erreur la fièvre jaune. Il les a décrits comme
des organismes spiralés, de couleur noire opaque, avec une ou deux
extrémités en crochet et les a dénommés Spirochaeta interrogans
en raison de leur forme en point d’interrogation. Il a aussi remarqué leur capacité à former des agrégats dans le tissu rénal (Faine
et al. 1999). Quelques années plus tard, Noguchi appellera le
microorganisme Leptospira icteroides (Noguchi, 1920).
Les leptospires pathogènes ont été isolés pour la première fois
en 1916 par le groupe d’Inada, au Japon, sur le milieu de culture de Noguchi. Dans une remarquable série d’études, le
même groupe montrait, entre 1916 et 1918, l’infection expérimentale et la protection passive du cobaye, les modes d’infection, le rôle du rat comme réservoir, la distribution de la bactérie dans les tissus, son excrétion, ainsi que ses caractéristiques
morphologiques. À la même époque, la maladie de Weil et l’infection expérimentale du cobaye ont été décrites en Europe par
Huebener et Reiter, pendant la Première Guerre Mondiale
(Faine et al. 1999). La leptospirose a été effectivement très
répandue pendant les guerres. D’ailleurs, la souche souche
utilisée pour le vaccin en France, Leptospira interrogans sérovar
Icterohaemorrhagiae, souche Verdun, a été isolée d’un soldat
présent sur les champs de bataille de Verdun.
Dès le début du XXe siècle, quelques années après la découverte
de l’agent de la maladie de Weil, ont été établis les concepts de
base concernant la leptospirose, qui sont encore couramment
utilisés aujourd’hui. Les années 1930-1940 ont été marquées par
la description d’autres formes de la maladie comme les formes
anictériques, par la découverte d’autres types de Leptospira et
de nombreux sérovars comme les sérovars Canicola, Pomona,
Grippotyphosa et Bataviae, et par la mise en évidence de
l’importance de la maladie chez les animaux (Faine et al.
1999). Le test d’agglutination microscopique ou MAT (pour
Microscopic Agglutination Test), évolution du test décrit par
Martin et Pettit à l’Institut Pasteur de Paris (Martin & Pettit,
268
1919), est encore aujourd’hui le test de référence pour le sérodiagnostic de la leptospirose.
Même si les premières descriptions de la maladie et de son agent
datent d’un peu plus d’un siècle, des textes beaucoup plus anciens
mentionnent une maladie ictérique qui pourrait être la leptospirose. Hippocrate avait écrit dans ses Aphorismes, en 400 av.
J-C : quand l’ictère apparaît après la fièvre avant le septième jour,
c’est un mauvais symptôme, à moins qu’il y ait des décharges aqueuses
des intestins. Selon la croyance populaire en Mésopotamie, on
retrouve l’affirmation suivante : quand la rivière apporte des
plantes jaunes, l’ictère apparaît au pays. Dans le passé, en Chine,
la médecine populaire nommait la leptospirose wei ni pour l’ictère de la culture du riz, nanukayami pour la fièvre des sept jours
et au Japon, akiyami pour la fièvre automnale. Plus tard et un
peu partout dans le monde, la leptospirose a été associée à des
activités et conditions environnementales particulières : elle a
reçu les noms de maladie des coupeurs de canne, des éleveurs
de porc, des mineurs, des égoutiers et de fièvre de la boue (Faine
et al. 1999).
DES BACTÉRIES UNIQUES
PARMI LES EUBACTERIA
Les leptospires (du grec leptós fin, petit, délicat et speira,
boucle, spire) sont des bactéries spiralées, qui mesurent entre
5-10 µm de longueur et 0,1 µm de diamètre, avec des extrémités
en spirale ou crochet (figure 1). Elles sont extrêmement mobiles,
car elles sont dotées d’un endoflagelle à chaque extrémité, qui
se localise entre la membrane externe et interne de la bactérie. En fonction de la souche, le temps de génération peut varier
de 3 à 15 heures, entraînant un temps de culture et d’isolement
parfois très long, allant de 2 à 30 jours. Le pH optimal de croissance est de 7,2 à 7,6 et la température optimale de 30 °C. Ces
bactéries sont sensibles à la dessiccation et à la plupart des antibiotiques. Par contre, elles peuvent survivre dans l’eau, les
rivières, les terrains alcalins (Faine et al. 1999), les lacs, les cours
d’eau et les marécages (Henry & Johnson, 1978), ce qui contribue à leur maintien dans la nature.
Figure 1 : À gauche, morphologie fine et spiralée de Leptospira biflexa révèlée
en microscopie électronique à transmission (Coloration négative d’uranyl acétate, grossissement X 12 500 ; technique réalisée par Evelyne Couture-Tosi à
l’Institut Pasteur). À droite, la section histologique d’un foie de cobaye infecté
par Leptospira interrogans sérovar Lai montre les nombreux leptospires en noir
opaque, disposés entre les hépatocytes et formant parfois des agglomérats (coloration argentique de Warthin-Starry, grossissement X 1 000).
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MÉMOIRE
Les leptospires sont exigeants du point de vue nutritionnel ; les
acides gras à chaîne longue, les vitamines B1 et B12 (WHO
2003), certains métaux comme le fer (Louvel et al. 2006) sont
essentiels pour leur métabolisme. Le milieu de culture le plus
utilisé est celui de Ellinghausen, McCullough, Johnson &
Harris (EMJH), qui présente dans sa composition le Tween 80
comme source d’acides gras et la sérumalbumine bovine comme
détoxifiant (Ellinghausen & McCullough, 1965 ; Johnson &
Harris, 1967). Les leptospires peuvent être cultivés en milieu
EMJH liquide (avec ou sans agitation), en milieu semi-solide
(0,3 % d’agar noble) utilisé pour le maintien des souches à
moyen terme, et en milieu solide (1 % d’agar noble) où les leptospires poussent en colonies isolées, en dessous de la surface.
Les colorations classiques des bactéries comme celle de Gram
ne sont pas applicables aux leptospires. Même s’ils sont structuralement plus proches des bactéries à Gram négatifs, les leptospires présentent des caractéristiques singulières de la paroi,
comme par exemple un peptidoglycane lié à la membrane
interne (Haake 2000). L’observation classique des leptospires
se fait au microscope optique à fond noir. Ils peuvent aussi être
observés au microscope optique à contraste de phase ou mis en
évidence par des colorations argentiques classiques comme celle
de Warthin-Starry (figure 1).
Les leptospires appartiennent à l’Ordre Spirochaetales, qui fait
partie d’un phylum bactérien à part entière regroupant les agents
d’autres maladies telles que celui de la syphilis (Treponema pallidum) et celui de la borréliose de Lyme. Ils possèdent une ultrastructure cellulaire unique et les études de séquençage de
l’ARN 16S montrent leur appartenance à un phylum très
ancien (Paster et al. 1991). De grande diversité génétique, ils
se répartissent en 17 espèces génomiques, parmi lesquelles sept
sont pathogènes pour l'homme et les animaux, qui forment le
complexe L. interrogans sensu lato (Morey et al. 2006). La
classification des leptospires est en fait bien plus compliquée,
de par la grande diversité de la composition lipopolysaccharidique de leur paroi. On peut cependant les classer en deux grands
groupes : Leptospira interrogans sensu lato, qui comprend le
groupe des pathogènes et Leptospira biflexa sensu lato, qui comprend celui des saprophytes (Bharti et al. 2003). La classification sérologique du genre a permis l’identification de sousespèces ou sérovars (Faine et al. 1999). Des sérovars possédant
des similarités antigéniques ont ainsi été regroupés en sérogroupes qui n’ont pas de valeur taxonomique, mais dont l’utilisation simplifie l’étude clinique et épidémiologique de la
leptospirose. Plus de 250 sérovars regroupés en 24 sérogroupes
existent actuellement. Les études d’hybridation ADN-ADN ont
permis de regrouper les leptospires en espèces génomiques, mais
le manque de corrélation systématique entre les espèces génomiques et les sérovars fait que la classification sérologique est
encore très utilisée dans les études cliniques et épidémiologiques
(Bharti et al. 2003). Le Centre National de Référence (CNR)
de la Leptospirose, localisé à l’Institut Pasteur de Paris, réalise,
outre la classification sérologique en sérogroupes et sérovars,
l’électrophorèse en champ pulsé (PFGE), le séquençage de
l’ARN 16S et l’étude des minisatellites ou VNTR (Variable
Number of Tandem Repeats) (Salaun et al. 2006) pour la classification génétique des leptospires.
LA LEPTOSPIROSE,
UNE ÉPIDÉMIOLOGIE COMPLEXE
La leptospirose est une zoonose présente sur tout le globe, en
zones urbaines ou rurales. Les cas de leptospirose humaine sévère
sont estimés à 500.000 par an dans le monde (WHO, 1999).
Les réservoirs principaux de l’agent pathogène sont les rongeurs
au premier rang desquels se trouve le rat dont le rein est chroniquement infecté et qui élimine, par ses urines, les leptospires
dans l’environnement. Toutes autres espèces de mammifères,
sauvages et domestiques, peuvent être un réservoir de leptospires, d’où une grande diversité de réservoirs. Ces animaux réservoirs hébergeant dans leurs reins des sérovars spécifiques sont
adaptés à l’infection (tableau 1). Ils sont peu sensibles aux leptospires et ont tendance à ne pas faire la maladie ou à développer
des formes chroniques. Dans le cycle de la leptospirose, l’élimination rénale des leptospires est donc un élément clé pour
leur persistance dans l’environnement. Une fois dans l’environnement, les leptospires contaminent les sols et l’eau. Les eaux
contaminées sont une très importante source de transmission
indirecte de la maladie aux humains et animaux, surtout en cas
de contact prolongé. La transmission directe se produit par le
contact avec les urines et les sécrétions d’animaux infectés. Les
voies d’infection classiques sont la peau et les muqueuses.
L’homme n’est qu’un hôte accidentel dans le cycle de la leptospirose, d’où son extrême sensibilité aux leptospires et sa propension à développer des formes graves de la maladie (Faine et
al. 1999).
Le taux d’infection des rats par les leptospires varie, selon les
auteurs, de 10 % (Johnson et al. 2004) à 36 % (Lilenbaum et
al. 1993). En France, la séroprévalence est de 33 % chez les
ragondins, avec une prédominance des sérogroupes
Icterohaemorrhagiae et Australis (Michel et al. 2001). Quant
aux réservoirs que peuvent constituer les animaux domesRéservoir
Rat
Mulot
Sérogroupe
Sérovar (s)
adapté (s)
Rattus norvegicus,
Icterohaemorrhagiae,
Icterohaemorrhagiae
Rattus rattus
Copenhageni
Apodemus
agrarius
Icterohaemorrhagiae
Lai
Chien*
Canicola
Canicola
Porc
Pomona, Tarassovi
Pomona, Tarassovi
Bovins
Sejroe
Hardjo
Ragondin
Icterohaemorrhagiae,
Icterohaemorrhagiae
Copenhageni
Australis, Bratislava,
Australis
Munchen
Sejroe
Sejroe
Tableau 1 : Leptospirose animale : réservoirs, sérogroupes et sérovars.
*Le chien est le réservoir de Canicola lors d'une infection rénale chronique.
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269
MÉMOIRE
tiques, une étude a soulevé l’importance des bovins dans la persistance du sérovar Hardjo, ce sérovar ayant été isolé à partir
de prélèvements rénaux chez 57 vaches sur 200 examinées (Ellis
et al. 1981).
La leptospirose chez les animaux domestiques
Chez les animaux d’élevage (bovins, porcs, chèvres, moutons), la leptospirose se manifeste par des troubles de la reproduction : avortements, mortinatalité, infertilité et augmentation de l’intervalle entre vêlages (Lilenbaum & Souza, 2003 ;
Ramos et al. 2006). On note une chute importante de la production de lait dans les élevages bovins laitiers, connue comme
le milk drop syndrome (Pearson et al. 1980). Même si les troubles
de la fertilité ont tendance à atteindre un plateau et à rester
chroniques dans l’élevage, ils sont responsables d’importantes
pertes économiques. La sévérité de la maladie semble être liée
à l’âge des animaux et à leur état immunitaire. Les cas aigus chez
les bovins et les porcs sont plus rares, touchant plutôt les jeunes
animaux, et ils sont caractérisés par la prostration, la fièvre, l’anémie, l’ictère et les vomissements (Faine et al. 1999).
Les chevaux atteints présentent des troubles chroniques de la
reproduction (Léon et al. 2006) et / ou une uvéite causée par la
présence des leptospires et des anticorps spécifiques dans les
chambres oculaires ; cette uvéite laisse l’animal très sensible à
la lumière et peut évoluer vers la cécité.
Chez les chiens, la leptospirose se présente sous plusieurs formes.
Lorsqu’ils sont infectés par le sérogroupe Icterohaemorrhagiae,
ils développent une hépatonéphrite suraiguë ou aiguë, qui ressemble à la maladie humaine. Lorsqu’ils sont infectés par
Canicola, ils peuvent être victimes et développer une néphrite
aiguë nommée Maladie de Stuttgard, ou développer une néphrite
chronique et devenir des porteurs et réservoirs de Canicola. Les
signes cliniques les plus communs chez les chiens sont la fièvre,
les vomissements, la prostration, la rougeur des yeux, la déshydratation et le méléna, accompagnés ou non d’un ictère. Le pronostic est toujours réservé, voire même grave, la maladie pouvant évoluer rapidement vers la mort si elle n’est pas traitée
(Faine et al. 1999). La vaccination évite que les chiens ne développent les symptômes les plus graves de la maladie, mais n’empêche pas l’infection (André-Fontaine 2006).
En France, la majorité des diagnostics de la leptospirose chez
les animaux est assurée par l’École Vétérinaire de Nantes. Les
diagnostics, indirects, portent sur des sérums d’animaux (sérodiagnostics), reçus pour confirmation diagnostique. Leurs
résultats ne peuvent pas être interprétés comme des données
de prévalence de la maladie (tableau 2). Au Brésil, comme en
France, il n’existe pas d’étude de séroprévalence au plan
national. Cependant, des enquêtes séro-épidémiologiques
régionales montrent des pourcentages d’animaux positifs de 13
à 81 % pour les bovins (Rodrigues et al. 1999 ; Juliano et al.
2000), de 66 % pour les chiens et les porcs (Lilenbaum et al.
2002 ; Ramos et al. 2006) et de 11 % pour les chèvres
(Lilenbaum et al. 2007).
270
Les chats et autres félins ne sont généralement pas inclus dans
les enquêtes séro-épidémiologiques de la leptospirose et il
n’existe effectivement que peu de données de la littérature à ce
sujet (Luciani 2004 ; Lilenbaum et al. 2004). Le fait que le félin
soit plus résistant aux leptospires est assez déconcertant : du fait
de la cohabitation du chat domestique avec les chiens et les
humains, le rôle des félins comme réservoir possible reste à clarifier. Signalons toutefois que dans une étude récente portant
sur 98 chats, 48 % d’entre eux étaient séropositifs au test de la
microagglutination (MAT) à Leptospira spp., montrant que cette
infection est aussi fréquente dans cette espèce (Luciani 2004 ;
André-Fontaine 2006).
La leptospirose humaine
La leptospirose humaine peut se présenter sous des formes
bénignes qui guérissent spontanément ou des formes aiguës
sévères à très graves, comme la maladie de Weil due au sérogroupe Icterohaemorrhagiae. Dans toutes les formes de la
maladie, les symptômes (migraine, fièvre et douleurs musculaires) ne sont pas spécifiques au début. Dans les cas graves, apparaissent des symptômes caractéristiques de l’atteinte hépatorénale (ictère et insuffisance rénale prononcée), des hémorragies
oculaires, parfois des troubles méningés et / ou pulmonaires. Dans
les cas les plus sérieux, le taux de létalité varie de 5 à 25 %
(WHO, 1999). La leptospirose est une maladie professionnelle
qui concerne les agriculteurs, les éleveurs d’animaux domestiques, les vétérinaires, les égoutiers, le personnel de laboratoire,
les militaires, en bref toutes les professions en contact avec des
animaux réservoirs ou de l’eau contaminée.
La leptospirose humaine est endémique et épidémique dans certaines régions du globe, comme les Amériques du Sud et Centrale
(Trevejo et al. 1998 ; Ko et al. 1999), l’Inde (Jena et al. 2004) et
le Sud-Est Asiatique (Laras et al. 2002). Le caractère endémique
est dû aux conditions géographiques et climatiques; le nombre
de cas estimés par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS)
dans les pays au climat tropical humide est de 10 pour 100.000
habitants par an, soit 0,01 % de la population (OMS, 2007). Les
conditions démographiques et de développement, à savoir l’augmentation démographique désordonnée, les conditions précaires de vie, le manque d’hygiène et d’éducation sanitaire,
Nombre
Pourcentage
d’animaux testés d’animaux positifs (%)
Sérogroupes les
plus réactifs
Bovins
1842
13,1
Icterohaemorrhagiae,
Australis, Sejroë
Porcs
2632
19,9
Icterohaemorrhagiae,
Australis, Ballum
Chevaux
1883
35,6
Australis,
Icterohaemorrhagiae,
Canicola
Chiens*
707
66,3
Icterohaemorrhagiae,
Canicola, Australis
Tableau 2 : Fréquence de séropositivité (microagglutination /MAT) selon
l’espèce domestique en 2006 (rapport d’activité ENV Nantes).* Sont inclus
les chiens vaccinés contre les sérogroupes Icterohaemorrhagiae et Canicola.
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MÉMOIRE
l’urbanisation désordonnée favorisent l’endémicité de la leptospirose. Par exemple, la maladie est fortement répandue dans les
bidonvilles où les personnes vivent dans des habitations entourées d’égouts à ciel ouvert, proches du principal réservoir urbain
de la maladie, le rat (Rattus norvegicus).
Les flambées épidémiques surviennent pendant les mois les plus
chauds et pluvieux de l’année, spécialement lors des fortes inondations (Ko et al. 1999). Le nombre de cas peut atteindre 100
habitants pour 100.000, soit 0,1 % de la population (OMS,
2007). Au Brésil, la leptospirose est une maladie à déclaration
obligatoire et 3.000 cas sont déclarés en moyenne chaque année
(Tassinari et al. 2004). Lors de l’épidémie de 1996, 326 cas de
leptospirose aiguë ont été diagnostiqués dans un seul hôpital et
50 décès déclarés, ce qui montre l’importance de cette maladie et probablement une sous-estimation du nombre de cas dans
le pays entier (Ko et al, 1999).
D’importantes épidémies de leptospirose sont survenues dans les
dernières années comme au Nicaragua (Trevejo et al. 1998) et
en Inde (Jena et al. 2004). Il faut aussi mentionner les épidémies
de leptospirose survenues au contact des eaux de baignade, pendant la pratique d’activités de loisirs ou sportives, comme le rafting en Costa Rica (CDC, 1997), l’Éco Challenge en Malaisie
(Sejvar et al. 2003), le triathlon en Illinois (Morgan et al. 2002).
En France, comme dans la majorité des pays de climat tempéré
ou des pays développés, la leptospirose est considérée comme une
maladie sporadique et surtout une maladie professionnelle. Le
CNR de la Leptospirose de l’Institut Pasteur est le principal laboratoire français à pratiquer le diagnostic de la leptospirose
humaine et contribue à la surveillance épidémiologique de la leptospirose en France métropolitaine et Outre-Mer. Il assure
l’identification de toutes les souches isolées en pathologie
humaine. La leptospirose est diagnostiquée depuis 1920, sans que
l’on note de variations significatives au cours des années.
Cependant, l’incidence de la maladie est saisonnière, les cas apparaissant surtout pendant la deuxième partie de l'année. Le
sérogroupe Icterohaemorrhagiae représente la majorité des
sérodiagnostics positifs, suivi par le sérogroupe Grippotyphosa
(Baranton & Postic, 2006a). En 2006, 594 cas ont été recensés,
dont 192 en Métropole (figure 2) et 402 en Outre Mer (tableau 3)
(Baranton & Postic, 2006b). La maladie est considérée comme
une zoonose d’importance prioritaire par l’Institut de Veille
Sanitaire (Capek et al. 2006). Dans une évaluation du risque d’apparition et de l’évolution de zoonoses comme conséquence du
réchauffement climatique en France, la leptospirose est considérée comme une maladie dont les conséquences sont faible à
modérée pour la santé animale, modérée pour la santé humaine
et faible pour l’économie (Gauchard 2005).
Nous possédons peu d’informations sur la maladie en Afrique
et ce déficit est probablement dû à une sous-notification des cas
et à la présence des nombreuses maladies qui peuvent se
confondre avec la leptospirose, comme, par exemple, les fièvres
hémorragiques virales. Au Gabon, la séroprévalence de la leptospirose est de 15,7 % (Bertherat et al. 1999).
Figure 2 : Incidence de la leptospirose en France en 2006. L’incidence dans le
Nord-Pas-de-Calais est surestimée, car l’origine géographique des cas n’est pas
communiquée par les deux laboratoires réalisant le diagnostic (rapport d’activités 2006 du Centre National de Référence de la leptospirose).
Région
Nombre de cas
Population
(milliers d’hab.)
Incidence/
100.000 hab.
Antilles
137
846
16,19
Guyane
12
202
5,94
Réunion
59
784
7,52
Mayotte
16
201
7,96
Polynésie française
74
260
28,46
Wallis
1
10
10
Futuna
38
5
760
Nouvelle-Calédonie
65
232
28,02
Tableau 3 : Leptospirose humaine : incidence selon la région d’Outre Mer
en 2006 (rapport d’activités du CNR).
LA PATHOGÉNIE DE LA LEPTOSPIROSE
La dynamique de la pathogenèse de la leptospirose est complexe
et multifactorielle. La mobilité et la morphologie des leptospires
favorisent leur pénétration par la peau lésée et les muqueuses,
de même que leur dissémination rapide dans le sang et les tissus
de l’hôte. Après l’infection, la période de bactériémie est
variable et peut durer de 3 à 10 jours en moyenne. Elle est suivie
par l’arrivée des leptospires dans les organes cibles : reins, foie
et poumons, en provoquant la symptomatologie classique.
Une fois la maladie installée, elle évolue vers la mort ou vers
l’installation d’une immunité protectrice, engendrant l’élimination du microorganisme ou le développement de l’état de porteur (Faine et al. 1999).
La connaissance de la pathogénie de la leptospirose est basée
notamment sur les études de modèles animaux expérimentaux.
L’utilisation du cobaye comme modèle expérimental n’est
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MÉMOIRE
Figure 3 : Signes cliniques classiques de la leptospirose aiguë chez le cobaye infecté par Leptospira interrogans sérovar Lai. L’animal présente un ictère apparent
des muqueuses oculaires, de la peau et des tissus sous-cutanés, une hémorragie abdominale et des séreuses.
Figure 4: À gauche, les poumons de cobaye infecté par L. interrogans sérovar Lai présentent de larges plages hémorragiques. À droite, les lésions microscopiques
pulmonaires sont caractérisées par des hémorragies intra-alvéolaires et des infiltrats inflammatoires lymphoplasmocytaires (hématoxyline éosine, grossissement X 200).
pas récente (Noguchi 1920). Les jeunes cobayes inoculés par
des leptospires du sérogroupe Icterohaemorrhagiae, développent une maladie létale qui mime la leptospirose grave de
l’homme et du chien, avec la présence d’un ictère et d’hémorragies sous-cutanées, pulmonaires et abdominales (figures 3
et 4). Le hamster et la gerbille sont aussi sensibles aux leptospires. La résistance de la souris empêche son utilisation comme
modèle animal. Récement, il a été montré que des souris génétiquement modifiés en TLR-4 (Toll-like receptor 4), récepteur
de la réponse immune inée, sont sensibles à la maladie (Nally
et al. 2005).
La lésion principale de la maladie est constituée par des hémorragies et par l’afflux de cellules inflammatoires. Les leptospires
ne sont pas pyogéniques et induisent une réponse inflammatoire
lymphoplasmocytaire pauvre en neutrophiles (figure 4, figure 5
A-B). Leurs effets directs dans les tissus sont liés à la présence
du lipopolysaccharide (LPS) et d’autres toxines comme une
272
hémolysine (Lee et al. 2000) et des lipases (Palaniappan et al.
2007). Leur adhésion aux cellules est primordiale pour la colonisation des tissus de l’hôte. Les leptospires sont fréquemment
observés en étroit contact avec les membranes cellulaires
(figure 1) et doivent posséder d’importants facteurs de virulence
à cette étape. Capables de réaliser une translocation rapide dans
les cellules (Barocchi et al.2001), ils pénètrent dans les cellules
phagocytaires et non phagocytaires (Palaniappan et al. 2007),
mais ne sont pas intracellulaires (Faine et al. 1999). Même si
les mécanismes de virulence spécifiques des leptospires sont
encore obscurs, quelques protéines ont été identifiées comme
étant des facteurs de virulence putatifs, comme une protéine qui
a pour ligand la fibronectine (Merien et al. 2000) et les protéines
Lig (Matsunaga et al. 2003). Les récentes avancées de la
recherche en génomique permettront, en satisfaisant aux postulats moléculaires de Koch (Falkow 1988), de mettre en évidence le rôle de ces facteurs de virulence.
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MÉMOIRE
A
B
C
D
Figure 5 : Coupes histologiques d’organes de cobaye infecté par L. interrogans sérovar Lai. A, le foie présente une importante inflammation lymphoplasmocytaire périportale, des hépatocytes nécrosés et des cellules de Kupffer dilatées. La perte de l’architecture linéaire des hépatocytes est aussi marquée (hématoxyline éosine).
B, les reins présentent des lésions typiques de leptospirose caractérisées par des hémorragies diffuses du cortex, une nécrose tubulaire et des infiltrats lymphoplasmocytaires (hématoxyline éosine). C, l’immunohistochimie avec des anticorps spécifiques dirigés contre la protéine Loa22 révèle de nombreux leptospires (colorés
en rouge) dans les canalicules biliaires. D, elle révèle aussi la distribution diffuse des bactéries (colorées en rouge) dans les glomérules du rein et en plus grand nombre
dans les tubules proximaux. L’expression in vivo de la protéine Loa22, essentielle pour la virulence des leptospires, est ainsi démontrée par l’histochimie dans le
rein et le foie chez le cobaye (grossissement X 200).
La réponse immunitaire aux leptospires, peu connue, est réalisée par l’intermédiaire des processus de l’immunité innée et
acquise. Le LPS est responsable de la stimulation de l’immunité
innée par les TLR2 (Werts et al. 2001). La réponse humorale
est spécifique du sérovar infectant et le LPS semble être un antigène majeur, de même que les protéines de la membrane
externe. Les immunoglobulines réalisent l’opsonisation et permettent la phagocytose subséquente des leptospires (Faine et al.
1999). La réponse immunitaire cellulaire semble participer aussi
à la défense contre les leptospires, avec la production d’interféron gamma (Bharti et al. 2003).
LE BESOIN DE MESURES EFFICACES
DE CONTRÔLE
La leptospirose est fondamentalement liée aux conditions de
pauvreté, et les actions d’éducation sanitaire, d’urbanisation et
d’insertion sociale sont à la base de son contrôle. La protection
individuelle (port de bottes) en cas d’inondations et l’éradication des rongeurs sont très importantes pour le contrôle de la
maladie. Le traitement de la leptospirose peut être curatif ou
préventif et les leptospires sont sensibles aux antibiotiques
comme la pénicilline G et la doxycycline.
Le test diagnostique de référence est le test de microagglutination ou MAT, réservé à quelques laboratoires spécialisés. Il est
basé sur l’agglutination des différentes souches bactériennes
vivantes par le sérum, permettant de quantifier les anticorps
agglutinants totaux. Il permet non seulement un diagnostic sensible et spécifique mais aussi la détermination du sérogroupe. Il
a donc un intérêt à la fois diagnostique et épidémiologique. Par
contre, il possède une valeur limitée pour le diagnostic de la phase
aiguë de la forme sévère de la leptospirose, ainsi que des formes
moins sévères. Un autre inconvénient est qu’il nécessite un grand
nombre de souches vivantes correspondant aux sérogroupes
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273
MÉMOIRE
attendus. La « batterie » usuelle au CNR de la Leptospirose de
l’Institut Pasteur comprend 16 souches et peut être étendue à
23 si l’on suspecte un sérogroupe ou sérovar plus rare.
produits par l’infection. Un test diagnostique composé de
sous-unités bactériennes conservées parmi les différents sérovars de leptospires pourrait satisfaire à ces demandes.
En pratique humaine, on retiendra qu’il s’agira tout d’abord
d'une recherche sérologique et, en fonction de la demande du
biologiste, d’une culture et/ou amplification génique (PCR) dès
la prise en charge du patient. Ces trois approches sont complémentaires pour le diagnostic biologique de la leptospirose.
L'examen direct au microscope à fond noir est à proscrire à cause
des faux positifs.
Le diagnostic différentiel de la leptospirose doit être fait avec
les fièvres hémorragiques chez l’homme. La dengue est en effet
responsable d’un grand nombre d’erreurs de diagnostic chez
l’homme (Ko et al. 1999), cette maladie ne sévit que dans certains pays chauds. Chez les ruminants, porcins et équidés, on
doit différencier la leptospirose des infestations parasitaires et
de troubles de la reproduction ayant d’autres origines.
L’hémoculture est possible durant les 10 premiers jours suivant
l'apparition de la fièvre, celle du LCR se fera durant la deuxième
semaine de la maladie, et enfin les urocultures à partir de la troisième semaine. L’amplification par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de gènes spécifiques comme hap1
(Branger et al. 2005) est de plus en plus utilisée, de même que
la PCR en temps réel (Merien et al. 2005). Enfin le sérodiagnostic est réservé à quelques laboratoires avec la mise en œuvre
soit du MAT soit d’un test d’orientation par diverses techniques
dont ELISA (IgM) avec la souche saprophyte Patoc. Celui-ci
se révèle positif vers les 8 – 10e jours après le début de la maladie. Les anticorps décroissent sur 3 à 6 mois et peuvent persister à des taux résiduels plusieurs années. La cinétique des anticorps est indispensable (2 tests à 2 semaines d’intervalle) et son
interprétation intègre les données chronologiques et cliniques.
Une mesure de contrôle spécifique de la leptospirose est la
vaccination. Celle des groupes professionnels exposés ou à
risque est mise en place en France et dans d’autres pays comme
la Chine, le Japon, la Russie et Cuba. La vaccination en médecine vétérinaire est appliquée en routine aux chiens, car ils
développent des formes très graves de la maladie. Dans certains pays, comme le Brésil où la maladie est endémique chez
les animaux d’élevage, les bovins et porcins peuvent également être vaccinés.
Nous avons besoin d’un test diagnostique efficace, simple,
économique et sûr pour le personnel de laboratoire, capable
d’identifier les phases précoce et tardive de la maladie. Il serait
intéressant aussi de différencier les anticorps vaccinaux de ceux
Caractéristiques
L. biflexa
L. interrogans
L.
borgpetersenii
Taille (Kb)
3878
4627
3900
Structure
Contenu en GC (%)
2 chromosomes,
2 chromosomes
1 plasmide
2 chromosomes
38,5
34,9
40,3
6
26
120
3787
3728
3190
Fonction définie
2078
1972
1876
Hypothétiques
1709
1756
1053
Proportion de
fonction inconnue
(%)
45
47,1
33
Proportion gène/Kb
0,97
0,8
0,82
Séquence codante
totale (%)
93,7
74,7
74,1
Séquences
d’insertion
Gènes Nombre
total
ARN r
ARN t
2 23S, 2 16S, 2 5S 2 23S, 2 16S, 1 5S 2 23S, 2 16S, 1 5S
35
37
37
Tableau 4 : Leptospires : principales caractéristiques de trois génomes.
274
Les vaccins existant actuellement sont constitués de bactéries entières tuées par la chaleur ou le formol et présentent certains inconvénients : une réponse immune de courte durée qui
n’est pas toujours protectrice et qui est spécifique du sérovar
utilisé dans sa composition. La réponse immune de courte
durée implique le besoin de faire des rappels périodiques.
L’efficacité de ces vaccins entiers est très limitée. En effet, il
existe une grande diversité au sein du genre Leptospira (plus
de 250 sérovars), due essentiellement à la variation de la structure du lipopolysaccharide (LPS). Cette particularité est une
Figure 6 : Outils génétiques développés par l’Unité de Biologie des Spirochètes
de l’Institut Pasteur.
A : Mutagénèse aléatoire avec le transposon Himar 1. Après l’insertion aléatoire du transposon dans le chromosome de Leptospira, les clones mutants ont
acquis le gène qui code la résistance à la kanamycine (KmR) et pourront être
sélectionnés en milieu EMJH solide additionné de cet antibiotique.
B : Après la sélection de clones mutants, des tests sont réalisés pour la recherche
d’un phénotype différent du phénotype sauvage, comme l’atténuation de la virulence chez le cobaye. Une fois ce phénotype identifié, il faut ré-insérer le gène
identifié dans le chromosome de la bactérie pour restaurer le phénotype sauvage
et prouver que ce gène est responsable du phénotype observé.
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MÉMOIRE
limite au développement d’un vaccin multivalent, mais aussi
au sérodiagnostic. Quelques pays, comme Cuba, utilisent des
vaccins polyvalents composés de plusieurs sérovars (Martinez
et al. 2004), mais ils ne sont pas capables de protéger contre
l’ensemble des sérovars connus.
Il faut donc trouver des antigènes conservés chez les leptospires
et protecteurs pour développer un vaccin multivalent composé
d’une ou plusieurs sous-unités bactériennes. Aujourd’hui, les
chercheurs ont la possibilité, en utilisant la stratégie de la vaccinologie inverse (reverse vaccinology), de réaliser l’analyse
informatique de la totalité du génome pour rechercher des nouveaux candidats vaccins (Koizumi & Watanabe, 2005). Cette
stratégie nous permettra de trouver un vaccin moléculaire qui
protégera contre un large spectre de leptospires – un défi permanent pour les chercheurs. Ceci devrait permettre aussi d’appliquer un seul vaccin commun à plusieurs espèces animales et
à l’homme. Les vaccins composés de sous-unités protéiques ont
démontré une protection partielle chez les modèles animaux
(Haake et al. 1999 ; Branger et al. 2001). Le manque d’outils
génétiques a beaucoup freiné la recherche sur les leptospires.
GÉNETIQUE ET SANTÉ PUBLIQUE :
LA DESCRIPTION DU PREMIER FACTEUR
DE VIRULENCE
Le séquençage récent du génome des leptospires marque une très
grande avancée pour la recherche sur la leptospirose. Les deux
premières souches séquencées, Leptospira interrogans sérovars Lai
(Ren et al. 2003) et Copenhageni (Nascimento et al. 2004), sont
issues du sérogroupe Icterohaemorrhagiae et sont responsables
respectivement de fréquentes épidémies au Brésil et en Chine.
Le génome des leptospires se distingue de celui d’autres bactéries par ses deux chromosomes circulaires : un grand avec environ 4 millions de paires de bases et un petit d’environ 350 000
paires de bases. Il possède un contenu en G-C d’environ 35 %
et la majorité des gènes codent des protéines de fonction
encore inconnue. Le génome d’une seconde espèce, Leptospira
borgpertersenii sérovar Hardjo, a aussi été séquencé (Bulach et
al. 2006) et présente un génome réduit (tableau 4), suggérant
que le microorganisme est moins adapté pour survivre dans l’environnement et peut être en train d’évoluer vers un parasite obligatoire, bien que des données expérimentales manquent toutefois pour confirmer cette hypothèse. Une troisième espèce,
Leptospira biflexa, non pathogène, a été séquencée au sein de
l'Institut Pasteur (tableau 4). Cette étude permettra de réaliser
la génomique comparative des leptospires saprophytes et pathogènes. Elle sera d’une grande utilité pour identifier des facteurs
spécifiques du mode de vie des leptospires pathogènes et permettra de mieux comprendre l’évolution d’une bactérie saprophyte de l’environnement en une bactérie pathogène pour
l’homme et l’animal.
Un système de mutagénèse ciblée a été développé chez les leptospires saprophytes avec un vecteur navette (Bauby et al. 2003),
de même qu’un système de mutagénèse aléatoire, avec le trans-
poson « mariner » de la famille Himar 1 (Louvel et al. 2005)
(figure 6 A). Le séquençage du site d’insertion du transposon
permet ensuite de savoir quel est le gène interrompu.
Ultérieurement, l’utilisation des logiciels informatiques comme
MAGE(MagnifyingGenomes,http://www.genoscope.cns.fr/agc/mag)
précise la localisation du gène, ainsi que sa fonction putative.
De nombreux efforts ont été entrepris pour adapter ces techniques aux leptospires pathogènes, qui sont plus difficiles à manipuler génétiquement et qui pour l’instant, sont à peine transformables par mutagénèse aléatoire (Bourhy et al. 2005). La
mutagénèse aléatoire des leptospires saprophytes est d’une
bien meilleure efficacité. Elle permet la génération de milliers
de clones à chaque électroporation et de multiples stratégies de
criblage sont possibles en fonction du phénotype attendu
(figure 6 B). Par exemple, pour identifier les systèmes de régulation et de transport du fer, de nombreux criblages ont été réalisés en milieu de culture avec ou sans source de fer (Louvel et
al. 2006). Dans le cas des mutants obtenus chez les leptospires
pathogènes, le phénotype recherché est l’atténuation de virulence. On sait que la virulence d'un microorganisme se traduit
par sa capacité de produire une maladie, y compris sa capacité
de se multiplier dans l'hôte, atteindre les organes cibles et provoquer des lésions. Le phénotype de virulence atténuée des leptospires est donc identifié par l'absence de maladie et de létalité chez le cobaye ou, en système de culture cellulaire, en
vérifiant les étapes classiques de virulence comme l'adhésion,
l'invasion et la multiplication.
Après avoir réalisé une mutation, il faut ensuite réinsérer le gène
fonctionnel dans le génome pour prouver qu’il est bien responsable du phénotype observé. La complémentation du gène interrompu chez les leptospires pathogènes est faite par insertion aléatoire dans le génome (figure 6 B). Le but majeur de ces efforts est,
avec l’aide des séquences génomiques disponibles, d’identifier des
gènes impliqués dans la virulence des leptospires et, en conséquence, des molécules d’intérêt vaccinal et diagnostique.
La stratégie de mutagénèse aléatoire a permis, pour la première
fois, d’inactiver un gène de virulence de la souche pathogène
Leptospira interrogans sérovar Lai qui appartient au sérogroupe
Icterohaemorragiae (Ristow et al. 2007). Le transposon s’est
inséré dans un gène qui code une protéine de la famille OmpA
(Outer membrane protein), Loa22. La virulence du mutant
obtenu est atténuée, car injecté chez le cobaye et le hamster il
ne produit pas les lésions typiques de la maladie et n’entraîne
pas la mort des modèles animaux. De plus, lorsque le gène est
complémenté dans ce mutant, la virulence est restaurée chez
les animaux. Cette petite protéine, de fonction encore inconnue, a un domaine consensus conservé OmpA en partie C terminale. L’analyse in silico de la séquence en acides aminés révèle
les caractéristiques d’une lipoprotéine. Nous avons réalisé
l’immunofluorescence directe et observé que cette protéine est
exposée à la surface de L. interrogans sérovar Lai. Les protéines
de la membrane externe peuvent avoir un fort pouvoir immunogénique et cette protéine n’est pas une exception, puisque
nous avons observé des fortes réactions vis-à-vis de Loa22
comme antigène avec les échantillons de sérums humains pré-
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levés chez des patients ayant fait la maladie aiguë et chronique.
Loa22 est fortement exprimée par les leptospires pathogènes in
vitro (Koizumi & Watanabe, 2003), mais aussi in vivo par les leptospires infectant les organes de cobayes présentant une leptospirose aiguë (figure 5 C-D). Les protéines de la famille OmpA
sont impliquées dans de nombreux processus pathologiques chez
d’autres bactéries, comme leur adhérence sur les cellules (Shin
et al. 2005) et l’induction de cytokines (Jeannin et al. 2005).
La protéine Loa22 des leptospires satisfait les postulats moléculaires de Koch caractérisant un facteur de virulence (Falkow
1988) et semble capitale pour induire le pouvoir pathogène des
leptospires. La protéine Loa22 des leptospires est un candidat
potentiel pour un vaccin recombinant à finalité humaine et
vétérinaire.
À QUOI PEUT-ON S’ATTENDRE À L’ÈRE
POST-GÉNOMIQUE DES LEPTOSPIRES ?
L’ère post-génomique marque une période de changements dans
la recherche sur les leptospires. Un peu plus d’un siècle après
la description du microorganisme et l’élaboration des concepts
les plus primordiaux concernant la clinique et l’épidémiologie
de la maladie, les chercheurs ont la carte génétique dans leurs
mains et un plan à parcourir : l’avancée dans la connaissance
de la biologie et la pathogénie des leptospires et le développement urgent des mesures de contrôle applicables. Cette approche
ne peut être que multidisciplinaire, associant généticiens,
médecins, vétérinaires, épidémiologistes, bioinformaticiens,
pour aboutir à l’amélioration des tests de diagnostic de la leptospirose et au développement d’un vaccin. Les récents travaux
menés au sein de l’Unité de Biologie des Spirochètes ouvrent
la voie et vont dans ce sens.
Cette nouvelle ère de la recherche en génétique et dans le processus pathogénique ne doit pas faire oublier aux chercheurs que
la leptospirose est une maladie favorisée par les conditions de
pauvreté et que les mesures les plus fondamentales d’hygiène
et d’amélioration des conditions d’une vie digne sont à la base
de la maîtrise de la maladie. Même si elle implique d’importants
problèmes de santé publique, la leptospirose continue d’être une
maladie négligée.
REMERCIEMENTS
À Mathieu Picardeau pour son accueil à l’Institut Pasteur, sa direction de thèse et notre fructueux travail développé en France.
À Walter Lilenbaum (UFF, Rio de Janeiro, Brésil) et Leila Fonseca (UFRJ, Rio de Janeiro, Brésil) pour leur encadrement et direction
de ma thèse au Brésil et leur perpétuel soutien.
Aux équipes du Laboratoire de Recherche et des Centres Nationaux de Référence de la Leptospirose et des Borrelia de l’Institut
Pasteur, particulièrement à Pascale Bourhy, pour leurs conseils, travail d’équipe et esprit critique.
À Michel Huerre et Patrick Ave pour le travail réalisé à la Plateforme d’Histotechnologie de l’Institut Pasteur.
À Albert Ko pour son soutien et esprit critique.
À Hervé Bourhy pour son encouragement.
À Mathieu Picardeau et à Viviane Morel pour la lecture critique de ce manuscrit.
Aux financements de CAPES, Brésil ; FIOCRUZ, Salvador, Brésil – Institut Pasteur, Paris et Association Pasteur – Weizmann.
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Bull. Acad. Vét. France — 2007 - Tome 160 - N°4 www.academie-veterinaire-defrance.org/
Microbiology (2008), 154, 1309–1317
DOI 10.1099/mic.0.2007/014746-0
Biofilm formation by saprophytic and pathogenic
leptospires
Paula Ristow,1,2 Pascale Bourhy,1 Sophie Kerneis,3 Christine Schmitt,3
Marie-Christine Prevost,3 Walter Lilenbaum4 and Mathieu Picardeau1
Correspondence
1
Mathieu Picardeau
2
[email protected]
Unité de Biologie des Spirochètes, Institut Pasteur, 75724 Paris Cedex 15, France
Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil
3
Plate-Forme de Microscopie Électronique, Institut Pasteur, Paris, France
4
Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense, Brazil
Received 7 November 2007
Revised
14 December 2007
Accepted 17 February 2008
Leptospires exist as saprophytic organisms that are aquatic or as pathogens that are able to
survive in water. Leptospirosis is transmitted to humans through environmental surface waters
contaminated by the urine of mammals, usually rodents, which are chronically infected by
pathogenic strains. The ecology of Leptospira spp. prompted us to evaluate if these spirochaetes
were able to form biofilms. This study investigated the characteristics of biofilm development by
both saprophytic and pathogenic Leptospira species using microscopic examinations and a
polystyrene plate model. Biofilms were formed preferentially on glass and polystyrene surfaces.
Electron microscopic images showed cells embedded in an extracellular matrix. The formation of
such a biofilm is consistent with the life of saprophytic strains in water and may help pathogenic
strains to survive in environmental habitats and to colonize the host.
INTRODUCTION
The traditional paradigm of bacteria living in their
planktonic form has been recently revised. Biofilms, which
are surface-associated cells enclosed in a matrix of selfsynthesized extracellular materials, now appear to be
integral components of the prokaryotic life cycle (HallStoodley et al., 2004). In biofilms, micro-organisms
become more resistant to killing by biocides and
antibiotics. Biofilm formation begins with the adhesion
of planktonic bacteria to surfaces, including abiotic
surfaces (plastics, glasses, metals and minerals) and biotic
surfaces (plant and animal tissues). The attached cells will
then produce a matrix, consisting of exopolymeric
substances, and multiply, thereby forming a so-called
microcolony. From this microcolony, a mature biofilm can
arise. In the final stage of biofilm formation, cells may
detach and return to planktonic life or die (Hall-Stoodley
et al., 2004).
Leptospira spp. belong to the bacterial phylum of
Spirochaetes, an evolutionarily and structurally unique
group of bacteria. These bacteria are composed of both
saprophytic and pathogenic members, such as Leptospira
Abbreviations: SEM, scanning electron microscopy; TEM, transmission
electron microscopy.
The GenBank/EMBL/DDBJ accession numbers for the complete
genomic sequence of L. biflexa serovar Patoc strain Patoc1 are
CP000786, CP000787 and CP000788.
2007/014746 G 2008 SGM Printed in Great Britain
biflexa and Leptospira interrogans, respectively (Faine et al.,
1999). Leptospires are motile, obligately aerobic, and slowgrowing bacteria that have an optimal growth temperature
of 30 uC. They are able to survive in soil and water for long
periods (Henry & Johnson, 1978; Trueba et al., 2004).
Pathogenic species are the causal agents of leptospirosis, a
widespread zoonosis that is a major public health problem
in developing countries in South-East Asia and South
America. In the animal reservoirs of the disease such as
rodents, infection produces chronic and persistent asymptomatic carriage in the renal tubules and bacteria are then
excreted in urine. Humans are usually infected through cut
or abraded skin contact with water contaminated by the
urine of animal reservoirs (McBride et al., 2005). More
than 500 000 cases of severe leptospirosis occur each year,
with a mortality rate of 5–20 % (WHO, 1999).
Because of the association of both saprophytic and
pathogenic leptospires with water sources, we sought to
characterize biofilm development by these micro-organisms. Although Singh et al. (2003) revealed the presence of
Leptospira spp. in biofilms of dental water unit systems by
16S rDNA sequencing, biofilm formation by these organisms has not been characterized to our knowledge. Among
the order Spirochaetales, only Treponema denticola, which is
phylogenetically distant from leptospires, was shown to
form biofilms in vitro (Vesey & Kuramitsu, 2004).
Biofilm formation by Leptospira spp. may play an
important role in their ability to survive in diverse
1309
P. Ristow and others
environmental habitats, including in the host. This paper
describes, for the first time to our knowledge, the
characteristics of Leptospira spp. biofilms. We also discuss
the possible roles of these biofilms in the lifestyles of these
bacteria.
METHODS
Bacterial strains and growth conditions. The strains used for this
study are listed in Table 1. L. biflexa serovar Patoc strain Patoc1
(Institut Pasteur) and L. interrogans serovar Lai strain Lai 56601 (gift
from the National Institute for Communicable Disease Control and
Prevention, ICDC China CDC) were used as model bacteria to study
biofilm formation. Most of the strains were from the collection
maintained by the National Reference Laboratory for leptospirosis at
the Institut Pasteur. Additional strains were obtained from humans,
dogs and rats (humans, strains L1130, L1 133 and Eco Challenge;
dogs, strains Hook and Kito; rats, strains R 59 and R 61) and were
provided by Albert I. Ko (Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz,
Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Brazil). High-passage strains refer
to strains that have been subcultured in EMJH liquid medium more
than 10 times. Virulence of low-passage strains was maintained by
passages in guinea pigs or hamsters. All strains were cultured without
shaking at 30 uC in EMJH (Ellinghausen & McCullough, 1965;
Johnson & Harris, 1967) broth containing 1 % BSA.
Biofilm experiments. Strains were replicated without shaking at
least twice in liquid EMJH before performing biofilm experiments.
Tests were performed with a starting bacterial suspension inoculum
of 106 bacteria ml21 from a mid-exponential-phase culture (around
Table 1. Biofilm-forming capacities of Leptospira strains grown in static EMJH liquid. Leptospira
strains were cultured in glass tubes for 2 months at 30 6C as indicated in Methods
Data are the results of at least three independent observations.
Species
Serovar*
StrainD
Biofilm formationd
Surface-associated Floating
Saprophytes
L. biflexa
L. meyeri
Pathogens
L. borgpetersenii
L. borgpetersenii
L. borgpetersenii
L. borgpetersenii
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. interrogans
L. kirschneri
L. kirschneri
L. kirschneri
L. noguchi
L. weillii
Patoc
Semaranga
Patoc 1
Veldrat Semarang 173
+
+
+
2
Castellonis
Hardjobovis
Sejroe
Tarassovi
Autumnalis
Australis
Bratislava
Bataviae
Canicola
Hebdomadis
Copenhageni
Copenhageni
Copenhageni
Copenhageni
Lai
Lai
Icterohaemorrhagiae
Pomona
Pyrogenes
Saxkoebing
Wolffi
Canicola
Canicola
Grippotyphosa
Grippotyphosa
Grippotyphosa
Australis
Hebdomadis
Castelon3 HP
Sponselee HP
M84 HP
Mitis Johnson HP
Akiyami A HP
Ballico HP
Jez-Bratislava HP
Van Tienen HP
Hond strain Utrecht IV HP
Hebdomadis HP
L1 130 LP
L1 130 HP
R 59 LP
R 61 LP
56601 HP
56601 LP
Verdun HP
Pomona HP
Salinem HP
Mus24 HP
3705 HP
L1 133 LP
Kito EFS LP
Moskva V HP
RM52 LP
RM52 HP
HooK EFS2 LP
Eco Challenge LP
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
+
2
+
+
+
+
+
+
+
2
+
+
+
+
+
+
+
+
2
2
2
2
2
2
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
*When underlined, only the serogroup of the studied strain is indicated (the serovar was not identified).
DHP, high-passage strain; LP, low-passage strain.
dBiofilm formation at the liquid–air interface. Symbols: 2, does not form biofilm; +, forms biofilm.
1310
Microbiology 154
Leptospira spp. biofilms
108 bacteria ml21), unless stated in the text. All biofilm experiments
were performed without shaking the cultures.
Biofilm formation was tested in glass tubes with 10 ml EMJH liquid
medium. Tubes were incubated at 30 uC for a period of 2 months and
cultures were observed daily for the formation of surface-associated
biofilms at the air–liquid interface and floating biofilms, i.e. floating
pellicles that cover the liquid medium surface (Table 1). Biofilm
production of L. biflexa was also assessed in a low-nutrient
environment (inoculation of a 1 ml exponential-phase culture grown
in EMJH into 9 ml mineral water). For this purpose, L. biflexa was
cultured in glass tubes with filter-sterilized natural mineral water.
Biofilm production in commercially available non-carbonated natural
mineral water [pH 6.8; mineral content (mg l21): Na+, 2.7; K+, 0.9;
Ca2+, 7.1; Mg2+, 2; Cl2, 2; SO2{
4 , 6.6; NO3 , 2; HCO3 , 24] was
investigated over 2 weeks.
Biofilm formation was measured in 12-well polystyrene plates (flatbottom wells, tissue culture treated; Corning) with 700 ml EMJH
liquid medium. Polystyrene plates were sealed during incubation to
avoid desiccation. At different time points, the liquid culture was
removed by aspiration and the wells were gently rinsed once with
distilled water to remove non-adherent planktonic cells. Surfaceassociated cells were air-dried for 15 min and fixed with 2 % sodium
acetate. The sodium acetate solution was removed by aspiration and
surface-associated cells were allowed to dry again. Cells were then
stained with 900 ml 1 % crystal violet solution for 20 min. The crystal
violet was removed by aspiration, and the wells were carefully rinsed
three times in distilled water. Crystal violet remaining in the wells was
then dissolved in 1 ml of an ethanol/acetone (v/v 80/20) solution and
the A600 was measured.
Light microscopy of biofilms. Glass slides (76626 mm, MenzelGlaser) were incubated half submerged in a bacterial suspension
(initial concentration 106 bacteria ml21) and observed at different
times (1, 6, 16, 24, 40, 48, 64, 72, 160 and 190 h). After incubation,
slides were rinsed three times in distilled water, air-dried, fixed by
heating and observed by phase-contrast microscopy using a Nikon
FXA microscope (2006 magnification).
Electron microscopy of biofilms. For electron microscopy, glass
coverslips (18618 mm, Menzel-Glaser) were placed into wells of 12well polystyrene plates (Corning) with 2 ml of a bacterial suspension
at 106 bacteria ml21 for L. biflexa and at 56106 bacteria ml21 for L.
interrogans, and cultures were incubated for 2 and 8 days,
respectively. Coverslips were then removed and rinsed once in sterile
distilled water to remove non-adherent planktonic cells. For scanning
electron microscopy (SEM), L. biflexa and L. interrogans biofilms were
fixed in 2.5 % glutaraldehyde/0.1 M cacodylate buffer at 4 uC for 1 h
and overnight, respectively. The floating biofilm of L. biflexa was
grown in 10 ml liquid EMJH medium for 72 h at 30 uC, then put on
a glass coverslip, dried for 10 min at room temperature and fixed in
2.5 % glutaraldehyde/0.1 M cacodylate buffer at 4 uC for 1 h. Fixed
samples were rinsed three times with 0.2 M cacodylate buffer, postfixed with 1 % osmium tetroxide in 0.2 M cacodylate buffer for
15 min, and washed in water. Samples were treated with 0.2 % tannic
acid for 20 min, rinsed with water and treated with 0.5 % osmium
tetroxide in 0.2 M cacodylate buffer for 5 min; this step was done
twice. Samples were gradually dehydrated in ethanol baths, desiccated
and carbon evaporated. Samples were observed with a secondary
electron in-lens (SEI) detector using a JEOL JSM 6700F field
emission scanning electron microscope. For cryo-scanning electron
microscopy, after washing coverslips in sterile water, they were
submerged in liquid nitrogen, cryofractured, sublimated for 20 min at
295 uC, and metallized with chrome for 120 s. Samples were
observed with a lower electron image (LEI) detector, using the above
scanning electron microscope. For transmission electron microscopy
(TEM), biofilms were fixed in 1.6 % glutaraldehyde/0.1 M Sorensen
http://mic.sgmjournals.org
buffer pH 7.2 and rinsed three times for 10 min in Sorensen buffer.
Biofilms were post-fixed in 1 % osmium tetroxide/0.1 M Sorensen
buffer for 1 h, washed in water, dehydrated through a graded series of
ethanol baths and embedded in Epon. Ultrathin sections were
observed using a JEOL JEM 1010 electron microscope.
Mutagenesis in L. biflexa. Directed mutagenesis was carried out in
L. biflexa serovar Patoc strain Patoc1 as previously described (Louvel
& Picardeau, 2007). Briefly, a pGEM7Z-f+ (Promega) derivative
plasmid was used for the construction of plasmids containing the
genes LEPBIa2006 and LEPBIa2008. The process was as follows. PCR
primers for the amplification of the spectinomycin-resistance cassette
and the left and right arms of the target gene were designed and in
each instance introduced a restriction endonuclease site at each end of
each PCR product. The resulting three PCR products were digested
with the appropriate restriction endonucleases, and ligated into the
pGEM7Z-f+ derivative plasmid. The plasmid constructs delivering
the inactivated allele was formed by insertion of a spectinomycinresistance cassette between the right and left arms (#0.5 kb in length)
of the target gene, introducing a partial gene deletion. These plasmids,
which are not replicative in Leptospira spp., were then subjected to
UV irradiation and used to deliver the inactivated alleles into L.
biflexa. Spectinomycin-resistant colonies were picked and tested for
allelic exchange in the target gene by PCR. By using a similar strategy,
we also generated a flaB mutant (LEPBIa1589) in L. biflexa (Picardeau
et al., 2001). The complete genomic sequence of L. biflexa serovar
Patoc strain Patoc1 has been deposited in GenBank under the
accession numbers CP000786, CP000787 and CP000788.
RESULTS AND DISCUSSION
Formation of biofilms on abiotic surfaces by
saprophytic and pathogenic Leptospira species
The genus Leptospira is composed of more than 16
pathogenic and saprophytic species (Levett, 2001).
Although these spirochaetes have the ability to survive in
diverse environmental habitats, we lack a fundamental
understanding of most aspects of their biology.
We initially observed that, under static conditions, the
pathogen L. interrogans serovar Lai strain Lai 56601 formed
a halo attached to the wall of glass tubes at the air–liquid
interface in approximately 10 days at 30 uC (Fig. 1). For
the saprophyte L. biflexa serovar Patoc strain Patoc1, when
grown under static conditions, cells were found to strongly
attach to the glass surface after 2 days. For L. biflexa, we
also observed the formation of a floating pellicle at the
liquid–air interface after 4–5 days’ incubation (Table 1).
We therefore tested a variety of saprophytic and pathogenic
strains for their ability to form biofilms attached to glass
tubes or floating pellicles in nutrient-rich liquid medium in
glass tubes (Table 1). A total of 90 % of the tested strains,
which belong to seven Leptospira species, exhibited the
ability to form biofilms. Whereas saprophytes formed
biofilms in 2–5 days, a mean of 20 days was necessary for
biofilm formation by pathogens (data not shown). This is
correlated with the growth rates of saprophytes and
pathogens, respectively (Faine et al., 1999). Only a minority
of strains were also able to form floating biofilms. Finally,
three strains did not form biofilms on glass tubes (Table 1).
1311
P. Ristow and others
ability of low- and high-passage strains to form biofilms.
Pathogenic strains recovered from experimentally infected
guinea pigs, or low-passage strains, retained the biofilm
formation phenotype. Similarly, the biofilm formation
phenotype was maintained when strains were passaged in
liquid cultures. Generally, low-passage strains showed a
higher level of biofilm formation (reduced time for the
appearance of biofilm and increased biomass) than highpassage strains (data not shown).
Fig. 1. Visualization of biofilms formed by Leptospira spp. (A)
Surface-attached biofilm of L. interrogans serovar Lai was found at
the air–liquid interface in glass tubes containing 10 ml EMJH liquid
medium incubated at 30 6C for 10 days in a stationary batch
culture (1 ml liquid medium was removed from the glass tube
before taking the picture). (B) Crystal violet staining of biofilms of
L. biflexa serovar Patoc attached to polystyrene plates at 2 days.
Pathogenic leptospires are known to show reduced
virulence phenotype after repeated in vitro cultures
(Haake et al., 1991). It has also been reported that colony
morphology variants (leptospires grow into solid medium
in subsurface colonies) may arise after continuous in vitro
passages (Wood et al., 1981). We therefore assessed the
The saprophyte L. biflexa serovar Patoc strain Patoc1 and the
pathogen L. interrogans serovar Lai strain 56601 were chosen
for further biofilm analysis because these strains have been
well characterized and both their genomes have been
sequenced (M. Picardeau, unpublished; Ren et al., 2003).
We assessed biofilm formation under static conditions at
different temperatures. In this in vitro model of biofilm
formation in tubes, the temperature of incubation did not
influence the development of L. biflexa biofilms, as we
observed formation of similar surface-attached biofilms at
21, 30 and 37 uC. The ability to form biofilms was also
assessed in a low-nutrient environment (see Methods).
Again, L. biflexa was observed to form biofilms in glass
tubes with natural mineral water. However, the strain
showed a delay in biofilm production, which correlated
with slower growth in comparison to growth in EMJH
medium (data not shown).
Fig. 2. Light micrographs of L. biflexa biofilms
on glass slides. (A) Single bacteria attached to
glass at 1 h at the air–liquid interface. (B) Cell
aggregates forming intricate network structures at 24 h at the air–liquid interface. (C)
Attached bacteria form microcolonies covered
by an amorphous matrix at 2 days. (D) Biofilms
are less dense below the liquid–air interface at
2 days. (E) Cellular aggregates are interspersed with areas devoid of cells or matrix
at 6 days at the air–liquid interface. (F) Cells
from a pellicle (floating biofilm) form a dense
zone of bacteria at 4 days.
1312
Microbiology 154
Leptospira spp. biofilms
Fig. 3. Scanning electron microscopy of L. biflexa biofilms. Intricate network of bacteria forming microcolonies strongly
attached to the surface were observed (A, white arrowheads). Both glass-surface-associated (B, C) and pellicle (D) biofilms
showed that the cells were densely packed side by side, and embedded in a matrix.
For L. interrogans, biofilms were only observed at 30 and
37 uC, but bacterial growth was not optimal at 21 uC (data
not shown).
We also assessed biofilm formation of L. biflexa on
different plastic surfaces by visual and direct microscopic
examination after repeated washes. L. biflexa formed
biofilms after 2 days growth not only on polystyrene plates
(Fig. 1B), but also on polyolefin polymers (data not
shown). Although we observed slight adherence of L.
interrogans to polystyrene flasks and plates, biofilms were
not resistant to washes. The fastidious growth of pathogenic leptospires may affect the rate of bacterial attachment
and biofilm formation in static conditions. A continuousculture biofilm system may be more suitable for cultivating
and characterizing biofilms of pathogenic leptospires.
Microscopy analysis of biofilms on abiotic
surfaces
As a first approach, we used light microscopy to study
biofilm formation by L. biflexa over time. Cells were
allowed to adhere to and form biofilms on glass slides and
were observed by phase-contrast light microscopy at
intervals. The adherence of L. biflexa and subsequent
biofilm formation on a glass surface is illustrated in Fig. 2.
http://mic.sgmjournals.org
L. biflexa formed a dense layer on glass slides, which
increased in a time-dependent manner, reaching maximal
levels at 48 h. Fig. 2(C) shows typical surface coverage of
the biofilm. As documented for other biofilm-forming
bacteria, the developmental process of L. biflexa biofilm
formation can be characterized as a three-step process: (i)
adherence of planktonic cells to the surface (Fig. 2A), (ii)
biofilm maturation (Fig. 2C), and (iii) complete or partial
disintegration of the biofilm (Fig. 2E). The microscopic
aspect of the pellicular biofilm resembles the biofilm
attached to a glass surface (Fig. 2). L. biflexa cells form
denser biofilms at the air–liquid interface than below this
interface (Fig. 2). This is probably due to the fact that
leptospires are motile and obligate aerobic spirochaetes.
We used SEM to confirm the results obtained by light
microscopy and to elucidate the biofilm architecture. We
observed thick biofilms consisting of bacteria associated
with amorphous material at the air–liquid interface (Figs 3
and 4). For L. biflexa, there were intertwined networks of
attached cells that served as scaffolding for further biofilm
development over time. At 48 h, we observed the
formation of microcolonies (Fig. 3A) and, at a higher
magnification, large clusters of cells surrounded by
components of the matrix (Figs 3B and C). For L.
interrogans, at 8 days, microcolonies appeared as large,
1313
P. Ristow and others
distinct mound-shaped colonies, with the top cell layer
covered with a matrix-like material (Fig. 4A). Two types of
biofilm architecture were observed: one (L. interrogans)
consisting of large, distinct mound-shaped microcolonies,
and the other (L. biflexa) showing smaller microcolonies
with a flatter structure that were linked together by a
complex network of bacteria. In SEM, samples are prepared
by fixation, staining, drying and coating prior to imaging
under high vacuum. In other bacterial biofilms, the matrix
is essentially composed of water, but also includes
polysaccharides, proteins and nucleic acids. Desiccation
of the samples may therefore alter the biofilm morphology.
We therefore used TEM, which stabilizes the biofilms by
embedding samples in a resin, and cryo-scanning electron
microscopy. In this latter technique, samples are not
treated chemically as in conventional scanning, but are
immediately frozen in liquid nitrogen. This technique is
recommended for fragile and highly hydrated samples. By
cryo-scanning electron microscopy and TEM, Leptospira
biofilms appear to form multicellular and multilayered
structures, ranging from 5 to 14 mm and from 10 to 30 mm
in thickness for L. biflexa and L. interrogans, respectively
(Fig. 5). Bacteria were separated by void spaces that may
correspond to channel-like spaces that provide oxygen and
nutrients to embedded cells. For planktonic bacteria
(culture grown under agitation with no formation of
biofilm), SEM identified only a few spirochaetes on the
surface and no multilayered bacteria (data not shown).
The constituents of the matrix of leptospires remain to be
determined. In other bacteria, polysaccharides, after water,
are major components of the matrix (Hall-Stoodley et al.,
2004). The annotation of the genomes, including the
genome of the saprophyte L. biflexa serovar Patoc strain
Patoc1 (M. Picardeau, unpublished), suggested that several
genes are involved in the biosynthesis of polysaccharides
(Bulach et al., 2006; Nascimento et al., 2004; Ren
et al., 2003). Approximately 30 genes encoding putative
glycosyltransferases, which are capable of synthesizing
levans and dextrans, are found in the genomes of
both saprophytic and pathogenic Leptospira species.
Interestingly, genes involved in alginate biosynthesis are
present in both L. biflexa (11 genes) and L. interrogans (8
genes), but are absent in Leptospira borgpetersenii, a finding
consistent with the reduced environmental survival of L.
borgpetersenii (Bulach et al., 2006).
Quantification of biofilm formation
Biofilm formation can be quantified by crystal violet
staining of the cells attached to the surface. In the present
Fig. 4. Scanning electron microscopy of L. interrogans biofilms on a glass surface. At 8 days, cells were strongly attached to
the glass surface at the liquid–air interface (A–D). The pathogenic strain forms biofilms consisting of large mound-shaped
microcolonies (a). Micrographs show organisms embedded in a matrix (B–D). (D) Higher magnification of the boxed area in (B).
1314
Microbiology 154
Leptospira spp. biofilms
Fig. 5. Biofilm morphology of L. biflexa and
L. interrogans on a glass surface. (A)
Cryofracture of L. biflexa biofilm by cryoscanning electron microscopy after growth
for 48 h (scale bar: 10 mm). (B, C)
Transmission electron micrographs of L. interrogans biofilm after growth for 8 days. Scale
bars: B, 10 mm; C, 2 mm.
study, we showed that 12-well polystyrene plates yielded
the largest amount of surface-attached biomass for L.
biflexa (Fig. 1B). In light of these results, we assayed biofilm
formation of L. biflexa in polystyrene plates at 30 uC under
static conditions. In this assay, biomass was formed at the
bottom of the wells and at the liquid–air interface (data not
shown), and crystal violet staining reached a maximal A600
of approximately 2 after 2 days. Afterwards, the crystal
violet staining became lower and A600 values were low as
soon as 72 h incubation (Fig. 6). The increase in crystal
violet staining and biofilm production was correlated with
bacterial growth in the medium and ceased in the
stationary growth phase.
To study the roles of the flagella and motility in the biofilm
formation, we tested the L. biflexa flaB mutant (Picardeau
et al., 2001), which is defective in the synthesis of the
endoflagella and non-motile, in polystyrene plate assays.
The flaB mutant was able to form biofilms, showing that
the flagella of leptospires, which are located in the
http://mic.sgmjournals.org
periplasm, are not essential for biofilm formation.
However, the flaB mutant exhibited a delay in biofilm
formation (Fig. 6). To determine the effect of alginate on
biofilm formation by L. biflexa, we generated mutants in
two of the genes, alg1 (LEPBIa2006) and alg2
(LEPBIa2008), that could be involved in alginate biosynthesis. LEPBIa2006 and LEPBIa2008 exhibit 41 and 66 %
similarity with the putative alginate biosynthesis protein
AlgJ of Pseudomonas syringae and a putative alginate Oacetyltransferase of Bacillus anthracis, respectively. The
average level of maximum biomass for the mutant strains
was similar to the parent strain. However, this level was
reached with a 24 h lag for the alg1 mutant compared with
the parent strain. The lack of an obvious phenotype in
these mutants could be due to functional redundancy with
other alginate biosynthetic genes.
We recently identified transposon mutants of L. biflexa that
were not able to use some iron sources for survival (Louvel
et al., 2005, 2006). Using transposon mutagenesis, we could
1315
P. Ristow and others
Fig. 6. Biofilm quantification by crystal violet staining. Biofilms
formed by L. biflexa mutants of flaB (grey bars), alg1 (striped bars),
and alg2 (bars with dots) were compared with the biofilm formed
by the parent strain (black bars) by visualization with crystal violet
staining on a polystyrene surface (white bars: crystal violet staining
of wells that contained only culture medium). The amount of biofilm
was quantitatively measured as A600. Error bars are standard
errors derived from four replicate experiments.
also screen a library of random mutants in a polystyrene
plate assay to identify biofilm-defective mutants.
Role of biofilm formation in Leptospira spp.
Bacterial biofilms have a structurally complex and dynamic
architecture and can develop on many surfaces. Both
saprophytic and pathogenic Leptospira strains were found
to form surface-associated biofilms in standing cultures.
The progression of biofilm formation by Leptospira spp.
mimics other biofilms described in the literature, beginning
with individual bacteria adhering to the abiotic surface,
expansion into colonies, and formation of a threedimensional structure (Hall-Stoodley et al., 2004).
Our data, based on SEM and TEM, show differences in
biofilm architecture between a strain of the pathogen L.
interrogans serovar Lai and a strain of the saprophyte L.
biflexa serovar Patoc in the tested conditions. This may be
correlated with phylogenetic and lifestyle differences
between pathogenic and saprophytic strains. L. interrogans
is an important animal and human pathogen, but it was
not previously considered as a biofilm-building species.
Our study revealed that the majority of pathogenic strains
produced detectable biofilms on abiotic surfaces in vitro.
Bacteria in biofilms exhibit properties distinct from those
of planktonic cells, such as increased resistance to biocides
and antimicrobial agents (Hall-Stoodley et al., 2004).
Multi-species biofilms may also contribute to gene transfer
between micro-organisms (Wang et al., 2002). It was
recently shown that severe leptospirosis was associated with
exposure to a high concentration of leptospires in
environmental water samples (Ganoza et al., 2006).
Biofilm formation may contribute to long-term survival
in environmental water (Trueba et al., 2004). In our study,
natural mineral water was also used as the sole source of
1316
nutrient supply to allow the development of L. biflexa
biofilms. The ability of pathogenic Leptospira to survive in
aquatic ecosystems in biofilms could be one of the main
factors controlling environmental survival and disease
transmission. Since the long-term colonization of proximal
renal tubules of mammalian maintenance host species by
pathogenic leptospires is believed to proceed via the
formation of cell aggregates (A. I. Ko, unpublished data),
biofilm formation may also play an important role in
maintaining chronic carriage of the pathogen L. interrogans
in animal reservoirs. The determination of the structure
and the mechanism of colonization of kidneys in the
animal reservoir will no doubt be of fundamental
importance.
Further studies are required to study the biofilms of these
ubiquitous organisms in the context of their environmental
habitats such as fresh water or renal tubules.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work is part of the doctoral thesis of P. R. at the Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Brazil. We are grateful to L. S. Fonseca, F.
Aviat, A. I. Ko, J.-M. Ghigo, E. Couture-Tosi, C. Beloin and F. Guinet
for their support and eucouragement. We also thank S. Guadagnini
and M. Sachse for assistance and J. M. Panaud for graphical
assistance. This work was supported by a training grant from the
National Institutes of Health (2 D43 TW00919), CAPES (Brazil), the
French Ministry of Research «ANR Jeunes Chercheurs» (no. 05-JCJC0105-01), and Pasteur-Fiocruz and Pasteur-Weizmann scientific
cooperation programmes.
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Edited by: G. E. Duhamel
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