Elyara
Helder
Wendy
Abordagens...
 Diferenciação/Desenvolvimento de Th2
 STAT3
 STATs e Diferenciação
 Diferenciação e epigenética
STATs X Células T CD4+
Cytokine, 47: 149-156, 2009.
JAK/STATs X Células T CD4+
Arch Immunol Ther Exp, 55: 231-245, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.
STATs X Células T CD4+
Curr Opin Immunol, 21(2): 161-166, 2009.
STAT3 - Estrutura
Apresenta 6 domínios conservados
Interação
com DNA
Interação
proteína-proteína
Interação
com PY
Atividade
transcricional
Arch Immunol Ther Exp, 55: 231-245, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.
STAT3 - Função
Importância de STAT3 → camundongos stat3-/- →
morte durante o desenvolvimento embrionário
Proc Natl Acad Sci USA 94: 3801-3804, 1997.
STAT3 - Função
Ativado por diversas citocinas
e fatores de crescimento
Clin Cancer Res, 13::5665-5669, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.
STAT3 - Função
↑ expressão de genes com funções inibitórias (IL-10, TGF-β);
↓ expressão de genes com funções pro-inflamatórias (IFNs, IL-12,
TNF, MHCII, CD80/86)
Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.
STAT3 - Tumor
Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Curr Opin Immunol, 20(2): 228-233, 2008.
STAT3 – Células T
STAT3 → papel crítico em vários tecidos
Células T CD4+
stat3-/-
Nenhum déficit evidente no
desenvolvimento
Timo e compartimentos
periféricos normais
Reduzida proliferação
dependente de IL-6 e IL-2
Int Immunol, 10: 1747-1751, 1998; J Immunol, 161: 4652-4660, 1998.
STAT3 – Diferenciação de células Th17
Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009; Curr Opin Immunol, 21(2): 161-166, 2009.
.
STAT3 – Doenças inflamatórias crônicas
Uveite → grupo de doenças inflamatórias
intraocular → envolvimento das células Th17
Modelo em camundongo:
Células T reativas – Th17
Doença inibida com anti-IL-17
CD4stat3-/- - resistentes a uveite
Nat Med, 13: 711-718, 2007
.
STAT3 – Doenças inflamatórias crônicas
Inflamação intestinal crônica → envolvimento das
células Th17 e STAT3
STAT3 – Th2
Objetivo
Demonstrar função de STAT3 no padrão de resposta Th17 (modelo de colite)
e na expansão homeostática de TCD4+ naïve nos órgãos linfóides
Estabelecimento de modelo de colite, através da
transferência de células TCD4+ naïve, para avaliar papel
do STAT3
Controle: Stat3fl/fl
TCD4+
Baço e linfonodos
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+ naïve
CD25-CD45RBhigh
iv
4.105
Rag2-/-
Estabelecimento de modelo de colite, através da
transferência de células TCD4+ naïve, para avaliar papel
do STAT3
9 weeks
STAT3 foi, portanto, crítico para o desenvolvimento de colite (órgão
específico), bem como para respostas inflamatórias sistêmicas.
Papel de STAT3 no diferenciação deTh17: responsável
pela produção de IL-17?
Controle:
Stat3fl/fl
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+
naïve
CD25CD45RBhigh
9 semanas
Rag2-/-
Lâmina Própria
Linfonodos Mesentéricos
Baço
FACS TCD4+ IL17+
STAT3 é necessário para a produção de IL-17A, mas não para IFN-γ, em
células TCD4+, utilizado modelo de colite.
Papel de STAT3 na conversão de células TCD4+ naïve para
Treg em modelo de colite
Concentração homeostática de Treg nos doadores de TCD4+
Controle: Stat3fl/fl
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
Lâmina Própria
Linfonodos Mesentéricos
Baço
FACS TCD4+ Foxp3+
STAT3 tem pouco efeito sobre a expressão de Foxp3 em
células TCD4+, na ausência de inflamação.
Papel de STAT3 na conversão de células TCD4+ naïve para
Treg em modelo de colite
Concentração de Treg em ambiente inflamatório
Controle:
Stat3fl/fl
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+
naïve
CD25CD45RBhigh
9 semanas
Rag2-/-
Lâmina Própria
Linfonodos Mesentéricos
Baço
STAT3 inibi a conversão de TCD4+ naïve para Treg
Foxp3+, em ambiente inflamatório.
FACS TCD4+ Foxp3+
TCD4+ naïve
CD25-CD45RBhigh
(Stat3-/-)
Cd4 Cre; Stat3fl/fl
IL-17A +
Rag2-/-
Foxp3 +
Score Clínico
STAT3 regula então quais genes envolvidos na
diferenciação de padrão Th17?
Regulação gênica
Controle: Stat3fl/fl
TCD4+
Baço e linfonodos
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+ naïve
CD4+CD44-CD62L+
anti-CD3, anti-CD28
IL-6, TGF-β,
anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ
72h
STAT3 liga-se a mais de 3000 genes
Liga-se a muitos genes associados
a diferenciação de Th17
IL-6
ChIP-Seq
1h
anti-pSTAT3
anti-H3K4Me
Szalkowski A M , Schmid C D Brief Bioinform 2010;bib.bbq068
STAT3 regula então quais genes envolvidos na
diferenciação de padrão Th17?
Expressão gênica
Controle: Stat3fl/fl
TCD4+
Baço e linfonodos
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+ naïve
CD4+CD44-CD62L+
anti-CD3, anti-CD28
IL-6 e/ou TGF-β,
anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ
IL-6
1h
Microarray
PCR em Tempo Real
72h
STAT3 regula positivamente modificações epigenéticas nos genes em que
é alvo, aumentando sua expressão e, portanto contribui para estabilidade
do padrão Th17.
Ainda no modelo de inflamação sistêmica através de
colite ...
Controle:
Stat3fl/fl
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+
naïve
CD25CD45RBhigh
9 semanas
Rag2-/-
• Lâmina Própria
• Linfonodos Mesentéricos
• Baço
FACS TCD4+
Apesar da ausência de inflamação
corroborar com pequeno infiltrado de
células no recipiente Rag2-/-, porque as
células TCD4+ Stat3-/- não se acumulam
num recipiente linfopênico?
Criando-se um ambiente inflamatório junto com a
transferência de células TCD4+ Stat3-/-, estas acumular-seiam nos órgãos linfóides?
9 semanas
• Lâmina Própria
• Linfonodos Mesentéricos
• Baço
FACS
TCD4+ CD45.1
TCD4+ Cd4 Cre; Stat3 fl/fl
Portanto, STAT3 tem papel importante na expansão de células T, num
ambiente inflamatório.
E como seria a expansão das células TCD4+ na ausência
de inflamação?
Controle: CD45.1
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
TCD4+
naïve
CD25CD45RBhigh
2 semanas
Rag2-/-
•Linfonodos Mesentéricos
• Baço
FACS TCD4+
A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- em acumular-se indica que
STAT3 tenha papel na expansão de células T, anterior ao
estabelecimento da inflamação.
Qual seria a importância de STAT3 na expansão
homeostática de células T?
Controle: CD45.1
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
8 semanas
Medula
óssea Rag2-/-
• Timo
• Linfonodos Mesentéricos
• Baço
FACS células T
Qual seria a importância de STAT3 na expansão
homeostática de células T?
Controle: CD45.1
(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl
MO
1:1
8 sem
Rag2-/-
• Timo
FACS
• Linfonodos
• Baço
TCD4+ CD45.1
TCD4+ Cd4 Cre; Stat3 fl/fl
Modelo reconstituição competitiva
Portanto, STAT3 tem papel essencial na proliferação celular de TCD4+ não
somente em ambientes patológicos, mas também a partir de células tronco.