VI Simpósio de Pós-Graduação e Pesquisa em Nutrição e Produção Animal – VNP – FMVZ – USP – 2012
EFEITO DA PROGESTERONA E DO ESTRADIOL SOBRE A SINALIZAÇÃO
HIPOTALÂMICA DO NPY NO INÍCIO DA PUBERDADE EM NOVILHAS
NELORE¹
Juliane Diniz Magalhães², Milton Maturana Filho3, Bruno de Souza Mesquita2, Dannylo
Oliveira de Sousa2, Frederich Diaz Rodrigues2, Bárbara Santos Marques2, Luis Felipe
Prada e Silva²
¹Financiada pela FAPESP.
²Departamento de Nutrição e Produção Animal - FMVZ/USP/Pirassununga. e-mail:
[email protected]
3
Departamento de Reprodução Animal - FMVZ/USP/Pirassununga
INTRODUÇÃO
A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais nutrição, genética e
tratamentos hormonais alteram o início da puberdade é de fundamental importância para
o desenvolvimento de estratégias que reduzam a idade ao primeiro parto, e
consequentemente a taxa de desfrute do rebanho Nelore.
Foi investigado o efeito de dispositivos de progesterona (P4), e do estradiol endógeno,
sobre mecanismos moleculares controlando a obtenção da puberdade de novilhas Nelore
pré-púberes. Especificamente, as vias moleculares de sinalização do Neuropeptídeo Y
(NPY).
MATERIAL E MÉTODOS
Este experimento foi conduzido no campus da USP em Pirassununga no
Laboratório de Genômica Funcional do departamento de Nutrição e Produção Animal
da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia.
Trinta e cinco novilhas Nelores não púberes, e com idade entre 13 e 14 meses,
foram divididas em quatro tratamentos experimentais (nove ou oito por tratamento):
dispositivo de P4 sem estradiol (P-E); dispositivo de P4 com estradiol (P+E); sem
dispositivo de P4 e sem estradiol (E-); e sem dispositivo de P4 e com estradiol (E+). A
descrição detalhada dos tratamentos está representada na figura 1. As novilhas foram
alimentadas no cocho pós desmame até atingirem por volta de 280 kg, com
fornecimento de água à vontade. Ao término do tratamento hormonal as novilhas foram
abatidas e os hipotálamos colhidos, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e
mantidas à -80oC até extração do RNA total.
As amostras de tecido hipotalâmico foram submetidas à extração do RNA total
pelo método do Trizol e tratadas com DNAse I. Após a padronização dos primers, foi
quantificada a expressão relativa dos genes do NPY e de seu receptor NPY-Y1 por RTPCR em tempo real (qRT-PCR). As detecções das amplificações foram realizadas no
equipamento StepOne® (Applied Biosystems®) utilizando o reagente SYBR Green
master mix 2 X (Applied Biosystems®). Os dados de qRT-PCR foram analisados
utilizando o programa SAS, por meio de análise de covariância (ANCOVA), segundo
modelo proposto por Yuan et al. (2006).
1
Inserção
Dispositivo
P4
D-18
PES
USG
SG
D-12
USG
SG
D-4
USG
SG
Inserção
Dispositivo
P4
ASF
D-12
USG
SG
D-4
USG
SG
Retirada
Disp P4
ASF
Abate Tratamento
P-E
D-1
D0
USG
PES
SG
SG
Retirada
Disp P4
Abate
P+E
D-18
PES
USG
SG
D-1
USG
SG
D0
PES
SG
ASF
Abate
D-1
USG
SG
D0
PES
SG
ED-18
PES
USG
SG
D-12
USG
SG
D-4
USG
SG
ASF
Abate
E+
D-18
PES
USG
SG
D-12
USG
SG
D-4
USG
SG
D-1
USG
SG
D0
PES
SG
Figura 1. Representação esquemática dos tratamentos experimentais e seus respectivos abates. PES:
Pesagem; USG: Ultrassonografia; SG: Colheita de sangue; ASF: Aspiração Folicular; P4: Progesterona;
P-E, P+E, E+ e E-, siglas correspondentes aos tratamentos, onde: P = progesterona e E = estradiol
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi quantificada a expressão relativa por PCR em tempo real do gene do
Neuropeptídeo Y (NPY) e de seu receptor NPY-Y1 em relação ao gene constitutivo
18SRNA no hipotálamo de novilhas Nelore submetidas a diferentes tratamentos
experimentais. A análise da expressão gênica foi baseada no ΔCt (gene alvo – gene
controle).
A progesterona exógena estimulou a expressão do NPY na ausência do estradiol
endógeno, havendo um aumento em 7,56 vezes na expressão do NPY no tratamento P-E
quando comparado ao tratamento controle E- (Figura 6), confirmando o observado por
O’Conner et al., 1995. Quando observada a ação conjunta da P4 com o estradiol, não
houve efeito. Isolando o efeito do estradiol endógeno (E+) foi observado um aumento
de 2,1 vezes na expressão em relação ao tratamento E-, porém não houve diferença
estatística (P=0,40).
Quando analisado efeito da progesterona sobre a expressão do gene receptor do
NPY (NPY-Y1), foi observada maior expressão nos tratamentos E+ e P-E em relação ao
tratamento com estradiol e progesterona (P+E), porém sem diferença com o tratamento
controle (E-). No caso da expressão de NPY-Y1, a progesterona reduziu a expressão
deste receptor quando na presença do estradiol endógeno (P+E vs. E+) (Figura 2).
2
9,0
A
Razão da expressão gênica
8,0
7,0
NPY
6,0
NPY-Y1
5,0
4,0
3,0
AB
2,0
B
a
a
ab
B
1,0
b
0,0
E-
E+
P-E
P+E
Tratamentos
Figura 2. Efeito da progesterona sobre a expressão dos genes NPY e NPY-Y1no hipotálamo de novilhas
Nelore. O tratamento E- (sem progesterona e sem estradiol endógeno) foi utilizado como referência
(razão = 1). Linhas de barras representam o erro padrão da média. Letras maiúsculas evidenciam o efeito
do NPY. Letras minúsculas evidenciam o efeito do NPY-Y1 (P <0,05)
CONCLUSÕES
Os resultados de quantificação gênica compraram a hipótese inicial de ação da
progesterona através da sinalização do NPY.
LITERATURA CITADA
O'CONNER, J. L.; WADE, M. F.; BRANN, D. W.; MAHESH, V. B. Evidence that progesterone modulates anterior
pituitary neuropeptide y levels during the progesterone-induced gonadotropin surge in the estrogen-primed intact
immature female rat. Steroid Biochem. Malec. Bioi, v. 52, n. 5, p. 497-504, 1995
YUAN, J. S.; REED, A.; CHEN, F.; STEWART, C. N. JR. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC
Bioinformatics, v. 7, n. 85, 2006.
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