IDENTIFICAÇÃO DAS VARIAÇÕES ALÉLICAS DE
Saccharomyces cerevisiae NA FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL
Silva, A.C.P(1). Leite, A.L(1); Santos, F. J. A. L(1); Lima, M. C. S(1);
Neto, A. G. B. N(2,3); Brasileiro, B. T. R. V(1,3)
[email protected]
(1)
Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP, Recife - PE, Brasil, CNPq;
(2)
Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife - PE, Brasil;
(3)
Genetech Bioprodutividade, Recife - PE, Brasil.
RESUMO
A possibilidade de eventos de recombinação genética em leveduras industriais
desperta para a necessidade de um melhor entendimento de padrões de segregação
genética aberrantes das inter regiões entre repetições de microssatélites presentes.
Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar o padrão de segregação
meiótica de linhagens industriais de S. cerevisiae do processo de fermentação para a
produção de álcool combustível por destilarias do nordeste brasileiro através de perfis
genéticos obtidos pela amplificação com marcadores moleculares. As amostras de
linhagens haplóides foram submetidas à análise do padrão de segregação genética
utilizando os iniciadores (GTG)5 para a região ISSR. Os resultados que têm sido
publicados sobre a caracterização da população de S. cerevisiae em vários processos
fermentativos mostram uma diversidade maior do que a esperada. O iniciador (GTG)5
é capaz de distinguir os estados homozigotos e heterozigotos destas linhagens e se
tornou possível identificar o padrão de segregação dos fragmentos gerados. A
identificação e caracterização das variações alélicas que controlam características
relevantes para fermentação industrial fornecem a base para uma abordagem genética
possibilitando melhorar a performance fermentativa das leveduras industriais,
identificando os genes alvo para otimização via engenharia genômica.
Palavras-chave: Fermentação Alcoólica; Marcador (GTG)5; Linhagens Haplóides.
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INTRODUÇÃO
O etanol é uma fonte de energia renovável e considerada como uma boa
alternativa para substituir os combustíveis fósseis. Atualmente, o
continente americano é o maior produtor mundial de etanol, com
Estados Unidos e Brasil sendo os maiores produtores mundiais
(CASTANHEIRA, 2013). No Brasil, a levedura Saccharomyces
cerevisiae é utilizada em grande escala para a produção de etanol
combustível através da fermentação de mostos (caldo-de-cana e/ou
melaço) a partir de matérias-primas à base de cana de açúcar, sendo um
exemplo
de
sucesso
de
bioprocessos,
que
proporciona
um
biocombustível avançado, a preços competitivos e de baixo impacto
ambiental (DÁRIO, 2012; CASTANHEIRA, 2013).
Quando o fermento é submetido a um tratamento ácido (ácido sulfúrico
– 2N) antes de ser submetido a uma nova fermentação pode
comprometer a viabilidade das células e consequentemente, provocar
uma queda no rendimento da fermentação (BROSNAN et al. , 2000,
BASSO et al., 2008). Uma das explicações possíveis seria o aumento do
polimorfismo individual em decorrência de eventos recombinacionais
que modificariam o padrão de fragmentos amplificados. Ao longo das
últimas décadas, algumas leveduras selvagens de S. cerevisiae foram
isoladas, identificadas, caracterizadas e, eventualmente, reintroduzidas
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no processo, permitindo-nos a construir o conhecimento sobre esses
organismos (DELLA-BIANCA, et al., 2013; DÁRIO, 2012).
A possibilidade de eventos de recombinação genética em leveduras
industriais desperta para necessidade de um melhor entendimento de
padrões de segregação genética aberrantes das inter regiões entre
repetições de microssatélites presentes nesses micro-organismos.
Tendo em vista a direta influência desses rearranjos genéticos
aberrantes no discernimento das diferentes linhagens pelo marcador
(GTG)5, é importante identificar analisar o padrão de segregação
meiótica dos fragmentos de linhagens industriais haplóides P1 e P25 de
S. cerevisiae utilizando o marcador ISSR e saber como esses eventos de
recombinação podem interferir nos procedimentos de tipagem genética.
MATERIAL E MÉTODOS
Micro-organismos
As amostras de linhagens haploides foram provenientes de esporos de
oito tétrades da linhagem parental P25 e de três tétrades da linhagem
parental P1 da Coleção de Culturas do Laboratório de Genética do
Curso de Ciências Biológicas da Universidade Católica de Pernambuco,
Recife - PE.
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Extração do DNA
O processo de extração do DNA nuclear foi realizado pelo método
descrito por Silva-Filho et al. (2005). Para quantificação, a amostra foi
diluída 1:200 e levada ao espectofotômetro a 260 nm de comprimento
de onda, utilizando a relação 1D.O= 50 µg/ml (SAMBROOK et al.,
1989). O DNA extraído foi armazenado a –20ºC até o momento do uso.
Técnica Molecular
As análises de DNA-fingerprinting e ribotipagem por PCR foram feitas
segundo Silva-Filho et al. (2005b) e Liberal et al. (2007). As reações de
amplificação por PCR fingerprinting da região ISSR com o iniciador
(GTG)5 (5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3') e por PCR-RAPD foram
realizadas no volume final de 25 µL nas seguintes condições: tampão de
PCR 10X (Tris-HCl 20mM pH 8.4; KCl 50mM), MgCl2 1.5mM, BSA
(Soro albumina bovina) 0,25µg/µL, dNTP 0.2mM, cada iniciador 12.5
pmols, Taq DNA polimerase 1.25 U (Operon Technologies CA), DNA
50 ng. A amplificação foi programada para realizar uma desnaturação
inicial de 6 minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos para desnaturação a
94ºC por 20 segundos, pareamento a 53ºC por 20 segundos, extensão a
72ºC por 60 segundos e finalmente, 5 minutos a 72º C para extensão
final.
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Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel
de agarose 1.3% a 7,5 volts/cm por 90 minutos em tampão TBE 0,5X
(Tris-Borato-EDTA) utilizando-se o marcador de peso molecular de
100-bp (Invitrogen Life Technologies), corados em brometo de etidio
TBE 1X / EtBr 0,5 µg/mL (SAMBROOK et al., 1989), visualizados em
transiluminador
de
luz
U.V
e
fotografados
em
sistema
de
fotodocumentação Photocapt para posterior análise no programa
Photocapture.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
SILVA-FILHO et al. (2005a) caracterizou a dinâmica das populações
de leveduras ao longo do período de fermentação em seis destilarias do
Brasil, usando a sequência nucleotídica (GTG)5 como iniciador. Este
estudo permitiu o isolamento e caracterização de linhagens dominantes
de S. cerevisiae que podem ser comercializadas como fermento para
destilarias de álcool combustível (SILVA-FILHO et al., 2005b). Os
resultados que têm sido publicados sobre a caracterização da população
de S. cerevisiae em vários processos fermentativos mostram uma
diversidade maior do que a esperada. Existem três possíveis explicações
para este fato: 1) a entrada de células de diferentes linhagens no
processo industrial, 2) a multiplicação diferencial das células das
diferentes linhagens em momentos distintos dos processos ou 3)
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variação genética ocorrendo no genoma das células pré-existentes que
geram novas combinações reveladas pelos marcadores, seguidos de
multiplicação diferencial das células das diferentes variantes. Caso esta
terceira alternativa seja verdadeira, o uso destes marcadores de tipagem
pode ficar comprometido, assim como ocorre para as variações
cromossômicas que aportam certo grau de incerteza à técnica de
cariotipagem para análise de rotina da dinâmica populacional de
leveduras nos processos industriais. Desta forma, foi necessário se
calcular as taxas de variação destas marcas ou mesmo estudar o padrão
de segregação de algumas delas para se calcular o quanto eventos de
recombinação e segregação meiótica podem afetar os padrões de
tipagem das linhagens industriais.
A linhagem P25 foi identificada pela presença dos fragmentos comuns
que caracterizam a espécie S. cerevisiae, tais como de 3100 pb, 2200
pb, 1500 pb, 1450 pb, 1300 pb, 1080 pb, 1050 bp, 980 pb e 650 pb, e
pela presença dos fragmentos polimórficos de 2800 pb e 750 pb (Figura
2; SILVA-FILHO et al., 2005a). A linhagem P1 foi identificada pela
presença dos fragmentos comuns que caracterizam a espécie S.
cerevisiae, tais como os fragmentos de 3100 pb, 2200 pb, 1500 pb,
1450 pb, 1300 pb, 1080 pb, 1050 bp, 980 pb e 650 pb, e pela presença
dos fragmentos polimórficas de 2500 pb e 750 pb (Figura 2; SILVAFILHO et al., 2005a).
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As células da linhagem P25 apresentam uma taxa de esporulação
normal com tétrades completas. Os produtos de segregação desta
linhagem foram analisados e pode-se observar a presença de todos os
fragmentos espécie-específicas citadas. Além disso, os resultados
mostraram a segregação na proporção de 2:2 para cada uma dos
fragmentos polimórficos, indicando que a linhagem P25 é heterozigota
em relação às bandas de 2800 pb e 750 pb (Figura 1). Como mostrado
na tabela 1, dentre as 8 tétrades analisadas, 3 apresentaram a proporção
gamética de 1:1:1:1 (Figura 1), sugerindo-se que os locos
correspondentes
a
estes
fragmentos
devem
se
localizar
em
cromossomos distintos. Porém, as linhagens provenientes das tétrades 1
e 2 apresentaram ligação na segregação dos fragmentos.
As células da linhagem P1 apresentam uma taxa de esporulação menor
do que a da linhagem P25 e produz a maioria dos ascos com apenas três
ascosporos, indicando a presença de aneuploidia para pelo menos um
dos 16 pares de cromossomos homólogos. Neste trabalho, apenas as
tétrades completas foram analisadas e nos produtos de segregação desta
linhagem pode ser observada a presença de todos os fragmentos
espécie-específicas citados acima. Os resultados de tipagem com o
iniciador (GTG)5 mostraram que esta linhagem é homozigota em
relação os dois fragmentos marcadores de 2500 pb e 750 bp (Tabela 2).
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Isto mostra que este marcador é capaz de distinguir os estados
homozigotos e heterozigotos destas linhagens.
Figura 1. Padrão de amplificação do
DNA com o iniciador (GTG)5 de quatro
linhagens haplóides derivadas da
linhagem parental P25. A: linhagem
13A; B: linhagem 13B; C: linhagem
13C; D: linhagem 13D. Os fragmentos
polimórficos de 2800 pb e 750 pb estão
apontados.
A análise das proporções gaméticas da linhagem P25 nas diferentes
tétrades levanta duas hipóteses para o padrão de segregação dos
marcadores 2800 pb e 750 pb. A primeira sugere que os dois
marcadores estariam ligados no mesmo cromossomo na configuração
cis (tétrades 1 e 2) ou trans (tétrade 3), mas a uma distância genética em
torno de 50 cM que permite uma alta taxa de aparecimentos das formas
recombinantes (tétrades 5, 9, 12, 13 e 14). A segunda hipótese é que os
genes se encontram em cromossomos distintos, a partir da observação
das tétrades que apresentam o padrão Mendeliano de segregação
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esperado para genes não-ligados (tétrades 12, 13 e 14). A análise global
das proporções para os quatro arranjos alélicos possíveis revela uma
leve distorção das proporções para a configuração de ligação em cis.
Entretanto, a aplicação do teste estatístico do qui-quadrado indica que a
segunda hipótese parece a mais aceitável, de que os genes estão
localizados em cromossomos diferentes. Além disso, as proporções
gaméticas das tétrades 5 e 9 sugerem um evento de conversão gênica
que converte o alelo 2800- no alelo 2800+.
Tabela 1. Composição gamética das linhagens haplóides derivadas da linhagem industrial P25 quanto à
presença ou ausência dos fragmentos de DNA de 2800 pb e 750 pb geradas pela amplificação com o
iniciador (GTG)5. (A = presença de 2800, a = ausência de 2800, B = presença de 750, b = ausência de 750).
TÉTRADE
1
FRAGMENTOS DE DNA (pb)
Esporo A
2800 750
+
+
Esporo B
2800 750
+
+
Esporo C
2800 750
-
Esporo D
2800
750
-
2
-
-
+
+
+
+
-
-
3
-
+
+
-
-
+
+
-
5
+
+
-
+
-
+
+
+
9
-
+
+
+
+
+
-
+
12
-
-
+
-
-
+
+
+
13
+
-
-
-
+
+
-
+
14
+
-
-
-
+
+
-
+
TOTAL
Proporção
Gamética
2AB: 0Ab:
0aB: 2ab
2AB: 0Ab:
0aB: 2ab
0AB: 2Ab:
2aB: 0ab
2AB: 0Ab:
2aB: 0ab
2AB: 0Ab:
2aB: 0ab
1AB: 1Ab:
1aB: 1ab
1AB: 1Ab:
1aB: 1ab
1AB: 1Ab:
1aB: 1ab
11AB: 5Ab:
9aB: 7ab
9
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Tabela 2. Composição gamética das linhagens haploides derivadas da linhagem industrial P1quanto a
presença ou ausência das bandas de 2500 pb e 750 pb geradas pela amplificação com o iniciador (GTG)5. (A
= presença de 2800, a =ausência de 2800, B = presença de 750, b =ausência de 750).
TÉTRADE
6
Esporo A
2800 750
+
+
FRAGMENTOS DE DNA (pb)
Esporo B
Esporo C
Esporo D
2800 750 2800 750 2800
750
+
+
+
+
+
+
7
+
+
+
+
+
+
+
+
12
+
+
+
+
+
+
+
+
TOTAL
PROPORÇÃO
GAMÉTICA
2AB: 0Ab:
0aB: 2ab
2AB: 0Ab:
0aB: 2ab
0AB: 2Ab:
2aB: 0ab
4AB: 2Ab:
2aB: 4ab
CONCLUSÃO
Com este trabalho tornou-se possível identificar o padrão de segregação
dos fragmentos gerados pela amplificação do DNA de linhagens
haplóides de S. cerevisiae com o iniciador (GTG)5. Adicionalmente,
estes resultados mostram que estes loci podem se encontrar tanto no
estado homozigoto como no estado heterozigoto. Isto demonstra que
esses fragmentos apresentam um padrão Mendeliano de segregação e
que podem ser considerados alelos de um determinado locus
cromossômico. O estado heterozigoto foi mostrado pelo aparecimento
na progênie de descendentes que não apresentavam os fragmentos de
2800 bp ou 750 pb, a despeito do seu parental apresentar amplificação
destes fragmentos, assim, o caráter presença de fragmento é conferido
pela presença do alelo considerado dominante e que a ausência de
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fragmento corresponde à presença do alelo recessivo. Também foi
possível mostrar a ocorrência de eventos de recombinação recíproca e
não recíproca ocorrendo entre os dois alelos definidos pela amplificação
do fragmento de comprimento correspondente.
A linhagem industrial P25 foi então identificada como sendo
heterozigota para os dois fragmentos, cujos loci devem estar situados
em cromossomos diferentes. Por outro lado, a linhagem P1 mostrou-se
homozigota para os loci correspondentes aos dois fragmentos
marcadores.
No trabalho de Silva-Filho et al. (2005b; 2005c; Figura 5) mostrou que
o padrão de fragmentos gerados pelo iniciador (GTG)5 é útil na tipagem
e discriminação de linhagens de S. cerevisiae, exatamente, pela
presença ou ausência de fragmentos polimórficos para mais de 900
linhagens de S. cerevisiae, dentre linhagens de coleção, linhagens
comerciais e isolados industriais. Nota-se, por exemplo, a ausência nas
linhagens P4, P4a, P5, P15, P15a e P20 do fragmento de 750 bp.
Assumindo que estas linhagens são diplóides, mesmo com alguma
aneuploidia, os resultados apresentados no presente trabalho podem
concluir que estas linhagens são homozigotas para o alelo recessivo
(750-/750-).
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Pb
3100
2900
2800
2700
2600
2500
2200
1850
1500
1450
1350
1120
1080
1020
980
750
650
450
Figura 2. Eletroferograma de 16 perfis de amplificação gerados pelo iniciador (GTG)5 a partir da
amplificação do DNA de S. cerevisiae isoladas de uma destilaria de álcool combustível. Os perfis P21 e P22
correspondem ao de duas leveduras que não são S. cerevisiae. Fonte: Silva-Filho et al. (2005b; 2005c).
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