Controle de florações de cianobactérias tóxicas – busca
por auto-inibidores de crescimento em Microcystis
DIOGO DE ABREU MEIRELES
Dissertação apresentada ao centro de
Biociências
e
Biotecnologia,
da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para a obtenção do
título de Mestre em Biociências e
Biotecnologia, com ênfase em Biologia
Molecular e Biotecnologia.
Orientadora: Dra. Denise Saraiva Dagnino
Campos dos Goytacazes - RJ
Maio, 2006
Controle de florações de cianobactérias tóxicas – busca
por auto-inibidores de crescimento em Microcystis
DIOGO DE ABREU MEIRELES
Dissertação apresentada ao centro de
Biociências
e
Biotecnologia,
da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para a obtenção do
título de Mestre em Biociências e
Biotecnologia, com ênfase em Biologia
Molecular e Biotecnologia.
Aprovada em 24 de maio de 2006.
Comissão examinadora:
___________________________________________________________________
Profa. Anna Lvovna Okorokova Façanha (Dra. em Química Biológica) – UENF
___________________________________________________________________
Prof. Arnoldo Rocha Façanha (Dr. em Química Biológica) – UENF
___________________________________________________________________
Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho (Dr. em Biociências e Biotecnologia) –
UENF
___________________________________________________________________
Profa. Vera Lúcia de Moraes Huszar (Dra. em Ecologia e Recursos Naturais) –
Museu Nacional/RJ
___________________________________________________________________
Profa. Denise Saraiva Dagnino (Dra. em Ciências Matemáticas e da Natureza) –
UENF
(Orientadora)
ii
“Se um dia já homem feito e realizado
sentires que a terra cede aos teus pés,
que tuas obras desmoronam,
que não há ninguém a tua volta
para te estender a mão,
esquece a tua maturidade,
passa pela tua mocidade,
volta a tua infância e balbucia,
entre lágrimas e esperanças,
as últimas palavras que sempre te
restarão na alma
Minha Mãe, Meu Pai!”
Rui Barbosa
Dedico este trabalho a minha família: meu
pai, Idevaldo; minha mãe, Norma; minha
irmã, Elaine e meu sobrinho, Gabriel.
AMO VOCÊS.
iii
EU
Agradecimentos
___________________________________________________________________
Agradecimentos:
Agradeço a Deus por me dar força nos momentos de luta e esperança quando
sentia que tudo estava perdido.
Agradeço aos meus tios e primos por todo carinho e conforto.
Agradeço aos meus amigos: Ana Lustozza, Gabriela Gesualdi, Gustavo Chagas,
Izabela da Silva, Maria Cristina, Thaís Granato, Wendell e em especial Anna Rosa
Carvalho, Inês Costa, Janice Dias e Viviane Cabral, por sete anos companheirismo.
Agradeço as minhas companheiras de trabalho e amigas: Ana Laura Boechat, Erika
Fraga, Érica Santana, Gláucia Fragoso, Marina Silva, Rafaela Silva e Thays Abreu.
Agradeço a Débora Abreu Rangel pelo carinho e amizade.
Agradeço a minha orientadora, profa. Denise Saraiva Dagnino pela minha formação.
Agradeço ao prof. Jan Schripsema, pela interpretação dos espectros de RMN e
apoio na realização deste trabalho.
Agradeço ao prof. João Carlos de Aquino Almeida, pelas micrografias eletrônicas e
também pela amizade.
Agradeço ao revisor desta dissertação, o prof. Ekkhard Ernst Theodor Hansen pela
boa vontade.
Agradeço as profas. Anna L. Okorokova Façanha e Tânia Jacinto pelo apoio nos
momentos finais de minha formação.
Agradeço a todos os membros da banca por terem participado da defesa desta
dissertação.
Agradeço a todos os companheiros de laboratório que por muitos anos estiveram
presentes em minha vida acadêmica.
iv
Agradecimentos
___________________________________________________________________
Agradeço aos demais professores que compartilharam seus conhecimentos ao
longo do curso.
v
Índice
___________________________________________________________________
Índice geral:
Lista de abreviaturas........................................................................................... ix
Índice de figuras.................................................................................................. x
Índice de tabelas................................................................................................. xi
Resumo................................................................................................................ xii
Abstract............................................................................................................... xiv
1- Introdução........................................................................................................ 01
1.1- As cianobactérias...................................................................................... 01
1.2 - A fisiologia da fase estacionária............................................................... 06
1.2.1- Introdução...................................................................................... 06
1.2.2 - Em cianobactérias......................................................................... 09
1.3 - A comunicação intercelular em microorganismos.................................... 12
1.3.1- Introdução...................................................................................... 12
1.3.2- Outras classes de sinais extracelulares presentes em culturas
estacionárias de microorganismos........................................................... 16
2- Objetivos.......................................................................................................... 21
2.1- Objetivo geral........................................................................................... 21
2.2- Objetivos específicos............................................................................... 21
3- Material e Métodos........................................................................................
22
3.1- Cepas de cianobactérias e condições de cultivo...................................... 22
3.2- Caracterização das células de Microcystis PCC 7806 em diferentes 22
estágios de crescimento................................................................................... 23
3.2.1- Crescimento e perfil de pigmentos................................................. 23
3.2.2- Estimativa do conteúdo de glicogênio – método enzimático.......... 23
3.2.2.1- Hidrólise ácida................................................................... 24
3.2.2.2- Quantificação de glicose................................................... 24
3.2.2.3 -Quantificação das amostras.............................................. 25
3.2.3 -Estimativa do conteúdo de proteínas solúveis............................... 25
3.2.3.1 - Extração de proteínas solúveis........................................ 26
3.2.3.2 - Obtenção da curva de calibração..................................... 26
3.2.3.3 - Quantificação das amostras............................................. 27
3.2.4- Perfil metabólico - Ressonância Magnética Nuclear (RMN).......... 27
vi
Índice
___________________________________________________________________
3.2.4.1- Procedimento de extração................................................ 28
3.2.4.2- Análise dos extratos.......................................................... 28
3.2.5- Ultra-estrutura – microscopia eletrônica......................................... 28
3.2.6- Viabilidade das células cloróticas................................................... 29
3.2.6.1- Capacidade de crescimento de cultivos cloróticos 29
inoculados em 2 ASM-1................................................................. 29
3.2.6.2- Verificação da integridade de membrana de células
cloróticas........................................................................................ 30
3.3- Auto-regulação do crescimento................................................................. 30
3.3.1- Efeito do meio condicionado, obtido de culturas cloróticas, sobre
o crescimento de culturas da mesma cepa, mantidas em meio rico em
nutrientes................................................................................................... 30
3.3.1.1- O ensaio de inibição........................................................... 31
3.3.2- Investigação do mecanismo envolvido na inibição do crescimento 32
3.3.2.1- Perfil de pigmentos e ultraestrutura de células tratadas
com meio condicionado................................................................... 32
3.3.2.2- Atividade do meio condicionado sobre culturas da
mesma cepa de diferentes idades.................................................. 32
3.3.3- Especificidade da atividade do meio condicionado......................... 33
3.4- Extração e caracterização preliminar do fator responsável pela atividade
do meio condicionado sobre culturas saudáveis de Microcystis PCC
7806.................................................................................................................. 33
3.4.1- Extração do meio condicionado....................................................
33
3.4.1.1- Empacotamento e ativação da coluna.............................. 34
3.4.1.2- Obtenção do extrato.......................................................... 34
3.4.2- Testes de estabilidade................................................................... 34
3.4.3- Purificação inicial............................................................................ 35
3.4.4- Análise por CLAE........................................................................... 35
3.4.4.1- Parâmetros da análise...................................................... 36
3.4.4.2- Processamento das frações.............................................. 36
4- Resultados e discussão................................................................................. 38
4.1- Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 de diferentes
estágios de crescimento................................................................................... 38
vii
Índice
___________________________________________________________________
4.1.1- Curva de crescimento e dinâmica no conteúdo de pigmentos
durante cultivo de Microcystis PCC 7806 por longos períodos................. 38
4.1.2- Cultivo de células cloróticas em meio 2 ASM-1............................. 39
4.1.3 - Verificação da integridade de membrana....................................... 40
4.2 - Caracterização dos dois fenótipos........................................................... 46
4.2.1 - Diferenças na ultraestrutura........................................................... 46
4.2.2 - Diferenças no acúmulo de glicogênio............................................ 47
4.2.3 – Conteúdo de proteínas solúveis.................................................... 50
4.2.4 - Diferenças no perfil metabólico...................................................... 51
4.3- Auto-regulação do crescimento de Microcystis PCC 7806....................... 57
4.3.1 - O efeito do meio condicionado de Microcystis sobre o
crescimento e conteúdo de pigmentos da mesma cepa.......................... 57
4.3.2 - Atividade do meio condicionado ativo sobre outras cepas........... 59
4.4 - Investigação do mecanismo de inibição................................................... 62
4.4.1 - Efeito do meio condicionado ativo sobre o perfil de pigmentos,
ultraestrutura e viabilidade de células de Microcystis PCC 7806............. 62
4.5 - Extração e caracterização preliminar do fator responsável pela
atividade do meio condicionado em culturas de Microcystis PCC 7806.......... 64
4.5.1 - Extração....................................................................................... 65
4.5.2 - Análise por CLAE......................................................................... 66
4.6 - Considerações finais................................................................................ 69
5- Conclusões...................................................................................................... 73
5.1- Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 em diferentes
estágios de crescimento................................................................................... 73
5.2 - Auto-regulação do crescimento em Microcystis PCC 7806..................... 73
6- Referências bibliográficas.............................................................................. 75
7- Anexos............................................................................................................. 91
viii
Lista de abreviaturas
___________________________________________________________________
Lista de abreviaturas:
AHB:
Alquilhidroxibenzeno;
AHL:
N-acil homoserina lactona;
ASB:
Albumina sérica bovina;
ADN:
Ácido desoxiribonucléico;
DO:
Densidade óptica;
EDTA:
Àcido etilenodiaminotetracético;
GOD:
Glicose oxidase;
CLAE:
Cromatografia líquida de alta eficiência
HSL:
Homoserina lactona;
ODS:
Octadodecilsilano;
PCC:
Pasteur culture collection;
PHB:
Poli-hidroxibutirato;
POD:
Peroxidase;
RMN:
Ressonância magnética nuclear;
ARN:
Ácido ribonucléico;
TFA:
Ácido trifluoracético;
UV:
Ultravioleta;
ix
Índice de figuras
___________________________________________________________________
Índice de figuras:
Figura 1- Exemplo de floração de cianobactéria do gênero Microcystis....................3
Figura 2 - Mecanismo de ‘quorum sensing’ em Photobacterium fischeri..................15
Figura 3 - Alguns exemplos de moléculas envolvidas no processo de comunicação
intercelular em microorganismos...............................................................................20
Figura 4 - Curva de crescimento...............................................................................41
Figura 5 - Espectros de absorção de suspensão de células de Microcystis PCC
7806 coletadas com 3, 15 e 35 dias de cultivo..........................................................42
Figura 6 - Fenótipos de Microcystis PCC 7806 em diferentes estágios de cultivo....43
Figura 7 - Experimento de regeneração....................................................................44
Figura 8 - Micrografias eletrônicas de células de Microcystis sob diferentes
condições...................................................................................................................48
Figura 9 - Estimativa do conteúdo de glicogênio.......................................................49
Figura 10 - Espectros de 1H RMN (400 mHz) de células de Microcystis PCC 7806
coletadas em diferentes estágios de crescimento da cultura.....................................56
Figura 11 - Efeito do meio condicionado ativo sobre o crescimento de culturas de
Microcystis crescidas em meio repleto de nutrientes.................................................58
Figura 12 - Efeito da adição do meio condicionado ativo em culturas de Microcystis
com 4, 7, 10 e 14 dias de crescimento.......................................................................61
Figura 13 - Cromatograma da fração ativa e atividade das frações coletadas após
passagem por CLAE..................................................................................................68
x
Índice de tabelas
___________________________________________________________________
Índice de tabelas:
Tabela 1- Informações auxiliares aos espectros dos extratos aquosos.................55
Tabela 2- Informações auxiliares aos espectros dos extratos metanólicos............55
Tabela 3- Informações auxiliares aos espectros dos extratos clorofórmicos..........55
Tabela 4- Comparação do efeito do meio condicionado de culturas cloróticas de
Microcystis PCC 7806 sobre o crescimento de outras cepas....................................60
xi
Resumo
___________________________________________________________________
Resumo
A ocorrência de florações de cianobactérias em corpos d´água vem aumentando em
todo o mundo nos últimos anos. Essas florações geralmente são tóxicas e por isso,
geram sérios riscos de intoxicação à população humana. O objetivo deste trabalho
foi detectar a produção de auto-inibidores de crescimento em Microcystis PCC 7806.
O cultivo de Microcystis por longos períodos de tempo em meio ASM-1 líquido leva
ao aparecimento de dois fenótipos distintos: um durante a fase de multiplicação
celular onde a cultura é verde e outro na fase estacionária onde a cultura torna-se
clorótica (sem pigmentos). O espectro visível dessas culturas cloróticas mostrou a
redução da concentração de clorofila a. A comparação do perfil metabólico,
conteúdo de glicogênio e da ultraestrutura entre as células verdes e cloróticas
revelou várias diferenças. As culturas cloróticas permanecem viáveis e voltam a
adquirir o tom verde característico da cultura em fase de crescimento, quando
inoculadas em meio repleto de nutrientes. Um sinal extra-celular foi detectado no
meio de cultura (meio condicionado) das células cloróticas: quando o meio
condicionado de células cloróticas é adicionado a culturas verdes em fase de
crescimento, a multiplicação das células dessa cultura é drasticamente reduzida
quando comparada à multiplicação em culturas controle (onde foram adicionados ou
água ou meio novo ao invés de meio condicionado). A inibição da multiplicação com
a adição de meio condicionado foi observada em culturas em qualquer fase de
crescimento. Esses efeitos não são específicos para a cepa, mas parecem ser, no
mínimo específicos para o gênero já que outras cepas de Microcystis respondem da
mesma maneira ao tratamento com o meio condicionado e outros gêneros testados
(Synechocystis e Synechococcus) não tiveram seu crescimento alterado após a
xii
Resumo
___________________________________________________________________
adição deste meio. A investigação do mecanismo de inibição da multiplicação celular
revelou que as culturas tratadas com o meio condicionado adquirem também um
aspecto clorótico, com a concentração de pigmentos similar ao encontrado em
culturas cloróticas. A observação da ultra-estrutura das células tratadas demonstrou
que o meio condicionado induz a desorganização dos tilacóides. Um extrato ativo foi
obtido e experimentos mostraram que a sua atividade não é alterada após fervura ou
adição de solventes. Estes fatos indicam que o (s) fator (es) encontrado (s) no meio
condicionado de células cloróticas se trata de um composto não-proteico e apolar.
Parte deste trabalho foi publicado na revista Environmental Microbiology (2006) 8(1):
30-36.
xiii
Abstract
___________________________________________________________________
Abstract
The frequency of cyanobacterial blooms has been increasing all over the world.
These blooms are often toxic and have become a serious health problem. The aim of
this work was to detect extra-cellular signalling molecules that could coordinate
proliferation of Microcystis PCC 7806. Microcystis cultured for long periods in liquid
ASM-1 medium looses its characteristic green colour. Whole cell visible spectra of
these cultures show a reduced chlorophyll peak. The comparison of the metabolic
profiles, glycogen acummulation and the ultra-structure of green and chlorotic cells
revealed several differences between these cells. Chlorosis is reversible; when the
pale culture is transferred back to ASM-1 medium it regains its characteristic colour
within a week or two. An extra-cellular signal has been found in the culture medium
of starved cultures: when culture medium from chlorotic cells is added to a normal
culture, cell density increase (measured by turbidity) is drastically reduced when
compared to controls. Inhibition of cell proliferation by the conditioned medium occurs
during all stages of development; reduced cell density increase and induced
chlorosis occur no matter at what stage the conditioned medium is added to cultures.
These effects are not strain specific but seem to be at least genus specific; other
Microcystis strains respond the same way to the conditioned medium, but other
genera tested (Synechocystis e Synechococcus) showed no detectable response.
Investigations on the mechanism of growth inhibition showed that cultures treated
with the conditioned medium acquired a pale colour, with pigment concentration
similar to that found in chlorotic cultures. Ultrastructural examination showed that the
condicioned medium induced thylakoid membrane disorganization, typical of the
chlorotic cells, in nutrient-replete cultures. An active extract was obtained and
xiv
Abstract
___________________________________________________________________
investigations showed that activity was retained after heating and after addition of an
apolar solvent. This indicates that activityof the condicioned medium from chlorotic
cells results from non-protein, apolar compound (s). Part of this work was published
in Environmental Microbiology (2006) 8(1): 30-36.
xv
1
Introdução
___________________________________________________________________
1- Introdução:
1.1- As cianobactérias:
As cianobactérias, também chamadas de cianofíceas ou algas azuis, são
organismos procariontes que diferem das demais bactérias fotossintetizantes pelo
fato de serem fototróficas oxigênicas, ou seja, realizam a fotossíntese com a
liberação de oxigênio. Esses microorganismos possuem diversos mecanismos para
se adaptar a diferentes condições ambientais. São amplamente distribuídos pelo
mundo ocorrendo nos mais variados tipos de ambientes terrestres e aquáticos e são
capazes de colonizar ambientes extremos, como por exemplo, cinzas vulcânicas,
desertos arenosos e rochas (Dor & Danin, 1996).
As cianobactérias possuem grande importância econômica. Alguns gêneros
são diazotróficos (fixadores de nitrogênio molecular) e contribuem para a fertilização
da água e do solo (Rai, 1990). Algumas espécies são usadas na indústria alimentícia
por apresentarem alto valor nutricional (Borowitska & Borowitska, 1988). Elas
também são uma rica fonte de novas substâncias com potencial interesse
farmacêutico, já que produzem uma grande variedade de metabólitos secundários
com atividade biológica (Patterson et al., 1994).
As cianobactérias têm a capacidade de se multiplicar rapidamente em águas
ricas em nutrientes (principalmente fósforo e compostos nitrogenados) (Watanabe et
al., 1986; Codd, 1984). Durante os últimos anos, o que tem chamado atenção para
este grupo de microorganismos são as florações. Florações de cianobactérias são o
resultado da multiplicação excessiva das células que chega a alterar a coloração da
água para verde ou vermelha.
2
Introdução
___________________________________________________________________
A freqüência de florações vem aumentando nos últimos anos devido aos
problemas crescentes de poluição em corpos d’água (rios, lagos, reservatórios, etc).
A atividade agrícola e o lançamento descontrolado de esgoto não tratado, devido ao
crescimento das cidades, são tidos como os maiores responsáveis pela aceleração
dos processos naturais de eutrofização.
Fatores climáticos que favorecem o surgimento de florações são altas
temperaturas e ambiente sem chuva. A população de cianobactérias quando
dispersa na coluna d’água pode parecer pouco densa. No entanto, quando as
condições atmosféricas são favoráveis as células concentram-se na superfície da
água em poucas horas. Estas podem, em seguida, ser arrastadas para as margens
da massa d’água por ação do vento e gerar uma concentração maior de células (Fig.
1). A decomposição de enorme quantidade de biomassa acumulada por esses
microorganismos, leva à desoxigenação da água causando prejuízos em todo o
ecossistema.
As florações são indesejáveis não apenas por prejudicar a estética local
devido à formação de grossas natas verdes e odores fétidos nas margens, mas
também porque cerca de 60 % das florações são tóxicas (Carmichael & Gorham,
1981; Repavich et al., 1990; Costa & Azevedo, 1995).
Existem vários gêneros de cianobactérias de água doce, capazes de produzir
potentes toxinas, tais como Anabaena, Aphanizomenom, Microcystis e Oscillatoria
(Chorus & Bartram, 1999). As toxinas produzidas por estes gêneros são
classificadas, de acordo com os sintomas que provocam em mamíferos:
hepatotoxinas, neurotoxinas e dermatotoxinas.
3
Introdução
___________________________________________________________________
Retirado de http://bilbo.bio.purdue.edu/www-cyanosite/index.html
Fig. 1- Exemplo de uma floração de cianobactéria do gênero
Microcystis. Esta densidade só foi atingida graças à ação do
vento.
As neurotoxinas produzidas por cianobactérias são anatoxina-a, anatoxinaa(s) e saxitoxinas. Em caso de intoxicação aguda seus efeitos são muito rápidos,
provocando a morte por parada respiratória em poucos minutos (Carmichael, 1992).
As
hepatotoxinas,
microcistinas
e
nodularinas
(peptídeos
cíclicos),
cilindrospermopsinas (alcalóides) atuam de um modo mais lento; em animais foi
observado que provocam danos hepáticos e hemorragias, resultando num forte
choque circulatório e na perda de funções hepáticas (Hooser et al., 1991). As
microcistinas, quando ingeridas em doses subletais, podem atuar como promotores
de tumores hepáticos (Falconer, 1991).
Os registros de intoxicações causadas por ingestão de água com florações de
cianobactérias são encontrados em todo o mundo (Carmichael, 1981). A maioria dos
4
Introdução
___________________________________________________________________
casos descreve a intoxicação ou morte de animais silvestres e domésticos após o
consumo de água contaminada. Em 1990, na Escócia, foi registrada a morte
imediata de vários cães após a ingestão da água de um lago contendo uma floração
neurotóxica de Oscillatoria (Cood & Battie, 1991; Edwards et al., 1992; Gunn et al.,
1992). Na Inglaterra, em 1989, uma floração de Microcystis aeruginosa, num
reservatório de água, provocou a morte de 20 cordeiros e 15 cães (Codd & Battie,
1991; Hunter & Roberts, 1991).
Apesar da freqüência com que as florações tóxicas surgem, o número de
intoxicações humanas agudas, quando comparadas com o número de intoxicações
em animais, não é elevado. Isto se deve, provavelmente ao fato do homem
selecionar mais a água que consome. Os maiores problemas em humanos surgem
geralmente devido ao contato direto com as cianobactérias durante a recreação em
massas
d’água
contaminadas,
ou
devido
ao
tratamento
insuficiente
dos
reservatórios de água potável. Durante o tratamento geralmente ocorre a ruptura das
células, o que ocasiona a liberação das toxinas para a água.
As intoxicações agudas provocadas por cianobactérias podem provocar
sintomas no homem, tais como: reações alérgicas (asma, irritação nos olhos,
dermatites), gastroenterites ou hepatoenterites com diarréia e dores, letargia,
tremores musculares e respiração ofegante (Beasley et al., 1989), enfraquecimento,
anorexia, palidez das membranas mucosas e extremidades frias (Carmichael, 1992).
No Brasil, são descritos dois casos trágicos de intoxicação humana por
cianobactérias: em 1988 foi constatada a correlação epidemiológica entre a floração
de cianobactérias no Reservatório de Itaparica, BA e a morte de 88 pessoas entre
2000 intoxicadas (Teixeira et al., 1993). Mais recentemente, em 1996, foi
comprovada a presença de microcistina na água que abastecia o Centro de
5
Introdução
___________________________________________________________________
Hemodiálise de Caruaru, PE. Setenta e seis pacientes morreram de um total de 116
pessoas intoxicadas após tratamento nessa instituição (Azevedo, 1996, Jochimsen
et al.,1998).
No ano de 2002, no município de Campos dos Goytacazes - RJ, o aumento
de matéria orgânica e a baixa vazão do rio Paraíba do Sul contribuíram para o
surgimento de uma floração de cianobactérias. A água deste rio é usada para
abastecimento urbano. O surgimento desta floração causou a interrupção no
abastecimento de água por vários dias, devido a relatos de pessoas hospitalizadas
após o consumo desta água.
Os casos descritos acima tornam evidente a importância do estudo da
fisiologia e do metabolismo desses microorganismos, com o objetivo buscar
maneiras de controlar a formação de florações de cianobactérias potencialmente
tóxicas.
Várias estratégias de combate às florações de cianobactérias têm sido
desenvolvidas. Na tentativa de prevenir o surgimento de florações procura-se
diminuir a descarga de matéria orgânica em corpos d’ água como rios, lagos e
reservatórios, desacelerando o processo de eutrofização. Quando já existe a
floração, outros métodos podem ser aplicados na tentativa de diminuir a
concentração das células: métodos físicos, que incluem a regulação do fluxo da
água, sua aeração e/ou controle da luminosidade e métodos químicos, como o uso
de algicidas, sendo o exemplo mais comum o uso de sulfato de cobre. Todas essas
alternativas de solucionar o problema têm se mostrado ineficazes, ou por serem
praticamente inaplicáveis em larga escala, ou porque durante o processo ocorre a
lise das células, aumentando a liberação de toxinas para a água o que, muitas
vezes, agrava o problema.
6
Introdução
___________________________________________________________________
1.2- A fisiologia da fase estacionária:
1.2.1- Introdução:
As bactérias são os organismos mais abundantes da superfície terrestre,
podendo ser encontradas praticamente em qualquer tipo de ambiente. Em seus
habitats naturais elas se encontram, na maior parte do tempo, em um estado
fisiológico caracterizado por ausência de multiplicação (Kolter et al., 1993 e Huisman
et al., 1996) principalmente devido à baixa disponibilidade de nutrientes. Estudos
sobre a multiplicação celular bacteriana em laboratório mostram que a limitação de
um ou mais nutrientes durante o cultivo leva a uma progressiva parada na
multiplicação das células até a entrada para a fase estacionária (Kolter, 1993).
Vários estudos demonstram que populações de bactérias na fase estacionária
não só simplesmente param de se multiplicar, durante esta fase são iniciados
elaborados
programas
do
desenvolvimento
celular
que
estão
intimamente
associados aos mecanismos de sobrevivência destes microorganismos no ambiente
- ciclos de vida (para citar alguns exemplos: Shapiro et al., 2000; Kjelleberg et al.,
1993; Lange et al., 1991). O exemplo mais claro deste tipo de adaptação é quando
bactérias formam esporos.
Os
esporos
bacterianos
são
células
metabolicamente
inativas
que
apresentam alta resistência a estresses ambientais (como dissecação, frio e calor) e
deste modo, são capazes de persistir no ambiente por longos períodos de tempo
(Atrih & Foster, 1999). As bactérias que formam esporos são Gram-positivas e
geralmente pertencem aos gêneros Bacilli, Clostridia e Azospirilli. O processo de
esporulação nestas bactérias está relacionado com a resposta à privação de
nutrientes e ocorre durante a entrada para a fase estacionária.
7
Introdução
___________________________________________________________________
O processo de esporulação mais estudado é o que ocorre na bactéria
Baccillus subtilis. A entrada para a fase estacionária nesta bactéria leva à ativação
de um programa genético que culmina na formação de um endosporo (Shapiro et al.,
2000) que após sucessivos estágios de amadurecimento é liberado, com a lise da
célula-mãe, para o ambiente. Este esporo permanece viável, pois assim que as
condições favoráveis são re-estabelecidas ele é capaz de germinar dando origem a
uma nova população de células.
Para bactérias que não produzem esporos, as estratégias desenvolvidas para
resistir ao período de falta de nutrientes não são tão claras. A adaptação à exaustão
de nutrientes em bactérias Gram-negativas envolve uma série de eventos
intracelulares altamente organizados que capacitam as células à sobrevivência ao
período de privação de nutrientes (Kjelleberg et al., 1993).
Em E. coli, a entrada para a fase estacionária é acompanhada por mudanças
na morfologia das células; estas se apresentam menores e mais esféricas (Lange et
al., 1991). Essas mudanças na morfologia são acompanhadas por uma alteração
nos compartimentos sub-celulares, o citoplasma se apresenta mais condensado e o
volume periplasmático maior (Reeve et al., 1984). A redução do tamanho celular em
resposta à entrada para fase estacionária parece ser uma estratégia de
sobrevivência bastante comum em bactérias marinhas como Vibrio, Pseudomonas,
Aeromonas, Alcaligenes spp. (para uma revisão detalhada ver Kjelleberg et al.,
1987) e bactérias do solo como Rhizobium leguminosarium. Esta redução no
tamanho celular ocorre de maneira geral como resultado de sucessivas divisões
celulares sem que ocorra um aumento na massa celular (Ingramham et al., 1983 e
Williams & Thorne, 1997).
8
Introdução
___________________________________________________________________
Estudos mais recentes demonstram que durante a privação de nutrientes o
material genético de E. coli também passa por modificações estruturais. Foi visto
que a cromatina sofre uma transição reversível que permitem a proteção de seu
DNA: ela se apresenta altamente condensada e ordenada. Essa modificação parece
ser ditada por propriedades intrínsecas da molécula de DNA e parece ser um
mecanismo comum entre bactérias Gram-negativas (Frenkiel-Krispin et al., 2004 e
Minsky et al., 2002).
Os estudos demonstram também que as células bacterianas na fase
estacionária apresentam no geral um decréscimo na síntese de RNA, DNA e
proteínas (Schultz et al., 1988 e Williams & Thorne, 1997) e adquirem resistência a
vários tipos de estresses, tais como: agentes oxidativos, altas temperaturas,
radiação ultravioleta, resistência a ácidos, etc (Foster et al., 1995; Kjelleberg et al.,
1993).
Bactérias Gram-positivas que não esporulam também sofrem mudanças na
fisiologia das células. Em Micrococcus luteus foi mostrado que, quando esta bactéria
é submetida a prolongados períodos de ausência de nutrientes, ela se mantém num
estado de dormência; as células neste estado foram incapazes de formar colônias
em placas contendo meio sólido apropriado (Kaprelyants & Kell, 1993) e somente
foram ‘ressuscitadas’ quando condições especiais de cultivo foram aplicadas
(Mukamolova et al., 1998).
A resposta de Staphylococccus aureus à limitação de glicose ou à limitação
de vários de nutrientes resulta numa estratégia um pouco diferente. Inicialmente
ocorre a perda de viabilidade de 99 a 99,9 % da população. As células que
sobrevivem ao período de privação de nutrientes permanecem viáveis por muito
tempo e adquirem um maior potencial de sobrevivência. As células que sobrevivem
9
Introdução
___________________________________________________________________
também apresentam uma diminuição do tamanho e um aumento na resistência a
estresses oxidativos e a ácidos; adaptações que se assemelham às descritas para
bactérias Gram-negativas (Watson et al., 1998).
1.2.2- Em cianobactérias:
Em cianobactérias adaptações a condições de escassez de nutrientes
também ocorrem. A transcrição de um grande número de genes é influenciada por
mudanças ambientais (Tandeu de Marsac & Houmand, 1993) e em resposta a essas
mudanças, alguns gêneros de cianobactérias filamentosas, pertencentes à ordem
Nostocales (subseção IV) e à ordem Stigonematales (subseção V), são capazes de
produzir células altamente especializadas: os acinetos e heterocitos.
Os acinetos são células especializadas que funcionalmente se assemelham
aos esporos bacterianos. Eles se originam a partir da diferenciação de uma célula
vegetativa do filamento, e são observados com maior freqüência em culturas
estacionárias. Os acinetos são resistentes ao frio e à dissecação, mas não ao calor
(Nichols & Adams, 1982; Adams, 1992). Os acinetos apresentam um grande
espessamento da parede celular (Herdman, 1987,1988) e podem apresentar um
volume celular até dez vezes maior ao de uma célula vegetativa (Fay, 1969). No
citoplasma é observado um grande acúmulo de grânulos de cianoficina e glicogênio
(Simon, 1987). Também são consideradas células dormentes por apresentarem
atividade metabólica muito baixa ou indetectável (Raí et al., 1985; Sarma & Ghai,
1998). Assim como os esporos de bactérias, os acinetos são capazes de germinar
quando as condições de crescimento são re-estabelecidas (Nichols & Adams, 1982;
Herdman, 1987).
Os heterocitos são células especializadas que são responsáveis pelo
processo de fixação de nitrogênio. Eles se originam a partir da diferenciação de
10
Introdução
___________________________________________________________________
algumas células vegetativas dentro do filamento sempre em resposta a escassez de
nitrogênio (Adams & Duggan, 1999). As enzimas responsáveis pela fixação do
nitrogênio (as nitrogenases) são extremamente sensíveis à presença de oxigênio.
Deste modo, ao longo do processo de diferenciação em heterocitos, as células
vegetativas sofrem uma série de modificações estruturais que permitem criar, no seu
interior, um ambiente livre de oxigênio (Wolk et al., 1998).
Para cianobactérias que não possuem a capacidade de produzir acinetos e
heterocitos, outros tipos de estratégias parecem ter sido desenvolvidas na tentativa
de se adaptar ao período de privação de nutrientes.
Cianobactérias incapazes de produzir acinetos e heterocitos podem
responder à privação de seus nutrientes essenciais (p. ex. nitrogênio, fósforo e
enxofre) pela degradação reversível de seus pigmentos fotossintéticos, num
processo conhecido como clorose (Allen & Smith, 1969 e Lau et al., 1977). O
fenômeno de clorose é observado tanto em gêneros de cianobactérias filamentosas
quanto unicelulares (Allen & Smith, 1969).
Em 1998, Görl e colaboradores iniciaram estudos sobre os efeitos da privação
de nitrogênio em culturas do gênero unicelular Synechococcus PCC 7942. Eles
observaram que após a transferência da cultura para um meio de cultivo sem
nitrogênio (em condições padronizadas), o processo de clorose apresenta três fases
distintas: Uma fase inicial marcada por um rápido declínio no conteúdo das
ficobiliproteínas e quase nenhuma alteração no conteúdo de clorofila a; uma fase
intermediária onde é observada uma gradativa redução nos níveis de clorofila a; e
uma fase final, onde os níveis dos pigmentos fotossintéticos chegam a valores
indetectáveis e as células se tornam completamente apigmentadas (cloróticas). Esta
acentuada queda nos níveis dos pigmentos fotossintéticos, observada nesta fase
11
Introdução
___________________________________________________________________
final, poderia ser interpretada como irreversível perda de viabilidade (Tandeu de
Marsac & Houmard, 1993). Porém, os experimentos de regeneração mostraram, que
as células cloróticas mantiveram sua viabilidade, ou seja, poucos dias após reinoculadas em meio de cultura contendo nitrato, os pigmentos fotossintéticos foram
re-sintetizados e o crescimento da cultura foi novamente observado (Görl et al.,
1998). A diferenciação em células cloróticas, em resposta à privação de nitrogênio,
mostra características de um estado de dormência. Em 2001, Saüer e colaboradores
investigaram os mecanismos de manutenção de viabilidade nas células cloróticas de
Synechococcus PCC 7942. Eles observaram que durante o processo de aclimatação
à falta de nitrogênio as células apresentam uma drástica redução no conteúdo de
proteínas solúveis. Experimentos sobre a síntese protéica (através da incorporação
de aminoácidos radioativos) mostraram que as células cloróticas mantêm um nível
basal de expressão gênica e que a homeostase energética, nas células cloróticas,
foi mantida por uma pequena fração da atividade fotossintética de células em fase
de crescimento.
Estes estudos demonstram claramente que o fenômeno de clorose nesta
cepa faz parte de um processo de aclimatação no qual as células vegetativas, em
resposta a falta de nitrogênio, se diferenciam em células não pigmentadas
(cloróticas) que apresentam características de um estado de dormência. Este
mecanismo possibilita a sobrevivência a prolongados períodos de privação de
nutrientes, uma vez que mutantes que não reagem desta maneira perdem
rapidamente a viabilidade (Görl et al., 1998).
No meio ambiente também podem ser observadas células de cianobactérias
com características de um estado de dormência. Em países onde as estações do
ano são bem definidas, o surgimento de florações de Microcystis parece obedecer a
12
Introdução
___________________________________________________________________
um ciclo anual. O aparecimento das células na coluna d’água é observado no final
da primavera e é seguido por sucessivas florações durante todo o verão. Durante o
outono e o inverno raramente são observadas células na coluna d’água (Brunberg &
Boström, 1992). Os estudos iniciais demonstram que durante o inverno as células
persistem nos sedimentos (forma bentônica) dos lagos. Esta forma bentônica parece
ser de grande importância ecológica, pois estas células permanecem viáveis e
servem como inóculo para o recomeço de seu ciclo anual (Brunberg et al., 2003;
Fallon & Brock, 1981; Reynolds et al., 1981 e Preston et al., 1980).
Em 2004, Latour e colaboradores publicaram estudos sobre a caracterização
metabólica da população de células bentônicas de Microcystis. Neste estudo, a
atividade metabólica das células, medida através de atividade enzimática, foi
monitorada ao longo do ano. Foi observado que durante o inverno, quando as
temperaturas são menores, as células bentônicas apresentam um nível residual de
atividade enzimática, permanecendo viáveis. Na primavera, o aumento da
temperatura leva a reativação das células e novamente o ciclo é recomeçado.
Estudos mais detalhados sobre os mecanismos envolvidos na manutenção da
viabilidade em Microcystis durante o período de baixa atividade metabólica ainda
não foram realizados.
1.3- A comunicação intercelular em microorganismos:
1.3.1- Introdução:
A comunicação intercelular é utilizada por muitos tipos de microorganismos
para regular a expressão de genes da população e o seu desenvolvimento. Uma das
formas de sinalização intercelular mais bem estudadas envolve uma resposta
regulatória a sinais relacionados com a densidade celular. Este processo, às vezes
13
Introdução
___________________________________________________________________
chamado de ‘quorum sensing’ (Fuqua et al., 1994), é caracterizado tipicamente por
eventos de regulação metabólica que são induzidos em células crescendo em altas
densidades.
Em
bactérias
gram-negativas
a
comunicação
intercelular
freqüentemente envolve a utilização de pequenas moléculas sinais chamadas de Nacil homoserina lactonas – as AHLs (Fuqua et al., 1996). Em bactérias grampositivas o processo de ‘quorum sensing’ utiliza peptídeos ou peptídeos
processados como moléculas sinalizadoras (Miller & Bassler, 2001).
O primeiro modelo de ´quorum sensing´ caracterizado foi o da bactéria
luminescente gram-negativa Photobacterium fischeri (mais conhecida como Vibrio
fischeri). Esta bactéria habita ambientes marinhos, e quando se encontra livre na
água do mar, sua densidade populacional geralmente é menor do que 100 céls/mL
(Ruby & Nealson, 1978; Ruby et al., 1980; Baumann & Baumann, 1981), e suas
células não emitem luz. Porém, em simbiose com alguns peixes e lulas de águas
profundas, essa bactéria atinge concentrações de 1010 - 1011 céls/ml (Dunlap &
Greenberg, 1991; Ruby, 1996), e nessa concentração emite luminescência. Esse
fato levou os pesquisadores a investigar o mecanismo que a bactéria utiliza para
monitorar a expressão dos genes relacionados com a produção de luz.
Hoje se sabe que o sistema utilizado por P. fischeri é composto de: uma AHL,
purificada e identificada como 3-oxo-hexanoil-L-homoserina lactona (3-oxo-C6 HSL)
(Eberhard, 1981) e de genes lux que estão organizados em duas unidades
transcricionais: luxR e luxICDABEG. O gene luxR codifica um regulador
transcricional que, quando ligado à AHL, interage com a RNA polimerase,
aumentando sua afinidade pela região promotora do operon luxICDABEG (o operon
lux propriamente dito) (Engebrecht & Silverman, 1984) O operon lux codifica
diferentes proteínas, inclusive enzimas e proteínas responsáveis pela produção de
14
Introdução
___________________________________________________________________
luz. O primeiro gene do operon lux (luxI) merece destaque pois ele codifica uma
enzima chamada de acil-AHL sintase, que é responsável pela síntese de AHLs,
amplificando o sinal uma vez iniciado o processo. Deste modo os genes luxR e o
luxI, juntamente com as moléculas de AHLs, são responsáveis pela regulação da
expressão da bioluminescência dependentes de altas concentrações celulares (Ver
Fig. 2).
O sistema ‘quorum sensing’ descrito acima é descrito, hoje, em mais de 70
espécies de bactérias gram-negativas e regula a expressão de diversos fenótipos
(Miller et al., 2001; de Kievit & Iglewski, 2000; Fuqua et al., 2001; Parsek e
Greenberg, 2000). Esses sistemas têm em comum a enzima acil-AHL sintase,
homóloga a LuxL, bem como um regulador transcricional, homólogo ao LuxR.
Alguns exemplos de sistemas homólogos ao utilizado por P. fischeri são: TraR e
TraL de Agrobacterium tumefaciens que regulam a transferência por conjugação do
plasmídeo Ti (Tumor inducing) (Zhang et al, 1993); LasR e LasL de Pseudomonas
aeruginosa, que regulam a transcrição de uma série de fatores de virulência,
incluindo a elastase (Passador et al, 1993); e ExpR e ExpL de Erwinia carotovora,
que controlam a síntese de antibióticos e a produção de exoenzimas (Beck von
Bodman & Farrand, 1995).
15
Introdução
___________________________________________________________________
Baixa densidade celular
Alta densidade celular
luz
Adaptado de www.nottingham.ac.uk/quorum
Fig. 2 – Mecanismo de ‘quorum sensing’ em P. fischeri.: A baixa densidade
populacional, a transcrição do operon lux ocorre a níveis basais e não há
acúmulo significante do autoindutor. Quando a densidade de células
aumenta, há um acúmulo desse autoindutor que interage com o regulador
transcricional, permitindo a transcrição dos genes responsáveis pela
bioluminescência. Repare que a transcrição do gene luxL leva a uma
amplificação do sinal, uma vez iniciado o processo.
As bactérias que utilizam um sistema homólogo ao LuxR/LuxL também
produzem autoindutores similares ou idênticos a 3-oxo-C6 HSL produzido por P.
fischeri. Exemplos de outros tipos de autoindutores descobertos subseqüentemente
incluem o de V. harveyi N-(3-hidroxibutanoil)-L-homoserina lactona (3-hidroxi-C4HSL), o autoindutor de A. tumefaciens N-(3-oxooctanoil)-L-homoserina lactona (3oxo-C8-HSL) e o autoindutor de P. aeruginosa, N-(3-oxododecanoil)-L-homoserinalactona (3-oxo-C12-HSL). Essas moléculas variam quanto ao comprimento da
16
Introdução
___________________________________________________________________
cadeia acil, quanto ao grau de oxidação no C3 e quanto à presença ou ausência de
insaturações (Fig. 3a).
1.3.2- Outras classes de sinais extracelulares presentes em culturas
estacionárias de microorganismos:
A comunicação intercelular por sinais químicos para coordenar eventos
intracelulares de uma população é hoje bem documentado em eubactérias.
Micromoléculas envolvidas no processo de ‘quorum sensing’ (AHLs, peptídeos ou
peptídeos processados) são os exemplos melhor caracterizados deste tipo de
estratégia. Porém, outros tipos de metabólitos extracelulares estão freqüentemente
sendo descobertas.
Um exemplo bem estudado deste tipo de estratégia é a produção de alquilhidroxibenzenos (AHBs). AHBs são compostos anfifílicos de baixo peso molecular
produzidos por culturas de Azotobacter vinelandii (Reusch & Sadoff, 1979), A.
chroococcun (Batvakov et al., 1982), Pseudomonas carboxydoflava (Osipov et al.,
1985), Bacillus cereus (Gryaznova et al., 1985), Micrococcus luteus (Mulzukin et al.,
1996) e pela levedura Sacharomyces cerevisiae (Batrakov et al., 1993). Eles foram
encontrados em culturas estacionárias desses microorganismos como misturas de
isômeros com diferenças na posição e tamanho da cadeia do substituinte alquil do
anel aromático (Fig. 3b).
AHBs são autoreguladores naturais da multiplicação celular, pois ao
acumularem no meio de cultivo ao longo do crescimento induzem a cultura à entrada
para a fase estacionária. Estas moléculas, em altas concentrações, também são
responsáveis pela formação de ‘resting cells’ – células caracterizadas por um alto
grau de refratividade (quando observadas ao microscópio óptico) e profundo estado
17
Introdução
___________________________________________________________________
de dormência (células anabióticas ou hipometabólicas) (Svetlichnyi et al., 1986).
Estudos da atividade de AHBs sobre o metabolismo das células revelam que estas
moléculas atuam como modificadores naturais de estruturas enzimáticas, formando
complexos enzimáticos termo-estáveis que possuem baixa atividade catalítica, e
contribuem para bloqueio do processo metabólico nas células anabióticas (Bespalov
et al., 2000 e Kolpakov et al., 2000).
Estudos ‘in vitro’ mostram que estas moléculas parecem possuir um
mecanismo de ação bem simples. Foi demonstrado que AHBs formam interações
não covalentes (pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e iônicas) com
moléculas biológicas (proteínas, lipídeos de membrana, DNA e RNA) atuando como
chaperonas químicas (Martirosova et al., 2004). Estudos sobre a influência de
moléculas do tipo AHBs sobre a expressão gênica ainda não foram realizados.
Outro exemplo deste tipo de comunicação é o que ocorre nas bactérias do
gênero Streptomyces. Foi mostrado que este gênero produz uma classe de
moléculas auto-reguladoras denominadas de γ-butirolactonas (Fig. 3e). Estas
moléculas participam diretamente na regulação do metabolismo secundário das
células atuando principalmente no controle da produção de antibióticos (Yamada,
1999 e Shikura et al., 2002).
Outros
exemplos
de
fatores
extracelulares
produzidos
por
culturas
estacionárias são encontrados; fatores de sinalização produzidos por Stigmatella
são necessários para o desenvolvimento de estruturas de reprodução em condições
onde os nutrientes são limitados (Fig. 3c) (Plaga & Schairer, 1999). Quando as
condições voltam a ser favoráveis, os esporos formados nestas estruturas germinam
formando uma nova população. Em culturas de Vibrio sp. submetidas a regimes de
falta de nutrientes foi encontrado um composto que, quando adicionado a uma
18
Introdução
___________________________________________________________________
cultura rica em nutrientes, induz a síntese de proteínas encontradas apenas em
culturas cujos nutrientes estavam esgotados (Srirnivasan et al., 1998).
Em cianobactérias, também é relatada a existência de fatores extracelulares
produzidos em resposta a condições desfavoráveis.
Da década de 70 existem relatos sobre o papel de sinais extracelulares
envolvidos na indução de acinetos. Foi demonstrado que a cianobactéria
Cylindrospermum lincheniforme Kütz produz um composto capaz de estimular a
formação de acinetos em culturas jovens da mesma cianobactéria (Fisher & Wolk,
1976; Hirosawa & Wolk, 1979 a). A fórmula molecular deste composto foi identificada
como sendo C7H5OSN e sua suposta estrutura química determinada (Fig. 3d)
(Hirosawa & Wolk, 1979 b).
A formação de heterocitos também parece ser regulada por moléculas
sinalizadoras. Nos filamentos da cianobactéria Anabaena sp. cada heterocito é
separado por aproximadamente dez células vegetativas. Este padrão de ocorrência
de heterocitos dentro do filamento é regulado por um peptídeo PatS (Yoon &
Golden, 1998). O mecanismo molecular proposto sugere que durante as primeiras
horas após a privação de nitrogênio, algumas células do filamento aumentam a
produção do peptídeo PatS. Este peptídeo então, se difunde através do filamento,
inibindo a formação de heterocitos nas células adjacentes. As células produtoras do
PatS são imunes a ação inibitória do próprio peptídeo e portanto, completam sua
diferenciação em heterocitos. Deste modo, a ação deste peptídeo também ocorre
através de mecanismos de sinalização intercelular (neste caso interfilamentar).
Em 1998, Bachofen e Schunk demonstraram, através de bioensaios de
detecção, a presença de AHLs no sobrenadante obtido de uma amostra natural de
uma floração de cianobactéria onde o gênero dominante era Microcystis. Porém,
19
Introdução
___________________________________________________________________
este estudo não foi conclusivo, pois por se tratar de uma amostra natural, outros
microorganismos poderiam estar produzindo a molécula de AHL detectada no
bioensaio. Em um trabalho anterior (Meireles, 2002) foi investigada a produção de
moléculas de AHLs em duas cepas axênicas de Microcystis. Através de bioensaios
de detecção foi mostrado que Microcystis, nas condições testadas, não foi capaz de
produzir as AHLs descritas pela literatura.
Este trabalho investiga formas de auto-regulação do metabolismo de
cianobactérias tóxicas. O gênero escolhido inicialmente para os estudos foi
Microcystis. Este gênero tem sido responsável pelo maior número de relatos de
intoxicações em animais e humanos (Carmichael, 1996). Microcystis é uma
cianobactéria não diazotrófica que é freqüentemente encontrada como gênero
dominante numa floração. É um gênero cosmopolita, sendo encontrada em
ambientes de água doce a salobra.
20
Introdução
___________________________________________________________________
Fig. 3 – Alguns exemplos de moléculas envolvidas no processo de
comunicação intercelular em microorganismos; a. Moléculas do tipo Nacil homoserina lactonas, envolvidas no processo de comunicação
intercelular em bactérias Gram-negativas; b. Análogos químicos de alquilhidroxibenzenos (AHBs); c. Composto que coordena a formação de corpos
de frutificação em Stigmatella aurantiaca; d. Estrutura aproximada do fator
envolvido na estimulação da produção de acinetos em Cylindrospermum
licheniforme Kütz; e. Dois tipos de autoreguladores (γ-butirolactonas).
Ambos estão envolvidos na regulação da produção de antibióticos em
espécies de Streptomyces sp..
21
Objetivos
___________________________________________________________________
2- Objetivos:
2.1- Objetivo geral:
Este trabalho visou verificar a existência de mecanismos de auto-regulação
da multiplicação celular em culturas de Microcystis PCC 7806.
2.2- Objetivos específicos:
Cultivar Microcystis PCC 7806 em meio 2 ASM-1, por longos períodos de
tempo, buscando caracterizar bioquimicamente e fisiologicamente células em
diferentes estágios de cultivo.
Testar a atividade do sobrenadante, obtido em diferentes tempos de
crescimento da cepa Microcystis PCC 7806, sobre a capacidade de inibir o
crescimento de culturas do próprio microorganismo crescidas em meio repleto
de nutrientes.
Detectada a presença de atividade inibitória no meio condicionado, buscou-se
também investigar o mecanismo de inibição do crescimento.
22
Material e Métodos
___________________________________________________________________
3- Material e Métodos:
3.1 - Cepas de cianobactérias e condições de cultivo:
O gênero escolhido para os estudos foi Microcystis. Este gênero tem sido
responsável pelo maior número de relatos de intoxicações em animais e humanos
(Carmichael, 1996).
Todos os experimentos foram realizados utilizando a cepa Microcystis
aeruginosa PCC 7806 (Pasteur Culture Collection, Instituto Pasteur, Paris, França).
Outras cepas utilizadas neste estudo foram:
-
Microcystis UENF Mic1, isolada da Lagoa de Jacarepaguá - Rio de Janeiro RJ;
-
Microcystis UENF Mic2, isolada da Lagoa de Iquipari – São João da Barra –
RJ;
-
Synechococcus PCC 7942;
-
Synechocystis PCC 6803;
Todas as cepas foram mantidas em meio de cultura com o dobro da
concentração do ASM-1 (Gorhan et al., 1964), daqui a diante chamado de 2 ASM-1,
em câmara de cultivo com temperatura mantida a 25 ± 3 ºC sob lâmpadas
fluorescentes (lâmpadas frias PHILIPS TLT 20 W/75 S) com fotoperíodo de 16 h.
23
Material e Métodos
___________________________________________________________________
3.2 - Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 de
diferentes idades:
3.2.1- Crescimento e perfil de pigmentos:
Microcystis foi inoculada em Erlenmeyers de 1 L contendo 200 mL de meio 2
ASM-1 com DO750 inicial de 0,2. A cultura foi incubada em agitador rotatório (Nova
Ética modelo 109 B) com velocidade variando entre 90 e 100 rpm e mantida em
câmara de cultivo com densidade de fluxo de fótons variando entre 30-45 µmol
fótons m-2 s-1. O crescimento da cultura foi monitorado periodicamente em função da
densidade óptica a 750 nm por 35 dias (espectrofotômetro Shimadzu UV/V-1203).
Mudanças ocorridas no perfil de pigmentos fotossintéticos ao longo do
crescimento da cultura de Microcystis foram monitorados através do espectro de
absorção da suspensão de células. A absorbância foi medida entre 600 e 800 nm.
Os espectros foram obtidos de culturas coletadas em diversos estágios de
cultivo. Antes de cada medição a DO760 de cada suspensão de células era ajustada
com água para 0,22 ± 0,01.
Este experimento foi repetido três vezes em culturas independentes.
3.2.2- Estimativa do conteúdo de glicogênio – método enzimático:
O conteúdo de glicogênio foi determinado indiretamente após hidrólise ácida e
liberação dos monômeros de D-glicose utilizando o método enzimático/colorimétrico
(glicose oxidase) do Kit Bioliquid (Biodiagnóstica).
As culturas de Microcystis foram cultivadas conforme descrito no item 3.2.1 e
as células coletadas em dois momentos do cultivo: durante a fase de crescimento da
24
Material e Métodos
___________________________________________________________________
cultura (8 dias de cultivo) e quando as culturas já se encontravam na fase
estacionária (40 dias de cultivo).
3.2.2.1- Hidrólise ácida:
Cerca de 108 células foram ressuspensas em tubos de ensaio contendo 500
µL de solução de H2SO4 a 2,5%. Em seguida, os tubos foram deixados em banho
maria (100 ºC) por 80 min sendo homogeneizados a cada 10 min. Após o término da
hidrólise, os tubos foram centrifugados a 10000 x g por 5 min a temperatura
ambiente. O sobrenadante foi coletado e reservado.
3.2.2.2- Quantificação de glicose:
A detecção de D-glicose ocorre segundo a reação na qual a glicose, através
da ação da enzima glicose oxidase (GOD), é oxidada gerando ácido glicônico e
peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido de hidrogênio pela ação de uma
peroxidase (POD) reage com corantes apropriados (hidroxibenzoato e 4aminofenazona) formando um complexo corado. A absorbância da solução onde o
complexo vermelho é formado apresenta absorbância proporcional a concentração
de glicose na amostra analisada, medida a 500 nm.
GOD*
D-glicose + H20 + O2 Ac. Glicônico + 2 H2O2
POD**
2 H2O2 + Hidroxibenzoato + 4-aminofenazona Complexo corado.
* GOD = Glicose oxidase;
** POD = Peroxidase.
25
Material e Métodos
___________________________________________________________________
A curva de calibração foi obtida a partir de diluições de uma solução padrão
contendo 5 mg/mL de D-glicose em H2SO4 a 2,5%. As reações foram montadas
conforme descrito a seguir: em tubos de ensaio foram misturados 10 µL de cada
diluição da solução padrão com 990 µL do reagente enzimático contendo glicose
oxidase (10.000 U/L), peroxidase (500 U/L), 4-aminofenazona (0,2 mmol/L) e
hidroxibenzoato (5 mmol/L). A concentração final de glicose em cada diluição foi de
0, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5 µg de glicose por mL de reação. Em seguida os tubos foram
deixados em banho-maria a 37 ºC por 10 min.
Após o término da reação as amostras foram medidas a 500 nm. Os valores
de absorbância x concentração de glicose foram plotados em um gráfico. A
correlação entre concentração de glicose e ABS500 foi de 0,996 (y = 0,0261x +
0,0066).
3.2.2.3 -Quantificação das amostras:
A curva de calibração foi obtida simultaneamente com a incubação das
amostras. A reação foi montada conforme descrito para obtenção da curva padrão.
As amostras foram diluídas para que ficassem no intervalo de concentração onde as
relações absorbância x concentração fossem lineares. Todos os ensaios foram
realizados em triplicata.
Este experimento foi repetido duas vezes em culturas independentes.
3.2.3 - Estimativa do conteúdo de proteínas solúveis:
O conteúdo de proteínas solúveis, determinado pelo método descrito por
Bradford (1976), se baseia na colorimetria para quantificar proteínas solúveis. O
26
Material e Métodos
___________________________________________________________________
reagente principal é um corante que interage com resíduos de aminoácidos básicos
e aromáticos produzindo cor. Esta coloração é detectada por espectrofotometria e é
lida a 595 nm.
Para este experimento foram coletadas culturas de Microcystis, cultivadas
conforme descrito no item 3.2.1, coletadas em dois momentos: durante a fase de
crescimento (8 dias de cultivo) e quando as culturas já se encontravam na fase
estacionária (40 dias de cultivo).
3.2.3.1 - Extração de proteínas solúveis:
Cerca de 108 células foram ressuspensas em tampão 20 mM Tris-HCl pH 7,4,
contendo 0,5 mM de CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2. A extração de proteínas solúveis foi
realizada após sonicar células em banho de gelo, utilizando processador ultra-sônico
na potência máxima, num tempo total de 7,5 min (15 ciclos de 1 min: 30 s sonicando
e 30 s resfriando a amostra). A lise total das células foi verificada por observações
ao microscópio óptico. Os restos celulares foram removidos por centrifugação
(18000 x g por 40 min a 4 ºC). O sobrenadante foi coletado e preservado sob
refrigeração até a quantificação.
3.2.3.2 - Obtenção da curva de calibração:
A curva de calibração foi obtida a partir de diluições de uma solução padrão
contendo 0,1 mg/mL de ASB (albumina sérica bovina). As diluições do ASB foram
feitas em H2O ultrapura e ajustadas para um volume final de 200 µL As reações
foram montadas conforme descrito a seguir: em tubos para microcentrífuga novos de
1,5 mL foram misturados 800 µL de cada diluição da solução padrão com 200 µL do
reagente de Bradford. A concentração final de ASB, após a mistura, em cada tubo
27
Material e Métodos
___________________________________________________________________
foi de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µg de ASB por mL de reação. Após homogeneizar
vigorosamente os tubos foram lidos a 595 nm.
Os valores de absorbância x concentração de ASB foram plotados em um
gráfico. A correlação entre concentração de ASB e ABS595 foi de 0,986 (y = 0,0383x
+ 0,0395).
3.2.3.3 - Quantificação das amostras:
A curva de calibração foi obtida simultaneamente com o preparo das
amostras (extração). As amostras foram diluídas para que ficassem no intervalo de
concentração em que as relações absorbância x concentração de ASB fossem
lineares. A reação foi preparada misturando-se 800 µL da amostra diluída com 200
µL do reagente de Bradford. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Este experimento foi repetido duas vezes em 6 culturas independentes (três
cloróticas e três verdes)
3.2.4- Perfil metabólico - Ressonância Magnética Nuclear (RMN):
As culturas de Microcystis foram cultivadas conforme descrito no item 3.2.1 e
as células coletadas em dois momentos do cultivo: durante a fase de crescimento da
cultura (8 dias de cultivo) e quando as culturas já se encontravam na fase
estacionária (40 dias de cultivo).
As células foram separadas do meio de cultura por centrifugação (Beckman
Coulter Allegra 6R), liofilizadas (Labconco freeze-dry system/freezone 4.5) e
mantidas no freezer até a extração.
Este experimento foi repetido duas vezes em culturas independentes.
28
Material e Métodos
___________________________________________________________________
3.2.4.1- Procedimento de extração:
Três extratos foram obtidos por extrações sucessivas do mesmo material
utilizando solventes de polaridade decrescente: água, metanol e clorofórmio. O
procedimento de extração foi o mesmo para os dois tipos de células.
A 500 mg de biomassa liofilizada, condicionada em tubo de vidro para
centrífuga, foram adicionados 10 mL de solvente. O tubo foi agitado vigorosamente
em vortex por 1 min e em seguida centrifugado a 3000 x g por 30 min. O
sobrenadante foi reservado. Este procedimento foi repetido 3 vezes para cada
solvente. Ao final de cada ciclo de extração (cerca de 30 mL para cada solvente) os
extratos foram coletados e armazenados a -20 ºC. Os extratos, metanólico e
clorofórmico, foram secos à pressão negativa em evaporador rotativo (Fisotom
Modelo 802) e o extrato aquoso foi liofilizado.
3.2.4.2- Análise dos extratos:
Os extratos foram ressuspensas nos respectivos solventes deuterados (D2O,
MeOD e CDCL3) e em seguida foram centrifugados e analisados por Ressonância
Magnética Nuclear (RMN) operando a 400 MHz para análise de prótons (RMN JOEL
Eclipse +400 MHz).
3.2.5- Ultra-estrutura – microscopia eletrônica:
Para esta análise foram coletadas alíquotas de culturas de Microcystis com 8
e 41 dias de cultivo. As células foram separadas do meio de cultura por
centrifugação e, em seguida, lavadas em meio ASM-1 e pré-fixadas em uma mistura
9:1 de tampão cacodilato 0.1 M e glutaraldeído 2.5%. As amostras pré-fixadas foram
mantidas a 4 ºC até o processamento.
29
Material e Métodos
___________________________________________________________________
Durante o processamento as amostras foram lavadas três vezes com PBS pH
7,2 e pós-fixadas por 20 min, no escuro, em uma solução de tetróxido de ósmio 1 %
(em solução de cloreto de cálcio 5 mM) e ferrocianeto de potássio 0,8 %. Em
seguida, as amostras foram lavadas três vezes em PBS pH 7,2 e desidratadas em
gradiente crescente de acetona 30%, 50%, 70%, 90% e duas vezes em acetona
super seca (100%). Depois de desidratadas as amostras foram infiltradas em
diluições crescentes de acetona:epon (3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 0:1) e incluídas em resina
epon (Poly-BED 812). Cortes ultrafinos com espessura de 70 nm foram obtidos em
ultramicrótomo (Ultracut S Reichest) utilizando faca de diamante. Estes cortes foram
coletados em grade de cobre com malha de 400 µm. Os cortes foram examinados
ao microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss EM 900) operando a 80 KV.
Este experimento foi repetido duas vezes a partir de culturas independentes.
3.2.6- Viabilidade das células cloróticas:
3.2.6.1- Capacidade de crescimento de cultivos cloróticos inoculados em 2 ASM-1:
Uma alíquota de 10 mL de uma cultura clorótica com 40 dias de cultivo foi
coletada e centrifugada. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e as
células foram lavadas duas vezes em água destilada estéril (2 x 10 mL).
Após a lavagem das células, elas foram ressuspensas em 40 mL de meio 2
ASM-1. Em seguida essa suspensão foi diluída cerca de cinco vezes em meio 2
ASM-1 obtendo-se uma DO750 de 0,84. A suspensão foi distribuída em tubos de
ensaio (1,5 mL para cada tubo) que foram incubados em sala de cultivo nas mesmas
condições de iluminação e temperatura já descritas no item 3.1. Este experimento foi
repetido duas vezes em culturas independentes.
30
Material e Métodos
___________________________________________________________________
O perfil de pigmentos e o aumento da densidade celular foram monitorados
conforme descrito no item 3.2.1 acima.
3.2.6.2- Verificação da integridade de membrana de células cloróticas:
A viabilidade de culturas cloróticas foi investigada com uso do Kit de
viabilidade LIVE/DEAD BacLight (Molecular Probes). O Kit é composto por dois
corantes: iodeto de propídio e o Syto 9®. Estes corantes permitem verificar a
integridade da membrana célula. A visualização das células depois de coradas foi
realizada por microscopia de fluorescência (Zeiss Axiovert), utilizando filtros para
rodamina e fluoresceína.
Para este experimento foram utilizadas culturas cloróticas de Microcystis com
pelo menos 40 dias de idade. As células foram separadas do sobrenadante por
centrifugação e em seguida lavadas duas vezes em meio ASM-1 sem fosfato. Para
corar as células, elas foram novamente ressuspensas em meio ASM-1 sem fosfato e
logo após 1 mL da suspensão foi misturada a 3 µL da solução dos corantes
(proporção 1:1 das soluções de iodeto de propídio e Syto 9®). A suspensão de
células, após a mistura com os corantes, foi mantida no escuro por 15 min antes de
ser observada ao microscópio de fluorescência.
Este experimento foi repetido três vezes em culturas independentes.
3.3- Auto-regulação do crescimento:
3.3.1- Efeito do meio condicionado, obtido de culturas cloróticas, sobre o
crescimento de culturas da mesma cepa, mantidas em meio rico em
nutrientes:
31
Material e Métodos
___________________________________________________________________
Microcystis foi inoculada a uma DO750 de 0,1 em Erlenmeyers de 1 L
contendo 200 mL de meio 2 ASM-1. A cultura foi incubada em agitador rotatório (90100 rpm) mantido em câmara de cultivo, com intensidade de luz variando entre 3045 µmol fótons m-2 s-1. Após a cultura ter se tornado clorótica alíquotas foram
coletadas. As células foram separadas do sobrenadante (meio condicionado) por
centrifugação a 3000 x g por 20 min. A capacidade do meio condicionado em inibir o
crescimento de culturas saudáveis da mesma cepa foi verificada através do ensaio
descrito abaixo.
3.3.1.1- O ensaio de inibição:
A DO750 de uma cultura de Microcystis em fase de crescimento linear foi
ajustada para 0,3 com meio 2 ASM-1. Em seguida 500 µL desta cultura foram
distribuídas para tubos de ensaio. Em cada tubo contendo a cultura diluída foram
adicionados mais 500 µL de meio condicionado. Duas culturas controle foram
utilizadas neste experimento: em uma foram adicionados 500 µL de meio 2 ASM-1 e
na outra 500 µL de água ao invés do meio condicionado.
Os tubos foram incubados em sala de cultivo sem agitação nas mesmas
condições de luz e temperatura. Os resultados foram observados três a cinco dias
após o inicio do experimento. Todos os ensaios foram feitos em triplicata em
condições estéreis.
Este experimento foi repetido três vezes a partir de culturas cloróticas
independentes.
32
Material e Métodos
___________________________________________________________________
3.3.2- Investigação do mecanismo envolvido na inibição do crescimento:
3.3.2.1- Perfil de pigmentos e ultraestrutura de células tratadas com meio
condicionado:
A inibição do crescimento de culturas de Microcystis foi investigada através do
ensaio de inibição descrito no item 3.3.1.1. Após a confirmação da inibição do
crescimento, as células foram coletadas e os efeitos sobre o perfil de pigmentos e a
ultra-estrutura foram verificados conforme métodos já descritos nos itens 3.2.1 e
3.2.5, respectivamente.
3.3.2.2- Atividade do meio condicionado sobre culturas da mesma cepa de
diferentes idades:
Durante este experimento todas as culturas foram incubadas em agitador
rotatório (90-100 rpm) mantido em câmara de cultivo sob condições já descritas. O
crescimento das culturas foi monitorado em função da DO750.
No primeiro dia de experimento, uma cultura de Microcystis foi inoculada em
dois Erlenmeyers de 500 mL contendo 100 mL de meio 2 ASM-1 cada (DO750 inicial
de 0,2). O mesmo procedimento foi realizado no 3º, 7º, 11º e 14º dia do experimento.
Ao chegar no 18º dia de experimento, já com culturas em diferentes fases de
crescimento, a atividade do meio condicionado foi testada em cada cultura através
do ensaio de inibição descrito no item 3.3.1.1. O efeito do meio condicionado sobre o
crescimento e sobre o perfil de pigmentos destas culturas foi analisado conforme
procedimento já descrito. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
33
Material e Métodos
___________________________________________________________________
3.3.3- Especificidade da atividade do meio condicionado:
A atividade do meio condicionado, obtido de culturas cloróticas de Microcystis,
foi testada em outras cepas de cianobactérias através do ensaio inibição já descrito.
Foram testadas tanto cepas pertencentes ao mesmo gênero como Microcystis UENF
Mic1 e Microcystis UENF Mic2 (cepas independentes isoladas das Lagoas de
Jacarepaguá e Iquipari, RJ) quanto cepas pertencentes a outros gêneros:
Synechococcus PCC 7942 e Synechocystis PCC 6803. Todos os ensaios foram
realizados em triplicata.
Este experimento foi realizado três vezes a partir de culturas cloróticas
independentes.
3.4 - Extração e caracterização preliminar do fator responsável pela
atividade do meio condicionado sobre culturas saudáveis de
Microcystis PCC 7806:
3.4.1- Extração do meio condicionado:
Culturas de Microcystis foram cultivadas em Erlenmeyers de 1 L contendo
200 mL de meio 2 ASM-1 até se tornarem cloróticas. Periodicamente, alíquotas das
culturas cloróticas eram retiradas e sua atividade monitorada através da realização
dos ensaios de inibição. Uma vez detectada atividade no meio condicionado, o
restante das culturas era centrifugado para obtenção do restante do meio
condicionado.
O meio condicionado foi passado por uma coluna de fase reversa C18 (ODS
– octadodecilsilano) conforme procedimento descrito a seguir:
34
Material e Métodos
___________________________________________________________________
3.4.1.1- Empacotamento e ativação da coluna:
Cerca de 700 mg ODS foram empacotados em uma coluna (1 x 8 cm). Depois
de empacotada a fase estacionária foi ativada pela passagem de cinco volumes de
metanol (1 volume corresponde a altura da fase estacionária na coluna) seguidos de
cinco volumes de água.
3.4.1.2- Obtenção do extrato:
Após a ativação, cerca de 30 mL de meio condicionado foram passados
através da coluna. O líquido não retido foi coletado e liofilizado. O material retido na
coluna foi eluído com 5 volumes de metanol 100 % e seco em evaporador rotativo.
Os extratos, retido e o não retido, foram ressuspensos em cerca de 15 mL de
meio 2 ASM-1, ficando cerca de 2 vezes concentrado em relação ao meio original.
Após sonicar a suspensão para deixar os extratos em solução eles foram
esterilizados por filtração (0,22 µm, filtro lavado previamente com 10 mL de H2O
estéril). Em seguida a eficiência da extração foi verificada através do ensaio de
inibição já descrito. A inibição do crescimento destes ensaios foi comparada aos
controles negativos realizados com adição de: água, meio 2 ASM-1, água
esterilizada por filtração (0,22 µm, filtro lavado previamente com 10 mL de H2O
estéril), extrato 10 vezes concentrado de meio condicionado de células verdes e
extrato 10 vezes concentrado do meio de cultura 2 ASM-1.
3.4.2- Testes de estabilidade:
Para investigar e caracterizar inicialmente a natureza química do fator
presente no meio condicionado ele foi deixado em banho-maria (100 ºC) por 5 min
35
Material e Métodos
___________________________________________________________________
ou congelado e descongelado três vezes consecutivas. Para testar a estabilidade a
solventes orgânicos os extratos foram re-dissolvidos em metanol, secos sobre
pressão negativa e reconstituídos em meio 2 ASM-1.
A atividade do meio condicionado submetido aos tratamentos descritos acima
foi comparada à atividade do meio condicionado original, conforme ensaio de
inibição descrito anteriormente.
3.4.3- Purificação inicial:
Após a passagem do meio ativo por uma coluna contendo ODS, um gradiente
de metanol:água (10, 20, 40, 60, 80 e 100% de metanol) foi usado para eluir uma
série de frações. O metanol destas frações foi evaporado sob pressão negativa e a
água eliminada por liofilização. Após a reconstituição dos extratos em meio 2 ASM-1
e esterilização por filtração (0,22 µm, filtro lavado previamente com 10 mL de H2O
estéril) a atividade inibitória foi verificada através do ensaio de inibição.
3.4.4- Análise por CLAE:
Cerca de 500 mL de meio condicionado ativo foi extraído com 4 g de ODS. A
coluna (diâmetro 3,2 cm x altura de 50 cm) foi ativada conforme já descrito no item
3.4.1.1 e o meio condicionado passado pela coluna. Em seguida o material retido foi
eluído em gradiente de metanol:água 20, 40, 60, 80 e 100 % de metanol. As frações
que apresentaram atividade foram reunidas, liofilizadas e ressuspensas em 200 µL
de metanol.
36
Material e Métodos
___________________________________________________________________
3.4.4.1- Parâmetros da análise:
Coluna de fase reversa C18 - Merck C18 50981 GORP (5 µm; 125 x 4 mm)
Volume de amostra injetado: 20 µL;
Fluxo: 1,5 mL/min;
Detecção: UV (ultravioleta - detector de arranjo de diodos), cromatograma
monitorado à 200, 250, 300 e 360 nm de comprimento de onda.
Eluente A: Ácido trifluoracético (TFA) 0,05 % em àgua;
Eluente B: TFA 0,05 % em metanol.
Gradiente:
Tempo (min)
B (%)
0,01
5
47
100
57
100
72
5
72,1
stop
Durante a corrida, frações foram coletadas a cada minuto até o tempo de 50
min. Essas frações foram então processadas para a análise da atividade através dos
ensaios de inibição.
3.4.4.2- Processamento das frações:
Para neutralizar o TFA (utilizado durante a corrida) foi adicionado em cada
fração coletada 100 µL de uma solução de K2HPO4 1 M e KH2PO4 1 M (proporção
de 94:6). O pH final de cada fração após a mistura com a solução de neutralização
foi de aproximadamente 8. Em seguida cada uma das frações foi diluída em água,
37
Material e Métodos
___________________________________________________________________
obtendo uma concentração final de 5 % de metanol, e posteriormente passada por
coluna com ODS conforme descrito a seguir:
A fração processada foi passada através da coluna e em seguida a coluna foi
lavada com 5 volumes de água a fim de eliminar o restante de sais e TFA. Em
seguida cada fração foi eluída em 100 % de metanol.
A atividade de cada fração eluída foi verificada, pelo ensaio de inibição item
3.3.1.1, após evaporação do metanol em evaporador rotativo, reconstituição em
meio 2 ASM-1 e esterilização por filtração (0,22 µm, filtro lavado previamente com 10
mL de H2O estéril). Este ensaio foi realizado com as frações concentradas cerca de
doze vezes, ou seja, com a atividade 12 vezes maior que a atividade do meio
condicionado original.
O crescimento destas frações foi comparado ao crescimento de culturas
controle: controles negativos - água, 2 ASM-1 e água esterilizada por filtro
previamente lavado e controle positivo - fração ativa 12 vezes concentrada,
reconstituída em meio 2 ASM-1 e esterilizada por filtração (0,22 µm, filtro lavado
previamente com 10 mL de H2O estéril).
38
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
4- Resultados e Discussão:
4.1-Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 de
diferentes estágios de crescimento:
4.1.1 - Curva de crescimento e dinâmica no conteúdo de pigmentos durante
cultivo de Microcystis por longos períodos:
Cultivos de cianobactérias apresentam um crescimento muito lento quando
comparado à maioria das bactérias heterotróficas cultivadas em laboratório. Por
exemplo, enquanto um cultivo de Escherichia coli, em condições ideais, pode
alcançar uma taxa de crescimento de 72 duplicações diárias, cianobactérias
apresentam taxas que podem variar de 0,3 a 1,4 duplicações por dia (Van Liere &
Walsby, 1982). Deste modo para confeccionar a curva de crescimento de
Microcystis foram necessários muitos dias de cultivo.
O crescimento da cepa Microcystis em meio 2 ASM-1 foi monitorado durante
35 dias conforme curva de crescimento mostrada pela figura 4. Neste período a
cultura apresentou um crescimento predominantemente linear. A entrada para fase
estacionária ocorreu aproximadamente após 27 dias de cultivo. Durante a confecção
da curva de crescimento também foi observado que Microcystis apresentou dois
fenótipos distintos; um durante o crescimento ativo onde a cultura apresentou a
típica coloração verde da maioria das cianobactérias, e outro, cerca de trinta dias
após o inicio do cultivo, onde a cultura experimentou uma progressiva perda de sua
coloração original até se tornar creme (clorótica), ver figura 6. A mudança descrita
no fenótipo da cultura foi monitorada através da obtenção de espectros de absorção
(medido entre 600 e 800 nm) ilustrados pela figura 5. Os espectros demonstram que
o perfil de pigmentos da suspensão de células de Microcystis no inicio do cultivo
39
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
(t=0) apresentou dois picos de absorção máxima, um λmáx=635 nm e outro λmáx =
680 nm. Estes picos de absorção correspondem aos principais pigmentos
fotossintéticos encontrados em Microcystis: as ficocianinas e a clorofila a,
respectivamente. Após 15 dias de cultivo o perfil de pigmentos da cultura apresentou
uma gradual redução no pico de clorofila a (680 nm) que chegou no 35º dia a cerca
de um quarto da intensidade do inicio do cultivo. Nenhuma ou pouca alteração foi
observada em relação ao pico de ficocianina. Deste modo conclui-se que a
degradação da clorofila a é o principal fator relacionado ao surgimento do fenótipo
clorótico.
4.1.2 - Cultivo de células cloróticas em meio 2 ASM-1:
As células cloróticas de Microcystis, quando observadas ao microscópio
óptico, apresentam as mesmas características das células em crescimento ativo, ou
seja, não apresentam nenhuma alteração morfológica que pudesse ser interpretada
como perda de viabilidade. Segundo a literatura, a acentuada queda nos níveis de
clorofila a, como observado com Microcystis, geralmente seria interpretada como
uma irreversível perda de viabilidade (Tandeu de Marsac & Houmard, 1993). Porém
estudos sobre o processo de clorose em Synechoccocus PCC 7942 mostraram que
este fenótipo é reversível, pois assim que os nutrientes suprimidos novamente eram
adicionados, as culturas regeneravam, ou seja, re-adquiriam seus pigmentos
fotossintéticos e voltavam a crescer dentro de 4-5 dias (Görl et al., 1998).
O experimento com Microcystis descrito a seguir buscou verificar se as
culturas cloróticas
desta espécie também mantinham sua capacidade de
regeneração. A capacidade de regeneração das culturas cloróticas de Microcystis é
demonstrada pela figura 7. O espectro da suspensão de células cloróticas no início
40
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
do experimento mostrou ausência de absorção da clorofila a, como já podia ser
esperado (linha tracejada). O meio 2 ASM-1 foi adicionado a estas células e, após
13 dias de incubação, as culturas já apresentavam um pico de absorção da clorofila
a bem definido, e a sua coloração verde característica. A densidade da cultura
durante o experimento também foi monitorada. A cultura aumentou sua densidade
de DO750 0,84, no início do experimento, para praticamente o dobro (DO750 1,55 ±
0,254), após 13 dias de cultivo. Os resultados descritos neste experimento mostram
que pelo menos uma parte das células cloróticas de Microcystis mantém sua
capacidade de regeneração e, portanto permanecem viáveis.
4.1.3 - Verificação da integridade de membrana:
As células de culturas de Microcystis em crescimento (verdes), quando observadas
ao microscópio de fluorescência, apresentam forte auto-fluorescência vermelha.
Esta fluorescência é atribuída principalmente à abundante presença de clorofila a.
Assim a viabilidade de uma população de células de Microcystis em crescimento
pode ser facilmente verificada. De maneira contrária, as células cloróticas de
Microcystis quando observadas ao microscópio de fluorescência não apresentam
esta auto-fluorescência típica. Este fato já era esperado, pois as células cloróticas
como já descrito, apresentam uma drástica redução no conteúdo de clorofila a. Para
determinar qual a percentagem de células na cultura clorótica permanecia viável,
outro método, através do uso de marcadores fluorescentes, foi utilizado. Neste
método a viabilidade das células é verificada pela manutenção da integridade da
membrana.
O uso de marcadores fluorescentes para avaliar a viabilidade de culturas
cloróticas de cianobactérias já havia sido reportado na literatura por Forchhammer e
41
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
4
3,5
3
DO
750
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
tempo (dias)
Fig. 4- Curva de crescimento. O crescimento de Microcystis PCC 7806
em meio 2 ASM- 1 foi monitorado em função da densidade ótica (DO),
medida à 750 nm.
42
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
0,23
absorbância relativa
0,22
0,21
0,20
3 dias
0,19
15 dias
35 dias
0,18
590
640
690
740
comprimento de onda (nm)
Fig. 5- Espectros de absorção de suspensão de células de Microcystis
PCC 7806 coletadas com 3, 15 e 35 dias de cultivo. Os espectros foram
medidos de 600 a 760 nm.
43
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
a.
b.
Fig. 6 – Fenótipos de Microcystis PCC 7806 em diferentes estágios de cultivo;
a. Aspecto de uma cultura com 8 dias de cultivo; b. Aspecto de uma cultura com 35
dias de cultivo.
44
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
0,24
absorbância relativa
13 dias
0,23
0,22
1 dia
0,21
0,2
590
640
690
740
comprimento de onda (nm)
Fig. 7 – Experimento de regeneração. A linha contínua representa o espectro
da cultura clorótica 1 dia após adição de meio 2 ASM-1. A linha pontilhada
representa o espectro de uma cultura clorótica 13 dias após a adição de meio
2 ASM-1.
45
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
colaboradores (1998). Em seus estudos, a viabilidade de culturas de Synechococcus
PCC 7942 submetidas à privação de nitrogênio foi monitorada por duas técnicas. Em
uma, foi utilizado o kit de viabilidade ‘LIVE/DEAD Baclight’ (Molecular Probes), onde
foi demonstrado que após 28 dias de privação de nitrogênio as células de
Synechococcus ainda preservavam sua integridade de membrana. Na outra técnica,
culturas submetidas à privação de nitrogênio por um período de 20 dias foram
avaliadas quanto sua capacidade de retomar o crescimento e readquirir os
pigmentos fotossintéticos (regenerar). Elas foram re-inoculadas em meio de cultura
completo na presença de um agente inibidor da formação de septo. Deste modo, as
células que readquiriam seus pigmentos eram facilmente visualizadas por retomar a
auto-fluorescência característica e as que se dividiam formavam filamentos, pois
devido a ação do agente inibidor da formação de septo elas não se separavam. Foi
observado que após 3 - 4 dias de incubação praticamente todas as células cloróticas
de Synechococcus foram capazes de regenerar, confirmando assim sua viabilidade.
As observações feitas em culturas cloróticas de Microcystis coradas com o kit
de viabilidade mostraram que a integridade da membrana se mantinha, em cada
população observada, geralmente entre 70 - 90%. Assumindo que a manutenção da
integridade de membrana é um fator suficiente para a célula se regenerar podemos
concluir então que a maior parte das células cloróticas dentro de cada cultura
permanecia com capacidade de regeneração. Estas suposições poderão ser
confirmadas em experimentos com culturas sobre lâminas de microscópio.
Outros experimentos realizados mostraram que culturas de Microcystis
cloróticas foram capazes de manter sua viabilidade por aproximadamente um ano
quando mantidas em sala de cultivo e sob iluminação, somente com a adição de
água para evitar o ressecamento (dados não mostrados).
46
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
4.2 - Caracterização dos dois fenótipos:
Após observar que Microcystis PCC 7806 apresenta dois fenótipos distintos
ao longo do cultivo, os experimentos posteriores visaram uma melhor caracterização
destes dois estados metabólicos.
4.2.1 - Diferenças na ultraestrutura:
Estudos sobre alterações na ultraestrutura de células de cianobactérias
decorrentes da privação de nutrientes essenciais são escassos e antigos (Ariño et
al., 1995; Stevens et al., 1985; Wanner et al., 1986; Sherman et al., 1983; Miller et
al., 1977; Vasconcelos & Fay, 1974). Nestes estudos um tipo de alteração na
ultraestrutura freqüentemente relatado ocorre em relação aos grânulos de reserva
(Allen, 1984). Outra alteração constantemente observada ocorre no aparato
fotossintético (desaparecimento dos tilacóides) da célula que quase sempre é
afetado.
As micrografias eletrônicas das células de Microcystis de diferentes fenótipos
são mostradas na figura 8. Foi observado que as células coletadas durante a fase de
crescimento apresentaram a típica organização ultraestrutural de uma célula de
cianobactéria. No citoplasma observou-se a presença de estruturas esféricas eletrodensas e eletro-lucentes. Estas estruturas provavelmente se tratam de grânulos de
reserva encontrados em cianobactérias, como por exemplo, grânulos de polifosfato e
corpos lipídicos (Allen, 1984). É também claramente observado no citoplasma um
proeminente sistema interno de membranas tilacoidais que constituem o aparato
fotossintético da célula. A parede celular se apresentou bem estruturada, com o
arranjo multi-laminar típico das bactérias gram-negativas (figura 8 A).
47
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
As micrografias das células cloróticas mostraram que ocorrem profundas
mudanças na organização celular durante a clorose. Nestas células foi observado o
desaparecimento do aparato fotossintético que era caracterizado principalmente pela
abundante presença dos tilacóides. As células cloróticas apresentaram também uma
marcante reorganização na parede celular (figura 8 B).
4.2.2 - Diferenças no acúmulo de glicogênio:
O glicogênio é um polissacarídeo formado por subunidades de glicose unidas
através de ligações α14, com ligações α16 nas ramificações. Em cianobactérias,
o glicogênio é acumulado sob a forma de pequenos grânulos localizados
principalmente entre os tilacóides. O glicogênio pode ser degradado em
cianobactérias a dióxido de carbono pela via pentose fosfato e os elétrons
transferidos ao oxigênio via cadeia transportadora de elétrons (Van Liere et al.,
1979), portanto sua principal função é de servir como produto de reserva; provável
fonte de carbono e energia na ausência luz.
O acúmulo de glicogênio ocorrido durante o processo de clorose já foi
relatado para outros gêneros de cianobactérias. Em culturas de Synechococcus
PCC 7942, por exemplo, o processo de clorose foi acompanhado por um aumento
de aproximadamente 4 vezes no conteúdo de glicogênio, após 30 dias de privação
de nitrogênio (Görl et al., 1998).
A quantificação de glicogênio nas células de Microcystis foi obtida
indiretamente, após hidrolise ácida com liberação de monômeros de glicose. Este
dado está representado pelo gráfico de barras da figura 9. Os resultados mostram
que as células cloróticas apresentam cerca de 5 vezes mais glicogênio que as
48
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
Fig. 8 – Micrografias eletrônicas de células de Microcystis sob diferentes
condições; a. Ultraestrutura de células coletadas durante a fase de crescimento. As
setas pretas mostram a organização dos tilacóides; b. Ultraestrutura de células cloróticas.
Nestas células observa-se a ausência das membranas tilacoidais e uma reorganização da
parede celular; c. Efeito do meio condicionado ativo, sobre a ultraestrutura de células
crescidas em meio repleto de nutrientes. Estas células tratadas também apresentaram a
perda dos tilacóides. As micrografias selecionadas são representativas de cada estágio
analisado. As barras representam 0,25 µm.
49
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
12
glicose (µg/10 8 céls)
10
8
6
4
2
0
culturasmédia
culturas
verdes
cloróticas
Fig. 9 – Estimativa do conteúdo de glicogênio. Os resultados foram
obtidos a partir de culturas com 8 (células verdes) e 40 dias (células
cloróticas). O conteúdo de glicogênio foi determinado indiretamente após
hidrólise ácida e liberação dos monômeros de D-glicose utilizando o
método enzimático/colorimétrico (glicose oxidase) do Kit Bioliquid
(Biodiagnóstica).
50
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
células em fase de crescimento. As células cloróticas com 40 dias de cultivo
apresentaram 8,11 ± 2,18 µg de glicose/108 células enquanto as células verdes, com
8 dias de cultivo, apresentaram 1,55 ± 0,68 µg de glicose/108 células.
4.2.3 – Conteúdo de proteínas solúveis:
A análise proteômica de proteínas solúveis em Synechocystis PCC 6803
revelou que grande parte das proteínas identificadas está relacionada ao
metabolismo energético (fotossíntese) e ao metabolismo de aminoácidos (Simon et
al., 2002). Além disso, estima-se que cerca de um terço do total de proteínas
solúveis em Synechocystis esteja associada a membranas (Norling et al., 1998).
A estimativa do conteúdo de proteínas solúveis em Microcystis revelou que na
média não houve diferença clara entre os fenótipos: as células verdes apresentaram
17,5 ± 4 µg enquanto as células cloróticas apresentaram 20 ± 9,3 µg de proteínas
solúveis/108 células.
A grande variação no conteúdo de proteínas solúveis
observada dentro de cada fenótipo analisado (alto desvio padrão) pode ter sido
influenciada por problemas na metodologia. Durante o processo de extração das
proteínas solúveis foi observado que as células cloróticas apresentaram maior
resistência à lise quando comparada às células verdes. Deste modo foi preciso
aumentar o número de ciclos de sonicação no processo de extração para garantir
que todas as células cloróticas rompessem. O procedimento de sonicação é um
método agressivo e a extensão do número de ciclos pode ocasionar a desnaturação
de proteínas o que poderia influenciar os resultados obtidos. Assim, os resultados
deste experimento são preliminares, pois o método de extração deverá ser otimizado
a fim de minimizar os efeitos do procedimento de sonicação na quantificação das
proteínas solúveis de cada fenótipo.
51
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
Mais uma razão para questionar os resultados acima, são os dados obtidos
nos estudos sobre clorose em Synechococcus PCC 7942 (Sauer et al., 2001). Os
autores mostraram que as células mantidas por 70 dias em meio sem nitrogênio
apresentaram cerca de 0,4% do total de proteínas solúveis de células coletadas na
fase de crescimento (Sauer et al., 2001). Portanto os resultados apresentados neste
trabalho para as células cloróticas de Microcystis diferem do que foi observado
durante a clorose em Synechococcus PCC 7942 (Sauer et al., 2001).
4.2.4 - Diferenças no perfil metabólico:
O uso da ressonância magnética nuclear como ferramenta na área da
microbiologia vem ganhado destaque nos últimos anos (Kell, 2004; Grivet et al.,
2003 e Fiehn, 2002).
Entre as principais aplicações desta técnica destaca-se a
possibilidade de se obter um perfil químico completo de uma amostra e ainda ser
possível identificar um composto dentro dessa mistura complexa, sem a
necessidade de purificá-lo. Neste estudo a RMN foi utilizada para obter o perfil
químico das micro-moléculas solúveis presentes em diferentes extratos de células
de Microcystis PCC 7806 de diferentes fenótipos.
A medição dos espectros do extrato aquoso e metanólico mostrou que, no
geral as células cloróticas apresentaram uma redução na intensidade dos sinais,
quando comparadas com as células verdes. No extrato aquoso os compostos
identificados foram: colina, ácido acético, ácido láctico, ácido β-hidroxi butírico,
açúcares e dois compostos que não puderam ser identificados (figura 10 A e B). No
extrato metanólico os compostos identificados foram: ácido fórmico, clorofila a e
ácido acético, além de ácidos graxos saturados e insaturados, açúcares e um
composto não identificado (figura 10 C e D).
52
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
A comparação dos espectros dos extratos clorofórmicos mostrou claramente
uma mudança no perfil de ácidos graxos (figura 10 E e F). As células cloróticas
apresentaram maior quantidade de ácidos graxos insaturados em relação às células
verdes. Este fato é evidenciado principalmente pelo aparecimento do sinal com
deslocamento químico em 5.35, que provavelmente corresponde a uma insaturação
na cadeia de C.
A presença de ácido β-hidroxi butírico no extrato aquoso de cianobactérias é
comum já que este composto pode formar um polímero, o poli-β-hidroxibutirato
(PHB) que é unicamente encontrado em bactérias. Em algumas espécies de
cianobactérias, o acúmulo de PHB é induzido pela privação de nutrientes, como em
Synechococcus sp. MA19 que foi capaz de acumular rapidamente PHB quando
cultivada em condições de privação de nitrogênio (Miyake et al., 1997). Em outras
espécies o acúmulo de PHB ocorre em função de excesso de poder redutor ou pela
presença de excesso de ácido acético (De Phillipis et al., 1992). No extrato aquoso
de células cloróticas de Microcystis foi observado uma redução em torno de 2,5
vezes nos sinais relativo ao ácido β-hidroxi butírico. A diminuição dos sinais relativos
ao ácido β-hidroxi butírico, junto ao fato de ocorrer um aumento de 3,8 vezes no
sinal relativo ao ácido acético no extrato metanólico sugere que ocorreu um
acúmulo, nas células cloróticas, de ácido β-hidroxi butírico na sua forma polimérica
(PHB). O PHB não é detectado nos espectros por se tratar de uma molécula
polimérica e por isso há a necessidade de técnicas específicas de RMN para
confirmar este acúmulo nas células cloróticas de Microcystis.
No espectro do extrato aquoso de células verdes foi detectado um sinal
relativo a molécula de colina. Este sinal estava ausente no extrato aquoso das
células cloróticas. Em bactérias a colina pode participar da formação de
53
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
fosfatidilcolina – um tipo de fosfolipídio de membrana (Sohlemkamp et al., 2003). A
ausência deste sinal nas células cloróticas pode ser explicada pelo fato desta cultura
já se encontrar na fase estacionária e, portanto o processo de formação de
membranas nestas células estar reduzido.
A comparação da intensidade dos sinais relativos aos açúcares entre as
células verdes e cloróticas revelou que houve uma redução em torno de 60 vezes no
conteúdo destas moléculas nas células cloróticas. Esta redução é prontamente
justificada pela marcante redução do processo de fotossíntese nas células
cloróticas.
O ácido lático é uma molécula proveniente da fermentação da glicose. Ele é
formado a partir do piruvato e em cianobactérias é sintetizado principalmente
durante o período de escuro, para produção de ATP. O sinal relativo ao ácido lático
se apresentou cerca sete vezes menos intenso nas células cloróticas. Este fato
provavelmente é mais um reflexo da redução no metabolismo das células. Como a
produção de açucares foi drasticamente reduzida o metabolismo do piruvato a
lactato durante o período de ausência de luz também foi diminuído.
O espectro aquoso e metanólico das células cloróticas revelou um aumento
na intensidade dos sinais relativos ao ácido acético e ao ácido fórmico, quando
comparado com os espectros das células verdes. Esses compostos também são
produtos de fermentação.
Apesar da respiração aeróbica ser considerada o modo habitual de geração
de energia em cianobactérias na ausência de luz, esses microorganismos podem
ser encontrados em ambientes sob permanente condição de anoxia (por exemplo,
quando formam grossas natas durante as florações) ou temporariamente,
principalmente durante a noite, quando a oferta de oxigênio é limitada pela
54
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
supressão da fotossíntese. Sob condição de falta de oxigênio o metabolismo aeróbio
pode ser substituído pelo metabolismo anaeróbio através do processo fermentativo.
Em cianobactérias vários tipos de fermentação já foram reportados: culturas aeradas
de Microcystis PCC 7806 e crescidas em meio de cultura BG11, foram capazes de
fermentar, na ausência de luz, o glicogênio de reserva em etanol, acetato, dióxido de
carbono (CO2) e H2 (Moezzelaar & Stal, 1994); Oscillatoria limnetica, quando em
condições de anoxia foi capaz de realizar fermentação homolática (Oren & Shilo.,
1979); Oscillatoria limosa, uma espécie que pode formar densas camadas de células
onde a difusão de gases é dificultada (Revsbech et al., 1983), é capaz de realizar
uma fermentação heterolática e homoacética simultaneamente (Heyer et al., 1989);
em Cyanothece PCC 7822, um gênero unicelular, quando incubada na ausência de
oxigênio e luz e foi capaz de utilizar suas reservas de carbono gerando acetato,
etanol, formato e lactato caracterizando um tipo de fermentação ácida mista (Van
der Oost et al., 1989). Os dados relativos aos produtos da fermentação sugerem que
durante o crescimento no meio ASM-1 (homeostase energética) as células de
Microcystis apresentaram uma fermentação preferencialmente homolática (ac.
lático). Durante a clorose com a drástica mudança no metabolismo energético das
células vias alternativas de obtenção de energia se tornaram ativas, como foi
observado pela produção de ácido acético e ácido fórmico nas células cloróticas.
Durante esta fase provavelmente fontes de carbono de reserva (glicogênio e PHB,
por exemplo) serviram como substratos para este tipo de fermentação.
No extrato metanólico das células cloróticas foi observado a ausência do sinal
relativo à clorofila a; Este fato já era esperado, pois como já descrito em
experimentos anteriores, as células cloróticas apresentam redução no conteúdo de
clorofila
a.
55
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
Tabela 1- Informações auxiliares aos espectros dos extratos aquosos.
Letra
Deslocamento
químico (p.p.m)***
Células.
verdes*
Células.
cloróticas*
Molécula identificada
a1
a2
a3
1.2
2.5
4.15
5
2
ácido β-hidroxi butírico
b
c
d
3.25
1.35
2
0.7
X**
0.1
colina
ácido lático
1.9
2
3
ácido acético
C5H14ON
C3H6O3
C2H4O2
e1
e2
f
3.5-4.0
5.4
4.4
12
0.2
açúcares
variável
0.8
0.05
composto não identificado
desconhecida
g
6.9
X**
0.05
composto não identificado
desconhecida
Fórmula química
C4H8O3
* intensidade relativa do sinal; ** sinal não detectado; *** valores aproximados.
Tabela 2- Informações auxiliares aos espectros dos extratos metanólicos.
Letra
Deslocamento químico
(p.p.m.)***
Células.
verdes*
Células cloróticas*
Molécula identificada
Fórmula química
h
8.55
0.1
1.6
ácido fórmico
CH2O2
i
5.96, 6.15, 8.03, 8.45,
9.35 e 9.6
0.8
0
clorofila a
C55H72MgN4O5
j
5.3 e 5.4
9
3
k
0.9 e 1.3
16
17
l
7.05 e 7.75
0.2
X**
e
3.5 - 4.0
4
0.5
ácidos graxos
insaturados
ácidos graxos
saturados e
insaturados
composto não
identificado
açúcares
d
1.9
1.3
5
ácido acético
variável
variável
desconhecida
variável
C2H4O2
* intensidade relativa do sinal; ** sinal não detectado; *** valores aproximados.
Tabela 3- Informações auxiliares aos espectros dos extratos clorofórmicos.
Letra
Deslocamento químico
(p.p.m.)***
Células.
verdes*
Células cloróticas*
Molécula identificada
Fórmula química
k
0.9 e 1.3
1,7
1,4
ácidos graxos
saturados e
insaturados
variável
ácidos graxos
insaturados
* intensidade relativa do sinal; ** sinal não detectado; *** valores aproximados.
j
5.35
0,02
0,2
variável
56
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
células verdes
A.
células cloróticas
B.
a1
H2 O
d
e1
d
b
e2
H2O
a2
a3
f
g
a1
c
e2
a3
e1
a2
c
D.
C.
i
MeOH
-
MeOH
k
j
k
k
k
e
d
i il l
i
ii
j
d
j
h
E.
F.
k
k
k
j
k
j
Fig. 10 - Espectros de 1H RMN (400 mHz) de células de Microcystis PCC 7806 coletadas em
diferentes estágios de crescimento da cultura. Perfil metabólico de células coletas durante a
fase de crescimento; extrato aquoso (A), extrato metanólico (C), extrato clorofórmico (E). Perfil
metabólico de células coletadas na fase estacionária (células cloróticas); extrato aquoso (B), extrato
metanólico (D), extrato clorofórmico (F).
57
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
4.3- Auto-regulação do crescimento de Microcystis PCC 7806:
4.3.1 - O efeito do meio condicionado de Microcystis sobre o crescimento e
conteúdo de pigmentos da mesma cepa:
A entrada para a fase estacionária em bactérias quase sempre é
acompanhada por diversas mudanças fisiológicas que visam a sobrevivência das
células no ambiente (Kolter et al., 1993). Em cianobactérias parece não ser
diferente. Mudanças fisiológicas em bactérias estão freqüentemente associadas à
produção de sinais extracelulares que são responsáveis pela coordenação dessas
respostas.
A fim de investigar se o meio de cultura obtido de células cloróticas possui
sinais químicos que coordenem uma resposta da população à falta de nutrientes,
este meio foi adicionado a culturas crescidas em meio repleto de nutrientes. Meio de
cultura de células cloróticas (meio condicionado) foi separado e adicionado em
culturas recém inoculadas em meio 2 ASM-1.
A figura 11 mostra o efeito do meio condicionado de células cloróticas sobre
culturas crescidas em meio repleto de nutrientes. Os experimentos mostraram que
depois de 3 a 5 dias, houve uma clara diferença na densidade das células: enquanto
as culturas controle, onde água ou meio de cultura foram adicionados, apresentaram
aumento na densidade, as culturas que foram tratadas com o meio condicionado da
fase estacionária apresentaram crescimento muito inferior. A DO750 da cultura
tratada foi de 0,36 + 0,04, o que corresponde à cerca de duas vezes a densidade do
inóculo. Já nos controles a absorbância aumentou de 8-9 vezes (DO750 do controle
com água 1,24 + 0,23 e do controle com meio 2 ASM-1 1,35 + 0,09) (figura 11).
58
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
1
2
3
Fig. 11 - Efeito do meio condicionado ativo sobre o crescimento de culturas de
Microcystis PCC 7806 crescidas em meio repleto de nutrientes. 1- Controle
negativo com adição de H2O; 2- Adição do meio condicionado ativo; 3- Controle
negativo com adição de meio 2 ASM-1. A observação foi feita 5 dias após o início do
experimento.
59
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
Para verificar se o acúmulo do composto inibitório se dá especificamente na
fase estacionária de crescimento o mesmo tipo de ensaio foi realizado utilizando-se
meio condicionado de cultivos de Microcystis ainda em crescimento, ou seja,
enquanto as células ainda estavam verdes. Nenhuma inibição no crescimento foi
observada nestes ensaios (dados não mostrados). Deste modo podemos concluir
que o fator responsável pela inibição está presente somente em culturas
estacionárias.
A fim de verificar com mais detalhe a inibição descrita acima, também foi
avaliada a susceptibilidade de cultivos de Microcystis, em diferentes fases de
crescimento, ao tratamento com o meio condicionado.
O efeito do meio condicionado ativo sobre o crescimento de culturas de
Microcystis com 4, 7, 10 e 14 dias de cultivo é mostrado na figura 12 A. A DO750 foi
medida 5 dias após o ensaio ter sido realizado. A inibição da divisão celular ocorreu
de maneira independente da idade da cultura a qual o meio condicionado ativo foi
adicionado.
Estes resultados mostraram que a atividade do meio condicionado sobre
culturas saudáveis de Microcystis independe da fase de crescimento a qual ele é
adicionado.
4.3.2 - Atividade do meio condicionado ativo sobre outras cepas de
cianobactérias:
Os mesmos experimentos de inibição foram realizados em outras cepas
independentes do mesmo gênero, ambas isoladas no Brasil. A tabela 4 mostra que a
inibição do crescimento na cepa de Microcystis UENF Mic1 e Microcystis UENF Mic2
foi cerca de 25% menor quando comparado com o poder de inibição na cepa
60
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
Tabela 4- Comparação do efeito do meio condicionado de culturas cloróticas de
Microcystis PCC 7806 sobre o crescimento de outras cepas. Resultados
observados 5 dias após a realização do ensaio de inibição. Os valores de
inibição são relativos ao resultado do ensaio obtido com a cepa Microcystis PCC
7806.
Cepa
Força de inibição relativa (%)__
Microcystis PCC 7806
100
Microcystis UENF Mic1
75 - 60
Microcystis UENF Mic2
75 – 60
Synechococcus PCC 7942
0
Synechocystis PCC 6803
0
61
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
a.
1,2
2,5
2
0,8
1,5
0,6
1
0,4
D.O. 750 nm
absorbância relativa
1
0,5
0,2
0
0
0
5
10
tempo (dias)
15
20
b.
absorbância relativa
0,23
0,22
0,21
0,20
0,19
590
640
690
740
comprimento de onda (nm)
Fig. 12- Efeito da adição do meio condicionado ativo em culturas de Microcystis
com 4, 7, 10 e 14 dias de crescimento; a. (•) Curva de crescimento em função da
DO
750.
As barras verticais mostram o crescimento relativo das culturas em cada
idade após o tratamento com: pretas meio 2 ASM-1, cinzas água, brancas meio
condicionado; b. Espectro de uma cultura de Microcystis com 10 dias de crescimento
após tratamento com meio condicionado, onde: (
2ASM-1 e (
) meio condicionado foi adicionado.
) água, (
) meio
62
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
original; deste modo, estes resultados mostraram que a inibição não foi específica, e
que as outras cepas de Microcystis também são sensíveis à adição do meio
condicionado.
A fim de investigar se o meio condicionado de Microcystis PCC 7806 possui
efeito sobre outros gêneros de cianobactérias pertencentes à mesma Seção de
Microcystis, o ensaio de inibição foi realizado em duas culturas: Synechococcus
PCC 7942 e Synechocystis PCC 6803. Como mostrado na tabela 4, nenhuma das
duas cepas respondeu à adição do meio de cultura condicionado, ou seja, as
culturas foram capazes de manter o crescimento mesmo na presença do meio
condicionado de culturas cloróticas de Microcystis PCC 7806.
Os resultados acima sugerem, que o efeito do meio condicionado ativo de
Microcystis PCC 7806 não é universal para cianobactérias e que seja talvez gênero
específico.
4.4 - Investigação do mecanismo de inibição:
4.4.1 - Efeito do meio condicionado ativo sobre o perfil de pigmentos,
ultraestrutura e viabilidade de células de Microcystis PCC 7806.
Os ensaios, no qual o meio condicionado de células cloróticas foram
adicionados em culturas repletas de nutrientes do mesmo organismo, mostraram
que além da inibição da multiplicação das células, o tratamento tornava as culturas
tratadas pálidas, ou seja, com fenótipo semelhante ao observado nas células
cloróticas. Para confirmar esta suspeita, foi medido o perfil de pigmentos de culturas
tratadas com meio condicionado ativo. A figura 12 B mostra o espectro de uma
cultura de Microcystis incubada durante 10 dias com o meio condicionado. Foi
observado que a intensidade do pico de absorção da clorofila a na cultura tratada foi
63
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
bem menor quando comparado às intensidades dos picos de clorofila a nas culturas
controle (tratadas com água ou 2 ASM-1). Deste modo foi confirmado que, além da
inibição da divisão celular, o meio condicionado ativo também possui efeito sobre o
conteúdo de pigmentos das células. Culturas com 4, 7 e 14 dias de cultivo
submetidas ao mesmo tratamento também apresentaram diminuição na intensidade
do pico de clorofila a (dados não mostrados) indicando assim que a redução no
conteúdo de clorofila a também ocorreu de maneira independente da idade da
cultura na qual o meio condicionado ativo foi adicionado.
O efeito do meio condicionado sobre a ultraestrutura das células tratadas
também foi investigado. A figura 8 C (página 49) mostra a ultraestrutura de uma
célula de Microcystis PCC 7806 após tratamento com o meio condicionado. A
principal característica que as células tratadas apresentaram foi o desmantelamento
de seu aparato fotossintético, notado principalmente pela ausência dos tilacóides.
Este fato se assemelha ao observado nas células cloróticas (ver figura 8 B).
A fim de verificar, se as células tratadas com meio condicionado permaneciam
com sua membrana intacta, foram usados novamente marcadores fluorescentes. As
observações após corar as células tratadas com o Kit LIVE/DEAD Baclight
mostraram que mais de 90 % destas células mantinham a integridade de membrana
preservada, e que, provavelmente, estas células permaneciam viáveis.
Os resultados descritos acima sugerem que a redução da multiplicação
celular, nas culturas em que o meio condicionado foi adicionado, foi acompanhada
pelo desmantelamento do aparato fotossintético das células, essencial para a
captação de energia. Também demonstra que as células tratadas com o meio
condicionado adquirem características similares às encontradas nas células
cloróticas na fase estacionária, pois como foi verificado as células tratadas mantêm
64
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
preservada a integridade da membrana e, portanto provavelmente permanecem
viáveis.
4.5 - Extração e caracterização preliminar do fator responsável pela
atividade do meio condicionado em culturas de Microcystis PCC
7806.
Os resultados até agora discutidos sugerem a presença de algum fator
liberado no meio de cultura de células cloróticas capaz de inibir a multiplicação
celular do mesmo microorganismo, mesmo na presença de nutrientes suficientes no
meio de cultura. Uma investigação mais profunda revelou que este composto foi
capaz de levar as células verdes a adquirirem características de células cloróticas.
Este fator seria produzido pelas células durante o processo de clorose (entrada para
a fase estacionária).
Para definir estratégias de isolamento do fator presente no sobrenadante de
células cloróticas, primeiramente foi avaliada a estabilidade do meio condicionado a
altas temperaturas e ao congelamento. Foi observado que após fervura e após
sucessivas etapas de congelamento/descongelamento, o meio condicionado
preservou sua atividade. Também foi verificado que este fator preservou sua
atividade após a sua solução em solventes orgânicos. Destes resultados conclui-se
que o composto ativo deve se tratar de uma micro-molécula relativamente apolar e
por isso foi definida uma estratégia de purificação.
65
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
4.5.1 - Extração:
A eficiência da extração do composto ativo foi avaliada após tentativas de
adsorção em ODS. O ensaio de inibição realizado com a fração eluída e não-eluída
revelou a fração eluída apresentou os mesmos resultados de inibição do meio
condicionado original (que não foi passado pela coluna) e a fração não-eluída não
apresentou nenhuma atividade. Conclui-se então que o composto responsável pela
atividade é capaz de ficar retido em ODS.
Em outro experimento o mesmo procedimento de extração, utilizado para
meio condicionado de células brancas, foi realizado com meio condicionado de
células ainda em fase de crescimento (verdes) e com o meio de cultura 2 ASM-1
fresco (sem inóculo). Após passados por cada coluna o material retido foi eluído com
metanol 100 %, seco em rotavapor e concentrado cerca de 10 vezes, ou seja,
reconstituído em meio 2 ASM-1 ao equivalente a décima parte do volume do meio
condicionado de células verdes ou do meio de cultura 2 ASM-1 sem inóculo
passados inicialmente pela coluna. Os extratos concentrados foram usados como
controles negativos nos ensaios de inibição.
O resultado do ensaio de inibição mostrou que os extratos do meio
condicionado de células ainda em fase de crescimento (verdes) e do meio de cultura
2 ASM-1 fresco sem inóculo mesmo concentrados, não apresentaram atividade
inibitória e o crescimento das culturas tratadas desta maneira foi similar ao das
culturas onde somente água e meio 2 ASM-1 foram adicionados (dados não
mostrados). Estes resultados confirmam que a atividade do meio condicionado
ocorre somente quando as células estão na fase estacionária de crescimento, ou
seja, quando as células já estão cloróticas. Mostram também que nenhum
66
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
componente presente no meio de cultura 2 ASM-1 é responsável pela inibição do
crescimento.
Depois de confirmada a retenção do composto ativo em ODS foi iniciada
etapa de purificação. Primeiramente foram realizados ensaios de atividade com as
frações eluídas em 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100% de metanol. O resultado destes
ensaios indicou que somente as frações eluídas a 60 e 80% de metanol
apresentaram atividade. Nenhuma inibição foi observada com as frações eluídas a
5, 10, 20, 40 e 100% de metanol. Estes resultados confirmam se tratar de um
composto relativamente apolar.
4.5.2 - Análise por CLAE:
Após extrair uma grande quantidade de meio condicionado as frações eluídas
entre 60 e 80% de metanol foram reunidas e concentradas para a análise por CLAE.
O cromatograma da fração ativa se mostrou bastante complexo, como é
mostrado pela figura 13. Os compostos detectados no cromatograma foram
exclusivamente oriundos do metabolismo das células uma vez que cianobactérias
são organismos autotróficos e seu meio de cultura é composto apenas de sais
minerais (ver anexo I) e EDTA.
A atividade das frações coletadas após a passagem pelo CLAE foi monitorada
através do ensaio de inibição (figura 13). O resultado dos ensaios revelou várias
frações com atividade inibitória. As frações coletadas que apresentaram atividade
são representadas pelos vales no gráfico da figura 13. A atividade das frações se
concentrou nos intervalos entre 23 e 24 minutos, entre 35 e 38 minutos e entre 40 e
44 minutos.
67
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
Ao comparar os intervalos onde houve a inibição de crescimento com o tempo
de saída de picos no cromatograma foi observado que a fração coletada no intervalo
entre 23 e 24 min embora tenha mostrado atividade não coincidiu com nenhum pico
de absorção. No intervalo entre 35 e 38 min a atividade inibitória foi acompanhada
por vários picos que absorveram mais fortemente a 200 e 250 nm. O intervalo entre
40 e 44 min apresentou dois picos bem definidos que absorveram somente a 200
nm. Neste intervalo de tempo também foram observadas regiões que embora tenha
apresentado atividade inibitória não apresentaram picos de absorção nos
comprimentos de onda monitorados. A presença de atividade inibitória em regiões
do cromatograma onde não apresentam absorção no ultravioleta próximo (200 – 380
nm) indica que existem compostos que embora contribuam para a atividade do meio
condicionado não apresentam cromóforos, ou seja, são invisíveis no ultravioleta
próximo e, portanto não podem ser detectadas por esta técnica. Portanto o
fracionamento da amostra por CLAE indica que mais de um fator estaria envolvido
com a atividade do meio condicionado.
68
Resultado e discussão
_______________________________________________________________________________________________________
0,6
crescimento
cromatograma -CLAE
HPLC
0,4
1000
OD750
0,8
0,2
Absorbância relativa
2000
1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tempo (min)
Fig. 13 - Cromatograma da fração ativa e atividade das frações coletadas após passagem por CLAE. A amostra
foi injetada em coluna C18 em CLAE com detector de diodo. O volume de amostra injetado foi de 20 µL com fluxo de
corrida a 1,5 mL/min. Os eluentes usados na corrida foram: eluente A: TFA 0,05 % em água e eluente B: TFA 0,05 %
em metanol. O espectro foi monitorado a 200 (linha verde), 250 (linha vermelha) e 300 nm (linha azul). Após passagem
pela coluna as amostras foram coletadas, processadas e testadas quanto a sua atividade. Os vales indicam os tempos
que apresentaram atividade inibitória. DO750 das culturas controle: 1,086 (água), 1,155 (2 ASM-1), 1,035 (água
esterilizada por filtro) e 0,189 (controle positivo).
69
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
4.6 - Considerações finais:
As culturas de Microcystis apresentam uma coloração verde-azulada
característica da maioria das cianobactérias unicelulares (figura 6 a). Esta coloração
é atribuída principalmente à presença dos seus principais pigmentos fotossintéticos:
a clorofila a e a ficocianina. Cultivos de Microcystis mantidos por longos períodos de
tempo são reportados na literatura (Lyck, 2004), porém em nenhum estudo foi
descrito o fenômeno de clorose. Apesar das condições de cultivo e as cepas
testadas serem diferentes da nossa, este parece ser um dos primeiros estudos que
reportam este fenômeno no gênero Microcystis.
Os experimentos indicaram que o fenômeno de clorose em Microcystis
ocorrreu sempre de maneira espontânea e geralmente quando as culturas
apresentavam altas densidades celulares. O pH do meio condicionado, quando as
células já se apresentavam cloróticas, ficou em torno de 8, portanto o pH parece não
possuir influência sobre a indução de clorose.
O efeito da limitação de nutrientes sobre a fisiologia de cianobactérias não
fixadoras de nitrogênio tem sido freqüentemente estudada. Uma freqüente
observação é a redução no conteúdo dos pigmentos fotossintéticos da cultura.
(Wanner et al., 1986, Saha et al., 2003, Görl et al., 1998, Collier & Grossman, 1992).
As culturas permanecem viáveis desde que essa adaptação é prontamente
reversível.
A limitação por nitrogênio leva a uma gradual queda no conteúdo dos
pigmentos fotossintéticos de Synechococcus PCC 7942. Este processo resulta em
baixos níveis de fotossíntese já que a homeostase energética nas células cloróticas
é mantida a 0,1 % da atividade fotossintética de células verdes. Deste modo propõese que esta reação seja um mecanismo de adaptação para a sobrevivência
70
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
prolongada das células (Sauer et al., 2001) já que mutantes que não reagem desta
maneira possuem baixa viabilidade (Sauer et al., 1998). Nestes estudos também foi
mostrado que as culturas cloróticas foram capazes de permanecer viáveis por no
mínimo um ano de privação, desde que fossem mantidas na presença de luz;
culturas cloróticas incubadas na ausência de luz por 14 dias já mostravam atraso no
tempo de regeneração quando colocadas novamente em meio de cultura
suplementado com nitrogênio.
O espectro de Microcystis PCC 7806 no inicio do cultivo mostra um pico
relativamente pequeno de ficocianina, quando comparado ao pico de clorofila a. A
redução de pigmentos mais pronunciada observada durante a clorose foi em relação
ao pico de clorofila a, que foi reduzido a cerca de um quarto da sua intensidade
original de absorção. A degradação da clorofila a e de proteínas associadas, em
Microcystis PCC 7806 teria os mesmos efeitos propostos para a degradação de
ficobiliproteínas em Synechococcus PCC 7942 descritos antes: uma diminuição da
absorção de luz com um concomitante aumento na disponibilidade de nutrientes
limitantes, possibilitando que Microcystis sobreviva às condições de estresse. Além
disso, os resultados sobre o conteúdo de glicogênio mostraram que as células
cloróticas de Microcystis apresentaram um aumento no conteúdo de glicogênio. Este
último fato se assemelha aos experimentos sobre privação de nitrogênio em
Synechococcus PCC 7942, onde também foi observado um acúmulo de glicogênio.
Portanto este estudo mostra que Microcystis e Synechococcus devem adotar
estratégias semelhantes de sobrevivência.
As mudanças fenotípicas, observadas em microorganismos fotossintéticos,
em resposta a vários estresses levam a um balanço entre a absorção de energia
pelo aparato fotossintético e a demanda dos produtos da fotossíntese, ATP e
71
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
NADPH no metabolismo da célula. Falhas neste processo de adaptação levam a
uma série de reações incontroláveis que podem comprometer a viabilidade das
células, já que a diminuição na disponibilidade de nutrientes freia uma série de
processos metabólicos (Hellingwerf, 2002). A diminuição do metabolismo das células
durante a clorose foi observada pelos espectros dos extratos medidos por RMN. A
comparação do perfil metabólico entre as células verdes e cloróticas revelou no
geral que existe uma acentuada queda nos níveis intracelulares das principais micromoléculas nas células cloróticas.
A existência de mecanismos químicos de autocontrole da densidade
populacional em Microcystis foi investigada. Os resultados dos experimentos
sugerem a presença de fator(es) no meio extracelular, que aparentemente foi
produzido durante a entrada para a fase estacionária. Este(s) fator(es) foi capaz de
induzir uma resposta similar em células de Microcystis crescidas em meio repleto de
nutrientes.
A auto-inibição do crescimento no gênero Microcystis já foi investigado por
alguns autores. Kozitskaya (1980) investigou a capacidade de Microcystis auto-inibir
seu crescimento, ela correlacionou a diminuição da velocidade de crescimento com
o aparecimento de compostos fenólicos no meio de cultura.
A auto-inibição do crescimento também já foi reportado para outros gêneros
de cianobactérias. Já em 1917, Harder observou uma auto-inibição do crescimento
em Nostoc punctiforme. Em Porphydium tenue foi observado que culturas axênicas
desta espécie morriam repentinamente, enquanto culturas originais, contaminadas
por bactérias, permaneciam saudáveis. Deste modo, Murakami e co-autores em
1990 passaram a investigar a capacidade desta espécie em auto-inibir seu
crescimento. As substâncias responsáveis pela inibição foram identificadas como
72
Resultado e discussão
___________________________________________________________________
uma mistura de ácidos graxos insaturados que quando acumulados no meio de
cultura ao longo do cultivo provocavam a morte das células dentro da população.
(Yamada et al., 1994).
Na tentativa de usar esta abordagem para controlar a formação de florações
tóxicas de cianobactérias, nós procuramos por fatores envolvidos na comunicação
intercelular no meio de cultura de Microcystis. Este gênero é geralmente responsável
pelo maior número de relatos de intoxicação em animais e humanos. Neste trabalho
é reportada a existência de um sinal extracelular no meio de cultura de células
cloróticas de Microcystis PCC 7806 que parece coordenar esta resposta na
população; sua adição a culturas saudáveis promove a redução do crescimento da
população e a desorganização do aparato fotossintético das células.
Estudos sobre o ciclo de vida de células de Microcystis na natureza revelam a
manutenção de um estoque de células nos sedimentos de lagos ao longo do outono
e do inverno. Estas células parecem manter um estado de baixa atividade
metabólica e os estudos sugerem que estas formas são um importante inoculo para
a formação de novas florações na próxima estação (Brunberg & Blomqvist, 2003;
Stahl-Delbanco et al., 2003).
73
Conclusões
___________________________________________________________________
5- Conclusões:
5.1 - Caracterização de culturas de Microcystis PCC 7806 em diferentes
estágios de crescimento:
Culturas de Microcystis PCC 7806 quando cultivadas por longos períodos em
meio 2 ASM-1 apresentam a redução dos pigmentos fotossintéticos num processo
denominado de clorose.
Durante a clorose a maior parte das células permanece viável já que a cultura
clorótica é capaz de regenerar quando incubada novamente em meio de cultura
completo e as células permanecem com sua integridade de membrana preservada.
As células cloróticas de Microcystis têm como características a redução no
conteúdo de clorofila a, desarranjo das membranas tilacoidais, acúmulo de
glicogênio e alterações no perfil intracelular de micro-moléculas.
5.2 - Auto-regulação do crescimento em Microcystis PCC 7806:
Quando o meio de cultura (meio condicionado) de células cloróticas de
Microcystis PCC 7806 é adicionado a culturas da mesma cepa, crescidas em meio
repleto de nutrientes, ocorre a inibição do crescimento nas culturas tratadas.
A inibição do crescimento em culturas tratadas com o meio condicionado ocorre
de maneira independente da idade da cultura à qual ele é adicionado.
A maior parte das células tratadas permanece viável já que mantém a integridade
de membrana preservada.
A investigação do mecanismo de inibição revelou que as culturas tratadas
apresentam redução no conteúdo de clorofila a e a desorganização dos tilacóides,
fenótipo semelhante ao encontrado em culturas cloróticas.
74
Conclusões
___________________________________________________________________
O efeito do meio condicionado não é específico para a cepa, mas no mínimo
específico ao gênero, já que outras cepas de Microcystis (UENF Mic1 e UENF Mic2)
foram capazes de responder da mesma maneira a adição do meio e outros gêneros
testados (Synechococcus e Synechocystis) não apresentaram resposta ao
tratamento.
Um extrato ativo foi obtido e as investigações sobre a sua estabilidade mostraram
que o fator responsável pela inibição é resistente a altas temperaturas, ao
congelamento e descongelamento e a solução em solventes, indicando se tratar de
um composto relativamente apolar e de baixo peso molecular.
As etapas iniciais de purificação indicam que provavelmente mais de um fator
seria responsável pela atividade do meio condicionado.
75
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91
Anexos
___________________________________________________________________
7- Anexos:
7.1 - Meio de cultura utilizado:
7.1.1- Meio ASM-1:
Composição do meio de cultura ASM-1*
Reagentes
g/L
_________________________________________________________________________
NaNO3
6,80
MgCl2 . 7 H2O
1,64
MgSO4. 7 H2O
1,96
CaCl2
0,88
K2HPO4
0,87
Na2HPO4 7H2O
1,33
H3BO3
2,48
MnCl2 4 H2O
1,39
FeCl3 6 H2O
1,08
ZnCl2
0,335
CoCl2
0,019
CuCl2
0,0014
EDTA Na2
1,86
________________________________________________________
*pH ajustado para 8,0 com NaOH;
2 ASM-1: dobrar concentração dos reagentes;
ASM-1 sólido: acrescentar 15 g/L de agarose.