INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
Seleção de isolados de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e nematoides
entomopatogênicos para o controle da broca-da-bananeira
Cosmopolites sordidus (Germar) (Coleoptera: Curculionidae)
MARIANA GARCIA MARTINEZ DA SILVA
Dissertação
apresentada
ao
Instituto Biológico, da Agência
Paulista
de
Tecnologia
dos
Agronegócios, para obtenção do
título de Mestre em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental
no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade
Vegetal, Segurança Alimentar e o
Ambiente.
Orientador: Prof.
Batista Filho
São Paulo
2013
Dr.
Antonio
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
Núcleo de Informação e Documentação – IB
Silva, Mariana Garcia Martinez da
Seleção de isolados de Beauveria bassiana (Bals.amo) Vuill. e nematóides
entomopatogênicos para o controle da broca-da-bananeira Cosmopolites sor didus (Germar) (Coleoptera: Curculionidae). / Mariana Garcia Martinez da
Silva. -- São Paulo, 2013.
53 p.
Dissertação (Mestrado). Instituto Biológico (São Paulo). Programa de PósGraduação.
Área de concentração: Sanidade Animal, Segurança Alimentar e o Ambiente.
Linha de pesquisa: Sanidade Vegetal, Segurança Alimentar e o Ambiente no
Agronegócio.
Orientador: Antonio Batista Filho.
Versão do título para o inglês: Selection of strains of Beauveria (Bals.) Vuill. and
Entomopathogenic nematodes for the controlo of banana weevil Cosmopolites sor –
didus (Germar) (Coleoptera: Curculionidae).
1. Controle microbiano 2. Fungos entomopatogênicos 3. Steinermema 4.
Heterorhabditis 5. Bananicultura I. Silva, Mariana Garcia Martinez da II. Batista
Filho, Antonio III. Instituto Biológico (São Paulo). IV. Título
IB/Bibl./2013/002
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO BIOLÓGICO
Pós-Graduação
Av. Cons. Rodrigues Alves 1252
CEP 04014-002 - São Paulo – SP
[email protected]
FOLHA DE APROVAÇÃO
Mariana Garcia Martinez da Silva
Título: Seleção de isolados de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e
nematoides entomopatogênicos para o controle da broca-da-bananeira
Cosmopolites sordidus (Germar) (Coleoptera: Curculionidae)
Orientador: Prof. Dr. Antonio Batista Filho
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico da Agência Paulista de
Tecnologia dos Agronegócios para
obtenção do título de Mestre em
Sanidade, Segurança Alimentar e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade
Vegetal, Segurança Alimentar e o
Ambiente.
Aprovada em:
Banca Examinadora
Assinatura:
Prof. Dr. Antonio Batista Filho
Instituição: Instituto Biológico
Assinatura:
Prof. Dr. Luis Francisco Angeli Alves
Instituição: Unioeste
Assinatura:
Prof. Dr. Italo Delalibera Júnior
Instituição: ESALQ/ USP
“Insanidade: fazer a mesma coisa uma e outra vez e esperar
resultados diferentes.”
Albert Einstein
A Gilvanira que com orgulho conta a todos de sua neta!
E a minha avó Florinda que se estivesse aqui estaria
orgulhosa de mim!
Ofereço
Aos meus pais, Sueli e Weliton pela dedicação e
apoio recebido ao longo da minha vida. Mesmo
distantes sempre se uniram quando o assunto era eu.
Dedico
Agradecimentos
Primeiramente a Deus, por me dar saúde e capacidade para lutar por meus objetivos.
Ao Prof. Dr. Antonio Batista Filho, por proporcionar aprendizado como meu orientador
e confiar em mim como sua orientada. Por seu exemplo como profissional, seus
ensinamentos, sua dedicação e seus fortes abraços de incentivos.
Aos membros da banca examinadora da qualificação e da defesa, Dr. Luis Garrigós
Leite, Dra. Inajá Marchizeli Wenzel, Dr. José Eduardo Marcondes de Almeida, Luis
Francisco Angeli Alves e Italo Delalibera Júnior por suas sugestões e correções
essenciais para melhoria deste trabalho.
Ao Dr. Valmir Antônio Costa, por seu bom humor, sua boa vontade e paciência, pelos
ensinamentos e suas belas e sempre perfeitas fotos dos insetos.
Ao Dr. Luis Garrigós Leite, por toda a paciência e confiança em dedicar seus projetos
para que aprendesse com erros e acertos, pelos conselhos, pela convivência e por
sempre buscar solucionar todas as minhas dúvidas.
Ao Dr. Sergio Ide, por ter aberto às portas do Instituto Biológico e ter me mostrado a
força da pesquisa e desta instituição.
A Dra. Harumi Hojo, por ter acreditado em mim quando ainda era graduanda, por ter me
mostrado as primeiras linhas de como a ciência pode ser aplicada no campo, por
acreditar em minhas ideias e ouvir minhas sugestões. Por ter tido a oportunidade de
conviver diretamente com ela. Sobretudo pela amizade, carinho e por sempre tentar me
ajudar. Por ouvir minhas choradeiras e ter sempre pronto seus conselhos.
Ao Sr. Alberto do Polo Regional de Registro por seu auxilio na coleta dos insetos.
A Dra. Zuleide Alves Ramiro pelo convívio e exemplo único de profissional a ser
seguido.
Aos docentes do Programa de Pós Graduação em Sanidade, Segurança Alimentar e
Ambiental no Agronegócio do Instituto Biológico pelos ensinamentos ministrados.
Ao Instituto Biológico pela oportunidade de desenvolvimento dos estudos.
A Dr. Márcia Maria Rebouças por seu exemplo como profissional e por mostrar o quão
importante é conhecer e fazer parte da história da ciência.
A Capes pela concessão da bolsa.
A FUNDAG e FUNDEPAG pelo apoio financeiro nas despesas do projeto.
Aos companheiros de trabalho e amigos do Laboratório de Controle Biológico: Renata
Marraschi, Aline Almeida, Tatiane Pietrobon, Ana Paula Pinto, Fernanda Polastre,
Daysi Andrade, Lucas Simi, Thiago Fabrin, Roselaine Bueno, Ana Paula Bartels,
Patrícia Ballone, Advaldo Barreto e Thais Pires por toda a ajuda fundamental para a
realização deste trabalho, pela atenção, carinho, e a convivência agradável de todos os
dias. Por aguentarem as minhas lamentações e saudades de casa, por viverem cada
emoção junto comigo! Pelas risadas intermináveis e por todo o bom humor tão raros de
se ter. Por não se importarem com seus jalecos manchados graças aos meus
experimentos, pelas tortuosas idas ao bananal e por terem aprendido que nem sempre
que algo parece estar morto, realmente está! Vocês são muito importantes para mim e
me mostraram que o significado de “equipe de trabalho” se faz real neste laboratório –
Obrigada por tudo!
Aos amigos de Pós Graduação em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no
Agronegócio pelo companheirismo nas disciplinas e momentos de descontração, em
especial a Karen Maciel, Armando Tomomitsu (Toshi), Thaís Garcia, Randy
Narumoto, e Michele Lima.
A Mário Kokubu, Anderson Fujita, Fábio Schmidt, Daysi Andrade e Marilia Marcassi
pela amizade e companhia no alojamento.
A Nayte Vitielo e Daniele Oliveira um agradecimento pela companhia nas viagens para
Campinas, por todas as aventuras, risadas e apoio nos momentos mais tensos. Em
especial à amiga Daniele Oliveira, minha grande companheira no alojamento e nas
intermináveis idas e vindas. Obrigada pelo apoio em todas as noites em que a saudade
de casa batia, por todas as risadas e piadas que fizeram com que o tempo passasse
mais depressa e fosse mais leve a pressão por saber que alguém tão especial dividia
esta sensação comigo! Você é muito importante e sem dúvida se tornou uma grande
amiga!
Mais uma vez a Roselaine Bueno por toda a atenção, preocupação e cuidados de mãe.
Uma pessoa única e especial, exemplo de força para minha vida!
Em especial agradeço a Patrícia Balone, Daysi Andrade, Roselaine Bueno, Daniele
Oliveira, Ana Paula Pinto, Ana Paula Bartells, Thais Pires, Lucas Simi e Aline Almeida por
terem madrugado ou anoitecido comigo no laboratório para montar meus experimentos.
Mais uma vez ao Lucas Simi por sempre pacientemente tirar minhas dúvidas e ajuda com
a estatística e Aline Almeida por toda a ajuda no experimento de produção.
A Dona Ilza por seu bom humor e toda sua colaboração na estada no alojamento.
Finalmente a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a concretização deste
sonho. Muito obrigada por tudo!
Agradecimentos Especiais
Aos meus pais José Weliton da Silva e Sueli Garcia Martinez pela compreensão da
minha ausência, carinho e amor. Por me ensinarem como eu deveria encarar a vida e por
valorizarem sempre o diálogo entre nós! Não seria nada sem vocês! Amo muito os dois!
Ao Richard Campestrini por seu amor, carinho e atenção. Por suas valiosas correções e
por sempre me mostrar que todo texto pode ser melhor escrito. Por ser acima de um
companheiro, um exemplo de caráter, honestidade e força para a minha vida. E por
conversar mais de seis mil minutos no telefone e nunca deixar eu me sentir sozinha! Sem
você seria muito difícil... Te amo muito!
A todos os meus familiares, tios e primos os quais não poderia deixar de agradecer, pois
me deram a base para qualquer projeto de vida, me ensinaram que caráter e família
fazem parte do conjunto para ser feliz. Em especial as minhas primas-irmãs Fernanda
Ribeiro e Andréa Quintais e as minhas tias sempre presentes Marta Garcia e Maria
das Graças da Silva por todo o amor, ajuda e confiança!
Aos colegas de profissão e amigos, Rosana Puñales, Flávia Carvalho, Keila Almeida,
Fábio Mesquita, Flávia Martins por sempre me incentivarem a prosseguir. As amigas
Thais Ferreira, Vanessa Oliveira, Ivie Macedo e Raphaela Guilherme por sempre
acreditarem em mim mesmo torcendo o nariz quando o assunto são os insetos.
A todos muito obrigada por tudo!
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................................... i
ABSTRACT .......................................................................................................................................ii
Lista de Tabelas .............................................................................................................................iii
Lista de Figuras ............................................................................................................................. iv
1.
INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 1
2.
REVISÃO DE LITERATURA................................................................................................. 3
3.
2.1.
Bananicultura ................................................................................................................. 3
2.2.
Pragas e doenças das bananeiras ............................................................................ 3
2.3.
Broca-da-bananeira ...................................................................................................... 5
2.3.1.
Ovos e larvas .......................................................................................................... 5
2.3.2.
Adultos ..................................................................................................................... 6
2.4.
Distribuição ..................................................................................................................... 6
2.5.
Danos................................................................................................................................ 7
2.6.
Formas de Controle ...................................................................................................... 7
2.6.1.
Controle Químico .................................................................................................. 8
2.6.2.
Controle Biológico ................................................................................................ 8
MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................... 11
3.1.
Obtenção e manutenção dos insetos .................................................................... 11
3.2.
Fungos ........................................................................................................................... 12
3.2.1.
Obtenção dos Conídios ..................................................................................... 12
3.2.2. Seleção de isolados de Beauveria bassiana contra adultos de
Cosmopolites sordidus ..................................................................................................... 14
3.2.3.
3.3.
Produção de isolados de Beauveria bassiana em meio sólido .............. 16
Nematoides entomopatogênicos ............................................................................ 17
3.3.1.
Multiplicação dos nematoides entomopatogênicos .................................. 17
3.3.2. Avaliação de isolados de nematoides entomopatogênicos contra
adultos de Cosmopolites sordidus ................................................................................ 18
3.3.3. Concentrações do nematoide entomopatogênico Steinernema
brazilense contra adultos de Cosmopolites sordidus............................................... 20
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 21
4.1. Seleção de Isolados de Beauveria bassiana contra adultos de
Cosmopolites sordidus ......................................................................................................... 21
4.2.
Produção de isolados de Beauveria bassiana em meio sólido ...................... 26
4.3. Avaliação de isolados de nematoides entomopatogênicos contra adultos
de Cosmopolites sordidus .................................................................................................... 28
4.4. Concentrações do nematoide entomopatogênico Steinernema brazilense
contra adultos de Cosmopolites sordidus ....................................................................... 30
5.
CONCLUSÕES...................................................................................................................... 32
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 33
i
RESUMO
MARTINEZ-SILVA, M. G. SELEÇÃO DE ISOLADOS DE BEAUVERIA BASSIANA
(BALS.) VUILL. E NEMATOIDES ENTOMOPATOGENICOS PARA O CONTROLE DA
BROCA DA BANANEIRA COSMOPOLITES SORDIDUS (GERMAR) (COLEOPTERA:
CURCULIONIDAE). São Paulo. 2012. Dissertação (Mestrado em Sanidade Vegetal,
Segurança Alimentar e o Ambiente) Instituto Biológico.
O Brasil é um dos maiores produtores e consumidores de banana no mundo,
entretanto alguns fatores contribuem para a perda de produção e baixos índices de
exportação, entre eles o constante ataque por pragas. Destaca-se como principal inseto
praga da cultura o moleque da bananeira (Cosmopolites sordidus), broca que chega a
gerar até 30% de perda. Atualmente, o controle químico é o mais utilizado, porém como o
consumo da banana é quase na totalidade “in natura”, há uma preocupação quanto ao
efeito destes insumos no meio ambiente e na saúde, tanto do consumidor quanto do
produtor. Medidas alternativas têm sido investigadas e a utilização de agentes de controle
biológico como os fungos e nematoides entomopatogênicos tem se mostrado bastante
promissora. Devido a variabilidade genética destes organismos, torna-se necessária a
seleção de novos isolados mais virulentos. Embora muito promissores, são raros os
trabalhos que utilizam nematoides para o controle de C. sordidus. Diante disso, este
trabalho avaliou o potencial de novos isolados do fungo Beauveria bassiana e de
nematoides dos gêneros Steinernema e Heterorhabditis no controle de C. sordidus. Com
exceção do isolado IBCB 80 de B. bassiana os demais 29 isolados testados foram
patogênicos ao coleóptero C. sordidus. Os isolados IBCB 170, IBCB 182 e IBCB 21 tem
grande potencial no controle de C. sordidus exibindo respectivamente 95, 82 e 82% de
mortalidade confirmada na concentração de 1x108. Os isolados IBCB 247, IBCB 195 e
IBCB 170 apresentaram os melhores resultados de esporulação na produção em arroz
em relação os demais isolados (2,6 x108, 2,5 x108, 2,2 x 108 conídios/ g). Todos os
isolados de nematoides entomopatogênicos testados foram patogênicos para a praga.
IBCB n 24, IBCB n05 e IBCB n06 diferiram da testemunha e apresentam potencial para o
controle de C. sordidus. IBCB n06 mostrou-se mais eficiente na concentração de 2000 JI/
insetos.
Palavras-chave: Controle microbiano;
Heterorhabditis; bananicultura.
fungos
entomopatogênicos;
Steinernema;
ii
ABSTRACT
MARTINEZ-SILVA, M. G. SELECTION OF STRAINS OF BEAUVERIA BASSIANA
(BALS.) VUILL. AND ENTOMOPATHOGENIC NEMATODES FOR THE CONTROL OF
BANANA WEEVIL COSMOPOLITES SORDIDUS (GERMAR) (COLEOPTERA:
CURCULIONIDAE). São Paulo. 2012. Dissertação (Mestrado em Sanidade Vegetal,
Segurança Alimentar e o Ambiente) Instituto Biológico.
Brazil is one of the largest producers and consumers of bananas in the world; however,
certain factors contribute to loss of production and low levels of exports, among them the
constant attack by pests. The most important pest of banana crop is banana weevil
(Cosmopolites sordidus) that can provide up to 30% loss. Currently, chemical control is
the most used borer control tatic, but as the consumption of bananas is almost entirely in
natura, there is concern about the effect of these inputs in the environment and health of
both the consumer and the applicator. Alternative measures have been investigated and
the use of biological control agents such as fungi and entomopathogenic nematodes has
been very promising. Due to genetic variability of these organisms it becomes necessary
to seek a new selection of more virulent isolates. Although very promising, there are few
studies that use nematodes to control C. sordidus. This study tested the potential of new
strains of the fungus Beauveria bassiana and nematode from the genera Steinernema
and Heterorhabditis in controlling C. sordidus. With the exception of strain IBCB 80 the
remaining 29 strains tested were pathogenic to C. sordidus. The IBCB 170, 182 and 21 in
a concentration of 1x108 conidia/ g has great potential in controlling this bettle showing
respectively 95, 82 and 82% mortality confirmed. Strains IBCB 247, IBCB 195 and IBCB
170 showed the best results in the production of sporulation in rice compared to all other
strains (2,6 x108, 2,5 x108, 2,2 x 108 conidia/ g). All strains of entomopathogenic
nematodes tested were good for control. IBCB n24, IBCB n05 and IBCB n06 differed from
the control and show potential for controlling C. sordidus. IBCB n06 was more effective at
a concentration of 2000 JI/ insects.
Key-words: Microbial control; entomopathogenic fungi; Steinernema; Heterorhabditis;
banana crop.
iii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Relação de isolados de Beauveria bassiana utilizados no experimento. ..........13
Tabela 2. Relação de isolados de nematoides entomopatogênicos testados contra
Cosmopolites sordidus.....................................................................................................18
Tabela 3. Mortalidade confirmada de adultos de Cosmopolites sordidus causada por
trinta diferentes isolados do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana em condições
de laboratório (25º ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), dezembro, 2012. ..............22
Tabela 4. Mortalidade confirmada de adultos de Cosmopolites sordidus, em condições de
laboratório, causada por dez diferentes isolados do fungo entomopatogênico Beauveria
bassiana, os quais apresentaram os maiores índices de mortalidade em relação aos 30
isolados avaliados em teste anterior (25º ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h),
dezembro, 2012. ..............................................................................................................24
Tabela 5. Resultado do teste de produção de conídios de dez diferentes isolados de
Beauveria bassiana em arroz parboilizado tipo 1 (25º ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e fotofase de
12h), dezembro, 2012. .....................................................................................................27
Tabela 6. Mortalidade total e confirmada de adultos de Cosmopolites sordidus causada
por diferentes espécies de nematoides entomopatogênicos em condições de laboratório
(25º ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), junho, 2012. ............................................29
iv
Lista de Figuras
Figura 1. A- Recipiente onde foram mantidos os adultos de Cosmopolites sordidus. BPedaços de pseudocaule ofertados como alimento para Cosmopolites sordidus. ...........11
Figura 2. Lâmina de microscopia utilizada para verificar a viabilidade dos conídios. .......14
Figura 3. Esquema representativo do teste para seleção de isolados de Beauveria
bassiana. .........................................................................................................................15
Figura 4. A: Produção sólida em arroz de 10 isolados de Beauveria bassiana; B: Agitação
do material realizada após 7 dias da data de inoculação. ................................................17
Figura 5. A - Inoculação de nematoides entomopatogênicos em larvas de Galleria
mellonella; B - Armadilha de "White" para a retirada de juvenis infectivos de nematoides
entomopatogênicos; C - Liberação de juvenis infectivos em destaque. ...........................18
Figura 6. A - Experimento para avaliação da mortalidade de Cosmopolites sordidus por
nematoides entomopatogênicos. Recipiente plástico, solo, insetos e um pedaço de
pseudocaule como fonte de alimento. B- Câmara climatizada onde o ensaio permaneceu
até a avaliação.................................................................................................................19
Figura 7. Armadilha de “White” para constatação da morte de Cosmopolites sordidus por
nematoides. .....................................................................................................................20
Figura 8. Vista ventral de Cosmopolites sordidus colonizado por Beauveria bassiana. ...21
Figura 9. Vista dorsal e ventral das infecções causadas por 10 diferentes isolados de
Beauveria bassiana em Cosmopolites sordidus sob condições de laboratório (25º ± 1ºC ;
U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), dezembro, 2012.........................................................26
Figura 10. Mortalidade causada por cinco diferentes concentrações no nematoide
Steinernema brasilense testados em condições de laboratório contra adultos de
Cosmopolites sordidus (25 ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), novembro, 2012.
Médias seguidas de mesma letra, não diferem pelo teste de Tukey a 5% (p<0,05).
Valores originais e análise estatística realizada com dados transformados em Log x + 10.
........................................................................................................................................31
1
1. INTRODUÇÃO
A cultura da banana (Musa spp.) tem grande importância para o Brasil, sendo
cultivada por pequenos e médios produtores. Sua fruta é considerada um importante
complemento alimentar e lidera o mercado nacional com 30,6% em volume vendido,
seguida pela laranja com 18,6% e abacaxi 8,5% (SEBRAE/ ESPM, 2008).
No cenário mundial, o Brasil aparece como o quinto maior produtor desta fruta,
atingindo, em 2010, 6,97 milhões de toneladas com uma área plantada superior a 500 mil
hectares (IBGE, 2011), sendo superado pela Índia (31,89 milhões de toneladas), China
(9,84 milhões de toneladas), Filipinas (9,10 milhões de toneladas) e Equador (7,93
milhões de toneladas) (FAO, 2010).
As regiões do Brasil mais representativas para a produção nacional são nordeste
e sudeste (37% e 32%, respectivamente). Somente o Estado de São Paulo produziu, em
2009, mais de 1,2 milhões de toneladas, as quais estão concentradas na região do Vale
do Ribeira, sul do estado, que abriga 7 das 10 cidades com maior produção de bananas
do país (IBGE, 2009a). A região tem como atividades econômicas a agricultura e o
turismo ecológico, sendo a banana o principal produto. Entretanto é considerada uma
localidade pobre, e apresenta um Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) de 0,72959,
sendo um dos menores do estado de São Paulo (0,82025) (PNUD, 2000).
A produção brasileira é praticamente toda destinada ao mercado interno,
exportando apenas 1,8%, enquanto o Equador, por exemplo, exporta em média 65% de
sua produção (IBGE, Levantamento Sistemático da Produção Agrícola, 2009b). Avaliando
a relação área plantada e produção, observa-se que a bananicultura brasileira sofre com
os impactos da baixa tecnificação e modernização, pois sua área plantada perde apenas
para a área da Índia e ainda assim ocupa esta baixa colocação (SILVA NETO &
GUIMARÃES, 2011).
Entre os fatores que afetam a produtividade e a exportação desta cultura estão as
pragas e doenças, que são frequentes e diversificadas, exigindo o uso de medidas de
manejo e controle (BATISTA-FILHO et al., 2002). Dentre as pragas, destaca-se a brocada-bananeira ou moleque-da-bananeira (Cosmopolites sordidus L.), considerado o
principal inseto-praga da cultura. As larvas deste besouro alimentam-se do colmo da
planta construindo galerias em diversas direções, acarretando no amarelecimento das
2
folhas e na produção de cachos pequenos, além de facilitar a entrada de microrganismos
fitopatogênicos a partir de seus danos diretos (GOLD, 2001).
A principal medida para o controle de Cosmopolites sordidus é a utilização de
inseticidas químicos sistêmicos. O uso intensivo de agrotóxicos traz sérias restrições,
pois contamina o meio ambiente e causa danos à saúde humana, além de afetar
organismos não alvo, como insetos benéficos, animais silvestres e de criação (SOUZA &
REIS, 1986). Entretanto, por se tratar de um produto consumido quase na totalidade in
natura e muitas vezes cultivado em regiões de preservação ambiental como o Vale do
Ribeira, métodos com baixo impacto ambiental, como o controle biológico utilizando
agentes entomopatogênicos, são fundamentais para o desenvolvimento desta cultura
(LARA et al., 2000). O agroecossistema da bananicultura, como outras culturas perenes,
oferece ainda condições para manutenção das populações de inimigos naturais e para
preservação de inóculos de fungos entomopatogênicos (NEVES & HIROSE, 2005).
Na tentativa de diminuir a utilização de inseticidas químicos e devido à crescente
demanda por culturas orgânicas, diversos estudos têm sido realizados para comprovar a
eficiência de agentes entomopatogênicos para o controle de C. sordidus, destacando-se
o fungo Beauveria bassiana (BATISTA FILHO et al., 1996b; JORDÃO et al., 1999;
NAKINGA & MOORE, 2000; AKELLO et al., 2008; ALMEIDA et al., 2009) e os
nematoides entomopatogênicos dos gêneros Steinernema e Heterorhabditis (SCHMITT
et al., 1992; ROSALES & SUÁREZ, 1998; SEPÚLVEDA-CANO et al., 2008;
BORTOLUZZI, 2009).
O presente trabalho foi realizado com o objetivo de selecionar em condições de
laboratório, isolados patogênicos do fungo Beauveria bassiana e avaliar nematoides dos
gêneros Steinernema e Heterorhabditis para o controle de C. sordidus.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Bananicultura
Entre as culturas agrícolas mais importantes para as regiões tropicais e
subtropicais do mundo estão as bananeiras (Musa sp.), as quais têm como principal
produto comercial seus frutos, as bananas.
Acredita-se que as bananeiras sejam
originadas da Ásia Tropical, com centros secundários na África e Ilhas do Oceano
Pacífico, sendo resultados dos cruzamentos das espécies selvagens Musa acuminata
(genoma A) e Musa balbisiana (genoma B). As bananeiras são encontradas em todas as
regiões tropicais e subtropicais do globo (BORGES & SOUZA, 2004). No Brasil, é
cultivada em todas as unidades da federação, plantando-se principalmente as cultivares
do grupo Prata (Prata, Pacovan e Prata-Anã), grupo Nanica - subgrupo Cavendish
(Nanica, Nanicão e Grand Naine) e grupo Maçã (Maçã, Mysore e Thap Maeo) (OLIVEIRA
et al., 1999).
Seus frutos são fonte de alimento básico para milhões de pessoas. A banana
possui grande valor nutricional, altamente energético (cerca de 100 kcal por 100g de
polpa), seus carboidratos (aproximadamente 22%) são facilmente assimiláveis, além das
fontes de vitamina A, vitamina C, fibras e potássio (ABAVAR, 2012). Bastante apreciada
em cardápios de diferentes faixas etárias, é considerada alimento adequado para
crianças e idosos. A cultura da banana representa papel estratégico na segurança
alimentar do mundo (SILVA NETO & GUIMARÃES, 2011).
A área de cultivo mundial atinge cerca de 4,8 milhões de hectares, sendo que
84% das bananas produzidas são destinadas ao consumo das populações dos próprios
países e apenas 16% são para exportação (FAO, 2010).
2.2. Pragas e doenças das bananeiras
A alta incidência de pragas e doenças são fatores que corroboram para os baixos
níveis de exportação e altos índices de perda na produção, além do baixo nível
tecnológico existente em algumas áreas (BATISTA FILHO et al., 2002). Na bananicultura
são considerados de maior importância os danos causados respectivamente por
4
doenças, fitonematoides e artrópodes como insetos e ácaros (CORDEIRO et al., 2004;
GOLD et al., 2006).
Sendo afetadas por diferentes grupos de patógenos, tais como fungos, bactérias e
vírus, as plantas doentes somam danos diretos e indiretos na produção de frutos com
qualidade. Dessa forma, é considerado de grande importância o manejo correto e a
capacidade de detecção de sintomas para o sucesso do plantio (LICHTEMBERG &
LICHTEMBERG, 2011). Destacam-se as doenças ocasionadas pela interação entre a
planta, o ambiente e fungos fitopatogênicos como Mycosphaerella musicola Leach, forma
perfeita ou sexuada, ou Pseudocercospora musae (Zimm) Deighton, forma assexuada ou
imperfeita que proporciona a Sigatoka Amarela e Mycosphaerella fijiensis (Morelet) fase
sexuada, ou Paracercospora fijiensis (Morelet) Deighton, fase assexuada) agentes da
Sigatoka Negra e Fusarium oxysporum f.sp. cubens fator do Mal do Panamá. Tais
doenças têm sido controladas com aplicações sucessivas de fungicidas, muitas vezes
realizadas sem critérios, com a utilização de equipamentos e produtos inadequados, o
que pode também favorecer o aumento do potencial de inóculo (NOGUEIRA, 2008;
ROCHA-JÚNIOR, et al., 2010).
Os fitonematoides são um grande problema para a cultura, sua dispersão está
diretamente ligada ao homem, ao uso de mudas contaminadas e deslocamento de
equipamentos contaminados para áreas sadias. Pouco se sabe a cerca dos prejuízos
econômicos gerados por estes organismos para a bananicultura, entretanto é conhecido
que o nível populacional dos nematoides, tipo de solo, susceptibilidade da variedade, e
condições climáticas influenciam no nível de dano econômico (RITZINGER & COSTA,
2004). As principais espécies fitoparasitas de bananeiras são Radopholus similis,
diferentes espécies de Meloidogyne spp., Helicotylenchus spp., Pratylenchus spp. e
Rotylenchulus reniformis (RITZINGER & FANCELLI, 2006; DIAS-ARIEIRA et al., 2010).
Muitos artrópodes são relatados nos bananais, como lepidópteros, coleópteros,
hemípteros, thysanópteros entre outros. Entretanto, em razão dos prejuízos causados à
cultura, poucos são considerados pragas de importância econômica (GOITÍA & CERDA,
1998; FANCELLI, 2004). Dentre os lepidópteros, estão as lagartas desfolhadoras Caligo
spp., Opsiphanes spp., Antichloris spp., e a traça-da-bananeira Opogona sacchari que
penetra no fruto e constrói galerias na polpa (FANCELLI, 2004; SMILANICH & DYER,
2012). Os tripes constituem um importante grupo de pragas para os bananais, sendo as
espécies
mais
recorrentes
Frankliniella
brevicaulis
e
F.
fulvipennis
atacando
principalmente frutos em desenvolvimento e Chaetanaphothrips spp., Caliothrips bicinctus
5
e Tryphactothrips lineatus são responsáveis pela ferrugem nos frutos (MONTEIRO et al.,
2001; FANCELLI, 2004). Dentre os ácaros, os mais importantes são os chamados ácaros
de teias, pertencentes ao gênero Tetranychus, e seu controle acontece principalmente
através do uso de acaricidas, porém o controle biológico pode ser feito utilizando e
preservando ácaros predadores da família Phytoseidae (HASTIE et al., 2010).
Entre os coleópteros, Cosmopolites sordidus tem papel fundamental no manejo,
sendo considerado o principal inseto praga da cultura, por vezes confundido com
Metamasius hemipterus a falsa broca-da-bananeira ou broca-rajada, a qual não
representa papel direto sobre a cultura, todavia, sua multiplicação nos bananais pode
gerar problemas às culturas vizinhas como cana-de-açúcar e coqueiros, onde é
considerada praga (PAULI et al., 2011).
2.3. Broca-da-bananeira
A broca-da-bananeira ou moleque-da-bananeira C. sordidus (Germar, 1824)
(Coleoptera: Curculionidae) é considerada o principal inseto praga da bananicultura, seus
danos podem impedir o estabelecimento da cultura, reduzir a produtividade e contribuir
para a diminuição da vida do plantio (GOLD & MESSIAEN, 2000).
São insetos com um período de vida prolongado e baixa fecundidade, vivendo em
média por um ano, embora possam chegar a quatro anos (MASANZA et al., 2005). Estes
estão presentes em todos os estados produtores, atacando principalmente os cultivares
Prata, Nanica e Nanicão, mas, relatados também em banana maçã e terra (GALLO,
2002).
2.3.1. Ovos e larvas
As fêmeas de C. sordidus possuem uma taxa de oviposição considerada baixa,
existindo registros de um ovo por dia, entretanto, a média é de um ovo por semana, com
uma proporção sexual entre machos e fêmeas de 1:1. Os ovos são brancos de formato
ovalado, colocados individualmente em cavidades feitas pela própria fêmea. Os locais
preferidos para oviposição são as bainhas foliares e superfície do rizoma, sendo
6
ambientes ideais às plantas já florescidas e os restos culturais (GOLD & MESSIAEN,
2000).
As larvas são curculioniformes recurvadas em formato de “c”, ápodas, de cor
branca com um tamanho máximo médio de 1,25 cm (VALLEJO et al., 2007). Passam em
geral por 5-8 ínstares, até a formação da pupa próxima a superfície da planta hospedeira.
As larvas se alimentam preferencialmente do rizoma e eventualmente do pseudocaule. O
ciclo completo de ovo a adulto ocorre em torno de 5 a 7 semanas, sendo a temperatura
um fator importante para as taxas de crescimento (GOLD & MESSIAEN, 2000).
2.3.2. Adultos
Os adultos do moleque-da-bananeira são de cor preta brilhante, medem cerca de
11 mm de comprimento por 4 mm de largura, sua cabeça é pequena e apresenta um
“bico” proeminente característico, apresenta antenas clavadas inseridas na base do início
do bico (VALLEJO et al., 2007).
Os adultos são de vida livre e hábito gregário, sendo encontrados entre as
bainhas foliares, no solo e na base das plantas associados aos restos culturais (GOLD et
al., 2006). Possuem hábitos noturnos, e suas larvas são bastante suscetíveis à
dessecação. C. sordidus habitualmente permanece na mesma área de plantio por longos
períodos, tendo uma baixa taxa de deslocamento, cerca de 25 m em 6 meses, são
capazes de voar, mas raras são as circunstâncias em que isto acontece (GOLD, 2001).
2.4. Distribuição
Acredita-se que C. sordidus evoluiu no sudeste da Ásia coincidindo com a área de
origem das bananeiras, e a partir de lá se espalhou pelo mundo, provavelmente através
de mudas e materiais infestados (GOLD, 2001). O moleque-da-bananeira não é
considerado hoje uma praga importante para a Ásia, entretanto já trouxe grandes
problemas no passado (WATERHOUSE, 1993).
No Brasil esta praga está espalhada por todos os estados produtores. É
considerada praga específica do gênero Musa, ainda que tenha sido relatada sua
7
presença em outras culturas. Não há espécies e variedades de bananeiras
verdadeiramente resistentes a C. sordidus, porém existem diferenças consideráveis
quanto à severidade e susceptibilidade do ataque (PAVIS & LEMAIRE, 1997; KIGGUNDU
et al., 2003).
2.5. Danos
Os danos causados por C. sordidus geram perdas superiores a 40% do cultivo em
bananais comerciais, através de danos diretos e indiretos. As larvas se alimentam do
colmo, construindo galerias em diversas direções, acarretando no amarelecimento das
folhas e a produção de cachos pequenos (NAVA et al., 2006). Seu ataque impede ainda
o surgimento de novas raízes, morte das raízes existentes, limitando a absorção de
nutrientes, gerando atraso na floração, e aumento da susceptibilidade a fitopatógenos
(OLIVEIRA et al., 1999; GOLD & MESSIAEN, 2000).
Os adultos de C. sordidus são atraídos por substâncias voláteis da própria planta
hospedeira, assim o corte de rizomas, prática comum em bananais, exerce atração
especial, o que torna difícil estabelecer novos plantios em áreas já infestadas. Em
cultivos de primeiro ciclo os índices de infestação são baixos, e aumentam fortemente a
partir do terceiro ciclo (GOLD, 2001).
2.6. Formas de Controle
Uma vez que a principal forma de dispersão desta praga é através de mudas
infestadas, principalmente por indivíduos em estágio de desenvolvimento, a primeira
estratégia de controle é a seleção de mudas sadias e a escolha por áreas com ausência
ou baixos níveis de infestação da praga. Mais recentemente, a utilização de mudas
micropropagadas tem sido intensificada, pois possuem a vantagem de estarem sadias
tanto em nível de pragas como doenças (LISEI-DE-SÁ & BRAGA, 2002; NOMURA et al.,
2008;).
Eliminar áreas de refúgio, manter o bananal limpo e livre de restos culturais são
medidas consideráveis para a diminuição do número de adultos no campo, que podem
ser intensificadas pela utilização de iscas atrativas que detenham os adultos (BORGES &
8
SOUZA, 2004). Estas podem ser feitas com feromônios sintéticos comercializados ou
simplesmente por pedaços de pseudocaules de bananeiras que já produziram, entretanto
é um atividade custosa no que tange a mão-de-obra e tempo para sua execução
(BATISTA-FILHO et al., 1990; TINZAARA et al., 2005).
2.6.1. Controle Químico
A principal forma de controle de C. sordidus em plantações comerciais é o uso de
inseticidas químicos (BORGES & SOUZA, 2004). Atualmente, os produtos mais utilizados
pertencem ao grupo dos organofosforados e carbamatos, em especial o composto
carbofurano, menos persistente que outros inseticidas utilizados no passado; no entanto,
é considerado caro e tóxico para o aplicador (MARTÍNEZ & ROSALES, 1993). Tem ação
inseticida e nematicida, com efeito sistêmico. Embora apresente eficiência, já existem
evidências de resistência de C. sordidus a tais produtos (COLLINS et al., 1991). Segundo
o Insecticide Resistance Action Committee (IRAC) (2013) com base em publicações
científicas de referência internacional, são conhecidas resistências de C. sordidus para
quatro diferentes ingredientes ativos (aldrin, dieldrin, HCH-gamma, heptachlor), com
registro em 18 localidades no Brasil.
Diante das evidências negativas do uso dos inseticidas, surgem alternativas como
os compostos botânicos que têm sido pesquisados como uma alternativa de controle
para C. sordidus. Trabalhos mostram que tratamentos com imersão de mudas em
soluções de extratos de sementes de Neem (Azadirachta indica) protege a planta contra
ataques, repelindo os adultos, o que diminui a oviposição e consequentemente o
crescimento populacional (MUSABYIMANA et al., 2001; GOLD & MESSIAEN, 2000).
2.6.2. Controle Biológico
Nas diversas regiões onde C. sordidus é considerado uma praga importante, ele é
tido como um inseto exótico, sugerindo que estratégias de controle biológico clássico
possam ser utilizadas (HASYIM & SYAFRILD, 2009).
Waterhouse & Norris (1987) descreveram o besouro Plaesius javanus como um
inimigo natural da broca-da-bananeira, cujas larvas e adultos são fortes predadores.
9
Entretanto, as tentativas de introdução de P. javanus e outros inimigos naturais
fracassaram na América Latina e África (GOLD, 2001).
Fungos entomopatogênicos exibem os melhores resultados no controle da brocada-bananeira, especialmente Beauveria bassiana que vem sendo estudado contra esta
praga desde a década de 1970 (GOLD & MESSIAEN, 2000). Os resultados utilizando
este patógeno são favoráveis e evoluíram nas últimas décadas, alcançando controles
superiores a 80% para diferentes pragas. (BATISTA-FILHO et al., 1996c; ALMEIDA et al.,
2009; NAKINGA & MOORE, 2000). Diversas pesquisas investiram em técnicas que
otimizam a aplicação e a produção de conídios de B. bassiana em larga escala (AKELLO
et al., 2007; LÓPEZ et al., 2010; MICHEREFF-FILHO et al., 2009).
B. bassiana é capaz de atingir um grande número de espécies de insetos em
praticamente todos os estágios de desenvolvimento (ovos, larvas, pupas e adultos),
contaminando-os através de contato, ingestão ou penetração. Este patógeno possui
grande variabilidade genética o que implica em estudos de seleção de cepas ou isolados
e avaliação dos mais virulentos para um controle eficiente para diferentes pragas
(ALMEIDA & MACHADO, 2006). Assim como outros fungos entomopatogênicos, B.
bassiana é altamente especializado, e pode proporcionar a morte do inseto alvo ou ainda
atingir as gerações seguintes, diminuindo a oviposição, a viabilidade de ovos ou
aumentando a sensibilidade da população a outros agentes biológicos e químicos
(ALVES, 2008).
Para que o uso de B. bassiana seja eficiente no controle de pragas, é importante
que os isolados sejam estudados e sua diversidade genética compreendida (FERRI,
2010). Para tal, a seleção de isolados é ferramenta importante e serve de base para
pesquisas aplicadas, que utilizem estes fungos em estratégias de controle biológico. B.
bassiana tem sido alvo de numerosos estudos de seleção de isolados para a praga em
questão, a broca-da-bananeira, buscando características importantes como produção e
virulência (BATISTA FILHO et al., 1996c; NEVES & ALVES, 2000; NEVES & HIROSE,
2005; YE et al., 2006; RODH et al., 2006;). É importante enfatizar ainda, que a seleção
de isolados é fator determinante no processo de registro e patente de produtos que
possam utilizar B. bassiana. (MICHEREFF FILHO et al., 2009)
Segundo Treverrow & Bedding (1993) o controle de C. sordidus utilizando
nematoides entomopatogênicos (NEPs) é relatado como uma alternativa técnica e
economicamente viável. Trabalhos mostraram que diferentes espécies de NEPs
apresentam mortalidade significativa e podem ser aliados no controle desta praga
10
(SEPÚLVEDA-CANO et al., 2008; PADILLA-CUBAS et al., 2010; MWAITULO et al.,
2011). No Brasil, raros são os trabalhos utilizando nematoides entomopatogênicos para o
controle do moleque-da-bananeira, necessitando de pesquisas e investimentos na área
(SCHMITT et al., 1992; BORTOLUZZI, 2009).
Existem dois gêneros de nematoides considerados os mais importantes como
biocontroladores: Steinernema e Heterorhabditis. Os nematoides entomopatogênicos
vêm sendo utilizados com sucesso para o controle de diversas pragas, especialmente as
de solo (BATISTA FILHO, 1996a; GIOMETTI et al., 2011; LEITE et al., 2006). Os
esteinernematídeos e heterorhabditídeos já são produzidos comercialmente e largamente
utilizados tanto nas pragas de importância agrícola como veterinária e urbana. Algumas
razões podem ser atribuídas ao crescente interesse por estes organismos, entre elas a
possibilidade de criação massal, a compatibilidade com diversos defensivos químicos,
sua especificidade para insetos, o comportamento de busca pelo hospedeiro, a
persistência no ambiente, e a ausência de toxicidade para seres humanos, entre outras
(LEITE et al., 2006).
Giometti
et
al.
(2011),
demonstraram
a
eficiência
de
nematoides
entomopatogênicos quando aplicados no controle do bicudo-da-cana (Sphenophorus
levis), este inseto também pertencente a família Curculionidae e que possui hábitos
bastante semelhantes a C. sordidus.
11
3. MATERIAL E MÉTODOS
Os ensaios foram desenvolvidos no Laboratório de Controle Biológico, situado no
Centro Experimental Central do Instituto Biológico, sediado em Campinas – SP.
3.1. Obtenção e manutenção dos insetos
Os adultos de Cosmopolites sordidus, foram capturados com o auxílio de
armadilhas do tipo “telha” confeccionadas a partir de pseudocaules de bananeiras que já
produziram frutos, cortando-se longitudinalmente e deixando a parte cortada voltada para
o solo ao lado da touceira, em plantações comerciais de banana localizadas na região do
Vale do Ribeira, São Paulo.
Ao chegarem ao laboratório foram colocados em recipientes plásticos com tampas
vasadas para aeração e alimentados com pedaços de pseudocaule de bananeiras
provenientes de plantação na própria instituição (Figura 1). Os besouros foram mantidos
em sala climatizada (25 ±1°C e fotofase de 14 horas) por um período máximo de 15 dias
até a realização dos testes.
Figura 1. A- Recipiente onde foram mantidos os adultos de Cosmopolites sordidus. B- Pedaços de
pseudocaule ofertados como alimento para Cosmopolites sordidus.
12
3.2. Fungos
3.2.1. Obtenção dos Conídios
Foram utilizados isolados de Beauveria bassiana pertencentes à Coleção de
Fungos Entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu” do Laboratório de Controle
Biológico do Centro Experimental Central do Instituto Biológico, localizado em Campinas,
SP e credenciada como fiel depositária pelo IBAMA. Estes isolados (Tabela 1) são
mantidos armazenados em “freezer” a -4°C, sob a forma de conídios puros,
acondicionados em microtubos e em tubos de cultura com óleo mineral.
A seleção foi dividida em duas etapas, a fase de screening onde primeiramente
foram testados os 30 isolados mais a testemunha, divididos em 3 blocos de 10 isolados.
Na segunda fase foram testados os 10 isolados que presentaram melhor mortalidade.
Os isolados foram escolhidos avaliando características como hospedeiros e
localidade, buscando um espectro amplo de acordo com a disponibilidade do banco, e
produzidos a partir de repicagem em três pontos em placas de Petri (9 cm de diâmetro),
contendo meio autoclavado de batata-dextrose-ágar (BDA). As placas foram incubadas
em câmara de germinação do tipo BOD (25 ± 1ºC e fotofase de 12 horas), e após 14 dias
foram utilizadas no preparo das suspensões. As placas cultivadas foram raspadas com o
auxílio de uma espátula, e o material obtido foi adicionado em um tubo de ensaio
contendo 10 mL de água destilada e agente tensoativo (Tween 80) a 0,01%. As
suspensões foram diluídas e quantificadas em câmara de Neubauer, com o auxílio do
microscópio óptico e aumento de 400x.
13
Tabela 1. Relação de isolados de Beauveria bassiana utilizados no experimento.
Isolado
Origem
Localidade da coleta
IBCB 07
Sem registro
Sem registro
IBCB 18
Hypothenemus hampei
Tapiratiba (SP)
IBCB 21
Solo
Cascavel (PR)
IBCB 31
Nezara viridula
Piracicaba (SP)
IBCB 34
Solo
Cascavel (PR)
IBCB 35
Cosmopolites sordidus
Cruz das Almas (BA)
IBCB 66
H. hampei
São José do Rio Pardo (SP)
IBCB 67
Sem registro
Sem registro
IBCB 80
H. hampei
Caconde (SP)
IBCB 81
Solo
Cascavel (PR)
IBCB 82
C. sordidus
Goiânia (GO)
IBCB 102
Solo
Cosmópolis (SP)
IBCB 161
Solo
Guaraniaçú (PR)
IBCB 164
Solo
Guaraniaçú (PR)
IBCB 170
Solo
Iracemápolis (SP)
IBCB 175
Solo
Cascavel (PR)
IBCB 182
Solo
Cascavel (PR)
IBCB 195
Solo
Cascavel (PR)
IBCB 204
Solo
Pouso Redondo (SC)
IBCB 213
Solo
Ribeirão Preto (SP)
IBCB 239
H. hampei
Campinas (SP)
IBCB 240
H. hampei
Campinas (SP)
IBCB 241
Oryzophagus oryzae
Pindamonhangaba (SP)
IBCB 246
H. hampei
Taubaté (SP)
IBCB 247
H. hampei
Taubaté (SP)
IBCB 254
Solo
IBCB 258
H. hampei
Fazenda São José, Manuel
Oliveira (SP)
Taubaté (SP)
IBCB 264
Solo
Ribeirão Preto (SP)
IBCB 272
Solo
Ribeirão Preto (SP)
IBCB 276
Solo
Ribeirão Preto (SP)
Antes da imersão, foi determinada a viabilidade dos conídios da suspensão,
concentrada em 1x108, através da técnica de microcultivo e exame direto em lâminas de
microscopia esterilizadas previamente e marcadas com três círculos na face inferior,
recobertas com uma fina camada de BDA (Figura 2). Sobre o meio de cultura foi
inoculado, em cada círculo, 0,1 mL da suspensão fúngica obtida de colônias crescidas
14
em BDA. As lâminas, acondicionadas individualmente em placas plásticas de Petri
estéreis (90 x 15 mm), com algodão umedecido, foram incubadas a 25 ± 1°C, durante
18h. Após este período, foi feita a observação de 150 conídios em cada área da lâmina,
utilizando-se microscópio com aumento de 400x. Foram contados conídios germinados e
não germinados, estabelecendo-se a porcentagem de germinação. Cada lâmina
corresponde a uma repetição, confeccionando-se três lâminas conforme metodologia
adaptada de MARQUES et al. (2004). Para aplicação nos insetos foram utilizadas apenas
as suspensões que apresentaram viabilidade acima de 90%.
Figura 2. Lâmina de microscopia utilizada para verificar a viabilidade dos conídios.
3.2.2. Seleção de isolados de Beauveria bassiana contra adultos de
Cosmopolites sordidus
As suspensões preparadas conforme o Item 3.2.1 foram inoculadas nos insetos
utilizando o método de imersão. Foram colocados 50 insetos, durante 1 minuto, em 30
mL da suspensão na concentração 1x108 conídios/ mL, já estimada previamente como a
CL50 para C. sordidus, utilizando o isolado IBCB 66 como isolado padrão (ALMEIDA et
al., 2009). Durante este tempo, foram realizados movimentos circulares do recipiente
onde os besouros estavam imersos, para homogeinizar a suspensão (Figura 3).
15
Figura 3. Esquema representativo do teste para seleção de isolados de Beauveria bassiana.
Após a imersão, os insetos foram colocados, individualmente, em placas de
acrílico com tampa (6 cm de diâmetro x 2 cm de altura) e mantidos em câmara
climatizada (25 ± 1ºC; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12 horas). As avaliações foram
realizadas com 7 e 14 dias contando o número de insetos mortos e vivos. Os insetos
foram colocados em câmara úmida para estimular a esporulação do fungo e constatar se
a morte ocorreu devido ao patógeno em questão. Como testemunha foi utilizado o
mesmo volume do tratamento de água destilada mais Tween 80 a 0,01%
Na fase de screening os tratamentos foram agrupados em 5 repetições com 10
insetos cada, foram consideradas apenas as mortalidades confirmadas e avaliados os
percentuais comparando-se a testemunha.
Os dez isolados que apresentaram maiores índices percentuais de mortalidade
desta seleção, foram testados novamente a fim de confirmar seu potencial no controle de
C. sordidus, seguindo a mesma metodologia.
16
Os isolados desta segunda fase receberam tratamento estatístico, foi considerado
apenas as mortalidades confirmadas e aplicado o teste Tukey (P ≤ 0,05) sem
transformação de dados, e agrupados em 5 repetições com 10 insetos cada, sendo
comparadas sempre à testemunha, utilizando o software SAS 9.0 (Enterprise Guide,
2006).
3.2.3. Produção de isolados de Beauveria bassiana em meio sólido
Foram avaliados no aspecto produção de conídios, os dez isolados que
apresentaram melhores resultados de mortalidade nos testes de seleção. Como meio de
cultura para o crescimento e esporulação de B. bassiana foi utilizado arroz parboilizado
tipo 1, sendo atualmente este o substrato sólido mais utilizado por biofábricas, que visem
produção comercial de fungos entomopatogênicos. Isto ocorre, entre outros fatores,
devido ao equilíbrio nutricional disponível para o fungo, custo, ampla disponibilidade
mundial, capacidade de hidratação e preservação de características estruturais após a
colonização pelo fungo (JENKINS et al., 1998).
O arroz foi recoberto com água por 30 minutos, e esta água reposta sempre que o
volume baixava visivelmente. Após este processo de umidificação, o arroz foi pesado e
colocado em sacos autoclaváveis, que foram fechados utilizando grampos metálicos para
papel. Foram então autoclavados durante 20 minutos à temperatura de 121 °C e
resfriados em seguida.
Para a inoculação foram feitas as suspensões dos isolados conforme a
metodologia do item 3.2.1. Foram consideradas 5 repetições por isolado, sendo cada
repetição composta de um saco com 300g de arroz (pesados antes da autoclavagem).
Os sacos foram individualmente inoculados com 5 mL da suspensão fúngica, na
concentração de 1 x 108 com/ mL utilizando-se seringas farmacêuticas. O orifício
realizado pela perfuração foi tampado com o uso de fita adesiva. Os sacos foram
identificados, agitados e mantidos em sala climatizada (25 °C, 70% U.R. e fotoperíodo de
12 horas) (Figura 4A). Após sete dias da inoculação, os sacos foram agitados e, após 14
dias fez-se a avaliação da produção (Figura 4B).
17
Figura 4. A: Produção sólida em arroz de 10 isolados de Beauveria bassiana; B: Agitação do
material realizada após 7 dias da data de inoculação.
Para tal, foi retirada uma amostra de 1 g de arroz com fungo de cada saco,
totalizando 5 amostras, adicionando-se a ela 10 mL de água estéril mais Tween 80 a
0,01%, e agitados para a preparação de uma suspensão de conídios. As suspensões
foram diluídas e quantificadas em câmara de Neubauer sob microscópio óptico de luz no
aumento de 400x e realizados os cálculos para a conversão da concentração em
conídios/ grama.
Os dados de produção foram submetidos à analise de variância comparando-se
as médias pelo teste de Tukey (P<0,05), com dados transformados em Log de x + 10.
3.3. Nematoides entomopatogênicos
3.3.1. Multiplicação dos nematoides entomopatogênicos
Os nematoides foram obtidos a partir de produção in vivo, usando-se larvas de
Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae), mais conhecidas como “traça dos favos”, do
3o ao 5o ínstar. Esses insetos foram mantidos em dieta artificial à base de soja e cera de
abelha, à temperatura de 32º C, umidade relativa ambiente e fotoperíodo de 12 horas
segundo metodologia citada por Cruz (1988).
As larvas de G. mellonella foram colocadas em placas de Petri (8,5 cm de
diâmetro x 1,5 cm de altura) (5 por placa) sobre papel de filtro onde foi aplicado 1,5 mL
de suspensão aquosa contendo o isolado dos nematoides para que estes se
multiplicassem no corpo do inseto. As placas foram vedadas e mantidas em câmara
climatizada do tipo B.O.D. (25º ± 1ºC e fotofase de 12 horas) até a constatação da morte.
18
As lagartas foram então transferidas para armadilhas de “White” (GLAZER & LEWIS,
2000), constituída de placa de Petri com uma lâmina de água e disco de papel filtro
úmido para a retirada dos juvenis infectivos (JI) (Figura 5).
Figura 5. A - Inoculação de nematoides entomopatogênicos em larvas de Galleria mellonella; B Armadilha de "White" para a retirada de juvenis infectivos de nematoides entomopatogênicos; C Liberação de juvenis infectivos em destaque.
3.3.2. Avaliação de isolados de nematoides entomopatogênicos contra
adultos de Cosmopolites sordidus
Foram avaliados cinco diferentes espécies de nematoides dos gêneros
Steinernema e Heterorhabditis correpondentes a cinco isolados provenientes de diversos
hospedeiros e diferentes regiões geográficas, pertencentes à Coleção de Nematoides
Entomopatogênicos do Instituto Biológico (Tabela 2).
Tabela 2. Relação de isolados de nematoides entomopatogênicos testados contra Cosmopolites
sordidus.
Isolado
Nematoide
Origem
Localidade da coleta
IBCB n01
Steinernema glaseri
Migdolus sp.
Araras (SP)
IBCB n02
Steinernema carpocapsae
Solo
Flórida (EUA)
IBCB n05
Heterorhabditis indica
Solo
Itapetininga (SP)
IBCB n06
Steinernema brazilense
Solo
Porto Murtinho (MG)
IBCB n24
Heterorhabditis amazonensis
Sphenophrus levis
Piracicaba (SP)
19
Foram consideradas 5 repetições por tratamento, sendo cada repetição
representada por 10 insetos agrupados em um pote plástico (9 cm de diâmetro x 5 cm de
altura) contendo um pedaço de pseudocaule de bananeira entre 200 g de areia (10% de
umidade), totalizando 50 insetos por tratamento (Figura 6A). Os isolados foram aplicados
em suspensão aquosa, com o auxílio de uma pipeta, na dosagem de 500 JI/ inseto sobre
a areia, como concentração discriminatória. Os potes foram mantidos em sala climatizada
tipo fitotrom (25 ± 1ºC; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12 horas) (Figura 6B). As avaliações
foram realizadas 12 dias após a aplicação, contando-se o número de insetos vivos e
mortos.
Figura 6. A - Experimento para avaliação da mortalidade de Cosmopolites sordidus por
nematoides entomopatogênicos. Recipiente plástico, solo, insetos e um pedaço de pseudocaule
como fonte de alimento. B- Câmara climatizada onde o ensaio permaneceu até a avaliação
Os insetos mortos foram transferidos para armadilhas de “White” para confirmar a
infecção pelos nematoides, utilizando-se como parâmetro a emergência de juvenis
infectivos (Figura 7).
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05), com dados transformados em Log de x + 10,
utilizando o software SAS 9.0 (Enterprise Guide, 2006).
20
Figura 7. Armadilha de “White” para constatação da morte de Cosmopolites sordidus por
nematoides.
3.3.3. Concentrações
do
nematoide
entomopatogênico
Steinernema
brazilense contra adultos de Cosmopolites sordidus
Foram testadas cinco diferentes concentrações do nematoide Steinernema
brazilense (isolado IBCB n06) sendo: 250 JI/ inseto, 500 JI/ inseto, 1000 JI/ inseto, 2000
JI/ inseto e 4000 JI/ inseto, com o objetivo de avaliar qual seria a mais adequada para
aplicação visando controle de Cosmopolites sordidus. O ensaio foi realizado seguindo a
mesma metodologia descrita no item 3.3.2.
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Tukey (P ≤ 0,05), sem transformação de dados, utilizando o
software SAS 9.0 (Enterprise Guide, 2006).
21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Seleção
de
Isolados
de
Beauveria
bassiana
contra
adultos
de
Cosmopolites sordidus
Observaram-se diferenças na esporulação nos insetos, tendo alguns deles
pequenos sinais do fungo na região das articulações das pernas e membranas
intersegmentares, enquanto outros insetos tinham o corpo quase ou completamente
coberto pela esporulação. Ambos os sinais foram considerados para confirmar a infecção
causada por Beauveria bassiana (Figura 8).
Figura 8. Vista ventral de Cosmopolites sordidus colonizado por Beauveria bassiana.
Na fase de screening os isolados de B. bassiana apresentaram taxas de
mortalidade que variaram de 10 a 76%, sendo que apenas o isolado IBCB 80 não se
mostrou patogênico (Tabela 3).
22
Tabela 3. Mortalidade confirmada de adultos de Cosmopolites sordidus causada por trinta
diferentes isolados do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana em condições de laboratório
(25º ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), dezembro, 2012.
Tratamento
Mortalidade Confirmada
Erro Padrão
da Média (±)
IBCB 175
IBCB 195
IBCB 21
IBCB 240
IBCB 170
IBCB 182
IBCB 67
IBCB 247
IBCB 34
IBCB 272
IBCB 164
IBCB 81
IBCB 213
IBCB 204
IBCB 264
IBCB 161
IBCB 102
IBCB 35
IBCB 241
IBCB 239
IBCB 246
IBCB 276
IBCB 66
IBCB 18
IBCB 07
IBCB 82
IBCB 258
IBCB 254
IBCB 31
IBCB 80
76 %
74 %
70 %
68 %
68 %
66 %
66 %
64 %
64 %
62 %
60 %
54 %
Abc
52 %
50 %
50 %
48 %
46 %
44 %
44 %
40 %
40 %
40 %
40 %
38 %
38 %
36 %
35 %
34 %
10 %
0%
3,58
7,27
8
3,35
7,69
4,56
6,07
4,56
7,8
3,35
7,69
7,8
5,93
4,90
6,32
6,57
6,07
6,07
7,27
4,9
6,93
6,93
6,32
4,38
5,22
4,56
7,27
4,56
4,9
0
0%
0
TESTEMUNHA
Três isolados (IBCB 175, IBCB 195 e IBCB 21) destacaram-se com valores
absolutos de mortalidade confirmada superiores a 70%. Os isolados IBCB 82 (36%),
IBCB 258 (35%), IBCB 254 (34%), IBCB 31 (10%) e IBCB 80 (0%) apresentaram os
valores de mortalidade confirmada mais baixos dentre os isolados testados.
Onze isolados apresentaram valores maiores que 60% de mortalidade
confirmada, sendo estes IBCB 164 (60%), IBCB 272 (62%), IBCB 34 (64%), IBCB 247
(64%), IBCB 67 (66%), IBCB 182 (66%), IBCB 170 (68%), IBCB 240 (68%), IBCB 21
23
(70%), IBCB 195 (74%) e IBCB 175 (76%). Carballo (2001) enfatizou que isolados com
níveis entre 61 e 95% são promissores para o manejo da praga, atingindo assim taxas de
controle semelhantes ou por vezes melhores do que de inseticidas químicos.
O isolado IBCB 66 já foi considerado, em diversos estudos para o controle de C.
sordidus, como um dos melhores isolados (BATISTA FILHO et al., 1990; BATISTA FILHO
et al., 1995; BATISTA FILHO et al., 1996d). No presente trabalho, apresentou 30% de
mortalidade confirmada e assemelhou-se ao resultado obtido por Almeida et al. (2009)
que ao usar a concentração de 1x108 observaram uma mortalidade de 40%. Prestes
(2005) utilizando a concentração de 2 x108 também obteve um baixo índice de
mortalidade para este isolado, alcançando 20% de mortalidade com 20 dias de avaliação.
O Isolado IBCB 18 apresentou 38% de mortalidade, resultado próximo ao
observado por Almeida et al. (2009) que foi de 42% e inferior em 10% ao registrado por
Batista Filho et al. (1991).
Vários fatores podem influênciar índices de mortalidade, tais como a dose, a
origem (hospedeiro ou solo), localidade e, principalmente, variabilidade genética do
entomopatógeno, além de fatores abióticos como temperatura, umidade e radiação, os
quais podem ser controlados em laboratório (ALVES, 1992). Entre os 10 isolados que
apresentaram os maiores percentuais de mortalidade a origem do isolado variou, tendo
sido encontrados em solo e em adultos de Hypothenemus hampei. Destaca-se que os
isolados provenientes de outros adultos de C. sordidus não apresentaram altos índices
de mortalidade, sugerindo que a fonte dos isolados de B. bassiana não garante relação
com a virulência. O mesmo foi visto por Takada (2002) para Metarhizium anisopliae e B.
bassiana contra Oryzophagus oryzae, segundo o qual os melhores isolados testados
foram oriundos de solo e não de insetos, mesmo testando isolados obtidos do mesmo
inseto praga.
Com uma mortalidade confirmada mínima de 60%, foram escolhidos os 10
isolados com os maiores percentuais de mortalidade confirmada e testados novamente
(Tabela 4).
24
Tabela 4. Mortalidade confirmada de adultos de Cosmopolites sordidus, em condições de
laboratório, causada por dez diferentes isolados do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana,
os quais apresentaram os maiores índices de mortalidade em relação aos 30 isolados avaliados
em teste anterior (25º ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), dezembro, 2012.
IBCB 170
Mortalidade
Confirmada (%)
94 a
Erro Padrão
(±)
2,45
IBCB 182
82 ab
5,83
IBCB 21
82 ab
2,45
IBCB 247
72 ab
8,37
IBCB 164
70 ab
7,35
IBCB 175
68 ab
8,60
IBCB 67
66 b
3,16
IBCB 195
62 b
2,45
IBCB 34
60 b
5,83
IBCB 240
56 b
5,83
TESTEMUNHA
0c
0,00
C.V. (%):
18,86
Tratamento
Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem pelo teste de Tukey a 5% (p<0,05).
*Significativo a 5% de probabilidade
Nesta segunda etapa todos os isolados diferiram estatisticamente da testemunha
apresentando mortalidade confirmada entre 56 e 94%. O isolado com maior valor
absoluto de mortalidade foi IBCB 170 atingindo 94% de mortalidade e diferindo
estatísticamente dos isolados IBCB 67 (66%), IBCB 195 (62%), IBCB 34 (60%), IBCB 240
(56%). Os demais isolados não diferiram entre si.
Em relação ao teste anterior, o melhor isolado havia sido IBCB 175 com 76% de
mortalidade confirmada. Entretanto, o mesmo apresentou 68% de mortalidade no
segundo teste. Por outro lado, o isolado IBCB 170 passou de 68% para 94%. Em geral os
isolados não mantiveram os valores exatos de mortalidade, apenas o isolado IBCB 67
exibiu o mesmo percentual em ambos os testes. Tal variação pode ter sido influenciada
pela sucetibilidade dos hospedeiros, uma vez que, embora pertencentes a mesma
espécie e localidade, pode ocorrer variação da defesa individual. Díaz et al. (2006)
ressaltaram que a eficiência de fungos entomopatogênicos tem influência da relação
25
patógeno-hospedeiro, sendo ambos organismos ativos que exibem pressões de seleção
e podem favorecer ou não um determinado isolado.
Os isolados repetiram um bom crescimento no corpo dos insetos, exibindo
variação de acordo com o isolado, como alterações na cor dos micélios e no volume de
esporos liberados. Tais variações foram constatadas visualmente durante a verificação
das mortalidades (Figura 9).
Os resultados aqui obtidos vão ao encontro do que foi discutido por Neves &
Hirose (2005), os quais demonstraram a importância de se realizar seleções de isolados,
afim de buscar qualidades desejaveis, como produção e virulência.
26
.
Figura 9. Vista dorsal e ventral das infecções causadas por 10 diferentes isolados de Beauveria
bassiana em Cosmopolites sordidus sob condições de laboratório (25º ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e
fotofase de 12h), dezembro, 2012.
4.2. Produção de isolados de Beauveria bassiana em meio sólido
Os 10 isolados testados na produção de fungos apresentaram colonização do
arroz, com esporulação que variou entre 0,68 x108 e 2,65 x108 conídios/ g de arroz. A
viabilidade dos isolados testados foi superior a 95% em todos os casos.
27
Os isolados IBCB 247 com 2,65 x 108 e IBCB 195 2,53 x 108 conídios/ g, diferiram
apenas do isolado IBCB 240 com 0,68 x 108 conídios/ g. Os demais isolados não
diferiram entre si (Tabela 5). Valores próximos a estes foram observados por Fanti (2011)
com 2,3 e 2,6 x108 conídios/ g de arroz em isolados de B. bassiana.
Tabela 5. Resultado do teste de produção de conídios de dez diferentes isolados de Beauveria
bassiana em arroz parboilizado tipo 1 (25º ± 1ºC ; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), dezembro,
2012.
Isolado
Esporulação
(Conídios/ grama)
IBCB 247
2,65 x 10 a
IBCB 195
2,53 x 10 a
IBCB 170
2,25 x 10 ab
IBCB 175
1,99 x 10 ab
IBCB 164
1,75 x 10 ab
IBCB 34
1,75 x 10 ab
IBCB 182
1,59 x 10 ab
IBCB 21
1,35 x 10 ab
IBCB 67
1,18 x 10 ab
IBCB 240
0,68 x 10 b
Teste F:
C.V. (%):
2,62
3,56
Erro Padrão
(±)
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
0,31
0,63
0,25
0,61
0,26
0,24
0,09
0,28
0,19
0,06
Considerando-se que todos os isolados tiveram as mesmas condições de
crescimento como tipo de substrato, temperatura e luminosidade, os resultados exibem
as características de cada isolado. Assim os isolados IBCB 247, IBCB 195 e IBCB 170
apresentaram boa esporulação (2,65 x 108, 2,53 x 108, 2,25 x 108 conídios/ g
respectivamente), números estes superiores aos utilizados nas fases de deleção deste
trabalho. Tal observação é corroborada por Zappelini et al. (2006) que obtiveram
3,03x109 conídios/ g do isolado IBCB 66 utilizando método bifásico.
28
O isolado IBCB 21 neste trabalho apresentou uma esporulação de 1,35 x108
conídios/ g valor superior ao visto por Barci et al. (2009) que foi menor que 108, fator que
pode ter sido influenciado por diferenças na qualidade e composição do substrato ou
variações climaticas.
Ottati-de-Lima et al. (2010) ressaltaram o arroz parboilizado como um dos
melhores substratos para B. bassiana e obtiveram valores 0,80 x108 conídios/ g para o
isolado IBCB 66, valor inferior aos obtidos pelos isolados aqui testados, exceto IBCB 240.
O crescimento de B. bassiana em arroz se faz válido no controle de C. sordidus, como
visto por Batista-Filho et al. (1990), os quais indicaram o uso de uma pasta formada por
conídios mais arroz e água sobre iscas de pseudocaule, sem a necessidade de
formulações.
4.3. Avaliação de isolados de nematoides entomopatogênicos contra adultos de
Cosmopolites sordidus
Todos os isolados avaliados foram patogênicos ao moleque-da-bananeira
proporcionando mortalidade confirmada entre 4,0 e 18,0%. Pode-se dizer que os valores
são baixos e com grandes diferenças quanto à virulência dos isolados (Tabela 6), tais
resultados podem ter ocorrido devido uma maior resistência de adultos de coleópteros a
infecção por nematoides, como visto por Rodrigueiro et al. (2008) em testes com
nematoides contra o cascudinho do aviário (Alphitobius diaperinus) o quais constataram
que o tegumento mais quitinizado deste coleóptero induz a resistência na penetração dos
nematoides, além da habilidade de realizar comportamentos de auto-limpeza, não exibido
pelas larvas, percebendo a presença dos nematoides no corpo e diminuindo assim a
incidência de infecções por esses patógenos.
29
Tabela 6. Mortalidade total e confirmada de adultos de Cosmopolites sordidus causada por
diferentes espécies de nematoides entomopatogênicos em condições de laboratório (25º ± 1ºC ;
U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), junho, 2012.
Espécie
Isolados
Mortalidade
Confirmada* (%)
Desvio
Padrão (±)
Erro Padrão¹
(±)
Heterorhabditis amazonensis
IBCB n24
18 a
7,5
3,59
Heterorhabditis indica
IBCB n05
16 a
8
4,0
Steinernema brazilense
IBCB n06
16 a
4
4,0
Steinernema glaseri
IBCB n01
14 ab
13,6
6,0
Steinernema carpocapsae
IBCB n02
4 ab
4,9
2,66
----------
0b
0
0
Testemunha
C.V. (%)
27,61
Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem pelo teste de Tukey a 5% (p<0,05).
*Significativo a 5% de probabilidade.
Dentre as espécies avaliadas, H. amazonensis (IBCB n24), H. indica (IBCB n05) e
S. brazilense (IBCB n06) ocasionaram mortalidade confirmada de 18, 16 e 16%,
respectivamente, diferindo estatisticamente da testemunha. Por outro lado S. glaseri e S.
carpocapse não diferiram da testemunha (14 e 4%). Entretanto nenhum isolado diferiu
entre si.
Avaliando diferentes NEPs contra adultos de Sphenophorus levis, coleópetero
também pertencente a família Curculionidae, Giometti et al. (2011) obteve mortalidades
entre 2,9 e 45%, com índices de 31,4% para IBCB n24, 14,3% para IBCB n05 e 45% para
IBCB n06, corroborando com os resultados obtidos para C. sordidus.
Pode-se considerar que os isolados apresentaram baixa mortalidade. Estudos
utilizando diferentes isolados no controle de larvas de C. sordidus apresentaram taxas de
até 100% evidenciando maior susceptibilidade das larvas do que dos adultos (SCHMITT
et al., 1992; MWAITULO et al., 2011; PADILLA-CUBAS et al., 2010). Contudo, o principal
alvo do controle em campo tem sido os adultos e seu manejo contribui para a diminuição
dos níveis populacionais (ROSALES & SUÁREZ, 1998). Assim, a seleção de isolados
eficientes contra adultos é uma ferramenta importante e necessária.
30
Ao avaliar o potencial de diferentes isolados de nematoides das famílias
Steinernematidae e Heterorhabditidae contra C. sordidus Bortoluzzi (2009) utilizou a dose
de 100 JI/ cm2 e observou para IBCB n02 3,3%, semelhante ao obtido neste trabalho
(4%) o que indica a baixa infectividade deste isolado para esta espécie. Bortoluzzi testou
ainda IBCB 05 e IBCB 24 que apresentaram uma mortalidade respectivamente de 16,7%
e 33,3% valores bastante semelhantes aos aqui obtidos (16 e 18% respectivamente).
Utilizando S. carpocapse, em condições de laboratório, Rosales & Suárez (1998)
obtiveram mortalidade máxima contra adultos de 80% e mínima de 16%, sendo
necessárias doses de até 5 mil JI/ inseto para alcançar tais valores, sendo difícil a
comparação com os resultados aqui obtidos, uma vez que a dose utilizada foi menor
(500JI/ inseto), e diferenças quanto a metodologia de aplicação.
Se considerados os valores absolutos (percentual de mortalidade confirmada) os
isolados IBCB n24, IBCB n05 e IBCB n06 podem apresentar maiores valores de
mortalidade em maiores concentrações, pois se sabe que a densidade dos juvenis
infectivos é fator determinante na eficácia de um isolado de NEP (ANDALÓ et al., 2005;
MOLINA-ACEVEDO & LÓPEZ-NÚÑEZ, 2009), para tal verificação são necessários testes
de concentrações.
4.4. Concentrações do nematoide entomopatogênico Steinernema brazilense
contra adultos de Cosmopolites sordidus
Para o teste de concentrações, foi escolhido o isolado IBCB 06, que embora não
tenha apresentado o maior percentual de mortalidade no teste anterior (IBCB n24 com
18%, IBCB 06 16% de mortalidade), foi um dos três melhores isolados e não houve
diferença significativa entre os mesmos.
Este isolado também foi escolhido por apresentar características que o favorecem
como um bom agente biológico. Entre elas sua eficiência comprovada para diferentes
pragas, bom desempenho em campo (TAVARES, 2006; SILVA et al., 2010; GIOMETTI et
al., 2010; LEITE et al., 2012) , e capacidade de boa multiplicação em relação aos demais,
fato observado ao longo destes experimentos.
Das cinco concentrações testadas, apenas 3 diferiram estatisticamente da
testemunha, sendo 1000; 2000 e 4000 JI/ inseto. Entre as concentrações, apenas 2000
31
diferiu de 250 e 500 JI/ inseto, com uma mortalidade de 34, 8 e 8% respectivamente
(Figura 10).
A mortalidade alcançada foi superior a observada no teste de seleção de isolados
o que sugere que em diferentes concentrações o isolado IBCB n06 pode exibir maiores
ou menores índices de mortalidade contra C. sordidus.
Figura 10. Mortalidade causada por cinco diferentes concentrações no nematoide Steinernema
brasilense (IBCB n06) testados em condições de laboratório contra adultos de Cosmopolites
sordidus (25 ± 1ºC; U.R. 70 ± 10% e fotofase de 12h), novembro, 2012. Médias seguidas de
mesma letra, não diferem pelo teste de Tukey a 5% (p<0,05). Valores originais e análise
estatística realizada com dados transformados em Log x + 10.
32
5. CONCLUSÕES
Os isolados de Beauveria bassiana testados foram patogênicos para adultos do
coleóptero Cosmopolites sordidus, com exceção do isolado IBCB 80.
Os isolados IBCB 170, IBCB 182 e IBCB 21 foram selecionados como potenciais
para o controle de Cosmopolites sordidus por terem exibido alta mortalidade, assim como
os isolados IBCB 247, IBCB 195 e IBCB 170 que se destacaram nos valores de produção
de conídios.
Todos os isolados de nematoides entomopatogênicos testados foram patogênicos
para a praga. IBCB n06 foi selecionado como um dos mais eficientes no controle de C.
sordidus e causou maior mortalidade na concentração 2000JI/ inseto.
33
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Bananicultores do Vale do Ribeira, 2012. Disponivel em: <http://www.abavar.com.br/>.
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