Patologia molecular: do
genótipo ao fenótipo
Genética Médica
Henriqueta Coimbra Silva
Diagnóstico pré-sintomático e de portadores
Pesquisa de mutações constitucionais
doente
44
60
controlo
35
68
51
22
anos
Cancro da mama
Cancro da mama
Cancro do ovário
Medicina preventiva e
personalizada
Diagnóstico pré-sintomático e de portadores
Pesquisa de mutações constitucionais
?
Coreia de Huntington
◨
?
Síndroma de X Frágil
Fibrose quística
◑
Diagnóstico de mutações somáticas no cancro
membrana celular
RAS
EGFR GRB2
RAC
SOS
RAF
MEKK1
MAP cinases
Identificação de mutações do KRAS e EGFR:
identificação de alvos terapêuticos; avaliação
prognóstica e selecção terapêutica
Patologia molecular: correlação
genótipo-fenótipo
Objectivos:
1.
Identificar e descrever os diversos tipos de
mutações
2.
Descrever as características das sequências
associadas a elevada taxa de mutação
3.
Explicar a correlação genótipo -fenótipo
1. Tipo de Mutações
Classifique quanto ao tipo de mutação:
DNA
Aminoácidos
Resultado
CAA TTC CGA CGA
Val-Lys-Ala-Ala
Normal
CAA TTT CGA CGA
Val-Lys-Ala-Ala
Mutação sinónima
CAA CTC CGA CGA
Val-Glu-Ala-Ala
Mutação missense
CAA ATC CGA CGA
Val
Mutação nonsense
CAA _TC CGA CGA...
Val-Arg-Leu-...stop
Delecção com frameshift
CAA TTT CCG ACG A
Val-Lys-Gly-Cys-
Inserção com frameshift
1. Tipo de mutações: mutação nonsense
Gene normal
Gene mutado
Transcrição
Transcrição
Codão stop
Interrupção da tradução
Tradução
Formação de peptídeo
completo
Formação de peptídeo truncado,
não funcional
• mRNA instável → degradação → ausência de síntese de proteína
• Polipeptídeo truncado com alguma função
• Polipeptídeo que interage com outras proteínas
1. Tipo de mutações: mutação com frameshift
Mutação do gene da β-globina associada a β-talassémia
Sequência da cadeia beta normal
Delecção de AA
frameshift
Codão stop
Nonsense
Mediated
Decay:
mecanismo que detecta codões
STOP prematuros.
Actua ao nível do mRNA de
modo a impedir a síntese de
proteínas truncadas.
Só detecta os codões stop
situados a > 50 nucleótidos a
montante do local de splicing
seguinte
1. Tipo de mutações: mutação missense
A substituição do aminoácido é
conservadora?
A mutação está numa região conservada
do ponto de vista evolutivo?
A mutação está em algum domínio
funcionalmente importante da proteína?
Outros critérios...
Mutação do codão 13 do gene
KRAS (GGC>GAC) num cancro
do pulmão
Gli13Asp (G13D)
H – CH - COOH
NH2
Glicina; grupo I
HOOC - CH2– CH - COOH
NH2
Ácido aspártco; grupo IV
Distância fisicoquímica entre pares de aminoácidos
Tabela de Grantham, compara os aminoácidos quanto à polaridade,
volume molecular e composição química.
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas
sequências de splicing
Splicing normal
AG
GT
GT
AG
Retenção de intrão
GT
GT
GT
AG
SR
AG
SR
AG
SR
Eliminação de exão
GT
GT
GT
AG
SR
SR
AG
SR
AG
Frequentemente associam-se a efeito de frameshift e codões stop
prematuros a jusante.
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas
sequências de splicing
Síndroma de Frasier
Transplantada renal (glomerulonefrite crónica
membranoproliferativa)
• Amenorreia
• Genitais externos hipotróficos
• Cariótipo 46,XY
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas
nas sequências de splicing
A proteína WT1 é um factor de transcrição com funções supressoras tumorais, e
que também desempenha um papel crucial no desenvolvimento embrionário do
rim e gónadas.
KTS+
K - Lys
T - Thr
S - Ser
KTS-
Gene do tumor de Wilms, WT1. Podem formar-se 24 isoformas da
proteína WT1 por combinação de 3 mecanismos de controlo da
expressão génica.
A variante de splicing do exão 9 permite a inclusão ou exclusão de
três aminoácidos (KTS). As duas isoformas, KTS positivas e KTS
negativas, parecem ter diferentes funções e diferentes localizações
ao nível do núcleo.
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas
sequências de splicing
Exão 9
Segmento amplificado do exão 9.
Mutação intrónica alterando o segundo local dador de splincing,
dando origem preferencial às isoformas WT1-KTS.
A mutação cria um site de restrição para a enzima HinP I
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas
sequências de splicing
T>C
F D F C C ϕX C D
Estudaram-se os familiares e
50 controlos (100 alelos) por
RFLP coma enzima HinP I
Neomutação, freq <1% na população
Não se estudou o mRNA: o gene só é transcrito durante o
desenvolvimento embrionário e no rim
1. Tipo de mutações: activação de uma sequência críptica
de splicing
As mutações intrónicas afectam o splicing
1. Tipo de mutações: activação de uma sequência
críptica de splicing num exão
GT
AG
GT
AG
Uma mutação sinónima pode activar uma sequência críptica
dadora de splicing no exão 2: parte do exão é eliminado
1. Tipo de mutações: activação de uma sequência
críptica de splicing
• Uma mutação sinónima pode ser patogénica
exão 16
exão 17
Intrão 16
GAG GGC AAA GGC AAA ACA AGT.....
GT
AG
CCA CAG CCT...
GAG GGT AAAG...
frameshift
Intrão 16
GAG G
GT
AG
CC ACA GCC T...
Mutação do gene calpaína 3 responsável por uma forma de distrofia muscular, a LGMD2A.
Aparentemente a mutação é silenciosa porque é sinónima, dado que ambos os codões,
GGC e GGT codificam a glicina. No entanto, a mutação activa uma sequência críptica dadora
de splicing originando perda de parte do exão 16, introdução de frameshift e stop prematuro a
jusante.
1. Tipos de mutações: mutações das regiões
reguladoras
Gene da β-globina e localização das várias
mutações associadas à β-talassémia
-29A →G
-88C →T
Porque serão patogénicas?
Frequentemente, uma patologia pode ser provocada por
diferentes tipos de mutações num gene – heterogeneidade alélica
Alguns dos tipos de mutações do gene do receptor das LDL, o
LDLR, na origem da hipercolesterolémia familiar.
Mutation hotspots
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
citosina
H
CH3
NH2
C5
H
5-metilcitosina
C4
C6
N3
H
2C
Metilação
O
C5
1N
N3
O
C6
C4
2C
CH3
NH2
C5
1N
timina
H
C4
C6
1N
N3
O
Desaminação espontânea
2C
O
citosina metiltransferase
Dinucleótidos CpG: 8 a 12 x mais mutações
Transição citosina → timina, a qual vai emparelhar com adenina
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
Replicação
Sequênciasnormal
repetitivas – os microssatélites favorecem a ocorrência de inserções e
delecções por deslizamento das cadeias durante a replicação. Para certos loci, um
número excessivo de repetições pode originar mutações patogénicas, as mutações
dinâmicas.
Mecanismo de inserção
Por deslizamento para
trás da nova cadeia
Mecanismo de delecção
Por deslizamento para
trás da cadeia molde
Doenças associadas a mutações dinâmicas
Doença
Transmissão
Grandes repetições
Localização
Sequência
Normal
Não codificante
Instável
Pré-mutação
X frágil
XR
5’UTR
(CGG)n
6-54
200-1000
Ataxia de Friedreich
AR
Intrão 1
(GAA)n
7-22
200-1700
Distrofia miotónica (DM1)
AD
3’UTR
(CTG)n
5-35
50-4000
D. de Huntington
AD
Codificante
(CAG)n
10-26
36 -100
D. de Machado Joseph
AD
Codificante
(CAG)n
12-39
62-86
D. de Kennedy
XR
Codificante
(CAG)n
9-35
38-62
Repetições CAG
Etc..
Mutações com diversos mecanismos patogénicos
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
Motivos extensos de DNA repetitivo ou com grandes homologias, por
exemplo genes e respectivos pseudogenes favorecem a ocorrência de
crossing-overs assimétricos entre cromátides irmãs ou entre cromátides de
cromossomas homólogos dá origem a delecções /inserções e genes de
fusão
30 Kb
30 Kb
C4A
CYP21A
Pseudogene
Não funcional
Com mutações
C4B
CYP21B
21-hidroxilase
O gene CYP21B e o pseudogene CYP21A localizam-se numa sequência repetitiva
de DNA de cerca de 30Kb que inclui ainda outro gene também em duplicado, o C4
(C4A e C4B).
Mutações da 21-hidroxilase
Formação de crossing-overs
assimétricos; 25% das
mutações
Emparelhamento
assimétrico
Conversão génica
75% das mutações
Micro
conversão
Rotura e
reconstrução
Gene de fusão, inactivo
Gene mutante com
mutações
inactivadoras
Delecção
A maioria das mutações da 21-hidroxilase devem-se a trocas de sequências do
CYP21B, com um pseudogene próximo, o CYP21A, por emparelhamento assimétrico.
Mutações patogénicas do gene da 21-hidroxilase (CYP21B) podem ocorrer por
cópia a partir do pseudogene CYP21A.
Hiperplasia congénita da supra-renal
ACTH
Hipotálamo/
Hipófise
Colesterol
Pregnanolona
Progesterona
CYP21
Deoxicorticosterona
Corticosterona
↓ Aldosterona
(Perda renal de sódio)
17 α–OH
Pregnanolona
↑ 17 α–OH
Progesterona
Deidroepiandrosterona
↑Androstenediona
↑ Testosterona
CYP21
11-deoxicortisol
↓ Cortisol
Estrona
Feed-back
negativo
Estradiol
Hiperplasia congénita da supra-renal
por défice da 21-hidroxilase
Ambiguidade dos genitais externos
Pseudo-hermafroditismo feminino
Virilização precoce no sexo masculino
Síndrome de perda de sal
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
A existência de sequências homólogas pode ainda dar origem a outras
alterações graves como inversões. Exemplo da hemofilia A.
No intrão 22 do gene F8 há outros dois genes, o F8B e o F8A. A cerca de 300 Kb,
na direcção do telómero, localizam-se os genes F8A* e F8A**, homólogos de
F8A. Pode ocorrer inversão por emparelhamento do gene F8A (do intrão 22 do
gene F8) com dois genes homólogos, o F8A* e F8A**.
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
Pequenas sequências repetitivas são frequentemente encontradas nos
limites de muitas delecções patogénicas do mtDNA na síndroma de
Kearns-Sayre.
Porque surge a patologia?
Porque há doenças recessivas e dominantes?
3.Mutações: consequências
As consequências de uma mutação dependem da
alteração da função da proteína e da função da proteína
na célula/organismo.
• Perda/diminuição
de função
Fenótipos dominantes
• Aumento de função
Fenótipos recessivos
• Nova função
Doença autossómica
recessiva
Doença autossómica
dominante
3. Mutações: consequências
Mutações da região
codificante
Proteína anormal
1
Mutação
Mutações que afectam a
regulação ou a dosagem génica
2
Mutações que afectam a estabilidade
do RNA ou o seu processamento
Proteína normal
Causa de Patologia
Hemofilia,
β talassémia, etc
Perda de função
(a maioria)
Acondroplasia
Aumento de função
Gene híbrido
Nova função
d. Huntington
3
Efeito lesivo
Expressão ectópica
ou heterocrónica
Cancro
↓ quantidade
α talassémia
↑ quantidade
D. Charcot-Marie-tooth I
Expressão
inapropriada
3. Mutações: consequências
Mutações com perda de função:
delecções; frameshift; nonsense; inversões, missense,
Fenótipo recessivo (enzimas, factores de coagulação,..)
50% da proteína assegura a função
Podem associar-se a fenótipos dominantes
Mutações com perda de função:
exemplo da β-talassémia
A figura representa o gene da β-globina e a localização das várias
mutações associadas à β-talassémia. Algumas das mutações localizamse na região reguladora e limitam a taxa de transcrição. Outras originam
proteínas mutantes não funcionais. Doença autossómica recessiva com
heterogeneidade alélica.
Alteração com perda de função
Exemplo
Delecção
Inserções
α-talassémias; Distrofia muscular de Duchenne
De LINE-1 no gene F8 na hemofilia A
Disrupção da estrutura de um gene
translocação
nversão
Distrofia muscular de Duchenne
gene F8 na hemofilia A
Inibição do promotor
mutação
metilação
β-talassémia
CDKN2A no cancro
Destabilização do mRNA
mutação do site de poliadenilação
pelo NMD
Mutação da α-globina na α talassémia
β-talassémia (Q39X)
Interferência no splicing
β-talassémia; mucoviscidose; ...
Frameshift
β-talassémia; s. Papillon-Lefèvre
Mutação nonsense
β-talassémia; s. Papillon-Lefèvre
Mutação missense em aac. essencial
Mucoviscidose
Mutação que interfira com o
processamento pós-tradução
s. Ehlers Danlos tipo VII (procolagénio resistente
à clivagem)
Mutação que impeça a correcta
localização na célula
Fibrose quística (pF508del)
Mutações com perda de função
• X frágil: (CGG)>200 na região 5’UTR do gene FMR1
→ metilação da região promotora e ausência de
expressão do gene – perda de função – X recessiva
Principal causa de atraso mental
hereditário no sexo masculino
Prognatismo; grandes pavilhões auriculares
Mutações dinâmicas em
regiões não codificantes
Síndroma de X-frágil
A proteína FMR1 é importante para o desenvolvimento e maturação do SNC
onde regula a tradução de vários mRNAs.
Mutações com perda de função
A osteogénese imperfeita é uma doença que afecta o esqueleto e que surge
por mutações nos genes que codificam as cadeias α1 ou α2 do colagénio.
Cromossoma 17
Cromossoma 7
Gene
COL1A1
Gene
COL1A2
2n α1
n α2
α2
α1
O colagénio é uma proteína multimérica
formada por duas cadeias α1 e uma cadeia α2
Mutações com perda de função
Mutação
missense
Gene
COL1A1
n α1 normais e n
cadeias α1 mutadas
Apenas n/4 de proteínas
normais
Gene
COL1A2
n α2
3n/4 de proteínas
anormais não funcionais
Efeito dominante negativo: mutação com perda de
função associada a fenótipos dominantes
Delecções
COL1A1
COL1A2
n α1
n α2
n α1
n α2
Só se sintetizam
peptídeos normais
n/2 moléculas normais
Efeito dominante negativo – a proteína mutada interfere com a proteína
normal
→ Os heterozigotos são doentes
→ Mutação missense com consequências mais graves do que a delecção
Gene
Localização
da mutação
nonsense
Efeito
Na ausência de correcção
pelo
NMD,
mutações
nonsense podem originar
proteínas truncadas na
origem
de
fenótipos
dominantes por efeito
dominante negativo
Mutações com perda de função
Haploinsuficiência: redução de 50% da função causa
patologia- fenótipo dominante
Patologia
MIM#
Gene
S. de Alagille
Exostose múltipla
Neuropatia Tomaculosa
Estenose aórtica supra-valvular
S. Trico-rino-falângico
S. Waardenburg tipo 1
118340
133700
162500
185500
190350
193500
JAG1
EXT1
PMP22
ELN
TRPS1
PAX3
Efeito de dosagem génica
• via de sinalização “quantitativa” – taxa de ocupação de receptor
• actuação por competição
• cooperação ou interacção entre proteínas
3. Mutações: consequências
Mutações com perda de função
Fenótipo recessivo (enzimas, factores de coagulação,..)
50% da proteína assegura a função
Podem associar-se a fenótipos dominantes
Efeito dominante negativo
Haploinsuficiência
Mutações com ganho de função
Fenótipo dominantes
50% da proteína não asseguram a função
Mutações com ganho de função – efeito tóxico da
proteína
Doença de Huntington:
(CAG) 36 a >100
6-35 normal
36-40 penetrância incompleta
> 40 penetrância completa
Redução de 25-30% do
peso do cérebro
• No 1º exão do gene HD → sequência de poliglutamina no terminal
amina da proteína huntingtina
• Formam-se agregados de proteína no núcleo e citoplasma
• Morte celular no estriado e cortex cerebral
Autossómica dominante
Mutações com ganho de função
G1138A
Activação constitutiva do receptor
Acondroplasia. Normalmente, a ligação de factor de crescimento FGF
activa o receptor FGFR3 tendo como consequência a inibição da
proliferação dos condrócitos na placa de crescimento. A mutação
causa a activação constitutiva do receptor, independentemente da
ligação do ligando, pelo que o crescimento dos ossos longos é inibido.
90% mutação missense (glicina>arginina)
Fenótipo dominante
Mutações com ganho de função
Mutações pontuais: protooncogene RET
Codão
609
611
618
620
634
Síndroma MEN2A: cancro
medular da tiróide e adenoma
das supra-renais
Dimerização
Autofosforilação
Activação das vias de
transdução de sinal
Proliferação
celular e cancro
Ganho de função ou nova função
Mecanismo
Aumento da expressão
(duplicação do gene)
Activação de receptor
(mutação pontual)
Efeito citotóxico
proteína
RNA?
Insensibilidade a
inibidores
(proteína quimérica)
Canal iónico
permanentemente aberto
Gene
PMP22
RET
oncogene
HD
DMPK
BCR-ABL
Oncogene
SCN4A
Doença
Doença de Charcot-Marie-Tooth
MEN2A (síndroma tumoral
hereditária)
Doença de Huntington
Distrofia miotónica
Leucemia mielóide crónica
Paramiotonia congénita
Ganho de função?
• Espectro de mutações mais restrito
• A patologia não se associa a delecções ou
disrupções do gene
• Mutações em locais específicos
• Modelos in vitro: “knockout”
Há muitas excepções,...
Variabilidade das doenças monogénicas?
44
60
• Penetrância incompleta
• Expressividade variável
35
68
51
22
anos
• Penetrância com a idade
Cancro da mama hereditário: genes modificadores
Genes modificadores do BRCA1 e do BRCA2
RAD51
MAP3K1
FGFR2
MAP3K
TNRC9
Associação de polimorfismos dos genes FGFR2 e TNRC9:
↑ cancro da mama aos 70 anos, para portadoras de mutação do
BRCA2, de 41% (sem alelos de risco) para 70% (4 alelos de risco)
Common Breast Cancer-Predisposition Alleles Are Associated with Breast Cancer Risk in BRCA1
and BRCA2 Mutation Carriers
Antoniou et al, Am J Hum Genet, 2008
Estudo em 10.358 portadoras de mutações do BRCA1/BRCA2
Querubismo – penetrância variável com o sexo
Proliferação do tecido
conjuntivo fibroso com
numerosas células
gigantes multinucleadas
•
•
•
Querubismo (Displasia fibrosa familiar dos
maxilares)
Expansão progressiva, indolor e simétrica,
dos maxilares; regride após a puberdade
Alterações da erupção dentária
AD
Mutações no gene 3BP2
Penetrância de 100% no
sexo masculino e de 50 a
70% no sexo feminino
Proteína 3BP2 – envolvida na activação e
desgranulação dos mastócitos e activação
dos osteoclastos
A presença da mutação não assegura o
fenótipo patológico
Exemplo da fenilcetonúria: metabolopatia autossómica recessiva, por
mutações no gene da fenilalanina hidroxilase, com deficiência mental e
alterações neurológicas em homozigotos mutados, apenas na ausência de
dieta pobre em fenilalanina. Diagnóstico perinatal pelo “teste de Guthrie”.
◨ ◑
Mãe com fenilcetonúria,
homozigota mutada.
Se não fizer dieta durante
a gravidez
Doença por efeito tóxico de metabolitos
maternos sobre os fetos, mesmo que estes
sejam heterozigotos - fenocópia
Penetrância incompleta e expressividade
variável em doenças monogénicas
Correlação genótipo-fenótipo (tipo e localização da
mutação)
Interferências do meio
Genes modificadores: polimorfismos, mutações
Interferências com polimorfismos do mesmo gene
Dificuldades no diagnóstico
e no prognóstico
DPN?
Diagnóstico de portadores?
Avaliação do risco para a descendência?