CLÉBER SÉRGIO DA SILVA
ESTUDO IMUNOHISTOQUÍMICO DAS SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS,
MACRÓFAGOS E ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZIDA EM COLO UTERINO
DE MULHERES COM NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL CERVICAL GRAU III E
CARCINOMA EPIDERMÓIDE INVASIVO
Tese apresentada ao curso de pós-graduação
em
Patologia,
área
de
concentração:
Patologia Ginecológica e Obstétrica, da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro,
como requisito parcial para obtenção do
Título de Doutor em Ciências.
ORIENTADOR: Professor Eddie Fernando Candido Murta
CO-ORIENTADOR: Professora Márcia Antoniazi Michelin
UBERABA – MG
Novembro, 2006
2
Apoio Financeiro:
• Universidade Federal do Triângulo Mineiro
• Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES)
Local de desenvolvimento do trabalho:
• Laboratório de Patologia Geral da UFTM
• Laboratório de Patologia Cirúrgica da UFTM
• Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia da UFTM
3
Dedico esse trabalho especialmente a Cris e
à Júlia, por me encherem de amor a todo
tempo.
4
AGRADECIMENTOS
A realização de um trabalho científico envolve a participação de um grande número
de pessoas que direta ou indiretamente oferecem a sua contribuição. A confecção desta
Tese não foi diferente. Diversos indivíduos estiveram envolvidos, emprestando o seu
trabalho e apoio, aos quais presto o meu agradecimento:
Agradeço à Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), pela estrutura
que me proporcionou à realização deste trabalho;
À Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia da UFTM.
Aos professores Eddie Fernando Candido Murta e Márcia Antoniazzi
Michelin, pela orientação na realização desse trabalho;
Às Dras. Renata Margarida Etchebere, Adilha Misson Rua e Sheila Jorge
Adad, pelo entusiasmo no auxílio sempre de imediato quando solicitado;
A todos os médicos residentes do curso de Patologia da UFTM matriculados nos
últimos quatro anos. Em algum momento, todos, sem exceção, contribuíram com uma
orientação, uma leitura de lâmina ou auxílio na confecção das figuras.
À Dra. Dayse Chesca, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, pelo auxílio
na padronização da metodologia da imunohistoquímica.
Ao Sr. Hênio da Silva Oliveira pelo auxílio na padronização das diluições dos
anticorpos utilizados na imunohistoquímica.
Ao Sr. Richard Átila de Sousa, Srta. Eliângela de Castro Cobo e à Sra. Luzia
Helena Gonçalves dos Santos pela dedicação e apoio técnico na realização dos testes de
imunohistoquímica;
Ao Prof. Paulo José Maluf, pela solidariedade e auxílio na fase final de conclusão
desse trabalho.
5
Às funcionárias do Laboratório de Patologia Geral, Sra. Jucélia Ribeiro Torres e
Sra. Vandair Gonçalves e pelo auxílio no corte de blocos e montagem das lâminas.
A todos os funcionários do Laboratório de Patologia Cirúrgica da UFTM pelo
auxílio sempre de imediato, inclusive à noite e finais de semana.
Às secretárias Nilva Aparecida da Silva Aveiro, Dóris Lima Dayrell de
Carvalho, Heloísa Helena Vieira e Zelma Rocha Camargos Pereira, pelo auxílio
fornecido no levantamento e confecção do Banco de Dados.
Ao Prof. Dr. Vicente Antunes Teixiera, pelo fornecimento e liberação do
Laboratório de Patologia Geral e de funcionários para corte dos blocos de parafina dos
casos estudados nesse trabalho.
Aos professores do curso de pós-graduação em Patologia, pelos ensinamentos.
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................18
1.1. Colo Uterino................................................................................................19
1.2. O câncer do colo uterino..............................................................................20
1.3. O Papilomavírus humano (HPV).................................................................21
1.4. O Sistema Imune..........................................................................................24
1.4.1. O sistema imune na mucosa cervico-vaginal frente ao HPV e
lesões associadas.........................................................................25
1.5.Óxido nítrico (NO).......................................................................................27
2. OBJETIVOS...........................................................................................................30
3. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................32
3.1. Material........................................................................................................33
3.2. Métodos.......................................................................................................34
3.2.1. Caracterização da amostra..................................................................34
3.2.2. Método Histoquímico.........................................................................37
7
3.2.3. Método Imunohistoquímico................................................................38
3.2.3.1. Critério de análise................................................................41
3.2.4. Método estatístico e construção de gráficos.......................................41
4. DISCUSSÃO...........................................................................................................56
5. CONCLUSÃO........................................................................................................72
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................74
ANEXOS
8
LISTA DE FIGURAS
Prancha 1. Cortes histológicos de mulheres pertencentes ao grupo controle. A. Corte
histológico corado segundo a técnica de HE mostrando epitélio escamoso estratificado não
queratinizado, epitélio colunar simples e a JEC com moderado infiltrado inflamatório no
estroma subjacente (aumento de 200 vezes). B. Corte histológico corado através da técnica
de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD3+ coradas em
marrom (aumento de 200 vezes). C. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD8+ coradas em marrom
(aumento de 200 vezes). D. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD20+ coradas em marrom
(aumento de 200 vezes). E. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação para iNOS coradas em
marrom (aumento de 200 vezes). F. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD68+ coradas em marron
(aumento de 200 vezes)
Prancha 2. Cortes histológicos de mulheres pertencentes ao grupo de portadoras de NIC
III. A. Corte histológico corado segundo a técnica de HE mostrando epitélio com NIC III e
infiltrado inflamatório no estroma subjacente (aumento de 200 vezes). B. Corte histológico
corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação
CD3+ coradas em marron (aumento de 200 vezes). C. Corte histológico corado através da
técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD8+ coradas
em marron (aumento de 200 vezes). D. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD20+ coradas em marron
(aumento de 200 vezes). E. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação para iNOS coradas em
marron (aumento de 200 vezes). F. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD68+ coradas em marron
(aumento de 200 vezes).
Prancha 3. Cortes histológicos de mulheres pertencentes ao grupo de portadoras de
carcinoma invasivo de colo uterino estadiamento I. A. Corte histológico corado segundo a
técnica de HE mostrando carcinoma invasivo caracterizado pela invasão de clones de
células epidermóides invadindo o estroma e infiltrado inflamatório peritumoral (aumento
de 200 vezes). B. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
mostrando células positivas com marcação CD3+ coradas em marron (aumento de 200
vezes). C. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando
células positivas com marcação CD8+ coradas em marron (aumento de 200 vezes). D.
Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células
positivas com marcação CD20+ coradas em marron (aumento de 200 vezes). E. Corte
histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas
com marcação para iNOS coradas em marron (aumento de 200 vezes). F. Corte histológico
corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação
CD68+ coradas em marron (aumento de 200 vezes).
9
Prancha 4. A, B, C e D. Cortes histológicos de tecido corados através da técnica de
imunohistoquímica, mostrando células positivas coradas em marrom (B, C e D), ilustrando
o escore de Georgiannos (GEORGIANNOS et al, 2003) 0, 1, 2 e 3, respectivamente
(aumento de 200 vezes).
Figura 1. Caso 50. Corte histológico de tecido corado através da técnica de
imunohistoquímica, mostrando intenso infiltrado peritumoral (seta) e leve intratumoral
(asterisco). (CD8+, 400 vezes).
10
LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS
Gráfico 1. Média e desvio padrão em relação à idade e ao diagnóstico histológico..........34
Gráfico 2. Média e desvio padrão em relação à idade da sexarca e ao diagnóstico
histológico.......................................................................................................35
Gráfico 3. Média e desvio padrão em relação ao número de gravidezes e ao diagnóstico
histológico.........................................................................................................36
Gráfico 4. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de Linfócitos T CD3+ segundo
diagnóstico histológico.....................................................................................44
Gráfico 5. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de Linfócitos T CD8+ segundo
diagnóstico histológico.....................................................................................46
Gráfico 6. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de Linfócitos B CD20+ segundo
diagnóstico histológico.....................................................................................48
Gráfico 7. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de Macrófagos CD68+ segundo
diagnóstico histológico.....................................................................................50
Gráfico 8. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de células com iNOS segundo
diagnóstico histológico.....................................................................................52
Gráfico 9. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) nos espaços peri e intratumoral de
linfócitos T (CD3+ e CD8+), linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e
iNOS em neoplasias invasivas do colo uterino.................................................54
Gráfico 10. Distribuição da proporção (Intensa : Fraca) de linfócitos T (CD3+ e CD8+),
linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e células que expressam iNOS em
pacientes do grupo controle, portadoras de NIC III e carcinoma invasivo de
colo uterino nos espaços peri e intratumoral....................................................55
11
Tabela 1. Distribuição das pacientes segundo a quantificação intensa e fraca de células T
CD3+ em relação ao diagnóstico histológico.....................................................43
Tabela 2. Distribuição das pacientes segundo a quantificação intensa e fraca de céluas T
CD8+ em relação ao diagnóstico histológico.....................................................45
Tabela 3. Distribuição das pacientes segundo a quantificação intensa e fraca de céluas B
CD20+ em relação ao diagnóstico histológico...................................................47
Tabela 4. Distribuição das pacientes segundo a quantificação intensa e fraca de macrófagos
CD68+ em relação ao diagnóstico histológico....................................................49
Tabela 5. Distribuição das pacientes segundo a quantificação intensa e fraca de células que
expressam iNOS em relação ao diagnóstico histológico....................................51
Tabela 6. Distribuição das pacientes com carcinoma invasivo segundo a quantificação
intensa e fraca nos espaços peritumoral e intratumoral de linfócitos T (CD3+ e
CD8+), linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e de células que
expressam iNOS................................................................................................53
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ATP – Trifosfato de adenosina
BSA – Soroalbumina bovina
CD – Cluster Diferenciated
CHP – Complexo de Histocompatibilidade Principal
DAB – Diaminobenzidine-tetrahidrocloridro
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DST – Doença sexualmente transmissível
E – Early
FIGO – Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia
g – grama
HE – Hematoxilina-eosina
HIV – Vírus da imunodeficiência humana
HPV – Papilomavirus humano
IFN-γ - Interferon gama
IL – Interleucina
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
JEC – Junção escamo-colunar
L – Late
LPS – Lipopolissacáride bacteriano
LTC – Linfócito T citotóxico
M – molar
ml – mililitro
NIC – Neoplasia intra-epitelial
NK – Célula natural killer
13
nm – nanômetro
NO – Óxido nítrico
NOS – Óxido nítrico sintase
OE – Orifício externo
PBS – Solução salina tamponada com fosfato
pH – Potencial hidrogeniônico
RNA – Ácido ribonucléico
Th – Linfócito T helper
TNF - Fator de necrose tumoral
°C – grau Celsius
µm – micrômetro
14
RESUMO
15
RESUMO
A resposta imune mediada é importante no controle da infecção pelo HPV e das
neoplasias associadas a esse vírus. Evidências sugerem que o NO atua como mediador da
resposta de linfócitos T. Realizamos estudo transversal cujo objetivo foi identificar e
quantificar subpopulações de linfócitos, macrófagos e da enzima óxido nítrico sintase
induzida em colo uterino de mulheres com NIC III e carcinoma invasivo.
Foram analisados cortes histológicos de 60 mulheres (20 controles , 20 NIC III e 20
carcinoma epidermóide) marcados por imunohistoquímica com os anticorpos: CD3+,
CD8+, CD20+, CD68+ e iNOS. As lâminas foram avaliadas por 2 observadores e a
concordância entre eles foi calculada através do coeficiente de Kappa. Os casos
discordantes foram re-analisados pelos dois em conjunto. As proporções foram
comparadas por meio do teste exato de Fisher.
O Kappa para os 5 marcadores foi de 0.86. Infiltrado inflamatório com linfócitos T,
B, macrófagos e iNOS foi identificado em todos os casos de NIC III e carcinoma invasor,
sendo sempre maior nos últimos. No grupo invasivo, para todos os anticorpos testados a
distribuição das células marcadas foi sempre maior no infiltrado peritomural que
intratumoral.
Em resumo, demonstramos a existência de infiltrado inflamatório em mulheres com
NIC III e carcinoma invasivo, nada podendo ser afirmado em relação à capacidade
citotóxica desses linfócitos. A expressão crescente de iNOS sugere a produção de grandes
quantidades de NO durante a carcinogênese, fazendo-nos concluir que este mediador possa
desenvolver papel importante nesse processo.
Palavras-chave: neoplasia de colo uterino; óxido nítrico; NIC III; infiltrado inflamatório.
16
ABSTRACT
17
ABSTRACT
The immune response is important in the control of the infection for HPV and of
the neoplasm associated to that virus. Evidences suggest that the NO acts as mediator of
the answer of T lymphocytes. We made a traverse study whose objective was to identify
and to quantify lymphocytes, macrophages and inducible NO synthase (iNOS) in uterine
cervix of women with CIN III and invasive cervix neoplasm.
Cervix tissue specimens were obtained of 60 women (20 controls, 20 CIN III and
20 invasive carcinoma). It was made immunohistochemical study with the antibodies:
CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ and iNOS. Immunohistochemical staining was analysed
independently by two observers and the agreement among them it was calculated through
the Kappa coefficient. In case of disagreement staining results were re-analyzed by the
observers together. The proportions were compared through the exact test of Fisher.
The Kappa coefficient for the 5 markers was of 0.86. Infiltrated inflammatory with
lymphocytes T, B, macrophages and iNOS was identified in all the cases of CIN III and
invasive carcinoma, being always larger in the last ones. In the group of invasive
neoplasm, for all the tested antibodies the distribution of the marked cells was always
larger in the peritumoral infiltrated than that intratumoral.
In summary, we demonstrated the existence of inflammatory infiltrated in women
with CIN III and invasive carcinoma, nothing could be affirmed in relation to the
cytotoxicity of tumor-infiltrating lymphocytes. The growing expression of iNOS suggests
the production of great amounts of NO during the tumorigenic transformation, making to
us conclude that NO can develop important paper in that process.
Keywords: cervical câncer; nitric oxide; CIN III, Lymphocyte infiltratade.
18
1 – INTRODUÇÃO
19
1. INTRODUÇÃO
1.1 – O Colo Uterino
O colo uterino é a porção mais baixa do útero e protrus na porção superior da vagina.
Possui duas áreas anatomicamente distintas: a ectocérvice e a endocérvice. Esta última
compreende a região entre o corpo uterino e o orifício externo (OE) do colo. A endocérvice
normalmente não fica exposta e está revestida por epitélio colunar, secretor de muco, que
se aprofunda no estroma subjacente, produzindo criptas que às vezes são designadas de
glândulas endocervicais (COTRAN, KUMAR & ROBBINS, 1991). A ectocérvice
representa a região visível ao olho no exame especular vaginal. Está coberta por um epitélio
escamoso estratificado não queratinizado, que se reflete a partir dos fórnices vaginais para
o colo e se estende aproximadamente até ao OE. Abaixo desses epitélios encontra-se o
estroma, que é formado por tecido conjuntivo, rico em uma rede capilar para suprimento de
oxigênio e nutrientes às células epiteliais. O limite entre as células pavimentosas e
cilíndricas é denominada junção escamo colunar (JEC) e ocorre de maneira brusca em
qualquer local da ecto-endocérvice, entretanto, em condições de normalidade, coincide
com o OE (STEFANON & MONANARI, 1996).
Através de ação hormonal, a JEC move-se em direção à ectocérvice. O epitélio
colunar, exposto a condição adversa de pH, sofre um processo de transformação denominado
metaplasia escamosa, no qual as células colunares são substituídas por células escamosas.
Esta área é denominada de zona de transformação (COTRAN, KUMAR & ROBBINS,
1991). Essa região representa uma área de intensa renovação celular que pode ser mais
susceptível à transformação neoplásica por fatores inflamatórios e infecções que num epitélio
maduro (CHEN et al., 1999).
20
1.2 – O Câncer do Colo Uterino
O câncer do colo uterino é a segunda neoplasia maligna em freqüência na mulher
em todo mundo, sendo responsável, anualmente, por cerca de 471 mil novos casos e pelo
óbito de, aproximadamente, 230 mil mulheres (BRASIL, 2005). Ao contrário do que
ocorre nos países mais desenvolvidos, as taxas de mortalidade por câncer do colo do útero
continuam elevadas no Brasil e, do ponto de vista temporal, vêm aumentando: em 1979, a
taxa era de 3,44/100.000, enquanto em 1999 era de 4,67/100.000, correspondendo a uma
variação percentual relativa de 36%. O número de casos novos esperados para o ano 2006
em todo o país é de 19.260, o que corresponde a taxa bruta de incidência de 20,31/100.000
(BRASIL, 2005). O Câncer cervical é precedido por lesões bem definidas no epitélio
conhecidas como neoplasia intraepitelial cervical (NIC). Essas lesões estão associadas com
infecção genital pelo papilomavírus humano (HPV). A maioria das infecções genitais pelo
HPV são clinicamente indetectáveis e não resultam em NIC ou câncer (KOBAYASHI et
al., 2004).
O termo NIC foi proposto por RICHART & BARRON (1969) devido à concepção
da natureza progressiva das lesões que levariam à neoplasia cervical invasiva. Na
proposição inicial destes autores, as NICs seriam classificadas em I, II, III e carcinoma in
situ. Posteriormente, a NIC III e o carcinoma in situ foram agrupados como NIC III (ELUF
NETO, 1998). NIC I reflete atividade de replicação do HPV e raramente evolui para
câncer, tendo resolução espontânea. Em contraste, NIC II e III representam potenciais
lesões precursoras de câncer. Aproximadamente 12% dos casos de NIC III progredirão
para câncer se não tratadas (KOBAYASHI et al., 2004).
O câncer do colo uterino é uma doença multifatorial. Muitos estudos têm
examinado fatores epidemiológicos para o desenvolvimento desse tumor. Evidências
existem de um aumento do risco em mulheres que iniciaram precocemente atividade
21
sexual, multiplicidade de parceiros sexuais, companheiro promíscuo e multiparidade
(WALSH, KAY & LEADER, 1995). Entretanto, na etiologia do câncer do colo do útero e
de suas lesões precursoras, a infecção pelo HPV desenvolve o principal papel (BESKOW
et al., 2001). Evidências epidemiológicas e moleculares têm permitido concluir que
virtualmente todos os casos de câncer cervical e suas lesões precursoras estão relacionadas
com infecção pelo HPV (STANLEY, 2006).
1.3 – O Papilomavírus Humano
Os vírus indutores de papiloma foram inicialmente isolados de coelhos em 1933.
Em 1935 descobriu-se que os papilomas induzidos por esses vírus tinham o potencial de
transformação maligna. Na mulher, lesões de células escamosas originadas a partir da
infecção pelo HPV foram observadas em 1956. Antes da invenção de técnicas de clonagem
na década de 1970, a investigação do HPV era difícil em função desse vírus não se
desenvolver em meios de cultura (JASTREBOFF, 2002). Os HPVs formam uma família
com aproximadamente 120 tipos diferentes de vírus (TINDLE, 2002). Pertencem à família
Papovaviridae. As partículas virais são icosaédricas, não envelopadas, com um diâmetro
aproximado de 55 nm. São vírus DNA de dupla hélice com aproximadamente 8.000 pares
de nucleotídeos (ZUR HAUSEN, 1994). Estes nucleotídeos se dividem aproximadamente
em 10 genes que codificam todas as funções do vírus, sendo 8 genes (localizados numa
região do genoma denominada precoce – “Early”) envolvidos na replicação e 2 genes
(localizados numa região do genoma denominada tardia – “Late”) responsáveis pela
produção das proteínas do cápside viral (VILLA et al., 1998). Os tipos de HPV são
classificados com base na seqüência de nucleotídeos do DNA viral, sendo atualmente o
principal critério de agrupamento dos diferentes tipos que infectam os seres humanos (DE
VILLIERS, 1994).
22
O HPV é um patógeno humano exclusivo, causador de câncer cervical e outros
tumores malignos ano-genitais, assim como verrugas genitais e papilomatose respiratória
recorrente. A infecção pelo HPV é mais comum entre jovens sexualmente ativos, embora
as estimativas de contaminação em indivíduos sexualmente ativos ao longo de suas vidas
são de aproximadamente 75% a 80% (WEAVER, 2006). Os vírions do HPV infectam as
células da camada basal do epitélio escamoso estratificado do colo uterino. Limitada
replicação viral é acompanhada pela expressão das proteínas “early” E1 e E2 na camada
basal. Nas camadas mais distantes, E6 e E7 são expressas. Essas proteínas promovem a
proliferação celular e atrasam a diferenciação. Quando as células infectadas diferenciam
em células escamosas, a proteína E4 e as “late” proteínas L1 e L2 (as quais formam o
cápside), são expressas. Os cápsides virais são espalhados no trato genital dentro de células
epiteliais descamadas (TINDLE, 2002).
A infecção pelo HPV tem uma característica transitória, onde cerca de 70% a 90%
dos indivíduos eliminam o vírus 12 a 24 meses após diagnóstico inicial. A persistência de
HPV em 10% a 30% dos casos é mais comum nos casos de alto risco, estando fortemente
associado com o desenvolvimento de NIC II e III (GONÇALVES & DONADI, 2004). A
progressão de uma infecção clinicamente detectável até o carcinoma invasivo ocorre em
menos de 1% das mulheres. A infecção pelo HPV lembra outros vírus oncogênicos, tais
como o Epstein-Bar vírus e o vírus da hepatite B, para os quais a infecção na comunidade é
largamente disseminada. Apenas uma pequena proporção daqueles infectados é que
desenvolverão doenças malignas associadas aos vírus. Isto indica que outros fatores estão
envolvidos na progressão de uma célula infectada com potencial invasivo (TINDLE,
2002).
Várias linhas de pesquisa têm implicado a resposta imune do hospedeiro como um
fator crítico no controle dessas condições. Evidências sugerem que a resposta imune
23
mediada por células é importante no controle tanto da infecção pelo HPV, quanto das
neoplasias associadas a esse vírus. Esse fato pode ser suspeitado pela incidência aumentada
de câncer genital em pacientes imunossuprimidos, uma vez que, apenas uma minoria de
infecções genitais por HPV resulta no desenvolvimento desses tumores em indivíduos
imunocompetentes (PENN, 1988). Várias vias da resposta imune podem estar afetadas e a
soma dessas contribui para a incidência de tumores associados ao HPV e a sua resistência
ao controle imune (TINDLE, 2002). Trabalho prévio de pesquisadores de nosso grupo
(FERNANDES JÚNIOR, 2006) demonstrou que neutrófilos periféricos de pacientes com
carcinoma invasivo de colo uterino apresentam diminuição da capacidade quimiotática e
fagocítica quando comparadas a pacientes com NIC III. A relação neutrófilo/linfócito
(NLR) tem sido sugerida como um índice da resposta inflamatória sistêmica em pacientes
com doenças críticas (ZAHOREC, 2001). Essa relação é considerada alterada quando
maior ou igual a cinco (WALSH et al., 2005). Em outro trabalho desenvolvido em nosso
grupo, GARCIA (2006), demonstraram NLR maior ou igual a cinco na grande maioria das
pacientes com neoplasia de colo uterino em estadiamento mais avançado, em oposto ao
observado em pacientes com NIC III e neoplasia invasiva inicial. Estes estudos sugerem
participação imunológica sistêmica no processo de carcinogênese. Em outro trabalho,
RESENDE, 2005, demonstraram aumento da produção de IL-8, IL-10 e NO na secreção
cervico-vaginal de mulheres com NIC III e discutem o papel das citocinas na imunidade
local. Mecanismos intrínsecos no desenvolvimento do carcinoma invasivo podem envolver
mudanças na produção local de citocinas ou perda da responsividade das mesmas (NICOL
et al., 2005).
24
1.4 – O sistema imune
Os leucócitos, incluindo linfócitos, são componentes chaves do sistema imune, o qual
é caracterizado por dois braços principais inter-relacionados: a imunidade inata e adquirida. O
sistema imune, através da coordenação do funcionamento de várias células e proteínas,
fornece proteção contra uma grande variedade de patógenos e desenvolve o papel de resposta
do organismo contra células neoplásicas (KOBAYASHI, 2000).
As células do sistema imune podem ser de maneira simples, divididas em linfócitos
que especificamente reconhecem antígenos e células efetoras que atacam microorganismos
estranhos ou células infectadas por vírus depois de estimuladas por linfócitos ou seus
produtos. Os linfócitos podem ser divididos em células B, diferenciadas pela presença da
molécula CD20+ em sua superfície, cujo papel é a secreção de anticorpos, e células T
diferenciadas pela presença da molécula CD3+ em sua superfície (TERR & STITES, 1992).
A resposta imune específica às infecções é regulada pelos linfócitos T. Duas
subclasses de linfócitos T auxiliares (CD4+), células Th1 e Th2, determinam se na
vigência de um processo infeccioso predominará a imunidade mediada por células ou por
anticorpos (ROMAGNANI, 1992; SEDER, 1994). A ativação de celulas Th1 estimula a
liberação de (interferon gama) IFN-γ. Essa citocina estimula os macrófagos a iniciar o
processo de fagocitose e a liberação de outra citocina, IL-1. Essa citocina estimula células
Th1 a produzir IL-2. Essas por sua vez, estimulam tanto a replicação das células Th1 que
reconheceram os micróbios infectantes, quanto a ação de células T citotóxicas (CD8+)
antígenos específicas e as células NK. Dessa forma, a defesa do hospedeiro contra a
infecção é feita por uma combinação de atividades de células citotóxicas e fagocitose.
Além disso, o IFN-γ também inibe a ativação de células Th2 (WITKIN, 2000).
A IL-12, produzida por células apresentadoras de antígenos, representa outra chave
regulatória da resposta imune Th1 (MANETTI, 1993). A habilidade dos linfócitos T em se
25
desenvolver em células Th1 é dependente de sua capacidade de ativar o gene que codifica
a cadeia β do receptor de IL-12. A inativação desse gene favorece o desenvolvimento de
células T através da via Th2, embora a ativação do mesmo por IFN-γ, favorece a indução
da via Th1. Portanto, a habilidade de transcrever o receptor de interleucina 12 também
regula o desenvolvimento de classes de células T CD4+ (SZABO, 1997).
Em contraste, a ativação das células Th2 pela IL-4 produzida por células T,
mastócitos e basófilos (SEDER, 1994), estimula a liberação de IL-4, 5 e 10. A IL-10 inibe
especificamente a ativação de células Th1 por inibirem a produção de interleucina 12 e
IFN-γ e todas as 3 citocinas estimulam a produção de anticorpos pelos linfócitos B. A
resposta imune à infecção ocorre, portanto, através da produção de moléculas de anticorpos
e não por células (SEDER, 1994; TRINCHIERI, 1995).
Pouco é conhecido sobre a variabilidade de resposta imunológica do hospedeiro
em relação às infecções. A exposição ao mesmo micróbio pode ter conseqüências que são
vastamente diferentes entre indivíduos, ou no mesmo paciente em diferentes ocasiões
(WITKIN, 2000). Respostas imunológicas humoral e citotóxica são vistas durante a
resolução da infecção ao HPV (KOBAYASHI, 2000).
1.4.1 – O Sistema Imune na Mucosa Cérvico-vaginal frente ao HPV e lesões associadas
Linhagens de células epiteliais das superfícies mucosas do corpo humano
representam o primeiro sistema de defesa e também são capazes de participar tanto de
funções imunes inatas, quanto adquiridas. Citocinas derivadas de células epiteliais e fatores
de crescimento, dentre outros, parecem ter um importante papel no recrutamento de células
do sistema imunológico, imunorregulação e mecanismos de reparo tecidual (ECKMANN,
1995).
26
Estudos têm demonstrado a existência de pequenos acúmulos de células linfóides
na cérvice ao nível da zona de transformação. Linfócitos CD4+ e CD8+ têm sido
observados tanto como células isoladas quanto em pequenos acúmulos no estroma da
mucosa vaginal e cervical (WHITE et al., 1997). Pequenos números de células B têm sido
encontradas na mucosa da cérvice e da vagina (BELL et al, 1995). Muitos fatores
determinam se haverá predomínio de IL-12 ou IL-4 e portanto, se ocorrerá uma resposta
imunológica tipo Th1 ou Th2 no trato genital feminino a qualquer tempo em resposta a um
agente infeccioso específico (WITIKIN, 2000).
Várias evidências sugerem que a resposta imune mediada por células é importante
no controle tanto da infecção pelo HPV, quanto das neoplasias associadas a esse vírus.
Esse fato pode ser suspeitado pela incidência aumentada de câncer genital em pacientes
imunossuprimidos, uma vez que, apenas uma minoria de infecções genitais por HPV
resultam no desenvolvimento desses tumores em indivíduos imunocompetentes (PEN,
1988). Outro fator que justifica essas evidências é o encontro de infiltrado de células T
CD4+ e CD8+ em verrugas genitais associadas ao HPV em fase de regressão. Estudos com
animais têm demonstrado que a imunização de camundongos C3H/HeN por células de uma
linhagem de fibroblastos transfectadas com o gene E7 do HPV-16 confere proteção contra
células de um tumor singeneico positivo para a proteína E7 do HPV-16 (SANTIN, 1999).
O infiltrado de linfócitos no sítio da neoplasia pode determinar o prognóstico
clínico da infecção (persistência, regressão, progressão). Estudos prévios da população
linfocitária infiltrando a cérvix displásica tem usado imunohistoquímica e tem demostrado
significantes infiltrados de linfócitos T citotóxicos e auxiliares e linfócitos B no estroma
abaixo da lesão (BELL et al., 1995).
Os macrófagos expressam de forma específica em sua superfície a proteína CD68+,
a qual permite a sua detecção através de imunohistoquímica pela utilização de um
27
anticorpo monoclonal (HELLER, 2003). Segundo revisão de GONÇALVES & DONADI
(2004) populações de macrófagos têm sido encontradas na mucosa cérvico-vaginal na
ausência de infecção ou inflamação. Em NIC II/III, um aumento no número de macrófagos
tem sido observado. A presença dessas células pode ser um indicador de regressão da
lesão. Alguns carcinomas de células escamosas mostram uma proeminente concentração
de macrófagos no infiltrado inflamatório associado ao tumor. Os macrófagos parecem
desenvolver vários papéis na biologia tumoral, tanto positivos quanto negativos no
hospedeiro. Atualmente o papel dos macrófagos na imunologia tumoral continua sendo um
assunto cheio de lacunas a ser preenchidas por estudos científicos e representa um foco
para futuras terapias (HELLER, 2003).
1.5 – Óxido Nítrico (NO)
O NO é um gás que está envolvido em muitos processos biológicos. É sintetizado
pela oxido nítrico sintase (NOS) (GARCIA & STEIN, 2006). Há três isoformas da NOS.
Duas são descritas como constitutivas, as quais estão presentes, respectivamente, nas
células vasculares endoteliais (eNOS), e no sistema nervoso central e periférico (nNOS).
O termo constitutivo se dá em função da sua ativação não depender da síntese de novas
proteínas. Uma terceira forma, denominada induzida (iNOS), também é descrita
(RODRIGO et al., 1995). A síntese de NO através do endotélio vascular é responsável por
vasodilatação. NO produzida pelo sistema nervoso central é um neurotransmissor
envolvido na formação da memória; perifericamente, alguns nervos operam por
mecanismos dependentes do NO para mediar vasodilatação neurogênica dentro dos
sistemas respiratório, gastrointestinal e genitourinário. NO também contribui para controle
da agregação plaquetária e regulação da contratilidade cardíaca (GARCIA & STEIN,
2006). A iNOS é produzida em uma variedade de tipos celulares, incluindo macrófagos,
28
hepatócitos, neutrófilos, músculo e endotélio, através de uma variedade de estímulos
imunológicos tais como o IFN-γ, TNF e LPS (RODRIGO, MARTINEZ-MURILLO &
BEESLEY, 1995).
O NO é produzido em grandes quantidades durante a resposta imune. Em função de
suas propriedades citotóxicas e em função de ser também produzido por macrófagos
ativados, acredita-se que tenha um papel na imunidade não específica (GARCIA & STEIN,
2006). O NO é um mediador crítico em uma variedade de funções biológicas, incluindo
atividade microbicida e tumoricida e a participação em uma variedade de imunopatologias.
Surge agora como um provável e potente mediador da resposta de linfócitos T. Há
evidências de que o NO pode tanto estimular quanto suprimir a função das células T e que
algumas sub-classes desses linfócitos podem ser ativados a produzir NO (LIEW, 1995).
Segundo revisão de AKAIKE & MAEDA (2000), em algumas doenças virais, as
replicações desses ou de seus componentes induzem diretamente a expressão da NOS sem
a mediação por citocinas pró-inflamatórias, como o que ocorre na encefalite pelo HIV-1.
Portanto, a produção de NO por NOS pode contribuir diretamente para a patogênese da
demência associada ao HIV-1. Efeitos antivirais do NO são também conhecidos para
alguns tipos de vírus, principalmente DNA vírus, tais como o Epstein-Bar vírus e o Herpes
vírus. Alguns RNA vírus também sofrem efeito antiviral por parte do NO como o
Coxsackie vírus. Portanto, NO tem um papel complexo na resposta imunológica do
hospedeiro contra vírus.
O crescimento e a metastatização de tumores sólidos requer uma complexa
seqüência de eventos incluindo a proliferação celular, a formação de novos vasos
sanguíneos e a permeação através da membrana basal do sítio primário; o mesmo processo
ocorre novamente no sítio de uma metástase. O NO tem sido implicado tanto como agente
citotóxico quanto como promotor de crescimento tumoral, sendo, portanto, esses os dois
29
principais debates sobre o papel do óxido nítrico no desenvolvimento de tumores. Os
efeitos citotóxicos podem ocorrer através de dano direto sobre DNA, inibição de enzimas
envolvidas na síntese de ácidos nucléicos. Por outro lado o NO pode favorecer a
disseminação tumoral através da promoção da angiogênse. (BRENNAN et al, 1999)
ROSBE et al. (1995), investigando atividade do NO em carcinoma escamoso oral
concluíram que a NOS estava aumentada nesse tipo de neoplasia. A mesma conclusão foi
obtida por KLOTZ et al. (1999) trabalhando com carcinoma de próstata. LEJEUNE et al.
(1994), com base em trabalho experimental em modelo animal de carcinoma de colon,
demonstraram a ocorrência de diminuição de células mononucleares concomitante ao
aumento da produção de NO por macrófagos esplênicos. Com base nisso têm sugerido que
a produção de NO em sítios tumorais pode ser responsável pela imunossupressão induzida
por tumores que freqüentemente é observada.
Até o momento, pelos nossos conhecimentos, o papel do NO em relação à infecção
pelo HPV e à carcinogênese do colo uterino não tem sido relatada.
30
2 - OBJETIVOS
31
2. OBJETIVOS
2.1. Identificação e quantificação estromal de linfócitos T com marcação CD3+ e CD8+;
linfócitos B com marcação CD20+; macrófagos com marcação CD68+ e células que
expressam iNOS em mulheres sem lesões neoplásicas do colo uterino e com NIC III e
carcinoma invasivo estadiamento I.
2.2. Identificação e quantificação peri e intratumoral de linfócitos T com marcação CD3+ e
CD8+; linfócitos B com marcação CD20+; macrófagos com marcação CD68+ e células
que expressam iNOS em mulheres com carcinoma invasivo estadiamento I.
2.3. Comparar as proporções das diferentes populações linfocitárias, macrófagos e células que
expressam iNOS entre os três grupos acima.
2.3. Comparar as proporções peri e intratumoral das diferentes populações linfocitárias,
macrófagos e células que expressam iNOS em mulheres com carcinoma invasivo
estadiamento I.
32
3 - MATERIAL E MÉTODOS
33
3.1. MATERIAL
Foram analisados, retrospectivamente, cortes histológicos de colo uterino de 60
mulheres atendidas no ambulatório de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade Federal
do Triângulo Mineiro e que foram submetidas a procedimento cirúrgico de conização, alça
diatérmica, histerectomia ou cirurgia de Whertein-Meigs. Esses cortes foram divididos em
três conjuntos distintos, sendo um grupo controle formado por 20 mulheres sem evidência
histológica de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) ou carcinoma invasivo que se
submeteram a histerectomia abdominal total doença uterina benigna e sem anornalidades
cervicais; outro grupo com 20 mulheres com diagnóstico histológico de NIC III e um
grupo com 20 mulheres com diagnóstico histológico de carcinoma invasivo estadiamento I,
de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO). As peças
cirúrgicas foram obtidas nos arquivos da disciplina de Patologia Cirúrgica da mesma
instituição e os dados de caracterização das amostras foram acessados pela revisão de
prontuários. Para manutenção do sigilo da fonte das informações, cada mulher foi
identificada com um número, sendo que os números de 1 a 20 equivalem às pacientes do
grupo controle; 21 a 40, mulheres com NIC III e 41 a 60, mulheres com carcinoma
invasivo.
Critérios de inclusão nos grupos:
1 – Mulheres sem o diagnóstico de gravidez no momento da biópsia;
2 – Ausência de descrição no prontuário médico de sorologia positiva para o HIV
ou qualquer condição orgânica relacionada com imunossupressão;
3 – Mulheres sem história prévia de radioterapia para tratamento de neoplasia
ginecológica.
34
3.2. MÉTODOS
Todas as mulheres foram caracterizadas pela idade, o número de gravidezes e a
idade da primeira relação sexual. As amostras foram submetidas a método histoquímico e
imuno-histoquímico.
O trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Universidade Federal
do Triângulo Mineiro.
3.2.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A distribuição das mulheres segundo a idade e ao diagnóstico histológico é mostrada
nos Anexos I, II e III, sendo a média e desvio padrão dessa variável apresentadas no Gráfico
1.
Idade
75
Controle
NIC III
Invasivo
50
25
0
Controle
NIC III
Invasivo
Diagnóstico
Gráfico 1. Média e desvio padrão em relação à idade e ao diagnóstico histológico.
No grupo de pacientes controle, a idade variou entre 35 e 52 anos, com média e
desvio padrão de 43,9 ± 4,3 (Intervalo de Confiança de 95% variando entre 41,8 e 45,9) e
35
mediana de 43 anos; no grupo de mulheres com NIC III, a idade variou entre 22 e 63 anos,
com média de 35,5 ± 9,5 de desvio padrão (Intervalo de Confiança de 95% variando entre
31 e 39,9) e mediana de 32,5 anos; no grupo de mulheres com carcinoma invasivo, a idade
variou entre 26 e 73 anos, com média de 50 ± 11,2 de desvio padrão (Intervalo de
Confiança de 95% variando entre 44,7 e 55,2) e mediana de 50 anos.
Nos Anexos I, II, III estão dispostas as idades em que ocorreram a sexarca de cada
paciente nos 3 grupos. O Gráfico 2 mostra a média e desvio padrão dessa variável em
relação ao diagnóstico histológico.
Idade Sexarca
30
Controle
NIC III
Invasivo
20
10
0
Controle NIC III Invasivo
Diagnóstico
Gráfico 2. Média e desvio padrão em relação à idade da sexarca e ao diagnóstico
histológico.
No grupo de paciente controle, a análise foi feita em 19 pacientes em relação à
idade da primeira relação sexual porque constava no prontuário de uma paciente o fato da
mesma ser virgem no momento da cirurgia. Nesse grupo, a idade da sexarca variou entre
12 e 30 anos, com média e desvio padrão de 18,9 ± 4,3 (Intervalo de Confiança de 95%
36
variando entre 16,8 e 21) e mediana de 18 anos; no grupo de mulheres com NIC III, a
idade da sexarca variou entre 13 e 24 anos, com média de 17,6 ± 3,3 de desvio padrão
(Intervalo de Confiança de 95% variando entre 16 e 19,2) e mediana de 17 anos; no grupo
de mulheres com carcinoma invasivo, a idade da sexarca variou entre 12 e 23 anos, com
média de 16,4 ± 3,2 de desvio padrão (Intervalo de Confiança de 95% variando entre 14,9
e 17,9) e mediana de 16,5 anos.
Os Anexos I, II e III, correspondem à distribuição das pacientes segundo ao
número de gravidezes e ao diagnóstico histológico. A média e desvio padrão do número de
gestações são mostradas no Gráfico 3.
Nº de Gravidezes
15
Controle
NIC III
Invasivo
10
5
0
Controle
NIC III Invasivo
Diagnóstico
Gráfico 3. Média e desvio padrão em relação ao número de gravidezes e ao diagnóstico
histológico.
No grupo de mulheres do grupo controle, houve uma variação entre 0 e 8
gravidezes, com média e desvio padrão de 2,75 ± 2 (Intervalo de Confiança de 95%
variando entre 1,8 e 3,7) e mediana de 3 filhos; no grupo de pacientes com NIC III, o
número de gestações variou entre 1 e 17, com média e desvio padrão de 4,35 ± 3,8
37
(Intervalo de Confiança de 95% variando entre 2,6 e 6) e mediana de 3,5 gestações; no
grupo de pacientes com carcinoma invasivo, o número de gestações variou entre 1 e 13,
com média e desvio padrão de 6,25 ± 3,9 (Intervalo de Confiança de 95% variando entre
4,4 e 8,1) e mediana de 4 gestações.
3.2.2 – MÉTODO HISTOQUÍMICO
Os casos foram selecionados com base no laudo emitido por médicos patologistas
na época da cirurgia. As amostras de tecidos encontravam-se emblocadas em parafina.
Esses blocos foram separados, desparafinados em estufa e novamente incluídos em
parafina para estudo histológico atual, em conjunto com patologista.
Em cada caso realizou-se um corte de 5 µm e coloração pela HE:
a) Hematoxilina: 0,5 ml de hematoxilina + 5,0 ml de álcool absoluto + 10 g de
alúmem de potássio + 0,25 g de óxido velho de mercúrio + 100 ml de água
destilada;
b) Eosina: Eosina amarela hidrossolúvel 0,5 g + água destilada 100 ml + 90 ml de
álcool a 95°C + 1 gota de ácido acético;
c) Diferenciador: 100 ml de álcool a 95°C + 5 gotas de ácido clorídrico.
O método histoquímico foi realizado para a caracterização diagnóstica de ausência
de neoplasia, NIC III e carcinoma invasivo. Os critérios diagnósticos utilizados são
descritos abaixo:
a) Caracterizou-se ausência de neoplasia o corte histológico que apresentava epitélio
escamoso estratificado não queratinizado e epitélio cilíndrico sem a presença de
NIC ou carcinoma invasivo.
38
b) Caracterizou-se como NIC III o corte histológico que apresentava maturação
ausente ou confinada ao terço superficial do epitélio. Marcantes anormalidades
nucleares através de toda a espessura do epitélio. Figuras mitóticas numerosas e
encontradas em todos os níveis do epitélio. Frequentes anormalidades mitóticas.
c) Caracterizou-se como carcinoma invasivo o corte histológico que apresentava uma
considerável heterogeneidade com cordões de epitélio neoplásico infiltrando o
estroma fibroso da cervix. Presença de células individuais geralmente poligonais
com citoplasma eosinofílico e proeminente membrana celular.
3.2.3 – MÉTODO IMUNOHISTOQUÍMICO
Os casos que preencheram os critérios, após estudo histoquímico, foram separados,
sendo realizado em cada bloco, 15 cortes com lâmina em micrótomo de 5 µm de espessura.
Os cortes foram montados em lâminas preparadas com Poli-L-Lisina.
O protocolo e as soluções utilizadas seguiram descrição de BACHI et al. (1999) e
BOENISCH (2001) para a identificação de linfócitos T com marcação CD3+ e CD8+;
linfócitos B com marcação CD20+, macrófagos com marcação CD68+ e da iNOS2. Os
anticorpos primários e diluições são descritos abaixo:
39
ANTICORPO
MARCA
MARCAÇÃO
DILUIÇÃO
CD3+
Novocastra
Linfócito T
1/100
CD8+
Novocastra
Linfócito T
1/200
Citotóxico
CD20+
Novocastra
Linfócito B
1/400
CD68+
Novocastra
Macrófago
1/500
iNOS
Santa Cruz
iNOS
1/250
Biotecnology
Protocolo de Imunohistoquímica:
1.
As lâminas foram desparafinadas em xilol e hidratadas em álcoois decrescentes até
água destilada;
2.
Colocação das lâminas no suporte e submersas em Tampão Citrato (volume 200ml
para 20 lâminas);
3.
-
Realizada recuperação antigênica em panela a vapor:
Tampão Citrato pH 6,0 por 40 minutos em recipiente plástico.
4.
Esfriamento em temperatura ambiente por 30 a 40 minutos;
5.
Realizada a separação dos anticorpos, mantindos em geladeira a 4oC;
6.
Realizado o secamento das lâminas ao redor dos cortes, formando "janelas";
7.
Realizada lavagem em PBS (0,1M pH7.4)por 3 vezes, aspirando a cada lavagem;
8.
Pingou-se peróxido de hidrogênio a 3% por 20 minutos;
40
9.
Lavagem em PBS por 3 vezes, aspirando a cada lavagem;
10. Colocação das lâminas na bandeja e incubação no anticorpo primário correspondente a
cada corte. Realizada a colocação de água para formar uma câmara úmida, fechamento
e cobertura com compressa, protegendo da luz. Incubação over night em geladeira.
Obs: os anticorpos foram previamente diluídos em BSA e conservados em geladeira a
4oC;
11. Lavagem em PBS por 3 vezes, aspirando a cada lavagem;
12. Incubação no anticorpo secundário biotinilado por aproximadamente 1 hora;
13. Lavagem em PBS por 3 vezes, aspirando a cada lavagem;
14. As amostras foran incubadas com o complexo Streptoavidina-Biotina-Peroxidase da
marca Dako (LSAB 2 – Kit peroxidase código K0675) por aproximadamente 1 hora;
15. Lavagem em PBS por 3 vezes, aspirando a cada lavagem;
16. As lâminas foram deixadas em PBS;
17. A preparação do DAB ocorreu no momento do uso;
18. Aspiraração das lâminas e colocação do DAB, que foi deixado por aproximadamente 5
minutos;
19. Lavagem em água corrente;
20. Realizada a contracoloração com Hematoxilina de Harris sem ácido por
aproximadamente 30 segundos e após, lavagem em água corrente;
21. Realizado azulamento das lâminas em água amoniacal, posteriormente lavagem,
desidratação em álcoois e diafanização em xilol.
41
22. Realizada montagem das lâminas em entellan.
3.2.3.1 – Critério de Análise
Para a quantificação das células marcadas, utilizamos o critério de pontuações
adotado por GEORGIANNOS et al. (2003). As lâminas foram avaliadas por 2
observadores independentes e a categoria foi dada de acordo com a proporção de células
coradas: 0 = nenhuma; 1 = raras células; 2 = número moderado de células coradas; 3 =
número abundante de células coradas. Inicialmente as células foram observadas em
pequeno aumento (10 vezes) para obter uma impressão geral da distribuição das células,
em particular a contagem máxima, e em seguida examinada em detalhes (aumento de 400
vezes) para obtermos a pontuação final. As células coradas consideradas para análise
deveriam estar no estroma subjacente à junção escamo-colunar no grupo controle, no
estroma subjacente à NIC III e no tecido peri e intratumoral nos casos invasivos.
3.2.4 – MÉTODO ESTATÍSTICO E CONSTRUÇÃO DOS GRÁFICOS
Calculamos a concordância entre os 2 observadores utilizando o coeficiente de
Kappa (ARANGO, 2001). Para fins estatísticos, consideramos como intenso no Kappa as
pontuações 2 e 3, e fraco as pontuações 0 e 1. O coeficiente de Kappa para os 5 marcadores
foi de 0.86. Por fim, o resultado final foi obtido após avaliação conjunta dos casos
discordantes.
As proporções foram comparadas por meio do teste exato de Fisher. Os resultados
foram considerados significativos quando a probabilidade de rejeição da hipótese de
nulidade foi menor que 5% (p < 0,05).
Os gráficos foram construídos através da utilização do Programa GRAPHPAD
PRISM versão 3.0.
42
4 – RESULTADOS
43
4. RESULTADOS
Nos 60 casos estudados, nenhum foi excluído por divergência entre o diagnóstico
histológico emitido pelos médicos patologistas na época do procedimento e a revisão atual
das lâminas.
No Anexo IV estão descritos, individualmente, a quantificação dos linfócitos T
CD3+ e CD8+, linfócitos B CD20+, macrófagos CD68+ e das células que expressam a
iNOS das pacientes segundo o diagnóstico histológico. Também está descrita para as
pacientes com carcinoma invasivo, a quantificação peri e intratumoral.
A Tabela 1 mostra a distribuição da quantificação intensa e fraca dos linfócitos T
CD3+ em relação ao diagnóstico histológico.
Tabela 1. Distribuição das pacientes segundo a quantificação intensa e fraca de células T
CD3+ em relação ao diagnóstico histológico.
Controle
NIC III
Invasivo
n (%)
n (%)
N (%)
CD3+ Intenso 06 (31,6)*;** 16 (84,2)*;***
19 (100)**;***
CD3+ Fraco
13 (68,4)
03 (15,8)
0 (0)
TOTAL
19 (100)
19 (100)
19 (100)
Fisher: *P=0.025 (NIC III em relação ao controle)
**P<0,0001 (Invasivo em relação ao controle)
***P=0,2297 (Invasivo em relação a NIC III)
44
Observa-se nesta tabela maior quantificação intensa de linfócitos T CD3+, com
diferença estatisticamente significante, no grupo NIC III e invasivo em relação ao grupo
controle. Não se observa diferença entre o grupo invasivo e NIC III.
O Gráfico 4 mostra a distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de linfócitos T
CD3+ marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de GEORGIANNOS et
al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
**,***
(+)
Proporção (Intensa :
Fraca) de linfócitos T
CD3+
20
10
*,***
0
*,**
CONTROLE
NIC III
INVASIVO
Fisher: *P=0.025 (NIC III em relação ao controle)
**P<0,0001 (Invasivo em relação ao controle)
***P=0,2297 (Invasivo em relação a NIC III)
Gráfico 4. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de Linfócitos T CD3+ segundo
diagnóstico
histológico. (+) Não houve casos de infiltrado fraco para CD3
A Tabela 2 mostra a distribuição da quantificação intensa e fraca dos linfócitos T
CD8+ em relação ao diagnóstico histológico.
45
Tabela 2. Distribuição das pacientes segundo a distribuição intensa e fraca de células T
CD8+ em relação ao diagnóstico histológico.
CD8+ Intenso
Controle
NIC III
Invasivo
n (%)
n (%)
n (%)
04 (20,0)*;**
08 (42,1)*;*** 16 (88,8)**;***
CD8+ Fraco
16 (80,0)
11 (57,9)
02 (11,2)
TOTAL
20 (100)
19 (100)
18 (100)
Fisher: *P=0,4951 (NIC III em relação a controle)
**P<0,0001 (Invasivo em relação a controle)
***P=0,013 (Invasivo em relação a NIC III)
Observa-se nesta tabela maior concentração intensa de linfócitos T CD8+, com
diferença estatisticamente significante, no grupo invasivo em relação ao grupo NIC III e
controle. Não se observa diferença entre o grupo NIC III e controle.
O Gráfico 5 mostra a distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de linfócitos T
CD8+ marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de GEORGIANNOS et
al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
Proporção (Intensa :
Fraca) de Linfócitos T
CD8+
46
10.0
**,***
7.5
5.0
2.5
*,**
*,***
0.0
CONTROLE
NIC III
INVASIVO
Fisher: *P=0,4951 (NIC III em relação a controle)
**P<0,0001 (Invasivo em relação a controle)
***P=0,013 (Invasivo em relação a NIC III)
Gráfico 5. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de Linfócitos T CD8+ segundo
diagnóstico histológico
A Tabela 3 mostra a distribuição de quantificação intensa e fraca dos linfócitos B
CD20+ em relação ao diagnóstico histológico.
47
Tabela 3. Distribuição das mulheres segundo a quantificação intensa e fraca de células B
CD20+ em relação ao diagnóstico histológico.
CD20+ Intenso
Controle
NIC III
Invasivo
n (%)
n (%)
n (%)
03 (15,7)*;** 05 (26,3)*;*** 18 (100)**;***
CD20+ Fraco
16 (84,3)
14 (73,7)
0 (0)
TOTAL
19 (100)
19 (100)
18 (100)
Fisher: * P=1.3072 (NIC III em relação a controle)
**P<0,0001 (Invasivo em relação a controle)
***P<0,0001 (Invasivo em relação a NIC III)
Observa-se nesta tabela maior concentração intensa de linfócitos B CD20+, com
diferença estatisticamente significante, no grupo invasivo em relação ao grupo NIC III e
controle. Não se observa diferença entre o grupo NIC III e controle.
O Gráfico 6 mostra a distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de linfócitos B
CD20+ marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de GEORGIANNOS
et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
48
**,***
(+)
Proporção (Intensa :
Fraca) de linfócitos B
CD20+
20
10
*,***
*,**
0
CONTROLE
NIC III
INVASIVO
Fisher: *P=1.3072 (NIC III em relação a controle)
**P<0,0001 (Invasivo em relação a controle)
***P<0,0001 (Invasivo em relação a NIC III)
Gráfico 6. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de Linfócitos B CD20+ segundo
diagnóstico histológico. (+) Não houve casos de infiltrado fraco para CD20
A Tabela 4 mostra a distribuição de quantificação intensa e fraca de macrófagos com
marcação CD68+ em relação ao diagnóstico histológico.
49
Tabela 4. Distribuição das mulheres segundo a quantificação intensa e fraca de
macrófagos CD68+ em relação ao diagnóstico histológico.
CD68+ Intenso
Controle
NIC III
Invasivo
n (%)
n (%)
n (%)
01 (6,6)*;**
01 (6,6)*;*** 08 (53,3)**;***
CD68+ Fraco
14 (93,4)
14 (93,4)
07 (46,7)
TOTAL
15 (100)
15 (100)
15 (100)
Fisher: *P=1,5172 (NIC III em relação a controle)
**P=0,0142 (Invasivo em relação a controle)
***P=0,0142 (Invasivo em relação a NIC III)
Observa-se nesta tabela maior concentração intensa de macrófagos CD68+, com
diferença estatisticamente significante, no grupo invasivo em relação ao grupo NIC III e
controle. Não se observa diferença entre o grupo NIC III relação ao grupo controle.
O Gráfico 7 mostra a distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de macrófagos
CD68+ marcados pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de GEORGIANNOS
et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
Proporção (Intensa :
Fraca) de macrófagos
CD68+
50
1.5
**,***
1.0
0.5
*,**
*,***
0.0
CONTROLE
NIC III
INVASIVO
Fisher: *P=1,5172 (NIC III em relação a controle)
**P=0,0142 (Invasivo em relação a controle)
***P=0,0142 (Invasivo em relação a NIC III)
Gráfico 7. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de Macrófagos CD68+ segundo
diagnóstico histológico
A Tabela 5 mostra a distribuição de quantificação (Intensa : Fraca) de células que
expressam iNOS em relação ao diagnóstico histológico.
51
Tabela 5. Distribuição das mulheres segundo a quantificação intensa e fraca de células que
expressam iNOS em relação ao diagnóstico histológico.
iNOS Intenso
Controle
NIC III
Invasivo
n (%)
n (%)
n (%)
06 (30,0)*;**
07 (43,7)*;*** 15 (75,0)**;***
iNOS Fraco
14 (70,0)
09 (56,3)
05 (25,0)
TOTAL
20 (100)
16 (100)
20 (100)
Fisher: *P=0,500 (NIC III em relação a controle)
**P=0,0484 (Invasivo em relação a controle)
***P=0,0060 (Invasivo em relação a NIC III)
Observa-se nessa tabela maior concentração intensa de células que expressas iNOS,
com diferença estatisticamente significante, no grupo invasivo em relação ao grupo NIC III
e controle. Não se observa diferença entre o grupo NIC III e controle.
O Gráfico 8 mostra a distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de células que
expressam iNOS marcadas pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de
GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico
52
**,***
Proporção (Intensa :
Fraca) de células que
expressão iNOS
3
2
1
* ,***
* ,**
0
CONTROLE
NIC III
INVASIVO
Fisher: *P=0,500 (NIC III em relação a controle)
**P=0,0484 (Invasivo em relação a controle)
***P=0,0060 (Invasivo em relação a NIC III)
Gráfico 8. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de células com iNOS segundo
diagnóstico histológico
A Tabela 6 mostra a distribuição da quantificação intensa e fraca nos espaços
peritumoral e intratumoral de linfócitos T (CD3+ e CD8+), linfócitos B (CD20+), macrófagos
(CD68+) e de células que expressam iNOS de mulheres com carcinoma invasivo de colo
uterino.
53
Tabela 6. Distribuição das pacientes com carcinoma invasivo segundo a quantificação intensa
e fraca nos espaços peritumoral e intratumoral de linfócitos T (CD3+ e CD8+),
linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e de células que expressam iNOS.
Peritumoral
Intratumoral
Intenso
Fraco
Intenso
Fraco
n (%)
n (%)
n (%)
n (%)
CD3+
19 (100)*
0 (0)
1 (5,5)*
18 (94,5)
CD8+
16 (88,9)+
2 (11,1)
3 (16,7)+
15 (83,3)
CD20+
18 (100)°
0 (0)
0 (0)°
18 (100)
CD68+
8 (53,3)•
7 (46,7)
1 (6,7) •
14 (93,3)
iNOS
16 (80)∆
4 (20)
5 (25) ∆
15 (75)
Fisher: *P<0,0001 (CD3+ peritumoral em relação ao intratumoral)
+
P<0,0001 (CD8+ peritumoral em relação ao intratumoral)
°
P<0,0001 (CD20+ peritumoral em relação ao intratumoral)
•
P<0,0142 (CD68+ peritumoral em relação ao intratumoral)
P<0,0012 (iNOS peritumoral em relação ao intratumoral)
∆
Observa-se nesta tabela maior quantificação intensa de linfócitos T (CD3+ e CD8+),
linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e de células que expressam iNOS no espaço
peritumoral em relação ao intratumoral.
O Gráfico 9 mostra a distribuição proporcional (Intensa : Fraca) nos espaços peri e
intratumoral de linfócitos T (CD3+ e CD8+), linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e
54
de células que expressam iNOS marcados pela imunohistoquímica de acordo com
protocolo de GEORGIANNOS et al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
Proporção (Intensa : Fraca) de linfócitos T e B,
macrófagos e células que expressam iNOS
peritumoral e intratumoral em mulheres com
carcinoma invasivo de colo uterino
Peritumoral
20.0
Intratumoral
*
°
17.5
15.0
12.5
10.0
+
7.5
5.0
∆
2.5
•
0.0
+
*
CD3+
CD8+
°
•
CD20+
CD68+
∆
iNOS
Fisher: *P<0,0001 (CD3+ peritumoral em relação ao intratumoral)
+
P<0,0001 (CD8+ peritumoral em relação ao intratumoral)
°P<0,0001 (CD20+ peritumoral em relação ao intratumoral)
•
P<0,0142 (CD68+ peritumoral em relação ao intratumoral)
P<0,0012 (iNOS peritumoral em relação ao intratumoral)
∆
Gráfico 9. Distribuição proporcional (Intensa : Fraca) nos espaços peri e intratumoral de
linfócitos T (CD3+ e CD8+), linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e
iNOS em neoplasias invasivas do colo uterino.
55
O Gráfico 10 mostra a distribuição proporcional (Intensa : Fraca) de linfócitos T
(CD3+ e CD8+), linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e células que expressam
iNOS marcadas pela imunohistoquímica de acordo com protocolo de GEORGIANNOS et
Proporção Intenso : Fraco de
células marcadas por
Imunohistoquímica
al. (2003), segundo diagnóstico histológico.
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
CD3+
CD8+
CD20+
CD68+
iNOS
Controle
NIC III
Invasivo
Invasivo
Peritumoral Intratumoral
Diagnóstico Histológico
Gráfico 10. Distribuição da proporção (Intensa : Fraca) de linfócitos T (CD3+ e CD8+),
linfócitos B (CD20+), macrófagos (CD68+) e células que expressam iNOS em
pacientes do grupo controle, portadoras de NIC III e carcinoma invasivo de
colo uterino nos espaços peri e intratumoral.
56
5 - DISCUSSÃO
57
5. DISCUSSÃO
Em todo o mundo, o câncer do colo uterino é a segunda causa de morte por
neoplasia maligna em mulheres. Estima-se que a cada ano sejam diagnosticados 500.000
novos casos. Entre as populações há grandes diferenças nas taxas de incidência dessa
neoplasia (SCHOELL et al., 1999). A história natural do carcinoma do colo uterino foi
alterada pela introdução de programas de rastreamento que favoreceram a detecção
precoce e redução das taxas de mortalidade (WALSH et al., 1995).
Em estudo epidemiológico realizado no Brasil, CAVALCANTI et al., 2000,
encontraram média de idade de 36,7 anos para mulheres com diagnóstico de NIC II/III e de
47,3 anos para pacientes com carcinoma invasivo. Esta média é muito semelhante à
encontrada por nós neste estudo. Na amostra estudada, as pacientes com NIC III
apresentaram média de idade em torno de 35 anos, enquanto que as mulheres com
carcinoma invasivo, média de 50 anos. Também, segundo MOUGIN et al. (2001), as NIC
II e III ocorrem preferencialmente em mulheres com idade entre 35 e 40 anos de idade.
O início da atividade sexual precoce tem sido identificado em vários estudos como
o mais importante fator de risco epidemiológico para o desenvolvimento de neoplasia
intra-epitelial cervical porque durante a adolescência, a cérvice, especificamente a zona de
transformação é particularmente susceptível à indução de carcinogênese por agentes
oncogênicos de transmissão sexual (ECONOMOS et al., 1994). Segundo HARRIS et al.
(1980), essa susceptibilidade ocorre em função da metaplasia resultante da ectopia que
surge durante a adolescência. EDEBIRI (1990) em um estudo do tipo caso-controle
envolvendo mulheres com NIC atendidas numa clínica de colposcopia encontrou diferença
estatisticamente significante, com risco relativo de 3,64, quando a idade da primeira
relação sexual era abaixo de 18 anos de idade. Esse achado não é corroborado por
58
HARAHAP (1986), que não encontrou influência significante da idade da primeira relação
sexual e o desenvolvimento de NIC. Em nosso estudo observamos uma menor média de
idade de início da atividade sexual nas pacientes com carcinoma invasivo, seguido das
pacientes com NIC III e por fim no grupo controle, sendo que nas duas primeiras, a média
de idade da sexarca foi abaixo dos 18 anos.
Outro fator epidemiológico descrito de maior associação com o carcinoma de colo
uterino é a multiparidade. EDEBIRI (1990) não encontrou diferença estatística entre
pacientes nulíparas e multíparas em relação à incidência de NIC. Encontramos maior
média de gravidezes em mulheres com carcinoma invasivo, seguidas das mulheres com
NIC III e menor média nas mulheres do grupo controle. Nossos resultados estão de acordo
com os encontrados por MUNOZ et al. (2002) que compilaram dados de oito estudos
desenvolvido em 4 continentes sobre carcinoma invasivo cervical e dois estudos sobre
carcinoma in situ, tendo encontrado uma associação direta entre o número de gestações a
termo e o risco de carcinoma cervical, sendo de 3,8 o risco relativo quando comparadas
pacientes com sete ou mais gestações com nulíparas e de 2,3 vezes com mulheres que
tiveram uma ou duas gestações a termo. Os mecanismos exatos que justifiquem maior
associação entre o maior número de gestações e o desenvolvimento de carcinoma invasivo
são ainda desconhecidos (HILDESHEIM et al., 2001). Possíveis explicações incluem a
influência de hormônios endógenos, nutrição e modulação da resposta imune ao HPV pela
gravidez (HILDESHEIM et al., 2001; BARTHOLOMEUW et al., 1998; FIFE et al., 1999).
A associação entre a infecção pelo HPV e a neoplasia cervical parece ser mais forte do
que a existente entre o tabagismo e o carcinoma de pulmão. Pelo menos 20 tipos oncogênicos
de HPV têm sido identificados em mais de 95% das lesões pré-invasivas e invasivas, sendo o
HPV do tipo 16 o mais comum. A detecção desse vírus é importante para identificar aquelas
pacientes que podem ser de alto risco para o desenvolvimento de neoplasia cervical
59
(EINSTEIN & GOLDBERG, 2002). O principal fator que permite a progressão para NIC II e
III é o persistente achado da infecção pelo HPV (RIETHMULLER et al., 2002). O HPV
infecta a camada basal do epitélio na região de metaplasia e da zona de transformação da
cérvice uterina, onde as células se apresentam mais vulnerávies (MANDIC & VUJKOV,
2004). A infecção genital pelo HPV representa uma DST muito freqüente, talvez a mais
comum. Por um lado, esta infecção é geralmente passageira e assintomática, induzindo uma
efetiva resposta imune que permite a cura da infecção; por outro lado, ela pode ser
responsável por uma lesão intra-epitelial que pode progredir para o carcinoma invasivo
(RIETHMULLER et al., 2002).
As células pré-malignas e malignas se originam como resultado da integração do
DNA do HPV ao genoma celular do hospedeiro que induz a expressão dos oncogenes
virais E6 e E7. As células adquirem uma vantagem proliferativa de escapar do controle de
crescimento exercido pela produto dos genes p53 e Rb. Ambas proteínas celulares são
inativadas respectivamente pelas proteínas E6 e E7 (MOUGIN et al., 2001).
Pouco é conhecido sobre a duração das lesões cervicais pré-cancerosas em relação
à infecção pelo HPV. Lesões precursoras da cérvix persistem mais tempo e progridem mais
rapidamente em mulheres com infecção por HPV oncogênicos do que em portadoras de
infecção por HPV não oncogênico ou sem HPV. Testes de lesões cervicais para HPV
oncogênicos podem ajudar a identificar aquelas pacientes que são mais prováveis de
progredir rapidamente (SCHLECHT et al., 2003). Segundo WALSH (1995), o intervalo de
tempo para o desenvolvimento do câncer invasivo a partir do carcinoma in situ é variável,
podendo oscilar entre curtos intervalos até 13 anos. Em nosso estudo, a média de tempo em
idade entre as pacientes com NICIII e carcinoma invasivo foi de aproximadamente 13
anos, com diferença estatisticamente significante. Esse achado reforça a idéia de que o
carcinoma de colo uterino possui história natural longa. Nos carcinomas, o DNA viral está
60
integrado ao genoma do hospedeiro e nenhuma produção viral é detectada (SCHOELL et
al., 1999).
O carcinoma de colo uterino representa um sistema ideal de estudo de
carcinogênese em função de possuir um estágio pré-canceroso bem definido (BELL et al.,
1995). A presença do HPV por si só não é suficiente para a evolução da doença (PARKIN
et al., 2005). Os estágios pré-invasivos bem definidos, assim como os fatores virais
envolvidos ao nível molecular, tornam o carcinoma do colo uterino um bom modelo para
investigação de alternativas terapêuticas imunológicas (SCHOELL et al., 1999).
O processo de carcinogênese é atualmente visto como uma série de passos que
envolvem a inativação de genes supressores de tumor e ativação de oncogenes. Ambos os
tipos de mudança genética envolvem dano sobre o DNA em forma tanto de mutações
quanto deleções (TAMIR & TANNENBAUM, 1996). A homeostase em tecidos normais é
mantida através da regulação da proliferação e morte celular. Sinais externos e internos
podem tanto iniciar quanto inibir a proliferação celular e apoptose. Durante a
carcinogênese, lesões genéticas acumuladas em células displásicas e neoplásicas, geram
um desequilíbrio entre as vias regulatórias do crescimento e morte celular (AMBS et al.,
1997).
Informações sobre a distribuição histológica de leucócitos no trato genital são
escassas, embora a imunidade local seja importante (JOHANSSON et al., 1999). O sistema
imune ao nível genital é principalmente programado para desencadear uma resposta
humoral. Entretanto, IgA secretora, que é particularmente eficiente para imunidade antiinfecciosa ao nível das mucosas, está presente em quantidades muito pequenas em
secreções vaginais fisiológicas (RIETHMULLER & SEILLES, 2000).
A presença de células imunocompetentes tem frequentemente estado associada com
melhora no prognóstico. Muitos tumores e suas metástases são circundados por infiltrados
61
de leucócitos incluindo linfócitos T e B, células NK e macrófagos, sugerindo uma resposta
do hospedeiro ao tumor (BETHWAITE et al., 1996).
A carcinogênese cervical inclui a infecção pelo HPV, a persistência, progressão às
lesões pré-cancerosas e a invasão. A persistência e progressão envolvem uma complexa
interação entre o vírus e fatores do hospedeiro como a carga viral, susceptibilidade
genética, resposta imune contra o HPV e eventos moleculares associados com a
progressão. A resposta imune é essencial para conter tanto a infecção pelo HPV quando as
lesões neoplásicas associadas a esse vírus (DANERI-NAVARRO et al., 2005). A diferença
entre a resposta inflamatória benéfica e a prejudicial é um processo complexo. É proposto
que nos tumores isto seja uma transformação gradual, que depende não só do tipo tumoral
como também dos mediadores que são produzidos no microambiente tumoral e que dão
suporte para a natureza nociva da inflamação (BEN-BARUCH, 2006). Demonstramos
nesse estudo a existência de linfócitos T CD3+ e CD8+, linfócitos B CD20+ e macrófagos
no córion cervical de mulheres sem lesão neoplásica, com predomínio dos primeiros. Essa
demonstração foi importante para a realização das comparações com pacientes do grupo
NIC III e carcinoma invasivo. Um questionamento que poderia ser feito neste estudo seria
o da capacidade funcional e numérica dos linfócitos não ser tão eficaz em mulheres mais
velhas, uma vez que houve diferença estatística da média de idade entre os grupos controle
e NIC III e entre os grupos NIC III e carcinoma. Entretanto, WHITE et al.(1997),
demonstraram manutenção da capacidade citotóxica e, portanto a imuno-competência
cervical de linfócitos T CD3+ e CD8+ em pacientes sem lesões neoplásicas,
independentemente da idade. HACHISUGA et al. (2001), em estudo da resposta imune
local de pacientes com carcinoma de colo uterino com idade variando entre 26 e 74 anos
(média de 53), não encontraram diferença significativa na concentração de linfócitos T em
62
relação à idade. Dessa forma pode-se inferir que tanto em relação ao número, quanto em
relação à citotoxicidade, a idade não altera a função de linfócitos T ao nível local.
Os nossos achados mostraram que houve um aumento estatisticamente significante
da população de linfócitos T CD3+ no córion de pacientes com NIC III em relação ao
grupo controle. O infiltrado de linfócitos no sítio da neoplasia pode determinar o
prognóstico clínico da infecção (persistência, regressão, progressão). Estudos prévios da
população linfocitária infiltrando a cérvix displásica tem usado imunohistoquímica e tem
demonstrado significantes infiltrados T citotóxicos (CD8+), auxiliares (CD4+) e linfócitos
B (CD20+) no estroma abaixo da lesão (BELL et al., 1995).
É conhecido que a maioria dos tumores humanos alberga infiltrado inflamatório
crônico, incluindo linfócitos (OKADA et al., 1989), provavelmente com reatividade
específica a tumores autólogos (HILDERS, 1994; VOSE & MOORE, 1985).
Evidenciamos um aumento estatisticamente significante da população tanto de linfócitos T
CD3+ e CD8+ e linfócitos B CD20+ no córion de pacientes com carcinoma invasivo em
relação ao grupo controle. Embora seja conhecido que o sistema imune pode reconhecer
tumores como não próprios e destruí-los, há vários caminhos pelos quais os tumores
podem escapar da destruição, incluindo falência de células efetoras, perda das moléculas
do complexo de histocompatibilidade principal (CHP) nas células tumorais, expressão de
genes anti-apoptóticos, produção de fatores supressores, disfunção e supressão de
linfócitos T por células imuno-reguladoras (DANERI-NAVARRO, 2005). Apesar dessas
observações, até o momento, apenas poucas publicações têm surgido que demonstram a
geração de linfócitos T citotóxicos específicos contra as oncoproteínas em pacientes com
câncer cervical, sugerindo que os precursores desses linfócitos podem estar presentes em
concentrações muito baixas (SANTIN, 1999).
63
Mostramos neste estudo que em pacientes com NIC III houve maior proporção de
infiltrado celular intenso de linfócitos T CD3+ do que de linfócitos B CD20+. Conforme
demonstrado por outros autores, as lesões neoplásicas do colo uterino se associam
fortemente à infecção pelo HPV. Há claras evidências de que a resposta imune celular
desenvolve o principal papel no controle e curso da infecção pelo HPV. Esta resposta varia
de acordo com o grau da lesão e o potencial oncogênico do HPV (RIETHMULL ER &
SEILLES, 2000). DIETL et al. (1990) em estudo imunohistoquímico para determinar o
infiltrado linforreticular em carcinoma invasivo do colo uterino encontraram que os
linfócitos T predominavam dentro do estroma tumoral, enquanto os linfócitos B foram
encontrados em menores números. Achado semelhante já foi descrito em outros tipos de
tumores como melanoma, câncer de mama e metástases em linfonodos axilares
(KORSTEN et al., 1983; HORNY & HORST, 1986; HORST & HORNY, 1987
OKADA et al. (1989) em estudo que avaliou infiltrado linfocitário extraído de
tumores ginecológicos em cultura e posteriormente submetidos a citometria de fluxo,
encontraram maior quantidade de linfócitos T CD3+, com predomínio de T CD8+. Nesse
estudo em treze de quatorze pacientes com estadiamento inicial (I e II) houve predomínio
de CD8+, independentemente do tipo histológico, sendo que em quatro os linfócitos CD8+
expressavam citotoxicidade específica contra apenas células tumorais autólogas, sugerindo
a existência de antígenos tumorais específicos em tumores humanos. Vários estudos
imunológicos em carcinoma cervical têm demonstrado altos níveis de infiltrados de células
mononucleares, consistindo predominantemente de linfócitos T CD8+ (HILDERS, 1994;
FERGUSON et al., 1985). Acredita-se que esses linfócitos presentes in situ no carcinoma
cervical representem mais uma interação específica direcionada ao tumor do que uma
resposta inflamatória por causa da sua presença em associação com a expressão da CHP
classe I das células tumorais (HILDERS, 1994; HILDERS et al.., 1993). Em nosso
64
trabalho, nas mulheres com carcinoma invasivo, encontramos grande infiltrado
inflamatório peritumoral linfócitos T (CD3+ e CD8+), B (CD20+), macrófagos (CD68+) e
de células que expressam iNOS, sem correspondência intratumoral. Tal achado permitenos especular a hipótese de que esse infiltrado possa não estar relacionado a uma resposta
específica ao tumor ou de que existam fatores produzidos pelo tumor que impedem a
entrada e a atividade desses linfócitos.
Ao contrário do que ocorre em pacientes sem lesão neoplásica do colo uterino, o
potencial citolítico de linfócitos isolados de carcinoma cervical geralmente é baixo ou não
expresso. Esta característica é desencadeada provavelmente pelo microambiente do tumor,
o qual afeta profundamente a capacidade citotóxica das células imunes (HILDERS, 1994).
Tem sido mostrado em estudos funcionais que o microambiente tumoral é propenso a
suprimir ou mesmo paralisar as células linforreticulares infiltrantes (DIETL et al, 1990).
OKADA et al. (1989), estudando pacientes com tumores avançados demonstraram que a
proliferação e resposta citolítica específica de linfócitos T CD8+ foram inibidas por um
fator supressivo, presumivelmente derivado do tumor. A redução ou perda das moléculas
CHP classe I e também um defeito na apresentação de antígenos aos linfócitos citotóxicos
(CD8+) pode em parte explicar a citotoxicidade deficiente (RIETHMULLER & SEILLES,
2000).
Conforme revisto na introdução, as lesões neoplásicas do colo uterino se associam
fortemente com a infecção pelo HPV e, de acordo com RIETHMULLER & SEILLES
(2000), uma deficiência na indução do mecanismo de citotoxicidade celular parece estar
envolvido na persistência à infecção pelo HPV e também na carcinogênese do colo uterino.
Os macrófagos são as principais células fagocitárias do sistema imune e podem
internalizar partículas mais rápida e eficientemente que outras. Após a fagocitose de
partículas externas, o macrófago é capaz de realizar a degradação intracelular e a
65
apresentação de fragmentos de peptídeos na sua superfície celular, associado ao CHP II,
atuando como célula apresentadora de antígenos (WU et al, 2004). Os macrófagos podem
atuar como células fagocitárias inespecíficas ou induzir a morte de células neoplásicas,
através da produção de mediadores, que estimulam o sistema imune, ou por mecanismos
como citotoxicidade e apoptose, inibindo ou reduzindo o crescimento tumoral (ALSARIREH & EREMIN, 2000). Encontramos nesse trabalho uma maior concentração de
macrófagos em mulheres com carcinoma invasivo quando comparadas ao grupo controle.
Achado semelhante foi verificado por DAVIDSON et al, 1997. Como a contagem dessas
células não teve aumento significativo nas mulheres portadoras de NIC III, é possível que
o aumento observado no grupo invasivo possa refletir mais uma reação estimulada pela
invasão estromal do tumor.
Apesar de milhares de publicações sobre o papel do NO na saúde e na doença, esta
minúscula molécula ainda esconde muitos mistérios. Encontramos nesse estudo expressão
da enzina iNOS no córion de pacientes sem lesão neoplásica, com NIC III e carcinoma
invasivo. Ocorreu aumento significativo da expressão dessa enzima quando comparado
pacientes com carcinoma invasivo em relação às dos grupo controle e NIC III. Pelo nosso
conhecimento esta é a primeira vez que essa comparação é feita em colo uterino.
Estudos recentes têm examinado a expressão e atividade das três isoformas da NOS
em cânceres humanos. Um aumento dos níveis de atividade e/ou expressão de NOS foi
observada em tumores ginecológicos, mama e sistema nervoso central. No caso dos
cânceres ginecológicos e de mama, este aumento da expressão foi inversamente
proporcional ao grau de diferenciação do tumor (AMBS et al., 1997; THOMSEN et al.,
1994; THOMSEN et al., 1995; COBBS et al., 1995). ROSBE et al. (1995), investigando
atividade do NO em carcinoma escamoso oral concluíram que a NOS estava aumentada
66
nesse tipo de neoplasia. A mesma conclusão foi obtida por KLOTZ et al. (1999),
trabalhando com carcinoma de bexiga.
Os efeitos do NO sobre as células são dependentes da dose. É provável que o NO
em concentrações fisiológicas seja necessário para a proliferação das células T, podendo
inclusive proteger alguns tipos celulares de dano e apoptose. Em altas concentrações,
entretanto, exerce efeito inibitório na proliferação celular, podendo ter ações citostáticas e
citotóxicas (LIEW, 1995). A produção persistente de NO pela iNOS pode ser capaz de
levar à exaustão os mecanismos de defesa celular normalmente muito bem desenvolvido
(AMBS et al., 1997). Os principais alvos do NO são enzimas com grupamentos de ferro e
enxofre. A citotoxicidade do NO pode causar necrose celular (HO et al., 1996; AMBS et
al., 1997).
Tem sido mostrado que o NO modula vários mecanismos imunes, desenvolvendo
um papel na indução de imunidade tanto específica quanto inespecífica e uma resposta
anti-microbiana a uma variedade de parasitas extracelulares e algumas células tumorais.
NO derivado da iNOS pode regular a proliferação de células T, produção de citocinas e
apoptose (BLESSON et al., 2002). Esse fato poderia justificar o aumento da população
linfocitária em relação ao controle nas pacientes com carcinoma invasivo peritumoral
encontradas nesse estudo, uma vez que tanto linfócitos T (CD3+ e CD8+) quanto B
(CD20+) se correlacionaram com a expressão da enzima NOS. Entretanto, existem
evidências que indicam que NO derivado de macrófagos pode inibir a resposta linfocitária
(MEDOT-PIRENNE et al., 1999). Tem sido notado que o NO produzido por células
tumorais humanas pode por sua vez favorecer o crescimento tumoral através de um
mecanismo de paralisar a função de células T imunes (BLESSON et al., 2002; MEDOTPIRENNE et al., 1999). LEJEUNE et al. (1994), têm sugerido que a produção de NO pelos
tumores pode ser responsável pela imunossupressão freqüentemente observada nos
67
mesmos. Segundo BLESSON et al. (2002) o NO não influencia na sobrevivência de
células T. Entretanto, interfere com a ativação das mesmas através da inibição seletiva da
geração linfócito T citotóxico (CD8+) por regular negativamente o receptor de IL2 de
células em repouso. Isto sugere que NO pode desenvolver um papel durante o processo de
diferenciação ou na fase de resposta indutiva de linfócito T CD8+, afetando a diferenciação
dos precursores desses linfócitos em efetores maduros.
O mecanismo preciso pelo qual a defesa do hospedeiro a tumores malignos é
mediada in vivo é desconhecido até o momento. As células cancerosas podem servir de
gatilho para uma resposta imune, a qual por sua vez pode limitar o desenvolvimento do
tumor (FARIAS-EISNER et al., 1994). Estudos in vitro indicam que certas citocinas são
capazes de ativar macrófagos e induzir a síntese de NO, exercendo, portanto, efeito
citostático e/ou citolítico (PACE et al., 1983; LORSBACH et al., 1993; FARIAS-EISNER
et al., 1994).
MACLEAN et al. (1998), descreveram que em ratos deficientes em iNOS ocorre
estimulo da resposta Th1 seguindo a infecções ou estimulação antigênica. A inibição da
proliferação de células Th1 pelo NO pode ser revertida pela adição de IL-2 exógena, mais
não por IFN-γ. Esses resultados sugerem que NO inibe a expansão das células Th1 por
bloquear a secreção de IL-2, a qual é um mediador autócrino da função das células T
(LIEW, 1995).
Outro modo que o NO pode influenciar a função das células T é através da
modulação da apresentação de antígenos pela regulação negativa da expressão das
moléculas de classe II do CHP nas células apresentadoras de antígeno (LIEW, 1995;
SICHER et al., 1994).
Além das supostas ações do NO atuando na citotoxicidade de linfócitos T, outras
ações dessa molécula poderiam contribuir para o processo de carcinogênese cervical. A
68
maioria dos relatos implica que o próprio NO ajuda no crescimento tumoral, facilita a
disseminação e ativamente promove angiogênese (ORUCEVIC et al., 1996; BREENAN,
2000). A citotoxicidade pode ocorrer através de numerosos mecanismos, incluindo dano
direto sobre o DNA, inibição de enzimas envolvidas na síntese de DNA e RNA, assim
como naquelas envolvidas na geração de ATP na cadeia transportadora de elétrons
(MILLS, 1991; BREENAN, 2000).
TAMIR & TANNENBAUM (1996), demonstraram que a produção elevada de NO
pode favorecer a citotoxicidade, que por sua vez, quando crônica, poderia estimular a
replicação celular a qual é um fator de risco para a maioria dos cânceres (AMES & GOLD,
1990). Através de uma variedade de mecanismos, as células expostas ao NO sofrem dano
no DNA. O tipo de lesão que ocorre inclui modificação das bases e quebra tanto na fita
simples quanto na dupla. O sucesso no reparo desse dano favorecerá a recuperação,
entretanto, reparo insuficiente resultará em uma combinação de mutagênese e morte
celular. A contínua exposição ao NO ao longo do tempo favorecerá o acúmulo de
populações celulares, com ativação de oncogenes ou inativação de genes supressores de
tumor.
Está claro que o crescimento de tumores sólidos é regulado por interações entre
células endoteliais da vasculatura do tumor, células imunes infiltrantes da neoplasia e as
células tumorais entre si. A maioria desses componentes celulares tem sido mostrada
gerararem NO que funciona como um mensageiro intra e intercelular, sugerindo que este
mediador é um componente essencial do microambiente tumoral (BLESSON et al., 2002;
CHOUAIB et al., 1997; JENKINS et al., 1994; LAMAS et al., 1992; RADOMSKI et al.,
1991).
A função primária das células produtoras de NO em um sítio inflamatório é realizar
a inibição ou destruição de organismos estranhos e reparação tissular. Entretanto, em
69
situações onde infecções ou inflamações continuam ao longo de meses ou anos, ocorrerá o
efeito colateral não desejado danoso sobre as células vizinhas. Experimento em ratos com
diferentes estímulos inflamatórios tem mostrado inequivocamente que a inibição da NOS
interrompe os sintomas da doença inflamatória. Esta é a lógica que associa o NO a um
risco aumentado de câncer (TAMIR & TANNENBAUM, 1996).
O crescimento e metastatização de tumores sólidos requerem uma complexa
seqüência de eventos incluindo a proliferação celular, a formação de nossos vasos
sanguíneos e a permeação através da membrana basal no sítio primário; o mesmo processo
ocorre novamente no sítio das metástases (BRENNAN, 2000). Como resultado do aumento
da produção do NO pode ocorrer hiper-permeabilidade via interação com fatores de
crescimento endotelial. Esse fato poderia favorecer o escape de células tumorais na
circulação e representaria o primeiro passo na metástase (WU et al., 1992; BREENAN,
2000). A expressão e atividade da NOS tem sido encontrado ser maior na grande parte dos
tumores, comparado ao tecido normal adjacente, exceto no carcioma de células renais e
colorretal, onde ele aparece em concentrações mais baixas (BREENAN, 2000; JANSSON
et al., 1998; MOOCHHALA et al., 1996).
Conforme vastamente descrito na literatura, o processo de carcinogênese cervical é
um processo lento, podendo levar anos. Embora nosso trabalho não tivesse cunho de
avaliação funcional, alguns aspectos do mesmo chamam atenção e merecem ser
destacados. É intrigante o fato de que as pacientes com NIC III, apesar de não constituir
neoplasia invasiva, apresentarem um infiltrado de linfócitos T CD3+ no estroma subjacente
estatisticamente significante em relação às pacientes do grupo controle. O mesmo não
ocorreu em relação aos linfócitos T CD8+. Embora não tivesse sido objetivo desse estudo
analisar o infiltrado de linfócitos T CD4+, os achados descritos permitem-nos especular
que provavelmente são esses os linfócitos T que se elevam no NIC III. Outro achado
70
interessante foi a elevação, de modo significante em relação ao controle, tanto de linfócitos
T (CD3+ e CD8+), linfócitos B CD20+, macrófagos CD68+ e de células que expressam
iNOS. Outro aspecto mais interessante foi o comportamento semelhante, em termos de
proporção, das curvas de macrófagos CD68+, iNOS e linfócitos T CD8+. Destacamos
também a grande elevação de linfócitos B CD20+ na região peritumoral, sendo inferior
apenas à elevação de linfócitos T CD3+. Finalmente chamamos atenção para o fato de que
apesar desse grande infiltrado inflamatório peritumoral de todas as células testadas, poucas
ou nenhuma foram encontradas no interior do tumor. Com base em dados da literatura já
descritos e nos achados supramencionados, podemos construir um modelo hipotético para
justificar nossos resultados. O NIC III representaria uma doença sistêmica produtora de
citocinas capazes de estimular a migração de linfócitos T CD3+, provavelmente com
predomínio de linfócitos T CD4+. Uma dessas citocinas, IL-10 já foi encontrada em
pacientes com NIC III significativamente aumentada em relação a controles por
RESENDE (2005). Conforme descrito a IL-10 exerce efeito inibidor sobre a produção de
IL-12 e IFN-γ, chaves da resposta tipo Th1. Essa inibição da produção de IFN-γ em
pacientes com NIC III talvez justifique o achado de não significância em relação às
pacientes controle de macrófagos CD68+ e iNOS, uma vez que macrófagos ativados são os
principais indutores da expressão dessa sintase e da produção de NO. Podemos especular,
portanto, que em pacientes com NIC III possa haver predomínio da resposta Th2. Dessa
forma, resposta imune à NIC III ocorreria através da produção de moléculas de anticorpos
e não por células. Partindo-se do princípio que a doença invasiva pode ser vista como uma
evolução da NIC III e associado ao fato de termos estudado câncer de colo uterino inicial,
é possível que o grande influxo peritumoral de linfócitos B CD20+ que ocorra nessas
pacientes seja o resultado do predomínio Th2 na fase antecessora. O comportamento de
linfócitos T CD8+, macrófagos CD68+ e células que expressam iNOS é semelhante desde
71
o controle até a doença invasiva, sendo que a elevação de linfócitos T CD8+ é
proporcionalmente menor à elevação de linfócitos T CD3+. Provavelmente, a partir do
momento que ocorre a invasão, ocorra migração de macrófagos para o sítio tumoral que
após ativados induzem a expressão da iNOS com a conseqüente produção de NO. Esse gás
talvez exerça efeito inibitório sobre a proliferação de linfócitos T CD8+. Embora haja
elevação de linfócitos T e B, macrófagos e iNOS no espaço peritumoral, essas células têm
pouca penetração no leito intratumoral, sugerindo que ocorra a produção de fatores no
microambiente tumoral que o mesmo escape do mecanismo de resposta imune.
Tais hipóteses necessitam ser testadas. Dessa forma, entender o repertório de
citocinas durante a ativação de linfócitos T, B e macrófagos, assim como suas interrelações com o NO pode ser um passo decisivo no entendimento da carcinogênese cervical.
72
6 – CONCLUSÃO
73
6. CONCLUSÃO
A análise desse trabalho nos permite concluir que:
6.1. Mulheres sem lesão neoplásica do colo uterino e com NIC III expressam infiltrado
inflamatório estromal constituído por linfócitos T com marcação CD3+ e CD8+,
linfócitos B com marcação CD20+, macrófagos e a enzima iNOS.
6.2. Mulheres com carcinoma invasivo de colo uterino estadiamento I (FIGO) expressam
infiltrado inflamatório peritumoral e intratumoral constituído por linfócitos T com
marcação CD3+ e CD8+, linfócitos B com marcação CD20+, macrófagos e a enzima
iNOS.
6.3. O infiltrado inflamatório das diferentes populações linfocitárias, macrófagos e células que
expressam iNOS foi sempre maior no grupo com carcinoma invasivo, seguido do grupo
com NIC III e controle.
6.4. Nas mulheres com neoplasia invasiva observou-se maiores concentrações peritumorais
em relação à concentração intratumoral de linfócitos T CD3+ e CD8+, linfócitos B,
macrófagos e células que expressam iNOS.
Esses dados permitem-nos concluir que há variação no perfil imunológico local
durante o processo de carcinogênese do colo uterino. O NO pode ter papel nesse processo.
74
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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84
ANEXOS E FIGURAS
85
Anexo I - Distribuição das mulheres do grupo controle segundo a idade, sexarca e ao
número de gravidezes.
CASO
IDADE
SEXARCA
Nº GRAVIDEZES
1
43
19
2
2
35
30
0
3
37
21
3
4
40
20
4
5
44
18
0
6
46
19
3
7
42
14
6
8
43
16
2
9
46
22
2
10
41
15
0
11
42
-
0
12
49
26
3
13
43
18
2
14
47
15
3
15
42
16
4
16
50
12
8
17
47
19
4
18
40
24
2
19
52
18
4
20
48
17
3
86
Anexo II - Distribuição das mulheres do grupo NIC III segundo a idade, sexarca e ao número de
gravidezes.
CASO
IDADE
SEXARCA
Nº GRAVIDEZES
21
41
23
2
22
48
15
8
23
25
14
3
24
35
17
5
25
46
24
4
26
30
19
2
27
31
22
4
28
45
18
1
29
22
16
3
30
29
21
1
31
37
23
2
32
31
15
3
33
38
15
4
34
32
17
2
35
63
16
17
36
31
14
4
37
33
15
8
38
32
18
1
39
25
17
4
40
35
13
9
87
Anexo III - Distribuição das mulheres do grupo invasivo segundo a idade, sexarca e ao número de
gravidezes.
CASO
IDADE
SEXARCA
Nº GRAVIDEZES
41
58
20
13
42
32
16
04
43
55
19
11
44
65
16
07
45
73
12
03
46
49
12
07
47
56
18
04
48
42
15
03
49
47
18
09
50
35
19
03
51
53
14
04
52
59
12
06
53
26
23
01
54
51
13
13
55
62
17
12
56
52
13
03
57
44
15
03
58
44
18
04
59
48
17
11
60
48
21
04
88
Anexo IV – Distribuição das mulheres segundo a contagem de células
•
PACIENTES
CD3+
CD8+
CD20+
CD68+
i NOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
1
1
2
1
2
1
1
2
1
1
2
2
1
3
1
1
1
1
1
2
1
3
2
2
2
3
1
2
2
1
2
2
2
2
3
2
2
2
3/1
3/1
3/1
3/1
3/1
3/1
3/1
3/1
3/2
3/1
3/1
3/1
3/1
3/1
3/0
3/1
3/1
3/1
2/0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
2
0
1
2
2
1
2
1
2
1
1
1
2
1
2
1
1
2
1
2
0
2
3
2
1/0
3/1
3/1
3/1
3/0
3/3
2/1
3/1
3/1
2/0
3/1
1/0
2/1
2/1
2/1
3/1
3/3
2/2
1
1
2
0
0
1
0
1
0
1
2
1
1
3
0
1
1
1
1
2
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
0
2
1
2
3
0
1
0
2/0
2/0
3/1
2/1
3/0
2/1
3/1
3/1
3/0
2/0
3/1
2/1
2/0
2/1
2/1
3/1
3/1
2/0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
2
0
1
0
1
0
1/0
3/1
0/0
1/1
2/0
3/1
1/1
2/1
2/1
0/0
1/0
3/1
3/1
3/2
0/0
0
0
1
0
1
1
2
1
2
1
3
2
0
0
2
1
0
1
1
2
3
3
0
0
1
2
0
0
0
0
2
0
3
0
2
0
1/0
1/0
3/1
3/1
2/0
0/0
3/2
3/1
3/0
3/1
2/1
3/3
2/0
2/1
2/0
3/3
2/0
3/3
3/3
0/0
Nos casos 41 a 60, equivalentes às pacientes com carcinoma invasivo, há dois números
separados por “ / ”. Do lado esquerdo está descrivo a quantificação peritumoral e do lado
direito a intratumoral. Nos casos onde não constam números e sim hífen, equivalem a casos
onde a qualidade ruim da lâmina não permitiu a inclusão no estudo, sendo portanto
excluídos.
89
LEGENDAS DAS PRANCHAS E FIGURAS
PRANCHA 1. Cortes histológicos de mulheres pertencentes ao grupo controle. A. Corte
histológico corado segundo a técnica de HE mostrando epitélio escamoso estratificado não
queratinizado, epitélio colunar simples e a JEC com moderado infiltrado inflamatório no
estroma subjacente (aumento de 200 vezes). B. Corte histológico corado através da técnica
de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD3+ coradas em
marrom (aumento de 200 vezes). C. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD8+ coradas em marrom
(aumento de 200 vezes). D. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD20+ coradas em marrom
(aumento de 200 vezes). E. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação para iNOS coradas em
marrom (aumento de 200 vezes). F. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD68+ coradas em marron
(aumento de 200 vezes).
PRANCHA 2. Cortes histológicos de mulheres pertencentes ao grupo de portadoras de
NIC III. A. Corte histológico corado segundo a técnica de HE mostrando epitélio com NIC
III e infiltrado inflamatório no estroma subjacente (aumento de 200 vezes). B. Corte
histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas
com marcação CD3+ coradas em marron (aumento de 200 vezes). C. Corte histológico
corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação
CD8+ coradas em marron (aumento de 200 vezes). D. Corte histológico corado através da
técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD20+ coradas
em marron (aumento de 200 vezes). E. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação para iNOS coradas em
marron (aumento de 200 vezes). F. Corte histológico corado através da técnica de
imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação CD68+ coradas em marron
(aumento de 200 vezes).
PRANCHA 3. Cortes histológicos de mulheres pertencentes ao grupo de portadoras de
carcinoma invasivo de colo uterino estadiamento I. A. Corte histológico corado segundo a
técnica de HE mostrando carcinoma invasivo caracterizado pela invasão de clones de
células epidermóides invadindo o estroma e infiltrado inflamatório peritumoral (aumento
de 200 vezes). B. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica
mostrando células positivas com marcação CD3+ coradas em marron (aumento de 200
vezes). C. Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando
células positivas com marcação CD8+ coradas em marron (aumento de 200 vezes). D.
Corte histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células
positivas com marcação CD20+ coradas em marron (aumento de 200 vezes). E. Corte
histológico corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas
com marcação para iNOS coradas em marron (aumento de 200 vezes). F. Corte histológico
corado através da técnica de imunohistoquímica mostrando células positivas com marcação
CD68+ coradas em marron (aumento de 200 vezes).
90
A
B
C
D
E
F
91
A
B
C
D
E
F
92
A
B
C
D
E
F
93
A
B
C
D
Prancha 4. A, B, C e D. Cortes histológicos de tecido corados através da técnica de
imunohistoquímica, mostrando células positivas coradas em marrom (B, C e D), ilustrando o
escore de Georgiannos (GEORGIANNOS et al, 2003) 0, 1, 2 e 3, respectivamente (aumento
de 200 vezes).
94
*
Figura 1. Caso 50. Corte histológico de tecido corado através da técnica de
imunohistoquímica, mostrando intenso infiltrado peritumoral (seta) e leve intratumoral (asterisco). (CD8, 400 vezes).