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PUC-Rio - Certificação Digital Nº 0410380/CA
Roberta Lyrio Santos Neves
Avaliação da contaminação de óleo no ambiente
estuarino da Baía de Guanabara (RJ) pela determinação
fluorimétrica de Hidrocarbonetos Policíclicos
Aromáticos (HPAs) na bílis de peixes Mugil liza
Dissertação de Mestrado
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Química da PUC-Rio como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre em
Química Analítica.
Orientadores: Prof. Roberta Lourenço Ziolli
Prof. Terezinha Ferreira de Oliveira
Rio de Janeiro
fevereiro de 2006
Roberta Lyrio Santos Neves
PUC-Rio - Certificação Digital Nº 0410380/CA
Avaliação da contaminação de óleo no ambiente
estuarino da Baía de Guanabara (RJ) pela
determinação fluorimétrica de
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
(HPAs) na bílis de peixes Mugil liza
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em
Química da PUC-Rio. Aprovada pela Comissão Examinadora
abaixo assinada.
Profa. Roberta Lourenço Ziolli
Orientadora
Departamento de Química – PUC-Rio
Dra. Zuleica Carmem Castilhos
Centro de Tecnologia Mineral – UFRJ
Prof. Ricardo Queiroz Aucélio
Departamento de Química – PUC-Rio
Prof. José Eugenio Leal
Coordenador Setorial do
Centro Técnico Científico – PUC-Rio
Rio de Janeiro, 22 de fevereiro de 2006
Todos os direitos reservados. É proibida a reprodução total
ou parcial do trabalho sem autorização da universidade, da
autora e do orientador.
Roberta Lyrio Santos Neves
PUC-Rio - Certificação Digital Nº 0410380/CA
Graduou-se em Engenharia Química na PUC-Rio em 1996.
Trabalhou na L’Oréal de 1996 a 2003, na área de
regulamentação de cosméticos. Participou de diversos
congressos na área ambiental.
Ficha Catalográfica
Neves, Roberta Lyrio Santos
Neves, Roberta Lyrio Santos
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) na
da contaminação
de óleo no ambiente
bílis do Avaliação
peixe Mugil
liza como biomarcadores
para o
monitoramento
ambiental
da
contaminação
de
óleo/
estatutário da Baía de Guanabara (RJ) pela determinação
Roberta Lyrio Santos Neves; orientadora: Roberta
fluorimétrica
de– hidrocabornetos
policíclicos
aromáticos
Lourenço
Ziolli.
Rio de Janeiro: PUC,
Departamento
de
Química,
2006.
(HPAs) na
bílis de peixes Mugil Liza / Roberta Lyrio
Santos Neves ; orientadores: Roberta Lourenço Ziolli,
Terezinha
Oliveira. – Rio de Janeiro : PUC,
v., 101 Ferreira
f.: il.; 29,7decm
Departamento de Química, 2006.
1. Dissertação (mestrado) – Pontifícia Universidade
120 f. : il. ; 30 cm
Católica do Rio de Janeiro, Departamento de Química.
Dissertação
(mestrado)
–
Pontifícia
Inclui referências
Universidade
Católicabibliográficas.
do Rio de Janeiro, Departamento
de Química.
CDD: 540
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Aos meus pais, Lúcia e José Eduardo,
e a minha irmã, Renata,
por serem uma família incrível.
Agradecimentos
À minha orientadora, Roberta Lourenço Ziolli, pela confiança em mim depositada
e pelo apoio neste trabalho.
À minha orientadora, Terezinha Ferreira de Oliveira, pela amizade e pelo
incentivo ao longo deste trabalho.
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Ao professor Ricardo Queiroz Aucélio pelo empréstimo do equipamento e pela
ótima acolhida no seu laboratório.
Aos amigos, Pedro Cavalcanti e Nédio Araújo, por toda a amizade dentro e fora
do laboratório.
Aos amigos, Ana Paula, Bruno, Camila, Carol, Diego, José Victor e Letícia, por
toda a ajuda nas coletas e pela ótima convivência no laboratório.
À Yaneth pela amizade e por todas as noites insones, fundamentais para esse
trabalho.
À Lívia e Bernardo, companheiros nesse desafio.
Aos amigos do LEEA, Wagner, Carlos, Ilfran, Alessandra, Flávia e João, pela
apoio e amizade ao longo deste trabalho.
À professora Angela Rebelo Wagener por todo o material emprestado.
À equipe do LABMAM, em especial ao Ricardo, Cláudia, Adriana e Francine por
toda a ajuda fornecida.
Ao CNPq e a PUC pelos auxílios concedidos, sem os quais este trabalho não
poderia ter sido realizado.
À prof. Isabel Moreira por todo material emprestado.
Ao Anselmo pela ajuda com o espectrofotômetro.
Ao Jorge, Charles e Carlão pelo empréstimo de equipamentos.
À todos da secretária do departamento pela ajuda, em especial a Fátima.
Ao Sr. Irani e ao Nico pelas coletas na Baía de Guanabara e em Itaipu.
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À Ana Paula Rodrigues pela ajuda com os peixes e pela companhia sempre
divertida.
Ao Alexandre Azevedo pelo apoio e carinho nestes últimos meses.
e a todos os meus amigos e familiares que sempre me incentivaram e souberam
entender minha ausência neste período.
Resumo
Neves, Roberta Lyrio Santos. Avaliação da contaminação de óleo no
ambiente estuarino da Baía de Guanabara (RJ) pela determinação
fluorimétrica de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) na
bílis de peixes Mugil liza. Rio de Janeiro, 2006. 120p. Dissertação de
Mestrado – Departamento de Química, Pontifícia Universidade Católica do
Rio de Janeiro.
Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) são poluentes ubíquos
na natureza sendo os derrames de óleo uma das principais fontes destes compostos
para os ambientes aquáticos costeiros. Este trabalho avalia a possibilidade de uso
dos metabólitos de HPAs na bílis do peixe Mugil liza (tainha) como biomarcadores no monitoramento ambiental de ecossistemas aquáticos. Para esta avaliação
realizou-se um monitoramento sazonal na Baía de Guanabara, RJ, área cronica-
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mente contaminada por óleo, e em Itaipu, Niterói, RJ, como área controle. Nos locais de coleta foram medidos parâmetros físico-químicos tais como, pH, oxigênio
dissolvido, entre outros e selecionados os peixes variando entre 35 e 51 cm para
maior homogeneidade das amostras. Em laboratório foram feitas medidas morfométricas dos indivíduos e retirado o seu líquido biliar. O método analítico foi otimizado e seus parâmetros de desempenho analítico foram determinados. As amostras de líquido biliar foram diluídas em etanol 48% (1:2000 v/v) e analisadas por
fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão, respectivamente,
332 nm e 383 nm. A média das concentrações de HPAs totais na bílis dos peixes
coletados na Baía de Guanabara foi significativamente diferente da área controle,
Itaipu. Na Baía de Guanabara, valores de 7,0 ± 3,4 (n=19) e 10,4 ± 6,4 (n=12) mg
de equivalentes (eqv.) de pireno L-1 foram obtidos, respectivamente, no inverno e
no verão. Em Itaipu, a concentração de HPAs foi de 1,8 ± 0,7 (n=11) mg de eqv.
de pireno L-1. Estes resultados indicam que o método é capaz de diferenciar áreas
recentemente contaminadas por óleo de áreas não contaminadas, sendo o peixe
Mugil liza um possível biomonitor para esta área. Este método analítico apresenta
vantagens em relação a outros métodos, tais como tempo e custo de análise reduzidos, podendo ser usado em levantamento de dados preliminares nos programas
de monitoramento ambiental.
Palavras-chave
HPAs, biomarcador, Mugil liza, bílis, Baía de Guanabara
Abstract
Neves, Roberta Lyrio Santos. Evaluation of the oil contamination of the
estuarine environment of the Guanabara Bay (RJ) by the fluorometric
determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in the
Mugil liza fish bile. Rio de Janeiro, 2006. 120p. MSc. Dissertation –
Departamento de Química, Pontifícia Universidade Católica do Rio de
Janeiro.
Polycyclic
aromatic hydrocarbons
(PAHs)
are
ubiquitous
in
the
environment. The main source of contamination is antropogenic, and oil spills are
one of the main PAHs sources for the aquatic environment. This work evaluates
the usage of PAH metabolites in fish bile (Mugil liza) as biomarkers in the aquatic
environment. For this evaluation two distinct areas were monitores: Guanabara
Bay, RJ, known for its chronic oil contamination, and Itaipu, Niterói, RJ, the
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control area. Physico-chemical measurements: pH, dissolved oxygen, conductivity
and transparency were made in situ and fish varying from 35 to 50 cm were
selected for sampling homogeneity and sexual maturity. In the laboratory,
morphometric measures were taken and the fish bile was extracted. After
optimizing the analytical method the samples were analysed by diluting each bile
sample in ethanol 48% (1:2000 v/v) and fluorimetric measurements were made in
excitation/emission wavelengths of 332 nm/383 nm. The mean total PAHs
concentrations in the bile samples collected in the Guanabara Bay were
significantly different from the control area, Itaipu. In the Guanabara Bay the
means were 7,0 ± 3,4 (n=19) and 10,4 ± 6,4 (n=12) mg L-1 pyrene equivalents, in
winter and summer, respectively. In Itaipu, the mean HPA concentration was 1,8
± 0,7 (n=11) mg L-1 pyrene equivalents. These results indicate that this method
can differentiate contaminated areas from non contaminated ones, making the fish
Mugil liza one possible biomonitor in the Guanabara Bay, RJ. Additionally, this
analytical method has advantages compared to other methods because it is less
time consuming and is inexpensive and therefore could be used as a preliminary
monitoring tool.
Keywords
PAHs, biomarker, Mugil liza, bile, Guanabara Bay
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Sumário
1. Introdução
17
1.1. Objetivo geral
19
1.2. Objetivos específicos
19
2. Petróleo no meio ambiente aquático
21
2.1. Fontes de contaminação por óleo
21
2.2. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
23
2.2.1. Fontes de contaminação por HPAs
24
2.2.2. Propriedades físico-químicas dos HPAs
26
2.3. Distribuição dos HPAs no ambiente aquático
27
3. Toxicidade dos HPAs
32
3.1. Considerações Gerais
32
3.2. Metabolismo dos HPAs em peixes
33
3.2.1. O metabolismo do pireno
37
3.3. A bílis e a formação de biliverdina
38
3.3.1. A bílis
38
3.3.2. A formação de biliverdina
39
4. Monitoramento ambiental
41
4.1. Biomarcadores
42
5. Ecologia e biologia do peixe Mugil liza (tainha)
46
5.1. Mugil liza (tainha)
46
5.2. Análise biométrica
48
5.2.1. Estimativa do Peso Total (W T) e Comprimento Padrão (LP)
49
5.2.2. Fator de condição (K)
49
5.3. Órgãos reprodutores
50
5.3.1. Estágios de maturação sexual
51
6. Determinação de HPAs em peixes
53
6.1. Técnicas de extração e clean-up
53
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6.2. Determinação de HPAs em bílis de peixe
55
6.3. Fluorescência molecular
57
7. Áreas de estudo
60
7.1. Baía de Guanabara, RJ
60
7.1.1. Poluição por petróleo e derivados na Baía de Guanabara
63
7.1.2. Estudos de HPAs na Baía de Guanabara
65
7.1.3. Praia de Ipiranga, Magé
67
7.2. Itaipu, Niterói
68
8. Parte experimental
71
8.1. Coleta dos peixes e medição dos parâmetros físico-químicos
71
8.2. Amostragem dos peixes
72
8.3. Análise da bílis
74
8.3.1. Escolha do sistema solvente
74
8.3.2. Determinação dos comprimentos de onda de excitação e emissão
75
8.3.3. Curva analítica
75
8.3.4. Absorção molecular
75
8.3.5. Estudo do efeito de matriz
76
8.3.6. Determinação de HPAs total por fluorescência na bílis de peixe
76
8.3.7. Limpeza do material
77
8.4. Análise de HPAs totais em água
77
8.4.1. Determinação dos comprimentos de onda de excitação e emissão
77
8.4.2. Curva analítica
77
8.4.3. Coleta de água
78
8.4.4. Extração de HPAs totais
78
8.4.5. Determinação de HPAs total por fluorescência em água
79
8.4.6. Limpeza do material
79
8.5. Análise estatística dos dados
79
9. Resultados e discussões
81
9.1. Otimização da análise de HPAs em bílis de peixe
81
9.1.1. Escolha do sistema solvente
81
9.1.2. Determinação dos comprimentos de onda de excitação e emissão
83
9.1.3. Parâmetros de desempenho analítico
84
9.1.4. Efeito de matriz
87
9.1.5. Adição de analito
89
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9.2. Comparação entre Baía de Guanabara e Itaipu
92
9.2.1. Parâmetros físico-químicos
92
9.2.2. Análise morfométrica dos peixes
93
9.2.3. Análise da bílis
98
9.2.4. Análise por fluorescência - método sincronizado
102
9.2.5. Correlação entre as variáveis
104
9.2.6. Determinação de HPAs totais em água
106
10. Conclusões e Considerações finais
109
11. Referências bibliográficas
114
Lista de figuras
Figura 1. Representação estrutural de alguns HPAs.
24
Figura 2. Representação da distribuição dos hidrocarbonetos no meio aquático.
29
Figura 3. Esquema de biotransformação de xenobióticos.
35
Figura 4. Mecanismo de ativação dos HPAs.
36
Figura 5. Representação esquemática simplificada do metabolismo do
benzo[a]pireno.
37
Figura 6. Estrutura do pireno.
38
Figura 7. Canalículo bilífero.
39
Figura 8. Oxidação do anel heme até a formação de biliverdina.
40
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Figura 9. Representação esquemática da ordem sequencial de respostas ao
estresse causado por poluentes em um sistema biológico.
43
Figura 10. Mugil liza.
47
Figura 11. Diagrama do corpo do peixe e as medidas utilizadas.
48
Figura 12. Métodos de determinação de HPAs em bílis de peixe.
56
Figura 13. Diagrama parcial de energia de um sistema fotoluminescente.
58
Figura 14. Mapa do estado do Rio de Janeiro, destacando em vermelho a região
metropolitana e em azul a Baía de Guanabara.
Figura 15. Curral próximo a praia de Ipiranga, Magé.
60
67
Figura 16. trecho da Carta náutica 1501 indicando a região dos currais próximos
a praia de Ipiranga, Magé.
68
Figura 17. Mapa do Estado do Rio de Janeiro, com destaque para a cidade de
Niterói.
69
Figura 18. Abertura do indivíduo.
72
Figura 19. Identificação do sexo do peixe pela análise visual das gônadas.
73
Figura 20. Localização da vesícula biliar.
73
Figura 21. Retirada do líquido biliar.
73
Figura 22. Espectro de excitação (λem = 383 nm) e emissão (λex = 332 nm) do
pireno em etanol 48%.
84
Figura 23. Curva analítica da solução de pireno em etanol 48% (n=4) em
condições otimizadas.
85
Figura 24. Coloração do líquido biliar das amostras utilizadas no teste do efeito
de matriz.
88
Figura 25. Gráfico do aumento do efeito de matriz com a diminuição das
diluições das amostras.
88
Figura 26. Gráfico de adição de analito usando a bílis dos peixes coletados na
Baía de Guanabara.
90
Figura 27. Gráfico de adição de analito usando a bílis dos peixes coletados em
Itaipu.
91
Figura 28. Distribuição de frequência do comprimento total dos indivíduos
coletados
94
Figura 29. Gráfico de Boxplot do comprimento total, classificado por coleta.
94
Figura 30. Proporção sexual dos indivíduos capturados.
95
em todas as coletas da Baía de Guanabara e Itaipu.
95
Figura 31. Gráfico de Boxplot do peso, classificado por sexo.
96
Figura 32. Gráfico de Boxplot do comprimento total, classificado por sexo.
96
Figura 33. Espectros de emissão fluorescente das bílis diluídas da Baía de
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Guanabara e Itaipu.
98
Figura 34. Gráfico de Boxplot da concentração de HPAs na bílis dos peixes, por
coleta.
100
Figura 35. Espectro de fluorescência sincronizada (∆λ=51 nm) para bílis de
peixes coletados na Baía de Guanabara.
103
Figura 36. Dendograma de similaridade dos valores absolutos das correlações
absolutas das distâncias pelo método de Ward.
Figura 37. Curva analítica de soluções de pireno em diclorometano (n=3).
105
106
Lista de tabelas
Tabela 1. Concentração de alguns HPAs em diferentes derivados de petróleo. 25
Tabela 2. Valores máximos permitidos para alguns HPAs (µg L-1).
26
Tabela 3. Parâmetros físico-químicos de alguns HPAs.
28
Tabela 4. Concentrações de HPAs encontrados na água, sedimento e biota da
Baía de Guanabara.
66
Tabela 5. Valores de referência para o HPAs totais para estimar o nível de
contaminação em tecido de peixes (peso úmido).
Tabela 6. Análise de variância do experimento.
66
82
Tabela 7. Estimativas dos efeitos e coeficientes com os respectivos intervalos de
confiança de 95%.
82
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Tabela 8. Valores de Ŷ para a equação de regressão obtida do experimento
fatorial 23.
83
Tabela 9. Análise de variância da curva de regressão.
85
Tabela 10. Parâmetros físico-químicos.
93
Tabela 11. Número de machos e fêmeas capturados.
95
Tabela 12. Estimativa da média do peso (kg) dos peixes coletados*.
95
Tabela 13. Estimativa da média do comprimento total (cm) dos peixes
coletados*.
Tabela 14. Análise de variância do fator de condição em relação as coletas.
96
97
Tabela 15. Análise de variância da média das concentrações de HPAs por sexo,
coleta da Baía de Guanabara, agosto/2005.
99
Tabela 16. Análise de variância da média das concentrações de HPAs por sexo,
coleta de Itaipu, agosto/2005.
99
Tabela 17. Análise de variância da média das concentrações de HPAs por sexo,
coleta de Itaipu, setembro/2005.
99
Tabela 18. Análise de variância das concentrações de HPAs por coleta.
100
Tabela 19. Matriz de correlação das variáveis.
104
Tabela 20. Análise de variância da curva de regressão.
107
Tabela 21. Concentração de HPAs medidos em amostras de água*.
108
Lista de quadros
Quadro 1. Carcinogenicidade, genotoxicidade e mutagenicidade de alguns
HPAs.
33
Quadro 2. Fatores e níveis do experimento.
81
Quadro 3. Parâmetros de desempenho analítico.
86
Quadro 4. Cor e valores de absorvância à 380 nm das amostras utilizadas no
teste do efeito de matriz.
87
Quadro 5. Cor e valor de absorvância das amostras utilizadas no teste de adição
de analito.
89
Quadro 6. Equações das regressões lineares das adições de analito e seu
coeficiente de correlação (R2).
90
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Quadro 7. Data e coordenadas da coletas.
92
Quadro 8. Estimativa das médias dos valores do fator de condição (K)*.
97
-1
Quadro 9. Média da concentração de HPAs em mg L de equivalentes de pireno
na bílis dos peixes (Mugil liza) capturados, separados por sexo*.
99
Quadro 10. Estimativa das médias das concentrações de HPAs (µg de
equivalentes de pireno mL-1 de bile) por coleta*.
100
Quadro 11. Concentrações de HPAs em bílis de peixe em locais contaminados.
102
Quadro 12. Codificação das variáveis categóricas.
104
Quadro 13. Concentrações de HPAs na água da Baía de Guanabara.
108
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Antes tarde do que muito tarde.
Wagner Pacheco, num final de tarde chuvoso.
1
Introdução
A crescente demanda pelo uso do petróleo para obtenção de energia, faz
com que aumente a extração de petróleo e as atividades a ela associadas,
contribuindo para o crescente número de derrames de óleo crônicos ou agudos,
afetando o meio ambiente. Em geral, essas atividades se concentram nas zonas
costeiras, sendo essas as mais impactadas por este tipo de atividade.
O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos. Na sua
composição destacam-se os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs),
compostos potencialmente tóxicos pelo seu potencial carcinogênico.
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Os HPAs podem atingir o meio ambiente por fontes naturais, como
percolação de óleo do fundo oceânico e incêndios naturais em florestas, ou
fontes antropogênicas, tais como a queima incompleta de matéria orgânica,
incluindo as emissões veiculares e o uso de combustíveis fósseis, e derrames de
petróleo e derivados. Atualmente, as fontes antropogênicas são as que mais
contribuem para a contaminação do meio ambiente por HPAs, sendo as regiões
costeiras uma das regiões mais afetadas já que a produção de petróleo se
concentra principalmente nestas áreas.
O principal exemplo de região costeira potencialmente impactada pela
atividade petrolífera no Rio de Janeiro é a Baía de Guanabara, que é ameaçado
por várias formas de poluição, onde efluentes domésticos e industriais afetam
seu ecossistema. Existem no entorno da Baía duas refinarias de petróleo, 16
terminais de óleo, 6000 indústrias e dois portos comerciais sendo liberadas,
diariamente, sete toneladas de óleo na Baía, entre outros (CEDAE, 199-).
Há portanto a necessidade de se estabelecer parâmetros indicadores da
contaminação por hidrocarbonetos de petróleo que possam ser utilizados na
implementação de um programa de avaliação ambiental no monitoramento da
qualidade desses ecossistemas aquáticos.
Entre as várias formas de monitoramento que podem ser empregados para
monitorar
ou
predizer
os
efeitos
destes
poluentes
no
ambiente,
o
biomonitoramento tem sido utilizado como ferramenta promissora nos programas
de avaliação ambiental.
Introdução
18
Entre os organismos que vêm sendo propostos para o uso no
biomonitoramento, os peixes destacam-se por possuírem um papel fundamental
na cadeia alimentar e representarem uma importante fonte de alimentação para
a população. A presença dos produtos da metabolização dos HPAs na bílis de
peixes pode ser um bom indicador de contaminação crônica uma vez que a
metabolização destes compostos é eficiente, sendo a bílis o principal meio de
excreção destes compostos.
Embora o uso de metabólitos como marcadores seja promissor na
avaliação ambiental de rotina ou em casos de derrames, estudos de validação
da técnica e de seleção dos organismos mais adequados necessitam ser
conduzidos antes de sua aplicação.
Assim, este estudo busca avaliar a viabilidade do monitoramento ambiental
preliminar da contaminação por óleo na Baía de Guanabara, utilizando a análise
de metabólitos de HPAs na bílis de peixe como biomarcadores.
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Esta técnica permite avaliar a contaminação de petróleo e derivados em
ambientes aquáticos, neste caso avaliando o uso da espécie Mugil liza (tainha)
como biomonitor. Por ser uma prática rápida e de baixo custo permite a análise
de grande número de amostras em curto espaço de tempo e sendo a primeira
vez em que esta técnica é utilizada para avaliação do pescado da região da Baía
de Guanabara, RJ.
Inicialmente foi realizado um levantamento bibliográfico sobre a utilização
da análise de metabólitos de HPAs na bílis de peixes como biomarcador de
HPAs no ambiente aquático e sobre as metodologias analíticas disponíveis. A
metodologia selecionada para a análise dos metabólitos dos HPAs na bílis de
peixes por fluorescência foi otimizada e seus parâmetros analíticos de
desempenho foram determinados. Estudos adicionais como a influência da
matriz, bílis, na análise química, foram também realizados.
Paralelamente foram feitos levantamentos de campo, incluindo entrevista
com os pescadores locais, a fim de conhecer as espécies de peixes possíveis de
serem utilizadas como biomonitores no presente estudo, investigando seus
hábitos alimentares, abundância, forma de captura, entre outros parâmetros, e
estabelecer as regiões escolhidas para a captura dos indivíduos.
A proposta inicial era utilizar peixes das espécies Micropogonias furnieri
(corvina) e Mugil liza (tainha), encontradas em abundância na Baía e
consumidas pela população local, principalmente, do entorno da Baía de
Guanabara, RJ. Entretanto, em laboratório, alguns exemplares dessas e de
outras espécies foram dissecados na tentativa de identificação da vesícula biliar
Introdução
19
para extração da bílis par análise, mas nem sempre com sucesso. Após várias
tentativas, a espécie escolhida para utilização neste estudo foi a Mugil liza
(tainha) por apresentar-se em abundância na região, ser consumida pela
população local, ser de fácil captura e fácil identificação da vesícula biliar.
A parte experimental deste estudo contempla os trabalhos em campo e
laboratório. Os trabalhos de campo consistiam da captura e seleção dos
exemplares, caracterização físico-química do ambiente onde os peixes foram
coletados, coleta de água para análises e registros rotineiros de campo
(coordenadas, tábuas de marés, etc.). Em laboratório foram feitas as análises
morfométricas dos indivíduos, a análise química da bílis e as análises de água. A
concentração de HPAs na água coletada nas regiões de onde os peixes foram
capturados também foi determinada. Os resultados obtidos foram então tratados
estatisticamente, respaldando as discussões e conclusões apresentadas neste
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trabalho.
1.1.
Objetivo geral
O objetivo deste trabalho é estudar a viabilidade do uso da determinação
de metabólitos de HPAs em bílis de peixe, por fluorescência, em programas de
monitoramento ambiental.
1.2.
Objetivos específicos
Em sintonia com seu objetivo geral, essa dissertação possui os seguintes
objetivos específicos:
•
otimização da metodologia para a determinação de metabólitos de
HPAs na bílis de peixe, avaliando sistema solvente mais adequado
para as diluições empregadas;
•
avaliação da influência da matriz (bílis) no composto de referência;
•
avaliação do uso do peixe Mugil liza (tainha) como biomonitor ;
•
determinação semi-quantitativa dos HPAs totais e seus metabólitos
na bílis do peixe Mugil liza;
Introdução
•
20
avaliação das possíveis relações entre tamanho e peso dos peixes
coletados, volume de bílis retirada e absorvância das amostras
diluídas, com a concentração dos compostos estudados;
•
avaliação das possíveis variações sazonais das concentrações de
HPAs obtidas e demais parâmetros;
•
avaliação da ocorrência ou não de fontes de poluição crônica por óleo
na região estudada da Baía de Guanabara;
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•
obtenção de dados pretéritos para as regiões estudadas.
2
Petróleo no meio ambiente aquático
2.1.
Fontes de contaminação por óleo
As fontes de contaminação do oceano por óleo são variadas e podem ser
separadas em quatro grandes grupos: percolação natural no fundo oceânico,
extração de petróleo, transporte de óleo e consumo de petróleo. A quantidade de
óleo que atinge os mares anualmente pode variar muito, dependendo da
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ocorrência de acidentes ou guerras.
Estimativas do Comitê de Estudo de Óleo no Mar do National Research
Council (2003) indicam que o volume total de óleo que atinge os oceanos
anualmente é de cerca de 1.400.000 m3.
A percolação natural ocorre quando o óleo cru, a fração pesada do
petróleo, atravessa o extrato geológico do fundo marinho até a coluna d’água.
Este fenômeno natural é responsável por quase metade de todo óleo que é
lançado anualmente (680.000 m3) no ambiente marinho, mas sua taxa de
liberação é suficientemente baixa para que o ecossistema circunjacente possa
se adaptar.
A extração de petróleo pode resultar no vazamento de óleo cru e produtos
refinados. A natureza e tamanho destes derrames variam e se restringem às
áreas de exploração de óleo e gás natural, sendo um risco potencial para os
ambientes costeiros. Estima-se que sejam liberados 41.000 m3 de óleo no mar
anualmente, correspondendo a 5% de todo óleo que atinge o ambiente marinho.
No transporte de óleo podem ocorrer enormes vazamentos como
acidentes com navios tanque, tal como o vazamento de 13.000 m3 de óleo do
navio Exxon Valdez, ocorrido no Alasca em 1989. A contribuição dos
vazamentos decorrentes do transporte anual de óleo para o mar é estimada em
165.000 m3, 12% do total mundial.
Já o consumo de óleo corresponde a maior contribuição antrópica de
vazamento de óleo para o mar. Este tipo de fonte difusa libera nos oceanos
Petróleo no meio ambiente aquático
22
530.000 m3 de óleo anualmente, de forma lenta e crônica (National Research
Council, 2003).
A fim de melhor avaliar o impacto dos derrames de óleo no meio
ambiente é necessário conhecer algumas de suas características. Em geral, os
óleos são classificados como persistentes e não-persistentes. Os óleos nãopersistentes, mais leves, tendem a desaparecer rapidamente quando lançados
na superfície do mar (gasolina, nafta e querosene), enquanto os óleos
persistentes, mais pesados, dissipam mais vagarosamente (óleos crus e
resíduos de refino).
A persistência de um óleo depende de algumas propriedades tais como:
solubilidade, volatilidade, gravidade específica, viscosidade, tensão superficial,
entre outras. Essas propriedades influenciam como o petróleo vai se comportar
no ambiente aquático e determinar seus efeitos sobre a biota.
Os efeitos do óleo sobre os organismos marinhos podem ser divididos em
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efeitos físicos, resultantes do recobrimento dos organismos por óleo e, efeitos
químicos, associados à toxicidade dos compostos presentes. Estes efeitos não
são excludentes, podendo ocorrer simultaneamente. Nos óleos de alta
densidade, o efeito físico de recobrimento é predominante, enquanto nos óleos
de baixa densidade o efeito químico é mais representativo (CETESB, 2005).
Assim, após um derrame, dados devem ser coletados a fim de conhecer a
natureza do óleo, o tamanho da mancha de óleo e resultados de análises
químicas para água, sedimentos e biota.
Quando ocorre um derrame de óleo algumas decisões urgentes devem ser
tomadas, tais como, restringir ou suspender a pesca, avaliar a segurança do
consumo de frutos do mar e pescado e comunicar os riscos à saúde para
população (Yender et al., 2002). Alguns exemplos de derrames que levaram a
suspensão da pesca foram: o acidente com o navio Exxon Valdez no Alasca, e o
vazamento de 1.300 m3 de óleo na Baía de Guanabara, RJ, em janeiro de 2000,
onde a pesca foi suspensa por um mês, com grandes prejuízos para a
comunidade pesqueira da região.
Como os derrames são dinâmicos, as condições devem ser monitoradas e
os riscos para o pescado reavaliados até serem reduzidos. A determinação da
contaminação de alimentos pode ser bastante longa sendo, portanto, é
necessário o desenvolvimento de métodos de monitoramento que possam
fornecer uma resposta rápida ao fator de risco.
Em uma tentativa de prevenir os derrames de óleo foram feitas várias
convenções internacionais. A mais importante delas foi a MARPOL 73/78. Ela é
Petróleo no meio ambiente aquático
23
resultante da Convenção Internacional para a Prevenção da Poluição por
Navios, realizada em 1973, que não chegou a entrar em vigor, sendo absorvida
pelo protocolo da Conferência sobre Segurança de Petroleiros realizada em
1978 (International Maritime Organisation (IMO), 2006). A MARPOL 73/78 foi
aprovada com reservas pelo Brasil em 1987.
Ainda segundo a IMO, em 1990 foi realizada em Londres a Convenção
Internacional sobre Preparo, Resposta e Cooperação em Caso de Poluição por
Óleo (OPRC), que estabelece medidas para lidar com incidentes de poluição por
óleo, seja nacional ou em cooperação com outros países. Esta convenção
também foi aprovada pelo Brasil pelo decreto legislativo no 43, de 29 de maio de
1998 e pelo decreto no 2.870, de 10 de dezembro de 1998.
Além das convenções internacionais, está em vigor atualmente no Brasil a
lei federal no 9.966, de 28 de abril de 2000, conhecida como “a lei do óleo”, que
dispões sobre a prevenção, o controle e a fiscalização da poluição causada por
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lançamento de óleo e outras substâncias (Brasil, 2005; da Costa, 2003). Existe
ainda uma série de outras regulamentações federais e estaduais relacionadas à
poluição por óleo e à conservação do meio ambiente brasileiro.
2.2.
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
O petróleo é composto basicamente por hidrocarbonetos (97%), e
elementos como nitrogênio, enxofre e oxigênio (Yender et al., 2002; National
Research Council, 1985
apud
National
Research
Council,
2003). Os
hidrocarbonetos podem ser classificados em dois grandes grupos: alifáticos e
aromáticos. Os hidrocarbonetos aromáticos são formados por pelo menos um
anel aromático e podem ser separados em dois grupos: os compostos
monoaromáticos e os poliaromáticos também chamados de hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPAs) (Figura 1).
Embora os HPAs correspondam à menor fração presente no petróleo,
destacam-se por serem estáveis, persistentes no meio ambiente e podem
apresentar efeitos tóxicos nos organismos aquáticos.
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Petróleo no meio ambiente aquático
24
Figura 1. Representação estrutural de alguns HPAs.
2.2.1.
Fontes de contaminação por HPAs
Os HPAs podem ser formados a altas ou baixas temperaturas. A
combustão incompleta de matéria orgânica produz HPAs em ambientes com
temperatura entre 500 e 800 oC. A diagênese1 de material orgânico sedimentar
em temperaturas baixas ou moderadas, em longos períodos de tempo, também
leva à formação de HPAs no carvão ou depósitos de óleo. Os HPAs também
podem ser formados por plantas clorofiladas, fungos e bactérias (Hoffman,
2003).
1
diagênese: processos físicos, químicos e biológicos sofridos por um sedimento após a sua
deposição.
Petróleo no meio ambiente aquático
25
Nos processos a baixas temperaturas a distribuição de HPAs é governada
por propriedades termodinâmicas e nos processos a altas temperaturas a
distribuição é governada por características cinéticas. Assim, misturas de HPAs
formadas durante a combustão de combustíveis fósseis são geralmente
caracterizadas pela predominância de HPAs de alta massa molecular.
Segundo Silva (2004) para diferenciar HPAs originados em combustão
daqueles de origem petrogênica, podem ser usados índices baseados na razão
da concentração de HPAs selecionados. Assim, pode-se usar a razão entre
HPAs de baixa massa molecular e HPAs de alta massa molecular, onde valores
menores que 1 sugerem fonte de contaminação por combustão. Pode-se usar
também as razões entre componentes homólogos como Fenantreno e
Antraceno, Benzo(a)antraceno e criseno (Lima, 2001).
Apesar de existirem fontes naturais de HPAs para o meio ambiente tais
como, incêndios naturais em florestas, a percolação natural de óleo, erupções
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vulcânicas e bactérias, as fontes antropogênicas são as mais importantes
(Bjørseth, 1983). Segundo Hoffman (2003), as fontes antropogênicas são:
extração, transporte e consumo de óleo, incineração de lixo, motores de
combustão, principalmente os movidos a óleo diesel, entre outros, sendo a
contaminação das regiões costeiras causada por derramamentos de óleo,
esgoto urbano e industrial, escoamento urbano (runoff) e deposição atmosférica.
A concentração de HPAs presentes nos derivados de petróleo pode variar
bastante conforme mostrado na Tabela 1. Um óleo cru típico pode conter de
0,2% a 7% de HPAs e sua abundância geralmente diminui com o aumento da
massa molecular do HPA.
Tabela 1. Concentração de alguns HPAs em diferentes derivados de petróleo.
Meio
Unidade
8 óleos crus de diferentes origens
mg kg
Gasolina
mg L
-1
-1
Pireno
Benzo(e)pireno
Benzo(a)pireno
1,6 – 10,7
1,2 – 28,9
0,1 – 3,6
0,03 – 4,8
0,031 – 0,95
mg kg
-1
5,10 – 99,0
0,70 – 37,3
0,79 – 34,8
mg kg
-1
86 - 791
37 – 334
31 – 100
Sedimento contaminado com óleo mg kg
-1
1410
270
440
óleo lubrificante
óleo para motor, usado
de piche (matéria seca)
Fonte: Kornmüller & Wiesmann, 2003.
Petróleo no meio ambiente aquático
26
Em relação a contaminação por HPAs está em vigor a resolução no 357 do
CONAMA, de 17 de março de 2005 que classifica as águas em doces, salobras
e salinas, definindo qual a destinação de cada uma delas e os padrões de
qualidade de água que devem ser periodicamente monitorados pelo Poder
Público. Dentre os vários parâmetros de qualidade de água estabelecidos, foram
estipulados limites individuais para alguns HPAs de acordo com a destinação do
corpo d’água (Tabela 2).
Tabela 2. Valores máximos permitidos para alguns HPAs (µg L-1).
Tipo de corpo d’água
Classe 1 e 2
HPA
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benzo(a)antraceno
Água destinada para Pesca ou
Água doce
0,05
1
Cultivo de organismos para fins
de consumo intensivo
0,018
2
Água doce
Classe 3
3
-
benzo(a)pireno
0,05
0,018
0,7
benzo(b)fluoranteno
0,05
0,018
-
benzo(k)fluoranteno
0,05
0,018
-
criseno
0,05
0,018
-
dibenzo(a,h)antraceno
0,05
0,018
-
indeno(1,2,3,-cd)pireno
0,05
0,018
-
Fonte: CONAMA,2005.
1
Água doce classe 1: podem ser destinadas ao abastecimento para consumo humano após
tratamento adequado; à proteção das comunidades aquáticas; recreação de contato primário;
irrigação de hortaliças que são consumidas cruas e frutas que se desenvolvem rente ao chão e
serão consumidas cruas e sem remoção de película;
Água doce classe 2: podem ser destinadas ao abastecimento para consumo humano após
tratamento convencional; à proteção das comunidades aquáticas; recreação de contato primário;
irrigação de hortaliças que são consumidas cruas e frutas que se desenvolvem rente ao chão e
serão consumidas cruas e sem remoção de película, aqüicultura e atividade de pesca;
2
3
Valores para água doce, água salgada e água salobra;
Água doce classe 3: podem ser destinadas ao abastecimento para consumo humano após
tratamento adequado; irrigação de culturas arbóreas, cerealíferas e forrageiras; pesca amadora;
recreação de contato secundário; dessedentação de animais.
2.2.2.
Propriedades físico-químicas dos HPAs
Os HPAs são formados por dois ou mais anéis aromáticos fundidos em
sua estrutura, incluindo os compostos alquilados. Estes compostos variam de
dois anéis (naftaleno) até sete anéis (coroneno), como representado na Figura 1.
Petróleo no meio ambiente aquático
27
Suas propriedades físicas e químicas estão relacionadas com a massa
molecular, sendo divididos em HPAs de baixo peso molecular (2 a 3 anéis
benzênicos) e alto peso molecular (4 a 7 anéis benzênicos). Os HPAs de baixo
peso molecular apresentam toxicidade aguda significativa para os organismos
aquáticos enquanto os de alto peso molecular podem ser carcinogênicos e estão
amplamente distribuídos no meio ambiente (Newman & Unger, 2003).
Pela grande variedade de tamanho e massa molecular as propriedades
físicas dos HPAs variam muito, dependendo do composto de interesse. A Tabela
3 apresenta algumas características gerais dos HPAs: são sólidos à temperatura
ambiente, têm alto ponto de fusão e ebulição e baixa solubilidade em água. Com
o aumento da massa molecular a solubilidade diminui, os pontos de fusão e
ebulição aumentam e a pressão de vapor diminui. Consequentemente, estes
compostos variam bastante de comportamento, tanto em relação à sua
distribuição no ambiente aquático quanto em seus efeitos nos sistemas
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biológicos (Lima, 2001).
O coeficiente de partição octanol-água (Kow) descreve a tendência de
partição de um composto entre uma fase orgânica e uma fase aquosa. Este
parâmetro tem sido correlacionado
com fatores de bioconcentração em
organismos aquáticos, já que simula a partição da substância entre água e o
tecido adiposo. Pode-se observar na Tabela 3 que moléculas maiores têm maior
valor de Kow.
2.3.
Distribuição dos HPAs no ambiente aquático
Contaminantes orgânicos como os HPAs estão presentes em todo o meio
ambiente aquático. Sua distribuição é controlada por diversos processos físicos,
químicos e biológicos. Deve-se considerar a interação ar-água, água-sedimento,
água-biota, água-matéria orgânica dissolvida para entender os processos a que
eles estão sujeitos (Figura 2) (Lima, 1996).
A maioria dos HPAs que entra nos sistemas aquáticos permanece
relativamente próxima às suas fontes, decrescendo aproximadamente de forma
logarítmica, com a distância da origem. Assim, a grande maioria dos HPAs
encontrados está localizada em rios, estuários e águas costeiras (Lima, 2001).
Petróleo no meio ambiente aquático
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Tabela 3. Parâmetros físico-químicos de alguns HPAs.
28
Petróleo no meio ambiente aquático
29
Uma das fontes de HPAs para os oceanos é a deposição atmosférica. Os
HPAs liberados na atmosfera têm grande afinidade por partículas orgânicas
presentes no ar, sendo depositadas no mar tanto por deposição seca quanto
úmida (Hoffman, 2003). Pode haver também solubilização de compostos
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gasosos através da interface atmosfera-água.
Figura 2. Representação da distribuição dos hidrocarbonetos no meio aquático
(Fonte: Lima, 1996).
Nos casos de derrame de óleo a volatilização é um fator importante na
remoção dos hidrocarbonetos já que os compostos com maior pressão de vapor
vão evaporar mais facilmente. A quantidade evaporada pode variar de 10% para
óleos crus até 75% para os óleos leves (Ferreira, 1995). Entretanto, a
volatilização não provoca uma redução significativa dos hidrocarbonetos com
mais de quatro anéis benzênicos (Azevedo, 1998).
A solubilidade é de grande importância no comportamento de compostos
orgânicos no ambiente aquático. Apesar de, como um grupo, serem
considerados hidrofóbicos, os HPAs apresentam uma grande faixa de solubilidade em água. Segundo Varanasi (1989), Whitehouse, em 1984, demonstrou que
existe uma relação inversamente proporcional entre salinidade e solubilidade dos
HPAs, como previsto pela teoria de salting out, onde a adição de eletrólitos na
fase aquosa diminui a solubilidade dos HPAs. A solubilidade pode variar por um
fator de até dois na faixa de salinidade de 0 a 36 o/oo. Já a variação da
solubilidade dos HPAs com a temperatura pode chegar a um fator de cinco.
Petróleo no meio ambiente aquático
30
Como compostos com baixa solubilidade em água tendem a se ligar com o
material particulado presente, o comportamento de partição dos HPAs entre
água, sedimento e biota é principalmente determinado pelo conteúdo lipídico e
de carbono orgânico presentes.
Um importante parâmetro é o coeficiente de partição octanol-água (Kow).
Este descreve a tendência de partição de um composto entre a fase orgânica e
uma fase aquosa e é relacionado à solubilidade (S) pela Equação:
log Kow = a – b (log S)
(1)
onde a e b são constantes e S é a solubilidade do compostos em água.
Este coeficiente pode ser relacionado ao coeficiente de partição de
carbono orgânico (Koc), pela Equação (2). Esta equação descreve a tendência de
um composto orgânico ser adsorvido no solo ou sedimento quando em contato
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com água, quando o conteúdo de carbono orgânico do sorvente (foc) é
conhecido:
Koc = foc x Kow
(2)
Vários mecanismos como a troca iônica, ponte de hidrogênio, transferência
de carga, ligação covalente e adsorção hidrofóbica, controlam a interação da
matéria orgânica dissolvida (DOM) com compostos orgânicos, aumentando a
solubilidade dos HPAs na água, reduzindo sua volatilização e aumentando as
taxas de fotólise (Haitzer et al., 1998).
Segundo os autores op citem, apesar de aumentar a solubilidade dos
HPAs em água a DOM nem sempre aumenta sua biodisponibilidade, uma vez
que nem sempre há tempo suficiente para o xenobiótico se dissociar do
complexo DOM/substância química e se difundir pelas membranas das guelras
dos peixes, por exemplo.
Além
da
volatilização
e
solubilização,
os
HPAs
podem
sofrer
transformações fotoquímicas e metabólicas no ambiente aquático. Os HPAs
expostos à luz do sol podem ser convertidos à compostos polares por fotooxidação ou fotólise, durante a permanência desses na zona eufótica1, onde há
1
zona eufótica: camada de mar ou lago penetrada pela luz solar com intensidade suficiente para
permitir a fotossíntese.
Petróleo no meio ambiente aquático
31
luz para que estes processos ocorram. Já os HPAs que permanecem pouco
tempo na coluna d’água são mais resistentes à foto-oxidação (Sauer et al., 1993
apud Ke et al., 2002).
Na transformação metabólica os HPAs são degradados através de reações
de alguns organismos aquáticos, envolvendo a participação de enzimas
específicas. De 40 a 80% do óleo cru pode ser degradado por ação microbiana
(Hoffman, 2003).
Em relação a biota, os HPAs podem ser bioacumulados. Para que haja a
bioacumulação de um xenobiótico, a taxa de assimilação deve exceder a taxa de
eliminação deste. Muitos compostos lipofílicos como os HPAs, podem se
acumular quase que indefinidamente, se o organismo não for capaz de
transformá-los em metabólitos hidrofílicos, que são mais facilmente excretados.
Os peixes são capazes de metabolizar hidrocarbonetos e só o acumulam
em áreas muito poluídas. Já os organismos invertebrados têm metabolismo mais
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lento acumulando maiores quantidades de HPAs (Meador et al., 1995).
3
Toxicidade dos HPAs
3.1.
Considerações Gerais
O primeiro relato de câncer como efeito da exposição ao piche, ao alcatrão
e à fuligem foi feita pelo cirurgião Sir Percival Pott, em 1775, quando reportou a
alta incidência de câncer no órgão reprodutor masculino entre limpadores de
chaminés na Grã-Bretanha (Pereira Netto et al., 2000; Bjørseth & Ramdahl, 1985
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apud Lima, 2001), embora, somente em 1931, o benzo(a)pireno do carvão tenha
sido isolado e sintetizado (Costa, 2001).
Atualmente, pesquisas da Agência Internacional de Estudo do Câncer
(IARC) classificam alguns HPAs como carcinogênicos e/ou mutagênicos e/ou
genotóxicos (Quadro 1).
Compostos carcinogênicos são aqueles capazes de induzir um carcinoma,
tumor maligno com tendência a produzir metástase. Evidências sobre a
carcinogenicidade dos HPAs
são indicadas principalmente por estudos de
exposição ocupacional a misturas de HPAs resultantes de processos como a
produção de coque, refinamento do petróleo, entre outros (EPA, 2000).
Já compostos mutagênicos são capazes de induzir ou aumentar a
frequência de mutação no cromossomo de um organismo e compostos
genotóxicos são aqueles com capacidade de induzir alterações no material
genético de organismos a eles expostos.
Uma substância genotóxica é tóxica para o DNA. Ela pode se unir
diretamente a ele ou atuar indiretamente afetando as enzimas ligadas a sua
replicação, levando a mutações que podem levar ao aparecimento de um
câncer. No entanto, vale ressaltar que substâncias genotóxicas não são
necessariamente cancerígenas.
Estudos in vitro mostram que o benzo[a]pireno induz danos em células
procarióticas,
eucarióticas
e
células
de
mamíferos
produzindo
efeitos
genotóxicos variados, incluindo mutações genéticas em células somáticas,
formação de adutos de DNA, síntese de DNA não programada, entre outros
Toxicidade dos HPAs
33
(EPA, 2000). É importante ressaltar que muitos desses compostos, ao serem
metabolizados, podem dar origem a compostos mais tóxicos do que o original.
Nos Estados Unidos, a Agência de Proteção Ambiental americana (US
EPA) prioriza o monitoramento de 16 HPAs baseado em suas características
tóxicas, mutagênicas e carcinogênicas: naftaleno, antraceno, pireno, criseno,
fenantreno,
benzo(a)pireno,
benzo[g,h,i]perileno,
dibenzo[a,h]antraceno,
acenafteno,
acenaftileno,
benzo[a]antraceno,
fluoreno,
fluoranteno,
benzo[k]fluoranteno, benzo[b]fluoranteno, indeno[1,2,3-cd]pireno.
A exposição humana (e de outros animais) aos HPAs ocorre por diferentes
vias. As mais importantes são a inalação de ar poluído e a ingestão de alimentos
ou água contaminada.
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Quadro 1. Carcinogenicidade, genotoxicidade e mutagenicidade de alguns HPAs.
1
Genotoxicidade
2
3
HPA
Carcinogenicidade
Mutagenicidade
Fluoreno
I
L
Fenantreno
I
L
+
Antraceno
N
N
-
Fluoranteno
N
L
+
Pireno
N
L
+
Benzo(a)antraceno
S
S
+
Criseno
L
L
+
Benzo(e)pireno
I
L
+
Benzo(a)pireno
S
S
+
Perileno
I
I
+
Indeno(1,2,3-cd)pireno
S
I
+
Benzo(g,h,i)perileno
I
I
+
Dibenzo(a,h)antraceno
S
S
+
Coroneno
I
I
+
Fonte: Costa, 2001
S = suficientes; I = insuficientes; L = limitados; N = não carcinogênico. Genotoxicidade foi avaliada
através dos testes de deterioração do DNA; aberração cromossômica e mutagenicidade.
Mutagenicidade (teste de Ames): + (positivo), - (negativo).
3.2.
Metabolismo dos HPAs em peixes
Para assegurar sua sobrevivência, os organismos
desenvolveram
mecanismos de defesa para a proteção de suas células na presença de
Toxicidade dos HPAs
34
xenobióticos. Estes envolvem: a absorção, a distribuição, a biotransformação e a
excreção das substâncias estranhas.
A absorção em peixes ocorre por várias rotas, incluindo a alimentação e o
transporte direto através das membranas externas, sendo então distribuídos
para as diversas partes do corpo.
A biotransformação (metabolização) geralmente leva a formação de
compostos mais polares, portanto, mais hidrofílicos, consequentemente mais
facilmente excretados do que seu composto original. O órgão mais comumente
envolvido neste processo é o fígado. O fígado atua na emulsão de gorduras
através da produção da bílis, na metabolização de substâncias presentes na
corrente sanguínea e produção de vários compostos, como por exemplo,
proteínas. Esta atuação é devida a sua posição estratégica e por suas células
(hepatócitos) estarem entre as células mais ricamente perfundidas do organismo
(Livingstone, 1998; van der Oost, 2003).
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A biotransformação geralmente envolve dois estágios distintos, referidos
como reações da Fase I e da Fase II (Figura 3). Na Fase I, a biotransformação
de xenobióticos ocorre através de reações de redução, hidrólise e/ou oxidação,
sendo responsáveis por introduzir grupos funcionais no xenobiótico (Livingstone,
1998). A principal reação é a oxidação, catalisada principalmente pelo citocromo
P-450 monooxigenase, pelas monoamino oxidases (MAO) e pelas flavinas
monooxigenase (FMO) (Bastos, 2001).
As monooxigenases do citocromo P-450 são hemeproteínas associadas a
membranas principalmente do retículo endoplasmático. O nome P-450 vem de P
para pigmento e 450 para o comprimento de onda 450 nm, onde a absorção de
luz é máxima quando ligados a uma carbonila (CO) (Newman & Unger, 2003).
Na membrana, as isoenzimas estão associadas ao NADPH citocromo P-450
redutase que transfere elétrons ao conjunto de isoenzimas. Estas substâncias e
a membrana fosfolipídica formam a unidade responsável pela maior parte das
oxidações da Fase I através da reação (Newman & Unger, 2003):
RH + NADPH + O2 + H+ → ROH +NADP+ +H2O
(3)
onde:
RH é um composto orgânico a ser hidroxilado e NADPH é nicotina-adeninadinucleotídeo fosfato.
Toxicidade dos HPAs
35
FASE I
FASE II
Glicuronidação,
Xenobiótico
Oxidação,
Sulfoconjugação,
Redução, Hidrólise
Conjugação com GSH
Monooxigenases do Cit. P-450
Produtos
Primários
GST, UGT,
Produtos
Secundários
ST
Monoaminooxidades (MAO)
Flavinas Monooxigenases
Excreção
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Lipofílico
Hidrofílico
GST: Glutation S-transferases
UGT: Uridina Difosfoglicuronosil transferases
ST: Sulfotransferases
Figura 3. Esquema de biotransformação de xenobióticos (adaptado de Bastos, 2001).
Segundo Newman & Unger (2003) as monooxigenases do citocromo P-450
estão envolvidas no metabolismo de uma grande variedade de xenobióticos e
também no metabolismo de ácidos graxos, colesterol e hormônios esteróides.
Mudanças bioquímicas associadas a indução do citocromo P-450 foram usadas
por vários pesquisadores como biomarcadores na presença de contaminantes
orgânicos tais como os HPAs (Eggens et al., 1996; Camus et al., 1998; Barra et
al., 2001; Jewett et al., 2002).
As reações de hidrólise são catalisadas principalmente pelas epóxido
hidrolases como também pelas peptidases e pelas A-estearases. As reduções
são catalisadas por várias enzimas, dentre elas as carbonil redutases e as
glutation redutases, como também por processos não enzimáticos através de
agentes redutores (Bastos, 2001).
A Fase II freqüentemente envolve reações de conjugação na tentativa de
neutralizar o xenobiótico. Estas reações de conjugação são catalisadas pelas
glutation S-transferases (GST), uridina difosfoglicuronosil transferases (UGT) e
sulfotransferases (ST).
Toxicidade dos HPAs
36
Além disso, em múltiplas reações metabólicas de transferência de elétrons
em células aeróbicas são formadas espécies reativas de oxigênio (ERO). Estas
espécies
reativas
também podem resultar do metabolismo
de certos
xenobióticos e causam peroxidação de lipídios, alterações em proteínas e em
ácidos nucléicos, produzindo danos às células. A proteção contra estas ERO é
feita pelas enzimas superóxido dismutase, catalase, GST, glutation peroxidase
selênio-dependente, aldo-ceto redutase e enzimas de reparo do DNA.
Em geral, o aumento da polaridade da molécula leva à perda do potencial
tóxico do composto sendo biotransformado, levando a desintoxicação. Porém,
em alguns casos, pode ocorrer a ativação metabólica da molécula e o
xenobiótico pode ser convertido em um produto com maior potencial tóxico
(bioativação).
Atualmente, o mecanismo mais aceito para a ativação dos HPAs é a
oxidação enzimática seguida de hidrólise com a formação de diolepóxidos
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(Figura 4). A ligação entre os diolepóxidos, resultantes da ativação metabólica
destas substâncias, e o DNA é favorecida quando diolepóxidos vicinais são
formados, principalmente nas moléculas não lineares, que contenham regiões de
baía, como o benzo(a)pireno (Figura 5) (Pereira Netto et al., 2000; Bastos, 2001;
Hosnedl et al., 2003).
Figura 4. Mecanismo de ativação dos HPAs. (Adaptado de Pereira Netto et al., 2000)
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Toxicidade dos HPAs
37
Figura 5. Representação esquemática simplificada do metabolismo do benzo[a]pireno.
3.2.1.
O metabolismo do pireno
Como nesta dissertação o composto usado como referência é o pireno é
importante conhecermos os metabólitos que são gerados na sua biotransformação. Apesar de não ser considerado tóxico, o pireno é muito usado como
referência pela relativa simplicidade da sua biotransformação e por sua
abundância no meio ambiente aquático.
O principal metabólito gerado na Fase I é o 1-hidroxipireno já que, por ser
simétrica, a hidroxilação na molécula de pireno se dá preferencialmente nos
átomos de carbono C-1, C-3, C-6 e C-8 (Figura 6) sendo o metabólito obtido em
todos os casos chamado de 1-hidroxipireno (Luthe et al., 2002). Na Fase II é
formado principalmente o metabólito pireno-1-glucoronídeo (Bains & Kennedy,
2004) e em menor quantidade o pireno-1-sulfato que são então excretados na
bílis dos peixes.
Toxicidade dos HPAs
38
Figura 6. Estrutura do pireno.
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3.3.
A bílis e a formação de biliverdina
3.3.1.
A bílis
Uma das funções do fígado é a formação de bílis. A bílis desempenha
papel importante na digestão e absorção de gorduras, ajudando a emulsificar as
grandes moléculas de gordura transformando-as em moléculas menores. Além
disso, a bílis serve como meio de excreção de xenobióticos, entre outras
substâncias (Guyton & Hall, 2002; Kierszenbaum, 2004).
A eliminação biliar de xenobióticos foi pouco estudada durante a primeira
metade do século XX. A partir de 1950, com o aparecimento de uma grande
variedade de substâncias químicas sintéticas, foi reconhecida a importância da
bílis como via de excreção destes compostos (Klaassen & Watkins, 1984).
A bílis é secretada pelos hepatócitos, células funcionais metabólicas do
fígado. Esta secreção é formada por ácidos biliares, colesterol e outros
constituintes orgânicos. Em seguida, a bílis flui pelos canalículos biliares (Figura
7) até atingir o ducto hepático e o colédoco, podendo ser liberada diretamente no
duodeno e principalmente desviada para a vesícula biliar (Guyton & Hall, 2002).
Segundo os autores op citem, a bílis inicial recebe uma segunda secreção
aquosa de íons sódio e bicarbonato a fim de neutralizar o ácido proveniente do
estômago que deságua no duodeno. Em condições normais esta se encontra
concentrada na vesícula biliar por cerca de cinco vezes, podendo chegar a um
máximo de 20 vezes.
Toxicidade dos HPAs
39
Figura 7. canalículo bilífero (Kierszenbaum, 2004).
A bílis é formada basicamente de água (~97%) e sais biliares (1-2%),
quando secretada pelo fígado. Na vesícula biliar o conteúdo de água diminuiu
para 87% como resultado de sua concentração. São encontradas outras
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substâncias tais como os pigmentos biliares, biliverdina e bilirrubina, substâncias
derivadas da degradação da hemoglobina, além de metabólitos de xenobióticos.
Quando o peixe se alimenta, o início da digestão na porção superior do
trato gastrintestinal leva ao esvaziamento da vesícula biliar, sobretudo quando
alimentos gordurosos chegam ao duodeno. Acredita-se que ao esvaziar a
mesma se encha rapidamente de água, diminuindo a concentração de
xenobióticos presentes (Richardson et al., 2004).
Dessa forma, um peixe que passe maior período de tempo sem se
alimentar terá maior quantidade de metabólitos de HPAs sulfatados e
glicuronidados na vesícula biliar (Beyer et al., 1997; Richardson et al., 2004) e,
consequentemente, maior concentração de HPAs na bílis, quando comparado a
outro recém alimentado.
As quantidades de biliverdina e de proteína biliar, indicativos de densidade
da bílis, podem ser utilizadas como indicadores da situação (status) alimentar do
peixe.
3.3.2.
A formação de biliverdina
A principal função dos eritrócitos (hemácias) consiste em transportar
hemoglobina, esta é responsável pelo transporte de oxigênio para os tecidos.
Toxicidade dos HPAs
40
Quando a membrana eritrocitária dos eritrócitos se torna frágil, as células se
rompem durante sua passagem por algum ponto estreito da circulação, liberando
a hemoglobina que é quase imediatamente fagocitada por macrófagos do
sistema reticuloendotelial. Isto ocorre em muitas partes do organismo porém,
particularmente pelas células de Kupffer do fígado e por macrófagos no baço e
na medula óssea, liberando globina e heme (Guyton & Hall, 2002).
O anel heme é oxidado a α-meso-hidroxiheme, que no estado
desprotonado tem características de radical livre, reagindo com oxigênio para
produzir verdoheme e carbonila (Figura 8). A verdoheme é então, convertida a
biliverdina e ferro livre em uma reação que requer um NADPH-citocromo P-450redutase e O2. A liberação da biliverdina é uma etapa lenta, mas que pode ser
acelerada na presença de biliverdina redutase, enzima que converte a biliverdina
em bilirrubina (Montellano, 2000), sendo então, gradualmente liberada no plasma
pelos macrófagos (Guyton & Hall, 2002).
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A biliverdina é responsável pela pigmentação característica de alguns
peixes, anfíbios, répteis e insetos e pela coloração da casta do ovo de alguns
pássaros (Colleran & Heirwegh, 1979).
Em mamíferos os pigmentos biliares não parecem ter nenhum papel
funcional claro. Eles aparentemente servem como produtos finais do catabolismo
da heme da hemoglobina, destinados à rápida excreção.
Figura 8. Oxidação do anel heme até a formação de biliverdina.
4
Monitoramento ambiental
O monitoramento ambiental é uma importante ferramenta para a
administração dos recursos naturais. Este oferece conhecimento e informações
básicas para avaliar a presença de contaminantes, para compreender os
sistemas ambientais e para dar suporte as políticas ambientais.
O monitoramento consiste em observações repetidas de uma substância
química químico ou mudança biológica, com um propósito definido de acordo
com um planejamento prévio ao longo do tempo e espaço, utilizando métodos
comparáveis e padronizados. Segundo van der Oost e colaboradores (2003), os
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cinco métodos de monitoramento ambiental que devem ser seguidos para avaliar
o risco de contaminantes para os organismos e classificar a qualidade ambiental
dos ecossistemas são:
-
monitoramento químico – avalia a exposição medindo os níveis de
contaminantes bem conhecidos nos compartimentos ambientais;
-
monitoramento da bioacumulação – avalia a exposição medindo os níveis
de contaminantes na biota ou determinando a dose crítica no local de
interesse (bioacumulação);
-
monitoramento do efeito biológico – avalia a exposição e o efeito
determinando as primeiras alterações adversas que são parcial ou
totalmente reversíveis (biomarcadores);
-
monitoramento da saúde – avalia o efeito através do exame da ocorrência
de doenças irreversíveis ou danos no tecido dos organismos;
-
monitoramento dos ecossistemas – avalia a integridade de um
ecossistema através de um inventário de composição, densidade e
diversidade das espécies, entre outros.
Monitoramento ambiental
42
Quando organismos vivos são usados no monitoramento ambiental para
avaliar mudanças no meio ambiente ou na qualidade da água o monitoramento é
chamado de monitoramento biológico ou biomonitoramento.
Para que um
biomonitoramento seja bem sucedido é importante a escolha do biomonitor que
atenda as seguintes características (Figueira, 2006):
capacidade de acumulação mensurável da substância química de
•
interesse;
•
distribuição generalizada na área de estudo;
•
ausência de variações sazonais na quantidade disponível para
amostragem;
capacidade de acumulação diferenciada do poluente, relacionando a
•
intensidade de exposição ao fator ambiental. Esta relação deve poder ser
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descrita de uma forma quantitativa ou semi-quantitativa;
•
ausência de variações sazonais na capacidade de acumulação;
•
acumulação da substância química apenas pela via que se quer avaliar;
•
identificação taxonômica fácil;
•
que tenha sua fisiologia, ecologia e morfologia suficientemente estudada.
Assim, durante o biomonitoramento são utilizados biomarcadores
(celulares, tecido, fluidos corporais, mudanças bioquímicas, entre outros) para
indicar a presença de poluentes ou como sistema de aviso de efeitos iminentes.
4.1.
Biomarcadores
O biomarcador é uma característica que pode ser: bioquímica, fisiológica,
morfológica ou histológica, utilizada para indicar a exposição ou o(s) efeito(s) de
uma substância sobre o organismo de um ser vivo. A qualidade de um
biomarcador está relacionada a capacidade de uma mudança ser medida antes
que alguma consequência adversa significativa ocorra no organismo de
interesse. Um biomarcador ideal deve ser específico para um composto ou
classe de compostos, podendo ser utilizado em diferentes espécies (IPCS,
1993).
Monitoramento ambiental
43
Convém salientar que é necessário que o sistema envolvido seja bem
conhecido para que se possa interpretar a influência que o meio ambiente
exerce sobre ele.
A ordem seqüencial de resposta ao estresse causado por um poluente em
um sistema biológico é visualizado na Figura 9. O efeito em nível hierárquico
superior é sempre precedido por mudanças no processo biológico. Desta forma,
o biomarcador é utilizado como um sinal prévio refletindo a resposta biológica
causada por uma toxina.
primeiros sinais
(biomarcadores)
molecular
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subcelular (organelas)
celular
Exposição a um
tecido
poluente
sistêmico (órgãos)
organismo
efeitos tardios
Figura 9. Representação esquemática da ordem sequencial de respostas ao estresse
causado por poluentes em um sistema biológico (adaptado de van der Oost et al., 2003).
Biomarcadores podem ser divididos em três classes (National Research
Council, 2003; IPCS, 1993):
-
biomarcadores de exposição: são aqueles que detectam e
mensuram a quantidade de uma substância exógena,
seus
metabólitos ou o produto da interação entre o xenobiótico e a
molécula ou célula alvo em um compartimento do organismo;
-
biomarcadores de efeito: são aqueles que incluem alterações
bioquímicas, fisiológicas ou outra alteração nos tecidos ou fluidos
Monitoramento ambiental
44
corporais de um organismo que podem ser reconhecidos e
associados com uma doença ou possível prejuízo a saúde;
-
biomarcadores de suscetibilidade: são aqueles que indicam a
habilidade adquirida ou inerente de um organismo a responder a
exposição a um xenobiótico específico, incluindo fatores genéticos e
mudanças nos receptores que alteram a suscetibilidade de um
organismo a uma dada exposição.
Os biomarcadores de exposição podem ser usados para confirmar ou
estimar a exposição de indivíduos ou de uma população a uma determinada
substância ou grupo de substâncias fornecendo uma relação entre a exposição
externa e a dose interna. De acordo com a definição, a bioacumulação de certos
contaminantes persistentes em tecido de animais pode ser considerada com um
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biomarcador de exposição.
Os biomarcadores de efeito podem ser usados para documentar
alterações pré-clínicas ou efeitos adversos a saúde devido a exposição externa e
absorção de determinada substância.
Os biomarcadores de suscetibilidade ajudam a elucidar a variação no grau
de resposta da exposição a substâncias tóxicas observadas em diferentes
indivíduos.
O uso de biomarcadores de peixes no estudo da resposta biológica e
bioquímica a contaminantes tem atraído grande interesse já que podem ser
encontrados praticamente em todos os ambientes aquáticos e desempenham
importante papel na cadeia alimentar, já que têm a função de transportar energia
de níveis tróficos inferiores para níveis superiores (Beyer et al., 1996).
No entanto, as variações na fisiologia de diferentes espécies de peixes
podem repercutir de forma diferenciada nas respostas de um biomarcador.
Apesar disso e de sua alta mobilidade, peixes são considerados bons
organismos para o monitoramento da poluição em ambientes aquáticos.
Baseados nos critérios formulados por Stegeman e colaboradores (1992),
van der Oost e colaboradores (2003) propõem seis critérios que devem ser
observados para avaliar um biomarcador em peixes:
(1) Confiabilidade na quantificação do biomarcador (com controle de
qualidade) resultante de ensaios simples e de baixo custo;
Monitoramento ambiental
45
(2) Sensibilidade da resposta do biomarcador a exposição ou a efeitos de
poluentes utilizados como parâmetros de aviso;
(3) Definição clara dos dados de base de modo a permitir a distinção
entre a variabilidade natural (ruído) e o estresse induzido pelo
contaminante (sinal);
(4) Conhecimento dos fatores que possam dificultar a interpretação da
resposta do biomarcador à exposição ao poluente;
(5) Estabelecimento do mecanismo de relação entre a resposta do
biomarcador e a exposição ao poluente (dosagem e tempo);
(6) Estabelecimento do valor toxicológico do biomarcador, tal como a
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relação entre sua resposta e o impacto ao organismo.
5
Ecologia e biologia do peixe Mugil liza (tainha)
5.1.
Mugil liza (tainha)
Nesta dissertação serão feitos estudos para a medição de metabólitos de
HPAs na bílis de tainhas, sendo este um dos peixes mais comuns na região da
Baía de Guanabara, de fácil captura e cuja vesícula biliar é de fácil localização.
Para evitar variações no metabolismo entre indivíduos de diferentes espécies da
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mesma família, a espécie escolhida para estudo foi Mugil liza Valenciennes,
1836 que tem a seguinte taxonomia:
Classe OSTEICHTHYES
Subclasse ACTINOPTERYGII
Subdivisão TELEOSTEI
Série PERCOMORPHA
Ordem Perciformes
Família Mugilidae
Gênero Mugil
Espécie liza
A classe Osteichthyes corresponde a classe dos peixes ósseos, onde a
subclasse Actinopterygii corresponde aos peixes com nadadeira de raios e
aberturas branquiais protegidas por um opérculo ósseo.
Os teleósteos constituem o último grupo dos peixes de nadadeira raiada e
são atualmente os peixes dominantes. Sua nadadeira caudal é simétrica,
embora o eixo ainda se curve para cima. As nadadeiras pares são pequenas; as
peitorais podem atuar como freio e as nadadeiras pélvicas estão freqüentemente
localizadas bem à frente. Os teleósteos são os mais numerosos dos vertebrados,
devendo-se em parte, a uma eficiente organização corporal e reprodução.
Devido à sua abundância, constituem uma importante fonte de alimento para o
homem.
Ecologia e biologia do peixe Mugil liza
47
Os peixes da família Mugilidae têm ampla distribuição, ocorrendo em
águas tropicais e subtropicais de todo o mundo, principalmente nas regiões
costeiras estuarinas (Fishbase, 2005). São peixes detritívoros que se alimentam
de material orgânico derivado de corpos de organismos mortos ou fragmentos
destes e excreções deixadas por organismos vivos. Além disso, uma grande
variedade de invertebrados pode ocorrer no detrito (Oliveira, 1997).
No sudeste do Brasil ocorre apenas o gênero Mugil, representado por sete
espécies (Menezes, 1983). Na identificação das espécies a contagem de
escamas ao longo das séries laterais do corpo é feita a partir da escama que fica
imediatamente acima da base da nadadeira peitoral e atrás da margem
membranosa superior do opérculo até a base caudal, sem incluir as pequenas
escamas que recobrem a base dos raios medianos da nadadeira caudal.
A espécie Mugil liza foi primeiro descrita por Valenciennes em 1836. Esta
espécie possui corpo alongado, fusiforme, com estrias escuras longitudinais
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alternadas com estrias claras e a ausência quase total de escamas nas
nadadeiras anal e segunda dorsal (Figura 10). Sua maturidade sexual é atingida
quando seu tamanho chega a aproximadamente 40 cm (Menezes, 1983).
Figura 10. Mugil liza.
A espécie é pelágica, vivendo na coluna d’água ou na superfície, os jovens
permanecem no estuário, ambientes calmos, abrigados e ricos em alimentos, até
que suas gônadas iniciem a maturação. Sua desova ocorre em alto mar, porém
uma fase estuarial é obrigatória para os juvenis, à qual se segue o período de
migração reprodutiva para o mar (Bizerril & Costa, 2001).
A Mugil liza forma grandes cardumes, principalmente durante a migração
reprodutiva, quando entram nos estuários, que são áreas onde a boca do rio
entra no mar, havendo mistura de água doce e salgada.
Ecologia e biologia do peixe Mugil liza
48
5.2.
Análise biométrica
A Análise Biométrica ou Biometria é dividida em análises merísticas, que
analisa tudo que pode ser contado, e análise morfométrica, que analisa tudo que
pode ser medido.
Como informação básica que permitisse garantir a homogeneidade dos
indivíduos da espécie estudada (unidades amostrais) foi feita a análise
morfométrica a partir das seguintes grandezas (Figura 11):
a) Comprimento total (LT): obtido com o exemplar colocado com o flanco
direito sobre o ictiômetro, com o focinho encostado ao braço vertical do mesmo.
Considera-se a medição horizontal da ponta do focinho à maior extremidade da
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nadadeira caudal;
b) Comprimento padrão (LP): distância da ponta do focinho à porção
distal do pedúnculo caudal (base dos raios da nadadeira caudal);
c) Comprimento da cabeça (LC): distância da ponta do focinho à margem
posterior do opérculo;
d) Altura do corpo (AC): distância vertical, em ângulo reto com o eixo
longitudinal do peixe, entre os contornos dorsal e ventral do corpo, na altura da
inscrição da nadadeira peitoral, obtida a partir de um paquímetro;
Figura 11. Diagrama do corpo do peixe e as medidas utilizadas.
Além destas variáveis, obteve-se também o peso total do exemplar (W T),
antes de qualquer manipulação.
Ecologia e biologia do peixe Mugil liza
49
5.2.1.
Estimativa do Peso Total (WT) e Comprimento Padrão (LP)
Segundo Vazzoler (1982) é de fundamental importância para o estudo do
ciclo de vida de uma população conhecer seu crescimento e peso. Populações
distintas de uma mesma espécie apresentam taxas diferentes de crescimento e
peso.
Para estimar o peso total do peixe (W T) a partir do seu comprimento
padrão (LP) utiliza-se a seguinte equação:
WT = α ⋅ LPβ
(4)
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com α e β obtidos após a transformação logarítmica da equação acima:
log (WT) = log (α) + β log (LP)
(5)
Inicialmente, os valores de peso e comprimento padrão são obtidos para
sexos em separado. Esta separação é necessária devido à uma ocorrência mais
generalizada de dimorfismo relacionado com a estratégia de reprodução, visto
que a fecundidade aumenta com o comprimento dos indivíduos (Okumus &
Bascinar, 1997; Lowe-McConnell, 1999).
Ajusta-se aos dados a equação (2) e aplicando o teste t-student aos
valores de α e β relativos à regressão entre sexos para constar diferença entre
ambos. Quando não há diferença significativa os dados podem ser agrupados e
calcula-se a expressão para a espécie.
5.2.2.
Fator de condição (K)
O estado fisiológico de um peixe é condicionado pela interação de fatores
bióticos e abióticos, sendo a variação nesse estado expressa através do Fator
de Condição (K). Este fator indica condições alimentares recentes e varia
durante o ciclo de maturidade sexual de um peixe.
Ecologia e biologia do peixe Mugil liza
50
Admite-se que o peixe cresce isometricamente em todas as dimensões,
sendo os valores do fator de condição comparáveis somente quando os mesmos
são sexualmente maduros.
O Fator de Condição aqui considerado é o alométrico, que é expresso
pela relação:
K=
WT
LβP
(6)
onde W T é o peso total (g) e LP é o comprimento padrão do peixe (cm).
Outros índices usados com o mesmo fim são os índices gonadal (IG) e o
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de maturidade (IM), dados por:
IG =
WG
L3T
(7)
IM =
WG
LC
(8)
onde W G é o peso das gônadas e W C = W T – W G.
5.3.
Órgãos reprodutores
Para a identificação dos órgãos reprodutores deve-se realizar uma incisão
cuidadosa para não atingir e danificar os órgãos internos. Na cavidade
abdominal localizam-se:
Testículos: em geral apresentam forma alongada, sendo na fase inicial de
desenvolvimento tubulares; nas fases seguintes apresentam lobulares. A
coloração é esbranquiçada;
Ecologia e biologia do peixe Mugil liza
51
Ovários: apresentam forma alongada-tubular; nas fases iniciais são
translúcidos e nas seguintes sua coloração varia de amarelo, amarelo-rosado e
avermelhado. Após as fases iniciais de desenvolvimento, os ovócitos tornam-se
visíveis.
5.3.1.
Estágios de maturação sexual
Os estágios de maturidade das gônadas são classificados utilizando um
estereomicroscópio, com a escala proposta por Vazzoler (1982) como:
a) Imaturos: os ovários são filiformes, translúcidos, de tamanho reduzido,
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juntos a coluna vertebral; a olho nu não se observam os ovócitos. Os testículos
também são reduzidos, filiformes, com posição semelhante a dos ovócitos;
b) Em maturação: os ovários ocupam cerca de 1/3 a 2/3 da cavidade
abdominal, com intensa rede capilar; a olho nu observam-se grânulos opacos de
tamanho variado, os ovócitos. Os testículos, do mesmo modo que os ovários,
apresentam-se desenvolvidos, com forma lobulada, sendo que, com uma certa
pressão, sua membrana rompe-se eliminando esperma leitoso, viscoso;
c) Maduro: os ovários aparecem túrgidos, ocupam quase que totalmente
a cavidade abdominal; a olho nu observam-se ovócitos maduros que se
apresentam como grânulos esféricos e opacos e/ou translúcidos e grandes, cuja
freqüência varia com o progresso da maturação. Os testículos também
aparecem túrgidos, ocupam quase que totalmente a cavidade abdominal; com
uma fraca pressão, sua membrana rompe-se eliminando esperma menos
viscoso que o estado anterior;
d) Esvaziado: os ovários apresentam-se com aspecto hemorrágico,
completamente flácidos, ocupando menos 1/3 da cavidade abdominal,
observando-se poucos ovócitos, em estado de reabsorção. Os testículos
também apresentam-se flácidos, com aspecto hemorrágico; a membrana não se
rompe sob fraca pressão;
Ecologia e biologia do peixe Mugil liza
52
e) Em repouso: tem caracterização macroscópica bastante difícil, por
apresentarem aspectos semelhantes ao aspecto B, contudo suas membranas
são mais espessas ocorrendo em exemplares acima de 200 mm em épocas bem
definidas do ano.
Os
ovários
no
estágio
D
ocorrem
em
baixíssima
freqüência,
provavelmente, devido a curta duração desta fase.
A proporção entre jovens e adultos entre as diferentes épocas e locais de
coleta pode indicar períodos e áreas de recrutamento, assim pode-se considerar
peixes jovens como aqueles tiveram o estágio de maturidade gonodal
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classificado como imaturo (A) e adultos aqueles nos demais estágios.
6
Determinação de HPAs em peixes
Várias técnicas analíticas têm sido usadas para determinar os níveis de
HPAs e seus metabólitos em peixes. As técnicas mais comumente usadas
incluem a cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (CG/FID),
cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM),
cromatografia em fase líquida de alta eficiência com detector de ultravioleta ou
de fluorescência (CLAE/UV, CLAE/F), cromatografia de camada fina com
detector de fluorescência. Além destas técnicas quantitativas podem ser usadas
técnicas semi-quantitativas de fluorescência, técnicas de imunoensaio, entre
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outras.
Como matrizes podemos ter o tecido de diversos órgãos, e fluidos
biológicos como sangue e bílis. Por ser uma matriz complexa, a análise do tecido
exige uma etapa de extração dos HPAs da matriz e “clean up” antes da análise
propriamente dita, sendo um procedimento caro e demorado. Já a análise da
bílis do peixe é uma técnica mais simples pois não são necessárias etapas de
extração.
6.1.
Técnicas de extração e clean-up
O objetivo da extração é separar o HPA da matriz, com mínima coextração
de outros compostos e mínima degradação do HPA extraído. As amostras
devem ser extraídas o mais rápido possível após sua coleta, para minimizar a
degradação, sublimação e outras rotas de perda dos HPAs. Como exemplo de
perda por armazenagem temos a adsorção de HPAs nas paredes dos frascos de
vidro de amostras aquosas. Já em solventes orgânicos o HPA parece ser estável
(Bjørseth, 1983).
Como os HPAs se degradam facilmente na presença de radiação ultravioleta, deve-se evitar expor as amostras durante as etapas de extração e
análise, a fim de evitar sua fotodecomposição. A degradação térmica e a
Determinação de HPAs em peixes
54
sublimação também podem causar perdas de HPA durante a extração. É
recomendado
que
sejam
usados
solventes
relativamente
voláteis
em
procedimentos de refluxo ou destilação para permitir a concentração do extrato
em baixas temperaturas. Manter a temperatura abaixo de 45 oC reduz ou até
elimina as perdas de HPAs. Mas, a perda de HPAs com dois anéis pode chegar
até a 80% na concentração do extrato por evaporador rotativo (Bjørseth, 1983).
Os métodos de extração mais comuns são:
•
Extração com solvente: Soxhlet, ultra-som, extração mecânica de
alta intensidade e extração líquido-líquido;
•
Extração por métodos térmicos: sublimação e destilação;
•
Extração em fase sólida: carbono, resinas macroreticulares, sílica
gel, florisil, alumina, fase sólida ligada a sílica;
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•
Métodos de digestão.
Na extração com solvente, a eficiência da extração dos HPAs depende da
polaridade do solvente usado, da natureza da matriz e da preparação das
amostras.
Matrizes complexas como alimentos contém uma série de compostos
hidrofóbicos e é necessário que haja uma etapa de clean-up para que estes
sejam removidos.
Para o clean-up de amostras existe uma série de procedimentos que
podem ser usados tais como: fracionamento solvente:solvente, extração em fase
sólida, cromatografia de camada fina, cromatografia em coluna e cromatografia
por exclusão. Um dos métodos mais eficientes e seletivos é a coluna
cromatográfica com Al2O3·H2O de atividade IV. Eluentes como o hexano,
extraem todos os hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos não polares enquanto
os componentes que correspondem a maior quantidade de material dissolvido,
como os lipídios, ficam adsorvidos na coluna. Este procedimento foi sugerido
como método de escolha para o padrão ISO (Stolyhwo & Sikorski, 2005). Já para
matrizes de alto teor de lipídio, foi demonstrado que o uso da cromatografia por
permeação em gel, embora seja uma técnica mais cara, dá melhores resultados
(Rizel, 2003).
Determinação de HPAs em peixes
55
6.2.
Determinação de HPAs em bílis de peixe
Como o metabolismo de vertebrados é eficaz na biotransformação e
eliminação de HPAs, eles não se acumulam no tecido de peixes. Assim, os
níveis de HPAs no tecido não são considerados um bom marcador de
bioacumulação destes compostos já que não refletem os níveis destes
xenobióticos no meio ambiente (van der Oost et al., 2003). Assim, vários
cientistas passaram a usar a análise de metabólitos de HPAs em bílis de peixe
para monitorar o meio ambiente e demonstrar sua correlação com a exposição a
estes compostos (Krahn et al, 1984; Beyer et al., 1996, 1998; Lin et al., 1996;
Aas et al., 1998, 2000; Verweij et al., 2004; Haugland et al., 2005).
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Neste tipo de análise os compostos presentes na bílis são metabólitos,
produto da biotransformação dos HPAs no seu fígado, sendo compostos
hidroxilados e conjugados. Estes metabólitos refletem a exposição dos peixes
aos HPAs de 2 a 3 dias, onde a migração dos peixes não deve exercer influência
nos resultados (Ariese et al., 1993).
O primeiro trabalho onde os metabólitos de HPAs na bílis de peixe foram
usados como biomarcadores foi publicado em 1984 por Krahn e colaboradores.
Neste trabalho foi usada a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector
de fluorescência (CLAE-F), sem a separação completa ou identificação dos
metabólitos individuais. Os comprimentos de onda de excitação e emissão
usados foram, respectivamente, 380/430 nm para medir metabólitos do tipo
benzo(a)pireno e 290/335 nm para medir metabólitos do tipo naftaleno.
Em 1993 Ariese e colaboradores, usando peixes contaminados em
cativeiro, demonstraram existir correlação entre o método de determinação por
CLAE-F
e
por
fluorescência
sincronizada
(Synchronous
Fluorescence
Spectroscopy - SFS) para os comprimentos de onda de excitação e emissão de
380/430 nm. No ano seguinte, Lin e colaboradores
publicam um segundo
trabalho usando esta mesma técnica.
Em 1996 Lin e colaboradores estudaram o uso da medição por
fluorescência fixa (Fixed Fluorescence - FF) de metabólitos do tipo naftaleno e
metabólitos do tipo benzo(a)pireno, comparando com análises por cromatografia.
Neste estudo foram usados 3 diferentes tipos de peixes. Foi encontrada forte
correlação entre as duas técnicas, sendo as medições por FF, em geral,
Determinação de HPAs em peixes
56
menores que as medições feitas por CLAE-F. Além disso, foi demonstrado que
com a utilização desta técnica foi possível discriminar locais impactados de
outros não impactados.
Atualmente, são empregadas usualmente 5 técnicas diferentes, sendo três
semi-quantitativas: fluorescência com comprimentos de onda de excitação e
emissão fixos (FF) e comprimentos de onda de excitação e emissão
sincronizados (SFS) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de
Fluorescência (CLAE/F). Para a separação e quantificação dos HPAs podem ser
usadas técnicas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de
Fluorescência (CLAE/F) ou Cromatografia Gasosa acoplada a um espectrômetro
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de Massas (CG/EM) (Figura 12) (Ariese et al., 2005b).
Figura 12. Métodos de determinação de HPAs em bílis de peixe (adaptado de Ariese et
al., 2005b).
A vantagem de usar as técnicas semi-quantitativas é a sua rapidez e baixo
custo, já que não é necessária uma etapa de “clean up”, sendo indicadas para o
monitoramento ambiental em casos de derrame de óleo. No caso da CLAE,
para que esta técnica seja quantitativa a bílis deve ser hidrolisada
enzimaticamente, permitindo a detecção dos compostos hidroxilados livres. Para
a análise por cromatografia gasosa é necessária uma etapa de extração para
separar os HPAs hidrolisados da matriz e a derivatização pode ser usada para
aumentar a separação e sensibilidade. Este método é o mais indicado para a
Determinação de HPAs em peixes
57
análise de HPAs com 2 e 3 anéis por sua seletividade, sendo indicado para a
análise de exposição à petróleo. Já o CLAE é mais indicado para a detecção de
compostos com 4 ou 5 anéis, sendo indicado para contaminação por HPAs
resultantes de processos de combustão (Ariese et al., 2005b).
Além de sua simplicidade e baixo custo, alguns autores demonstraram que
as análises de bílis de peixe por fluorescência fixa têm uma boa correlação com
as análises feitas por CLAE com detetor de fluorescência, indicando que esta
técnica é uma boa ferramenta para o monitoramento de HPAs na bílis de peixe.
(Lin et al., 1996; Vuontisjärvi et al., 2004).
Nesta dissertação foi usada a técnica espectroscópica de Fluorescência
Fixa (Fixed Fluorescence) para o estudo semi-quantitativo dos metabólitos de
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HPAs na bílis dos peixes coletados na Baía de Guanabara.
6.3.
Fluorescência molecular
Quando orbitais atômicos se combinam formam um orbital molecular
ligante, de energia mais baixa, e um orbital molecular anti-ligante, de energia
mais alta. No estado fundamental, os elétrons de uma molécula ocupam os
orbitais de energia mais baixos. A ligação dupla em uma molécula orgânica
contém dois tipos de orbitais moleculares, um orbital sigma (σ), correspondente
a um par de elétrons ligantes e um orbital molecular pi (π) associado a outro par.
Os orbitais π são formados pela superposição paralela de orbitais p atômicos.
Muitos compostos orgânicos contém elétrons não-ligantes e esses elétrons nãocompartilhados são designados pelo símbolo n.
No estado fundamental, os HPAs são sistemas onde todos os orbitais π
ligantes estão ocupados por dois elétrons com spins opostos e todos os orbitais
π antiligantes (π*) estão desocupados e os orbitais estão em simetria. As
energias dos orbitais mais externos são particularmente importantes para as
propriedades físico-químicas dos HPAs, já que suas energias determinam as
propriedades dos HPAs. Os elétrons responsáveis pela formação dos orbitais
moleculares π são os elétrons 2pz do carbono (Bjørseth, 1983).
Conforme mostrado na Figura 13, as energias dos vários tipos de orbitais
moleculares diferem significativamente. Quase sempre o nível de energia de um
elétron não-ligante situa-se entre os níveis de energia dos orbitais σ e π ligantes
Determinação de HPAs em peixes
58
e antiligantes. As transições eletrônicas entre certos níveis de energia podem
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ocorrer por absorção de radiação (Skoog, 2002).
Figura 13. Diagrama parcial de energia de um sistema fotoluminescente (fonte: Skoog,
2002).
Todos os compostos orgânicos são capazes de absorver radiação
eletromagnética já que todos contém elétrons de valência que podem ser
excitados a níveis de energia mais altos. As energias de excitação associadas a
elétrons formando a maior parte ligações simples são altas, de modo que a
absorção por elas está restrita à chamada região ultravioleta de vácuo
(comprimento de onda (λ) < 185 nm). As dificuldades experimentais associadas
com o ultravioleta de vácuo são significativas e como conseqüência, a maioria
das investigações espectrofotométricas de compostos orgânicos envolve a
região de comprimento de onda maior que 185 nm.
A absorção de radiação visível e de ultravioleta de maior comprimento de
onda está restrita a um número limitado de grupos funcionais (grupos
cromóforos) que contém elétrons de valência com energia de excitação
relativamente baixas. Como o estado excitado é instável os elétrons excitados
pela absorção de fótons voltam ao seu estado fundamental (processo de
relaxação ou desativação) (Figura 13). Os processos de relaxação podem ser
Determinação de HPAs em peixes
59
não radiativos como a relaxação vibracional, a conversão interna e a conversão
externa (Skoog, 2002). Quando ocorre o cruzamento intersistema o spin de um
elétron excitado é invertido e se tornando não-emparelhado com o elétron no
estado fundamental. A probabilidade dessa transição é aumentada se os níveis
vibracionais dos dois estados se interpenetram (Figura 13). Após o cruzamento
para um estado triplete pode ocorrer desativação do estado eletrônico excitado
por conversão interna ou externa ou por emissão de fóton (fosforescência).
Se a diferença de energia entre o estado singleto excitado e o estado
fundamental é significativa, o retorno do estado excitado singleto para o estado
fundamental pode ocorrer por emissão de fóton, fluorescência e o grupo
cromóforo é chamado de fluoróforo.
As moléculas aromáticas, com sua estrutura rígida, têm menos graus de
liberdade vibracional que as moléculas alifáticas e são a classe de compostos
que mais frequentemente
apresentam fluorescência (Sharma & Schulman,
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1999).
A intensidade de fluorescência (IF) é diretamente proporcional à
intensidade do feixe de excitação (I0), a absorvância (εbC) e o rendimento
quântico (ΦF) da espécie, definidos pela equação:
IF = KF I0 ΦF ε b C
(9)
onde KF é uma constante de proporcionalidade, função da resposta instrumental
no momento da detecção, ε é a absortividade molar, b é o comprimento
percorrido pelo feixe na amostra e C a concentração da espécie fluorescente.
O rendimento quântico é a razão do número de moléculas luminescentes
pelo número total de moléculas excitadas. A maioria dos hidrocarbonetos
aromáticos não-substituídos fluoresce em solução e a eficiência quântica
aumenta com o número de anéis e seu grau de condensação.
7
Áreas de estudo
7.1.
Baía de Guanabara, RJ
A Baía de Guanabara encontra-se situada na região metropolitana do
estado do Rio de Janeiro (Figura 14) e ao longo das suas margens estão
situadas a cidade do Rio de Janeiro, Duque de Caxias, São Gonçalo, Niterói,
Petrópolis, entre outras. Ao redor da baía residem 7,6 milhões de pessoas,
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correspondendo a 2/3 da população da região metropolitana do Rio de Janeiro.
Localizada na latitude S 22o 50’ e na longitude W 43o 10’, a baía tem uma área
de 381 km2, espelho d’água de 328 km2 e 65 ilhas que somam 59 km2 de área.
O perímetro da baía mede 131 km e o volume médio de água é de 1,87 x 109 m3
(Kjerfve et al., 1997; Weber, 2001, da Costa, 2003; Instituto Baía de Guanabara,
2006).
Baía de Guanabara
Figura 14. Mapa do estado do Rio de Janeiro, destacando em vermelho a região
metropolitana e em azul a Baía de Guanabara.
Áreas de estudo
61
A Baía de Guanabara pode ser considerada um estuário e sua bacia de
drenagem mede 4.080 km2 sendo formada por 45 rios, onde apenas 6 são
responsáveis por 100 m3 s-1 da descarga média total anual de água fresca ,
sendo os mais importantes os rios Acari, Sarapuí, Pavuna, Suruí, Roncador,
Macacu, Guapimirim, Estrela e Iguaçu (Kjerfve et al., 1997; CEDAE, 199-;
Weber, 2001).
O clima na Baia de Guanabara é tropical úmido com verões quentes e
chuvosos e invernos frios e secos, com grande influência marinha. A
temperatura média anual é de 23,7 oC e a umidade relativa é 78% ao nível do
mar (DENEMET, 1992 apud Kjerfve et al., 1997). A profundidade média da Baía
de Guanabara é de 7,6 m, sendo 3 m no fundo da baía, 8,2 m no meio e 16,9 m
na entrada sendo a profundidade máxima de 50 m (Weber, 2001; Instituto Baía
de Guanabara, 2006).
A Baía é caracterizada por alta salinidade e temperatura. Durante o
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período de 1980-1993 a salinidade média foi de 29,5 ± 4,8 o/oo variando de 9,9 a
36,8 o/oo. A salinidade decresce da entrada do oceano até o fundo da baía, em
resposta a descarga de água doce nas margens do interior. A temperatura da
água foi medida no mesmo período sendo sua temperatura média de 24,2 ± 2,6
o
C, variando de 17,0 a 31,0 oC. A temperatura aumenta da entrada da baía até o
fundo, em resposta a advecção de água do mar, mais fria, para a baía (Kjerfve et
al., 1997).
A maré na baía é classificada como semi-diurna, com período de cerca de
12,5 horas. Na superfície a duração da enchente é de 4,5 h aproximadamente, e
a vazante é de 8 h. No fundo, a enchente e a vazante apresentaram a mesma
duração, com aproximadamente 6 h (JICA, 1994 apud da Costa, 2003).
No entorno da baía existem 6000 indústrias e mais 6000 na bacia de
drenagem, 2 portos comerciais, 12 estaleiros, 16 terminais de óleo, além de duas
refinarias de petróleo, o que demonstra a importância econômica da área.
Comparando com outras baías que propiciaram o surgimento de importantes
cidades como a Baía de Tóquio (cidade de Tóquio, espelho d’água: 1400 km2;
extensão 800 km) e a Baía de Chesapeake (cidades de Baltimore e Washington;
espelho d’água: 6.400 km2; extensão: 322 km), pode-se dizer que a importância
da Baía de Guanabara não é proporcional à sua dimensão (da Costa, 2003).
Embora invadida pela expansão urbana, o fundo da baía ainda é
margeado por 68,7 km2 de manguezais dos quais 43 km2 pertencem a área de
proteção ambiental de Guapimirim (Kjerfve et al., 1997; Weber, 2001; Instituto
Baía de Guanabara, 2006). Os manguezais são áreas extremamente
Áreas de estudo
62
importantes pois apresentam condições propícias para alimentação, proteção e
reprodução de muitas espécies animais.
As principais fontes de poluição da Baía de Guanabara são o esgoto
industrial, onde 80% dele é proveniente de apenas 52 indústrias, 7 t/dia de óleo,
20 m3/s de esgoto doméstico e 800 m3/dia de chorume (CEDAE, 199-).
Dados da FEEMA (2006) sobre a demanda bioquímica de oxigênio,
coliformes e clorofila-a de vários pontos da Baía de Guanabara indicam que, de
1990 a 2000 houve maior deterioração da qualidade da água da porção nordeste
da baía, que, no entanto, tem ainda melhor qualidade do que as áreas noroeste
e oeste.
Em 1991, apesar dos grandes investimentos feitos no Programa de
Despoluição da Baía de Guanabara (PDBG), apenas 15% do esgoto doméstico
e industrial receberam alguma forma de tratamento. Atualmente este valor subiu
para cerca de 25% (Marqueiro & Brandão, 2005).
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Segundo Kjerfve e colaboradores (1997) a maior concentração de
nutrientes é encontrada na margem oeste da baía por causa do enriquecimento
do escoamento urbano de esgoto e da renovação de água menos eficiente,
sendo as concentrações de nutrientes elevadas na superfície, com água menos
salina, refletindo a fonte de escoamento urbano. A profundidade do disco de
Secchi é menor que 0,75 m e a concentração de sólidos suspensos é maior que
25 mg L-1 (JICA, 1994 apud Kjerfve et al., 1997).
As concentrações de oxigênio dissolvido mostram grande flutuações
temporais e o valor médio não varia significativamente horizontalmente, com
exceção dos locais perto de pontos de descarga do escoamento urbano poluído.
A concentração média foi de 8,4 mg L-1 (124% de saturação) sendo a água da
superfície freqüentemente supersaturada refletindo altas taxas de produção
primária (Kjerfve et al., 1997).
Os grandes aportes de nutrientes levaram a eutrofização das águas da
baía e segundo a FEEMA o pescado diminuiu para 10% do que era há três
décadas atrás (Kjerfve et al., 1997). Apesar disso, a Baía de Guanabara mantém
uma produção pesqueira importante, tanto pelas quantidades desembarcadas
como pelo número de pescadores envolvidos (IBAMA, 2002).
No período de abril de 2001 a março de 2002 o IBAMA registrou que a
pesca da tainha ao longo do ano foi um importante recurso pesqueiro,
correspondendo a 6% do total pescado no período. Se for considerado apenas o
grupo de peixes sem destinação industrial o número de tainhas e corvinas
pescados/capturados passa a corresponder a 54% da produção (IBAMA, 2002).
Áreas de estudo
63
7.1.1.
Poluição por petróleo e derivados na Baía de Guanabara
Em relação ao petróleo e seus derivados as fontes de poluição na baía
podem ser crônicas ou agudas. Dentre as atividades realizadas na bacia da Baía
de Guanabara que geram efluentes oleosos rotineiramente estão compreendidas
as refinarias de petróleo, os estaleiros, os terminais marítimos e terrestres e os
postos de serviço de combustível. Nos últimos cinco anos ocorreram 8 acidentes
com petróleo e derivados na Baía de Guanabara.
O vazamento de 1,3 milhão de litros de óleo combustível ocorrido em um
duto da Petrobrás em janeiro de 2000 foi o mais comentado na mídia e sua
mancha se estendeu por mais de 50 km2, não sendo este o primeiro acidente,
nem o mais grave com este duto. Em 1997 já haviam vazado 2,8 milhões de
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litros de óleo combustível deste mesmo duto.
Por causa deste acidente a pesca foi proibida pelo IBAMA durante um mês
e liberada quando as determinações de HPAs nos tecidos dos peixes (corvina e
tainha) antes e depois do acidente não indicaram modificações nas
concentrações de HPAs encontradas nas amostras (Meniconi et al., 2001).
Abaixo estão listados os principais acidentes ocorridos na Baía (da Costa,
2003; de Cassia, 2005; Gomes, 2005 ; Ambientebrasil, 2006):
03/set/2005
vazamento de 2 mil litros de óleo na Baía de Guanabara
após um acidente com o navio Saga Mascot durante sua
atracação, atingindo as praias da Flecha e Icaraí em
Niterói;
12/ago/2005
vazamento de óleo de um navio na altura do Cais do
Porto, com a mancha atingindo cerca de 1,5 km;
31/mai/2005
vazamento de mais de 4 mil litros de óleo do navio
Alminufiyah, na altura do Cais do Porto;
26/abr/2005
despejo de mais de 60 mil litros de óleo diesel no Rio
Caceribu (rio afluente da Baía de Guanabara), na Área de
Proteção Ambiental de Guapimirim, pelo descarrilamento
Áreas de estudo
64
de um trem da Ferrovia Centro-Atlântica (FCA), controlada
pela Companhia Vale do Rio Doce, no Porto de Caxias;
mar/2004
vazamento de 2 mil litros de petróleo de um navio
desativado pertencente a uma empresa privada;
fev/2002
vazamento de 50 mil litros de óleo combustível do
transatlântico inglês Caronia;
jun/2000
380 litros de óleo combustível foram lançados ao mar pelo
navio Cantagalo, que presta serviços à Petrobrás;
jan/2000
rompimento de um duto da Petrobrás que liga a Refinaria
de Duque de Caxias (RJ) ao terminal da Ilha d’Água,
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provocando o vazamento de 1,3 milhões de litros de óleo
combustível;
ago/1997
vazamento de 2 mil litros de óleo combustível atingindo
cinco praias da Ilha do Governador (RJ);
mar/1997
rompimento de um duto da Petrobrás que liga a Refinaria
de Duque de Caxias (RJ) ao terminal da Ilha d’Água,
provocando o vazamento de 2,8 milhões de litros de óleo
combustível;
mar/1975
derramamento de 6 milhões de litros de óleo cru por um
cargueiro fretado pela Petrobrás.
Há um alto risco de acidentes por derramamento de petróleo e derivados já
que os diversos ecossistemas da baía são atravessados por muitos quilômetros
de oleodutos, através dos quais são continuamente bombeados dezenas de
milhões de litros de óleo e derivados entre seus terminais, navios, petroleiros e
balsas (da Costa, 2003).
Como fonte crônica é registrado um aporte de 7t/dia de óleo proveniente
do escoamento urbano e das indústrias, sendo 0,65 toneladas provenientes da
REDUC (CEDAE, 199-). Ou seja, em menos de um ano teríamos quantidade
comparável a do acidente ocorrido em janeiro de 2000.
Áreas de estudo
65
7.1.2.
Estudos de HPAs na Baía de Guanabara
Na Tabela 4 estão relacionados os trabalhos envolvendo estudos de
HPAs realizados na Baía de Guanabara, nos compartimentos água, sedimento
ou biota. Deve-se tomar cuidado ao analisar estes resultados já que distintas
técnicas analíticas nem sempre são comparáveis e muitas vezes foram usados
pontos de coleta em diferentes pontos da Baía.
Os resultados pré e pós derrame de janeiro/2000 mostram que não
houve impacto significativo no sedimento e na coluna d’água da Baía de
Guanabara (Meniconi et al., 2002).
Comparando-se os valores obtidos para organismos vertebrados e
invertebrados nota-se a diferença existente nos níveis de HPAs presentes no
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tecido, como o esperado, já que o metabolismo de HPAs em invertebrados é
mais lento do que em vertebrados.
De acordo com o critério adotado pela National Oceanic and Atmospheric
Administration (NOAA) no acidente com o navio Exxon Valdez no Alasca em
1989, as amostras de tecido de peixe são divididas em quatro categorias como
na Tabela 5. Levando-se em consideração a diferença entre peso seco e peso
úmido, os valores de tecido de peixe da Baía de Guanabara estariam
enquadrados nas amostras não contaminadas ou de contaminação mínima, não
representando uma ameaça a saúde pública.
Áreas de estudo
66
Tabela 4. Concentrações de HPAs encontrados na água, sedimento e biota da Baía de
Guanabara.
Concentrações
Referência
Observações
de HPAs
ÁGUA (µg L-1)
0,06 – 1,59
Silva, 2004
0,66 – 1,18 (F)
Lima, 2001
0,79 – 2,79 (NF)
0,93 (F)
amostras coletadas em 1999.
Resultados em equivalentes de criseno.
Lima, 2001
1,52 (NF)
amostra coletada após o acidente de
janeiro/2000. Resultados em
equivalentes de criseno.
<0,04 – 11,56
Meniconi et al., 2002
(NF)
0,05 – 1,09 (F)
10 dias após o acidente de 2000.
Resultados em equivalentes de criseno.
Azevedo, 1998
Resultados em equivalentes de criseno.
Hamacher, 1996
Resultados em equivalentes de criseno.
0,12 – 1,75 (NF)
0,21 – 1,40 (F)
0,93 – 2,97 (NF)
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SEDIMENTO (µg Kg –1)
78,61 – 8781,52
Silva, 2004
200 – 9700
Meniconi et al., 2002
554 – 1894
Hamacher, 1996
1564 – 18438
Lima, 1996
1051 – 5861
10 dias após o acidente de 2000
Chalaux, 1995 apud
Silva, 2004
BIOTA
(peso seco) (µg Kg –1)
INVERTEBRADOS
Mexilhão Perna perna
500
Lima, 2001
Mexilhão Perna perna
900
Lima, 2001
Mexilhão Perna perna
68 - 432
Azevedo, 1998
Mugil liza
2,3 – 15,6
Silva, 2004
Micropogonias furnieri
9,8 – 52,6
Mugil liza
63 – 76
Micropogonias furnieri
16 – 37
Mugil liza
313
Micropogonias furnieri
80
após o acidente de 2000
VERTEBRADOS
(Peixes)
Meniconi et al., 2001
20 dias após o acidente de 2000.
Meniconi et al., 2001
amostras de janeiro de 1999
F: filtrado ; NF: não filtrado
Tabela 5. Valores de referência para o HPAs totais para estimar o nível de contaminação
em tecido de peixes (peso úmido).
-1
Valores de referência (µg kg )
amostras não contaminadas
< 10
amostras de contaminação mínima
10 – 99
amostras com contaminação moderada
100 – 1000
amostras altamente contaminadas
> 1000
Fonte: Meniconi et al., 2001.
Áreas de estudo
67
7.1.3.
Praia de Ipiranga, Magé
A praia de Ipiranga localiza-se no município de Magé, RJ, e sua principal
atividade econômica é a pesca. A produção de pescado é comercializada no
local, adquirida por intermediários e destinada a feiras, peixarias e para o
CEASA (IBAMA, 2002).
O relatório do IBAMA de 2002 sobre a atividade pesqueira na Baía de
Guanabara indica que de abril de 2001 a março de 2002 existiam 511 currais
(Figura 15) em atividade, sendo 37 deles localizados na praia de Ipiranga
(IBAMA, 2002). Como a vida útil de um curral varia de 11 a 12 meses, o número
de armadilhas em operação efetiva pode variar ao longo do tempo.
Os currais são artes de pesca fixas, confeccionados com esteiras de
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bambu e tendo como fundação, troncos de árvores dos manguezais ou de
eucalipto. Para a construção de um curral são necessários 150 a 180 troncos,
com diâmetro variando de 3 a 8 cm e altura entre 5 e 7 metros (IBAMA, 2002).
Figura 15. Curral próximo a praia de Ipiranga, Magé.
A praia de Ipiranga foi um dos locais afetados pelo derrame de óleo de
janeiro de 2000 e por sua proximidade com o duto de transporte de óleo da
Petrobrás é de interesse que sejam monitorados os peixes da região quanto a
presença de HPAs no meio ambiente (Figura 16).
Áreas de estudo
68
região dos
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currais
Figura 16. trecho da Carta náutica 1501 indicando a região dos currais próximos a praia
de Ipiranga, Magé.
7.2.
Itaipu, Niterói
A praia de Itaipu é uma tradicional vila de pescadores que encontra-se
situada na região oceânica da cidade de Niterói, no estado do Rio de Janeiro
(Figura 17). Localizada na latitude S 22o 58’ e longitude W 43o 05’, a praia de
Itaipu é ligada a Lagoa de Itaipu por um canal construído em 1970 (IBAMA,
2000; Weber, 2001). Com a construção do canal o arco praial original de 3300 m
foi dividido em duas praias denominadas Camboinhas e Itaipu (Santos et al.,
2004).
A profundidade da água varia de um mínimo de 3-4 m logo após a
arrebentação até um máximo de 28 m. Itaipu é um ambiente clástico com ondas,
tendo uma variação de maré semi-diurna com uma flutuação máxima de 1,4 m e
Áreas de estudo
69
a velocidade das correntes raramente excedem 10 cm/s (Salvador et al., 2002;
Santos et al., 2004).
Segundo o Censo Demográfico de 1991, o bairro de Itaipu possui 11.136
habitantes, correspondendo a 2,55% do total de Niterói. Não existe uma rede
geral de esgotos e a maioria dos moradores utilizam como alternativa o sistema
de fossas sépticas (Prefeitura de Niterói, 2005). Assim, a lagoa de Itaipu recebe
esgoto doméstico não tratado que pode atingir a praia já que a renovação de sua
água é fortemente controlada pelas marés (Weber, 2001). Não existem relatos
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de acidentes com petróleo e derivados nesta região.
Figura 17. Mapa do Estado do Rio de Janeiro, com destaque para a cidade de Niterói.
Áreas de estudo
70
O tipo de pesca mais comumente usado na região é a rede de espera ou o
arrastão de praia. A presença de tainhas é sazonal, dependendo do seu ciclo
reprodutivo. Oliveira (1997) descreve que mugilídeos estudados na laguna de
Itaipu entram no sistema lagunar durante o final do período quente e/ou início do
frio e ao atingirem os maiores tamanhos saem do sistema, possivelmente para
fins reprodutivos, correspondendo ao final do período frio e/ou início do quente.
Esta freqüência também foi observada neste trabalho, onde a quantidade de
peixes coletados no verão (janeiro/2005 e janeiro/2006) foi sensivelmente menor
do que no inverno (setembro/2004 e agosto/2005). Dados fornecidos pelas
indústrias pesqueiras dos municípios do Rio de Janeiro, Niterói e São Gonçalo
revelam que as maiores capturas de tainhas em alto mar correspondem ao
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período quente (IBAMA, 1996 apud Oliveira, 1997).
8
Parte experimental
8.1.
Coleta dos peixes e medição dos parâmetros físico-químicos
O peixe escolhido para monitoramento foi a tainha, especificamente da
espécie Mugil liza já que junto com a corvina este é um dos peixes mais
pescados na região da Praia de Ipiranga, Magé, RJ (IBAMA, 2002).
Os peixes foram coletados tanto em área de contaminação crônica por
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óleo (Baía de Guanabara, RJ) quanto em área sem histórico de contaminação,
área controle (Itapu, Niterói).
Foram feitas duas amostragens iniciais, para reconhecimento dos pontos
de coleta, na estação chuvosa (verão) em fevereiro/2005. Foram feitas mais três
coletas, duas representando a estação seca (agosto/2005) e a outra
representando a estação chuvosa (dezembro/2005). Também foi feita uma
coleta em Itaipu, Niterói em setembro/2005, 4 dias após um derrame de óleo na
entrada da Baía de Guanabara que atingiu as praias da Flecha e Icaraí em
Niterói.
Na Baía de Guanabara os peixes foram capturados em currais localizados
na região próxima a praia de Ipiranga, Magé, tendo suas coordenadas
registradas em um GSP Garmin 12 (S22o 44’, W43o 11’). Já os peixes da área
controle foram capturados na praia de Itaipu, Niterói (S22o 56’, W43o 03’),
usando-se rede de espera ou arrasto de praia. Segundo a tábua das marés da
Diretoria de Hidrografia e Navegação da Marinha (DHN) para o Porto do Rio de
Janeiro, as coletas foram feitas em maré baixa a enchente. Após a captura, os
peixes foram conservados em gelo até a chegada no laboratório.
No local de amostragem foram feitas medições de temperatura, pH,
condutividade e oxigênio dissolvido usando-se uma sonda multi-parâmetros Insitu Troll 9000. A transparência foi medida com disco de Secchi. No laboratório
foi feita a medição da turbidez usando um turbidímetro Alfa Tecnoquimica AT2K.
Parte experimental
72
8.2.
Amostragem dos peixes
Para evitar grandes variações de metabolismo e buscando maior
repetitividade dos resultados foram selecionados peixes da mesma espécie e
tamanhos semelhantes.
Pela semelhança entre as espécies de mugilídeos e para evitar que
fossem usadas espécies diferentes foi feita a identificação de gênero e espécie
das tainhas capturadas de acordo com o método de Menezes (1983). Para tal,
foi verificada a presença de escamas na segunda nadadeira dorsal e na
nadadeira anal. Em seguida, foram contadas as séries de escamas laterais que
deveriam estar presentes em número de 29 a 34. Um indivíduo de cada local de
coleta foi retirado para ser analisado por técnicos do setor de Ictiologia do Museu
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Nacional (UFRJ) para confirmação da espécie e para ser guardado como
testemunho. O tamanho mínimo de captura foi 35 cm, tamanho permitido pelo
IBAMA (portaria no 73/2003), até 51 cm.
Após a identificação das espécies foram feitas medições morfométricas
(comprimento total, comprimento padrão, comprimento da cabeça, altura da
cabeça)
utilizando-se um ictiômetro e um paquímetro calibrados pela Rede
Brasileira de Calibração (RBC) e foi medido também o peso dos peixes
utilizando-se uma balança analítica.
Em seguida, os peixes foram abertos para dissecação (Figura 18), sendo
feita a identificação do sexo de cada indivíduo (Figura 19). Após a localização da
vesícula biliar (Figura 20) foi retirado o líquido biliar com o auxílio de uma seringa
(Figura 21). A bílis foi estocada em geladeira (10 oC) até que todos os indivíduos
fossem abertos e seu líquido biliar retirado, para em seguida proceder as
diluições e análises.
Figura 18. Abertura do indivíduo.
Parte experimental
Figura 19. Identificação do sexo do peixe pela análise visual das gônadas, neste caso,
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fêmea.
Figura 20. Localização da vesícula biliar.
Figura 21. Retirada do líquido biliar.
73
Parte experimental
74
8.3.
Análise da bílis
8.3.1.
Escolha do sistema solvente
O solvente comumente usado para diluição da bílis para determinação de
metabólitos de HPAs por fluorescência é o etanol diluído em água na proporção
48:52 v/v (Ariese et al., 1993, Lin et al.1994, Aas et al., 2000). Com o objetivo de
avaliar o desempenho de outros sistemas solvente na presença de HPAs foi feito
um planejamento experimental usando-se os solventes Etanol P.A. Merck,
Propanol P.A. Merck e água deionizada. As proporções solvente/água usadas
foram 25:75 v/v, 48:52 v/v e 75:25 v/v. Metanol não foi testado devido a sua alta
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toxicidade. Solventes apolares também não foram testados já que a bílis é
composta principalmente por água.
O HPA utilizado como referência foi o Pireno da Sigma (St. Louis, EUA)
com 97% de pureza. Apesar de o benzo[a]pireno ser o HPA mais estudado já
que foi o primeiro HPA a ter seu potencial carcinogênico reconhecido, os HPAs
menores são absorvidos, metabolizados e excretados em maior quantidade
(Krahn et al., 1987). No caso do pireno, o metabólito de interesse é o 1hidroxipireno, principal metabólito formado pelas reações de FASE I da sua
biotransformação. No entanto, este padrão não estava disponível durante o
período deste trabalho devido a dificuldades de importação.
Devido a sua alta hidrofobicidade, a solubilização do pireno em
etanol/água exige agitação vigorosa, sendo testada também a influência no
tempo de agitação no ultra-som utilizado durante o preparo das soluções
estoque.
A partir de soluções estoque independentes foram preparados padrões em
duplicata e sua análise feita no espectrofluorímetro Perkin Elmer LS 55
Luminescence Espectrometer. Foram usadas bandas espectrais de passagem
de 4 nm para excitação e emissão e cubetas de quartzo, em todas análises. A
detecção foi feita no comprimento de onda de excitação de 341 nm e o
comprimento de onda de emissão variou de 350 nm a 450 nm, de acordo com o
descrito na literatura (Ariese et al., 1993, Lin et al.1994, Aas et al., 2000).
Parte experimental
75
8.3.2.
Determinação dos comprimentos de onda de excitação e emissão
Após a escolha do sistema solvente, foram otimizados os comprimentos
de onda de excitação e emissão através da análise dos espectros com
comprimento de onda de emissão fixo, variando o comprimento de onda de
excitação de 200 nm até 400 nm. Assim, é possível verificar qual o comprimento
de onda de excitação dá a melhor resposta de intensidade de sinal.
8.3.3.
Curva analítica
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A curva analítica foi obtida com 8 pontos, incluindo o branco, com soluções
padrão diluídas na faixa de 1 a 20 µg L-1, preparadas a partir de uma solução
estoque de pireno em etanol/água 48% de concentração de aproximadamente
10 mg L-1. Foram feitas quatro replicatas de cada ponto. Foram feitas também
curvas de adição padrão com amostras de bílis diluídas (1:2000).
8.3.4.
Absorção molecular
A fim de ter uma referência do status alimentar dos peixes coletados,
vários autores indicam que deve ser feita a medição da concentração de
biliverdina através de medições de absorção molecular (Ariese et al., 1997; Aas
et al., 2000; Richardson et al., 2004). De acordo com estes autores, foram
preparadas soluções de bílis diluídas
em etanol 48% (1:100 v/v) e as
absorvâncias medidas em 380 nm, em um espectrofotômetro UV-Visível DMS100 Intralab.
Parte experimental
76
8.3.5.
Estudo do efeito de matriz
Com o objetivo de analisar se a concentração da amostra pode interferir na
análises por fluorescência foram feitas quatro diluições diferentes para algumas
amostras de bílis (1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:500). Foram então feitas medições
da transmitância das amostras diluídas em um espectrofotômetro Spec 20 MV
Coml. Indl. Dourado Ltda. no comprimento de onda de 332 nm.
A fim de observar se havia influência da densidade da bílis devida aos
diferentes status alimentar dos peixes coletados foram escolhidas 5 amostras
com cores variando do marrom ao verde musgo e valores diferentes de
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absorvância.
8.3.6.
Determinação de HPAs total por fluorescência na bílis de peixe
Antes das medições de fluorescência as amostras de bílis foram diluídas
1:2000 em etanol 48% a fim de obter uma amostra suficientemente transparente
(Ariese et al., 1993). A detecção foi feita no comprimento de onda de excitação
de 332 nm e o comprimento de onda de emissão variou de 350 nm a 450 nm.
Foi usada uma curva analítica feita com padrões de pireno em etanol 48% na
faixa de 1 a 20 µg L–1, sendo os resultados reportados em mg de equivalente de
pireno L-1.
Além do comprimento de onda de excitação de 332 nm, otimizado para o
pireno (4 anéis), foram feitas leituras nos comprimentos de onda de excitação e
emissão de 290/335 nm e 380/430 nm. Estes comprimentos de onda são
recomendados na literatura para a análise do grupo de HPAs de 2-3 anéis e 5-6
anéis, respectivamente.
Foram feitas também leituras onde os comprimentos de onda de excitação
e de emissão variavam simultaneamente, com um intervalo fixo de comprimento
de onda (∆λ). A varredura sincronizada pode fornecer espectros de fluorescência
bem característicos, dependendo do metabólitos de HPAs presentes.
Parte experimental
77
8.3.7.
Limpeza do material
Toda a vidraria volumétrica e os frascos usados para o armazenamento do
líquido biliar foram lavados com detergente (Detertec 3%) e enxaguada com
água. Em seguida, todo o material foi enxaguado três vezes com água
deionizada e rinsado com etanol 48%.
8.4.
Análise de HPAs totais em água
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8.4.1.
Determinação dos comprimentos de onda de excitação e emissão
Como os padrões usados na análise de HPAs totais em água são
preparados com o solvente diclorometano Mallinckrodt (grau HPLC) foi
necessário otimizar os comprimentos de onda de excitação e emissão que dão a
melhor resposta para o novo solvente. Foram analisados os espectros de
emissão, com o comprimento de onda de emissão fixo, variando o comprimento
de onda de excitação de 200 nm até 400 nm.
8.4.2.
Curva analítica
A curva analítica foi obtida com 8 pontos, incluindo o branco, com soluções
padrão diluídas na faixa de 10 a 150 µg L-1, preparadas a partir de uma solução
estoque de pireno em diclorometano de concentração de aproximadamente 10
mg L-1. Foram feitas triplicatas de cada ponto.
Parte experimental
78
8.4.3.
Coleta de água
As amostras foram coletadas com o auxílio de uma garrafa coletora de
acrílico de 1 L, a cerca de 50 cm abaixo da superfície e transferidas para
garrafas de vidro previamente limpas. Parte da amostra inicial foi usada para
rinsar a garrafa e desprezada em seguida. As amostras foram conservadas em
gelo até a chegada ao laboratório.
8.4.4.
Extração de HPAs totais
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Após as amostras atingirem a temperatura ambiente, foi feita a extração
dos HPAs segundo a metodologia adaptada do International Oceanographic
Commission (IOC-UNESCO) (1984). Foi realizada a filtração de parte das
amostras devido a grande quantidade de plâncton presente nas mesmas. Um
litro da amostra de água filtrada foi transferida para funil de separação de 2 L,
onde foram adicionados 50 mL de Diclorometano (Tedia grau HPLC), sendo a
extração dos HPAs foi feita por agitação manual durante 5 minutos. Após a
separação das fases, a fase orgânica foi recolhida em balão de vidro de fundo
chato e armazenada em local abrigado de luz.
Em seguida, realizou-se nova extração adicionando-se mais 50 mL de
diclorometano que foi recolhida no mesmo frasco que o primeiro extrato. O
extrato obtido foi centrifugado durante 3 minutos para separar a emulsão
formada durante a agitação devido a grande quantidade de matéria orgânica
presente na amostra, do diclorometano. Foi adicionado sulfato de sódio para a
quebra da emulsão e centrifugado novamente (Petrobrás, 200?).
O extrato final obtido foi concentrado em evaporador rotatório, à pressão
reduzida de 200 mmHg e temperatura de aproximadamente 36
o
C. O
concentrado obtido foi transferido para balão volumétrico de 10 mL e avolumado
com diclorometano.
Parte experimental
79
8.4.5.
Determinação de HPAs total por fluorescência em água
A análise de fluorescência para determinação de HPAs totais foi realizada
em um espectrofluorímetro Perkin Elmer LS 55 Luminescence Spectrometer. A
banda espectral de passagem foi de 4 nm para excitação e emissão e foram
usadas cubetas de quartzo em todas as análises. A detecção foi feita no
comprimento de onda de excitação de 334 nm e o comprimento de onda de
emissão foi variado de 350 a 450 nm. Foram feitos brancos do processo usandose água do mar artificial, preparada de acordo com a recomendação de Riley &
Shirrow (1975), a qual passou pelo mesmo processo de extração das amostras.
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8.4.6.
Limpeza do material
Toda a vidraria volumétrica e os funis de separação foram lavados com
detergente (Detertec 3%) e enxaguada com água. Em seguida, todo o material
foi enxaguado três vezes com água destilada seguida de rinsagem com acetona.
Após seco, todo o material foi rinsado com diclorometano.
8.5.
Análise estatística dos dados
Para a escolha do melhor sistema solvente para a diluição das amostras
foi usado o Planejamento Fatorial, modelo 23, onde foram escolhidos 3 fatores
diferentes para estudo, em dois diferentes níveis. Pela análise de variância
(ANOVA) dos resultados, os efeitos que apresentam valores de p < 0,05 são
considerados
normalidade
estatisticamente
dos resíduos
significativos.
usando
Foram
o teste de
também
testadas
Anderson-Darling
e
a
a
homogeneidade de variância pelo teste de Bartlett já que para o uso da ANOVA
as premissas de normalidade e homocedasticidade não podem ser violadas.
Para a análise dos parâmetros de desempenho analítico a curva analítica
foi construída usando-se o método dos mínimos quadrados. Pela análise de
variância testou-se a validade da regressão. Foram também testadas a
Parte experimental
80
normalidade usando o teste de Anderson-Darling e a homogeneidade de
variância pelo teste de Bartlett.
Para a análise morfométrica dos peixes foram construídos gráficos de
boxplot onde são mostrados os valores extremos (máximo e mínimo) dos dados,
e sua mediana.
Para comparação dos dados obtidos para os metabólitos de HPAs da
bílis dos peixes da Baía de Guanabara e Itaipu foi usada a análise de variância
onde a hipótese a ser testada, H0, seria aceita se os valores de p < 0,05. A
rejeição da H0 leva a aceitação da hipótese H1. Neste caso, a hipótese H0
corresponde à hipótese de que as médias dos resultados da Baía de Guanabara
e de Itaipu são iguais:
H0: µBaía de Guanabara = µItaipu
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H1: µBaía de Guanabara ≠ µItaipu
A fim de atender ao critério de homogeneidade de variância foi necessário
transformar os dados usando o logarítmo na base 10. A comparação das médias
foi feita usando o teste de Tukey com intervalo de confiança de 95%.
9
Resultados e discussões
9.1.
Otimização da análise de HPAs em bílis de peixe
9.1.1.
Escolha do sistema solvente
A fim de otimizar o sistema solvente para a diluição da bílis foi utilizado o
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modelo fatorial 23, em duplicata visando estudar o efeito de três fatores: tipo de
solvente, proporções solvente/água e o tempo de ultra-som em minutos. Antes
do uso do ultra-som partículas de pireno eram visíveis na solução. Estes fatores
foram distribuídos nos seguintes níveis do Quadro 2:
Quadro 2. Fatores e níveis do experimento.
Níveis
Fator
Si
Solvente
Pj
Proporção
Tk
Tempo de ultra-som
-1
+1
Etanol
Propanol
25%
48%
15
30
A análise de variância acusou como significativos: o tempo de ultra-som,
as interações duplas e a interação tripla (p<0,05) (Tabela 6).
A normalidade dos resíduos foi testada pelo teste de Anderson-Darlin, com
o valor de p = 0,999 e para homogeneidade de variância foi usado o teste de
Bartlett com o valor de p = 0,433.
A partir da Tabela 7 é possível obter a estimativa do sinal para a equação
de regressão ( x ):
Ŷ = 41,000+ 10,576 T − 12,753 SP − 4,770ST + 10,637PT − 12,685 SPT,
( ±1, 248 )
( ±1, 248 )
( +1, 248 )
( ±1, 248 )
( ±1, 248)
( ±1, 248)
R 2 = 97,88
( 10 )
Resultados e discussões
82
Tabela 6. Análise de variância do experimento
Causa de Variação
Solvente (S)
Grau de
Soma dos
Média dos
F
p
liberdade
Quadrados
Quadrados
1
0,3
0,3
0,01
0,919
Proporção (P)
1
46,0
46,0
1,85
0,211
Tempo de ultra-som (T)
1
1789,7
1789,7
71,83
0,000
(S) x (P)
1
2602,2
2602,2
104,45
0,000
(S) x (T)
1
364,0
364,0
14,61
0,005
(P) x (T)
1
1810,2
1810,2
72,66
0,000
(S) x (P) x (T)
1
2574,6
2574,6
103,34
0,000
Resíduo
8
199,3
24,9
Total
15
9386,3
Tabela 7. Estimativas dos efeitos e coeficientes com os respectivos intervalos de
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confiança de 95%.
Causa de variação
Efeito
t(8)
p
Coeficiente
Erro-padrão ICI 95%
ICS95%
Média
41,000
32,856
0,000
41,000
1,248
38,123
43,878
Solvente (S)
0,262
0,105
0,919
0,131
1,248
-2,746
3,009
Proporção (P)
-3,391
-1,359
0,211
-1,696
1,248
-4,573
1,182
Tempo (T)
21,152
8,475
0,000
10,576
1,248
7,699
13,454
(S) x (P)
-25,506
-10,220
0,000
-12,753
1,248
-15,631
-9,875
(S) x (T)
-9,540
-3,822
0,005
-4,770
1,248
-7,647
-1,892
(P) x (T)
21,273
8,542
0,000
10,637
1,248
7,759
13,514
(S) x (P) x (T)
-25,370
-10,165
0,000
-12,685
1,248
-15,563
-9,807
Utilizando apenas os efeitos considerados significativos e substituindo as
variáveis codificadas de acordo com o Quadro 2 na equação 10 a melhor
resposta ou o melhor sinal ( Ŷ ), é para o solvente etanol, na proporção de 48% e
tempo de ultra-som de 30 minutos (Tabela 8), sendo esta a condição otimizada
utilizada na metodologia de análise de HPAs em bílis de peixe.
Cabe ressaltar que a proporção etanol/água de 48% já vem sendo utilizada
por muitos autores para a análise de metabólitos de HPAs na bílis de peixe
(Beyer et al., 1996; Aas et al., 1998) mas não sendo informado como foi feita
esta escolha.
Resultados e discussões
83
3
Tabela 8. Valores de Ŷ para a equação de regressão obtida do experimento fatorial 2 .
Média
T
(P) x (T)
(S) x (T)
(S) x (P)
(S) x (T) x (P)
41,000
10,576
10,637
-4,770
-12,753
-12,865
-1
1
1
1
-1
1
-1
-1
-1
1
-1
-1
1
Ŷ
T
P
S
-1
36,223
-1
-1
-1
-1
1
45,899
-1
-1
1
-1
1
15,085
-1
1
-1
-1
1
-1
24,489
-1
1
1
-1
-1
1
1
20,271
1
-1
-1
1
-1
1
-1
-1
61,607
1
-1
1
1
1
-1
-1
-1
92,421
1
1
-1
1
1
1
1
1
32,005
1
1
1
PUC-Rio - Certificação Digital Nº 0410380/CA
9.1.2.
Determinação dos comprimentos de onda de excitação e emissão
Para determinação do melhor comprimento de onda de excitação (λexc) e
emissão (λem) foram obtidos espectros de excitação mantendo o λem fixo e
variando o λexc de 200 a 400 nm.
Apesar de vários autores reportarem o uso do λexc e λem de 341 nm e 383
nm, respectivamente, para os HPAs de quatro anéis, após o refinamento dos
espectros podemos observar pelo espectro que o pico de excitação e emissão
que têm intensidades correspondentes são os picos nos λexc e λem foram de 332
e 383 nm (Figura 22). Esta diferença observada dos valores reportados em
literatura para os valores aqui obtidos pode estar relacionada a diferença da
matriz usada e do composto de referência, já que o composto normalmente
estudado é o 1-hidroxipireno.
Ariese e colaboradores (2005b) reportaram que para otimizar o
comprimento de onda foi usado a bílis de um peixe contaminado em laboratório
com pireno a fim de ter apenas o metabólito de interesse em seu meio natural.
Esta maneira de abordar o problema é a mais indicada já que os λexc e λem dos
compostos de referência não serão exatamente os mesmos das espécies
conjugadas.
Um parâmetro que não foi otimizado foi a o tamanho da banda espectral
de passagem de excitação e emissão. As bandas de 4 nm foram utilizadas neste
trabalho uma vez que já vinham sendo utilizadas com sucesso em trabalhos
prévios desenvolvidos no Laboratório de Estudos Ambientais da PUC-Rio (Melo
et al., 2005). Além disso, alguns artigos reportam o uso de bandas espectrais de
Resultados e discussões
84
passagem de 2,5 nm ou 5 nm como as ideais para este tipo de medição (Lin et
al., 1996; Vuontisjärvi et al., 2004; Ariese et al., 2005b).
1000
f
900
332
800
383
Intensidade
700
600
Excitação
500
Emissão
400
300
200
100
0
300
320
340
360
380
400
420
440
comprimento de onda (nm)
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Figura 22. Espectro de excitação (λem = 383 nm) e emissão (λex = 332 nm) do pireno em
etanol 48%.
9.1.3.
Parâmetros de desempenho analítico
Para a determinação da faixa analítica de trabalho construiu-se uma
curva analítica utilizando 7 soluções-padrão com concentrações entre 1 a 20 µg
L-1, obtidos pela diluição da solução estoque de pireno. Esta faixa de trabalho foi
escolhida já que todas as amostras coletadas se encontravam dentro desta faixa
de trabalho, em sua maioria no meio da curva, região de menor incerteza da
curva. Foram feitas 4 replicatas de cada concentração, obtendo-se a seguinte
curva analítica (Figura 23):
Yˆc = 5,401+ 9,653 x,
( ±0 ,300 )
( ±0 , 030 )
R 2 = 99,98%
( 11 )
Resultados e discussões
85
Intensidade
200
100
Regressão
Intervalo de Confiança 95%
0
0
10
20
Concentração (ug/L)
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Figura 23. Curva analítica da solução de pireno em etanol 48% (n=4) em condições
otimizadas.
A Tabela 9 mostra a análise de variância da curva de regressão com p =
0,000. Os pressupostos de normalidade e homogeneidade de variância também
foram testados apresentando p=0,216 e p=0,932 para o teste de AndersonDarling e Bartlett respectivamente.
Tabela 9. Análise de variância da curva de regressão.
Causa de
Grau de
Soma dos
Média dos
variação
liberdade
Quadrados
Quadrados
Regressão
1
131919,000
131919,000
Resíduo
30
37,000
1,233
Total
31
131956,000
F
p
106961,351
0,000
Como os pressupostos de normalidade e homogeneidade de variância
foram válidos, o mínimo valor detectável (ou limite de detecção) referente à
concentração, x0, e o mínimo valor quantificável (ou limite de quantificação)
referente à concentração x0, podem ser obtidos pelas equações (13) e (14):
Resultados e discussões
xD =
86
3,29 QME
Bˆ
( 13 )
1
onde B̂1 corresponde ao coeficiente angular da curva analítica calculada e QME
corresponde a média do quadrado dos resíduos.
xD =
3,29 1,233
= 0,3785µg ⋅ L−1
9,653
xQ =
10 QME
Bˆ
( 14 )
1
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onde B̂1 corresponde ao coeficiente angular da curva analítica calculada e QME
corresponde a média do quadrado dos resíduos (de Freitas, 2003).
xQ =
10 1,233
= 1,504 µg ⋅ L−1
9,653
O cálculo do mínimo valor detectável (ou limite de detecção) foi baseado
na teoria do teste estatístico de hipótese, com probabilidades de falso positivo
(α) e falso negativo (β), considerando-se α = β = 5%.
Os parâmetros de desempenho analítico se encontram no Quadro 3:
Quadro 3. Parâmetros de desempenho analítico.
Equação
Yˆc = 5,401+ 9,653 x,
( ±0 , 300 )
R 2 = 99,98%
( ±0 , 030 )
-1
Faixa de trabalho
2 – 20 µg L
Limite de detecção
0,3785 µg L
Limite de quantificação
1,504 µg L
-1
-1
Resultados e discussões
87
9.1.4.
Efeito de matriz
Outros constituintes da bílis, além dos HPAs, podem absorver a luz que
chega na cubeta durante a medição de fluorescência das amostras. Para
observarmos como o efeito de matriz pode afetar o sinal de fluorescência
medido, foram feitas medições da transmitância, à 332 nm, comprimento de
onda de excitação usado nas análises de fluorescência.
Neste estudo foram usadas soluções com diferentes diluições do líquido
biliar em etanol 48%. As amostras de bílis utilizadas neste teste foram escolhidas
buscando variação de cor do líquido biliar e diferentes valores da absorvância
das amostras diluídas a 1% medidas em 380 nm (Quadro 4 e Figura 24). Todas
as bílis usadas neste teste foram retiradas de peixes coletados na Baía de
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Guanabara.
É importante monitorar os parâmetros de cor da bílis e absorvância à 380
nm já que, quanto maior o tempo que o peixe ficar sem se alimentar mais
concentrada estará sua bílis. Isto ocorre porque quando o peixe se alimenta, a
bílis é liberada no duodeno e a vesícula biliar se enche de água e concentrando
ao longo do tempo em que o peixe estiver em jejum. Vários autores usam a
concentração de biliverdina, pigmento presente na bílis, como indicativo do
“status alimentar” do peixe (Ariese et al., 1997; Aas et al., 2000; Richardson et
al., 2004). Para tal, medições espectrofotométricas das amostras foram feitas no
comprimento de onda de 380 nm. Como o padrão de biliverdina não estava
disponível para este trabalho foram feitas medições de absorvância para fins
comparativos.
Quadro 4. Cor e valores de absorvância à 380 nm das amostras utilizadas no teste do
efeito de matriz.
Código da amostra
Cor do líquido biliar
Absorvância
51
verde musgo
1,069
52
verde musgo
0,900
53
castanho
0,531
54
marrom
1,005
58
castanho claro
0,590
Resultados e discussões
51
52
88
54
53
58
Figura 24. Coloração do líquido biliar das amostras utilizadas no teste do efeito de matriz.
Pela Figura 25 percebe-se que o efeito de matriz se torna mais acentuado
a medida que a concentração do líquido biliar aumenta. Assim, neste trabalho foi
adotada a diluição de 1:2000, já que, para todas as amostras coletadas, ela foi
suficiente para obter valores dentro da faixa de trabalho da curva analítica e as
amostras indicaram que estas eram suficientemente transparentes, evitando
assim problemas de interferência de outros compostos presentes na bílis. Aas e
colaboradores (2000) concluíram que uma diluição 1:1000 a 1:2000 deve ser, em
geral, suficiente para evitar esse efeito mas, em alguns casos, pode ser
necessária uma diluição maior para que o sinal medido esteja dentro da faixa de
f
120.00
100.00
51
80.00
Transmitância
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trabalho.
52
53
60.00
54
40.00
58
20.00
0.00
1:2000
1:1500
1:1000
1:500
Diluição
Figura 25. Gráfico do aumento do efeito de matriz com a diminuição das diluições das
amostras.
Resultados e discussões
89
9.1.5.
Adição de analito
Outro teste que pode ser feito para estudar se a matriz afeta o sinal
analítico dos compostos de interesse é a adição de analito. Uma curva analítica
é feita com a adição da substância de referência na amostra e comparada com
uma curva analítica sem a presença da matriz. Um indício de que não há
interferência de matriz é o caso em que as curvas analíticas sejam paralelas
(Ribani et al., 2004).
Foram feitas três adições de analito tanto para amostras provenientes da
Baía de Guanabara quanto para as oriundas de Itaipu. Foram escolhidas bílis
com cores e valores de absorvância diferentes para uma maior heterogeneidade
das amostras (Quadro 5 e Quadro 6).
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No gráfico da Figura 26 nota-se que há pouca interferência da matriz já
que as curvas obtidas com as soluções contendo a bílis dos peixes coletados na
Baía de Guanabara são aproximadamente paralelas à curva obtida para as
soluções-padrão, mesmo para as bílis que apresentaram mais compostos
fluorescentes. No caso das bílis de peixes de Itaipu, as retas foram praticamente
coincidentes (Figura 27), independente da cor da amostra. Para a análise das
amostras utilizou-se então, a curva analítica preparada somente com solvente,
sem a presença da matriz, por ser uma técnica mais simples de análise.
Quadro 5. Cor e valor de absorvância das amostras utilizadas no teste de adição de
analito.
Código da amostra
Cor do líquido biliar
Absorvância
51
verde musgo
1,069
53
castanho
0,531
54
marrom
1,005
31
marrom
0,654
38
verde musgo
0,908
40
castanho claro
0,237
Baía de Guanabara
Itaipu
Resultados e discussões
90
Quadro 6. Equações das regressões lineares das adições de analito e seu coeficiente de
2
correlação (R ).
Amostra
99,20 %
YˆBG = 141,386+ 8,1188 x
99,40 %
YˆBG = 25,354+ 9,078 x
99,98 %
YˆBG = 76,923+ 8,617 x
99,85 %
31
YˆItaipu = 10,109+ 8,939 x
99,94 %
38
YˆItaipu = 7,801+ 8,686 x
99,71 %
40
YˆItaipu = 14,699+ 8,826 x
99,94 %
( ±1, 510 )
51
( ±8,119)
53
( ±0,588)
54
( ±1, 437)
( ±1, 216 )
( ±2, 372 )
( ±7 , 511)
( ±0 ,181)
( ±0,353)
( ±0, 070)
( ±0,172)
( ±0 ,146 )
( ±0 , 284 )
( ±0 , 900 )
350
f
300
250
Intensidade
PUC-Rio - Certificação Digital Nº 0410380/CA
Itaipu
R
Yˆs = 6,248+ 9,503 x,
Solvente
Baía de Guanabara (BG)
2
Equação da reta
soluções-padrão
200
adição de analito - amostra 51
150
adição de analito - amostra 53
100
adição de analito - amostra 54
50
0
0
5
10
15
20
25
Concentração ( µ g L-1)
Figura 26. Gráfico de adição de analito usando a bílis dos peixes coletados na Baía de
Guanabara.
Resultados e discussões
91
Intensidade
F
250
200
adição de analito - amostra 31
150
adição de analito - amostra 38
adição de analito - amostra 40
100
soluções-padrão
50
0
0
5
10
15
20
25
-1
Concentracao ( µ g L )
Figura 27. Gráfico de adição de analito usando a bílis dos peixes coletados em Itaipu.
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O teste de adição de analito também foi usado para verificação da
exatidão do método. Para tal, usando-se a curva analítica obtida para os padrões
diluídos com solvente, foram calculadas as concentrações das amostras
fortificadas com padrões e comparadas com a concentração esperada. Foi
obtido uma média de concentração correspondente a 86% da concentração
esperada, com valores variando de 81% a 93%.
Outra maneira de verificarmos a exatidão do método seria a análise de
materiais certificados de referência. No entanto, apesar de Ariese e
colaboradores (2005a, 2005b) terem
desenvolvido materiais certificados de
referência preparados com a bílis dos peixes Platichthys flesus (Linguado) e
Pleuronectes platessa (Solha) coletados em locais considerados não-poluídos e
expostos em laboratório a sedimentos contaminados e a óleo, respectivamente,
este material ainda não está disponível para compra.
Além disso, a exatidão do método também poderia ser estudada pela
comparação de resultados obtidos com outras técnicas já estabelecidas. No
entanto, está é a primeira vez que estão sendo feitas determinações de HPAs
em bílis de peixes coletados na Baía de Guanabara e não foi possível organizar
um ensaio interlaboratorial a fim de comparar os resultados obtidos pela
impossibilidade de organizar o teste no tempo disponível para a conclusão deste
trabalho.
Resultados e discussões
92
9.2.
Comparação entre Baía de Guanabara e Itaipu
9.2.1.
Parâmetros físico-químicos
Foram feitas 3 coletas na Baía de Guanabara e 3 coletas em Itaipu
conforme o Quadro 7. A primeira coleta na Baía de Guanabara e a primeira
coleta de Itaipu foram coletas de reconhecimento do local e os resultados
obtidos não foram considerados para as conclusões desta dissertação.
Como em setembro de 2005 houve o derrame de 2.000 L de óleo na Baía
de Guanabara que atingiu as praias da Flecha e Icaraí em Niterói, foi feita uma
coleta de peixes em Itaipu para avaliar se houve alteração nos valores de
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metabólitos de HPAs medidos, em relação aos valores de agosto.
Quadro 7. Data e coordenadas da coletas.
Local
Data
Coordenadas
Baía de Guanabara
16/02/2005
S 22 44.696’
Itaipu
23/02/2005
S 22 58.359’
Baía de Guanabara
10/08/2005
S 22 44.654’
o
W 43 11.483’
o
o
W 43 02.915’
o
W 43 11.496’
o
o
o
o
Itaipu
17/08/2005
S 22 56.550’
W 43 03.030’
Itaipu
06/09/2005
-
-
Baía de Guanabara
27/12/2005
S 22 44.774’
o
o
W 43 11.529’
Pelos parâmetros físico-químicos medidos nos locais de amostragem
(Tabela 10) vemos que há uma grande diferença entre a transparência e turbidez
da Baía de Guanabara e Itaipu, indicando que existe mais material particulado
em suspensão na Baía de Guanabara do que em Itaipu. A condutividade de
Itaipu é mais alta do que na Baía de Guanabara, como esperado, já que em
Itaipu a água é salina e na Baía de Guanabara a água é salobra. Nota-se
também o aumento da temperatura da água de ~11% no verão em relação ao
inverno.
Resultados e discussões
93
Tabela 10. Parâmetros físico-químicos.
Baía de
Itaipu
Baía de
Itaipu
Baía de
Guanabara
(fev/2005)
Guanabara
(ago/2005)
Guanabara
(fev/2005)
temperatura (oC)
27,0
(ago/2005)
26,0
23,8
(dez/2005)
23,2
26,1
pH
-
8,09
-
-
8,02
condutividade (mS cm-1)
-
52,8
-
41,8
33,8
5,7
oxigênio dissolvido (mg L-1)
5,8
-
-
9,1
transparência (m)
0,66
2,70
0,64
3,78
0,66
turbidez (NTU)
11,7
4,2
17,4
0,38
-
9.2.2.
Análise morfométrica dos peixes
Na Figura 28 encontra-se a distribuição de frequência do comprimento
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padrão dos indivíduos capturados na Baía de Guanabara e em Itaipu. A
normalidade dos dados foi analisada pelo teste de Anderson-Darling (p = 0,394).
Houve maior incidência de indivíduos (n=10) na faixa de tamanho de 42 a 44 cm.
Apenas na coleta de setembro de 2005, em Itaipu, foram coletados indivíduos
com comprimento total menor que 35 cm (Figura 29), tamanho menor que o
permitido pelo IBAMA (Portaria no 73/2003). É importante ressaltar que esta foi
uma coleta não programada, referente a um evento isolado decorrente de um
derramamento de óleo que ocorreu acidentalmente em Itaipu. A intenção desta
coleta foi aplicar a um caso real o método de determinação de metabólitos de
HPAs em bílis de peixes.
Excetuando-se a coleta de setembro, houve predominância de machos
nas demais coletas, correspondendo a 76% do total de indivíduos capturados
(Tabela 11 e Figura 30). Yender e colaboradores (2002) relatam que o risco de
exposição de peixes de estuário aumenta em áreas com menor profundidade e
durante a época de desova. Apesar de não ser conclusivo, este fato explicaria a
predominância de fêmeas observada somente nesta coleta.
Resultados e discussões
94
50
Comprimento total (cm)
PUC-Rio - Certificação Digital Nº 0410380/CA
Figura 28. Distribuição de frequência do comprimento total dos indivíduos coletados
40
30
BG
Ago/2005
n=19
Itaipu
Ago/2005
n=11
BG
Dez/2005
n=8
Itaipu
Set/2005
n=12
Figura 29. Gráfico de Boxplot do comprimento total, classificado por coleta
(BG: Baía de Guanabara).
Resultados e discussões
95
Tabela 11. Número de machos e fêmeas capturados.
Local
Mês
Macho
Fêmea
Total
Baía de Guanabara
Agosto/2005
17
2
19
Itaipu
Agosto/2005
6
5
11
Itaipu
Setembro/2005
3
5
8
Baía de Guanabara
Dezembro/2005
12
0
12
38
12
50
Total
24%
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76%
Macho
Fêmea
Figura 30. Proporção sexual dos indivíduos capturados
em todas as coletas da Baía de Guanabara e Itaipu.
Apesar de estarem presentes em maior número, os machos, em média,
são menores e pesam menos que as fêmeas (Tabela 12 e Tabela 13, Figura 31
e Figura 32).
Tabela 12. Estimativa da média do peso (kg) dos peixes coletados*.
Local
Mês
Macho
Fêmea
Total
Baía de Guanabara
Agosto/2005
0,520 ±1,128
1,128 ± 0,045
0,584 ± 0,284
Itaipu
Agosto/2005
0,707 ± 0,102
0,813 ± 0,106
0,755 ± 0,113
Itaipu
Setembro/2005
0,308 ± 0,030
0,464 ± 0,124
0,406 ± 0,125
Baía de Guanabara
Dezembro/2005
0,673 ± 0,216
Total
* média ± desvio-padrão
0,581 ± 0,223
0,673 ± 0,216
0,720 ± 0,272
0,614 ± 0,240
Resultados e discussões
96
Tabela 13. Estimativa da média do comprimento total (cm) dos peixes coletados*.
Local
Mês
Macho
Fêmea
Total
Baía de Guanabara
Agosto/2005
39,329 ± 5,018
50,800 ± 0,283
40,537 ± 5,955
Itaipu
Agosto/2005
43,983 ± 2,301
45,560 ± 2,809
44,700 ± 2,546
Itaipu
Setembro/2005
32,183 ± 2,426
36,880 ± 4,452
35,119 ± 4,350
Baía de Guanabara
Dezembro/2005
42,208 ± 3,895
Total
40,409 ± 5,057
42,208 ± 3,895
42,817 ± 6,412
40,987 ± 5,442
* média ± desvio-padrão
1.2
1.1
1.0
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
Macho
Fêmea
Figura 31. Gráfico de Boxplot do peso, classificado por sexo.
50
Comprimento total (cm)
PUC-Rio - Certificação Digital Nº 0410380/CA
Peso (kg)
0.9
40
30
Macho
Fêmea
Figura 32. Gráfico de Boxplot do comprimento total, classificado por sexo.
Resultados e discussões
97
Segundo Vazzoler (1996, in Costa, 2005) o valor do coeficiente angular
de regressão entre peso total (W T) e comprimento padrão (LP) varia de 2,5 a 4,0.
Pela equação 4 (seção 5.2.1.) foi calculado o modelo que relaciona W T, a partir
de LP:
Wˆ T = 0,0354 × L2P,790 ,
R 2 = 93,02%
com ambas estimativas significativas e o valor de p = 0,735 para o pressuposto
de normalidade dos resíduos. O valor de β foi 2,79, próximo de 3,0, valor
característico de espécies que apresentam crescimento isométrico.
A partir do cálculo de β foi possível calcular o fator de condição (K) para
cada indivíduo usando-se a equação 6 (5.2.2) (Quadro 8). Pela análise de
variância dos dados não foi encontrada diferença significativa entre os valores
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obtidos para cada coleta (Tabela 14), indicando que os peixes coletados tinham
mesmas condições de desenvolvimento. No entanto, é reportado que o fator de
condição é variável durante o ciclo de maturidade sexual do indivíduo, reduzindo
na época de reprodução, já que este pode ser influenciado, entre outros fatores,
pela variação do peso das gônadas e estômago. Esta tendência foi vista neste
trabalho nos peixes coletados na Baía de Guanabara em dezembro, época de
reprodução observada para a Mugil liza (Oliveira, 1997).
Quadro 8. Estimativa das médias dos valores do fator de condição (K)*.
Local
Mês
K
Baía de Guanabara
Agosto/2005
0,037 ± 0,009
Itaipu
Agosto/2005
0,037 ± 0,003
Itaipu
Setembro/2005
0,039 ± 0,008
Baía de Guanabara
Dezembro/2005
0,033 ± 0,003
* média ± desvio-padrão
Tabela 14. Análise de variância do fator de condição em relação as coletas.
Causa de
Grau de
Soma dos
Média dos
variação
liberdade
Quadrados
Quadrados
Local
3
0,0001932
0,0000644
0,0000519
Erro
46
0,0023885
Total
49
0,0025817
F
p
1,24
0,306
Resultados e discussões
98
9.2.3.
Análise da bílis
Na Figura 33 observa-se a diferença entre os espectros da bílis dos
peixes coletados na Baía de Guanabara e em Itaipu. Os espectros da Baía de
Guanabara apresentam dois picos em 383 nm e 405 nm, respectivamente.
Ariese e colaboradores, em seu artigo de 1993, reportam que o espectro da bílis
do linguado (Platichthys flesus) também apresenta dois picos nos mesmos
comprimentos de onda, que eles relacionaram com o espectro do metabólito 1pireno-glicuronídeo padrão, principal metabólito da fase II da biotransformação
do pireno. Os cálculos das concentrações de HPAs totais foi calculado a partir da
altura dos picos em 383 nm, comprimento de onda otimizado para o pireno, e as
.
80
f
70
Intensidade
PUC-Rio - Certificação Digital Nº 0410380/CA
concentrações são reportadas em equivalentes de pireno.
383 nm
60
2 (Baía de Guanabara)
50
4 (Baía de Guanabara)
7 (Baía de Guanabara)
40
30 (Itaipu)
30
31 (Itaipu)
39 (Itaipu)
20
10
0
350
370
390
410
430
450
470
490
comprimento de onda (nm)
Figura 33. Espectros de emissão fluorescente das bílis diluídas da Baía de Guanabara e
Itaipu.
O Quadro 9 apresenta as médias das concentrações de HPAs na bílis
dos peixes (Mugil liza) capturados em cada coleta, em relação ao sexo dos
indivíduos. Através da análise de variância verifica-se que não existe diferença
significativa entre as médias (Quadro 9, Tabela 15, Tabela 16, Tabela 17) e
portanto, os dados serão tratados como um todo, sem a separação por sexo.
Resultados e discussões
99
-1
Quadro 9. Média da concentração de HPAs em mg L de equivalentes de pireno na bílis
dos peixes (Mugil liza) capturados, separados por sexo*.
Local
Mês
Macho
Fêmea
Baía de Guanabara
Agosto/2005
7,4 ± 3,4 (n=17)
3,8 ± 0,7 (n=2)
Itaipu
Agosto/2005
1,8 ± 1,1 (n=6)
1,0 ± 0,4 (n=5)
Baía de Guanabara
Dezembro/2005
10,4 ± 6,4 (n=12)
Itaipu
Setembro/2005
1,7 ± 0,7 (n=3)
6,4 ± 3,3 (n=5)
* média ± desvio-padrão
Tabela 15. Análise de variância da média das concentrações de HPAs por sexo, coleta
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da Baía de Guanabara, agosto/2005.
Causa de
Grau de
Soma dos
Média dos
variação
liberdade
Quadrados
Quadrados
Sexo
1
23,3
23,3
Erro
17
187,9
11,1
Total
18
211,3
F
p
2,11
0,164
Tabela 16. Análise de variância da média das concentrações de HPAs por sexo, coleta
de Itaipu, agosto/2005.
Causa de
Grau de
Soma dos
Média dos
variação
liberdade
Quadrados
Quadrados
Sexo
1
1,456
1,456
Erro
9
6,625
0,736
Total
10
8,081
F
p
1,98
0,193
Tabela 17. Análise de variância da média das concentrações de HPAs por sexo, coleta
de Itaipu, setembro/2005.
Causa de
Grau de
Soma dos
Média dos
variação
liberdade
Quadrados
Quadrados
Sexo
1
40,83
40,83
Erro
6
45,50
7,58
Total
7
86,34
F
p
5,38
0,059
No Quadro 10 são apresentadas as estimativas das médias das
concentrações de HPAs na bílis dos peixes capturados em cada coleta e a
Figura 34 apresenta a distribuição das medições em relação à mediana,
mostradas na forma de boxplot. Medidas feitas na bílis diluídas de três peixes
Resultados e discussões
100
coletados em Itaipu estavam abaixo do limite de detecção de 0,3785 µg L-1 e não
foram utilizadas nos cálculos.
Quadro 10. Estimativa das médias das concentrações de HPAs (µg de equivalentes de
-1
pireno mL de bile) por coleta*.
-1
HPAs (µg mL )
Local
Mês
Baía de Guanabara
Agosto/2005
7,0 ± 3,4
Itaipu
Agosto/2005
1,8 ± 0,7
Baía de Guanabara
Dezembro/2005
10,4 ± 6,4
Itaipu
Setembro/2005
4,6 ± 3,5
equivalentes de pireno
* média ± desvio-padrão
Concentração (ug/L)
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30
20
10
0
BG
Ago/2005
Itaipu
Ago/2005
BG
Dez/2005
Itaipu
Set/2005
Figura 34. Gráfico de Boxplot da concentração de HPAs na bílis dos peixes, por coleta.
Pela análise de variância dos resultados obtidos nas diferentes coletas
verificou-se que existe diferença significativa entre os valores medidos (Tabela
18).
Tabela 18. Análise de variância das concentrações de HPAs por coleta.
Grau
de Soma
dos Média
dos F
liberdade
quadrados
quadrados
Local
3
2,8798
0,9599
Erro
43
3,4081
0,0793
Total
46
6,2879
12,11
p
0,000
Resultados e discussões
101
Usando-se o teste de Tukey foi feita a comparação entre as médias par a
par. Esta análise indicou que não existe diferença significativa, para um nível de
confiança de 95%, entre os valores obtidos para a Baía de Guanabara nas
diferentes estações do ano, inverno e verão.
Já comparando os valores obtidos para a Baía de Guanabara e Itaipu
antes do derrame de setembro/2005, vemos que há diferença significativa, para
um nível de confiança de 95%. Comparando os valores obtidos para Itaipu antes
e depois do derrame vemos que também houve diferença significativa entre os
resultados.
Assim, pelos resultados preliminares obtidos, pode-se dizer que o método
utilizado foi capaz de diferenciar um local contaminado de um local não
contaminado, tanto em casos de contaminação crônica (Baía de Guanabara)
quanto em casos de contaminações acidentais (Itaipu, setembro/2005).
A comparação dos valores de concentração obtidos neste trabalho com
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os valores obtidos por outros autores fica prejudicada uma vez que os resultados
são apresentados de formas distintas, além de, em muitas vezes, utilizarem
metodologias e técnicas analíticas diferentes. O Quadro 11 apresenta o
resultado de alguns trabalhos onde as concentrações são indicadas em
equivalentes de 1-hidroxpireno. Verifica-se que os valores obtidos para os locais
contaminados dos trabalhos de Lin e colaboradores (1994) e van der Oost e
colaboradores (1994),
encontram-se na mesma ordem de grandeza que os
valores obtidos neste trabalho para os peixes coletados na Baía de Guanabara e
em Itaipu após o derrame de setembro/2005.
Com
o
objetivo
de
tentar
minimizar
possíveis
variações
nas
concentrações de HPAs pela concentração dos compostos presentes na bílis, de
acordo com o tempo de jejum de cada peixe (status alimentar), alguns autores
tentaram normalizar as concentrações de HPAs pela concentração de biliverdina
ou proteína das amostras. No entanto, foi observado que não houve diminuição
na covariância dos resultados e aumentando a incerteza dos resultados (Ariese
et al., 1997; Aas et al., 2000; Richardson et al., 2004). Ainda assim, recomendase que sejam feitas estas medições para fins comparativos. Neste trabalho foram
feitas medições de absorvância em soluções de bílis diluídas em etanol 48%
(1:100).
Resultados e discussões
102
Quadro 11. Concentrações de HPAs em bílis de peixe em locais contaminados.
Peixe
Local
Concentração
Unidade
Referencia
Black river, rio que
27,9 – 126,1
(µg mg proteína-1)
Lin et al., 1996
FF
Ameiurus nebulosus
desemboca no Lago
equivalentes de
Erie (Grandes Lagos,
naftaleno
EUA)
FS
Ameiurus nebulosus
Black river, EUA.
2,63 – 19,5
(µg mLbílis-1)
Lin et al., 1994
equivalentes de
1-hidroxipireno
Anguilla anguilla
Lago Nieuwe Meer,
9,4 ± 7,2
Holanda
(µg mL bílis-1)
van der Oost et
equivalentes de
al., 1994
1-hidroxipireno
CLAE – F
Paralichthys
Marina del Rey,
californicus
Califórnia, EUA
1,8 – 4,6
(µg mL bílis-1)
Brown &
equivalentes de
Steinert, 2003
benzo(a)pireno
Pleuronectes vetulus canal de Duwamish,
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Puget Sound, EUA
0,3-0,6
(µg mL bílis-1)
Myers et al.,
equivalentes de
1998
benzo(a)pireno
9.2.4.
Análise por fluorescência - método sincronizado
Na fluorescência sincronizada, os comprimentos de onda de excitação e
emissão são variados simultaneamente, com um intervalo fixo ∆λ ou ∆E, onde o
máximo de sinal ocorrerá quando a varredura atingir o λexc.
Ariese e colaboradores (1993) recomendam que se use a análise de
fluorescência sincronizada já que o espectro obtido tem bandas mais bem
definidas do que o espectro obtido com a fluorescência fixa. Já Lin e
colaboradores (1996) indicam, para a análise de metabólitos de HPAs em bílis
de peixe, o uso da análise por fluorescência fixa por ser uma técnica mais
simples do que a fluorescência sincronizada. Atualmente, vários fluorímetros
comercialmente disponíveis oferecem a possibilidade de registro deste tipo de
espectro.
Aas e colaboradores (2000) ao estudarem os metabólitos presentes na
bílis de peixes expostos a determinados HPAs individualmente (naftaleno, pireno
e benzo(a)pireno) demonstraram que existem diferentes espectros para as
diferentes classes de HPAs, usando-se o mesmo ∆λ. Tendências espectrais
Resultados e discussões
103
podem ser demonstradas com bílis de peixes expostos a HPAs de fontes
petrogênicas e pirogênicas.
Neste trabalho, ao analisarmos as bílis dos peixes coletados na Baía de
Guanabara, os espectros de fluorescência sincronizada mostraram que existem
duas classes de HPAs presentes, com picos nos comprimentos de onda
característicos de compostos com 2-3 anéis (λ = 280 nm) e 4 anéis (λ = 332 nm)
(Figura 35). Não foi observado nenhum pico no comprimento de onda
característico de HPAs com 5-6 anéis (λ = 380 nm). Estes resultados seriam um
indício de contaminação petrogênica já que a combustão incompleta de matéria
orgânica dá origem preferencialmente a HPAs de alta massa molecular.
Este resultado é esperado já que a Baía de Guanabara recebe
diariamente 7 toneladas de óleo (CEDAE, 199-) e está em concordância com
estudos realizados por Lima (2001) em mexilhões da Baía de Guanabara, onde
os HPAs predominantes foram fenantrenos alquilados e dibenzotiofenos, os
presentes nos mexilhões.
No entanto, não se deve ignorar o aporte de HPAs provenientes da
combustão incompleta de matéria orgânica, que podem chegar à Baía de
Guanabara por deposição atmosférica, já que o grau de contaminação
atmosférico está diretamente relacionado com a urbanização, ao tráfego de
veículos automotores e com a industrialização da área (Pereira Netto et al.,
2000) . HPAs de 5-6 anéis também foram detectados nos estudos em mexilhões
feitos por Lima.
300
280 nm
250
Intensidade f
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quais destacam a origem, preferencialmente, petrogênica dos hidrocarbonetos
200
51
332 nm
150
55
56
100
50
0
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
comprimento de onda (nm)
Figura 35. Espectro de fluorescência sincronizada (∆λ=51 nm) para bílis de peixes
coletados na Baía de Guanabara.
Resultados e discussões
104
9.2.5.
Correlação entre as variáveis
As variáveis categóricas deste estudo foram codificadas de acordo com o
Quadro 12 a seguir. O critério utilizado para categorização do local levou em
consideração também o derramamento de óleo ocorrido em Niterói em setembro
de 2005.
Quadro 12. Codificação das variáveis categóricas.
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Sexo
Local
Cor da bílis
Macho
1 Baía de Guanabara – Ago/2005
1 Verde musgo
1
Fêmea
2 Itaipu – Ago/2005
2 Marrom
2
Baía de Guanabara – Dez/2005
3 Castanho
3
Itaipu – Set/2005
4 Castanho claro
4
Assim, foi calculada a matriz de correlação das variáveis, onde é indicado
o valor da correlação de Pearson entre cada variável e construído o dendograma
de similaridade pelo método de Ward, utilizando distâncias euclidianas como
medida de similaridade.
Pode-se observar na Tabela 19 e Figura 36 que são significativas as
correlações entre o peso, comprimento padrão e comprimento total, de acordo
com o crescimento isométrico calculado anteriormente. Houve também
correlação positiva entre o peso, comprimento total e comprimento padrão com o
volume de bílis, indicando que quanto maior o peixe maior a quantidade de bílis
encontrada.
Tabela 19. Matriz de correlação das variáveis.
WT
WT
1
LT
0,921
LT
LP
K
volume
sexo
local
HPA
Absorvância
Cor
1
LP
0,825
0,907
1
K
0,293
-0,029
-0,254
1
volume
0,603
0,606
0,500
0,066
sexo
0,215
0,161
0,079
0,194
0,186
1
local
-0,152
-0,235
-0,102
-0,022
-0,160
0,277
1
1
HPA
0,081
0,004
0,070
0,018
0,191
-0,237
0,025
1
Absorvância
-0,040
-0,109
-0,118
0,208
-0,021
0,158
0,143
0,567
1
Cor
0,045
0,028
0,065
-0,038
-0,164
0,235
0,227
-0,488
-0,381
1
Resultados e discussões
105
Similaridade
-123.10
-48.74
25.63
100.00
so
Pe
Lt
Lp
e
lum
Vo
K
xo
Se
l
ca
Lo
A
HP
ão
rç
so
b
A
r
Co
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Figura 36. Dendograma de similaridade dos valores absolutos das correlações absolutas
das distâncias pelo método de Ward.
Além destas correlações, foram encontradas correlações entre o valor de
absorvância em 380 nm, a cor da bílis e a concentração de HPAs medida,
mostrando a relação que existe entre a maior densidade da bílis e concentrações
maiores de HPAs, apesar de já ter sido demonstrado que normalizar as
concentrações de HPAs pela concentração de biliverdina, medida por absorção
molecular, não melhora a covariância dos resultados.
Uma preocupação neste trabalho era saber se o tipo de pesca teria
influência no status alimentar do peixe, afetando a concentração de HPAs
medida. Neste estudo o tipo de pesca usado na captura de peixes da Baía de
Guanabara foi o curral. O curral tem formato externo circular com um
prolongamento que sai de um ponto determinado e que serve para direcionar o
peixe para dentro do curral, até serem retirados com uma rede. Já em Itaipu o
tipo de pesca usado para captura dos peixes foi o arrasto de praia onde o
pescado se acumula na rede durante o arrasto.
Dos peixes capturados na Baía de Guanabara, 50% apresentaram bílis
com coloração verde musgo enquanto em Itaipu apenas 28% apresentaram esta
mesma coloração, podendo indicar que os peixes que ficam presos no curral
ficam maior tempo sem se alimentar. No entanto, estes dados não são
conclusivos para se afirmar que há influência do tipo de pesca usado, curral ou
arrasto, no status alimentar dos peixes capturados.
Resultados e discussões
106
9.2.6.
Determinação de HPAs totais em água
Para a análise de HPAs totais em água foi obtida uma curva analítica
utilizando soluções de pireno em diclorometano. Para a elaboração da curva
analítica foram utilizados 6 soluções-padrão com concentrações entre 10 a 150
µg L-1, obtidos pela diluição da solução estoque de pireno. Foram feitas 3
replicatas de cada concentração, obtendo-se a seguinte curva analítica (Figura
23):
Yˆc = 0,570+ 1,865 x,
( 11 )
R 2 = 99,80%
( ±0 , 020 )
300
Intensidade
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( ±1, 639 )
200
100
Regressão
Intervalo de Confiança 95%
0
0
50
100
150
Concentração (ng/mL)
Figura 37. Curva analítica de soluções de pireno em diclorometano (n=3).
A Tabela 20 mostra a análise de variância da curva de regressão com p =
0,000. O pressupostos de normalidade e homogeneidade de variância também
foram testados apresentando p=0,147 e p=0,131 para a estatística teste de
Anderson-Darling e Bartlett respectivamente.
Resultados e discussões
107
A linearidade da curva foi testada pelo teste do ajuste do modelo linear
(erro puro), sendo a faixa de trabalho considerada linear com p = 0,788.
Tabela 20. Análise de variância da curva de regressão.
Causa de
Grau de
Soma dos
Média dos
variação
liberdade
Quadrados
Quadrados
Regressão
1
194.532
194.532
Resíduo
19
426
22
Total
20
194.958
F
p
8.684,66
0,000
Como os pressupostos de normalidade e homogeneidade de variância
foram válidos, o mínimo valor detectável referente à concentração, x0, e o
mínimo valor quantificável referente à concentração x0, podem ser obtidos pelas
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equações (13) e (14):
xD =
3,29 22
= 8,274µg ⋅ L−1
1,865
xQ =
10 22
= 25,15µg ⋅ L−1
1,865
O mínimo valor detectável e o mínimo valor quantificável foram,
respectivamente, 8,274 µg L-1 e 21,15 µg L-1.
Os HPAs foram medidos em amostras de água do mar filtradas e não
filtrada. No entanto, os extratos obtidos para a água do mar não filtrada
encontravam-se intensamente coloridos, verdes, devido ao fitoplâncton presente
nas amostras, interferindo nas análises por fluorescência. e os resultados foram
expressos em equivalentes de pireno (µg L-1) (Tabela 21). Foram preparados
brancos do processo e seu valor de intensidade foi descontado do valor de
intensidade obtido para as amostras.
Resultados e discussões
108
Tabela 21. Concentração de HPAs medidos em amostras de água*.
Local
-1
Data
Concentração (µg L )
equivalentes de pireno
Baía de Guanabara
agosto/2005
0,0921 ± 0,0053
Itaipu
agosto/2005
0,0225 ± 0,0164
Baía de Guanabara
dezembro/2005
0,1097 ± 0,0009
* média ± desvio-padrão
Os valores obtidos neste estudo, apesar de reportados em equivalentes
de pireno, tiveram a mesma ordem de grandeza dos menores valores reportados
por Azevedo (1998) e Meniconi e colaboradores (2002), que reportaram seus
resultados em equivalentes de criseno (Quadro 13).
Quadro 13. Concentrações de HPAs na água da Baía de Guanabara.
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Concentrações de HPAs Unidade
0,06 – 1,59
(µg L-1)
-1
0,66 – 1,18 (F)
(µg L )
0,79 – 2,79 (NF)
equivalentes de criseno
0,93 (F)
(µg L-1)
1,52 (NF)
equivalentes de criseno
<0,04 – 11,56 (NF)
(µg L-1)
Referência
Silva, 2004
Lima, 2001
Lima, 2001
(µg L-1)
0,12 – 1,75 (NF)
equivalentes de criseno
0,21 – 1,40 (F)
(µg L-1)
0,93 – 2,97 (NF)
equivalentes de criseno
F: amostra filtrada; NF: amostra não filtrada
amostras coletadas em 1999.
amostra coletada após o acidente
de janeiro/2000.
Meniconi et al., 2002
equivalentes de criseno
0,05 – 1,09 (F)
Observações
Azevedo, 1998
Hamacher, 1996
10 dias após o acidente de 2000.
10
Conclusões e Considerações finais
No presente trabalho foi otimizada uma metodologia analítica simples e
de baixo custo para a determinação de metabólitos de HPAs em bílis de peixes
por fluorescência. Ao utilizar a análise por fluorescência deve-se ter em mente
que esta não é uma técnica seletiva e não possibilita a quantificação dos HPAs
individuais, sendo portanto, uma técnica semi-quantitativa.
Entretanto, o enfoque principal deste estudo não foi a quantificação dos
HPAs e sim desenvolver uma metodologia capaz de detectar a presença ou
ausência de contaminação por petróleo no ambiente no qual os indivíduos foram
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capturados (peixes). Assim, para fins de monitoramento ambiental preliminar,
esta técnica é indicada já que não são necessárias etapas de extração e cleanup , tornando o processo de análise mais rápido e econômico se comparado a
outros processos usualmente utilizado para a análise de HPAs.
Para a análise de metabólitos de HPAs em bílis de peixe foram otimizados
os principais parâmetros envolvidos na metodologia e na técnica analítica, sendo
os resultados obtidos para o limite de detecção (LD = 0,3785 µg L-1) e de
quantificação (LQ = 1,504 µg L-1) indicando uma aplicação favorável ao uso a
que se destina.
Após o uso de um planejamento experimental para determinar o melhor
sistema solvente para preparação das soluções-padrão e para a diluição das
amostras, verificou-se que a proporção etanol/água de 48% foi a condição mais
adequada. Cabe ressaltar que esta já vem sendo utilizada por outros autores
para a análise de metabólitos de HPAs na bílis de peixe.
Deve ser enfatizado que ao utilizar a metodologia proposta deve-se tomar
cuidado com a proporção da diluição das amostras devido o efeito de matriz ser
significativo. A diluição sugerida neste trabalho é a proporção 1:2000, bílissolvente.
A exatidão do método foi verificada através da adição de analito, onde o
valor médio das concentrações determinadas para a adição de analito
correspondeu a 86% da concentração esperada.
Conclusões e Considerações finais
110
Pela análise dos resultados obtidos para a Baía de Guanabara e Itaipu
conclui-se que o método proposto neste estudo é capaz de diferenciar um local
contaminado de um local não contaminado por compostos de petróleo, tanto em
casos de contaminação crônica (Baía de Guanabara) quanto em casos de
contaminações acidentais (Itaipu, setembro/2005).
Adicionalmente, apesar de não ser o objetivo principal do estudo, pôdese obter também informações preliminares da origem dos HPAs. Neste trabalho,
ao analisarmos as bílis dos peixes coletados na Baía de Guanabara, os
espectros de fluorescência sincronizada mostraram que existem duas classes de
HPAs presentes, com picos nos comprimentos de onda característicos de
compostos com 2-3 anéis (λ = 280 nm) e 4 anéis (λ = 332 nm). Não foi
observado nenhum pico no comprimento de onda característico de HPAs com 56 anéis (λ = 380 nm). Estes resultados seriam um indício de contaminação
petrogênica.
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Cabe ressaltar ainda a importância dos cuidados tomados no
planejamento amostral dos indivíduos capturados, selecionando e monitorando o
tamanho dos peixes entre outros dados morfométricos. Se a cadeia de custódia
das amostras não é bem estabelecida, principalmente neste tipo de estudo que
envolve grande parte de trabalho de campo, o resultado do trabalho pode ser
questionado, mesmo que estejam analiticamente corretos. Assim, estudos
adicionais e informações sobre a distribuição de frequência do comprimento total
dos indivíduos coletados, a proporção sexual dos indivíduos capturados, estágio
de maturação, fator de condição, entre outros são extremamente relevantes para
aplicações na área ambiental. O histórico e os dados (físico-químicos,
geográficos, climatológicos, entre outros) sobre o ambiente onde os indivíduos
foram capturados também devem fazer parte do estudo para uma melhor
compreensão e discussão dos resultados.
A análise de correlação entre os dados obtidos indicou que são
significativas as correlações entre o peso, comprimento padrão e comprimento
total, de acordo com o crescimento isométrico dos indivíduos. Houve também
correlação positiva entre o peso, comprimento total e comprimento padrão com o
volume de bílis, indicando que quanto maior o peixe maior a quantidade de bílis
encontrada para a Mugil liza. Isto indica que em programas de monitoramento
ambiental devam ser escolhidos para estudo indivíduos maiores, garantindo
assim sua maturidade sexual e a fácil retirada do líquido biliar.
Além destas correlações, foram encontradas correlações entre o valor de
absorvância em 380 nm, a cor da bílis e a concentração de HPAs medida,
Conclusões e Considerações finais
111
mostrando a relação que existe entre a maior densidade da bílis e concentrações
maiores de HPAs, apesar de já ter sido demonstrado que normalizar as
concentrações de HPAs pela concentração de biliverdina, medida por absorção
molecular, não melhora a covariância dos resultados.
Um aspecto importante que precisa ser mais estudado para alguma
conclusão é verificar se o tipo de pesca influencia o status alimentar do peixe,
afetando a concentração de HPAs medida.
Para uma melhor compreensão e discussão dos resultados é
fundamental a análise de HPAs no ambiente onde o biomonitor foi capturado. As
concentrações de HPAs obtidas na água, tanto da Baía de Guanabara quanto
em Itaipu, apresentaram a mesma ordem de grandeza dos menores valores
reportados anteriormente por outros autores. A idéia inicial era tentar verificar a
existência de alguma correlação entre as concentrações de HPAs na bílis do
peixe com as concentrações no ambiente onde os mesmos foram capturados.
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Entretanto, esta correlação não pode ser avaliada devido ao baixo número de
amostragens de água para esse tipo de conclusão.
É importante ressaltar que esta dissertação é o primeiro trabalho que relata
a utilização dos metabólitos de HPAs em bílis de peixes como biomarcadores no
monitoramento da contaminação por petróleo no Brasil. Este trabalho foi
apresentado em dois congressos durante o seu desenvolvimento (SBQ/2005 e
ENQA/2005), e atualmente outros grupos vem iniciando pesquisas na mesma
linha. Todas essas pesquisas vão contribuir para geração de dados pretéritos
que futuramente poderão gerar mais conhecimento dos ecossistemas brasileiros
estudados. Salienta-se aqui que o uso da análise de HPAs na bílis de peixe já
vem sendo usado com sucesso em outros países para o monitoramento
ambiental da contaminação por petróleo. Pela primeira vez esta técnica foi usada
para o monitoramento de peixes da Baía de Guanabara, RJ.
Existem na literatura estudos que avaliam a quantidade de HPAs
presentes no tecido de peixes coletados na Baía de Guanabara. No entanto,
este não é considerado um bom biomarcador de HPAs no ambiente aquático
devido ao seu rápido metabolismo em vertebrados, apesar de este tipo de
estudo ser importante do ponto de vista de saúde pública.
A tainha da espécie Mugil liza indicou ter potencial para ser um bom
biomonitor para a região da Baía de Guanabara, já que foi facilmente capturada
em épocas do ano distintas, pela fácil localização da vesícula biliar e por não
haver diferenças significativas entre os valores de HPAs medidos nas diferentes
estações do ano, inverno e verão.
Conclusões e Considerações finais
112
Apesar da sua proximidade com o Rio de Janeiro, facilitando a coleta de
indivíduos para o monitoramento, Itaipu não foi o local de controle mais
adequado, já que o biomonitor escolhido não foi facilmente coletado na estação
chuvosa (verão), época de sua reprodução em alto mar. Assim, é necessário
buscar um novo local para capturada dos peixes usados como controle.
Como conclusão geral, pode-se dizer que diante da crescente ameaça
ambiental que a Baía de Guanabara vem enfrentando, este trabalho torna-se
altamente interessante e com perspectivas muito promissoras para os protocolos
de avaliação ambiental. Haja visto que esta avaliação, baseada na determinação
de HPAs em peixes, pode fornecer dados pretéritos para a Baía de Guanabara,
nos casos de acidentes futuros, e contribuir para o monitoramento das emissões
crônicas por óleo, muitas vezes apresentando um potencial altamente tóxico,
oferecendo um grande perigo ao meio ambiente.
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Os bons resultados obtidos fazem supor uma grande potencialidade para
um uso mais amplo da metodologia otimizada para o biomonitoramento
buscando outros possíveis biomonitores, ou seja, testando outras espécies de
peixes. Entretanto, é necessário salientar uma limitação: o líquido biliar não pode
ser sempre considerado um bioindicador ideal, uma vez que há espécies de
peixes que não apresentam facilidade de localização e obtenção da bílis.
Por último, vale ressaltar que praticamente inexistem dados sobre a
contaminação de HPAs em peixes da espécie Mugil liza (tainha) na Baía de
Guanabara; além de serem pouco conclusivos, visto que os peixes são
transitórios no ambiente sendo, portanto, necessário um número maior de dados
para sua caracterização e avaliação.
Considera-se de fundamental importância para as discussões e conclusões
dos resultados obtidos a continuidade das pesquisas com trabalho de campo
baseado em um amplo planejamento amostral, com registros detalhados e que
monitore in situ os parâmetros físico-químicos e biológicos georeferenciados.
Finalmente, vale salientar que este trabalho contou com o apoio e a
colaboração de vários pesquisadores de áreas distintas o que faz deste um
trabalho de caráter interdisciplinar, contribuindo ainda mais para as discussões
na área.
Como trabalho futuro será estudada se existe correlação entre as
determinações feitas
usando-se a fluorescência fixa e a fluorescência
sincronizada. Além disso, deverá ser pesquisada nova área de controle onde o
Conclusões e Considerações finais
113
peixe Mugil liza esteja presente o ano inteiro e estudar como o ciclo reprodutivo
das tainhas pode influenciar os resultados. Deve ser estudada também as
possíveis relações entre o tipo de pesca e o status alimentar do peixe e a
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viabilidade do uso de novas espécies de peixes como biomonitores.
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