UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Helicobacter pylori E
CITOTÓXICA in vitro DE EXTRATOS ORGÂNICOS OBTIDOS DAS
FOLHAS DE Encholirium spectabile E Syzygium cumini.
GABRIELA MEDEIROS ARAÚJO
NATAL/RN
Março de 2014
GABRIELA MEDEIROS ARAÚJO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Helicobacter pylori E CITOTÓXICA in vitro
DE EXTRATOS ORGÂNICOS OBTIDOS DAS FOLHAS DE Encholirium
spectabile E Syzygium cumini.
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa
de
Pós-graduação
em
Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
requisito parcial à obtenção do grau de
Mestre em Ciências Biológicas.
Orientador: Professor Doutor José Veríssimo Fernandes
Coorientadora: Professora Doutora Vânia Sousa Andrade
2014
NATAL – RN
Catalogação da Publicação na Fonte
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Araújo, Gabriela Medeiros.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter pylori e citotóxica in vitro de
extratos orgânicos obtidos das folhas de Encholirium spectabile E
Syzygium cumini / Gabriela Medeiros Araújo. - Natal, 2014.
78f: il.
Coorientadora: Profa. Dra. Vânia Sousa Andrade.
Orientador: Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas.
1. Atividade antimicrobiana - Dissertação. 2. Citotoxicidade in vitro Dissertação. 3. Helicobacter pylori - Dissertação. I. Andrade, Vânia
Sousa. II. Fernandes, José Veríssimo. III. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE01
CDU 579.84
Dedico este trabalho a:
Meus pais,
Edjane Araújo e Jacó Araújo (In memoriam)
Meu companheiro,
Ruy Lima.
Meus tesouros.
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é
senão uma gota de água no mar. Mas o mar
seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Madre Teresa de Calcutá
Agradeço:
A Deus, por acompanhar e iluminar minha vida, inclusive a acadêmica,
sempre fortalecendo o que há de melhor em mim;
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (PPgCB) da UFRN
pelo suporte oferecido durante a realização do mestrado;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa de mestrado;
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Rio Grande do Norte (FAPERN), pelo
financiamento deste projeto;
À UFRN e aos professores do PPgCB, Eliza Freire, Gilberto Corso, Hugo
Rocha, Jomar Jardim, Josélio Araújo, José Veríssimo Fernandes, Maria Celeste
de melo, Renato Motta, Umberto Fulco e Vanessa Rachetti.
À secretária do PPgCB, Louise da Mata, pelo suporte oferecido ao longo
desse período;
À professora Vânia Sousa Andrade, pelo acolhimento, ensinamentos,
conselhos e confiança depositados em mim ao longo desses quatro anos de
parceria em pesquisa, minha “mãe científica”;
Ao professor José Veríssimo Fernandes, pela orientação neste mestrado,
estando à disposição para ajudar sempre que necessário e pelas contribuições
durante a correção da dissertação;
Às professoras Manuela Carvalho e Vanessa Rachetti, por terem aceitado o
convite como membros da banca de minha qualificação e pelas correções
apontadas;
Às professoras Natália Saraiva e Vanessa Rachetti, por aceitarem compor
minha banca de defesa e pelas sugestões propostas para a melhoria do
trabalho;
A todos os “colegas-amigos” do Laboratório de Micologia Médica e
Ambiental (LAMEA), Raíza Guerra, Luíza Xavier, Élita Morais, Diego Rebouças,
Leandro Dantas, Jéssica Campos e Nayara Martins, pela amizade, bons
momentos e por me ajudarem em todas as etapas da execução dos ensaios aqui
apresentados, além de tornarem meu mestrado mais extrovertido e animado.
À professora Renata Mendonça, pela supervisão e auxílio nas etapas de
obtenção dos extratos e a todos os componentes do LISCO (Laboratório de
Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos), Anne Natália, Deusielly Avelar,
Gizely Cavalcante, Jéssica Santana, Marcela Pontes, Nara Frutuoso, Rusceli
Diego, Sheeza Duarte, Taiannie Soriano e Vanessa Araújo pela ajuda durante
o processo de extração;
Ao professor Kleber Farias pela colaboração nesse projeto ao realizar o
teste de citotoxicidade;
A
todos
os
funcionários
do
Departamento
de
Microbiologia
e
Parasitologia da UFRN;
Aos colegas de mestrado, Alessandra, Aline, Daniel, Diego, Jaqueline,
João Gabriel, José Hilário, Larissa, Marana, Marcos, Marília, Michael, Miguel,
Raliny, Sara e Thiago, pelos bons momentos.
A Hélio dos Anjos, pela ajuda na coleta do material vegetal;
Aos membros da Coleção de Cultura de Campylobacter da FIOCRUZ, Sheila
Duque, Ana Luzia Filgueiras, Wagner Esteves, Gabriella Carneiro e Jacqueline
Thomé, pelo treinamento realizado;
Aos meus pais, Edjane e Jacó (In memoriam), pela educação recebida,
pela construção do meu caráter e pelo apoio incondicional em todas as etapas
da minha vida;
Ao meu companheiro, Ruy Lima, por todo suporte, amor e compreensão ao
longo dessa etapa;
A todos que colaboraram, direta ou indiretamente,
com este trabalho, minha sincera gratidão!
RESUMO
A Helicobacter pylori é uma bactéria espiralada, Gram negativa, móvel e
microaeróbia reconhecida como uma das principais causas de gastrite, úlcera, câncer
gástrico e do linfoma de células B de baixo grau de tecido linfoide associado à mucosa
(MALT), se constituindo um microrganismo em destaque na área da microbiologia
médica. Sua importância se deve à dificuldade de tratamento, devido à necessidade do
uso concomitante de vários medicamentos além do crescente surgimento de cepas
resistentes e multirresistentes aos antibióticos empregados na clínica. Com o intuito de
ampliar a gama de opções terapêuticas eficazes e seguras, ultimamente, vem sendo
intensificados estudos químicos sobre plantas medicinais, seja através da obtenção de
extratos, frações, compostos isolados ou óleos essenciais que apresentem algum tipo
de atividade biológica. Diante do exposto, objetivou­se avaliar a atividade inibitória de
extratos vegetais oriundos do Syzygium cumini e Encholirium spectabile, plantas com
histórico de ação antiúlceras, e do óleo essencial obtido do S. cumini frente a H. pylori
(ATCC 43504) utilizando a técnica de difusão em disco, para avaliação qualitativa, e a
determinação da concentração inibitória mínima (CIM), através da técnica de
microdiluição em caldo, para análise quantitativa. Também foi avaliada a toxicidade in
vitro dos extratos a partir de ensaio hemolítico, utilizando eritrócitos de carneiro, e em
cultura de células HeLa e VERO, pelo ensaio colorimétrico de viabilidade celular
utilizando o MTT. Os extratos de ambos vegetais empregados nos ensaios
antimicrobianos não inibiram o crescimento bacteriano, em contrapartida o óleo
essencial do S. cumini (SCFO) mostrou­se eficaz, exibindo CIM de 205 μg/mL (diluição
equivalente a 0,024% do óleo bruto). Quanto ao ensaio hemolítico, o mesmo óleo ainda
exibiu toxicidade intermediária ao promover 25% de hemólise a 1000 μg/mL. Em relação
à citotoxicidade em cultura de células, o SCFO, a 260 μg/mL, comprometeu a viabilidade
celular de cerca de 80% das células HeLa e 50% das células VERO. Portanto o óleo
obtido das folhas do S. cumini apresenta potencial antibacteriano frente a H. pylori e
potencial citotóxico, sugerindo­se uma fonte de novas moléculas candidatas a fármacos,
desde que novas etapas de toxicidade in vitro e in vivo assim como caracterização
química sejam avaliadas. Além disso, o desenvolvimento de um sistema de liberação de
fármacos pode resultar em um protótipo a ser utilizado em testes pré­clínicos.
Palavras­chave: Atividade antimicrobiana. Citotoxicidade in vitro. Encholirium
spectabile. Helicobacter pylori. Óleo essencial. Syzygium cumini.
ABSTRACT
Helicobacter pylori is a spiral, Gram negative, mobile, and microaerophilic
bacteria recognized as a major cause of gastritis, ulcer, gastric cancer, and gastric low­
grade, B­cell, mucosa–associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma, constituting an
important microorganism in medical microbiology. Its importance comes from the
difficulty of treatment because the requirement of multiple drugs use, besides the
increasing emergence of resistant and multiresistant strains to antibiotics used in the
clinic. In order to expand safe and effective therapeutic options, chemical studies on
medicinal plants by obtaining extracts, fractions, isolated compounds or essential oils
with some biological activity has been intensified. Given the above, the objective was to
evaluate the inhibitory activity of organic extracts derived from Syzygium cumini and
Encholirium spectabile, with antiulcer history, and the essential oil, obtained from S.
cumini, against H. pylori (ATCC 43504) by the disk diffusion method, for qualitative
evaluation, and determination of minimum inhibitory concentration (MIC) using the broth
microdilution method, for quantitative analysis. Also was evaluated the extracts in vitro
toxicity by a hemolytic assay using sheep red blood cells, and VERO and HeLa cells
using the MTT assay to analyze cell viability. The extracts of both plant used in
antimicrobial assays did not inhibit bacterial growth, however the essential oil of S.
cumini (SCFO) proved effective, showing MIC value of 205 μg/mL (0.024 % dilution of
the original oil). In the hemolytic assay, the same oil shows moderate toxicity, by promote
25% hemolysis at 1000 μg/mL. Regarding the cytotoxicity in cell culture, the SCFO, at
260 μg/mL, affected the cell viability around 80% of HeLa and 50% of VERO cells. So
the oil obtained from S. cumini leaves has antimicrobial activity against H. pylori and
cytotoxicity potential, suggesting a source of new molecule drug candidates, since new
stages of toxicity in vitro and in vivo, as well, chemical characterization be evaluated.
Moreover, the development of a prospective drug delivery system can result in a
prototype to be used in preclinical tests.
Keywords:
Antimicrobial
activity.
Encholirium
Helicobacter pylori. in vitro cytotoxicity. Syzygium cumini.
spectabile.
Essential
oil.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 11
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 12
LISTA DE SIGLAS .................................................................................................... 13
1. REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................. 15
1.1.
Helicobacter pylori ..................................................................................... 15
1.1.1.
BREVE HISTÓRICO.............................................................................. 15
1.1.2.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E FISIOLÓGICAS ................. 16
1.1.3.
PATOGÊNESE ...................................................................................... 17
1.1.4.
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS ........................................................ 19
1.1.5.
DESENVOLVIMENTO DE DOENÇAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO ... 21
1.1.6.
DIAGNÓSTICO DE ROTINA E LABORATORIAL ................................. 24
1.1.7.
TRATAMENTO E RESISTÊNCIA .......................................................... 25
1.1.8.
EFEITOS COLATERAIS E REFRATARIEDADE ................................... 28
1.2.
Terapêutica alternativa .............................................................................. 29
1.2.1.
PRODUTOS DE ORIGEM NATURAL ................................................... 29
1.2.2.
PLANTAS MEDICINAIS ........................................................................ 31
1.2.3.
ÓLEOS ESSENCIAIS ............................................................................ 33
1.3.
Syzygium cumini ........................................................................................ 34
1.3.1. ASPECTOS FARMACOBOTÂNICOS ...................................................... 34
1.4.
Encholirium spectabile .............................................................................. 36
1.4.1. ASPECTOS FARMACOBOTÂNICOS ...................................................... 36
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 38
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 39
3.1.
Objetivo geral ............................................................................................. 39
3.2.
Objetivos específicos ................................................................................ 39
4. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 40
4.1.
Material vegetal .......................................................................................... 40
4.1.1.
Syzygium cumini .................................................................................... 40
4.1.1.1.
Obtenção dos extratos orgânicos por maceração estática ............. 40
4.1.1.2.
Partição do extrato etanólico ........................................................... 41
4.1.1.3.
Obtenção do óleo essencial ............................................................ 41
4.1.1.4.
Obtenção do extrato aquoso por decocção .................................... 41
4.1.2.
4.2.
Encholirium spectabile ........................................................................... 42
4.1.2.1.
Obtenção dos extratos orgânicos por maceração estática ............. 42
4.1.2.2.
Obtenção dos extratos orgânicos em Soxhlet ................................. 42
Microrganismo e meio de cultura ............................................................. 43
4.2.1.
TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO.......................................................... 43
4.2.2.
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)..................................... 45
4.3.
Ensaio hemolítico....................................................................................... 47
4.4.
Citotoxicidade em cultura de células ....................................................... 48
5. RESULTADOS ................................................................................................... 50
5.1.
Rendimento dos extratos e óleo essencial .............................................. 50
5.2.
Avaliação anti-Helicobacter pylori dos extratos e óleo essencial ......... 50
5.3.
Atividade hemolítica do óleo essencial do S. cumini ............................. 53
5.4.
Atividade citotóxica in vitro do óleo essencial do S. cumini ................. 54
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 56
7. CONCLUSÕES .................................................................................................. 66
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 67
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Micrografia eletrônica de varredura da bactéria H. pylori (laranja) no
epitélio gástrico, aumento de 5000x (Fonte: Steve Gschmeissner ­ Science Photo
Library). ..................................................................................................................... 16
Figura 2. Formação da úlcera gástrica a partir da infecção pela H. pylori. Passagem
pela camada de muco, destruição das células epiteliais, migração leucocitária e
desenvolvimento de úlcera (Fonte: Somerville, Custom Medical Stock – Science
Photo Library). ........................................................................................................... 22
Figura 3. Endoscopia evidenciando: a) parede inflamada do estômago devido a
gastrite causada pela H. pylori e b) úlcera gástrica sangrando e adenocarcinoma (ao
centro), amostra positiva para H. pylori (Fonte: GASTROLAB / Science Photo
Library). ..................................................................................................................... 23
Figura 4. Elementos básicos do metabolismo primário em relação ao metabolismo
secundário de plantas (Fonte: Adaptado de García; Carril, 2009). ........................... 30
Figura 5. Syzygium cumini. a) Exemplar localizado no campus central da UFRN; b)
Folhas, flores e frutos imaturos e maduros; c) Flores e d) Fruto maduro (Fonte:
Arquivo próprio). ........................................................................................................ 35
Figura 6. Encholirium spectabile. a) Exemplar localizado em área rural no município
de São José do Seridó/RN; b) Folha; c) Inflorescência seca (Fonte: Arquivo próprio.
.................................................................................................................................. 36
Figura 7. Representação da distribuição das diluições, em porcentagem, realizadas
na microdiluição em caldo em placa de 96 poços. .................................................... 46
Figura 8. Redução do cloreto de 2,3,5­trifeniltetrazólio ao formazam (Adaptado de
Opwis et al., 2012). ................................................................................................... 46
Figura 9. Representação da distribuição das concentrações, em μg/mL, na
microdiluição em caldo para o óleo essencial do S. cumini. ..................................... 47
Figura 10. Halo inibitório do SCFO, a 25, 50 e 100%, frente o crescimento da H.
pylori. ......................................................................................................................... 52
Figura 11. CIM do SCFO (delimitado pelo retângulo vermelho) frente o crescimento
da H. pylori pela técnica de microdiluição em caldo. ................................................. 53
Figura 12. Percentual de hemólise induzida por diferentes concentrações do óleo
essencial extraído das folhas do S. cumini (SCFO). ................................................. 54
Figura 13. Percentual de viabilidade de células HeLa tratadas com diferentes
concentrações do SCFO. .......................................................................................... 55
Figura 14. Percentual de viabilidade de células VERO tratadas com diferentes
concentrações do SCFO. .......................................................................................... 55
Figura 15. Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos
secundários em plantas (Fonte: Gobbo­Neto e Lopes, 2007). .................................. 58
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Prováveis mecanismos antimicrobianos dos principais grupos químicos
orgânicos extraídos de vegetais. ............................................................................... 33
Tabela 2. Concentração, em mg/mL, dos extratos das folhas do S. cumini nos discos
utilizados no teste de difusão em disco e seus respectivos solventes. ..................... 44
Tabela 3. Concentração, em mg/mL, dos extratos das folhas da E. spectabile nos
discos utilizados no teste de difusão em disco e seus respectivos solventes. .......... 45
Tabela 4. Rendimento dos extratos do S. cumini e E. spectabile. ............................ 51
Tabela 5. Média dos halos de inibição (mm) do crescimento da H. pylori frente os
extratos vegetais do E. spectabile. ............................................................................ 51
Tabela 6. Média dos halos de inibição (mm) do crescimento da H. pylori frente os
extratos orgânicos e óleo essencial do S. cumini pelo teste de difusão em disco e
CIM. ........................................................................................................................... 52
Tabela 7. Avaliação da toxicidade (%) do óleo essencial obtido do S. cumini pelo
teste de hemólise. ..................................................................................................... 54
Tabela 8. Viabilidade (%) de células HeLa e VERO tratadas com diferentes
concentrações do SCFO. .......................................................................................... 55
13
LISTA DE SIGLAS
ATCC
American Type Culture Collection
BHI
Brain heart infusion, caldo de infusão de coração e cérebro
CC
Controle crescimento
CIM
Concentração inibitória mínima
CLSI
Clinical and Laboratory Standart Institute
CN
Controle negativo
CP
Controle positivo
CTT
Cloreto de 2,3,5­trifeniltetrazólio
DMSO
Dimetilsulfóxido
ESFCq
Encholirium spectabile folhas clorofórmio extração a quente
ESFE/Af
Encholirium spectabile folhas 50% etanol/ 50% água extração a frio
ESFEf
Encholirium spectabile folhas etanol extração a frio
ESFHf
Encholirium spectabile folhas hexano extração a frio
ESFHq
Encholirium spectabile folhas hexano extração a quente
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
IL­1
Interleucina­1
IL­8
Interleucina­8
INCQS
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
MALT
Mucosa-associated lymphoid tissue
MTT
Brometo de 3­(4,5­dimetiltiazol­2­il)­2,5­difenil tetrazólio
NA
Não avaliado
PBP
Penicillin-binding proteins, proteínas ligantes de penicilinas
PBS
Phosphate buffered saline, tampão fosfato salino
SCFAq
Syzygium cumini folhas aquoso quente
SCFE/AE
Syzygium cumini folhas etanol fração acetato de etila
SCFE/AQ
Syzygium cumini folhas etanol fração aquosa
SCFE/C
Syzygium cumini folhas etanol fração clorofórmica
SCFE/H
Syzygium cumini folhas etanol fração hexânica
SCFE
Syzygium cumini folhas etanol
SCFH/E
Syzygium cumini folhas hexano aproveitadas com etanol
SCFH
Syzygium cumini folhas hexano
14
SCFO
Syzygium cumini folhas óleo essencial
TD1
Solução aquosa de Tween 80 a 1% e DMSO a 1%
TNF­α
Fator de necrose tumoral alfa
TSA
Trypticase soy agar, agar triptona de soja
TSB
Trypticase soy broth, caldo triptona de soja
15
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
1. REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.
Helicobacter pylori
1.1.1. BREVE HISTÓRICO
Relatos da ocorrência de uma bactéria na mucosa estomacal datam desde
1893, quando Bizzozero observou a presença de espiroquetas nas células parietais
e glândulas gástricas de cachorros (DOENGES, 1938). Desde então, outros
trabalhos relacionaram lesões gástricas com a presença de uma bactéria espiralada,
até que em 1983, Warren e Marshall, pesquisadores australianos posteriormente
ganhadores de Nobel de Medicina em 2005 (WEYDEN et al., 2005), reuniram 135
espécimes de biópsias gástricas com presença de bacilos curvos em formato de “S”.
Marshall ainda observou que cerca de metade dos pacientes que realizaram os
procedimentos de gastroscopia ou biópsia mostraram colonização bacteriana no
estômago. Em novo trabalho, publicado em 1984, Marshall e Warren realizaram
biópsia gástrica de pacientes que ao exame endoscópico e histopatológico
apresentavam lesões ulcerativas, e conseguiram finalmente cultivar in vitro a
bactéria inicialmente denominada Campylobacter pyloridis (MARSHALL; WARREN,
1984).
A bactéria foi descrita como bacilos curvos ou espiralados, Gram negativos,
com presença de flagelos unipolares, produtores das enzimas catalase, urease,
produtores de sulfeto e microaerófilos (MARSHALL; WARREN, 1984).
Após análises morfológicas ultraestruturais da bactéria, ficou evidenciado que
a membrana da parede celular é regular, apresenta múltiplos flagelos, revestidos
com bainha, os quais são dispostos em uma única extremidade, apresentam bulbo
flagelar e quando agitados em caldo in vitro apresentam glicocálix em abundância.
Todas as características citadas não correspondem àquelas ocorrentes no gênero
Campylobacter. Além disso, a análise dos ácidos graxos, menaquinonas,
características de crescimento in vitro, capacidade enzimática e sequenciamento do
ácido ribonucleico da Campylobacter pylori levaram a uma nova proposta de gênero,
Helicobacter, passando a ser nomeada de Helicobacter pylori (GOODWIN et al.,
1989).
16
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
1.1.2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E FISIOLÓGICAS
A H. pylori apresenta­se como uma bactéria complexa devido às condições
adversas que encontra para colonizar o hospedeiro. É descrita como uma
espiroqueta ou bacilo curvo, Gram negativa (figura 1), que não oxida ou fermenta
açúcares, sendo considerada microaeróbia (10% CO2, 5% O2, 85% N2), móvel, não
esporulada e mesófila. Ainda reage positivamente aos testes de urease, catalase e
peroxidase e é produtora de enzimas como mucinase, lipase e arginase. A bactéria
mede em torno de 0,1 a 0,5 μm de largura e 3 μm de comprimento, apresentando
superfície lisa e extremidades arredondadas, com presença de vários flagelos
unipolares. Ainda pode possuir sistema de secreção tipo IV pelo qual injeta, no
citoplasma da célula hospedeira, duas proteínas principais, uma proteína
vacuolizante e uma citotoxina, que atuam no processo infeccioso (KONEMAN et al.,
2012).
Figura 1. Micrografia eletrônica de varredura da bactéria H. pylori (laranja) no epitélio
gástrico, aumento de 5000x (Fonte: Steve Gschmeissner ­ Science Photo Library).
Coloniza a mucosa gástrica normalmente e, em alguns casos, pode ser
isolada de área de metaplasia gástrica no duodeno, importante fator na patogênese
da úlcera péptica duodenal. Já a ocorrência em área de metaplasia intestinal é rara
(LADEIRA et al., 2003).
17
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
1.1.3. PATOGÊNESE
Para sobreviver ao ambiente gástrico e romper a barreira protetora da
camada de muco, a H. pylori deve ser capaz de inibir a acidez do suco gástrico, ser
móvel, produzir enzimas que ajudem na degradação da camada de muco e aderir à
superfície epitelial. Quando a bactéria é capaz de executar essas etapas é iniciado o
processo inflamatório local, que somado às lesões celulares culmina no
desenvolvimento da gastrite, podendo gerar úlceras ou até o câncer gástrico.
Após ser adquirida através da via oral, a H. pylori chega ao estômago e
rapidamente inicia a produção da urease. A urease é uma enzima com peso
molecular entre 500 e 600 KDa que age catalisando a hidrólise da ureia gerando
amônia e dióxido de carbono [(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3] sendo essencial para
o processo inicial de colonização (EATON et al., 1991; WEEKS et al., 2000). A
amônia, quando secretada, interage com os prótons liberados pelas células parietais
presentes nas glândulas gástricas ocasionando, consequentemente, o aumento do
pH nas áreas próximas à membrana externa da bactéria. A maior parte da urease
produzida fica no citoplasma bacteriano ou no espaço periplasmático, enquanto que
pequena quantidade é lançada no espaço extracelular. Desse modo, a ureia deve
entrar na célula para que a enzima possa atuar com maior eficiência (PHADNIS et
al., 1996).
Para controlar a entrada e saída da ureia do citoplasma bacteriano, é
codificada, a partir do gene ureI, uma proteína transmembranar (proteína UreI)
sensível à alterações de pH. À medida que a bactéria encontra­se exposta a menor
pH, ocorre maior expressão do gene ureI, com consequente aumento na
permeabilidade à ureia. Logo, a ureia, proveniente dos alimentos em processo de
digestão, é importada para o citoplasma bacteriano onde serve de substrato para a
enzima ali presente. Do mesmo modo, à medida que o pH aumenta, é diminuída a
expressão desse gene com consequente redução da permeabilidade à ureia,
prevenindo acúmulo tóxico de ureia no citoplasma bacteriano, evitando assim a
alcalinização do ambiente intracelular. À medida que se aproxima da camada de
muco, a produção de urease é reduzida para evitar gasto energético, visto que o pH
nesta região é próximo do neutro, condizente com a necessidade bacteriana
(WEEKS et al., 2000).
18
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Quando chega à camada de muco, os flagelos assumem um importante papel
na colonização, que consiste em promover a motilidade da célula bacteriana para
que haja a passagem por essa camada composta por água, eletrólitos e
glicoproteínas (EATON et al., 1992; OTTEMANN; LOWENTHAL, 2002). O formato
helicoidal da célula juntamente com a polarização dos flagelos provê à bactéria
movimentos circulares em torno do próprio eixo, permitindo­a penetrar na camada
de muco. Adicionalmente, mucinases e lipases são secretadas promovendo a
degradação dos componentes do muco facilitando o acesso à camada epitelial
(YOSHIYAMA; NAKAZAWA, 2000; LADEIRA et al., 2003).
Outra importante barreira encontrada pela H. pylori é a camada epitelial, na
qual deve se fixar para poder colonizar o ambiente gástrico. A adesão à superfície
estomacal ocorre através da interação entre lectinas da membrana bacteriana e
oligossacarídeos das glicoproteínas de membrana das células epiteliais gástricas.
Particularmente duas proteínas, a BabA e SabA, destacam­se com ação de adesina
(BALDWIN et al., 2007).
A ligação da H. pylori na superfície das células epiteliais gástricas (CEG) é
caracterizada pela perda das microvilosidades, formação do suporte de ligação entre
as células, rearranjo dos filamentos de actina do citoesqueleto e fosforilação de
proteínas hospedeiras no local da adesão alterando a superfície do epitélio de
revestimento gástrico (SEGAL et al., 1996).
Algumas cepas de H. pylori (cag+ ou tipo I) apresentam uma ilha de
patogenicidade, denominada cag­PAI, que contém como marcador o gene cagA
(citotoxin associated gene A). Essa ilha apresenta alguns genes homólogos aos do
sistema de secreção tipo IV, sendo esses genes codificadores de proteínas
específicas que formam uma estrutura tubular que interage com a membrana da
célula hospedeira, formando uma estrutura similar a um pili. Logo, a H. pylori cag+ é
capaz de secretar proteínas efetoras no citoplasma da célula hospedeira, desde que
possua um receptor específico na superfície desta. Dentre as substâncias que a
bactéria secreta por esse canal, destacam­se as proteínas CagA e VacA que são
importantes fatores de virulência da bactéria (ODENBREIT et al., 2000; BOURZAC;
GUILLEMIN, 2005).
19
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
Durante a ativação de genes bacterianos no processo de infecção crônica,
pode ser codificada a proteína efetora CagA, citotoxina associada à antígeno, que
atua no citoplasma da célula hospedeira. Esta proteína está principalmente
relacionada à ativação das vias de proliferação celular e inibição das vias que
promovem a apoptose da célula infectada (OLBERMANN et al., 2010).
Outra
proteína
secretada
pela
bactéria
é
a
VacA.
Também
atua
intracelularmente sendo transportada pelo sistema de secreção citado acima. Esta
toxina, expressa em todas as cepas de H. pylori, é uma formadora de poros que
pode causar várias alterações nas células epiteliais. Entre suas ações, destacam­se
a vacuolização celular, a despolarização do potencial de membrana, alteração na
permeabilidade da membrana mitocondrial, apoptose, ativação de proteínas
quinases ativadoras de mitógenos, inibição da apresentação de antígenos
(GANGWER et al., 2010). Além disso, ainda inibe a ativação e proliferação de
células T induzindo imunossupressão local (GEBERT et al., 2003).
Tem sido relatada uma regulação complexa entre as proteínas CagA e VacA
a qual permite que haja redução na inflamação da mucosa com consequente
diminuição de danos nas células gástricas epiteliais, facilitando o processo de
colonização crônica no estômago pela bactéria (GANGWER et al., 2010).
1.1.4. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
Distribuída mundialmente, a infecção pela H. pylori mantem índices variantes
de acordo com os países ou com as populações de um mesmo país. Estima­se que
cerca de metade da população mundial seja portadora da bactéria, tornando­a um
agente etiológico de importância pública, em virtude dos índices significantes de
morbidade e mortalidade (AGUILAR et al., 2001). No Brasil, é estimado que 70%
da população seja portadora da bactéria (INCA, 2014). Zhang et al. (2011) sugerem
que dos 50% de portadores da bactéria estimados mundialmente, 10% irão
desenvolver úlceras pépticas e 1% serão acometidos por doenças gástricas
malignas.
A prevalência da infecção está associada às condições socioeconômicas,
sendo maior em países em desenvolvimento e com condições sanitárias restritas
(WHO, 1999). A maior taxa de casos concentra­se em adultos, entretanto crianças a
20
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
partir de dois anos já foram identificadas como estando colonizadas pela bactéria
(SUERBAUM; MICHETTI, 2002). Já chegou a ser detectada, por métodos de
diagnósticos não invasivos, a ocorrência de infecção em 84% de crianças com 30
meses de idade em uma região do Gambia, na África ocidental (THOMAS et al.,
1999).
No Brasil, alguns índices de infecção por H. pylori, em pacientes adultos
sintomáticos, foram relatados como 90,72% em Belém/PA (VINAGRE et al., 2013);
43,61% em Marília/SP (SUZUKI et al., 2013); 9,68% em São Paulo/SP (MARQUES
et al., 2011), 78,9% em Monte Negro/RO (RIBEIRO et al., 2010). Deve­se ressaltar
que esses números podem não representar a real prevalência no país, tendo em
vista que o Brasil apresenta grande extensão territorial com diferentes climas, além
de que esse microrganismo não está entre os agentes infecciosos de notificação
compulsória do sistema de saúde nacional.
Em relação ao câncer gástrico, a ocorrência de tumores no Brasil está em
terceiro lugar na incidência entre homens e em quinto entre as mulheres, sendo a
prevalência dos casos em homens, por volta dos 70 anos. A estimativa de novos
casos é de 20.390 para 2014, tendo ocorrido 13.328 casos de morte em 2011 por
essa neoplasia. O câncer gástrico é de causalidade multifatorial, logo esses dados
não refletem a incidência da infecção pela bactéria, mas servem como suporte para
estimativas (INCA, 2014).
Os modos de aquisição da bactéria mais aceitos são através da ingestão de
água ou alimentos contaminados ou pessoa­pessoa, pelas vias oral­oral, fecal­oral
ou gástrica­oral. A aquisição da bactéria está intimamente relacionada à transmissão
na infância por contato com familiares portadores (MENDALL; NORTHFIELD, 1995;
WEYERMANN et al., 2006). Apesar de também infectar alguns primatas não­
humanos e outros animais, ainda não se sabe de transmissão de animais para
humanos (STONE, 1999; SUERBAUM; MICHETTI, 2002). Além disso, também há
risco de transmissão iatrogênica da bactéria, sendo a endoscopia o meio mais
comum, isto quando o equipamento não recebe o procedimento correto de
higienização e esterilização (LANGENBERG et al., 1990; TYTGAT, 1995).
21
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
1.1.5. DESENVOLVIMENTO DE DOENÇAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO
A infecção aguda é normalmente assintomática podendo ser associada a dor
epigástrica, distensão abdominal ou inchaço, arrotos, náuseas, flatulências e
halitose (MEURER; BOWER, 2002).
Após o estabelecimento da H. pylori na camada epitelial, são iniciadas
respostas inflamatórias do hospedeiro que, unidas à acidez do suco gástrico e à
amônia produzida pela bactéria, levam ao dano tecidual e consequente ocorrência
das síndromes clínicas (DIOGO FILHO, 2009).
Quando a infecção é associada ao processo inflamatório, à virulência da
bactéria e a fatores do hospedeiro, como, por exemplo, imunodeficiência, doenças
pré­existentes e ingestão de bebidas alcoólicas, pode resultar nos quadros clínicos
clássicos de gastrite, úlceras gástricas e duodenais, câncer gástrico e ao linfoma de
células B de baixo grau de tecido linfoide associado à mucosa – MALT (AGUILAR et
al., 2001).
Quanto à reação imunológica, tem­se inicialmente a resposta de fase aguda
na qual a bactéria libera quimiotaxinas que estimulam a liberação de interleucina­8
(IL­8) pelas células epiteliais. A IL­8 atua como fator pró­inflamatório ativando os
polimorfonucleares locais. Há também a liberação de interleucina­1 (IL­1) e do fator
de necrose tumoral alfa (TNF­α), estes agem estimulando a produção de enzimas
proteolíticas e produção de espécies reativas de oxigênio pelos polimorfonucleares
(CRABTREE, 1996). Quando essa resposta é eficaz, não há comprometimento à
integridade do órgão e o agente causal é destruído. Entretanto, como a H. pylori
consegue escapar do processo de fagocitose, devido à presença de superóxido
dismutase (GÖTZ et al., 1996), catalase (HAZELL et al., 1991) e arginase (GOBERT
et al., 2001), o único dano gerado é frente o epitélio que fica susceptível à rupturas.
Esta lesão leva à síndrome clínica de gastrite aguda que apresenta duração de
aproximadamente duas semanas (SOBALA et al., 1991).
No caso da inflamação crônica, que é caracterizada pela gastrite de longa
duração ou gastrite crônica, ocorre a infiltração de monócitos e linfócitos no tecido
gástrico lesionado, culminando na resposta de produção de anticorpos. No caso do
22
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
estabelecimento da doença, os anticorpos não conseguem agir adequadamente na
neutralização da bactéria, havendo persistência do agente. Assim ocorre processo
semelhante ao referido na reação inflamatória aguda, conduzindo ao quadro de
gastrite crônica. Na presença de fatores de risco, como má alimentação, ingestão de
bebidas alcoólicas, tabagismo, condições de imunossupressão, entre outros, além
de fatores de virulência bacterianos, pode haver evolução para quadros mais graves
(BODGER; CRABTREE, 1998; DIOGO FILHO, 2009).
Quando há interação da ação do ácido clorídrico, enzimas da digestão
gástrica e da resposta imunológica local, o dano é mais intenso e severo, surgindo
as úlceras pépticas. Nessa síndrome, ocorrem danos celulares pela liberação de
mediadores resultantes do processo inflamatório, além da exposição do epitélio,
fragilizado, à acidez do suco gástrico e à pepsina. Como a camada tecidual não
consegue ser reposta, ocorrem erosões na mucosa gástrica (figura 2) que com o
tempo e exposição ao agente tornam­se profundas, causando grande desconforto
aos pacientes (LEUNG et al., 1992; DIOGO FILHO, 2009).
Figura 2. Formação da úlcera gástrica a partir da infecção pela H. pylori. Passagem pela
camada de muco, destruição das células epiteliais, migração leucocitária e desenvolvimento
de úlcera (Fonte: Somerville, Custom Medical Stock – Science Photo Library).
A persistência no processo inflamatório na mucosa gástrica induz danos
oxidativos que, juntamente à produção excessiva de metabólitos reativos de
23
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
oxigênio à presença da bactéria, resultam na lesão tecidual e podem ser uma das
causas do câncer gástrico (DAVIES et al., 1994).
De modo geral, o desenvolvimento do câncer (figura 3) em presença da
bactéria evolui a partir da mucosa normal, que após infectada entra em processo de
gastrite crônica até a atrófica, seguida de displasia e neoplasia (LADEIRA et al.,
2003).
a)
b)
Figura 3. Endoscopia evidenciando: a) parede inflamada do estômago devido à gastrite
causada pela H. pylori e b) úlcera gástrica sangrando e adenocarcinoma (ao centro),
amostra positiva para H. pylori (Fonte: GASTROLAB / Science Photo Library).
Durante a resposta inflamatória crônica, ocorre a produção de espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio pelas células de defesa em resposta às citocinas
liberadas e a produtos bacterianos. Os reativos de oxigênio podem induzir alteração
da expressão de proto­oncogenes ou gerar produtos genotóxicos capazes de
interagir com alvos moleculares no DNA. De modo geral há comprometimento no
sistema de reparo. Os reativos do nitrogênio podem induzir danos no DNA direta ou
indiretamente, seja inibindo as enzimas do sistema de reparo ou inativando o
processo de apoptose pela nitrosilação de proteínas pró­apoptóticas, tais como p53
e caspases, permitindo, desta forma, a sobrevivência de células com danos no DNA,
tornando­as potenciais células neoplásicas (IARC, 2014).
Nem todos os casos de câncer de estômago ocorrem em virtude da infecção
pela H. pylori, entretanto, deve­se atentar que este microrganismo é uma das
24
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
principais causas desse processo patogênico. Logo, devido a seu destaque
enquanto doença, os esforços, para combater e evitar a disseminação desse
microrganismo, devem ser ampliados.
A H. pylori ainda aparece associada à outra complicação clínica: o linfoma
MALT (Mucosa-associated lymphoid tissue) de células B que é um tipo de neoplasia
de tecido linfoide associado à mucosa constituída por células pequenas e com baixo
grau de malignidade. O linfoma MALT de células B de baixo grau no estômago tem
como principal fator patogênico a infecção pela H. pylori. Tal relação tem sido
proposta visto que a remissão dos casos de linfoma chega a 70% em pacientes
portadores da bactéria e quando há o tratamento antibacteriano em estágio inicial da
neoplasia (ZULLO, 2010). Entre as neoplasias gástricas, esta é diagnosticada em
torno de 3% dos casos (INCA, 2014).
Baseado nisso é importante diagnosticar a infecção bacteriana e realizar o
tratamento
imediato
para
evitar
complicações
clínicas
relacionadas
à
poliquimioterapia, que normalmente é longa, onerosa e de baixa eficácia.
1.1.6. DIAGNÓSTICO DE ROTINA E LABORATORIAL
De modo geral, o diagnóstico da rotina para a infecção de gastrite pela H.
pylori é mais fidedigno e considerado “padrão ouro” quando é realizada a coloração
histológica e a cultura microbiológica a partir de biópsia gástrica (THIJS et al., 1996;
CARR et al., 2012).
Para o isolamento laboratorial, a amostra clínica deve ser semeada em ágar
sangue não­seletivo com base de triptona de soja, infusão de cérebro e coração
(BHI) ou Columbia com adição de 5% de sangue de carneiro desfibrinado e estéril.
O cultivo deve ser mantido em ambiente de microaerofilia (5% de O2, 10% de CO2 e
85% de N2), a 37ºC e pode demorar entre 2 e 5 dias para ser notado crescimento de
colônias. O crescimento é caracterizado por pequenas colônias acinzentadas e
translúcidas. Quanto à coloração pela técnica de Gram, são observados bacilos
curvos e espiralados Gram negativos. As provas bioquímicas da catalase, oxidase e
urease são positivas, sendo esta última de reação intensa (KONEMAN et al., 2012).
25
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
Na identificação histológica a especificidade e a sensibilidade são altas, já
que, além da identificação da bactéria ainda é possível avaliar o tipo e a intensidade
da inflamação da mucosa gástrica. O tecido obtido na biópsia pode ser submetido a
diferentes técnicas de coloração para que várias informações sejam coletadas.
Entretanto, é necessário um profissional bem capacitado além de uma coleta de
material correta para evitar erros que venham a prejudicar o diagnóstico (SIQUEIRA
et al., 2007).
Há também o diagnóstico não invasivo que é um modo indireto de detecção
da bactéria. Este tem ganhado adesão como método de detecção da infecção por H.
pylori devido à praticidade, rapidez do resultado, sensibilidade e especificidade
elevada e menor desconforto para o paciente. O mais específico e sensível utilizado
é o teste respiratório da ureia marcada, no qual o paciente ingere ureia marcada
com
13
C e se houver a enzima urease no estômago, correlacionando à presença da
H. pylori, ocorre a conversão da ureia em amônia e gás carbônico marcado que ao
ser expirado é detectado em um equipamento (GRAHAM et al., 1987). Seguindo o
mesmo princípio tem­se o teste de urina com ureia marcada, no qual o paciente
ingere ureia marcada com
15
N e este é detectado na urina caso haja presença da
bactéria no paciente. Outro método utilizado é a detecção de um antígeno da H.
pylori (HpSA) em amostras de fezes a partir de um imunoensaio enzimático, o qual
apresenta boa sensibilidade (90%) e especificidade (98%), sendo útil para
acompanhar a erradicação da bactéria após tratamento (ISHIHARA et al., 2000). Há
também as provas sorológicas para a detecção de anticorpos contra a bactéria, mas
esta última técnica apresenta alguns problemas de padronização de níveis basais de
positividade, visto que um paciente curado da infecção continua a produzir
anticorpos (KONEMAN et al., 2012).
1.1.7. TRATAMENTO E RESISTÊNCIA
Uma das principais problemáticas do tratamento da H. pylori vem da
dificuldade da determinação da concentração de antibiótico ativo na mucosa
gástrica. Há uma íntima relação entre a cinética do fármaco e a influência da
variação do pH local. De modo geral, os principais antibióticos utilizados para tratar a
infecção gástrica (amoxicilina, metronidazol e claritromicina) sofrem alteração em
seu tempo de meia vida de acordo com a diminuição ou aumento do pH, que varia
26
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
ao longo de 24 horas (ERAH, et al., 1997).
Além disso, a concentração do
medicamento varia dependendo da região gástrica, como no antro, corpo e fundo
deste órgão (COOREMAN et al., 1993; MÉGRAUD, 1998).
O mecanismo de ação dos antibióticos empregados na rotina clínica frente a
H. pylori consiste em danificar o DNA, inibir a síntese proteica e de parede celular e
são brevemente descritas a seguir.
O metronidazol, pertencente à classe dos nitroimidazólicos, entra na célula
bacteriana e é reduzido por enzimas gerando produtos tóxicos, como a
hidroxilamina, que atuam danificando o DNA (GOODWIN et al., 1998). Os
macrolídeos, como a claritromicina, agem inibindo a síntese proteica bacteriana ao
se ligarem à subunidade 23S da porção 50S do ribossomo bacteriano, ficando
impedida a transpeptidação e translocações das futuras proteínas bacterianas. Já as
tetraciclinas, impedem a síntese proteica ao se ligarem, reversivelmente, à porção
30S do RNA ribossomal, bloqueando a ligação do RNA transportador. Por sua vez,
os β­lactâmicos, como a amoxicilina, atuam ligando­se à PBP (Penicillin-Binding
Proteins) interferindo na síntese correta do peptidioglicano, gerando uma parede
celular instável (ANVISA, 2014).
O uso de um supressor de ácido, em associação à terapia de erradicação da
bactéria em estágio inicial, beneficia a cicatrização de úlceras gástricas. Entretanto a
cicatrização adequada pode ser bem sucedida se o tratamento antibiótico, mesmo
sem o emprego do supressor de ácido, for correto e rápido (TREIBER; LAMBERT,
1998).
Para erradicar a bactéria de modo mais eficiente, promovendo inclusive a
redução nos casos de reinfecção, deve ser realizada a administração conjunta de
dois a três fármacos antibacterianos e um agente supressor da acidez gástrica. A
poliquimioterapia, empregada no tratamento dessa doença, é necessária pela
dificuldade de ação de fármacos no lúmen gástrico e pela aquisição de resistência
bacteriana aos antibióticos. Dessa forma, para aumentar a chance de eficácia
terapêutica é realizada a administração de dois ou mais antibióticos, principalmente
metronidazol, claritromicina, amoxicilina ou tetraciclina, associados a um inibidor da
bomba de prótons, como o omeprazol, aumentando as chances de cura e reduzindo
27
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
o surgimento de resistência aos antibacterianos (LIND et al., 1999; LOGAN et al.,
1994).
O inibidor da bomba de prótons liga­se irreversivelmente à enzima K+­H+­
ATPase, que é responsável pela secreção de íons H+ pelas células parietais no
estômago gerando a acidez necessária para o processo de digestão gástrica. Desse
modo, com a redução da liberação de ácido pelas glândulas secretoras gástricas
ocorre menor dano à mucosa do estômago, lesionada em reação à presença da H.
pylori e do ácido clorídrico. Além dessa ação, essa classe de fármacos, composta
por omeprazol, lansoprazol, pantoprazol, rabeprazol, esomeprazol, dexlansoprazol e
tenatoprazol,
ainda
parece
promover
uma
ação
anti­Helicobacter
pylori
provavelmente pela inibição da urease ou ao ligar­se a H+­K+­ATPase bacteriana
(BRAGA et al., 2011).
Entretanto, deve­se ressaltar que a realização do teste de susceptibilidade é
muito importante para a eficácia terapêutica, visto que mesmo que o tratamento seja
constituído de dois antibióticos e um inibidor da bomba de prótons, há os casos de
resistência bacteriana. Em sua publicação, Street et al. (2001) constataram que a
cura da infecção por H. pylori foi mais adequada quando o antibiótico foi
administrado após a realização do teste de susceptibilidade (99%) do que quando se
administrou inibidor da bomba de prótons com antibióticos de uso padrão
(claritromicina e amoxicilina) sem a avaliação da resistência da cepa (81%).
Casos de resistência ao tratamento realizado para a remissão desse processo
infeccioso existem e são um problema crescente e preocupante, visto a limitação no
grupo de antibióticos de escolha, além da variação de resistência da bactéria
dependendo da localização geográfica, assim como de grupos de populações
afetados (KIM et al., 2001).
Para que a bactéria suporte a elevada concentração de antibióticos e tenha
sucesso na infecção, deve desenvolver mecanismos de resistência que modifiquem
ou substituam os locais de ação dos fármacos os quais geralmente resultam na
interferência da síntese proteica (claritromicina), na síntese de parede celular
(amoxicilina) ou na replicação do DNA (metronidazol). Para tanto, ocorrem
alterações genéticas na bactéria, como mutações em nível cromossomal, aquisição
28
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
de plasmídeos de resistência ou ainda por aquisição de DNA exógeno (MÉGRAUD,
1998).
Uma das vias de resistência aos antibióticos, utilizados na rotina médica,
desenvolvida por algumas cepas de H. pylori foi detectada por Fontana et al. (2002)
e consiste na modificação da subunidade 23S do RNA ribossômico impedindo que a
claritromicina, pertencente a classe dos macrolídeos, iniba a síntese proteica
bacteriana. Foi detectado por Goodwin et al. (1998) que mutações na enzima NADP
nitroredutase podem ser responsáveis pela redução da atividade enzimática, que é
necessária para a conversão do metronidazol em sua forma atuante. Também há o
relato da resistência à amoxicilina a partir de uma mudança na PBP1 (penicillinbinding proteins), impedindo a ligação desse β­lactâmico em seu sítio de ação
(OKAMOTO et al., 2002).
Já foi relatada a presença de cepas resistentes à amoxicilina, claritromicina,
metronidazol, tetraciclina e levofloxacina em todos os continentes do planeta, sendo
exceção apenas a levofloxacina nas Américas e claritromicina na África, além da
multirresistência a dois ou mais antibióticos (DE FRANCESCO et al., 2010). Street et
al. (2001) também detectaram, ao realizar o rastreamento da sensibilidade a
antibióticos, resistência a metronidazol, claritromicina, ampicilina e tetraciclina e
ainda foi registrada resistência concomitante a claritromicina e metronidazol.
A administração inadequada dos antibióticos é um dos maiores problemas na
erradicação da bactéria, visto que devido ao tratamento empírico – sem a detecção
de resistência por antibiograma ou métodos moleculares – cepas resistentes são
expostas aos clássicos antibióticos resultando na permanência da doença,
desestimulando o paciente à continuação do tratamento.
1.1.8. EFEITOS COLATERAIS E REFRATARIEDADE
Devido aos efeitos colaterais, como cólicas abdominais, náuseas, vômitos,
diarreia e disgeusia (ANVISA, 2014), decorrentes do uso dos medicamentos
combinados que compõem a terapia, ocorre a refratariedade ao tratamento por parte
de alguns pacientes (BELL et al., 1992). Isto, unido aos casos de recidivas, do
elevado custo dos medicamentos, além da inexistência de vacinas específicas para
o microrganismo, dificulta a redução nos casos de infecção (ZHANG et al., 2011).
29
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
A falta de uma terapia eficaz e destituída de efeitos adversos, para infecções
causadas por esse patógeno, é preocupante e reforça a necessidade do
desenvolvimento de novos agentes terapêuticos mais eficazes e menos tóxicos.
Devido à dimensão das lesões gástricas, à ocorrência de resistência aos
antibióticos, à refratariedade ao tratamento atualmente empregado, além dos casos
de recidiva da doença, motiva­se o estudo em busca de extratos de origem natural,
especialmente fitoterápicos e fitofármacos, como uma opção em potencial para o
desenvolvimento de novas terapias eficazes. O estudo da atividade biológica de
compostos químicos obtidos de vegetais, nativos ou cultivados regionalmente,
valoriza a etnofarmacologia local, providenciando informações úteis à comunidade
científica além do esclarecimento à população sobre a segurança do uso desses
extratos.
1.2.
Terapêutica alternativa
Com o advento da química e síntese orgânica, como ferramentas na obtenção
ágil e prática de rotas sintéticas, foi dado enfoque a esse mecanismo de origem de
antimicrobianos na indústria farmacêutica. Entretanto as vias microbianas de
resistência aos fármacos vêm superando a síntese de novos medicamentos eficazes
e de administração segura (FOGLIO et al., 2006).
Diante desse fato, a pesquisa por potenciais antimicrobianos se torna
imperiosa entre os grupos de pesquisa, os quais estão à procura de novos fármacos
de origem natural, como fontes vegetais e animais ou a partir de desenvolvimento
em processos biotecnológicos.
1.2.1. PRODUTOS DE ORIGEM NATURAL
Os seres vivos produzem de modo geral substâncias que são responsáveis
pela defesa do organismo frente situações adversas. Estes compostos são
denominados de metabólitos secundários (figura 4), moléculas orgânicas de ampla
variedade que aparentemente não apresentam função direta em etapas vitais para o
organismo, como processos fotossintéticos, respiratórios, de assimilação de
nutrientes, transporte de solutos ou síntese de proteínas, carboidratos ou lipídeos
(GARCÍA; CARRIL, 2009). Em contrapartida são produzidos para outras finalidades
30
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
como mecanismo de defesa contra predação ou parasitismo por microrganismos,
insetos e herbívoros, para produzir odores atrativos a agentes polinizadores, como
também para gerar pigmentos, sendo importantes na manutenção da vida do
organismo prolongando a sobrevivência uma vez que ajudam a aumentar a
qualidade e o tempo de vida (COWAN, 1999).
Figura 4. Elementos básicos do metabolismo primário em relação ao metabolismo
secundário de plantas (Fonte: Adaptado de García; Carril, 2009).
Na química de produtos naturais existe um esforço em isolar e identificar
novos compostos obtidos a partir de diferentes fontes com o intuito de descobrir
novas estruturas químicas que apresentem algum tipo de atividade biológica. Entre
os grupos que hoje são fonte de estudo para essa área, destacam­se os vegetais
(BARREIRO, 1990), fungos (BRIZUELA et al., 1998, STROBEL et al., 2004) e algas
(ROCHA et al., 2007). Os compostos naturais obtidos podem apresentar uma ou
diversas
ações
biológicas
como,
por
exemplo,
antibacterianos,
antivirais,
31
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
antifúngicos, inseticidas, anti­inflamatórios, antitumorais, reguladores enzimáticos,
de crescimento ou hormonais, além de outras interações em nível celular ou
sistêmico (COWAN, 1999; BAKKALI et al., 2008).
1.2.2. PLANTAS MEDICINAIS
Desde os primórdios da raça humana, busca­se o tratamento eficaz de
doenças em produtos naturais, sendo esta atenção preferencial em relação aos
vegetais. Desse modo, a partir de experiências empíricas, foram sendo repassados
entre os povos, ao longo dos anos, dados etnofarmacológicos de partes vegetais.
Essas informações são hoje o dado inicial na busca por novos extratos ou
compostos que apresentem alguma bioatividade, sendo as observações populares
importantes para o direcionamento da pesquisa científica comprobatória (MACIEL et
al., 2002).
Foglio et al. (2006) afirmam que pode­se considerar como planta medicinal
aquela administrada sob qualquer forma e por alguma via ao homem, exercendo
algum tipo de ação farmacológica. Ainda abordam que é necessário conhecer a
segurança do emprego dessa forma terapêutica, visto a adesão da população em
seu uso para o tratamento de doenças. São definidas ainda como “aquelas que
possuem tradição de uso em uma população ou comunidade e são capazes de
prevenir, aliviar ou curar enfermidades” e que são obtidos, ao final do
processamento, os medicamentos fitoterápicos (CARVALHO et al., 2007).
Em definição estabelecida pela ANVISA, “medicamentos fitoterápicos são
obtidos exclusivamente de matérias­primas ativas vegetais, cuja eficácia e
segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de
utilização, documentações tecnocientíficas ou evidências clínicas” e ainda
estabelece que fitoterápicos são extratos de origem vegetal formados pela mistura
de diferentes classes de compostos químicos, enquanto que fitofármaco consiste em
molécula isolada ou uma mistura de uma mesma classe de compostos também de
origem exclusivamente vegetal (RDC 14/2010).
As plantas medicinais são importantes para a pesquisa farmacológica, seja na
obtenção ou desenvolvimento de novos fármacos, tanto para o uso direto do
32
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
constituinte vegetal como modelo para síntese de compostos farmacologicamente
ativos (ZHANG, 1998).
Grande parte da população brasileira e mundial ainda procura nos produtos
de origem natural, especialmente nas plantas medicinais, uma fonte de terapia para
remediar condições patogênicas, seja em contexto cultural ou como fitoterápico.
Entretanto ainda são escassos os dados farmacológicos, fitoquímicos ou
toxicológicos sobre a maioria dos vegetais denominados medicinais, sendo
evidenciada, portanto, a importância nos estudos que venham a contribuir para o
conhecimento científico sobre essa fonte terapêutica (FOGLIO et al., 2006). Estima­
se que 80% da população mundial faça uso de plantas medicinais como primeiro
recurso no atendimento básico de saúde (WHO, 1999).
O Brasil é conhecido por sua grande biodiversidade exposta em diferentes
domínios fitogeográficos (MMA, 2007). Este fato associado aos diferentes grupos
étnicos e seus conhecimentos empíricos e ao desenvolvimento de pesquisas
direcionadas à validação de novos princípios ativos podem levar ao surgimento de
novas terapias eficazes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Populações locais do Brasil utilizam, na medicina popular, várias plantas,
oriundas do cerrado, da floresta amazônica e da mata atlântica, assim como plantas
exóticas introduzidas como fonte de agentes medicinais naturais para o tratamento
de diversas doenças, como esquistossomose, leishmaniose, infecções fúngicas e
bacterianas (DUARTE, 2006).
Os estudos fitoquímicos têm revelado uma variedade de compostos ainda
desconhecidos na química medicinal. Isto se deve ao desenvolvimento de técnicas
químicas aguçadas de análise de estrutura, fato que otimizou a elucidação de
estruturas complexas que podem possuir potencial farmacológico (CECHINEL
FILHO; YUNES, 1998).
Os vegetais possuem uma elevada capacidade de sintetizar compostos
aromáticos, em sua maioria fenóis e derivados. Os compostos orgânicos mais
associados à ação antibacteriana e sua possível rota de atuação foram revisados
por Cowan (1999) e são descritos brevemente na tabela 1.
33
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
Tabela 1. Prováveis mecanismos antimicrobianos dos principais grupos químicos orgânicos
extraídos de vegetais.
COMPOSTOS ORGÂNICOS
PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO
Fenóis e polifenóis
Inibição enzimática.
Ligação a adesinas de superfície, polipeptídeos
Quinonas
de parede ou enzimas de membrana; pode tornar
acesso bacteriano a substratos indisponível.
Formação
Flavonas,
flavonoides
de
e extracelulares
flavonóis
complexos
ou
com
a
com
proteínas
parede
celular
bacteriana; ruptura de membrana quando mais
lipofílicos.
Taninos
Inativação de adesinas, enzimas e transporte de
proteínas microbianas.
Cumarinas
Ação indireta através do sistema imune.
Terpenoides e óleos essenciais
Envolve ruptura de membrana.
Alcaloides
Habilidade de intercalar na molécula de DNA.
Formação de canais iônicos na membrana
Lectinas e polipeptídeos
microbiana; inibição competitiva da adesão de
proteínas
bacterianas
aos
receptores
de
polissacarídeo do hospedeiro.
1.2.3. ÓLEOS ESSENCIAIS
Os óleos essenciais são metabólitos secundários produzidos por plantas
aromáticas que tem como característica volatilidade, componentes com estrutura
química complexa e cheiro intenso. Na natureza esses óleos agem com função
protetora frente agentes nocivos para o vegetal, como bactérias, fungos, insetos,
vírus e herbívoros ou como atrativo para agentes polinizadores (LIMA et al., 2006;
BAKKALI et al., 2008).
De modo geral, são constituídos da mistura de 20 a 60 componentes com
concentrações variadas, onde geralmente dois ou três compostos destacam­se
como majoritários determinando a propriedade biológica do óleo. Essas substâncias
são originárias de dois caminhos biossintéticos distintos gerando um grande grupo
34
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
formado por terpenos e terpenoides e outro constituído de compostos alifáticos e
aromáticos (BAKKALI et al., 2008).
Os terpenoides são derivados de um precursor com cinco carbonos, o
difosfato de isopentenil.
Os monoterpenos, uma unidade de isopreno, e os
sesquiterpenos, três unidades de isopreno, constituem juntos parte da mistura de
compostos presentes nos óleos essenciais e são conhecidos como componentes
voláteis (CROTEAU et al., 2000).
Devido sua natureza mais apolar são solúveis em lipídeos e solventes
orgânicos apresentando, geralmente, densidade menor que a da água. Podem ser
extraídos de várias partes vegetais como: brotos, flores, folhas, caules, galhos,
sementes, frutas, raízes, madeira ou casca (BAKKALI et al., 2008).
Os óleos essenciais têm sido empregados durante séculos na rotina humana
por suas propriedades antisséptica, bactericida, antiviral, fungicida, analgésica,
sedativa, anti­inflamatória, antiespasmódica, além de serem utilizados como
fragrância, tempero ou na preservação de alimentos. Apresentam importância
comercial voltada para as indústrias farmacêutica, agronômica, alimentar, sanitária e
cosmética (NASCIMENTO et al., 2007; BAKKALI et al., 2008).
Em um trabalho realizado por Bergonzelli et al. (2003), foram avaliados
sessenta óleos essenciais comerciais diferentes frente a H. pylori, no qual ficou
demonstrado potencial bactericida em dezesseis deles. Um desses óleos, obtido da
semente de cenoura, foi avaliado in vivo, o qual demonstrou entre 20 e 30% de
redução da infecção pela bactéria, sendo sugerido que, de modo geral, os óleos com
ação anti­Helicobacter pylori podem ser usados como aditivos alimentares para
complementar a terapia contra esse patógeno.
1.3.
Syzygium cumini
1.3.1. ASPECTOS FARMACOBOTÂNICOS
Pertencente à família Myrtaceae, o Syzygium cumini (L.) Skeels (figura 5),
sinonimizado com Syzygium jambolanum (Lam.) DC., Eugenia jambolana Lam.,
Eugenia cumini (L.) Druce, Myrtus cumini L. ou Calyptranthes oneilli Lundell, é
35
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
conhecido popularmente no Brasil como jambolão, jamelão, azeitona preta, azeitona
do nordeste ou ameixa­roxa e tem sido utilizado empiricamente para o tratamento de
doenças infecciosas causadas por bactérias, fungos e vírus (CHANDRASEKARAN;
VENKATESALU, 2004), além de diabetes e doenças digestivas (LORENZI; MATOS,
2002; MACIEL et al., 2008).
Figura 5. Syzygium cumini. a) Exemplar localizado no campus central da UFRN; b) Folhas,
flores e frutos imaturos e maduros; c) Flores e d) Fruto maduro (Fonte: Arquivo próprio).
Em revisão, Migliato et al. (2006) reportam o uso popular de extratos obtidos
de várias partes do S. cumini frente diabetes, hipertensão, doenças de pele, diarreia,
disenteria, problemas gástricos, irritações na garganta, além de uso como anti­
inflamatório, diurético, bactericida, antipirético, anticonvulsivante, anti­hemorrágico,
entre várias outras implicações clínicas.
É uma planta arbórea com até 10 metros de altura, com folhas simples. Seus
frutos são pequenos de cor roxo­escura com uma única semente coberta de polpa
comestível de sabor doce, mas adstringente. É originária da Indomalásia, China e
Antilhas e cultivada em vários países, inclusive no Brasil (LORENZI; MATOS, 2002).
36
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Já foi confirmado efeito antisséptico profilático do extrato hidroalcoólico das
folhas frescas em modelo in vivo de ligação e punção cecal. Essa ação está
associada ao recrutamento de neutrófilos ativados ao local da infecção e diminuição
da resposta inflamatória sistêmica (MACIEL et al., 2008).
Também há registro de efeito anti­hiperglicemiante, em modelo animal, do
extrato etanólico da semente, o qual foi capaz de reduzir os níveis de glicose do
sangue e de hemoglobina glicada, com consequente aumento de insulina no soro e
também se mostrou capaz de reduzir os níveis de lipoproteína de baixa densidade
(LDL) e triglicerídeos, aumentando os níveis de lipoproteínas de alta densidade
(HDL) (BALIGA et al., 2012).
Além disso, também foi detectada atividade anti­inflamatória do extrato
aquoso da folha desse vegetal em modelo de edema de pata em camundongos
(LIMA et al., 2007).
1.4.
Encholirium spectabile
1.4.1. ASPECTOS FARMACOBOTÂNICOS
Uma espécie pertencente à família Bromeliaceae, a Encholirium spectabile
Mart. ex Schult. f. (figura 6), conhecida popularmente como macambira de flecha, é
endêmica do Brasil ocorrendo principalmente na Caatinga e no Cerrado
(CARVALHO et al., 2010).
Figura 6. Encholirium spectabile. a) Exemplar localizado em área rural no município de São
José do Seridó/RN; b) Folha; c) Inflorescência seca (Fonte: Arquivo próprio).
37
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
É uma erva com cerca de 1 metro de altura com escape floral de cerca de 1,7
metros e com inflorescência em espiga de aproximadamente 0,8 metro, as folhas
são verdes e suculentas e é encontrada em solos arenosos e pedregosos ou
afloramentos rochosos.
Carvalho et al. (2010) realizaram um estudo fitoquímico preliminar detectando
um perfil fenólico do extrato etanólico bruto das folhas da E. spectabile, fato que
corrobora os resultados de efeito antiulcerogênico e antioxidante do extrato
avaliados pelo mesmo grupo.
Baseado nos trabalhos citados na literatura, que demonstram a ação
protetora frente úlceras gástricas, e na escassez de pesquisas sobre essa planta
para estudos de bioatividade, é levantada a hipótese de ação anti­Helicobacter pylori
desse extrato, já que é uma das principais causas desse quadro clínico gástrico.
Diante dos trabalhos que demonstram o potencial farmacológico e antiúlceras
desses vegetais, fazem­se necessárias maiores investigações sobre o potencial anti­
Helicobacter pylori de fitoterápicos e fitofármacos obtidos dessas plantas.
38
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
2. JUSTIFICATIVA
O uso de plantas medicinais tradicionais para tratamento de infecções é
conhecido e trabalhos científicos nessa área tentam comprovar a eficácia dessa
aplicação milenar (MIGLIATO et al., 2006; MACIEL et al., 2008; CARVALHO et al.,
2010, SÁ et al., 2011). Para tanto averiguar a eficácia e segurança do emprego
desses extratos e óleos em testes laboratoriais minimiza alguns problemas, como
intoxicação ou dosagem inapropriada. Entre os vegetais que podem apresentar
potencial ação anti­Helicobacter pylori, foram escolhidos o S. cumini e o E.
spectabile, os quais tiveram extratos orgânicos capazes de inibir o crescimento de
outras bactérias, além de apresentarem ação cicatrizante frente úlceras gástricas.
Quando se fala em microrganismos, deve­se ressaltar o agravante dos casos de
resistência aos antibióticos de emprego clínico. Enfatiza­se, portanto, a necessidade
da descoberta e comprovação de atividade antibacteriana de novos extratos, óleos
essenciais, frações ou compostos sintéticos ou naturais, principalmente quando a
bactéria em estudo é a H. pylori, visto a dificuldade de tratamento devido o sítio e a
característica da infecção.
39
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
3. OBJETIVOS
3.1.
Objetivo geral
Avaliar a atividade anti­Helicobacter pylori e de toxicidade in vitro de extratos
orgânicos e óleo essencial obtidos do Syzygium cumini e Encholirium spectabile em
estudo bioguiado.
3.2.
Objetivos específicos

Obter extratos orgânicos brutos do S. cumini e E. spectabile;

Obter o óleo essencial do S. cumini;

Avaliar qualitativamente, pelo método de difusão em disco, a ação anti­
Helicobacter pylori dos extratos orgânicos e óleo essencial, sendo o dado
inicial para guiar os demais ensaios;

Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) das amostras ativas frente
à bactéria, pela técnica de microdiluição em caldo;

Determinar a citotoxicidade in vitro do óleo essencial do S. cumini em
concentração correspondente à CIM através da atividade hemolítica,
utilizando eritrócitos de carneiro, e de viabilidade em linhagens de células
HeLa e VERO.
40
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1.
Material vegetal
Os vegetais escolhidos foram o Syzygium cumini e o Encholirium spectabile,
os quais tiveram as folhas escolhidas como fonte dos extratos a serem obtidos. A
escolha dos vegetais aqui avaliados foi dada de acordo com literatura prévia sobre
atividade antiulcerogênica ou antibacteriana (SHAFI et al., 2002; CARVALHO et al.,
2010; MOHAMED et al., 2013).
4.1.1. Syzygium cumini
Foram coletadas folhas do Syzygium cumini de árvores próximas entre si
localizadas no campus central da UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, no mês de
dezembro de 2012, sendo a coleta realizada no início da manhã, por volta das 6
horas. A exsicata está depositada sob o código 5061 no Herbário da UFRN, sob
cuidados do Professor Doutor Jomar Gomes Jardim.
4.1.1.1. Obtenção dos extratos orgânicos por maceração estática
Todos os procedimentos para a obtenção dos extratos vegetais foram
realizados no Laboratório de Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos
(LISCO) do Instituto de Química da UFRN, sob supervisão da Professora Doutora
Renata Mendonça Araújo.
As folhas do S. cumini foram secas em temperatura ambiente e então
trituradas para seguirem para o processo de maceração estática. O pó rendeu 174
g. À metade da massa obtida foram adicionados 500 mL do solvente hexano (QEEL,
São Paulo, Brasil) enquanto que a outra metade, em outro recipiente, foi solubilizada
em 500 mL de álcool etílico absoluto (QEEL, São Paulo, Brasil), permanecendo em
repouso e em temperatura ambiente por 48 horas, quando foram, então, filtrados
com auxílio de algodão.
O solvente foi removido sob evaporação a vácuo em rotaevaporador (Fisatom
modelo 804, Brasil) e, após ser recuperado, foi misturado novamente ao pó que
permaneceu no recipiente. Esse procedimento foi realizado três vezes a fim de
extrair o máximo possível de componentes. Enquanto isso, os extratos brutos, tanto
41
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
etanólico (SCFE) quanto hexânico (SCFH), foram transferidos para vidros, os quais
permaneceram em temperatura ambiente para secagem do solvente residual.
O pó das folhas, que havia passado pela etapa de extração com hexano, foi
depois submetido à extração com etanol (SCFH/E) para avaliar se houve diferença
no rendimento de obtenção de extrato.
4.1.1.2. Partição do extrato etanólico
O extrato etanólico foi fracionado pela técnica de partição. Nesta esperou­se
separar os componentes mais apolares daqueles mais polares que compõe o
extrato. Para tanto foram solubilizados 2 g do extrato etanólico em solução aquosa
de metanol a 40%, sendo essa solução misturada a cada solvente por vez,
respeitando a ordem crescente de polaridade: hexano (SCFE/H), clorofórmio
(SCFE/C), acetato de etila (SCFE/AE) e água destilada (SCFE/AQ).
O procedimento foi realizado em um funil de separação e a homogeneização
foi realizada cuidadosamente. Ao final, cada fração gerada teve seu solvente
evaporado sob pressão em rotaevaporador e o solvente residual foi eliminado com
leve aquecimento em uma placa térmica a 50ºC.
4.1.1.3. Obtenção do óleo essencial
As folhas frescas do Syzygium cumini foram cortadas com auxílio de tesoura
em pequenos pedaços, com o intuito de aumentar a superfície de contato para
otimizar o rendimento do óleo essencial (SCFO). Em seguida 100 g de folhas foram
misturados a 250 mL de água destilada e submetidas ao procedimento de
hidrodestilação em aparelho de Clevenger durante 2 horas a partir da fervura da
água. Para a execução foram necessários: manta aquecedora para balões (Edutec,
Paraná, Brasil), dosador e condensador acoplado a um sistema de refrigeração.
4.1.1.4. Obtenção do extrato aquoso por decocção
Folhas frescas picotadas foram submersas em água destilada e submetidas a
aquecimento a 150ºC a fim de se obter o extrato aquoso por decocção desse
vegetal. A mistura filtrada obtida foi submetida à evaporação da água gerando o
extrato aquoso bruto (SCFAq).
42
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
4.1.2. Encholirium spectabile
As folhas do Encholirium spectabile foram coletadas em um afloramento
rochoso na zona rural no município de São José do Seridó, Rio Grande do Norte, na
área de caatinga no mês de agosto de 2013. A coleta foi realizada no início da
manhã, por volta das 6 horas. A exsicata está depositada, sob o código 16284, no
Herbário da UFRN, sob cuidados do Professor Doutor Jomar Gomes Jardim.
4.1.2.1. Obtenção dos extratos orgânicos por maceração estática
As folhas do E. spectabile foram secas em estufa a 40ºC e então trituradas
para seguirem ao processo de maceração estática. A partir de 125 g do pó foram
procedidas as extrações com o hexano (ESFHf), em seguida a mesma massa foi
submetida a extração com o etanol (ESFEf) e por fim foi realizada a extração com
solução aquosa de etanol a 50% (ESFE/Af). Em cada etapa, a massa permaneceu
em contato com o solvente em repouso e em temperatura ambiente por 48 horas,
sendo posteriormente filtrado com auxílio de algodão.
Entre cada etapa o solvente foi removido sob evaporação a vácuo em
rotaevaporador e, ao final, os extratos brutos foram transferidos para vidros até a
completa secagem do solvente residual.
4.1.2.2. Obtenção dos extratos orgânicos em Soxhlet
Os extratos brutos hexânico e clorofórmico quentes da E. spectabile foram
obtidos por extração contínua em extrator tipo Soxhlet. Neste sistema, 28 g do pó
das folhas secas da E. spectabile foram colocados em um cilindro poroso, de papel
filtro resistente, na porção interna do Soxhlet, o qual foi acoplado, na porção inferior,
a um balão de fundo redondo contendo o solvente, em uma manta aquecedora, e na
porção superior, a um condensador ligado a um sistema de refrigeração. O solvente
foi aquecido até a fervura branda e evaporou até condensar e cair no cilindro
contendo o pó, solubilizando os componentes com polaridade correspondente. A
solução foi sifonada para o balão ao encher a região em que o cilindro estava
inserido. O solvente foi removido por evaporação, sob pressão, em rotaevaporador,
permanecendo apenas o extrato bruto. A partir da mesma massa vegetal foram
43
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
obtidos os extratos hexânico (ESFHq) e clorofórmico (ESFCq). As extrações foram
realizadas mudando o solvente por ordem de polaridade (hexano  clorofórmio).
4.2.
Microrganismo e meio de cultura
Para análise da ação antimicrobiana foi utilizada a bactéria Helicobacter pylori
ATCC 43504, fornecida, sob o código INCQS 00380 (lote: 1011380), pelo Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – INCQS – da Fundação Oswaldo
Cruz ­ FIOCRUZ.
Os meios de cultura utilizados nos testes foram o ágar triptona de soja (TSA ­
Himedia, Índia) acrescido de sangue de carneiro desfibrinado estéril a 5% e o caldo
Mueller­Hinton (Himedia, Índia) acrescido de soro fetal bovino a 10% (MORGAN et
al., 1987; ZAIDI et al., 2012; CLSI, 2013).
O estoque da bactéria foi mantido em caldo triptona de soja (TSB – Himedia,
Índia) acrescido de glicerol a 20% em freezer a ­20°C. A cultura utilizada era
semeada 48 horas antes da realização dos testes.
4.2.1. TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO
Para a análise qualitativa de ação antibacteriana dos extratos, foi executada a
metodologia desenvolvida por Bauer et al. (1966) com algumas modificações. Discos
de papel filtro Whatman nº 1 estéreis com 6 mm de diâmetro foram impregnados
com 10 μL de cada amostra solubilizada em solução aquosa de tween 80 para
síntese a 1% e dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% nas concentrações demonstradas nas
tabelas 2 e 3. Esse material permaneceu em fluxo laminar até secagem total do
solvente. Os óleos foram impregnados nos discos imediatamente antes do teste,
para evitar evaporação dos componentes voláteis dessas amostras.
Os controles negativos (CN) consistiram nos solventes utilizados para diluição
das amostras. Foram adicionados 10 μL de solução aquosa de tween 80 a 1% e
DMSO a 1% ou água destilada, em discos de papel filtro estéreis e submetidos a
fluxo de ar e temperatura constantes nas mesmas condições das amostras testes.
Para o óleo, foram impregnados discos com solução aquosa de tween 80 a 1% e
DMSO a 1% imediatamente antes da execução do teste. O controle positivo (CP)
empregado foi a claritromicina a 15 μg/disco (CLA 15, DME, São Paulo, lote:
44
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
2010CLA) como recomendado pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standart Institute),
2013.
Na superfície do ágar sangue foi realizado semeio, com auxílio de swab
estéril, da H. pylori em suspensão ajustada a escala 2 de McFarland em solução
salina. Em seguida, os discos impregnados e secos foram colocados na superfície
do ágar e incubados em atmosfera de microaerofilia a 37ºC durante 48 horas. A
leitura consistiu na mensuração do halo de inibição, em milímetros, do crescimento
bacteriano em volta do disco. Os ensaios foram realizados em triplicata.
Tabela 2. Concentração, em mg/mL, dos extratos das folhas do S. cumini nos discos
utilizados no teste de difusão em disco e seus respectivos solventes.
Amostra
Concentrações nas diluições (mg/mL)
Solvente
100%
50%
25%
SCFH
10
5
2,5
TD1
SCFE
10
5
2,5
TD1
SCFE/H
10
5
2,5
TD1
SCFE/C
10
5
2,5
TD1
SCFE/AE
10
5
2,5
TD1
SCFE/AQ
10
5
2,5
Água destilada
SCFAq
10
5
2,5
Água destilada
SCFO
858
429
214,5
TD1
TD1: Solução aquosa de Tween 80 a 1% e DMSO a 1%.
SCFH: S. cumini folhas hexano; SCFE: S. cumini folhas etanol; SCFE/H: S. cumini folhas
etanol fração hexânica; SCFE/C: S. cumini folhas etanol fração clorofórmica; SCFE/AE: S.
cumini folhas etanol fração acetato de etila; SCFE/AQ: S. cumini folhas etanol fração
aquosa; SCFAq: S. cumini folhas aquoso quente e SCFO: S. cumini folhas óleo essencial.
45
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
Tabela 3. Concentração, em mg/mL, dos extratos das folhas da E. spectabile nos discos
utilizados no teste de difusão em disco e seus respectivos solventes.
Amostra
Concentrações nas diluições (mg/mL)
Solvente
100%
50%
25%
ESFEf
10
NA
NA
TD1
ESFHf
10
NA
NA
TD1
ESFE/Af
10
NA
NA
TD1
ESFCq
10
NA
NA
TD1
ESFHq
10
NA
NA
TD1
TD1: Solução aquosa de Tween 80 a 1% e DMSO a 1%.
NA: Não avaliado.
ESFEf: E. spectabile folhas etanol extração a frio; ESFHf: E. spectabile folhas hexano
extração a frio; ESFE/Af: E. spectabile folhas 50% etanol/ 50% água extração a frio, ESFCq:
E. spectabile folhas clorofórmio extração a quente e ESFHq: E. spectabile folhas hexano
extração a quente.
4.2.2. CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)
Para a determinação da CIM dos extratos e frações, frente a H. pylori, foi
realizada a microdiluição em caldo em microplaca de 96 poços.
Na técnica, foram pipetados ao poço, da microplaca de 96 poços estéril, o
caldo Mueller­Hinton acrescido de 10% de soro fetal bovino, a suspensão bacteriana
em solução salina ajustada ao padrão 2 da escala de McFarland e amostra­teste,
controle positivo e controle negativo em seus respectivos poços (CLSI, 2013).
A diluição da amostra teve início no primeiro poço da placa, sendo realizada
uma diluição seriada que resultou na variação decrescente de metade da
concentração máxima da amostra até a décima sexta diluição (50%; 25%; 12,5%;
6,25%; 3,125%; 1,562%; 0,781%; 0,391%; 0,195%; 0,098%; 0,049%; 0,024%;
0,012%; 0,006%; 0,003% e 0,002%) como representado na figura 7. No controle
negativo adicionou­se a solução aquosa de tween 80 a 1% e DMSO a 1% ao meio
de cultura e o controle positivo consistiu em claritromicina, solubilizada na mesma
solução do controle negativo, distribuída nas concentrações decrescentes de 32
μg/mL; 16 μg/mL; 8 μg/mL; 4 μg/mL; 2 μg/mL; 1 μg/mL; 0,5 μg/mL e 0,25 μg/mL. O
46
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
controle de crescimento (CC) foi realizado para mostrar a viabilidade da cepa, sendo
constituído apenas por meio de cultura e microrganismo. O teste foi realizado em
triplicata.
1
2
3
4
5
6
A
50
50
50
0,195 0,195 0,195
B
25
25
25
0,098 0,098 0,098
C 12,5
12,5
12,5 0,049 0,049 0,049
D 6,25
6,25
6,25 0,024 0,024 0,024
E 3,125 3,125 3,125 0,012 0,012 0,012
F 1,562 1,562 1,562 0,006 0,006 0,006
G 0,781 0,781 0,781 0,003 0,003 0,003
H 0,391 0,391 0,391 0,002 0,002 0,002
├───────────TESTE──────────┤
CN: controle negativo;
CP: controle positivo
CC: controle crescimento
7
CC
CC
CC
CC
CN
CN
CN
CN
8
CC
CC
CC
CC
CN
CN
CN
CN
9
CC
CC
CC
CC
CN
CN
CN
CN
10
11
12
32
32
32
16
16
16
8
8
8
4
4
4
2
2
2
1
1
1
0,5
0,5
0,5
0,25 0,25 0,25
├────CP────┤
Figura 7. Representação da distribuição das diluições, em porcentagem, realizadas na
microdiluição em caldo em placa de 96 poços.
A placa foi mantida a 37ºC sob condições de microaerofilia durante 48h
sendo, então, submetida à revelação do crescimento, que consiste na adição da
solução aquosa de cloreto de 2,3,5­trifeniltetrazólio (CTT) a 0,5% em cada poço,
sendo a placa incubada novamente durante 3h. Esse composto é solúvel em água e
inicialmente não apresenta coloração; quando há metabolismo bacteriano ativo, com
sistema desidrogenase funcional, ocorre a conversão do tetrazólio em um cristal
insolúvel de cor vermelha, compostos de formazam (figura 8). Logo, se houver
atividade metabólica bacteriana, o meio de cultura (amarelo claro) ganha uma
coloração vermelha, caso não haja atividade celular bacteriana, o meio permanece
com sua coloração original (GUNZ, 1949).
Figura 8. Redução do cloreto de 2,3,5­trifeniltetrazólio ao formazam (Adaptado de Opwis et
al., 2012).
47
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
Por se tratar de um estudo bioguiado, a determinação da CIM foi realizada
apenas para o óleo essencial, único que apresentou preliminarmente ação inibitória
frente a H. pylori. Houve uma adequação das concentrações avaliadas, partindo da
maior concentração possível (figura 9).
A
B
C
D
E
F
G
H
1
420.420
210.210
105.105
52.552,5
26.276,25
13.138,13
6.569,06
3.284,53
2
420.420
210.210
105.105
52.552,5
26.276,25
13.138,13
6.569,06
3.284,53
3
420.420
210.210
105.105
52.552,5
26.276,25
13.138,13
6.569,06
3.284,53
4
1.642,27
821,13
410,57
205,28
102,64
51,32
25,66
12,83
5
1.642,27
821,13
410,57
205,28
102,64
51,32
25,66
12,83
6
1.642,27
821,13
410,57
205,28
102,64
51,32
25,66
12,83
7
CC
CC
CC
CC
CN
CN
CN
CN
8
CC
CC
CC
CC
CN
CN
CN
CN
├──────────────TESTE────────────┤
CN: controle negativo;
CP: controle positivo
CC: controle crescimento
9
CC
CC
CC
CC
CN
CN
CN
CN
10
32
16
8
4
2
1
0,5
0,25
11
32
16
8
4
2
1
0,5
0,25
12
32
16
8
4
2
1
0,5
0,25
├──CP──┤
Figura 9. Representação da distribuição das concentrações, em μg/mL, na microdiluição em
caldo para o óleo essencial do S. cumini.
4.3.
Ensaio hemolítico
Empregado para determinar efeitos tóxicos da amostra de interesse a partir
da lise de eritrócitos, o ensaio de toxicidade por hemólise consiste em expor as
hemácias de carneiro à substância teste e avaliar a liberação de hemoglobina no
sobrenadante.
Nesse ensaio, adaptado a partir de Jorgensen et al. (1983) e Costa­Lotufo et
al (2002), preparou­se uma suspensão de células vermelhas de carneiro a 10%.
Inicialmente, 500 μL de sangue de carneiro foram centrifugados a 4000 rpm durante
5 minutos e o sobrenadante, composto de plasma e Buffy coat, foi descartado.
Foram realizadas sucessivas lavagens com tampão fosfato salina (PBS) até a
ausência de hemólise e então foi preparada a suspensão a 10%.
As amostras testes foram diluídas em DMSO e PBS e em seguida misturadas
à suspenção de hemácias em eppendorf, sendo incubadas a 37ºC por 1 hora. As
concentrações avaliadas foram 50 μg/mL, 100 μg/mL, 500 μg/mL e 1000 μg/mL. No
controle positivo, a suspensão foi incubada com o Triton X­100 a 1% e o PBS foi
usado como controle negativo. A solução controle tem DSMO nas concentrações de
48
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
0,5; 1; 5 e 10% como parâmetro em relação ao teste. Todos os testes foram
realizados em triplicata.
Após a incubação, as amostras foram colocadas em banho de gelo por 5
minutos, seguindo­se à centrifugação a 4000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante
resultante foi diluído em PBS (1/10) e as amostras tiveram sua absorbância (Abs)
medida em espectrofotômetro com comprimento de onda de 540 nm.
A porcentagem de hemólise foi calculada como se segue:
%ℎ
4.4.
ó
=
−
1%
100
Citotoxicidade em cultura de células
O ensaio utilizando cultura de células foi realizado no Laboratório de Biologia
Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC) do Departamento de
Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências, UFRN, com colaboração do
Professor Doutor Kleber Juvenal Silva Farias.
Os extratos que se mostraram eficazes frente a H. pylori foram avaliados
quanto a citotoxicidade em células VERO E6, originada de célula epitelial renal de
Cercopithecus aethiops imortalizada pelo vírus SV­40, e HeLa, célula epitelial de
cérvice uterina humana transformada por HPV­18. A viabilidade celular foi medida
pelo método colorimétrico do MTT, brometo de 3­(4,5­dimetiltiazol­2­il)­2,5­difenil
tetrazólio (Sigma ­ Aldrich, Alemanha) descrito por Mosmann (1983) com
modificações.
O MTT é um sal de tetrazólio amarelado que pode ser reduzido pela succinato
desidrogenase, nas mitocôndrias de células vivas, gerando cristais de formazam
azulados insolúveis em água. Ao ser dissolvido em DMSO, esse produto pode ser
mensurado em absorbância a 540nm. A quantidade de cristais formados é
proporcional ao número de células viáveis (CARMICHAEL et al., 1987; ELAISSI et
al., 2012).
Monocamadas confluentes de células VERO E6 e HeLa contidas em placas
de 96 poços foram expostas às concentrações de 26 μg/mL, 260 μg/mL, 2.600
49
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
μg/mL e 26.000 μg/mL da amostra teste, durante três dias a 37°C. Em seguida, 50
µL de meio L­15 (Leibovitz) contendo MTT, a uma concentração final de 5 mg/mL,
foram adicionados a cada poço. Após 4 horas de incubação a 37°C, o sobrenadante
foi removido e 100 µL de DMSO foram adicionados a cada poço para solubilizar os
cristais de formazan. Após agitação, a absorbância foi medida a 540 nm. O controle
crescimento consistiu no cultivo das células apenas com meio de cultura. Os ensaios
foram avaliados em triplicata.
A porcentagem de viabilidade celular foi calculada como se segue:
%
4.5.
=
100
Análise estatística
Para avaliar a correlação entre a viabilidade das células HeLa e VERO e a
concentração do extrato vegetal foi utilizada a fórmula, acima descrita. Os gráficos
foram plotados utilizando o programa Microsoft® Excel 2010, versão 9.0.2812 com
erro padrão expresso em porcentagem.
50
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
5. RESULTADOS
5.1.
Rendimento dos extratos e óleo essencial
O processo de extração a partir das folhas secas do S. cumini apresentou
como maior rendimento a obtenção de 11,9% de extrato bruto etanólico e 1,8% de
extrato bruto hexânico como menor porcentagem. A partição do extrato etanólico
revelou que a maior parte do extrato é composta por substâncias fortemente
apolares (4,5% fração hexânica) e fortemente polares (4,8% fração aquosa),
enquanto
que
as
frações
de
clorofórmio
e
acetato
de
etila
renderam,
respectivamente, 1,6% e 0,9%. A fração etanólica (10,5%) obtida após a extração
prévia pelo hexano das folhas não apresentou vantagem em relação ao rendimento
se comparado à fração etanólica obtida diretamente das folhas. O extrato aquoso
por decocção rendeu 6,7% (tabela 4).
O óleo rendeu 0,72g a partir de 1000g de folhas frescas, resultando em
0,072% de rendimento. A massa foi determinada em 858 mg a cada 1 mL de óleo
bruto.
A partir das folhas secas do E. spectabile obteve­se 1,1% do extrato etanólico
a frio, 0,9% do extrato hexânico a frio, 7,7% do extrato hidroalcoólico a 50% a frio,
1,1% do extrato clorofórmico a quente e 1,4% do extrato hexânico a quente (tabela
4).
5.2.
Avaliação anti-Helicobacter pylori dos extratos e óleo essencial
Quanto à ação inibitória frente a H. pylori, os extratos etanólico, hexânico,
hidroalcoólico e clorofórmico obtidos a partir das folhas do E. spectabile não
apresentaram atividade biológica, quando avaliados pelo método de difusão em
disco (tabela 5). O mesmo foi notado para os extratos etanólico, hexânico, aquoso e
particionado obtidos a partir das folhas do S. cumini, os quais não apresentaram
inibição do crescimento em nenhuma das concentrações avaliadas (tabela 6).
51
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
Tabela 4. Rendimento dos extratos do S. cumini e E. spectabile.
Quantidade (g)
Quantidade (g)
Rendimento (%)
Amostra
de folhas secas
de extrato
SCFH
87,9
1,6
1,8
SCFH/E
87,9
9,2
10,5
SCFE
87,9
10,5
11,9
SCFE/H
87,9
3,9
4,5
SCFE/C
87,9
1,4
1,6
SCFE/AE
87,9
0,8
0,9
SCFE/AQ
87,9
4,3
4,8
SCFAq
50
3,3
6,7
SCFO
1000
0,72
0,072
ESFEf
125
1,3
1,1
ESFHf
125
1,1
0,9
ESFE/Af
125
9,6
7,7
ESFCq
125
1,4
1,1
ESFHq
125
1,8
1,4
SCFH: S. cumini folhas hexano, SCFH/E: S. cumini folhas hexano aproveitadas com etanol,
SCFE: S. cumini folhas etanol; SCFE/H: S. cumini folhas etanol fração hexânica; SCFE/C: S.
cumini folhas etanol fração clorofórmica; SCFE/AE: S. cumini folhas etanol fração acetato de
etila; SCFE/AQ: S. cumini folhas etanol fração aquosa; SCFAq: S. cumini folhas aquoso
quente e SCFO: S. cumini folhas óleo essencial.
ESFEf: E. spectabile folhas etanol extração a frio; ESFHf: E. spectabile folhas hexano
extração a frio; ESFE/Af: E. spectabile folhas 50% etanol/ 50% água extração a frio, ESFCq:
E. spectabile folhas clorofórmio extração a quente e ESFHq: E. spectabile folhas hexano
extração a quente.
Tabela 5. Média dos halos de inibição (mm) do crescimento da H. pylori frente os extratos
vegetais do E. spectabile.
Teste
Amostra
CN
CP
0
0
38±1
0
0
0
39,3±1,15
0
0
0
;0
38,7±1,15
ESFCq
0
0
0
0
39,7±1,15
ESFHq
0
0
0
0
38,3±1,07
100%
50%
25%
ESFHf
0
0
ESFEf
0
ESFE/Af
CN: controle negativo (DMSO 1% + tween 80 a 1%)
CP: controle positivo (claritromicina 15 μg/disco)
ESFHf: E. spectabile folhas hexano extração a frio; ESFEf: E. spectabile folhas etanol
extração a frio; ESFE/Af: E. spectabile folhas 50% etanol/ 50% água extração a frio, ESFCq:
E. spectabile folhas clorofórmio extração a quente e ESFHq: E. spectabile folhas hexano
extração a quente.
52
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
O óleo essencial obtido a partir das folhas do S. cumini apresentou atividade
inibitória do crescimento da H. pylori, tendo sido observado halo inibitório com média
de 10,2 mm para a concentração máxima do óleo (8,58 mg/disco), 10 mm para a
concentração de 4,29 mg/disco e 8,85 mm para 2,15 mg/disco (tabela 6). O halo
inibitório da claritromicina (15 μg/disco) ficou em torno de 39 mm (figura 10).
100%
25%
CN
50%
Figura 10. Halo inibitório do SCFO, a 25, 50 e 100%, frente o crescimento da H. pylori.
Tabela 6. Média dos halos de inibição (mm) do crescimento da H. pylori frente os extratos
orgânicos e óleo essencial do S. cumini pelo teste de difusão em disco e CIM.
Difusão em disco
CIM (μg/mL)
Amostra
CN
CPdd
100%
50%
25%
SCFE
0
0
0
0
38±1
NA
NA
SCFE/H
0
0
0
0
39,1±1,3
NA
NA
SCFE/C
0
0
0
0
38,5±1,1
NA
NA
SCFE/AE
0
0
0
0
38±1
NA
NA
SCFE/AQ
0
0
0
0
39±1
NA
NA
SCFH
0
0
0
0
39,3±1,15
NA
NA
SCFAq
0
0
0
0
39,7±1,15
NA
NA
SCFO
10,2±0,5
10±0,76
8,85±1,62
0
38,3±1,07
205
0,5
CN: controle negativo (DMSO 1% + tween 80 a 1%);
CPdd: controle positivo (claritromicina 15 μg/disco);
Teste CPMIC
53
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
CPMIC: controle positivo (solução aquosa de claritromicina);
NA: não avaliado;
SCFE: S. cumini folhas etanólico; SCFE/H: S. cumini folhas etanólico fração hexânica;
SCFE/C: S. cumini folhas etanólico fração clorofórmica; SCFE/AE: S. cumini folhas etanólico
fração acetato de etila; SCFE/AQ: S. cumini folhas etanólico fração aquosa; SCFH: S.
cumini folhas hexânico, SCFAq: S. cumini folhas aquoso quente e SCFO: S. cumini folhas
óleo essencial.
A avaliação da concentração inibitória mínima foi realizada para o óleo
essencial (SCFO) sendo determinada em 205 μg/mL (tabela 6). Em relação à
concentração inicial pura do óleo (858 mg/mL), a atividade inibitória foi detectada até
a diluição correspondente a 0,024% (figura 11).
Figura 11. CIM do SCFO (delimitado pelo retângulo vermelho) frente o crescimento da H.
pylori pela técnica de microdiluição em caldo.
5.3.
Atividade hemolítica do óleo essencial do S. cumini
No ensaio da atividade hemolítica utilizando eritrócitos de carneiro constatou­
se que o óleo essencial apresentou atividade hemolítica de 25,04%, 20,07%, 0,99%
e 1,82%, respectivamente, para as concentrações de 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 100
μg/mL e 50 μg/mL (tabela 7), os dados estão representados na figura 12. O Triton X­
100 a 1% promove a hemólise de todos os eritrócitos, pois atua solubilizando
membranas lipídicas por ser um surfactante não­iônico, por isso seu emprego como
controle positivo para ensaios hemolíticos (Preté et al., 2002). De acordo com
Nofiani et al. (2011), a ação hemolítica deve ser considerada elevada quando as
porcentagens de hemólise atingem valores maiores que 40% e baixa quando esses
valores são inferiores a 10%.
54
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
Tabela 7. Avaliação da toxicidade (%) do óleo essencial obtido do S. cumini pelo teste de
hemólise.
Concentração (μg/mL)
Amostra
SCFO
1000
500
100
50
25,04 (±2,74)
20,07 (±13,95)
0,99 (±1,15)
1,82 (±1,25)
TRITON X
100
CP: Triton­X 1%
SCFO: S. cumini folhas óleo essencial.
.
100
Hemólise (%)
80
60
SCFO
40
Triton­X
20
0
50
-20
100
500
1000
Concentração (μg/mL)
Figura 12. Percentual de hemólise induzida por diferentes concentrações do óleo essencial
extraído das folhas do S. cumini (SCFO).
5.4.
Atividade citotóxica in vitro do óleo essencial do S. cumini
No ensaio de viabilidade de células HeLa, tratadas
com concentrações
crescentes do SCFO, foi demonstrado que este óleo essencial exibiu atividade
tóxica nas contrações de 260, 2600 e 26000 μg/mL, induzindo porcentagens de
morte celular de 78,1%, 86,0% e 90,1, respectivamente. Contudo, na concentração
de 26 μg/mL o SCFO não afetou a viabilidade dessas células, conforme mostrado na
tabela 8 e figura 13.
Para a linhagem VERO, o óleo também preservou a viabilidade (tabela 8) total
dessas células na concentração de 26 μg/mL e induziu a morte celular em 49,58%,
82,61% e 75,31%, respectivamente, para as concentrações de 260, 2600 e 26000
μg/mL, como demonstrado na tabela 8 e na figura 14.
55
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Araújo, G.M.
Tabela 8. Viabilidade (%) de células HeLa e VERO tratadas com diferentes concentrações
do SCFO.
Concentração (μg/mL) do SCFO
Células
26
260
2.600
26.000
HeLa
100
21,89
14,04
9,94
VERO
100
50,42
17,39
24,69
SCFO: S. cumini folhas óleo essencial.
Viabilidade células HeLa x
morte celular (%)
120%
100%
80%
100
100
78,11
85,96
90,06
60%
Controle crescimento
40%
Morte celular x SCFO
Viabilidade celular x SCFO
20%
21,89
0%
CC
26
260
14,04
9,94
2600
26000
Concentração (μg/mL) do SCFO
Viabilidade células VERO x morte
celular (%)
Figura 13. Percentual de viabilidade de células HeLa tratadas com diferentes concentrações
do SCFO.
120%
100%
100
100
49,58
82,61
75,31
80%
60%
Controle crescimento
Morte celular x SCFO
50,42
40%
Viabilidade celular x SCFO
20%
24,69
17,39
0%
CC
26
260
2600 26000
Concentração (μg/mL) do SCFO
Figura 14. Percentual de viabilidade de células VERO tratadas com diferentes
concentrações do SCFO.
56
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
6. DISCUSSÃO
A infecção pela H. pylori acomete cerca de metade da população mundial e
está estabelecida como principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer
gástrico, tendo sido classificada, em 1994, como carcinógeno classe I pela
Organização Mundial de Saúde (IARC, 2014). Sabendo­se que a eliminação da
bactéria resulta na redução da incidência de câncer gástrico, é de extrema
importância a resolução rápida e adequada desse processo patológico.
Há recentemente um esforço em relação à descoberta e caracterização de
novos compostos e extratos de fonte natural e que apresentem alguma ação anti­
Helicobacter pylori. Isto se deve ao surgimento de várias cepas resistentes (KIM et
al., 2001) e até mesmo para facilitar o acesso ao tratamento pelas populações com
baixa renda e de países em desenvolvimento, uma vez que o custo elevado das
drogas, disponíveis atualmente, tem sido um obstáculo ao tratamento das
populações mais acometidas por essa infecção (SUERBAUM; MICHETTI, 2002).
Dos extratos aqui avaliados do S. cumini e E. spectabile, apenas o óleo
essencial do S. cumini apresentou ação anti­Helicobacter pylori. Portanto os extratos
etanólico, hexânico e aquoso obtido a partir das folhas do S. cumini assim como os
extratos etanólico, hexânico, hidroalcoólico e clorofórmico obtidos a partir das folhas
do E. spectabile provavelmente não são constituídos por compostos químicos que
impeçam o crescimento da referida bactéria.
Donatini et al. (2009) relataram a ação antiúlcera e antioxidante do extrato
hidroalcoólico das folhas do S. cumini em modelo animal de indução de úlcera
gástrica com etanol. Apesar de não ter sido analisada ação do extrato hidroalcoólico
do S. cumini frente a H. pylori, ficou comprovado, no presente estudo, que o extrato
etanólico e o extrato aquoso não inibem o crescimento da H. pylori. É possível que
estes extratos possuam ação antioxidante e antiúlcera, assim como o hidroalcoólico,
visto serem formados pela mistura de compostos químicos semelhantes ou de
classes químicas próximas, principalmente quanto à polaridade dos extratos, porém
mais estudos devem ser realizados para maiores informações sobre as propriedades
biológicas dessas amostras.
57
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Quanto ao óleo essencial, foi detectada uma atividade biológica interessante,
uma vez que foi capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano na
concentração de 205 μg/mL, em diluição correspondente a 0,024% da concentração
do óleo puro (858 mg/mL). Deve ser enfatizado que o SCFO se mostrou eficaz
mesmo em uma concentração reduzida se comparada à original, confirmando a
importância em se estudar mais detalhadamente o referido óleo. O limite reduzido do
halo inibitório detectado no teste de difusão em disco (10 mm) provavelmente reflete
a dificuldade de dispersão do óleo no meio de cultura sólido, em virtude de seu
caráter hidrofóbico. Isso evidencia a necessidade da realização de ensaios inibitórios
em caldo, para que a eficiência do óleo seja melhor avaliada, em condições onde a
possibilidade de erros, decorrentes da dificuldade de solubilização, sejam evitados.
Apesar da CIM do SCFO ter sido determinada em 205 μg/mL, que é uma
concentração elevada se comparada à claritromicina (0,05 μg/mL), deve­se ressaltar
que este controle é o antibiótico de escolha frente a H. pylori, além de ser um
composto puro, portanto é esperada maior eficácia. Como o óleo é uma mistura de
vários componentes, tanto pode haver a uma inibição discreta em consequência da
baixa concentração do principio ativo, como também pode ocorrer o antagonismo
entre as substâncias presentes no extrato, portanto é comum que uma mistura de
compostos químicos resulte em menor atividade, em testes in vitro, quando
comparados a um controle positivo de aplicação definida.
Ação antibacteriana do óleo essencial das folhas do S. cumini já foi relatada
por Mohamed et al. (2013), que detectaram atividade inibitória do crescimento de
outras bactérias Gram negativas: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Neisseria gonorrhoeae, além das seguintes cepas Gram positivas: Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus e Enterococus faecalis. Esse fato vem confirmar a eficácia
deste óleo como antimicrobiano. Embora os referidos autores não tenham
determinado a CIM do óleo, no método de difusão em disco foram observados halos
inibitórios entre 12 e 14 mm, enquanto que o SCFO apresentou halo de 10 mm.
A composição química do óleo essencial do S. cumini extraído por Mohamed
et al. (2013) foi descrita como uma mistura complexa de hidrocarbonetos, composta
principalmente por monoterpenos e sesquiterpenos, sendo o componente majoritário
o α­pineno (32,32%), seguido do β­pineno (12,44%), do trans­cariofileno (11,19%),
58
Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
do 1, 3, 6­octatrieno (8,41%), do Δ­3­careno (5,55%), do α­cariofileno (4,36%), do α­
limoneno (3,42%) e de outros compostos com traços vestigiais. Já Shafi et al. (2002)
caracterizaram o óleo extraído das folhas do S. cumini como pinocarveol (15,1%), α­
terpenol (8,9%), mirtenol (8,3%), eucarvona (6,6%), murolol (6,4%), mirtenal (5,8%),
geranilacetona (5,6%), α­cardinol (4,6%), pinocarvona (4,4%) demonstrando uma
grande variação dos componentes gerados pelo vegetal. Provavelmente a
concentração e o perfil de constituintes químicos do SCFO deve apresentar
semelhança com alguma caracterização descrita anteriormente, porém dificilmente
será igual, visto que os metabólitos secundários resultam da interação química entre
a planta e o ambiente (figura 15). Desse modo, sua síntese pode ser afetada por
condições climáticas como disponibilidade hídrica, temperatura, altitude, nutrientes
do solo, sazonalidade, radiação ultravioleta, estímulos mecânicos, poluição
atmosférica, entre outros (GOBBO­NETO; LOPES, 2007).
Figura 15. Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos secundários
em plantas (Fonte: Gobbo­Neto e Lopes, 2007).
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Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
A fórmula geral desses hidrocarbonetos é (C5H8)n logo são de difícil
solubilização em água, que é um veículo fundamental nos ensaios antimicrobianos.
Devido esse fato, foi necessário solubilizar o óleo em tween 80 para síntese, um
surfactante e emulsificante não iônico, e em DMSO, um solvente polar, para a
realização dos testes. Entretanto, a concentração desses compostos deve ser
reduzida para evitar resultado falso positivo, tendo ficado, nesse trabalho, definida a
concentração em 1% de cada reagente. Outras concentrações foram testadas, como
2% e 4%, porém inibiram o crescimento da bactéria.
A padronização dos testes de determinação da atividade antibacteriana de
óleos deve ser precisa, entretanto há dificuldade para resolver esta problemática,
principalmente devido sua insolubilidade em água e volatilidade, condições químicas
que dificultam a confirmação de dados (NASCIMENTO et al., 2007). Por isso no
momento da leitura da CIM foi necessário considerar o primeiro poço da triplicata em
que houve crescimento como a concentração mínima, visto que a solubilidade do
óleo variou durante a execução da técnica.
Os óleos essenciais desempenham um importante papel na prevenção de
doenças como disfunção cerebral, câncer, doenças infecciosas, processos
inflamatórios e doenças cardíacas, isso por ser capaz de ligar­se a radicais livres por
apresentarem propriedades antioxidantes (KAMATOU; VILJOEN, 2010; MOHAMED
et al., 2013).
Há relato do uso popular S. cumini para tratamento de disenteria, inflamação
e diabetes. Desse mesmo vegetal já foram obtidos o óleo essencial, alcanos e
ácidos orgânicos. O óleo extraído das folhas do S. cumini por Shafi et al. (2002)
apresentou rendimento de 0,04%, quase metade do encontrado neste estudo para o
SCFO (0,0721%). Tal óleo foi eficaz frente Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, tendo se destacado frente os Gram negativos: Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium (SHAFI et al., 2002). No
presente estudo foi constatado que o óleo (SCFO) mostrou­se eficaz frente a outro
Gram negativo, reforçando a ação antibacteriana dessa mistura de compostos
químicos complexos.
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Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
Óleos essenciais também inibem o crescimento de outros microrganismos
como fungos filamentosos ou leveduriformes como descrito no trabalho de Pinto et
al. (2009), no qual o óleo obtido do Syzygium aromaticum, vegetal pertencente ao
mesmo gênero do S. cumini, foi capaz de inibir o crescimento de treze espécies
fúngicas, sendo cinco do gênero Candida, cinco espécies de dermatófitos e três
espécies de Aspergillus, ressaltando o valor biológico desse fitofármaco.
Outros extratos, que não foram avaliados aqui frente a H. pylori e que foram
obtidos da mesma parte vegetal (folhas) do S. cumini, apresentaram ação inibitória
sobre várias espécies bacterianas. Entre eles destacam­se os extratos metanólico e
cloreto de metileno frente E. coli, P. aeruginosa, N. gonorrhoeae, B. subtilis, S.
aureus e E. faecalis (MOHAMED et al., 2013); o extrato hidroalcoólico com CIM
determinadas em 485 mg/mL para Streptococcus mutans, Streptococcus oralis e
Lactobacillus casei, e 242,5 mg/mL para Streptococcus parasanguis e Streptococcus
salivarius (VIEIRA et al., 2012). Ainda, outro extrato hidroalcoólico foi ativo frente as
bactérias E. faecalis, Kocuria rhizophila, N. gonorrhoeae, Shigella flexneri, P.
aeruginosa e S. aureus, sendo eficaz também frente uma cepa resistente de P.
aeruginosa e uma de S. aureus, além de inibir as leveduras Candida albicans e
Candida krusei (OLIVEIRA et al., 2007); outro extrato metanólico e o extrato aquoso
foram eficazes contra Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhi A,
Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Pseudomonas aeruginosa, E. coli,
B. subtilis e S. aureus (GOWRI; VASANTHA, 2010).
Oliveira et al. (2007) ainda relatam que não houve inibição do crescimento da
E. coli e Klebsiella pneumonia, dois bacilos Gram negativos pelo extrato
hidroalcoólico. Estes resultados são coerentes com aqueles obtidos neste estudo
frente a H. pylori, que também é um Gram negativo. Contudo, isso não descarta a
possibilidade de atividade anti­Helicobacter pylori do extrato hidroalcoólico. Por outro
lado, Gowri e Vasantha (2010) afirmaram que o extrato aquoso foi eficaz frente
bactérias Gram negativas diferentemente do observado aqui em relação ao SCFAq,
que não inibiu o crescimento da H. pylori.
Em outro estudo realizado por Chandrasekaran e Venkatesalu (2004), foi
demonstrado que os extratos aquoso e metanólico, obtidos da semente do S.
cumini, também apresentaram ação antibacteriana. A CIM do extrato metanólico foi
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Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
62,5 μg/mL para o B. subtilis, 125 μg/mL para S. aureus e S. typhimurium, 250
μg/mL para P. aeruginosa, K. pneumoniae e E. coli. As CIMs para o extratos aquoso
foram exatamente o dobro daqueles citados para o metanólico, com exceção da P.
aeruginosa que foi susceptível a 250 μg/mL. Esses resultados mostram que os
extratos aquoso e metanólico, obtidos da semente, possuem ação antibacteriana, ao
contrário do observado no presente estudo para os extrato etanólico, aquoso e
hexânico de folhas, os quais não inibiram o crescimento da H. pylori. A diferente
resposta de bioatividade, detectada entre um extrato originado de folha ou de
semente do mesmo vegetal, pode ser oriunda da variação de compostos particulares
para o desenvolvimento da parte vegetal específica, assim como das condições
ambientais, as quais as plantas estão dependentes.
Outros compostos ou misturas de extratos obtidos a partir de plantas
medicinais já se mostraram eficazes frente a H. pylori como no caso relatado por Xie
et al. (2013) no qual uma mistura de extrato de doze plantas medicinais tradicionais
chinesas inibiu o crescimento da bactéria além de promover a cicatrização de úlcera
gástrica em modelo animal. Estes compostos resultaram em ação semelhante ao
controle positivo, um gastroprotetor, corroborando com o uso convencional. Além
disso, foi comprovada segurança em sua administração, após avaliação de
toxicidade aguda e crônica em ratos, validando sua ação antiúlcera e tornando esse
extrato um possível candidato à medicação alternativa ou complementar para
desordens gastrointestinais.
Outra planta utilizada na medicina tradicional chinesa também se mostrou
promissora frente a H. pylori incluindo uma cepa resistente ao metronidazol. Foram
isolados cinco novos compostos a partir do extrato etanólico das sementes da
Psoralea corylifolia, os quais exibiram CIM de 12,5 e 25 μg/mL. A CIM do
metronidazol foi determinada em 0,5 μg/mL para a cepa sensível e 128 μg/mL para a
cepa resistente, revelando a importância da atividade anti­Helicobacter pylori dessas
substâncias de origem vegetal (YIN et al., 2006).
Zaidi et al. (2009), em avaliação da atividade in vitro anti­Helicobacter pylori
de 50 extratos naturais de plantas medicinais utilizadas empiricamente para o
tratamento de desordens do trato gastrointestinal no Pasquistão, concluíram que
apenas 5 extratos (Curcuma amada Roxb.; Mallotus philippinenssis Muell.; Myristica
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Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
fragrans Houtt. (Aril); Psoralea corylifolia L. e curcumina)
possuíam atividade
bactericida potencial, ressaltando ainda a importância de estudos in vivo que
forneçam mais dados sobre a administração segurança desses fitoterápicos.
Já foi isolado um composto, sulforafano de isotiocianato, do broto de brócolis
que teve a eficácia comprovada como potente bacteriostático frente a H. pylori,
inclusive contra cepas resistentes, como bactericida intra e extracelular (FAHEY et
al., 2002) e que em modelo animal in vivo reduziu a colonização bacteriana no
estômago, atenuou a expressão do TNF­α e IL­1 e reduziu a inflamação da mucosa
gástrica. Em teste em humanos, foram inseridos brotos de brócolis na alimentação
de pacientes acometidos da infecção pela H. pylori durante oito semanas, resultando
ao final na redução da expressão da urease pela bactéria, detectada pelo teste de
ureia respirada, redução na detecção de antígenos da bactéria e de pepsinogênio,
quando comparado ao placebo (alfafa). Yanaka et al. (2009) sugerem que esse
tratamento parece fornecer uma proteção da mucosa gástrica frente o estresse
oxidativo induzido pela H. pylori.
Em relação a E. spectabile não foi detectada inibição do crescimento da H.
pylori a partir dos extratos avaliados neste estudo. Entretanto esse screnning foi
importante para o estudo inicial dessa bromélia, tendo em vista a existência de
poucos relatos de análise fitoquímica ou de potencial biológico desse vegetal.
Apesar de não impedir a proliferação bacteriana, já foi relatada a atividade do extrato
etanólico da E. spectabile contra úlceras gástricas em modelo animal, sugerindo­se
que esta planta apresenta atividade gastroprotetora, provavelmente a partir dos
compostos fenólicos (CARVALHO et al., 2010). Em outro estudo foi reportada a
detecção de compostos fenólicos totais (64,38 mg/g de amostra) e flavonoides totais
(8,95 mg/g de amostra) no extrato etanólico, o qual mostrou atividade antioxidante
(SANTANA et al., 2011). Até esse momento, apenas um trabalho (SÁ et al., 2012)
utilizando essa espécie vegetal para análise da ação antibacteriana mostrou boa
atividade frente E. coli e Corynebacterium spp., sendo estes dados opostos ao
detectado neste trabalho frente a H. pylori. Apesar de se tratarem de bactérias Gram
negativas, deve­se ressaltar que existem diferenças entre os gêneros bacterianos
avaliados, e que os componentes dos extratos aqui testados não foram capazes de
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Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
inibir a atividade celular da H. pylori, mas esse dado não descarta sua eficácia frente
outras bactérias ou até outros microrganismos.
Quanto à toxicidade determinada pelo ensaio hemolítico foi constatado que o
SCFO a 500 μg/mL apresentou porcentagem de hemólise de 25,04%. Tomando­se
como parâmetro os critérios estabelecidos por Nofiani et al. (2011), a toxicidade do
SCFO nessa concentração pode ser considerada intermediária, uma vez que
aqueles autores consideram como toxicidade elevada porcentagens de hemólise
acima de 40% e baixa toxicidade para valores inferiores a 10%. Por outro lado, em
concentrações abaixo de 100 μg/mL (0,99% de hemólise) o óleo do S. cumini
apresenta baixa toxicidade. Como a CIM foi determinada em 205 μg/mL, tem­se que
a toxicidade hemolítica do SCFO estaria entre 0,99% e 20,07%, as quais
correspondem, respectivamente, as concentrações de 100 e 500 μg/mL. Tal
resultado indica que um possível isolamento do composto ativo do óleo e uma
formulação farmacêutica adequada podem reduzir ainda mais os níveis de
toxicidade apresentados.
Em relação à citotoxicidade em cultura de células foi verificado, para o SCFO,
que em células VERO a viabilidade celular na concentração de 260 μg/mL, próxima
a CIM para a H. pylori, foi de aproximadamente 50%, enquanto que para a linhagem
HeLa, na mesma concentração, a viabilidade ficou em torno de 20%. Considerando­
se a menor viabilidade de células HeLa, que são de origem neoplásica, em
comparação a VERO, que são apenas imortalizadas, novos estudos são
necessários para avaliar se esse fenômeno se deve à toxicidade diferente para
células humanas e de macaco, ou se o óleo apresenta uma toxicidade seletiva para
células neoplásicas. Para isso, são necessários novas análises de toxicidade em
células humanas normais e neoplásicas, estudos moleculares visando determinar o
provável mecanismo de ação, além de ensaios in vivo em modelos animais, visando
a comprovação da eficácia e segurança do seu uso pré­clínico.
Uma vez vencidas todas essas etapas, sendo confirmada a atividade
antineoplásica, esse óleo poderá vir a ser o produto ideal para o tratamento da
infecção pelo H. pylori, caso apresente, concomitantemente, atividade antibacteriana
e antineoplásica, o que seria extremamente desejável. Como a H. pylori está
intimamente relacionada ao desenvolvimento de câncer gástrico, o tratamento com
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Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
uma droga com estas duas propriedades seria eficaz em qualquer estágio da
infecção bacteriana.
Trabalhos sobre a toxicidade de fitoterápicos obtidos do S. cumini são
escassos. Barh e Viswanathan (2008) obtiveram o extrato metanólico da pele da
fruta do S. cumini e detectaram efeito inibitório dose e tempo­dependentes de
células das linhagens HeLa (HPV­18+) e SiHa (HPV­16+) pelo ensaio do MTT e
ainda em outro ensaio (Hoechst 33342) identificaram características de apoptose em
20,5% para HeLa e 16,1% para SiHa tratadas com esse extrato do S. cumini na
concentração de 80% após 48 horas de exposição, sugerindo essa via como
provável mecanismo de ação do referido fitoterápico. Em outro estudo foi detectado
efeito citotóxico em concentrações variando de 0,04 µg/ml a 3 µg/ml dos óleos
essenciais de outros vegetais, Eugenia caryophyllata, Thymus vulgaris e Zataria
multiflora, pelo ensaio do MTT utilizando as linhagens VERO, HepII, HeLa
(RAHIMIFARD et al., 2009). Todavia, ainda são reduzidos os números de
publicações que forneçam dados a respeito da toxicidade em cultura de células de
fitoterápicos e fitofármacos.
Esse foi o primeiro trabalho a avaliar atividade anti­Helicobacter pylori dos
extratos orgânicos obtidos do S. cumini e do E. spectabile e reafirma­se a
importância na continuidade de experimentos mais avançados para a avaliação
detalhada do óleo essencial do S. cumini. Dados fitoquímicos são necessários para
a análise do princípio ativo do SCFO de modo a avaliar uma formulação mais
adequada, que aperfeiçoe sua eficácia antimicrobiana e reduza os danos citotóxicos,
para um futuro emprego pré­clínico.
Além disso, baseado nas informações coletadas no ensaio de toxicidade em
hemácias e células HeLa e VERO, novas abordagens podem ser avaliadas para
incorporar maior conhecimento a este fitofármaco, que seriam avaliações das
atividades antifúngica, antiviral, antimalárica, antineoplásica frente diferentes
linhagens tumorais, além de avaliar a citotoxicidade em células normais originadas
de tecidos diversos, como, por exemplo, em fibroblastos.
Essas informações são úteis à comunidade científica por prover dados
importantes para a possível validação de um fitoterápico assim como trazem a
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Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
chance de conhecimento sobre a segurança de seu emprego por populações e
comunidades, que empiricamente utilizam esses extratos vegetais.
Por fim, todos os dados compilados aqui refletem a importância de cada
estudo que comprove a eficácia como atividade biológica e o posterior estudo
avançado de toxicidade permitindo progressos na terapêutica de uma doença de
importância pública mundial.
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Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
7. CONCLUSÕES
Os extratos orgânicos obtidos das folhas do S. cumini e E. spectabile,
avaliados neste estudo, não foram capazes de inibir o crescimento da H. pylori nas
concentrações testadas.
O óleo essencial extraído das folhas do S. cumini foi eficaz frente à H. pylori
com CIM de 205 μg/mL, apresentando, no entanto, toxicidade intermediária, quanto
à hemólise, e elevada em relação às linhagens de células HeLa e VERO, ao exibir
redução de viabilidade celular de 80% e 50%, respectivamente.
O SCFO mostrou indícios iniciais de que poderá ser uma possível alternativa
ou complementação para o tratamento de infecção pela H. pylori associado ao
câncer, por induzir a morte de células cancerígenas (HeLa) em proporção superior à
citotoxicidade em células não neoplásicas (VERO). Entretanto novas análises mais
minuciosas se fazem necessárias, como a análise fitoquímica o isolamento do
composto ativo e a elaboração de um sistema de liberação de fármacos, para que
esse fitoterápico possa ter efeitos tóxicos avaliados in vivo, podendo proporcionar
sua utilização, futuramente, em testes pré­clínicos.
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Araújo, G.M.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter...
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