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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SINTÉTICOS BIOATIVOS
MARIA DO SOCORRO DE FRANÇA SILVA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO 2-NITRATO-1,3-DIBUTOXIPROPANO
(NDBP) SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR
JOÃO PESSOA – PB
2012
1
MARIA DO SOCORRO DE FRANÇA SILVA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO 2-NITRATO-1,3-DIBUTOXIPROPANO
(NDBP) SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências
da Saúde da UFPB, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de
Doutor em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos.
Área
de
concentração:
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Valdir de Andrade Braga
Co-orientador: Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros
JOÃO PESSOA – PB
2012
2
S586a
Silva, Maria do Socorro de França.
Avaliação dos efeitos do 2-nitrato-1,3dibutoxipropano (NDBP) sobre o sistema
cardiovascular / Maria do Socorro de França Silva.-João Pessoa, 2012.
150f. : il.
Orientador: Valdir de Andrade Braga
Co-orientador: Isac Almeida de Medeiros
Tese (Doutorado) – UFPB/CCS
1. Produtos Naturais. 2. Óxido nítrico –
tolerância.
3. Controle autonômico. 4.
Hipotensão. 5. Bradicardia.
UFPB/BC
547.9(043)
CDU:
3
MARIA DO SOCORRO DE FRANÇA SILVA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO 2-NITRATO-1,3-DIBUTOXIPROPANO
(NDBP) SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR
Aprovado em 03 de agosto de 2012.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Prof. Dr. Valdir de Andrade Braga
Universidade Federal da Paraíba
Orientador
______________________________________________
Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo
Universidade Federal da Paraíba
Examinador interno
______________________________________________
Profa. Dra. Sandra Rodrigues Mascarenhas
Universidade Federal da Paraíba
Examinador interno
______________________________________________
Prof. Dr. Luís Carlos Reis
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Examinador externo
______________________________________________
Prof. Dr. Deoclecio Alves Chianca Júnior
Universidade Federal de Ouro Preto
Examinador externo
4
Dedicatória
5
A minha querida mãe, Iraci Cordeiro, a quem devo
tudo o que sou!
6
Agradecimentos
7
A Deus pelo dom da vida! Pelo amor que me inspira a todo instante e pela presença insubstituível
de todas as pessoas com as quais Ele me presenteou.
Ao meu orientador, Prof. Valdir de Andrade Braga, pela disposição em ensinar com paciência e
competência, sempre me apoiando e incentivando. Não poderia ter tido melhor exemplo de professor e
pesquisador!
Ao professor Isac Almeida de Medeiros, quem primeiro me recebeu em seu laboratório,
possibilitando-me ingressar no mundo da pesquisa.
Ao professor Demétrius Antônio Machado de Araújo, por me abrir as portas do seu laboratório
com prontidão e solicitude.
Aos professores da banca de qualificação e defesa, pois contribuíram significativamente para
melhorar este trabalho.
Aos demais professores do Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos por fazerem parte da minha formação profissional.
Ao professor Petrônio Filgueiras de Athayde Filho e seu aluno Alexsandro Fernandes dos Santos,
pela substância cedida e cooperação ao longo deste trabalho.
A coordenação do PPGPNSB, na pessoa da profa. Dra. Fátima Agra, pelo incentivo constante à
realização de um trabalho com qualidade. Aos funcionários do Programa, meus agradecimentos.
A José Crispim pela amizade, força e disposição em ajudar, sempre quando necessário. A Luís
Cordeiro da Silva e Adriano Cordeiro pelo trabalho realizado no biotério, dando-nos suporte para trabalhar.
A Universidade Federal da Paraíba (UFPB) por possibilitar a realização desta pesquisa. À
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pelo suporte técnico e financeiro.
A todas as pessoas que fazem o Laboratório de Fisiologia Cardiovascular e Controle Neural da
Pressão Arterial, em especial a Matheus Monteiro, Leônidas Júnior e Thyago Queiroz pelo envolvimento
neste trabalho.
A minha mãe e meus irmãos pelo auxílio e incentivo em todos os momentos, das mais variadas
formas. Divido essa conquista com vocês!
Ao meu namorado, Daniel Falcão, por estar sempre comigo, me aconselhando e auxiliando nos
momentos mais necessários. Você tem sido muito importante para essa conquista!
A Melissa Negro Luciano, pela preciosa amizade e ajuda na elaboração desse trabalho! Com você
aprendi muito e sou grata por isso! E a Milena Ramos pela força e ajuda nessa etapa final! A colaboração e
o companheirismo de vocês duas são muito importantes para mim!
8
“A mente que se abre a uma nova ideia
jamais voltará ao seu tamanho original”.
Albert Einstein
9
Resumo
10
Avaliação dos efeitos do 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP)
sobre o sistema cardiovascular. FRANÇA-SILVA, MS. Tese de
Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, UFPB (2012).
RESUMO
Relatos prévios demonstraram que o 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP), um
nitrato orgânico sintetizado a partir da glicerina, induziu vasodilatação em anéis de
artéria mesentérica cranial isolada de rato mediante a ativação da via NO-GMPcPKG, bem como dos canais para K+ e, adicionalmente, causou hipotensão e
bradicardia em ratos normotensos não-anestesiados. O estudo atual teve como
objetivo investigar os efeitos do NDBP sobre o sistema cardiovascular em ratos,
avaliando a liberação de NO eliciada pelo NDBP em células musculares lisas
vasculares, a capacidade do NDBP induzir tolerância ao vasorrelaxamento e o efeito
da administração aguda do composto sobre o controle autonômico de animais
normotensos e hipertensos, por meio de abordagens in vitro e in vivo. Nos
experimentos bioquímicos foi utilizada a cultura de células musculares lisas de aorta
de rato (CMLAR) e, nos experimentos farmacológicos foram utilizados ratos Wistar
ou ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos Wistar Kyoto (WKY).
Foi observado que o NDBP causou um aumento concentração-dependente nos
níveis de NO em CMLAR. Além disso, não houve alteração no efeito vasodilatador
do NDBP quando os anéis de artéria mesentérica foram previamente expostos ao
NDBP, nas concentrações de 10 µM ou 100 µM, sugerindo que o nitrato orgânico em
estudo não induziu tolerância. Nos experimentos in vivo, foi constatado que a
pressão média basal dos animais espontaneamente hipertensos foi
significantemente maior que a do grupo normotenso. A administração aguda do
NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg, i.v.) induziu uma resposta bifásica: hipotensão e
bradicardia seguidas de hipertensão e taquicardia, em ratos SHR e WKY. O bloqueio
dos receptores muscarínicos pela atropina (2 mg/kg) atenuou a bradicardia induzida
pelo NDBP (15 mg/kg), reduzindo também a hipotensão em WKY e SHR. Entretanto,
a resposta pressora ao composto foi potencializada. A secção bilateral do nervo
vago praticamente aboliu a bradicardia em WKY e SHR. Adicionalmente o
hexametônio (30 mg/kg), um bloqueador nicotínico ganglionar, reduziu tanto a
bradicardia quanto a resposta pressora em ambos os grupos. A administração do
azul de metileno (4 mg/kg), um bloqueador da ciclase de guanilil solúvel (CGs),
atenuou as repostas hipotensora e bradicárdica induzida pelo NDBP (15 mg/kg) em
ratos WKY. Evento similar aconteceu nos animais SHR. Esses resultados sugerem
que o NDBP libera NO em CMLAR, sendo incapaz de induzir tolerância ao seu efeito
vasorrelaxante, entretanto, os efeitos cardiovasculares do NDBP são mediados,
principalmente, pela ação central do composto, resultando em alterações na função
autonômica de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos.
Palavras-chave: Óxido nítrico. Tolerância. Controle autonômico. Hipotensão.
Bradicardia.
11
Abstract
12
Evaluation of effects of the 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan
(NDBP) on cardiovascular system. FRANÇA-SILVA, MS. Tese
de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, UFPB (2012).
ABSTRACT
Previous studies have shown that the 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan (NDBP), an
organic nitrate synthesized from glycerin, induced vasorelaxation in mesenteric artery
of rats through activation of the NO-cGMP-PKG pathway and K+ channels, in
addition, caused hypotension and bradycardia in normotensive conscious rats. The
current research aimed to investigate the effects of the NDBP on cardiovascular
system in rats, evaluating the NO release in rat smooth muscle cell culture, the ability
of NDBP to induce tolerance to vasodilatation and the effect of the acute
administration of the compound on autonomic control of blood pressure and heart
rate of normotensive and hypertensive rats, using in vitro and in vivo approaches. For
biochemical determination aortic rat smooth muscle cell culture (ARSMC) was used
and the pharmacological experiments were developed using Wistar rats or
spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Wistar Kyoto (WKY) rats. The
NDBP caused concentration-dependent increases in NO levels in ARSMC. In
addition, NDBP produced no change in the vasorelaxation induced by the NDBP
when the rings were pre-incubated with the NDBP (10 µM or 100 µM), suggesting
that the NDBP did not induce tolerance. In vivo experiments, SHR rats were
significantly hypertensive compared with WKY rats. The acute administration of the
NDBP (1, 5, 10, 15 and 20 mg/kg, i.v.) caused a biphasic response: hypotension and
bradycardia followed by hypertension and tachycardia in WKY and SHR rats. The
blockade of muscarinic receptors with atropine (2 mg/kg) blunted the bradycardia
induced by NDBP (15 mg/kg) and reduced the hypotension in WKY and SHR.
However, the pressor response to the compound was potentiated. Furthermore,
vagotomy almost abolished the bradycardia in WKY and SHR. Moreover,
hexamethonium (30 mg/kg), a nicotinic ganglionic blocker, reduced both bradycardia
and pressor response in WKY and SHR. The administration of methylene blue
(4 mg/kg), a soluble guanylyl cyclase (sGC) blocker, attenuated the hypotension and
bradycardia induced by the NDBP (15 mg/kg) in WKY. Similar event occurred in SHR
animals. In conclusion, the NDBP releases NO in ARSMC, and was unable to induce
tolerance to its vasorelaxant effect, however, the cardiovascular effects of NDBP are
mainly mediated by the central action of the compound, resulting in changes on
autonomic function of spontaneously hypertensive and normotensive rats.
Key-words: Nitric oxide. Tolerance. Autonomic control. Hypotension. Bradycardia.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Representação esquemática da ação do óxido nítrico na célula
muscular lisa vascular.................................................................... 27
Figura 2:
Representação esquemática da ação do NO como
neuromodulador............................................................................. 28
Figura 3:
Estrutura química de alguns doadores de NO..............................
Figura 4:
Estrutura química dos principais nitratos orgânicos.....................
Figura 5:
Estrutura química do 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP)........
37
Figura 6:
Representação esquemática do protocolo experimental para a
avaliação da habilidade do NDBP induzir tolerância em anéis
de artéria mesentérica de rato......................................................
46
Representação esquemática do protocolo experimental para a
avaliação do efeito da administração aguda do NDBP sobre a
PA e a FC.....................................................................................
48
Representação esquemática do protocolo experimental para a
administração do NDBP (15 mg/kg) em ratos SHR e WKY nãoanestesiados antes e após diferentes bloqueios.........................
50
Figura 7:
Figura 8:
Figura 9:
Figura 10:
Figura 11:
Figura 12:
Figura 13:
Efeito do NDBP (10-6 M, 3x10-5 M, 10-4 M) ou NPS (10-7 M)
sobre os níveis de NO expressos como fluorescência relativa
em CMLAR, usando o DAF-2DA..................................................
33
34
52
Fluorescência basal emitida por DAF e pela adição do
nitroprussiato de sódio em CMLAR (A). Fluorescência basal
emitida pela adição do NPS ou NDBP, 10-6 M (B); NPS ou
NDBP, 3X10-5 M (C); NPS ou NDBP 10-4 M em CMLAR..........
53
Efeito do NDBP e NTG nas concentrações de 10 -6 M ou 10-4 M
sobre o nível de NO expresso como fluorescência relativa em
CMLAR, usando o DAF-2DA........................................................
54
Fluorescência basal emitida por DAF e fluorescência emitida
pela adição de diferentes concentrações de nitroglicerina (NTG)
em CMLAR...................................................................................
Traçado representativo do efeito induzido pelo NDBP (10-8 –
10-4 M) em anéis de artéria mesentérica cranial isolada de rato
pré-contraídos com FEN (10 M), sem exposição prévia ao
NDBP (A), após a incubação prévia com o NDBP (10 M) (B), e
grupo controle (C).........................................................................
55
56
14
Figura 14:
Figura 15:
Figura 16:
Figura 17:
Figura 18:
Figura 19:
Figura 20:
Figura 21:
Figura 22:
Figura 23:
Efeito vasorrelaxante do NDBP (10-8 – 10-4 M) em anéis de
artéria mesentérica cranial isolada de rato submetidos à
incubação prévia com o NDBP (10 µM) comparado ao grupo
que não sofreu incubação prévia e ao controle
(veículo)........................................................................................
57
Traçado representativo do efeito induzido pelo NDBP (10-8 –
10-4 M) em anéis de artéria mesentérica cranial isolada de rato
pré-contraídos com FEN (10 M), sem exposição prévia ao
NDBP (A), após a incubação prévia com o NDBP (100 M) (B),
e grupo controle (C)......................................................................
58
Efeito vasorrelaxante do NDBP (10-8 – 10-4 M) em anéis de
artéria mesentérica cranial isolada de rato submetidos à
incubação prévia com o NDBP (100 µM) comparado ao grupo
que não sofreu incubação prévia e ao controle
(veículo)........................................................................................
59
Traçado representativo ilustrando a pressão arterial pulsátil
(PAP), pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca
(FC) em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e
normotensos Wistar Kyoto (WKY)................................................
60
Valores basais de pressão arterial média e frequência cardíaca
em ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) e espontaneamente
hipertensos (SHR)........................................................................
61
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC após a administração aguda do NDBP (1, 5, 10, 15 e
20 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) nãoanestesiados................................................................................
62
Efeito da administração aguda do NDBP (1, 5, 10, 15 e
20 mg/kg, i.v.) sobre a PAM e FC em ratos normotensos Wistar
Kyoto (WKY) não-anestesiados...................................................
63
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC após a administração aguda do NDBP (1, 5, 10, 15 e
20 mg/kg, i.v.) em ratos espontaneamente hipertensos (SHR)
não-anestesiados.........................................................................
Efeito da administração aguda do NDBP (1, 5, 10, 15 e
20 mg/kg, i.v.) sobre a PAM e FC em ratos espontaneamente
hipertensos (SHR) não-anestesiados...........................................
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC em ratos WKY induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e
após a atropina (2 mg/kg).............................................................
64
65
66
15
Figura 24:
Figura 25:
Figura 26:
Figura 27:
Figura 28:
Figura 29:
Figura 30:
Figura 31:
Figura 32:
Figura 33:
Figura 34:
Figura 35:
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC em ratos SHR induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e
após a atropina (2 mg/kg).............................................................
67
Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em
ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) antes e após a atropina
(2 mg/kg)......................................................................................
68
Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em
ratos espontaneamente hipertensos (SHR) antes e após a
atropina (2 mg/kg)........................................................................
69
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC em ratos WKY induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e
após vagotomia............................................................................
70
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC em ratos SHR induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e
após vagotomia............................................................................
71
Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em
ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) antes e após
vagotomia.....................................................................................
72
Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em
ratos espontaneamente hipertensos (SHR) antes e após
vagotomia.....................................................................................
73
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC em ratos WKY induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e
após o hexametônio (30 mg/kg)...................................................
74
Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em
ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) antes e após o
hexametônio (30 mg/kg)...............................................................
75
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC em ratos SHR induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e
após o hexametônio (30 mg/kg)...................................................
76
Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em
ratos espontaneamente hipertensos (SHR) antes e após o
hexametônio (30 mg/kg)...............................................................
77
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC em ratos WKY induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e
após o azul de metileno (4 mg/kg)...............................................
78
16
Figura 36:
Figura 37:
Figura 38:
Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em
ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) antes e após o azul de
metileno (4 mg/kg)........................................................................
79
Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e
FC em ratos SHR induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e
após o azul de metileno (4 mg/kg)...............................................
80
Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em
ratos espontaneamente hipertensos (SHR) antes e após o azul
de metileno (4 mg/kg)...................................................................
81
17
LISTA DE QUADROS
Quadro 1:
Composição da solução nutritiva de Tyrode...............................
42
Quadro 2:
Composição da solução PBS......................................................
42
18
LISTA DE ABREVIATURAS
ACh
Acetilcolina
ALDHm
Aldeído desidrogenase mitocondrial
AMB
Núcleo ambíguos
ATP
Trifosfato de adenosina
bpm
Batimentos por minuto
CaV
Canal de cálcio operado por voltagem
CGs
Ciclase de guanilil solúvel
CE50
Concentração molar de um agonista que produz 50% do efeito
máximo do referido agonista
CMLAR
Células musculares lisas de aorta de rato
DAF
Diaminofluoresceína
DAF-2DA
Diacetato de 4,5-diaminofluoresceína
DAF-2T
Triazolo-diaminofluoresceína
DC
Débito cardíaco
DMEM
Meio de cultura de Eagle modificado por Dubelcco
DMV
Núcleo dorsal motor do vago
ECA
Enzima conversora de angiotensina
Emáx
Efeito máximo
eNOS
Sintase do óxido nítrico endotelial
EROs
Espécies reativas de oxigênio
FACS
Separador de células ativado por fluorescência
FC
Frequência cardíaca
FEN
Cloridrato de L (-) fenilefrina
GABA
Ácido gama-aminobutírico
GMPc
Monofosfato de guanosina cíclico
GSNO
S-nitroso-glutationa
GTP
Trifosfato de guanosina
iNOS
Sintase do óxido nítrico induzível
ISDN
Dinitrato de isossorbida
ISMN
Mononitrato de isossorbida
MAPKs
Proteínas cinases ativadas por mitógenos
19
MLKC
Cinase da cadeia leve da miosina
NADPH
Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina
NDBP
2-nitrato-1,3-dibutoxipropano
nNOS
Sintase do óxido nítrico neuronal
NO
Óxido nítrico
NOS
Sintase do óxido nítrico
NPS
Nitroprussiato de sódio
NTG
Nitroglicerina
NTS
Núcleo do trato solitário
OMS
Organização Mundial da Saúde
PA
Pressão arterial
PAD
Pressão arterial diastólica
PAM
Pressão arterial média
PAP
Pressão arterial pulsátil
PAS
Pressão arterial sistólica
PBS
Tampão fosfato salina
pD2
Logaritmo negativo na base 10 da CE50 de um agonista (- Log CE50)
PETN
Tetranitrato de pentaeritritol
PKG
Proteína cinase dependente de guanina
PMCA
Cá2+-ATPase da membrana plasmática
PVN
Núcleo paraventricular do hipotálamo
RVLM
Núcleo rostral ventrolateral do bulbo
RVPT
Resistência vascular periférica total
SBC
Sociedade Brasileira de Cardiologia
SERCA
Cá2+-ATPase do retículo endosarcoplasmático
SFB
Soro fetal bovino
SFO
Órgão subfornicial
SHR
Ratos espontaneamente hipertensos
SNA
Sistema Nervoso Autonômico
SNC
Sistema Nervoso Central
SRAA
Sistema renina-angiotensina-aldosterona
WKY
Ratos normotensos Wistar Kyoto
As abreviaturas e símbolos citados no trabalho que não constem nesta
relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas.
20
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO................................................................................... 23
1.1
Considerações gerais sobre pressão arterial....................................
1.2
Controle a curto prazo da PA – Papel do Sistema Nervoso
23
Autonômico........................................................................................
24
1.3
Óxido nítrico (NO)..............................................................................
26
1.4
Hipertensão........................................................................................ 30
1.5
Doadores de NO................................................................................
32
1.6
Nitratos orgânicos..............................................................................
34
1.7
Considerações sobre o 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP).......... 36
2
OBJETIVOS.....................................................................................
39
2.1
Objetivo geral.....................................................................................
39
2.2
Objetivos específicos.........................................................................
39
3
MATERIAIS E MÉTODOS................................................................. 41
3.1
Animais............................................................................................
41
3.2
Substâncias-teste..............................................................................
41
3.3
Drogas utilizadas...............................................................................
41
3.4
Soluções nutritivas............................................................................. 42
3.5
Cateteres vasculares.........................................................................
43
3.6
Ensaios bioquímicos in vitro........................................................
43
Medida da produção intracelular de NO em células musculares
lisas de aorta de rato (CMLAR)..............................................................
3.7
43
 Cultura primária de CMLAR....................................................
43
 Incubação do DAF-2DA e protocolos experimentais..............
44
Ensaios farmacológicos in vitro..................................................... 45
Avaliação da habilidade do NDBP em induzir tolerância ao
vasorrelaxamento............................................................................
45
 Preparações de anéis de artéria mesentérica cranial isolada
de rato normotenso.................................................................
45
21
 Verificação da presença do endotélio funcional...................... 45
 Avaliação da atividade vasorrelaxante do NDBP sobre
tecido vascular previamente exposto ao composto................
3.8
46
Ensaios farmacológicos in vivo................................................................................ 47
Efeitos do NDBP sobre o controle autonômico de ratos
espontaneamente
hipertensos
(SHR)
e
seus
controles
normotensos Wistar Kyoto (WKY).................................................
47
 Implantação dos cateteres vasculares.................................................. 47
 Registro da PA e FC...............................................................
47
 Avaliação do efeito da administração aguda do NDBP sobre
a PA e a FC em ratos espontaneamente hipertensos (SHR)
e normotensos Wistar Kyoto (WKY) não-anestesiados..........
48
 Avaliação da influência do bloqueio parassimpático na
resposta induzida pelo NDBP.................................................
49
 Avaliação da influência da vagotomia na resposta induzida
pelo NDBP.........................................................................
49
 Avaliação da influência do bloqueio ganglionar na resposta
induzida pelo NDBP................................................................
49
 Avaliação da influência do bloqueio da ciclase de guanilil
solúvel
nos
efeitos
cardiovasculares
induzidos
pelo
NDBP..................................................................................
49
3.9
Análise estatística............................................................................ 50
4
RESULTADOS..................................................................................
4.1
Produção de óxido nítrico intracelular em cultura de células
52
musculares lisas de rato...................................................................
52
4.2
Avaliação da tolerância elucidada pelo NDBP in vitro................
56
4.3
Efeitos do NDBP sobre o controle autonômico de ratos
espontaneamente
hipertensos
(SHR)
e
seus
controles
normotensos (WKY)........................................................................
60
 Efeitos do NDBP sobre a pressão arterial (PA) e frequência
cardíaca (FC) em ratos não-anestesiados..............................
60
22
 Efeitos do NDBP após bloqueio parassimpático..................... 66
 Efeitos do NDBP após vagotomia...........................................
70
 Efeitos do NDBP após bloqueio ganglionar............................
74
 Efeito do NDBP sobre a PA e a FC após bloqueio da ciclase
de guanilil solúvel (CGs).........................................................
78
5
DISCUSSÃO...................................................................................... 83
6
CONCLUSÕES.................................................................................. 91
7
PERSPECTIVAS...............................................................................
93
REFERÊNCIAS.................................................................................
95
APÊNDICE A – Artigos sobre o NDBP.............................................. 113
ANEXO A – Parecer do CEPA..........................................................
148
23
Introdução
24
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais sobre a pressão arterial
A pressão arterial (PA) corresponde ao produto do débito cardíaco (DC) pela
resistência vascular periférica total (RVPT). O DC é influenciado pelo volume
diastólico final, pela contratilidade miocárdica e pela frequência cardíaca. O volume
diastólico final é o volume que chega à câmara ventricular antes da contração,
sendo determinado pelo volume sanguíneo e tônus muscular venoso que
determinam a pressão venosa. A RVPT, por sua vez, é o resultado de modificações
tensionais no músculo liso vascular (GUYENET, 2006).
A pressão arterial é classificada em pressão arterial sistólica (PAS) e
pressão arterial diastólica (PAD). A pressão sistólica é o maior valor de pressão
mensurado durante um ciclo cardíaco, sendo a pressão na artéria após o sangue ter
sido ejetado do ventrículo esquerdo durante a sístole. Já a pressão diastólica é a
menor pressão arterial medida durante o ciclo cardíaco, sendo a pressão na artéria
durante o relaxamento ventricular quando nenhum sangue é ejetado. A diferença
entre pressão arterial sistólica e pressão diastólica consiste na pressão de pulso,
que reflete o volume de sangue ejetado em cada batimento cardíaco, ou seja, o
volume sistólico (CONSTANZO, 2006).
A partir desses valores de pressão, obtém-se a pressão arterial média
(PAM), pressão em um ciclo cardíaco completo, que é calculada pela soma da
pressão diastólica a um terço da pressão pulsátil. Desse modo, a PAM sofre maior
influência da pressão diastólica que diminui ao longo da árvore arterial, direcionando
o fluxo sanguíneo. O processo aterosclerótico, a redução da complacência arterial
ou o aumento do volume sanguíneo elevam a pressão arterial sistólica, pulsátil e
média, contribuindo para a instalação da hipertensão (CONSTANZO, 2006). Essas
alterações no sistema cardiovascular resultam do desequilíbrio entre os diversos
mecanismos que regulam a pressão arterial.
A regulação da pressão arterial ocorre pela ação integrada do sistema
cardiovascular com os sistemas neural, renal e endócrino, sendo o resultado de
atividades que operam a curto e longo prazo (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA,
2001).
25
O controle da PA a curto prazo é modulado por mecanismos neurais de
controle caracterizados por promoverem ajustes rápidos de pressão arterial e de
frequência cardíaca. Dentre os mecanismos neurais mais importantes para o
controle da pressão arterial destacam-se o reflexo cardiopulmonar, o quimiorreflexo
e o barorreflexo. O controle da pressão arterial a longo prazo é determinado pelo
sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) (COLEMAN, 1980; DAMPNEY et
al, 2002). E, paralelamente, o endotélio vascular também influencia a pressão
arterial
por
meio
contracturantes,
da
como
produção
de
substâncias
prostaglandinas,
vasoativas,
tromboxanos
e
sejam
endotelina,
elas
ou
vasodilatadoras como as prostaciclinas e o óxido nítrico (NO) (BATLOUNI, 2001). A
desregulação nesses mecanismos de controle da pressão arterial está relacionada
com o desenvolvimento da hipertensão.
1.2 Controle a curto prazo da PA – Papel do Sistema Nervoso Autonômico
Os mecanismos neurais de controle da PA resultam em alterações
apropriadas do débito cardíaco, da resistência periférica e do retorno venoso por
meio de mecanismos reflexos. Esta ação reflexa dá-se via sistema nervoso
autonômico (SNA) por meio de suas divisões simpática e parassimpática, e envolve
receptores, aferências, centros de integração, eferências e efetores, além da
liberação de diferentes hormônios. Receptores ao longo do sistema cardiovascular
captam as perturbações na PA e emitem sinais elétricos que são conduzidos pelas
fibras aferentes até o sistema nervoso central (SNC), a partir deste, a resposta é
gerada e transmitida pelas vias eferentes até os órgãos efetores (COLEMAN, 1980;
DAMPNEY, 1994).
No SNC, os neurônios formam redes integradas em regiões distintas
envolvidas com a regulação da pressão arterial. As áreas envolvidas com a
modulação simpática da PA incluem o órgão subfornicial (SFO), o núcleo
paraventricular do hipotálamo (PVN) e o bulbo ventrolateral rostral (RVLM). Por outro
lado, as principais regiões envolvidas com a regulação parassimpática da PA são o
núcleo dorsal motor do vago (DMV) e o núcleo ambíguo (AMB) (FENG et al, 2002).
As divisões simpática e parassimpática do SNA são compostas de neurônios
pré-ganglionares colinérgicos, localizados dentro do SNC que inervam os gânglios
simpáticos para- ou pré-vertebrais; e de glândulas como a adrenal ou redes
26
ganglionares de complexidade diversa como a rede cardíaca, localizadas fora do
SNC. Os gânglios periféricos contêm os neurônios motores, denominados neurônios
ganglionares, que controlam o músculo liso e outros órgãos viscerais. Os neurônios
ganglionares simpáticos que controlam os alvos cardiovasculares são principalmente
noradrenérgicos (BLESSING, 1997; LOEWY; SPYER, 1990).
Nesse sentido, o controle autonômico da pressão arterial opera através de
neurônios pré-ganglionares simpáticos e parassimpáticos que liberam acetilcolina,
responsável por atuar sobre os receptores nicotínicos pós-ganglionares; neurônios
pós-ganglionares parassimpáticos que liberam acetilcolina para atuar em receptores
muscarínicos no coração; e neurônios pós-ganglionares simpáticos, os quais liberam
principalmente noradrenalina e inervam o coração, vasos sanguíneos, rins e
glândula adrenal. O nervo vago é responsável pela inervação parassimpática de
praticamente todos os órgãos abaixo do pescoço, incluindo o coração. Já a
inervação simpática envolve diversos nervos, como o nervo simpático renal, lombar,
dentre outros (HANG, 2005; GUYENET, 2006).
Antagonistas dos receptores nicotínicos da acetilcolina atuam como
bloqueadores ganglionares, impedindo a transmissão parassimpática e simpática à
periferia. Em 1950 essas drogas foram introduzidas no tratamento da hipertensão,
por sua ação simpatolítica, sendo a mecamilamina a primeira a ser utilizada, seguida
do hexametônio, mas que tiveram o uso proibido devido a sérios efeitos colaterais
(SHYTLE et al, 2002). Atualmente o único bloqueador ganglionar utilizado como antihipertensivo é o trimetafan, e o hexametônio tem uso restrito em animais como
ferramenta farmacológica, sobretudo na avaliação do SNA (MURPHY, 1995).
Outras ferramentas farmacológicas utilizadas no estudo da atividade
autonômica incluem a atropina, antagonista competitivo dos receptores muscarínicos
da acetilcolina; o propranolol, antagonista dos receptores β-adrenérgicos; o prazosin,
antagonista dos receptores α-adrenérgicos, dentre outras drogas (LEE et al, 2008;
PATTERSON; O’HAGAN, 2002; KWAN et al, 2003; MURPHY, 1995; YAMADA et al,
2011). Alguns procedimentos como a secção de nervos parassimpáticos e
simpáticos também fornecem importantes informações sobre o funcionamento do
sistema nervoso autonômico.
A
acetilcolina,
noradrenalina
e
adrenalina
são
os
principais
neurotransmissores que operam no SNA, entretanto tem sido demonstrado que
outros neurotransmissores tais como o glutamato, ATP, serotonina, GABA,
27
neuropeptídeo Y e o óxido nítrico, desempenham papel importante nas mudanças
autonômicas via ativação de áreas neurais regulatórias da função cardiovascular
como o núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), o núcleo do trato solitário (NTS)
e o RVLM, em resposta a ativação de reflexos cardiovasculares (BRAGA et al, 2006;
CRUZ et al, 2008; FRANCHINI; KRIEGER, 1993; MAUAD; MACHADO, 1998;
PATON et al, 2008; REDDY et al., 2007).
1.3 Óxido nítrico (NO)
O NO, primeiramente descrito como o fator relaxante derivado do endotélio,
é uma molécula gasosa, inorgânica e incolor que constitui um dos mais importantes
mediadores de processos intra e extracelular. Ele é produzido pela ação da enzima
sintase do NO, da qual há três isoformas: a sintase do NO endotelial (eNOS),
sintase do NO neuronal (nNOS), ambas constitutivas; e a sintase do NO induzível
(iNOS), envolvida em processos inflamatórios (BONAVENTURA et al, 2006; DUSSE
et al, 2003; MAEDA et al, 2004).
O NO é o primeiro mensageiro na via de sinalização NO/GMPc/PKG,
iniciando a cascata de reações de fosforilação em que cada passo é
enzimaticamente amplificado, processo crítico para geração de efeitos fisiológicos. A
L-arginina é oxidada gerando L-citrulina e NO pela ação da NOS, que por sua vez
transfere elétrons do fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (NADPH),
via flavinas (flavina-adenina-dinucleotídeo e flavina-mononucleotídeo) do seu
domínio carboxiterminal redutase, para o grupo heme no domínio oxigenase
aminoterminal. Essa reação requer o cofator tetrahidrobiopterina (BH4) e diversos
mecanismos de ativação (FORSTERMANN; SESSA, 2012; FRANCIS et al, 2010).
Nas células endoteliais, o NO é formado pela isoforma endotelial da sintase do NO,
a eNOS, também denominada NOS III, ativada principalmente pelo complexo
Ca+2/Calmodulina ou outras proteínas como a Akt (FÖRSTERMANN et al, 1995;
GATH; RADI; AUGUSTO, 1996).
Após ser produzido no endotélio, o NO atua nas células musculares lisas
vasculares, tendo como principal alvo a enzima ciclase de guanilil solúvel (CGs). Ao
se ligar a CGs, esta muda de conformação tornando-se ativa e convertendo o
trifosfato de guanosina (GTP) em monofosfato de guanosina cíclico (GMPc). O
GMPc atua em diversos alvos, tais como fosfodiesterases, canais iônicos, proteínas
28
cinases dependentes de GMPc (PKG), e proteínas cinases ativadas por mitógenos
(MAPKs) (ARCHER et al, 1994; CORNWELL et al, 1991).
A PKG promove a fosforilação da cinase da cadeia leve da miosina (MLCK),
ocasionando sua inativação (CORNWELL et al, 1991); da bomba de Ca2+ do retículo
endosarcoplasmático (SERCA), ativando-a e acelerando a recaptação de Ca2+ para
os estoques intracelulares (CORNWELL et al, 1991); da bomba de cálcio da
membrana plasmática (PMCA), favorecendo o efluxo desse íon; do trocador
Na+/Ca2+, promovendo sua ativação; e dos canais para K+ da membrana plasmática,
promovendo sua abertura, o que gera hiperpolarização nas células musculares lisas
com fechamento dos canais para Ca2+ sensíveis à voltagem. Esses eventos
resultam na diminuição da [Ca+2]i e posterior vasorrelaxamento com redução da
resistência vascular periférica, conforme ilustrado na Figura 1 (FURCHGOTT, 1983;
HILGERS;
WEBB,
2005;
IRVINE;
FAVALORO;
KEMP-HARPER,
2003;
VANHOUTTE; BOULANGER, 1995).
Figura 1: Representação esquemática da ação do óxido nítrico na célula muscular lisa vascular. Cav:
Canal de cálcio operado por voltagem. CGs: ciclase de guanilil solúvel. GMPc: monofosfato de
guanosina cíclico. GTP: trifosfato de guanosina. MLCK: cinase da cadeia leve de miosina. NO: óxido
nítrico. PKG: proteína cinase dependente de guanina. SERCA: bomba de cálcio do retículo
2+
endosarcoplasmático. PMCA: Ca -ATPase da membrana plasmática.
29
Além disso, vários autores apresentaram evidências de que o relaxamento
vascular induzido pelo NO pode ocorrer por mecanismo independente do GMPc,
mediante a ativação direta dos canais para K + (BOLOTINA et al, 1994; MISTRY;
GARLAND, 1998; PLANE et al, 1996). Tem sido descrito como outra ação do NO a
sua interação com grupos tióis para formar compostos S-nitrosilados que modulam a
atividade desses canais (BROILLET, 1999).
Desse modo, o NO reduz a resistência vascular periférica, desempenhando
grande papel no controle do tônus vascular e da pressão arterial. Entretanto, o óxido
nítrico também atua pela via GMPC-PKG como um neuromodulador do SNC. Assim
as ações cardiovasculares desta molécula não são restritas a efeitos diretos nos
vasos sanguíneos, mas compreendem efeitos em todo o substrato neural que
contribui para a geração da atividade nervosa autonômica (BREDT et al, 1990;
GARTHWAITE et al, 1988). O NO modula a liberação de neurotransmissores como
mostrado na Figura 2, influenciando a transmissão da atividade autonômica para
órgãos alvo via medula espinhal, junções ganglionares e neuromusculares,
interferindo na descarga simpática e parassimpática à periferia (SCHMITT e
DIRSCH, 2009; ZANZINGER, 1999).
Figura 2: Representação esquemática da ação do NO como neuromodulador. Adaptado de Barreto;
Correia; Muscará (2005). CGs: ciclase de guanilil solúvel. GMPc: monofosfato de guanosina cíclico.
GTP: trifosfato de guanosina. GLUT: glutamato. NO: óxido nítrico. NOS: sintase do óxido nítrico. NT:
neurotransmissores. PKG: proteína cinase dependente de guanina. R NMDA: receptor de glutamato tipo
NMDA.
30
Abordagens experimentais revelaram que a interação do glutamato com o
óxido nítrico no NTS influencia os reflexos cardiovasculares, o que foi embasado
pela evidência da co-localização das isoformas eNOS e nNOS com o glutamato
nesse núcleo (DUN et al., 1994; KROWICKI et al., 1997; LIN et al., 1998, 2007). A
modulação glutamatérgica também é realizada pelo NO na região caudal
ventrolateral do bulbo (CVLM) (ZANZINGER et al, 1997). Atuando em sítios neurais,
específicos, o NO revela efeitos cardiovasculares muitas vezes opostos.
Estudos demonstraram que a produção de NO pela eNOS no NTS induz
hipotensão e bradicardia em ratos não-anestesiados (SAKAI et al., 2000; HIROOKA
et al., 2001, 2003). Por outro lado, autores afirmam que o NO derivado da eNOS
exerce efeitos estimulatórios no NTS (LIN, 2009).
Kishi et al (2001) constataram que a superexpressão da eNOS no RVLM
reduz a pressão arterial e a atividade nervosa simpática direcionada à periferia. Por
outro lado, a superexpressão da iNOS nesse núcleo causa hipertensão e
simpatoexcitação devido ao aumento do estresse oxidativo (KIMURA et al, 2005). As
respostas cardiovasculares diferentes podem ser atribuídas a diferentes quantidades
de NO produzido, o que também foi relatado por Chan et al (2001) e Morimoto et al
(2000).
Horn et al (1994) relataram a ação do NO sobre a liberação de
neurotransmissores, tanto inibitórios quanto excitatórios, no PVN, como o aspartato,
o glutamato e o ácido gama-aminobutírico (GABA) em ratos, o que ratifica o papel
dual do óxido nítrico no sistema nervoso autonômico e a necessidade de maiores
investigações.
Além de efeitos vasculares e neurais, o NO atua diretamente no coração.
Relatos da literatura apontam a produção de NO pelas três isoformas da NOS nas
células
endoteliais,
varicosidades
simpáticas,
fibras
pós-ganglionares
parassimpáticas e nos próprios cardiomiócitos, regulando a função cardíaca. O NO
apresenta efeito inotrópico positivo quando em baixa quantidade e inotrópico
negativo quando se encontra em alta quantidade. Adicionalmente, apresenta
cronotropismo negativo e atenua a sinalização β-adrenérgica em vários modelos
animais (HERRING; PATTERSON, 2001; BALLIGAND et al, 1995).
Devido às ações periféricas do NO na regulação do tônus vascular,
adicionadas à complexa interação do NO com funções autonômicas para a
modulação da pressão sanguínea e frequência cardíaca, mudanças patofisiológicas
31
na síntese e metabolismo desta molécula podem ter consequências diretas na
pressão arterial, acarretando doenças cardiovasculares, dentre elas a hipertensão,
sendo o NO, um potencial alvo terapêutico para o tratamento dessa enfermidade
(RAJAPAKSE; MATTSON, 2009; ZANZINGER, 1999).
1.4 Hipertensão
A hipertensão é um estado alterado da saúde no qual a pressão arterial do
sangue está acima dos valores considerados normais. Um indivíduo é considerado
hipertenso se apresentar valores de PA sistólica ≥ 140 mmHg e∕ou de PA diastólica ≥
90 mmHg em medidas de consultório. O diagnóstico deverá ser sempre validado por
medidas repetidas, em condições ideais, em, pelo menos, três ocasiões
(FIGUEIREDO et al, 2009; MANCIA et al, 2007).
Dados de mais de 194 países revelaram que um em cada três adultos no
mundo inteiro tem pressão arterial elevada, uma condição que provoca cerca de
metade de todas as mortes por derrame cerebral e doenças cardíacas. Tal
característica se faz mais evidente em países de baixa e média renda. Em alguns
países africanos, metade da população adulta tem pressão arterial elevada, onde a
maioria permanece sem diagnóstico, apesar de que, muitos casos poderiam ser
tratados com medicamentos de baixo custo, o que reduziria significativamente o
risco de morte e invalidez por doença cardíaca e/ou derrames. Em países de renda
alta, o diagnóstico, muitas vezes precoce, e tratamento generalizado de baixo custo
com medicamentos surtiram efeito, reduzindo significativamente a pressão arterial
média nessa população, contribuindo assim para uma redução nas mortes por
doenças relacionadas ao sistema cardiovascular (CAIN; KHALIL, 2002; WHO, 2012).
No Brasil, a hipertensão arterial atinge cerca de 30 % da população,
chegando a mais de 50 % nos indivíduos com idade entre 60 e 69 anos e mais de
75 % naqueles acima dos 70 anos, sendo um dos principais fatores de risco
associado à mortalidade no país (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA,
2010).
Na hipertensão são descritas anormalidades funcionais e morfológicas no
coração, músculo liso vascular e no endotélio, além de anormalidades intrínsecas na
função renal (COLEMAM et al, 1975; FOLKOW, 1982). Estas disfunções incluem
aumento da relação parede versus luz das artérias e da resistência periférica,
32
aumento da quantidade da massa cardíaca e muscular lisa, diminuição da
complacência venosa e aumento da vasoconstrição com redução da vasodilatação,
tanto dependente como independente do endotélio vascular (FOLKOW, 1982;
SAFAR et al, 1981).
Alterações
endoteliais
com
elevação
na
síntese
de
substâncias
contraturantes e espécies reativas de oxigênio, bem como a formação ou atividade
reduzida de substâncias vasodilatadoras como o óxido nítrico (NO) estão envolvidas
na patogênese da hipertensão (MARÍN; RODRIGUES-MARTINEZ, 1997; SMITH et
al, 2004).
Além disso, estudos relacionam a participação do aumento da atividade
simpática e a redução da atividade parassimpática à patogênese da hipertensão
(FLORAS et al, 1992; IRIGOYEN et al, 2005; WYSS, 1993). Esses fenômenos
estão bastante relacionados com a disfunção dos reflexos cardiovasculares que
modulam a atividade autonômica sobre a pressão arterial e frequência cardíaca
(DALL'AGO et al, 1999).
Estudos apontam para uma significativa atenuação na sensibilidade do
barorreflexo, tanto em animais quanto em pacientes com hipertensão e o grau de
atenuação tem correlação importante com a severidade da hipertensão (ECKBERG,
1979;
GRASSI;
MANCIA,
1994).
Evidências
experimentais
em
ratos
espontaneamente hipertensos (SHR) indicam que entre nove e quatorze semanas
de idade, o ganho do barorreflexo diminui progressivamente devido às alterações
correspondentes ao intervalo de FC, confirmando a associação entre hipertensão,
hiperatividade simpática e disfunção barorreflexa (DALL'AGO et al, 1999; FLORAS
et al, 1988).
Tanto a hiperatividade simpática quanto o mau funcionamento do
barorreflexo e outros reflexos cardiovasculares são eventos influenciados pelo
estresse oxidativo (BRAGA et al, 2011a; BRAGA et al, 2011b; NUNES et al, 2010), o
qual pode ser reduzido pelo aumento na biodisponibilidade do NO, demonstrando
mais um papel benéfico desta molécula. Nesse contexto, as drogas que mimetizam
o papel desta molécula no organismo, os doadores de NO, podem apresentar efeitos
benéficos frente ao processo hipertensivo.
33
1.5 Doadores de NO
Os doadores de NO são compostos capazes de liberar NO quando
aplicados em sistemas biológicos, reproduzindo a resposta do NO endógeno ou o
substituindo em situações de deficiência (FEELISCH, 1998). Esses compostos
geralmente apresentam um grupo nitroso funcional em sua molécula fornecendo o
NO em condições in vivo e in vitro (BATES et al, 1991).
O modo de liberação de NO difere significativamente entre as classes de
doadores, bem como a sua reatividade química. Alguns doadores liberam NO de
forma espontânea ou não-enzimática, enquanto outros requerem catálise enzimática
para liberá-lo, outros ainda requerem a interação com tióis, ácidos ou metais,
reações de oxidação ou redução para liberarem esta molécula (ACHIKE et al.,
2003).
Um doador de NO atualmente utilizado na clínica é o nitroprussiato de sódio
(NPS) (Figura 3), um complexo inorgânico com grupo ferroso, administrado para
reduzir rapidamente a pressão arterial em pacientes com crises hipertensivas, sendo
também o fármaco de escolha em estudos pré-clínicos e clínicos, reconhecido como
padrão na vasodilatação independente do endotélio. O mecanismo de liberação de
NO a partir do NPS em tecidos biológicos não ocorre de forma espontânea e
necessita de moléculas teciduais específicas, tais como a cisteína e a glutationa,
que contêm grupos sulfidril em sua estrutura, além de requerer a irradiação pela luz
ou redução de elétrons (BUTLER; MEGSON, 2002; FEELISCH, 1998; GROSSI;
D’ANGELO, 2005). A principal limitação do uso do NPS é a liberação de cianeto
(CN-), que causa toxicidade celular pronunciada (ARNOLD; LONGNECKER;
EPSTEIN, 1984; WANG et al, 2002).
Os diazeniodiolatos, conhecidos como NONOatos (DEA/NO, Figura 3), são
doadores de NO que apresentam um grupo diolato [N(O-)N=O] ligado a um
nucleófilo, geralmente aminas primárias ou secundárias, via um átomo de nitrogênio
(MARAGOS et al., 1991). Estes liberam NO espontaneamente e, por isso, são
atrativos para estudos experimentais, uma vez que sua decomposição não depende
de tióis ou quaisquer tecidos biológicos. Exercem atividade vasorrelaxante e
apresentam efeitos benéficos na prevenção de trombos e lesões vasculares,
entretanto, não são utilizados na clínica (KAVDIA et al., 2003; KAUL et al, 2000;
MORLEY; KEEFER, 1993; MILLER; MEGSON, 2007).
34
Os S-nitrosotióis (RSNO) são compostos que contém um grupo nitroso
ligado ao enxofre de um grupo tiol. Muitos deles são sintetizados, mas outros podem
ocorrer naturalmente, como a S-nitroso-glutationa (GSNO, Figura 3). Esses
compostos são derivados de aminoácidos, peptídeos e proteínas e funcionam como
estoques de NO, que pode ser liberado quando requeridos (STAMLER et al., 1992).
Vários fatores liberam NO dos S-nitrosotióis, incluindo luz, calor, metais de transição,
superóxidos, tióis adjacentes e enzimas, tais como xantina oxidase, superóxido
dismutase e diversas desidrogenases (AL-SA’DONI; FERRO, 2000; BUTLER et al.,
1998; LIU L et al., 2001).
Figura 3: Estrutura química de alguns doadores de NO (MILLER; MEGSON, 2007).
As oximas liberam NO de modo espontâneo ou por meio de enzimas
dependentes da NADPH; e por fim, os nitratos orgânicos, liberam NO por
mecanismos não-enzimáticos, incluindo hidrólise e nitrosação, reações com tióis, luz
e aquecimento, ou ainda via ação enzimática. Enzimas citosólicas, microssomais ou
ligadas à membrana são envolvidas na metabolização dos nitratos orgânicos
(FEELISCH, 1998; WANG et al, 2002).
35
1.6 Nitratos orgânicos
Os nitratos orgânicos são ésteres de ácido nítrico de álcoois mono- ou polihídricos (CSONT; FERDINANDY, 2005). Descobertos há mais de um século, esses
compostos são os doadores de NO mais conhecidos e comumente utilizados na
prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares, sendo capazes de reduzir a
pré-carga e pós-carga. Os principais constituintes dessa classe incluem o trinitrato
de gliceril, também conhecido por nitroglicerina (NTG); o mononitrato de isossorbida
(ISMN); dinitrato de isossorbida (ISDN) e o tetranitrato de pentaeritritol (PETN),
apresentados na Figura 4 (KOJDA et al, 1995; MILLER ; MEGSON, 2007).
Figura 4: Estrutura química dos principais nitratos orgânicos (MILLER; MEGSON, 2007).
A nitroglicerina é o protótipo desse grupo e, a aldeído desidrogenase
mitocondrial (ALDHm) foi identificada como a principal enzima envolvida na
biotransformação desse nitrato orgânico a 1,2-gliceril-dinitrato e NO2. A atividade da
ALDHm exerce papel central no vasorelaxamento induzido por NTG in vitro e
hipotensão in vivo e, a presença de inibidores dessa enzima cessa o
vasorelaxamento, da mesma forma que a produção de 1,2-gliceril-dinitrato (CHEN et
al., 2002; SYDOW et al., 2004; ZHANG et al., 2004).
A NTG é usada principalmente para aliviar a dor aguda associada à angina,
ela melhora o suprimento sanguíneo e o descompasso entre a demanda de oxigênio
e abastecimento nas áreas isquêmicas é rapidamente aliviado. Através dos mesmos
36
efeitos hemodinâmicos, a NTG e outros nitratos orgânicos como o dinitrato de
isossorbida
(ISDN)
e
o
mononitrato
de
isossorbida
(ISMN)
melhoraram
consideravelmente a função ventricular esquerda em pacientes com insuficiência
cardíaca congestiva e, a hipertensão pulmonar. Apresentam efeitos favoráveis sobre
o remodelamento do ventrículo esquerdo após o infarto do miocárdio, bem como
sobre a incidência de isquemia silenciosa (MÜNZEL et al, 2011; SKVARIL, 2000).
Estudos mostram que a administração de nitratos orgânicos é capaz de
amenizar a elevação da pressão arterial e melhorar alterações morfológicas e
funcionais do sistema cardiovascular em diversos modelos de hipertensão como a
hipertensão deficiente de NO, genética ou dependente de sal (BARROS et al, 2002;
TÖRÖK, 2008). Os nitratos orgânicos também são sugeridos como terapia adjuvante
aos inibidores da ECA no tratamento da hipertensão (ELKAYAM, 1996; FUNG,
1993; BODE-BÖGER, 2005)
Oliver et al (2010) demonstraram que a administração oral do ISMN reduziu
significativamente a pressão arterial em pacientes com hipertensão resistente e a
combinação desse nitrato com o inibidor de fosfodiesterases, sildenafil, promoveu
uma redução adicional da pressão arterial.
Estudos em animais mostram que o PETN é associado a efeitos benéficos
contra aterosclerose em coelhos hiperlipidêmicos e à melhora da disfunção
endotelial no diabetes pela redução do estresse oxidativo (SCHUHMACHER et al,
2011).
Todos os benefícios contra doenças cardiovasculares desempenhados
pelos nitratos orgânicos resultam, principalmente, do relaxamento das células
musculares lisas vasculares mediante a liberação de NO. Entretanto, a terapia a
longo prazo com essas drogas resulta no rápido desenvolvimento de tolerância,
limitando sua eficácia (GOYAL et al, 2006; KLEMENSKA; BERESEWICZ, 2009;
YURTSEVEN et al, 2003).
O desenvolvimento de tolerância ao nitrato caracteriza-se pela redução do
seu efeito vasodilatador ou a necessidade de doses mais altas após o uso contínuo,
configurando um fator limitante dessas drogas. Esse fenômeno pode apresentar
várias causas: depleção intracelular de grupos sulfidrilas, alvos do NO; redução da
atividade das enzimas envolvidas com a biotransformação dos nitratos; mecanismos
vasoconstritores; ou elevação das espécies reativas de oxigênio (EROs)
que
37
inativam enzimas envolvidas na liberação de NO (KLEMENSKA; BERESEWICZ,
2009; THADANI, 1997).
A partir da década de 80, abordagens experimentais revelaram que os
nitratos NTG, ISDN, ISMN e PETN induzem tolerância, sendo este último em menor
proporção (FINK; BASSENGE, 1997; JURT et al, 2001). A redução da atividade da
enzima ALDHm e a elevação das EROs são as principais causas de tolerância
induzida por essas drogas (DAIBER et al, 2004). Além disso, o processo de
tolerância está associada ao surgimento de modificações deletérias como a
disfunção endotelial e o aumento ativação simpática (KLEMENSKA; BERESEWICZ,
2009; THADANI, 1997; FUNG, 2004; FUNG, 1992).
Diante dessa problemática, a descoberta e a síntese de novos nitratos
orgânicos incapazes de induzir tolerância tornam-se bastante relevante para o
tratamento de desordens cardiovasculares, incluindo a hipertensão.
Recentemente, o nosso grupo de pesquisa apresentou os efeitos de um
novo nitrato orgânico, o 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP) (Figura 5), obtido a
partir da glicerina, um subproduto da rota de produção do biodiesel (SANTOS, 2009).
1.7 Considerações sobre o 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP)
Atualmente
o
mundo
está
vivendo
o
que
se
chama
"Era
dos
Biocombustíveis", devido à preocupação com o meio ambiente e o potencial
econômico dessas fontes energéticas (SANTOS, 2009). Entre os biocombustíveis,
destaca-se o biodiesel como uma interessante alternativa e, sua produção tem
aumentado nos últimos anos, no entanto, uma preocupação importante é como lidar
com a grande quantidade de subprodutos gerados durante a sua rota de produção.
Um subproduto importante da rota de produção de biodiesel é a glicerina.
Cada 90 m3 de biodiesel produzido são acompanhados por 10 m 3 de glicerina pura,
o que implica um excedente desse material, com grande queda de preços e
problemas ambientais resultantes de seu acúmulo na natureza. O consumo deste
volume extra de glicerina desafia várias indústrias para a sua aplicação em larga
escala, inclusive no desenvolvimento de drogas para o tratamento de doenças
cardiovasculares (KIRK-OTHMER, 2007).
38
Nesse contexto, a partir da glicerina foi sintetizado o 2-nitrato-1,3dibutoxipropano (NDBP). Este produto apresenta peso molecular de 249,304;
fórmula molecular C11H23NO5; e fórmula estrutural mostrada a seguir:
Figura 5: Estrutura química do 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP).
Estudos in vivo demonstraram que o NDBP apresentou efeito hipotensor e
bradicárdico de maneira dose-dependente em ratos normotensos não-anestesiados.
Abordagens in vitro revelaram que o NDBP exerceu atividade vasorrelaxante em
anéis de artéria mesentérica cranial isolada de rato e esse efeito possivelmente
envolveu a liberação de NO em meio fisiológico com posterior ativação da via NOGMPc-PKG, bem como canais para K+ (FRANÇA-SILVA, 2010), demonstrando
atividades promissoras do NDBP sobre o sistema cardiovascular. Entretanto,
estudos relacionados à tolerância medicamentosa induzida pelo NDBP não foram
realizados. Esses estudos são extremamente necessários para a obtenção de um
nitrato orgânico mais eficaz que os já existentes.
Além disso, a evidência de que a hipertensão pode estar associada a
alterações no sistema nervoso autonômico, e o fato de que o NO pode exercer
influência direta sobre o controle autonômico da pressão arterial, reduzindo os
efeitos deletérios de hipertensão, justificam a necessidade de avaliar os efeitos do
NDBP, como um doador de NO, no balanço autonômico de ratos espontaneamente
hipertensos (SHR), e seus controles normotensos Wistar Kyoto (WKY).
39
Objetivos
40
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos do 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP) sobre o sistema
cardiovascular de ratos normotensos e hipertensos por meio de abordagens in vitro
e in vivo.
2.2 Objetivos específicos
Abordagens in vitro

Avaliar a produção de óxido nítrico pelo NDBP em cultura de células
musculares lisas de aorta de rato (CMLAR);

Verificar se o NDBP induz tolerância em preparações de artéria
mesentérica cranial isolada de rato;
Abordagens in vivo

Caracterizar os efeitos da administração aguda do NDBP sobre a
pressão arterial e frequência cardíaca em ratos normotensos Wistar
Kyoto
(WKY)
e
espontaneamente
hipertensos
(SHR)
não-
anestesiados;

Avaliar a influência da administração aguda do NDBP no balanço
autonômico sobre a pressão arterial e frequência cardíaca de animais
WKY e SHR.
41
Material e métodos
42
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar nos experimentos
in vitro e, ratos
espontaneamente hipertensos (SHR) e seus controles normotensos Wistar Kyoto
(WKY) nos experimentos in vivo. Todos os animais foram provenientes do Biotério
Prof. Thomas George, do Centro de Biotecnologia da UFPB.
Esses animais pesaram entre 250 e 300 g e tinham idade entre 12 e 14
semanas. Eles foram mantidos sob condições controladas de temperatura (21 ±
1 ºC) e ciclo claro-escuro de 12 horas (das 6 às 18 horas), com livre acesso à água e
ração (Labina®, Purina). Todos os experimentos desenvolvidos neste estudo foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do CBIOTEC/UFPB, sob
parecer nº 0209/10 (Anexo).
3.2 Substância-teste
O NDBP foi obtido por síntese orgânica a partir da glicerina (SANTOS et al,
2009), e cedido ao projeto pelo laboratório do Prof. Dr. Petrônio Filgueiras de
Athayde Filho, do Departamento de Química da UFPB.
Para a realização dos protocolos experimentais in vitro, imediatamente
antes dos experimentos, o NDBP foi solubilizado em cremofor na proporção de 1:1 e
diluído em água destilada para a concentração de 10 -1 M; ou em solução salina
(0,9%) para a concentração de 20 mg/ml, nos experimentos in vivo. Em seguida
foram diluídos novamente para a concentração ou dose desejada, de acordo com a
necessidade de cada protocolo experimental.
3.3 Drogas utilizadas
Durante a realização dos experimentos foram utilizadas as seguintes
substâncias: azul de metileno; brometo de hexametônio; cloridrato de acetilcolina
(ACh); cloridrato de L(-) fenilefrina (FEN); cremofor; sulfato de atropina, todos
obtidos da Sigma-Aldrich (EUA); diacetato de 4,5-diaminofluoresceína (DAF-2DA)
obtido da Calbiochem (São Paulo, SP, Brasil); cetamina e xilazina, obtidas da Fort
43
Dodge; e sal sódico de heparina, obtido da Roche. As drogas utilizadas nos
experimentos in vitro foram dissolvidas em água destilada e as utilizadas nos
protocolos in vivo foram dissolvidas em salina.
3.4 Soluções nutritivas
Nos protocolos in vitro foram utilizadas soluções nutritivas (pH = 7,4) aeradas
com mistura carbogênia (95% de O2 e 5% de CO2) e mantidas a 37º C.
Na preparação das soluções foram utilizados os seguintes sais: cloreto de
sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de cálcio (CaCl2), cloreto de
magnésio (MgCl2), fosfato de sódio (NaH2PO4), bicarbonato de sódio (NaHCO3) e
glicose (C6H12O6) (SIGMA), cuja composição em milimolar (mM) é descrita no
Quadro 1.
Substância
Concentração (mM)
NaCl
158,3
KCl
4,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaH2PO4
0,42
NaHCO3
10,0
Glicose
5,6
Quadro 1: Composição da solução nutritiva de Tyrode (TANAKA et al, 1999).
Em outra série de experimentos foi utilizada a solução de tampão fosfato
salina, conhecida como PBS, composta de cloreto de sódio (NaCl), cloreto de
potássio (KCl), fosfato de potássio (KH2PO4) e fosfato dissódico (Na2HPO4), cuja
composição em milimolar (mM) é descrita no Quadro a seguir.
Substância
Concentração (mM)
NaCl
137,0
KCl
2,7
KH2PO4
4,17
Na2HPO4
4,3
Quadro 2: Composição da solução PBS.
44
3.5 Cateteres vasculares
Na confecção dos cateteres para os protocolos in vivo, foram utilizados
tubos de polietileno PE-10 (diâmetro interno e externo de 0,28 - 0,61 mm,
respectivamente) de 3 cm de comprimento para o cateter arterial e 2,5 cm para o
cateter venoso, soldados por aquecimento a tubos de polietileno PE-50 (diâmetro
interno e externo de 0,58 - 0,96 mm, respectivamente) de 22 cm. Antes da
canulação, os cateteres foram preenchidos com solução salina (0,9%) + 500 UI de
heparina e a extremidade PE-50 de cada cateter foi obstruída com pino de metal.
3.6 Ensaios bioquímicos in vitro
Medida da produção intracelular de NO em células musculares lisas de aorta
de rato (CMLAR)
O estudo bioquímico utilizando técnicas de citometria de fluxo/ Separador de
Células Ativado por Fluorescência (Citômetro FACS Calibur®, Becton Dickinson,
San Jose, CA, EUA) foi desenvolvido em colaboração com a Profª. Drª. Lia Sumie
Nakao, no Setor de Ciências Biológicas, Centro Politécnico, UFPR, Curitiba-PR.
 Cultura primária de CMLAR
Após a remoção da aorta torácica de ratos, esta foi transferida para PBS
estéril onde os tecidos conjuntivo e adiposo foram removidos. Em seguida, o PBS foi
trocado e a aorta seccionada em pequenos fragmentos de aproximadamente 5 mm.
Com a parte interna voltada pra baixo, os fragmentos foram colocados em
placas de 24 poços com inibidores de crescimento para fibroblastos. Sobre cada
fragmento foi depositado 50 μL de DMEM suplementado com 20% de soro fetal
bovino (SFB) e antibióticos (penicilina e estreptomicina), como descrito previamente
por Kojima et al (1998). Em dias alternados, o meio foi trocado até as células
atingirem confluência de 90% e, após a confluência desejada, as células foram
lavadas com PBS e ressuspensas por tripsina (0,2% por 5 minutos em estufa de
CO2). A suspensão obtida foi coletada em tubos estéreis e centrifugada (5 minutos a
45
2000 rpm). O sobrenadante foi desprezado e adicionou-se DMEM suplementado
com SFB (10%) mais antibióticos ao “pellet”, o qual foi transferido para novas placas
de cultura celular.
 Incubação do DAF-2DA e protocolos experimentais
As CMLAR em confluência foram lavadas com PBS e mantidas em DMEM
sem SFB para os experimentos. DAF-DA (10 μM) foi adicionado e incubado por 5
minutos 37ºC. Em seguida, adicionaram-se as substâncias-teste, que foram
incubadas por 30 minutos a 37 ºC. As células foram lavadas com PBS e tratadas
com tripsina (0,2% em DMEM) por 2 minutos para que fossem desprendidas do
assoalho da placa de 24 poços (P-24).
Logo após a confirmação do desprendimento das células por microscopia
óptica (Microscópio invertido Olympus, aumento de 400x), adicionou-se DMEM
suplementado com SFB a 5% para reduzir a ação da tripsina frente às células. A
seguinte sequência foi repetida por duas vezes: centrifugação (2000 rpm por 5
minutos), remoção do sobrenadante e lavagem com PBS. As suspensões de
CMLAR (~106 células/mL) em PBS foram imediatamente levadas ao Citômetro para
quantificar a fluorescência (excitação: 490 nm e emissão: 530 nm) do interior das
células (XIAO et al., 2006), sendo analisadas 10.000 células.
A biodisponibilidade de NO nas CMLAR foi quantificada por exposição das
amostras biológicas ao NDBP (10-6 M, 3x10-5 M, 10-4 M), ou ainda ao nitroprussiato
de sódio (NPS, 10-7 M) ou nitroglicerina (NTG, 10-6 M ou 10-4 M), os controles
positivos, após pré-incubação com o DAF-2DA. A fluorescência nessas células foi
produzida pela oxidação do DAF-DA em sua forma fluorescente verde, DAF-2T, e os
sinais foram obtidos em histogramas de frequência.
Desse modo, foi possível detectar a concentração de NO sem estimulação
(fluorescência basal), ou seja, na presença do DAF sozinho e, as mudanças na
concentração intracelular de óxido nítrico após o tratamento com o NDBP, NTG ou
NPS foram expressas como a razão entre a fluorescência após os tratamentos (F) e
a fluorescência basal (F0): F/F0. Todos os tratamentos foram realizados em
triplicatas de amostras biológicas.
46
3.7 Ensaios farmacológicos in vitro
Avaliação da habilidade do NDBP em induzir tolerância ao vasorrelaxamento
 Preparações de anéis de artéria mesentérica cranial isolada de rato
normotenso
Os ratos foram eutanasiados e, por meio de uma incisão no abdome do
animal, a artéria mesentérica cranial foi identificada, removida e imediatamente
transferida para a solução de Tyrode, onde o vaso foi dissecado e seccionado em
anéis (1 - 2 mm de comprimento). Os anéis tiveram o endotélio removido por atrito
mecânico entre as paredes internas do vaso e uma haste de metal. Cada anel foi
imerso em cubas contendo solução de Tyrode, a 37º C, gaseificada com uma
mistura de 95% de O2 e 5% de CO2 (carbogênio), para manter o pH relativamente
constante entre 7,2 e 7,4. Em seguida, os anéis foram suspensos verticalmente por
linhas de algodão fixadas a um transdutor de força (DATAQ®, 2008, Insight, Brasil) e
submetidos à tensão basal de aproximadamente 0,75 g, durante 60 minutos para
estabilização. Durante este período a solução do banho foi trocada a cada 15
minutos, para prevenir a interferência de metabólitos e a linha de base ajustada
quando necessário (ALTURA; ALTURA, 1970). Mudanças na tensão isométrica
foram captadas pelo sistema de aquisição (WinDaq/XL, DI 148-U, Insight, Brasil).
 Verificação da presença do endotélio funcional
A presença de endotélio funcional foi verificada pelo relaxamento dos anéis
pré-contraídos com fenilefrina (FEN,10 M) após adição de 10 M de acetilcolina
(ACh). Os anéis com relaxamento superior a 80% sobre a pré-contração com FEN
foram considerados com endotélio funcional (E+). Já os anéis com relaxamento
inferior a 10%, foram considerados sem endotélio funcional (E-) (FURCHGOTT;
ZAWADZKI, 1980). Para esse estudo foram utilizados apenas anéis sem endotélio
funcional. Os demais foram descartados.
47
 Avaliação da atividade vasorrelaxante do NDBP sobre tecido vascular
previamente exposto ao composto
O protocolo de avaliação da tolerância induzida pelo NDBP foi realizado de
acordo com Daiber et al (2004). Após um período de estabilização de 60 minutos e
posterior verificação do endotélio funcional, o NDBP (10 µM ou 100 µM) foi
adicionado ao banho e incubado por 30 minutos. Após este período os anéis foram
lavados e submetidos a um segundo período de estabilização, semelhante ao
anterior. Em seguida, induziu-se uma contração com FEN (10 M) e concentrações
crescentes do NDBP (10-8, 3 x 10-8, 10-7, 3 x 10-7, 10-6, 3 x 10-6, 10-5, 3 x 10-5 e 10-4
M), foram aplicadas de maneira cumulativa para a obtenção de uma curva
concentração-resposta (Figura 7). O relaxamento foi expresso como percentagem
reversa da contração induzida pela FEN. Após a obtenção das curvas concentraçãoresposta, foram calculados os valores de pD2 (-log da CE50) e Emáx (efeito máximo)
das curvas individuais. O relaxamento induzido pelo NDBP em anéis pré-incubados
com o composto foi comparado com o relaxamento dos anéis que não sofreram
exposição prévia ao NDBP. Em outro grupo, os anéis foram incubados apenas com
o cremofor (10 µM ou 100 µM) e o mesmo veículo foi administrado cumulativamente
nas mesmas doses utilizadas do NDBP (10-8 a 10-4 M) após a contração com FEN
(Grupo controle).
Figura 6: Representação esquemática do protocolo experimental para a avaliação da habilidade do
NDBP induzir tolerância em anéis de artéria mesentérica de rato.
48
3.8 Ensaios farmacológicos in vivo
Efeitos do NDBP sobre o controle autonômico de ratos espontaneamente
hipertensos (SHR) e normotensos Wistar Kyoto (WKY)
 Implantação dos cateteres vasculares
Um dia antes dos experimentos foi realizada a implantação dos cateteres
vasculares (canulação). Os animais foram anestesiados com cetamina (75 mg/kg,
i.p.) e xilazina (10 mg/kg, i.p.). Em seguida, foram colocados em decúbito dorsal em
uma prancha cirúrgica. Uma pequena incisão na região inguinal foi realizada,
separando a musculatura para localização do feixe vasculonervoso femoral. A seguir,
artéria e veia femorais foram dissecadas e expostas. A extremidade PE-10 do cateter
arterial foi introduzida em direção à aorta abdominal, via artéria femoral, para registro
dos parâmetros cardiovasculares e em direção à veia cava caudal, por meio da veia
femoral, para administração das drogas. Uma vez implantadas, as cânulas foram
exteriorizadas na região escapular dorsal do rato e fixadas com linha de sutura.
Após a cirurgia, os animais foram acondicionados em gaiolas individuais
mantidas sob condições de temperatura, luminosidade e níveis de ruído controlados
e receberam água e ração ad libitum, durante 24 horas para recuperação.
 Registro da pressão arterial (PA) e frequência cardíaca (FC)
Os registros da pressão arterial e da frequência cardíaca foram realizados em
animais não-anestesiados no dia seguinte à canulação. A cânula arterial,
previamente heparinizada, foi conectada a um transdutor de pressão (Modelo
BRPL2, World Precision Instruments, Sarasota, FL, EUA) acoplado a um
amplificador e conectado a um sistema de aquisição de dados (PowerLab,
ADInstruments, Unit 13, 22 Lexington Drive, BELLA VISTA, NSW, AUSTRALIA). O
software de aquisição e análise de dados foi o Chart 5.0. Esse equipamento de
aquisição permite o registro simultâneo da pressão arterial sistólica, pressão arterial
diastólica, pressão arterial média e frequência cardíaca.
49
 Avaliação do efeito da administração aguda do NDBP sobre a PA e a FC em
ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos Wistar Kyoto
(WKY) não-anestesiados
Após 24 horas da implantação dos cateteres vasculares, os animais foram
mantidos em aclimatação por um período de 30 minutos para estabilização dos
parâmetros cardiovasculares, em seguida, doses do NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg)
foram administradas aleatoriamente por via intravenosa e as alterações na pressão
arterial e na frequência cardíaca foram avaliadas, conforme o protocolo
esquematizado na Figura 7.
Figura 7: Representação esquemática do protocolo experimental para a avaliação do efeito da
administração aguda do NDBP sobre a PA e a FC.
Os valores de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC)
foram computados antes (valores da linha de base) e imediatamente após a
administração de NDBP e suas variações calculadas por meio da seguinte fórmula:
ΔPAM = PAMposterior – PAManterior
Onde:
PAM = Variação dos valores de pressão arterial média (PAM)
PAMposterior = PAM após a administração do NDBP
PAManterior = PAM antes da administração do NDBP
O mesmo cálculo foi realizado para os valores de FC.
Nos experimentos subsequentes, o NDBP foi administrado na dose de
15 mg/kg.
50
 Avaliação da influência do bloqueio parassimpático na resposta induzida pelo
NDBP
A fim de investigar a contribuição da atividade parassimpática nas respostas
induzidas pelo NDBP, a atropina (2 mg/kg), um antagonista dos receptores
muscarínicos (LEE et al, 2008), foi administrado por via intravenosa em ratos SHR e
WKY, e o efeito do NDBP foi avaliado antes e após o bloqueio.
 Avaliação da influência da vagotomia na resposta induzida pelo NDBP
Em
outra
série
de
experimentos,
após
anestesia
com
cetamina
(75 mg/kg, i.p.) e xilazina (10 mg/kg, i.p.), os ratos SHR e WKY foram submetidos à
secção bilateral do nervo vago, procedimento também denominado vagotomia e, as
respostas ao NDBP foram avaliadas antes e após este procedimento cirúrgico.
 Avaliação da influência do bloqueio ganglionar na resposta induzida pelo
NDBP
No intuito de avaliar o efeito do NDBP sobre a atividade simpática dos
animais SHR e WKY, foi administrado o hexametônio (30 mg/kg, i.v.), um bloqueador
nicotínico ganglionar (SHYTLE et al, 2002). O NDBP foi administrado antes e após a
utilização dessa ferramenta farmacológica e as respostas cardiovasculares foram
comparadas.
 Avaliação da influência do bloqueio da ciclase de guanilil solúvel (CGs) nos
efeitos cardiovasculares induzidos pelo NDBP
Para investigar a participação da CGs nos efeitos cardiovasculares in vivo do
NDBP, o azul de metileno (4 mg/kg, i.v.), bloqueador da ciclase de guanilil solúvel
(CGs), foi injetado in bolus nos animais SHR e WKY não-anestesiados. As respostas
ao NDBP antes e após esse bloqueio foram comparadas.
51
Todos os protocolos experimentais in vivo com os diferentes bloqueios estão
representados na Figura 8.
Figura 8: Representação esquemática do protocolo experimental para a administração do NDBP (15
mg/kg) em ratos SHR e WKY não-anestesiados antes e após diferentes bloqueios.
3.9 Análise estatística
Os dados foram expressos como média ± e.p.m. e foram consideradas
diferenças significativas quando p<0,05. Nos experimentos farmacológicos in vitro, o
valor de efeito máximo EMáx foi considerado como a resposta vasorrelaxante máxima
do NDBP à fenilefrina (FEN). As curvas foram obtidas por regressão não-linear, por
meio da qual obteve-se também o pD2.
As análises estatísticas, quando apropriadas, foram realizadas pelo teste t
Student, ANOVA “Two-way” seguida de pós-teste de Bonferroni ou ANOVA “Oneway” seguida do pós-teste de Tuckey e, sendo utilizado o programa GraphPad
Prism, versão 5.0.
Os gráficos de histograma da citometria por fluxo foram
analisados pelo software WinMDI 2.9, utilizando o GraphPad Prism 5.0.
52
Resultados
53
4 RESULTADOS
4.1 Produção de óxido nítrico intracelular em cultura de células musculares
lisas de rato
Em células musculares lisas de aorta de rato (CMLAR), o NDBP (10 -6 M,
3x10-5 M e 10-4 M) foi capaz de aumentar a fluorescência relativa após a incubação
com o DAF-2DA (% fluorescência = 22.0 ± 1.2; 37.9 ± 4.0; 75.8 ± 9.5,
respectivamente, n = 4, p<0,05), da mesma forma que o nitroprussiato de sódio, 10 -7
M (% fluorescência = 24.3 ± 1.8), o controle positivo, demonstrando a produção
intracelular de óxido nítrico (Figura 9). O tratamento com o cremofor (veículo) não
alterou a fluorescência basal emitida pelo DAF (dados não mostrados).
100
Fluorescência ( %)
*
80
60
*
40
*
*
20
PS
10
M
-7
M
N
P
B
D
N
N
D
B
N
P
D
3
B
x
P
10
10
-4
M
-5
M
10
-6
0
-6
-5
-4
-7
Figura 9: Efeito do NDBP (10 M, 3x10 M, 10 M) ou NPS (10 M) sobre os níveis de NO
6
expressos como fluorescência relativa em CMLAR ( 10 /ml) usando o DAF-2DA. Dados
representativos de quatro experimentos em triplicata. A produção basal foi zerada e a diferença foi
colocada como percentagem da fluorescência nos diferentes tratamentos. Valores expressos como
média ± e.p.m. *p<0,05 versus fluorescência basal.
A Figura 10 apresenta um traçado representativo ilustrando o aumento da
fluorescência emitida por DAF causado pelo NDBP em comparação com o
nitroprussiato de sódio (NPS) em CMLAR.
54
A
B
C
D
Figura 10: Fluorescência basal emitida por DAF, e pela adição do NPS em CMLAR (A).
-6
-5
Fluorescência basal emitida pela adição do NPS ou NDBP, 10 M (B); NPS ou NDBP, 3 x 10 M (C);
-4
NPS ou NDBP, 10 M (D) em CMLAR.
55
Não houve diferença estatística entre a produção de óxido nítrico induzida
pelo NDBP e a induzida pela nitroglicerina (NTG), um nitrato orgânico também
utilizado na clínica e que pertence a mesma classe química do NDBP, tanto na
concentração de 10-6 M (22.0 ± 1,2 versus 42.5 ± 11.3, respectivamente) quanto na
concentração de 10-4 M (75.8±9.5 versus 105.7 ± 12.9) (Figura 11).
A
150
Fluorescência ( %)
n.s.
100
*
50
*
0
NDBP 10-6 M
NTG 10-6 M
B
n. s.
Fluorescência ( %)
150
*
100
*
50
0
NDBP 10-4 M
NTG 10-4 M
-6
-4
Figura 11: Efeito do NDBP e NTG nas concentrações de 10 M (A) ou 10 M (B) sobre os níveis de
6
NO expressos como fluorescência relativa em CMLAR ( 10 /ml) usando o DAF-2DA. Dados
representativos de quatro experimentos em triplicata. A produção basal foi zerada e a diferença foi
considerada como percentagem da fluorescência nos diferentes tratamentos. Valores expressos
como média ± e.p.m. *p<0,05 versus fluorescência basal; n. s. – não significante.
56
A Figura 12 apresenta um traçado representativo ilustrando o aumento da
fluorescência emitida por DAF causado pela NTG (10 -6 M, 3 x 10-5 M e 10-4 M) e em
comparação com a produção basal.
Figura 12: Fluorescência basal emitida por DAF e fluorescência emitida pela adição de diferentes
concentrações de nitroglicerina (NTG) em CMLAR.
57
4.2 Avaliação da tolerância elucidada pelo NDBP in vitro
A Figura 13 apresenta os traçados representativos do efeito induzido pelo
NDBP ou cremofor em artéria mesentérica. São mostrados os seguintes grupos: (A)
Grupo FEN, no qual foram adicionadas concentrações cumulativas do NDBP (10 -8 –
10-4 M) após contração induzida por FEN (10 µM), sem incubação prévia; (B) Grupo
FEN + NDBP, no qual os anéis foram incubados com o NDBP (10 M) antes da
contração com FEN (10 µM);
e (C) Grupo Controle, no qual apenas o veículo
(cremofor, 10 M) foi incubado e, adicionado cumulativamente (10-8 – 10-4 M) após
contração induzida por FEN (10 µM).
A
B
C
-8
-4
Figura 13: Traçado representativo do efeito induzido pelo NDBP (10 – 10 M) em anéis de artéria
mesentérica cranial isolada de rato pré-contraídos com FEN (10 M), sem exposição prévia ao NDBP
(A), após a incubação prévia com o NDBP (10 M) (B), e grupo controle (C).
58
O NDBP quando adicionado ao banho de maneira cumulativa (10 -8 – 10-4 M),
promoveu
vasorrelaxamento
concentração-dependente
em
anéis
de
artéria
mesentérica cranial isolada de rato pré-contraídos com FEN, independente do
endotélio funcional (Emáx = 111
4%; pD2 = 5,8
0,06). A exposição prévia dos
anéis ao NDBP (10 µM) não alterou a resposta vasorrelaxante induzida pela adição
cumulativa do composto (Emáx = 113
1%; pD2 = 6,0
0,04). O cremofor não
induziu quaisquer efeitos significativos em preparações controle, como pode ser
visualizado na Figura 14.
Relaxamento (%)
0
Cremofor (10 M)
25
FEN
50
FEN + NDBP (10 M)
75
100
125
150
-8
-7
-6
-5
-4
Log [NDBP] M
-8
-4
Figura 14: Efeito vasorrelaxante do NDBP (10 – 10 M) em anéis de artéria mesentérica cranial
isolada de rato submetidos à incubação prévia com o NDBP (10 µM), comparado ao grupo que não
sofreu incubação prévia e ao controle (veículo). Os pontos na figura representam a média de 7
experimentos e as linhas verticais indicam o e.p.m.
59
A Figura 15 apresenta os traçados representativos do efeito induzido pelo
NDBP ou cremofor, ambos na concentração de 100 µM, em anéis de artéria
mesentérica cranial isolada de rato, nos seguintes grupos: (A) Grupo FEN; (B) Grupo
FEN + NDBP; e (C) Grupo Controle.
A
B
C
-8
-4
Figura 15: Traçado representativo do efeito induzido pelo NDBP (10 – 10 M) em anéis de artéria
mesentérica cranial isolada de rato pré-contraídos com FEN (10 M), sem exposição prévia ao NDBP
(A), após a incubação prévia com o NDBP (100 M) (B), e grupo controle (C).
60
Não houve alteração nos valores de efeito máximo (Emáx) e potência (pD2)
do composto entre o grupo FEN (Emáx = 111
4%; pD2 = 5,8
previamente exposto ao NDBP, 100 µM (Emáx = 111
0,06) e o grupo
6%; pD2 = 5,8
0,07),
indicando que o NDBP não induziu tolerância nessas condições experimentais. O
cremofor (100 µM) também não demonstrou alterações no Grupo Controle
(Figura 16).
Relaxamento (%)
0
25
Cremofor (100 M)
50
FEN
75
FEN + NDBP (100 M)
100
125
150
-8
-7
-6
-5
-4
Log [NDBP] M
-8
-4
Figura 16: Efeito vasorrelaxante do NDBP (10 – 10 M) em anéis de artéria mesentérica cranial
isolada de rato submetidos à incubação prévia com o NDBP (100 µM), comparado ao grupo que não
sofreu incubação prévia e ao controle (veículo). Os pontos na figura representam a média de 7
experimentos e as linhas verticais indicam o e.p.m.
61
4.3 Efeitos do NDBP sobre o controle autonômico de ratos espontaneamente
hipertensos (SHR) e seus controles normotensos (WKY)
 Efeitos do NDBP sobre a pressão arterial (PA) e frequência cardíaca (FC) em
ratos não-anestesiados
A Figura 17 apresenta um traçado representativo de um animal WKY e SHR,
ilustrando a pressão arterial pulsátil (PAP), pressão arterial média (PAM) e
frequência cardíaca (FC) basais.
WKY
SHR
Figura 17: Traçado representativo ilustrando a pressão arterial pulsátil (PAP), pressão arterial média
(PAM) e frequência cardíaca (FC) em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos
Wistar Kyoto (WKY).
62
A pressão arterial média basal dos animais espontaneamente hipertensos e
seus controles normotensos foi de 165 ± 5 mmHg e 105 ± 7 mmHg, respectivamente
(p < 0,0001). Não houve diferença significativa na frequência cardíaca entre os
grupos SHR e WKY (339 ± 18 e 359 ± 19, respectivamente), como pode ser
visualizado na Figura 18.
200
*
PAM
( mmHg)
150
100
50
0
WKY
SHR
400
FC
( bpm)
300
200
100
0
WKY
SHR
Figura 18: Valores basais de pressão arterial média e frequência cardíaca em ratos normotensos
Wistar Kyoto (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR). Valores expressos como média e.p.m.
*p< 0,0001 versus WKY, n = 6, cada.
63
A Figura 19 mostra o traçado representativo de um animal do grupo
normotenso Wistar Kyoto, ilustrando as variações na PAP, PAM e FC após a
administração de diferentes doses do NDBP ou cremofor por via intravenosa.
Figura 19: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC após a administração
aguda do NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) nãoanestesiados. As setas denotam o momento da administração do NDBP nas doses indicadas.
A administração do NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg, i.v.) causou hipotensão
(-4 ± 2, -21 ± 6, -54 ± 6, -62 ± 10, -76 ± 8 mmHg) e bradicardia (1 ± 5, -70 ± 26, -248
± 10, -240 ± 25, -301 ± 29 bpm), seguidas de hipertensão (5 ± 2, 4 ± 1, 6 ± 2, 5 ± 2,
12 ± 3 mmHg) e taquicardia (25 ± 4, 11 ± 10, 55 ± 19, 46 ± 9, 76 ± 16 bpm) de
maneira dose-dependente em ratos WKY (n = 6), como pode ser visualizado na
Figura 20. A administração do cremofor (20 mg/kg) ou salina não alterou os
parâmetros cardiovasculares desses animais. Os valores foram expressos como
variação de pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) antes (valores
da linha de base) e após a administração do NDBP.
64
50
PAM
( mmHg)
0
-50
-100
C
re
m
of
or
m
g/
kg
20
m
g/
kg
15
10
m
g/
kg
g/
kg
m
5
1
m
g/
kg
-150
200
FC
( bpm)
0
-200
of
or
re
m
C
g/
kg
m
20
g/
kg
m
15
10
m
g/
kg
g/
kg
m
5
1
m
g/
kg
-400
Resposta primária ao NDBP
Resposta secundária ao NDBP
Figura 20: Efeito da administração aguda do NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg, i.v.) sobre a PAM e FC
em ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) não-anestesiados. Valores expressos como
média e.p.m. (n = 6).
65
Em animais espontaneamente hipertensos (SHR, n=6), as respostas
hipotensora (-8 ± 1, -20 ± 5, -86 ± 4, -95 ± 5, -118 ± 3 mmHg) e bradicárdica (9 ± 8, 125 ± 37, -252 ± 10, -269 ± 16, -309 ± 18 bpm, n=6) foram mais acentuadas em
comparação ao grupo WKY, bem como a hipertensão (9 ± 2, 15 ± 3, 50 ± 5, 57 ± 4,
60 ± 8 mmHg) e taquicardia (30 ± 10, 45 ± 9, 49 ± 11, 76 ± 15, 110 ± 19 bpm), como
pode ser visualizado na Figura 22. A Figura 21 apresenta o traçado representativo
do grupo SHR após a administração do NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg, i. v.).
Figura 21: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC após a administração
aguda do NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg, i.v.) em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) nãoanestesiados.
66
100
PAM
( mmHg)
50
0
-50
-100
of
or
re
m
C
g/
kg
m
20
g/
kg
m
15
g/
kg
10
m
g/
kg
m
5
1
m
g/
kg
-150
200
FC
( bpm)
0
-200
re
m
of
or
C
m
g/
kg
20
m
g/
kg
15
m
g/
kg
10
g/
kg
m
5
1
m
g/
kg
-400
Resposta primária ao NDBP
Resposta secundária ao NDBP
Figura 22: Efeito da administração aguda do NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg, i.v.) sobre a PAM e FC
em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) não-anestesiados. Valores expressos como média
e.p.m. (n = 6).
67
A partir desses resultados, a dose de 15 mg/kg foi escolhida para os
experimentos subsequentes. A resposta ao NDBP antes de todos os bloqueios
utilizados foram referidas nas figuras como NDBP controle.
 Efeitos do NDBP após bloqueio parassimpático
As Figuras 23 e 24 apresentam os traçados representativos de animais WKY
e SHR, respectivamente, ilustrando as mudanças nos parâmetros cardiovasculares
na ausência e presença da atropina (2 mg/kg).
O bloqueio dos receptores muscarínicos com atropina (2 mg/kg) atenuou a
bradicardia induzida pelo NDBP (15 mg/kg) em ratos WKY (-265 ± 25 versus -48 ± 7
bpm, n = 6, p<0,05) e SHR (-255 ± 9 versus -25 ± 10 bpm, p<0,05, n=6). A
hipotensão também foi atenuada em WKY (-75 ± 9 versus -12 ± 3 mmHg, p < 0,05) e
SHR (-101 ± 6 versus -7 ± 2 mmHg, p < 0,05). Entretanto, a resposta pressora ao
composto foi potencializada em ambos os grupos (35 ± 7 versus 65 ± 4 mmHg em
WKY; 33 ± 10 versus 82 ± 6 mmHg em SHR; p<0,05) como mostrado nas Figuras 25
e 26.
Figura 23: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC em ratos WKY
induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e após a atropina (2 mg/kg).
68
Figura 24: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC em ratos SHR
induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e após a atropina (2 mg/kg).
69
100

PAM
( mmHg)
50
0
*
-50
-100
-150
100
FC
( bpm)
0
-100
*
-200
-300
-400
NDBP controle
NDBP após atropina
Figura 25: Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos Wistar
Kyoto (WKY) antes e após a atropina (2 mg/kg). *p<0,05 versus resposta hipotensora e bradicárdica
controle; versus resposta pressora controle, (n = 6).
70
150

PAM
( mmHg)
100
50
0
*
-50
-100
-150
100
FC
( bpm)
0
*
-100
-200
-300
NDBP controle
NDBP após atropina
Figura 26: Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em ratos espontaneamente
hipertensos (SHR) antes e após a atropina (2 mg/kg). *p<0,05 versus resposta hipotensora e
bradicárdica controle; versus resposta pressora controle, (n = 6).
71
 Efeitos do NDBP após vagotomia
As Figuras 27 e 28 apresentam os traçados de animais representativos do
grupo WKY e SHR, respectivamente, ilustrando as alterações na PAP, PAM e FC
induzidas pelo NDBP antes após a vagotomia.
Foi observado que a secção bilateral do nervo vago praticamente aboliu a
bradicardia em WKY (-136 ± 8 versus -17 ± 2 bpm, n=5, p<0,05) e SHR (-141 ± 9
versus -8 ± 2 bpm, n=6, p<0,05). Após este procedimento cirúrgico, a resposta
hipotensora também foi atenuada em ratos SHR (-66 ± 8 versus -34±11 mmHg,
p<0,05) da mesma forma que em animais WKY (-59 ± 11 versus -35 ± 9 mmHg,
p<0,05) (Figuras 29 e 30).
Figura 27: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC em ratos WKY
induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e após vagotomia.
72
Figura 28: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC em ratos SHR
induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e após vagotomia.
73
0
-20
PAM
( mmHg)
*
-40
-60
-80
-100
0
*
*
FC
( bpm)
-50
-100
-150
NDBP Controle
NDBPapós vagotomia - 0 seg
NDBP após vagotomia - 80 seg
Figura 29: Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos Wistar
Kyoto (WKY) antes e após vagotomia. *p<0,05 versus resposta controle, (n = 5).
74
50
PAM
( mmHg)
* 
0
-50
*
-100
50
*
0
FC
( bpm)
*
-50
-100
-150
-200
NDBP Controle
NDBP após vagotomia - 0 seg
NDBP após vagotomia - 50 seg
Figura 30: Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em ratos espontaneamente
hipertensos (SHR) antes e após vagotomia. *p<0,05 versus resposta hipotensora e bradicárdica
controle; versus resposta inicial à vagotomia, (n = 6).
75
 Efeitos do NDBP após bloqueio ganglionar
A Figura 31 ilustra as alterações na PAP, PAM e FC de um animal
representativo do grupo WKY no qual o NDBP foi administrado antes e após o
hexametônio (30 mg/kg). Em ratos WKY, o bloqueio nicotínico ganglionar com
hexametônio (30 mg/kg, i.v.) aboliu tanto a resposta bradicárdica (-278 ± 23 versus 48 ± 3 bpm, n = 6, p<0,05) quanto a resposta pressora (28 ± 8 versus -9 ± 5 mmHg,
p<0,05) e taquicárdica (74 ± 16 versus -41 ± 12 bpm, p<0,05), induzida pelo NDBP
(15 mg/kg), como pode ser verificado na Figura 32.
Figura 31: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC em ratos WKY
induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e após o hexametônio (30 mg/kg).
76
100
PAM
( mmHg)
50
0
-50
*
* 
-100
-150
200
100
FC
( bpm)
0
-100
*
*
-200
-300
-400
NDBP Controle
NDBP após Hexametônio
Figura 32: Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos Wistar
Kyoto (WKY) antes e após o hexametônio (30 mg/kg). *p<0,05 versus resposta hipotensora e
bradicárdica controle; versus respostas pressora e taquicárdica controle, (n = 6).
77
As respostas pressora e bradicárdica induzidas pelo NDBP (15 mg/kg)
também foram praticamente abolidas em ratos espontaneamente hipertensos (42 ± 7
versus -19 ± 8 mmHg; -285 ± 16 versus -27 ± 19 bpm, respectivamente, n=5;
p<0,05), como apontam as Figuras 33 e 34.
Figura 33: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC em ratos SHR
induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e após o hexametônio (30 mg/kg).
78
100
PAM
( mmHg)
50
0
-50
*
*
-100
-150
100
FC
( bpm)
0
-100
*
-200
-300
-400
NDBP Controle
NDBP após Hexametônio
Figura 34: Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em ratos espontaneamente
hipertensos (SHR) antes e após o hexametônio (30 mg/kg). *p<0,05 versus resposta hipotensora e
bradicárdica controle; versus resposta pressora controle, (n = 5).
79
 Efeito do NDBP sobre a PA e a FC após bloqueio da ciclase de guanilil
solúvel (CGs)
A Figura 35 apresenta o traçado de um animal representativo WKY,
ilustrando as alterações nos parâmetros cardiovasculares induzidas pelo NDBP
antes e após a administração do azul de metileno. Pode-se observar que a
administração in bolus do azul de metileno (4 mg/kg, i.v.), um inibidor da ciclase de
guanilil solúvel, atenuou as respostas hipotensora (-82 ± 6 versus -57 ± 7 mmHg,
p<0,05) e bradicárdica (-322 ± 14 versus -272 ± 11 bpm, n = 6, p< 0.05) do NDBP
em animais WKY (Figura 36).
Figura 35: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC em ratos WKY
induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e após o azul de metileno (4 mg/kg).
80
PAM
( mmHg)
0
-50
*
-100
0
FC
( bpm)
-100
-200
-300
*
-400
NDBP controle
NDBP após azul de metileno
Figura 36: Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em ratos normotensos Wistar
Kyoto (WKY) antes e após o azul de metileno (4 mg/kg). *p<0,05 versus resposta controle, (n = 6).
81
Em animais SHR foram observados resultados similares com relação à
hipotensão (-95 ± 8 versus -70 ± 4 mmHg, p<0,05) e bradicardia (-291 ± 12 versus 235 ± 6 bpm, p<0,05, n=5) (Figuras 37 e 38). Em ambos os grupos, não houve
alterações na resposta secundária ao NDBP, caracterizadas por hipertensão e
taquicardia.
Figura 37: Traçado representativo ilustrando as mudanças na PAP, PAM e FC em ratos SHR
induzidas pelo NDBP (15 mg/kg, i.v.) antes e após o azul de metileno (4 mg/kg).
82
PAM
( mmHg)
0
-50
*
-100
0
FC
( bpm)
-100
-200
*
-300
-400
NDBP Controle
NDBP após azul de metileno
Figura 38: Efeito da administração aguda do NDBP (15 mg/kg, i.v.) em ratos espontaneamente
hipertensos (SHR) antes e após o azul de metileno (4 mg/kg). *p<0,05 versus resposta
controle, (n = 5).
83
Discussão
84
5 DISCUSSÃO
A partir dos resultados obtidos, pôde-se observar que o NDBP apresentou
cinética de liberação de NO similar à nitroglicerina em CMLAR e não induziu
tolerância em preparações de artéria mesentérica isolada de rato normotenso. Além
disso, a infusão intravenosa aguda do NDBP provocou hipotensão e bradicardia
seguidas de hipertensão e taquicardia de maneira dose-dependente. A hipotensão e
bradicardia foram atenuadas pelo bloqueio da atividade vagal no coração ao passo
que a hipertensão e taquicardia foram abolidas após bloqueio nicotínico ganglionar
em ratos normotensos Wistar Kyoto (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR).
Em estudo anterior (FRANÇA-SILVA, 2010), foi demonstrado que o NDBP
promoveu o relaxamento de anéis de artéria mesentérica cranial isolada de ratos
normotensos, e esse efeito possivelmente envolveu a liberação de NO com ativação
da via NO-GMPc-PKG e ativação dos canais para K+. No presente estudo, através
de dosagens bioquímicas foi constatada a liberação de NO induzida pelo NDBP em
células musculares lisas de aorta de rato (CMLAR), corroborando com os resultados
funcionais
previamente
encontrados.
Pôde-se
observar
um
aumento
da
fluorescência nas células incubadas com diferentes concentrações do NDBP, da
mesma forma que nas células tratadas com o nitroprussiato de sódio (NPS) ou
nitroglicerina (NTG).
A liberação de NO pela NTG em células vasculares já havia sido
demonstrada em estudos anteriores por métodos indiretos. Diversos autores
demonstraram a produção de NO a partir da NTG em células musculares lisas de
aorta de rato pelo método de quantificação de nitrito (MISKO et al, 1993; SAKO et al,
1998; SALVEMINI et al, 1993; WEBER et al; 1996). Feelisch; Kelm (1991)
demonstraram a produção de NO a partir da NTG e do ISDN, mediante a conversão
de HBO2 em MetHb induzida por esse gás, tanto as células endoteliais quanto as
células musculares lisas de aorta de porco e rato apresentaram produção
semelhante de NO por esses nitratos orgânicos. Kurz et al (1993), mediram a
.
geração de NO em artéria carótida de cão, por quimioluminescência, utilizando o N 2.
A determinação da fluorescência emitida pelo DAF na presença de NO,
método adotado no atual estudo, permite a evidência direta do NO sob condições
fisiológicas por citometria de fluxo, sendo um método mais adequado em termos de
85
viabilidade e seletividade experimental (NAVARRO-ANTOLIN; LAMAS, 2001). O
diacetato-4,5-diaminofluoresceína (DAF-2DA), a forma permeável à membrana,
entra na célula e sofre a ação de esterases intracelulares para gerar o DAF-2, as
aminas do DAF-2 são reduzidas pelo NO, levando ao aumento da fluorescência
dependente da concentração desta molécula (KOJIMA et al, 1998).
Dessa maneira, pôde-se detectar diretamente o NO liberado pelo NDBP e
observou-se que a cinética de liberação de NO pelo nitrato em estudo foi
semelhante à apresentada pela nitroglicerina (NTG), sugerindo que nessas
condições experimentais, o composto em estudo apresenta a mesma eficácia em
liberar NO que o nitrato orgânico disponível atualmente no mercado.
Convém mencionar, entretanto, que a nitroglicerina e outros nitratos
orgânicos utilizados na clínica, induzem tolerância, efeito caracterizado pela redução
na biotransformação dos nitratos em meio fisiológico, redução da ativação da ciclase
de guanilil solúvel (CGs) e consequente redução da resposta vasorrelaxante
induzida pelos mesmos (BENNETT et al, 1988).
A fim de investigar a capacidade do NDBP em induzir tolerância ao
relaxamento de artéria mesentérica, foram realizados experimentos nos quais a
preparação foi exposta por um longo período de tempo a concentrações diferentes
do NDBP e, em seguida foi avaliado se o tecido vascular desenvolveu tolerância ao
composto. Nas condições experimentais adotadas, observou-se que os anéis, nos
quais o NDBP foi previamente incubado, apresentaram vasorrelaxamento em
resposta à adição cumulativa desse composto (NDBP, 10 -8 M – 10-4 M) similar aos
anéis que não foram pré-expostos ao nitrato, sugerindo que o NDBP não induz
tolerância vascular. Além disso, foi observado que o cremofor não induziu quaisquer
efeitos nos anéis onde ele foi administrado isoladamente.
Em contrapartida, estudos anteriores sobre a NTG e o PETN mostraram que
esses compostos induzem tolerância ao vasorrelaxamento de artérias mesentérica,
femoral e aorta, sendo a principal causa, o aumento nos níveis intracelulares de
EROs, que inibem a ação da enzima ALDHm, envolvida na biotransformação dos
mesmos. A depleção dos grupos sulfidrilas também é referida como causa da
tolerância causada por esses nitratos (DAIBER et al, 2004; IRVINE et al, 2011;
NAKANO et al, 2004). Adicionalmente, o mononitrato de isossorbida (ISMN)
apresentou tolerância à vasodilatação de artéria mesentérica cranial isolada de rato
(Stepanović-Petrović et al, 2004). O dinitrato de isossorbida (ISDN) também
86
apresentou tolerância, mas em menor proporção quando comparado ao ISMN e a
NTG (RADDINO et al, 2010).
Esses dados apontam uma vantagem do NDBP em relação a outros nitratos
orgânicos utilizados na clínica (AHLNER et al, 1987; AHLNER et al, 1988; DAIBER
et al, 2004), e faz do NDBP uma possível estratégia terapêutica para o tratamento
de desordens cardiovasculares tratadas com doadores de NO, como a angina,
isquemia e até mesmo a hipertensão.
Após a confirmação da liberação de NO pelo NDBP e verificada a ausência
de tolerância, buscou-se investigar o significado fisiológico do efeito induzido pelo
NDBP no controle autonômico de animais espontaneamente hipertensos e seus
controles normotensos.
Ratos espontaneamente hipertensos (SHR) constituem um modelo de
hipertensão
amplamente
utilizado
em
estudos
científicos
por
apresentar
características fenotípicas semelhantes às observadas na hipertensão essencial
humana (PINTO et al, 1998). Esse modelo está associado com aumento da
resistência vascular periférica, hipertrofia cardíaca, insuficiência cardíaca, entre
outras desordens (FAZAN Jr et al, 2001). Além disso, a atividade nervosa simpática
é significativamente maior nos ratos espontaneamente hipertensos do que em
normotensos Wistar-Kyoto (WKY) e os baixos níveis de NO contribuem para o
desenvolvimento e manutenção desse modelo de hipertensão. Portanto, animais
SHR foram escolhidos para investigar os efeitos do NDBP na atividade autonômica e
frente ao processo hipertensivo (WYMANN et al 2003; PORTALUPPI et al, 2004).
Inicialmente, a administração de NDBP em ratos SHR e WKY causou uma
hipotensão associada à bradicardia, ao contrário de taquicardia reflexa como
observado na administração de outros doadores de NO, tais como o nitroprussiato
de sódio (NPS) e a nitroglicerina (NTG) (CAPUTI et al., 1980; NEEDLEMAN, 1976).
Diante do efeito observado, utilizou-se a atropina (2 mg/kg), a fim de avaliar
a participação da atividade parassimpática na resposta induzida pelo NDBP (LEE et
al., 2008). A administração aguda de atropina reduziu a bradicardia confirmando o
bloqueio dos receptores muscarínicos no coração, além de atenuar a hipotensão
elucidada pelo NDBP, sugerindo que o NDBP reduz a pressão arterial média,
principalmente pela redução do débito cardíaco. Contrariamente ao resultado do
presente estudo, relatos anteriores demonstraram que os doadores de NO induzem
87
relaxamento do músculo liso vascular e esse efeito é o responsável por promover a
hipotensão em ratos (MUNHOZ et al, 2012; PAULO et al, 2012).
A ação bradicárdica de determinados compostos pode ocorrer por
mecanismos que aumentam a atividade parassimpática ou diminuem a atividade
simpática diretamente no coração ou pela atuação em áreas neurais envolvidas com
a regulação autonômica. É bastante relatada a influência direta de doadores de
óxido nítrico em terminações nervosas vagais cardíacas, o NO liberado atua
mediante a ativação da ciclase de guanilil solúvel (CGs), estimulando a liberação de
acetilcolina e, por outro lado, reduzindo a liberação de noradrenalina a partir das
terminações simpáticas (HERRING; PATERSON, 2001; WANG et al, 2007).
Paralelamente, evidências apontam para a atuação do NO em sítios específicos do
sistema nervoso central (SNC), aumentando a atividade parassimpática direcionada
ao coração, via NO-GMPc com posterior bradicardia, a qual por sua vez mascara a
taquicardia reflexa à hipotensão (FLETCHER et al, 2006; KISHI et al, 2001).
Nesse contexto, a fim de avaliar se a bradicardia induzida pelo NDBP ocorria
por uma ação direta do composto no coração ou devido a sua atuação no SNC, foi
realizada a vagotomia nos animais WKY e SHR. A secção bilateral do vago pôde ser
visualizada pela elevação instantânea na frequência cardíaca dos animais, uma vez
que a atividade parassimpática direcionada ao coração foi bloqueada. Este
procedimento praticamente aboliu a bradicardia induzida pelo NDBP, demonstrando
que a redução da frequência cardíaca provocada pelo composto ocorre devido à
ação neural do NDBP, estimulando a liberação de acetilcolina pelo nervo vago. A
vagotomia também reduziu a hipotensão devido à reversão da bradicardia,
confirmando a capacidade do nitrato em diminuir o débito cardíaco. Esse resultado é
ratificado por diversos estudos que apontam a participação do NO na modulação da
atividade vagal em regiões do sistema nervoso central, chamadas de núcleos
vagais, como o núcleo dorsal motor do nervo vago (DMV), o núcleo ambíguo (AMB)
e o núcleo do trato solitário (NTS) (FENG et al, 2002; ESTEVES, 2000; BABIC,
2008). A ação a nível central do NDBP pode ser viabilizada pelo fato do composto
ser lipofílico e provavelmente atravessar a barreira hematoencefálica do animal.
O NDBP além de induzir hipotensão e bradicardia também foi capaz de
elevar a pressão arterial e a frequência cardíaca em uma resposta secundária bem
característica do composto, a qual foi maior em animais hipertensos quando
comparada aos normotensos. Uma vez avaliada a participação da atividade
88
parassimpática no efeito induzido pelo NDBP, buscou-se investigar o envolvimento
da atividade simpática na ação do mesmo e, para isso foi utilizado o hexametônio.
O
bloqueio
nicotínico
ganglionar
com
o
hexametônio
atenuou
consideravelmente a bradicardia, confirmando os resultados obtidos com a
vagotomia, além de bloquear a hipertensão e taquicardia, como apresentado nas
Figuras 32 e 34. Esses efeitos secundários à administração do NDBP são, pois
atribuídos à estimulação da descarga simpática aos vasos e ao coração. A dose
utilizada
do
hexametônio
(30
mg/kg)
é
bastante
relatada
em
estudos
cardiovasculares como eficaz em bloquear os receptores nicotínicos ganglionares,
impedindo assim a transmissão simpática e parassimpática à periferia (WANG et al,
2010; ZHANG et al, 2008). A efetividade do bloqueio autonômico foi constatada pelo
declínio da pressão arterial sem aumento reflexo na frequência cardíaca. A resposta
acentuada em animais espontaneamente hipertensos possivelmente ocorreu devido
à hiperatividade simpática encontrada nesse grupo de animais aliada ao efeito
próprio do composto.
O NDBP elevou a atividade simpática em animais SHR e WKY
possivelmente por atuar de maneira direta em áreas centrais envolvidas com a
modulação simpática da pressão arterial. Entretanto, estudos locais em áreas
específicas do SNC como o órgão subfornicial (SFO), o núcleo paraventricular do
hipotálamo (PVN) ou o bulbo rostral ventrolateral do bulbo (RVLM) devem ser
realizados para responder a esses questionamentos.
É evidente a existência de contradições no que diz respeito ao efeito do NO
em áreas centrais envolvidas na regulação da pressão arterial. Enquanto diversos
estudos apontam para a elevação da atividade parassimpática mediada por esta
molécula, outras pesquisas demonstram que o NO é capaz de aumentar a atividade
simpática, o que pode ser ratificado pela capacidade do NO em aumentar a
liberação de neurotransmissores tanto excitatórios, como o glutamato, quanto
inibitórios, como o GABA (HORN et al, 1994; WANG et al, 2006). Esses relatos
contraditórios acerca do papel do NO em áreas do SNC são justificados pela
diferença entre as regiões onde o mesmo pode atuar, pela quantidade de NO
produzido ou liberado, pela isoforma da enzima sintase de NO (NOS), ou ainda pelo
modelo animal avaliado (CHOATE; PATERSON, 1999; GUO et al, 2009; KIMURA et
al, 2005; KISHI et al, 2001).
89
Observou-se ainda uma resposta hipotensora residual do NDBP na
presença do hexametônio, a qual pode ser atribuída ao efeito vasodilatador induzido
pelo composto.
A administração in bolus do azul de metileno, um bloqueador da ciclase de
guanilil solúvel (CGs), que por sua vez constitui o principal alvo do NO, causou
pequena atenuação na hipotensão induzida pelo NDBP em ambos os grupos, como
demonstrado nas figuras 36 e 38. Esses dados confirmam os relatos de Feelisch;
Noack (1987), os quais afirmaram que a liberação de NO por nitratos orgânicos é
suprimida pelo azul de metileno, e essa inibição reduz a vasodilatação mediada por
esses compostos e consequentemente seu efeito hipotensor. Outros estudos
demonstraram que o azul de metileno é capaz de atenuar o vasorrelaxamento, como
também a hipotensão induzidos por outros doadores de NO como o NPS,
corroborando com os resultados encontrados (WEI et al., 1992; WANG et al, 1995;
CRESTANI et al, 2008).
O azul de metileno interfere diretamente com a ciclase de guanilil solúvel
(GRUETTER et al, 1981; IGNARRO; KADOWITZ, 1985; GRYGLEWSKI et al, 1992)
via oxidação do centro heme da enzima (MARTIN et al., 1985; TSAI et al., 1983),
reduzindo os níveis de GMPc e assim o efeito mediado pelo NO (MARSHALL et al.,
1988; WOLIN et al., 1990). A dose de azul de metileno utilizada foi baseada em
estudos realizados por Takano et al (2007) e Wang et al (1995). Entretanto, esse
bloqueador apresenta pouca seletividade pela CGs, podendo atuar sobre a NOS;
sobre canais de Na+ sensíveis a voltagem; canais de K+ sensíveis ao Ca2+; além de
receptores e transportadores na membrana plasmática (OZ et al, 2011). Esse fato
justifica, pelo menos em parte, a pequena redução no efeito do NDBP induzida pelo
azul de metileno.
Vale ressaltar ainda que a inibição da CGs causada pelo azul de metileno é
reversível, além disso, a sua administração in bolus e não por infusão contínua,
aliada ao fato do composto ser hidrofílico, o que dificulta sua passagem pela barreira
hematoencefálica, sugere que a inibição mediada pelo azul de metileno
provavelmente ficou restrita à periferia, não inibindo os efeitos centrais induzidos
pelo NDBP, como seria esperado, uma vez que o NO também atua em áreas do
SNC pela ativação da via CGs/GMPc/PKG (GARTHWAITE et al, 1988; ZANZINGER;
CZACHURSKI; SELLER, 1997; ZANZINGER, 1999).
90
Dessa maneira, o azul de metileno inibiu a vasodilatação in vivo provocada
pelo NDBP, reduzindo a hipotensão residual apresentada pelo composto e,
confirmando a contribuição do vasorrelaxamento induzido pelo NDBP além da
redução do débito cardíaco para produzir queda na pressão arterial.
Diante do exposto, foi relatado pela primeira vez que um doador de NO, o
NDBP, induz hipotensão devido à redução do débito cardíaco por estimulação vagal
direta e, concomitantemente, atua provocando uma resposta pressora associada à
taquicardia por estimulação da descarga simpática à periferia. Desse modo, os
efeitos cardiovasculares do NDBP ocorrem principalmente por sua ação a nível
central, na modulação do balanço autonômico sobre a pressão arterial e a
frequência cardíaca de ratos normotensos (WKY) e espontaneamente hipertensos
(SHR) e, em menor proporção por seu efeito vasorrelaxante para provocar
hipotensão.
As descobertas obtidas sobre o efeito do NDBP no controle autonômico,
aliadas ao fato do NDBP não induzir tolerância em preparações vasculares de
artéria mesentérica, encorajam novos estudos para ampliar o conhecimento acerca
do efeito anti-hipertensivo do composto, o que poderá possibilitar avanços em outros
ensaios pré-clínicos e clínicos, considerando que os nitratos orgânicos utilizados
atualmente na clínica apresentam tolerância e outros efeitos indesejáveis, quando
utilizados no tratamento da hipertensão.
91
Conclusões
92
6 CONCLUSÕES

O NDBP libera NO em células musculares lisas de aorta de rato;

O NDBP não induz tolerância vascular em preparações de artéria mesentérica
de rato;

A administração aguda do NDBP induz uma resposta bifásica, caracterizada
por hipotensão e bradicardia, seguidas de hipertensão e taquicardia em ratos
espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos Wistar Kyoto (WKY)
não-anestesiados;

A hipotensão é mediada, em parte, pela redução do débito cardíaco devido à
estimulação direta da atividade vagal direcionada ao coração;

A resposta pressora associada à taquicardia ocorre, pelo menos em parte,
por estimulação da descarga simpática à periferia mediada pelo composto, a
qual é maior em ratos espontaneamente hipertensos (SHR).

As respostas cardiovasculares do NDBP são majoritariamente resultantes da
ação do composto a nível central ao invés de seu efeito vasorrelaxante
periférico.
.
93
Perspectivas
94
7 PERSPECTIVAS
O fato de o NDBP apresentar a mesma cinética de liberação de NO que a
nitroglicerina, nitrato orgânico bastante utilizado na clínica sem, no entanto, causar
tolerância, efeito comum para essa classe de doadores de NO, faz desse composto
uma alternativa potencial para o controle ou tratamento da hipertensão e outras
desordens cardiovasculares, tornando possível a geração de um produto melhor que
os já existentes. Para isso, entretanto, é necessária a realização de outros estudos
pré-clínicos e clínicos a fim de complementar o conhecimento sobre as diversas
propriedades do composto.
A ação dual do NDBP em áreas do SNC envolvidas com a regulação da
pressão arterial amplia a compreensão sobre o mecanismo de ação dos doadores
de NO, possibilitando avanços científicos relacionados ao papel do NO na
modulação autonômica dos parâmetros cardiovasculares.
95
Referências
96
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Apêndice A – Artigos sobre o NDBP
European Journal of Pharmacology 690 (2012) 170–175
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
European Journal of Pharmacology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/ejphar
Cardiovascular pharmacology
The 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan, a new nitric oxide donor, induces
vasorelaxation in mesenteric arteries of the rat$
Maria S. Franc- a-Silva a, Melissa N. Luciano a, Thaı́s P. Ribeiro a, Juliane S.F. Silva a, Alexsandro F. Santos b,
Karime C. Franc- a c, Lia S. Nakao c, Petrônio F. Athayde-Filho b, Valdir A. Braga a,n,1, Isac A. Medeiros a,1
a
~ Pessoa, PB, Brazil
Biotechnology Center, Federal University of Paraı́ba, P.O. Box 5009, 58.051-970 Joao
Department of Chemistry, Federal University of Paraı́ba, Joa~ o Pessoa, PB, Brazil
c
Department of Pathology, Federal University of Paraná, Curitiba, PR, Brazil
b
a r t i c l e i n f o
a b s t r a c t
Article history:
Received 5 April 2012
Received in revised form
19 June 2012
Accepted 20 June 2012
Available online 14 July 2012
The reduced availability of nitric oxide (NO) is associated with cardiovascular diseases. Therefore, NO
donors such as organic nitrates are useful for the treatment of these disorders. The 2-nitrate-1,3dibuthoxypropan (NDBP) is an organic nitrate synthesized from glycerin, which the pharmacological
effects have not been investigated. In this study we evaluated the vasorelaxant effect induced by NDBP
in superior mesenteric artery from rats. In phenylephrine pre-contracted artery rings, NDBP (10 8–
10 4 M) elicited concentration-dependent and endothelium-independent relaxation, which were
attenuated by hydroxocobalamin-HDX (30 mM), a NO extracellular scavenger, and 1-H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-1-one-ODQ (10 mM), an inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC). In addition,
the NDBP-induced relaxation was reduced by non-selective K þ channels blocker KCl (20 mM) or
selective K þ channels blockers such as tetraethylammonium-TEA (BKCa, 1 mM), charybdotoxin-ChTX
(BKCa, 100 nM), glibenclamide (KATP, 1 mM) and 4-aminopyridine-4-AP (KV, 1 mM). In preparations with
ODQ (10 mM) plus TEA (1 mM), the response was virtually abolished. In rat smooth muscle cells culture,
NDBP (10 6–10 4 M) caused concentration-dependent increases in NO levels. These findings suggest
that NDBP causes vasorelaxation through NO generation and activation of the sCG/cGMP/PKG pathway.
& 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords:
Organic nitrate
Nitric oxide
Vasorelaxation
1. Introduction
The nitric oxide (NO) is an important molecule in the modulation of cardiovascular function (Shapoval, 2004). One of its actions
consists of vascular tone regulation by direct vascular smooth
muscle cells relaxation via activation of soluble guanylyl cyclase
(Schmitt and Dirsch, 2009). The vascular tone in turn, is one of the
major determinants of blood flow resistance, playing important
role in blood pressure regulation (Jackson, 2000). Therefore,
dysregulation of the vascular tone contributes to the generation
and maintenance of some cardiovascular diseases, which have
been linked to decreased NO availability (Nassem, 2005).
The mechanisms underlying the vasorelaxation elicited by NO
involve activation of guanylate cyclase (sGC), increasing intracellular levels of cyclic guanosine monophosphate (cGMP) (Archer
et al., 1994), resulting in activation of protein kinase G (PKG),
which is an enzyme responsible for the phosphorylation
$
This work has been funded by ‘‘Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientı́fico e Tecnológico – CNPq‘‘ grant number 304718/2011-4.
n
Corresponding author. Tel./fax: þ 55 83 32167511.
E-mail address: [email protected] (V.A. Braga).
1
These authors are joint last authors.
0014-2999/$ - see front matter & 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ejphar.2012.06.043
of several proteins involved on vasorelaxation (McDonald and
Murad, 1996). Among the targets for PKG, the vascular smooth
muscle K þ channels significantly contribute to vascular tone
regulation and their opening results in cell hyperpolarization or
repolarization due to K þ efflux, followed by subsequent closing of
voltage-dependent Ca2 þ channels, decreasing the intracellular
level of Ca2 þ leading to vasodilatation (Archer et al., 1994;
Gurney, 1994; Haddy et al., 2006; Lovren and Triggle, 1998;
Sand et al., 2006). Nevertheless, several studies documented that
NO may act by a cGMP-independent mechanism, through direct
activation of K þ channels also resulting in vascular relaxation
(Bolotina et al. 1994; Mistry and Garland, 1998; Plane et al.,
1996).
Due to the role of NO in vascular tone regulation, a decrease in
its bioavailability is associated with several cardiovascular diseases (Nassem, 2005), such as hypertension and coronary disease.
In this context, potential NO donors, that mimic the role of
endogenous NO when applied to biological systems, have presented beneficial effects on these disorders. The organic nitrovasodilators, such as glyceril trinitrate and amyl nitrite, currently
used in clinical practice, induce vascular smooth muscle cells
relaxation, improving blood supply and thereby presenting a
beneficial effect against angina pectoris, pulmonary hypertension,
M.S. Franc- a-Silva et al. / European Journal of Pharmacology 690 (2012) 170–175
cardiac ischemia, thrombus formation, among other disorders due
likely to NO release (Goyal et al., 2006; Yurtseven et al., 2003).
Considering the importance of these compounds in treating
cardiovascular diseases, the efforts employed to the discovery
and synthesis of novel NO donors, including organic nitrates, from
different sources is justified.
Therefore, the aim of the present study was to evaluate the
vasorelaxant effect of a glycerin-derived newly synthesized organic
nitrate, the 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan (NDBP) (Fig. 1), on vascular smooth muscle cells of rats and to unravel the underlying
mechanisms involved in its vasorelaxant effect.
2. Material and methods
171
and sodium chloride, according to Fig. 2B. and 3. Obtaining of
2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan: by nitration of 1,3-diether-propan2-ol was originated a compound called 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan (NDBP) (Fig. 2C).
2.2. Preparation of the NDBP
The NDBP was dissolved in a mixture of distilled water and
chremophor and diluted to the desired concentrations with
distilled water. In functional studies, the final concentration of
cremophor never exceeded 0.01% in the bath and had no effect
when tested in control preparations (data not shown).
2.1. Synthesis of the 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan (NDBP)
2.3. Animals
According to Santos (2009), NDBP was synthesized at the
Department of Chemistry at the Federal University of Paraiba.
Its synthesis was divided in three steps: 1. Obtaining haloydrin:
haloydrin(1,3-dichlorine-propan-2-ol) was obtained by reaction
between glycerin and hydrochloric acid (HCl) dry in a reaction
with 70% yield (Fig. 2A). 2. Obtaining 1,3-diether-propan-2-ol:haloydrin was added dropwise into a solution of sodium alkoxide,
this obtained by reaction between metallic sodium and anhydrous alcohol. As a product we obtained 1,3-diether-propan-2-ol
Male Wistar rats (250–300 g), housed under controlled conditions of temperature (2171 1C) and lighting cycle (lights on:
06:00–18:00 h) with water and food (Labinas, PURINA, Brazil) ad
libitum, were used in all experiments. Experiments were conducted in accordance with the Institutional Animal Care and Use
Committee of the Biotechnology Center–Federal University of
Paraı́ba (CEPA 0310X09).
2.4. Drugs
Fig. 1. Structural formula of NDBP.
Phenylephrine chloride, acetylcholine chloride, 1-H-[1,2,4]
oxadiazolo–[4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ), tetraethylammoniumchloride (TEA), charybdotoxin (ChTX), 4-aminopyridine (4-AP) and
glibenclamide were obtained from Sigma-Aldrich (Sa~ o Paulo, SP,
Brazil). Hydroxocobalamin (HDX) was obtained from Bristol-Myers
Squibb (Sa~ o Paulo, SP, Brasil), and Diaminofluorescein diacetate
(DAF-2 DA) from Calbiochems (Sa~ o Paulo, SP, Brasil). ODQ and
glibenclamide were dissolved in DMSO. All other compounds were
dissolved in distilled water.
The composition of the Tyrode’s solution used was (mM): NaCl,
158.3; KCl, 4.0; CaCl2, 2.0; MgCl2, 1.05; NaH2PO4, 0.42; NaHCO3,
10.0; and glucose, 5.6. In depolarizing Tyrode’s solution with KCl
(20 mM), the concentration of Na þ was isosmotically adjusted.
Fig. 2. Synthetic route of 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan (NDBP).
172
M.S. Franc- a-Silva et al. / European Journal of Pharmacology 690 (2012) 170–175
2.5. Evaluation of the vasorelaxant effect induced by NDPB in vitro
After euthanasia, the superior mesenteric artery was isolated,
placed in Tyrode’s solution and dissected in order to make it free
of adhering tissue. In endothelium-denuded experiments,
endothelium was removed by rubbing the intimal surface of the
vessels. Rings with 1–2 mm were obtained and placed in physiological Tyrode’s solution, maintained to 37 1C, gassed with carbogenic mixture (95% O2 and 5% CO2) and kept at pH 7.4. All
preparations were stabilized under a resting tension of 0.75 g for
1 h. The solution was replaced every 15 min in order to prevent
the accumulation of metabolites. The force of contraction was
isometrically recorded by a force transducer (Miobath-4, WPI,
Sarasota, FL, USA) coupled to an amplifier-recorder (Miobath-4,
WPI, Sarasota, FL, USA) and to a computer equipped with an
analog-to-digital converter board as described earlier.
The presence of functional endothelium was assessed by the
ability of acetylcholine (10 mM) to induce more than 80% relaxation
of vessels pre-contracted with phenylephrine (10 mM). Less than
10% of relaxation to acetylcholine was taken as evidence that the
vessel segments were functionally denuded of endothelium. The
preparations were exposed to: (a) hydroxycobalamin (30 mM), a
NO scavenger (Kruszyna et al., 1998); (b) ODQ (10 mM), a soluble
guanylyl cyclase inhibitor (Garthwaite et al., 1995); (c) KCl (20 mM),
a modulator of potassium efflux (Campbell et al., 1996); and (d)
selective blockers for large condutance calcium-sensitive potassium
channel (TEA, 1 mM and ChTX, 100 nM), ATP-sensitive potassium
channel (glibenclamide, 1 mM), and voltage-operated potassium
channel (4-AP, 1 mM) (Adaramoye and Medeiros, 2009; Berg, 2002;
Huang and Kwok, 1997; Mombouli and Vanhoutte, 1997). These
inhibitors were added 30 min before the application of phenylephrine. In the tonic phase of the contraction, NDBP (10 8–10 4 M) was
cumulatively added to preparations until a maximum response to the
drug accumulation was observed as indicated by a plateau response
(approximately 3–5 min). Inhibition was calculated by comparing the
response elicited by NDBP in the absence and presence of inhibitors
or antagonists in the preparation.
(10 mM) for the highest concentration used. Statistical analyses
were performed by Student t-test, two-way ANOVA followed by
Bonferroni’s post-test, or one-way ANOVA with Tukey’s post-test
when appropriate, using a GraphPad Prism& software version 5.0
(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Significance was
considered when Po0.05.
3. Results
3.1. Effect induced by NDBP in arteries pre-contracted with
phenylephrine
Administration of glycerin-derived organic nitrate, NDBP
(10 8–10 4 M), produced concentration-dependent vasorelaxation in phenylephrine pre-contracted superior mesenteric artery
rings isolated from rats in the presence of functional endothelium
(pD2 ¼5.85 70.10; ME¼ 89.573.4%, n ¼6). In addition, removal of
endothelium did not alter the response induced by the compound
(pD2 ¼5.99 70.06; ME¼105.4 72.7%, n ¼6) (Fig. 3).
3.2. Effect of the NO scavenger and soluble guanylyl-cyclase
inhibitor on the relaxation induced by NDBP
In endothelium denuded mesenteric rings pre-treated with
hydroxocobalamin (30 mM), NDBP-induced relaxation was significantly attenuated with reduction of pD2 values, from 5.99 7
0.06–5.3970.12, Po0.05, n ¼6. The maximum effect (ME) also
2.6. Measurements of intracellular NO production in aortic rat
smooth muscle cells culture
Rat vascular smooth muscular cells (VSMC) line were grown in
24-well plates on the F12 medium and supplemented with 10%
fetal bovine serum and antibiotics (penicillin and streptomycin)
as previous described (Kojima et al., 1998). Samples were then
washed twice with phosphate-buffered saline containing bovine
serum albumin and analyzed with 10.000 cells per sample by flow
cytometry using the FACSCalibur equipment (Becton Dickinson, San
Jose, CA, USA). Bioavailability of NO in VSMC line was quantified by
exposing the biological samples to NDBP (10 6, 3 10 5 M, 10 4 M)
or to glyceril trinitrate (GTN), the positive control, for 30 min after
pre-incubation with DAF-2 DA (10 mM) for 5 min at 37 1C. The DAF-2
DA is a fluorescent indicator that enables the direct detection of NO
under physiological conditions by flow cytometry (Navarro-Antolin
and Lamas, 2001). We have detected the concentration of NO release
without stimulation (basal fluorescence) and changes in intracellular
NO concentration after treatments with NDBP or GTN were expressed
as ratio between fluorescence after treatments (F) and basal fluorescence (F0): F/F0. Treatments were performed in biological triplicate.
Values were expressed as mean7S.E.M. and analyzed by a WinMDI
software version 2.9.
2.7. Statistical analysis
Data were expressed as mean 7S.E.M. The maximum effect
was considered as the maximum response to phenylephrine
Fig. 3. Concentration-response curves of NDBP (10 8–10 4) in rat mesenteric
artery rings (n¼ 6). The vasorelaxant effect is expressed as a percentage of
relaxation in phenylephrine-induced contraction. Intact endothelium (K),
Denuded endothelium (J).
Fig. 4. Effect of hydroxocobalamin (30 mM) (n¼6) (~) and ODQ (10 mM) (n ¼7)
(’) on NDBP-induced relaxation in phenylephrine-contracted mesenteric artery
rings (n ¼6). Values are means7 S.E.M. *P o0.05 using two way ANOVA followed
by Bonferroni’s post test.
M.S. Franc- a-Silva et al. / European Journal of Pharmacology 690 (2012) 170–175
173
Fig. 5. A. Effect of KCl 20 mM (~) on NDBP-induced relaxation in phenylephrine-contracted mesenteric artery rings (n ¼9); Effects of TEA 1 mM (~) in B; ChTX 100 nM
(~) in C; 4-AP 1 mM (~) in D, and glibenclamide 1 mM (~) in E on NDBP-induced relaxation in phenylephrine-contracted mesenteric artery rings (n ¼6). Values are
means7 S.E.M. *P o 0.05 using two way ANOVA followed by Bonferroni’s post test.
was reduced (from 105.472.7%–62.8714.9%, Po0.05, n ¼6). In
addition, in the presence of ODQ (10 mM), the response evoked for
NDBP was almost abolished (ME: from 105.472.7% to 15.27
9.2%, Po0.05) (Fig. 4).
3.3. Effect of K þ channels blockers and the combination of ODQ and
K þ channel blocker on the relaxation induced by the NDBP
Pretreatment with KCl (20 mM), a K þ efflux modulator,
significantly attenuated the vasorelaxant response of NDBP. As a
result, KCl (20 mM) shifted to the right the concentrationresponse curve (pD2: 5.14 7 0.13, n¼ 9, Po0.05) and reduced
the maximum effect to 70.6715.1% (Fig. 5A).
Last but not the least, the vasorelaxant responses induced
by increasing concentrations of NDBP (10 8–10 4 M) were
also significantly rightward shifted, when incubated with TEA
(BKCa blocker, 1 mM) (pD2 ¼5.58 70.16, p ¼0.045, n ¼6) and
4-aminopyridine (KV blocker, 1 mM) (pD2 ¼5.59 70.05, p ¼0.48,
n ¼6) (Fig. 5B e 5E). The ChTX (BKCa blocker, 100 nM) was able to
attenuate the NDBP-induced vasodilatation reducing the pD2
values to 5.35 70.07, Po0.05, n¼ 6 and maximum effect to
76.76 74.67%, Po0.05, n¼6, as showed in Fig. 5C. The same
was found in the presence of glibenclamide (KATP blocker, 1 mM)
Fig. 6. Effect of ODQ (~) (10 mM) (n¼ 7) and ODQ (10 mM) plus TEA (1 mM) (n¼6)
(B) on NDBP-induced relaxation in phenylephrine-contracted mesenteric artery
rings (n¼6). Values are means 7S.E.M. *P o0.05 using two way ANOVA followed
by Bonferroni’s post test.
(pD2 ¼5.43 70.08, Po0.05, n ¼6; ME¼78.28 74.67%, Po0.05,
n¼ 6) (Fig. 5D). Moreover, the combination of TEA (1 mM) and
ODQ (10 mM), produced the same effect as when ODQ was
administered alone, eliciting the maximum effect of 6.37 3.6%
and 15.279.2%, respectively, n ¼6 (Fig. 6).
174
M.S. Franc- a-Silva et al. / European Journal of Pharmacology 690 (2012) 170–175
Fig. 7. NO generation in vascular smooth muscle cells (106/ml) estimated using
Diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA). Bar graph showing the effects of glyceryl
trinitrate (GTN, 10 6 10 4 M) as positive control and NDBP (10 6–10 4 M) on
NO levels expressed as relative fluorescence in aortic rat vascular smooth muscle
cells. These data are representative of 3 separate experiments in triplicate, the
production baseline was zeroed and the difference was plotted as percentage of
fluorescence in different treatments. P o 0.05 * versus basal fluorescence; # versus
NDBP (10 6 M) and NDBP (3 10 5 M). Values are shown as mean 7S.E.M.
3.4. Measurements of intracellular NO production after treatment
with NDBP
Based on our observations in isolated vessel preparations, we
quantified the bioavailability of NO using flow cytometry analysis by
quantifying the relative fluorescent using DAF2-DA, which increases
in proportion to the amount of NO released in the vascular smooth
muscle cells. Therefore, in vascular smooth muscle cells line, NDBP
(10 6 M, 3 10 5 M and 10 4 M) was able to increase the relative
fluorescence (22.071.2; 37.974.0; 75.879.5; D% fluorescence,
n¼3), suggesting the production of NO in the culture medium
compared to its control (Fig. 7), corroborating the results obtained in
functional studies. There was no statistical difference between NO
production of NDBP and to that elucidated by GTN (NDBP, 10 6 M:
22.071,2 versus GTN, 10 6 M: 42.5711.3; and NDBP, 10 4 M:
75.879.5 versus GTN, 10 4 M: 105.7712.9).
4. Discussion
The major finding of this work was that the organic nitrate
NDBP, induces vasorelaxation in rat superior mesenteric artery
rings through NO release and subsequently activation of the
NO-GMPc pathway and K þ channels activation.
Relaxing substances synthesized and released by endothelial
layer are involved in the mechanisms of relaxation in vascular
smooth muscle cells. Among those substances is NO, the main
vasodilator produced by endothelium. In addition, relaxation can
also be induced by exogenous NO, obtained from NO donors.
These compounds are able to relax the vessels in a endotheliumindependent fashion. In this context, our data pointed out that
NDBP relaxed the pre-contracted rat mesenteric rings independent of the endothelium. Based on this observation and supported
by the fact that organic nitrates have a history of acting as NO
donors, we investigated a possible involvement of the NO-pathway in the mechanisms underlying NDBP-induced vasorelaxation.
Based on our findings showing that hydroxocobalamin
(30 mM) attenuated the vasorelaxation of NDBP (Fig. 4), we
demonstrated that NO plays a role in the vasodilatation induced
by the tested compound. In addition, in the presence of the
soluble guanylate cyclase inhibitor, ODQ, the NDBP-induced
relaxant response was almost abolished (Fig. 4), further suggesting that the vasorelaxation elicited by NDBP involves NO release
and NO/cGMP pathway activation.
It has been widely reported that organics nitrates cause
vasorelaxation via activation of the soluble guanylyl cyclase
(sGC) by NO, which in turn dose-dependently increases the levels
of cGMP, demonstrating that NO is the effector molecule released
by the nitrovasodilator, being responsible for causing vasorelaxation. Furthermore, the accumulation of cGMP leads to activation
of protein kinases such as PKG. Among the downstream effectors
of PKG for vasorelaxation, K þ channels play an important role in
the regulation of smooth muscle contractility and vascular tone,
being determinant for the homeostasis of blood pressure. On the
other hand, NO can induce vasodilatation by cGMP-independent
mechanism throughout direct action on K þ channels (Bolotina
et al., 1994; Mistry and Garland, 1998; Plane et al., 1996).
In order to investigate whether NDBP-induced vasodilatation
through the NO release could involve the participation of K þ
channels, we incubated some preparations with KCl (20 mM), which
promotes partial blockade of K þ efflux, reducing the relaxation
mediated by the opening of K þ channels (Gurney, 1994). As a result,
increasing the concentration of extracellular K þ from 4 mM to
20 mM significantly altered the vasorelaxant response induced by
NDBP and reduced the maximum effect, suggesting that hyperpolarizing mechanisms mediated by the opening of K þ channels are
part of the effect induced by the compound.
Last but not the least, the vasorelaxant responses induced by
increasing concentrations of NDBP (10 8–10 4 M) were also
significantly rightward shifted, when incubated with tetraethylammonium (TEA, 1 mM), calcium sensitive K þ channel blocker
(ME ¼87.975.8%, Po0.05, n ¼6), as illustrated in Fig. 4.
The concentration of TEA employed in our studies (1 mM) is
known for selectively blocking the large conductance Ca2 þ sensitive K þ channels (Archer et al., 1994). Previous studies
indicate that NO and NO donors activate these channels by
cGMP-dependent protein kinases, by a direct modulation, or by
combining these two mechanisms (Archer et al., 1994; Bolotina
et al., 1994). In support to our data, several studies have demonstrated the activation of BKCa by NO or different NO donors in
others vascular tissues, such as pulmonary and cerebral arteries
(Bialecki and Stinson-Fisher, 1995; Hempelmann et al., 2001).
There is controversy if TEA 1 mM is selective for BKCa, therefore
we used charybdotoxin (ChTX, 100 nM), a BKCa blocker, which is
more selective than TEA, and the vasorelaxation remained attenuated, confirming the participation of BKCa in the effect induced
by NDBP.
In addition to the BKCa channels, it has been reported that NO
hyperpolarizes the membrane through the activation of ATPsensitive K þ channels (KATP) in coronary arteries of humans,
causing vasorelaxation (Farouque et al., 2004). In our experiments, after administration of the well known highly selective
ATP-sensitive K þ channels blocker, glibenclamide, the NDBPinduced vasodilatation was significantly attenuated (Fig. 4), suggesting the involvement of KATP channels in the vasorelaxant
effect produced by the compound. Our data are in accordance to
results reported by Garland and McPherson (1992). However,
Meisheri et al. (1993) reported that glibenclamide did not affect
the relaxation mediated by sodium nitroprusside and NOC-7 in
rat isolated aorta, suggesting that KATP channels do not play a role
in the vasorelaxation mediated by NO donors in aorta. These
divergences could be explained by differences among the NO
donors used, methods employed as well as the vascular tissue
evaluated.
It has been reported that NO also modulate the activity of
voltage-sensitive K þ channels (Archer et al., 1994). The 4-aminopyridine, a selective blocker of these K þ channels, significantly
rightward shifted the curve concentration-response to NDBP
on mesenteric artery rings, confirming the modulation of these
K þ channels by the NO released from NDBP (Fig. 4). The
M.S. Franc- a-Silva et al. / European Journal of Pharmacology 690 (2012) 170–175
vasorelaxation elicited by others NO donors such as DEA-NONOate also was attenuated by K þ channel blocker 4-aminopyridine
(4-AP) in rat basilar arteries (Sampson et al., 2001).
Among those K þ channels involved in the response mediated by
NDBP, the BKCa and KATP appeared to be the most important ones,
since the blockade with charybdotoxin or glibenclamide, respectively, caused the significant effect in attenuating the vasorelaxant
response elicited by the NDBP, being equivalent to the attenuation
produced by the non-selective blockade with KCl (20 mM).
It is important to report that the involvement of K þ channels
in the NDBP-induced vasorelaxation seems to be, mainly, dependent of soluble guanylate cyclase activation, since the administration of ODQ virtually abolished the relaxing effect induced by
the compound. However, residual vasodilatation found in preparations with ODQ alone was reduced when incubated with ODQ
and TEA together, suggesting a direct action of NO in K þ channels.
Corroborating the functional data, it was observed that the NDBP
presents kinetics of NO release in vascular smooth muscle cells
similar to glyceryl trinitrate (GTN), an organic nitrate widely known
with structure suchlike to NDBP and used in the clinics. Although we
have not tested the vasorelaxation effect induced by glycerin
trynitrate, glycerin was used as a positive control for measuring
NO in vascular smooth muscle cells. A series of elegant studies
performed by Miller et al. (2008) aiming to measure NO release
during GTN-induced relaxation reported that GNT was able to
induce relaxation independent on NO release. However, in that
case, authors may have succeed in measuring GTN-derived NO at
lower doses because NO was very diluted in the organ bath. In our
study, NO was directly measure at cell culture level, been much
more sensitive and precise. We believe that, although the potency of
NDBP was smaller than that reported for GTN, both NDBP and GTN
are able to induce vasodilation via NO production/release. Furthermore, the in vivo implications of NDBP organic nitrate as well as its
ability to induce tolerance are under investigation.
5. Conclusion
In summary, here we suggest the NDBP as a new NO generator.
In support of this concept, under our experimental conditions,
NDBP was able to induce relaxation in rat mesenteric rings preconstricted with phenylephrine via NO release and activation of
the sGC/cGMP pathway, with participation of K þ channels. It has
also released NO in vascular smooth muscle cell culture. These
data seem to be exciting, being the NDBP a possible alternative for
cardiovascular diseases treatment; however, several studies
regarding the metabolism of the compound, tolerance and physiological significance of the vasorelaxant activity of NDBP awaits
further investigation before it can be used in clinical trials.
Acknowledgments
The authors are grateful to José Crispim Duarte and collaborators for technical assistance and Matheus Morais de Oliveira
Monteiro for proof reading the final version of the manuscript.
This work has been funded by Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientı́fico e Tecnológico - CNPq grant number 304718/
2011-4.
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The new nitric oxide donor 2-nitrate-1,3-dibuthoxypropan alters
autonomic function in spontaneously hypertensive rats
Maria S. França-Silva1, Matheus M. O. Monteiro1, Thyago M. Queiroz1,
Alexsandro F. Santos2, Petrônio F. Athayde-Filho2 and Valdir A. Braga1
1
Biotechnology Center, Federal University of Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil;
2
Department of Chemistry, Federal University of Paraíba, João Pessoa, PB,
Brazil.
Running head: NDBP and autonomic control in hypertension
Corresponding author:
Valdir de Andrade Braga, DVM PhD
Biotechnology Center, Federal University of Paraiba
P.O. Box 5009, 58.051-970, João Pessoa, PB, Brazil.
E-mail: [email protected]
Phone: (55) 83 3216-7511
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ABSTRACT
Previously, we found that the nitrate synthesized from glycerin, 2-nitrate-1,3dibuthoxypropan (NDBP), increased NO levels in rat aortic smooth muscle cells,
inducing vasorelaxation in mesenteric artery. However, its effects on blood
pressure and heart rate as well as on autonomic function were not investigated.
This study evaluated the action of NDBP on these cardiovascular parameters in
spontaneously hypertensive (SHR) and Wistar Kyoto (WKY) rats. We found that
NDBP causes a biphasic response: hypotension and bradycardia followed by
hypertension and tachycardia in WKY and SHR rats.
Atropine (2 mg/kg)
blunted the hypotension induced by NDBP (15 mg/kg) in WKY and SHR (-75±9
vs -12±3 mmHg, n=6; -101±6 vs -7±2 bpm, n=6; respectively, p<0,05) and the
pressor response to the compound was potentiated. Furthermore, vagotomy
reduced the bradycardia in WKY and SHR (-136±8 vs -17±2, n=4, p<0.05; 141±9 vs -8±2, n=6, p<0.05). Moreover, hexamethonium (30 mg/kg) reduced
both bradycardia (-278±23 vs -48±3 in WKY; -285±16 vs -27±19 in SHR, n=4;
p<0.05) and pressor response (28±8 vs -9±5-WKY, n=6; 42±7 vs -19±8-SHR,
n=5; p<0.05). In addition, administration of methylene blue (4 mg/kg) attenuated
the hypotensive and bradycardic responses to the NDBP in all groups. In
conclusion, NDBP induces bradycardia by direct vagal stimulation and pressor
response by increasing sympathetic outflow to the periphery.
Keywords: nitric oxide, hypertension, bradycardia, autonomic function
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1. Introduction
Hypertension is a multifactorial disorder, which in a majority of cases is
a result of changes in several mechanisms that regulate the blood pressure.
Studies suggest that changes in reflex control of blood pressure are involved in
the development and maintenance of hypertension (Smith et al., 2004).
Endothelial alterations with enhanced generation of contractile substances,
reactive oxygen species and reduced formation or activity of nitric oxide (NO)
also may be involved in the pathogenesis of hypertension (Marín and
Rodrigues-Martinez, 1997).
NO is an important molecule in the modulation of cardiovascular
function participating in the maintenance of normal vascular tonus and as a
neuromodulator, interfering in the sympathetic and parasympathetic outflow to
the periphery (Schmitt and Dirsch, 2009; Zanzinger, 1999).
The beneficial role of NO against the establishment or maintenance of
cardiovascular diseases is classically related in the literature; therefore the NO
is a potential therapeutic target in hypertension (Rajapakse et al., 2009). In this
context, drugs which mimic the role of this molecule in the body such as NO
donors are known to act in the treatment of hypertension. Recently, our
research group showed the effects of a new NO donor, the 2-nitrate-1,3dibuthoxupropan (NDBP) (Fig. 1), which has similar kinect to other NO donors
such as nytroglicerin and sodium nitroprusside. Furthermore, NDBP presented
potent vasorelaxant activity in normotensive rats (Franca-Silva et al, 2012).
However their effects on blood pressure and heart rate has not been
investigated.
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The evidence that hypertension is associated with changes in
autonomic nervous system and the fact that NO may exert a direct influence on
autonomic control of blood pressure, reducing the deleterious effect of
hypertension, led us to evaluate the effects of the NO donor, NDBP, on the
autonomic balance of spontaneously hypertensive rats (SHR), and its control
normotensive Kyoto rats (WKY).
2. Material and Methods
2.1. Animals
Male Wistar Kyoto and Spontaneously Hypertensive Rats (250-300 g),
housed under controlled conditions of temperature (21  1ºC) and lighting cycle
(lights on: 06:00-18:00 h) with water and food (Labina®, PURINA, Brazil) ad
libitum were used in all experiments. All the experimental procedures were
conducted in accordance with the Institutional Animal Care and Use Committee
of the Federal University of Paraiba (CEPA 030910).
2.2. NDBP preparation
NDBP was dissolved in a mixture of saline solution and chremophor and
diluted to the desired concentrations with saline solution as previously
described (Franca-Silva et al, 2012).
2.3. Surgical procedures and protocols
Intra-aortic blood pressure was recorded using the technique described
by Braga (2010). Briefly, under ketamine (75 mg/kg, i.p.) and xylazine (10
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mg/kg, i.p.) anesthesia, rats were fitted with polyethylene catheters inserted into
the lower abdominal aorta and inferior vena cava through left femoral artery and
vein, respectively. Both catheters were filled with heparinized saline, tunneled
subcutaneously, exteriorized and sutured at the dorsal surface of the neck.
Twenty-four hours after surgical procedures, experiments were performed in
conscious rats. The arterial catheter was connected to a pre-calibrated pressure
transducer coupled to an acquisition system (PowerLab, ADInstruments, Unit
13, 22 Lexington Drive, BELLA VISTA, NSW, AUSTRALIA) connected to a
computer installed with Chart 5.0 software.
2.4. Assessment of cardiovascular effects of NDBP
One day after surgical procedures, the blood pressure and heart rate
were evaluated after the randomly administration of different doses of NDBP (1,
5, 10, 15 and 20 mg/kg, i.v.) in conscious rats.
2.5. Evaluation of parasympathetic activity on NDBP-induced responses
In order to investigate the contribution of parasympathetic activity on the
hypotension induced by NDBP, atropine (2 mg/kg, i.v.), a muscarinic blocker,
was injected in normotensive and hypertensive rats, and the effect of NDBP
was evaluated before and after (15 min) the blockade. In other set of
experiments, WKY and SHR rats were submitted to vagotomy and responses to
NDBP were evaluated before and after this surgical procedure.
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2.6. Evaluation of sympathetic activity on the NDBP-induced responses
In order to investigate the effect of NDBP on the sympathetic activity,
the organic nitrate was administered 15 minutes before and after ganglionic
blockade with hexamethonium (30 mg/kg, i.v.) in WKY and SHR rats.
2.7 Evaluation of the participation of the nitric oxide in the NDBP-mediated
cardiovascular effects
To investigate the effect of NDBP on the NO availability, the in vivo
effects of NDBP was assessed blocking soluble guanylyl cyclase (CGs), an
intermediate of the NO pathway, with intravenous administration of methylene
blue (4.1 mg/kg, in bolus) in WKY and SHR conscious rats.
2.7. Statistical analysis
Data are expressed as the mean ± SEM. When appropriate, the
significance of differences was determined using one-way ANOVA following
Bonferroni’s post test with GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, La
Jolla, CA, USA). A P-value < 0.05 was considered significant.
3. Results
3.1. NDBP induces biphasic response in conscious rats
Spontaneously hypertensive rats were significantly hypertensive
compared with WKY rats (165.8 ± 5.6 vs 105.8 ± 7.8 mmHg, n=6, p<0.05,
respectively). The Figure 2 (A and B) shows representative tracings from
spontaneously hypertensive rats and normotensive Wistar Kyoto illustrating the
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changes in these parameters after administration of NDBP. From these results,
the dose of NDBP (15 mg/kg) was chosen to perform the following protocols.
Administration of NDBP (1, 5, 10, 15 e 20 mg/kg) elicited a dose-dependent
hypotension (-4±2, -21±6, -54±6, -62±10, -76±8 mmHg, n=6) and bradycardia,
except in the first dose (1±5, -70±26, -248±10, -240±25, -301±29 bpm) followed
by hypertension (5±2, 4±1, 6±2, 5±2, 12±3 mmHg) and tachycardia (25±4,
11±10, 55±19, 40±9, 76±16 b.p.m.) in normotensive Kyoto (WKY) rats as
illustrated in figure 3A. Interestingly, in spontaneously hypertensive rats, the
hypotensive (-8±1, -20±5, -86±4,-95±5, -118±3 mmHg, n=6) and bradycardic (9±8, -125±37, -252±10, -269±16, -309±18 b.p.m., n=6) responses exhibited a
significant higher when compared to WKY rats. This increase was also found in
hypertension (9±2, 15±3, 50±5, 57±4, 60±8 mmHg) and tachycardic (30±10,
45±9, 49±11, 76±15, 110±19 b.p.m.) responses (Figure 3B).
3.2. NDBP acts by stimulation of parasympathetic activity
Acute administration of atropine (2 mg/kg) blunted the hypotension
induced by NDBP (15 mg/kg) in WKY (-75±9 mmHg vs -12±3 mmHg; n=6) as
well as in SHR rats (-101±6 vs -7±2 bpm, n=6), and the pressor response to the
compound was potentiated (35±7 vs 65±4 mmHg-WKY; 33±10 vs 82±6 mmHgSHR; p<0.05) as shown in Figure 4 e 5.
To further investigate the parasympathetic activity induced by NDBP,
using
a
different
experimental
protocol,
vagotomy
was
performed.
Representative tracings from WKY and SHR rats show changes in blood
pressure and heart rate elicited by NDBP before and after vagotomy are shown
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in Figure 6. Interestingly, vagotomy produced a reduction in the NDBP-induced
bradycardia in both WKY (-136±8 vs -17±2 b.p.m., n=4, p<0.05) and SHR rats
(-141±9 vs -8±2 b.p.m., n=6, p<0.05). After vagotomy, the hypotensive
response was attenuated in SHR (-66±8 vs -34±11mmHg) as well as WKY
animals (-59±11 vs -35±9 mmHg) as shown in Figure 7.
3.3. NDBP increases sympathetic activity
In order to investigate the effects of NDBP on sympathetic activity,
acute administration of hexamethonium (30 mg/kg, i.v.) produced inhibition of
the NDBP induced pressor response (28±8 vs -9±5 mmHg - WKY, n=6; 42±7 vs
-19±8 mmHg - SHR, n=5; p<0.05). In relation to HR, there was a reduction in
bradycardia in both animal models (-278±23 vs -48±3 b.p.m.-WKY; -285±16 vs 27±19 b.p.m.-SHR, n=4; p<0.05). The remaining hypotension (-23±3 and 13±10 mmHg, in WKY and SHR rats, respectively) can be attributed to the
vascular effect elicited by NDBP (Fig. 8 e 9) as described previously (FrancaSilva et al, 2012).
3.4 NDBP induces NO release in vivo
To evaluate the nitric oxide release in the response induced by
administration of NDBP (15 mg/kg, i.v.), the hypotension and bradycardic
responses were analyzed before and after acute infusion of soluble guanylyl
cyclase inhibitor, methylene blue (4 mg/kg). Representative tracings are
presented in figure 10. In WKY rats both hypotension and bradycardic effects
were reduced (-82±6 vs -57±7 mmHg, n=6 and -322±14 vs -272±11 b.p.m.,
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n=6, respectively, p<0.05). Similar results were found in SHR regarding
hypotensive (-95±8 vs -70±4 mmHg, p<0.05, n=2) and bradycardic effect (291±12 vs -235±6 b.p.m., p<0.05, n=5) as illustrated in Figure 11.
4. Discussion
The main findings of the present study were that acute intravenous
infusion of NDBP, a NO donor, evoked hypotensive and bradycardic effects
followed by hypertension and tachycardia. The hypotension seems to be, at
least in part, mediated by decreasing cardiac output due to direct stimulation of
vagal activity. The secondary response occurs by sympathetic activation that is
more exacerbated in spontaneously hypertensive rats, showing the dual effects
of NDBP on central nervous system.
Spontaneously hypertensive rats are widely used as animal model for
studying
essential
hypertension
in
humans,
because
these
animals
have phenotypic characteristics similar to those observed in human essential
hypertension (Pinto et al, 1998). This model is associated with increased
periphery vascular resistance, cardiac hypertrophy, heart failure, among other
pathologies (Fazan Jr et al., 2001). In addition, the sympathetic nerve activity is
significantly increased in relation with their normotensive controls, the WistarKyoto (WKY) rats. Furthermore, NO levels contribute to the development and
maintenance of hypertension in this model (Wymann et al. 2003; Portaluppi et
al., 2004). Thus, SHR were chosen as a model to investigate the effect of the
NO donor NDBP on the autonomic nervous system.
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Initially, the administration of NDBP in SHR and WKY rats induced
hypotension associated with bradycardia, instead of reflex tachycardia as
observed in other NO donors such as sodium nitroprusside (SNP) (Caputi et al.,
1980, Botelho-Ono et al, 2011, Guimarães et al, 2012). To evaluate the
bradycardic effect induced by our organic nitrate, atropine (2 mg/kg) was used
to probe the cardiac parasympathetic system (Lee et al., 2008). Acute
administration of atropine was able to decrease the hypotensive response; it
suggests that NDBP reduced the mean blood pressure mainly by reducing the
cardiac output in addition to its well-known effect on the smooth muscle in the
periphery (Franca-Silva et al).
The bradycardia was virtually abolished after bilateral vagal section,
suggesting that the bradycardia induced by NDBP is due to release of
acetylcholine from the vagus nerve. The vagotomy also reduced the
hypotension due to elimination of the bradycardia, confirming the ability of the
nitrate to decline the cardiac output. Interestingly, Jia et al. (1994) have found
that 8 days after left cervical vagotomy, NO synthesis (NOS) activity was
markedly enhanced in some vagal nuclei, i.e., the dorsal motor nucleus of
vagus nerve (DMV), the nucleus ambiguus (AMB) and the nucleus tractus
solitarii (NTS) (Feng et al., 2002). Furthermore, histological studies show that
vagal afferents to the NTS containing NOS and vagal activity decrease the NOS
immunoreactivity (Iwase et al. 1998; Lin, 2007) and this has also been found in
many nuclei of neurons within the medulla oblongata that sends projections to
the NTS (Esteves, 2000; Babic, 2008), which suggests that NO generated
inside NTS may modulate vagal afferent integration.
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In addition, Choate and Paterson (1999) found that exogenous NO
decreased baroreceptor activity and inhibited chronotropic responses, rather
than chronotropism which generally occurs. On the other hand, studies
confirmed the positive chronotropic response to NO donors, due to the release
of noradrenaline from sympathetic nerves (Choate and Paterson, 1999).
The residual outcome hypotensive and bradycardic is attributed to
vasorelaxant effect elicited by NDBP, that was reduced by soluble guanylyl
cyclase blocker, methylene blue. The NO exerts vasorelaxation via activation of
guanylate
cyclase,
increasing
intracellular
levels
of
cyclic
guanosine
monophosphate (cGMP), resulting in activation of protein kinase G (PKG), a
peptide responsible for the phosphorylation of several proteins involved on
vasorelaxation (McDonald and Murad, 1996; Archer et al., 2004). This effect
can lead to reduction in blood pressure, being attenuated by the blockage of the
NO pathway. However the concentration of methylene blue used was not
enough to block the entire response induced by NDBP.
Several findings report that the NO acts in brain sites, reducing the
sympathetic tone and increased parasympathetic activity directly to heart with
posterior bradycardia that mask the reflex tachycardia (Fletcher et al., 2006;
Kishi et al., 2001; Rugerri et al., 2000). However, in our experimental
procedures, NDBP caused, in a second moment, a hypertensive and
tachycardic effects that were blocked after pretreatment with hexamehtonium,
showing that NDBP induces increases sympathetic outflow to periphery.
Here we report for the first time that a NO donor, NDBP, induces
hypotension due reduction in cardiac output by direct vagal stimulation.
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Concomitantly, the NO donor acts influencing pressor response associated with
tachycardia by stimulation of sympathetic outflow to the periphery. These
responses seem to depend on the central action of the compound. Our findings
may encourage new studies to advance the understanding of the antihypertensive effects elicited by NDBP, which will help to advance the field
towards clinical trials, considering that currently used organic nitrates n the
clinic are not effective in the treatment of hypertension.
5. Acknowledgments
The authors are grateful to José Crispim Duarte for technical assistance
in experimental procedures.
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Figure legends
Fig. 1. Structural formula of NDBP.
Fig. 2. Representative tracings from spontaneously hypertensive rat (SHR) and
normotensive Wistar Kyoto (WKY) rat illustrating the changes in pulse arterial
pressure (PAP, mmHg), mean arterial pressure (MAP, mmHg), and heart rate
(HR, b.p.m.) in response to administration of different doses of the NDBP (black
arrows).
Fig.3. Effect of NDBP on mean arterial pressure (MAP, mmHg) and heart rate
(HR, b.p.m.) in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Wistar
Kyoto (WKY) rats. Values are means ± S.E.M.
Fig. 4. Representative tracings from spontaneously hypertensive rat (SHR) (A)
and normotensive Wistar Kyoto (WKY) (B) illustrating the changes in pulse
arterial pressure (PAP, mmHg), mean arterial pressure (MAP, mmHg), and
heart rate (HR, b.p.m.) in response to administration of NDBP before and after
administration i.v. atropine (black arrows).
Fig. 5. Effect of NDBP (15 mg/kg) before and after blockade with atropine
(2 mg/kg) in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Wistar Kyoto
(WKY) rats. Values are means ± S.E.M, p<0.05.
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Fig. 6. Representative tracings from spontaneously hypertensive rat (SHR) (A)
and normotensive Wistar Kyoto (WKY) (B) illustrating the changes in pulse
arterial pressure (PAP, mmHg), mean arterial pressure (MAP, mmHg), and
heart rate (HR, b.p.m.) in response to administration of NDBP before and after
vagotomy.
Fig. 7. Effect of NDBP (15 mg/kg) before and after vagotomy in spontaneously
hypertensive (SHR) and normotensive Wistar Kyoto (WKY) ats. Values are
means ± S.E.M, p<0.05.
Fig. 8. Representative tracings from spontaneously hypertensive rat (SHR). (A)
and normotensive Wistar Kyoto rat (WKY). (B) illustrating the changes in pulse
arterial pressure (PAP, mmHg), mean arterial pressure (MAP, mmHg), and
heart rate (HR, b.p.m.) in response to administration of NDBP before and after
administration of hexamethonium (black arrows).
Fig. 9. Effect of NDBP (15 mg/kg) before and after blockade with
hexamethonium
(30 mg/kg)
in
spontaneously
hypertensive
(SHR)
and
normotensive Wistar Kyoto (WKY) rats. Values are means ± S.E.M, p<0.05.
Fig. 10. Representative tracings from spontaneously hypertensive rat (SHR).
(A) and normotensive Wistar Kyoto (WKY). (B) illustrating the changes in pulse
arterial pressure (PAP, mmHg), mean arterial pressure (MAP, mm Hg), and
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heart rate (HR, b.p.m.) in response to administration of NDBP before and after
administration of methylene blue (black arrows).
Fig. 11. Effect of NDBP (15 mg/kg) before and after acute infusion of methylene
blue (4 mg/kg) in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Wistar
Kyoto (WKY) rats. Values are means ± S.E.M, p<0.05.
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20
1
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3
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58
59
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61
62
63
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Figure 1-11
H3 C
NO2
O
O
O
H3 C
Figure 1
1 mg/kg
5 mg/kg
10 mg/kg
15 mg/kg
20 mg/kg
PAP
(mmHg)
150
0
MAP
(mmHg)
150
0
HR
(bpm)
600
0
0
Figure 2A
1 min
1 mg/kg
5 mg/kg
10 mg/kg
15 mg/kg
20 mg/kg
PAP
(mmHg)
250
0
MAP
(mmHg)
250
0
HR
(bpm)
650
0
0
Figure 2B
1 min
20
15
10
5
1
g/
kg
g/
kg
Figure 3A
20
15
10
g/
kg
m
g/
kg
m
g/
kg
m
g/
kg
m
0
5
-150
g/
kg
m
 HR
(bpm)
-50
1
g/
kg
m
g/
kg
m
g/
kg
m
m
m
 MAP
(mmHg)
200
50
0
-200
-100
-400
Figure 3B
20
15
m
g/
kg
m
g/
kg
m
g/
kg
g/
kg
m
-150
5
g/
kg
m
 HR
(bpm)
-50
1
g/
kg
m
g/
kg
m
g/
kg
m
g/
kg
m
g/
kg
m
0
10
20
15
10
5
1
 MAP
(mmHg)
100
200
50
0
-200
-100
-400
NDBP
NDBP
PAP
(mmHg)
230
0
MAP
(mmHg)
230
HR
(bpm)
0
600
0
Atropine
0
Figure 4A
1 min
NDBP
NDBP
PAP
(mmHg)
280
MAP
(mmHg)
0
280
0
HR
(bpm)
600
0
0
Atropine
Figure 4B
1 min
WKY
SHR
150

100
NDBP control
-50
NDBP after atropine
*
 MAP
(mmHg)
 MAP
(mmHg)
50
0
*
100
NDBP control
50
NDBP after atropine
0
*
-50
-100
-100
-150
-150
100
100
-100
-200
0
*
 HR
(bpm)
 HR
(bpm)
0
-100
-200
-300
-300
-400
-400
Figure 5
*
NDBP
Vagotomy
NDBP
PAP
(mmHg)
200
0
MAP
(mmHg)
200
0
HR
(bpm)
400
0
0
Figure 6A
1 min
NDBP
Vagotomy
NDBP
PAP
(mmHg)
200
0
MAP
(mmHg)
200
HR
(bpm)
0
400
0
0
Figure 6B
1 min
SHR
WKY
50
 MAP
(mmHg)
-25
*
Control
Vagotomy - time 0
Vagotomy - time 80 s
-50
 MAP
(mmHg)
0
*
0
Control
Vagotomy - time 0
Vagotomy - time 80 s
-50
*
-75
-100
-100
50
0
*
*
*
0
-100
*
 HR
(bpm)
 HR
(bpm)
-50
-50
-100
-150
-150
-200
-200
Figure 7
NDBP
hexamethonium NDBP
PAP
(mmHg)
250
0
MAP
(mmHg)
250
0
HR
(bpm)
650
0
0
Figure 8A
20 s
NDBP
hexamethonium NDBP
PAP
(mmHg)
300
0
MAP
(mmHg)
300
0
HR
(bpm)
650
0
0
Figure 8B
20 s
SHR
WKY
NDBP Control
100
100
NDBP after
hexamethonium
*
*
 MAP
(mmHg)
 MAP
(mmHg)
-50
NDBP after
hexamethonium
50
50
0
NDBP Control
0
-50
*
-100
-100
-150
-150
200
100
100
0
-100
*
*
 HR
(bpm)
 HR
(bpm)
0
-100
-200
-200
-300
-300
-400
-400
Figure 9
*
*
HR
MAP
PAP
Methylene blue
Figure 10A
HR
MAP
PAP
Methylene blue
Figure 10B
SHR
WKY
0
NDBP Control
NDBP after
methylene blue
NDBP Control
NDBP after
methylene blue
 MAP
mmHg
 MAP
mmHg
0
-50
*
-50
*
-100
-100
0
0
-100
NDBP control
NDBP after methylene
blue
-200
 HR
(bpm)
 HR
(bpm)
-100
NDBP control
NDBP after methylene
blue
-200
-300
-300
*
-400
-400
Figure 11
*