Conjunto SPOT-Light® HER2 CISH
Cat. n.° 84-0150
20 exames com lamelas de 24 mm x 30 mm
Uso pretendido
Para utilização de diagnóstico in vitro
O conjunto SPOT-Light® HER2 CISH destina-se a determinar quantitativamente a amplificação do gene HER2 em
secções de tecido de carcinoma mamário fixadas em formalina e incluídas em parafina (formalin-fixed, paraffinembedded, FFPE), utilizando hibridação cromogénica in situ (chromogenic in situ hybridization, CISH) e
microscopia de campo claro. Este exame deve ser realizado num laboratório de histopatologia.
O conjunto SPOT-Light® HER2 CISH está indicado como auxiliar na avaliação de doentes para os quais está a ser
considerado o tratamento com Herceptin® (trastuzumab). Os resultados destinam-se a ser utilizados como adjuvantes
da informação clínico-patológica a ser presentemente utilizada como parte do tratamento de doentes com cancro da
mama. A interpretação dos resultados do exame tem de ser efectuada no contexto do historial clínico do doente e por
um patologista devidamente qualificado.
Resumo e explicação
O gene humano HER2, ou c-erbB-2, e o gene murino equivalente, neu, foram identificados como sendo protooncogenes(1-3) que partilham homologia com o oncogene de relação próxima v-erbB(1). O gene HER2 localiza-se no
cromossoma 17 (17q11.2-21) e codifica uma proteína semelhante a um receptor de membrana, de 185 kDa. A
proteína codificada pelo HER2 tem actividade de tirosina quinase e partilha homologia com o receptor do factor de
crescimento epidérmico (conhecido como EGFr, HER1, ou c-erbB-1), embora seja distinta deste(2).
Foi identificada a amplificação do gene HER2 ou a sobre-expressão da proteína HER2 em 18-30% dos cancros da
mama humanos(8-9). A identificação do estado de amplificação do gene HER2 é importante para a determinação do
prognóstico de doentes diagnosticados com cancro da mama invasivo, bem como na selecção de doentes elegíveis
para a terapêutica com trastuzumab (Herceptin®, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Suíça e Genentech, Inc., South
San Francisco, CA, EUA)(4-6). O trastuzumab é um anticorpo monoclonal específico para a proteína HER2. O
trastuzumab mostrou ser uma terapêutica eficaz apenas em doentes cujos tumores apresentam amplificação do gene
HER2 e/ou sobre-expressão da proteína HER2(7,11) . Numa fase precoce do cancro da mama, um ciclo curto de
trastuzumab administrado concomitantemente com docetaxel ou vinorelbina mostrou ser eficaz em mulheres com
cancro da mama que têm um gene HER2/neu amplificado(12). Outros estudos mostraram ainda que o estado de HER2
previa a sensibilidade ou resistência a certos regimes de quimioterapia(13). Por conseguinte, os métodos exactos,
consistentes e directos para a avaliação do estado do gene HER2 e da proteína HER2 têm-se revestido de uma
importância cada vez maior.
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Princípios do procedimento
A técnica CISH utiliza sondas de ADN marcadas com digoxigenina que são específicas para o lócus genético do
HER2 no cromossoma 17q11.2-21 para hibridar com os ácidos nucleicos complementares presentes na amostra de
cancro da mama. A sonda de HER2 marcada é feita com tecnologia de sonda por subtracção (Subtraction Probe
Technology, SPT™), uma tecnologia exclusiva e patenteada que cria sondas específicas, reduzindo
significativamente as sequências repetitivas (por ex., elementos Alu e LINE) encontradas nos ácidos nucleicos
humanos. Através de PCR, a sonda mostrou conter o gene HER2 e mostrou ainda ligar-se especificamente ao lócus
genético do HER2 no cromossoma 17q11.2-21 através de FISH metafásica em linfócitos normais.
Consequentemente, as sondas SPT™ da Invitrogen são inerentemente específicas e não necessitam do bloqueio
repetitivo de sequências, como acontece com as sondas de ADN citogenéticas tradicionais. A técnica CISH permite
a avaliação de aberrações genéticas sob microscopia de campo claro, utilizando detecção cromogénica.
Os resultados da coloração CISH podem ser claramente visualizados com microscopia normal de campo claro e com
uma objectiva de 40x a seco. O estado de amplificação do gene HER2 pode ser visualizado no contexto da
morfologia do tecido circundante.
Após a desparafinização, as amostras são pré-tratadas com um passo de recuperação a quente, seguido de digestão
enzimática. As amostras são, então, desidratadas e secas ao ar, antes da adição da sonda HER2. Após a adição da
sonda e da lamela à amostra, a combinação é desnaturada e hibridada por mais de dez horas ou de um dia para o
outro. Em seguida, a amostra é lavada para remover a sonda não hibridada, e o sinal é detectado cromogenicamente
através de adição sequencial de anticorpo ao conjugado de digoxigenina com polímero de peroxidase de rábano
(horseradish peroxidase-polymer, HRP). A cor é desenvolvida através da reacção do HRP ligado com o cromogénio
DAB e o substrato de H2O2. Por último, faz-se a contracoloração da amostra com hematoxilina de Mayer, para
identificar a morfologia tecidular e cobre-se com uma lamela. O sinal do gene HER2 é identificado através de um
único ponto castanho-escuro, quando presente num baixo número de cópias ou de agrupamentos castanhos quando o
sinal se apresenta sob a forma de muitas cópias. As áreas de células tumorais podem ser facilmente identificadas sob
uma objectiva de baixa ampliação de um microscópio de campo claro e as cópias do gene HER2 podem ser
quantificadas utilizando a objectiva de 40x. Utilizando microscopia de campo claro com uma objectiva de 40x,
localizam-se as células tumorais e quantificam-se as cópias do gene HER2. A DAB forma um precipitado corado,
pelo que os resultados podem ser arquivados e revistos posteriormente.
Materiais fornecidos
O conjunto SPOT-Light® HER2 CISH contém todos os reagentes necessários para a realização do procedimento
CISH em tecidos fixados com formalina e incluídos em parafina. Os materiais listados a seguir são suficientes para
um total de vinte exames e até duas execuções com as duas lâminas de controlo, utilizando amostras de tecido
cobertas com lamelas de 24 mm x 30 mm. Podem ser realizados mais exames se forem utilizadas lamelas mais
pequenas.
O conjunto SPOT-Light® HER2 CISH é enviado em blocos refrigerados. Os blocos refrigerados devem estar ainda
frios aquando da recepção da encomenda, para garantir que a embalagem não foi exposta a temperaturas elevadas.
Contudo, alguns componentes podem permanecer descongelados sem que tal afecte o desempenho do conjunto.
Consulte Conservação dos reagentes para obter informações relativas à conservação destes componentes aquando
da recepção.
Reagente A. Solução de pré-tratamento a quente
1 l, contendo tampão Tris-EDTA (pronto a utilizar)
Reagente B. Reagente de pré-tratamento enzimático
5 ml, contendo solução de pepsina com azida sódica a 0,05% e detergente (pronto a utilizar)
CUIDADO: perigoso
Reagente C. Sonda HER2
0,4 ml de sonda SPOT-Light® HER2 marcada com digoxigenina em tampão de hibridação contendo
formamida (pronto a utilizar)
CUIDADO: perigoso
Reagente D. Tampão SSC
500 ml, contendo citrato de sódio salino (saline sodium citrate, SSC) (pronto a utilizar)
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Reagente E1. Pó PBS
3 embalagens, cada uma suficiente para 1 l de PBS
Reagente E2. Tween 20 (50%)
2 ml, Tween 20 em solução a 50%
Reagente F. CAS-BlockTM
3 ml, contendo tampão, estabilizador e azida sódica a 0,1% (pronto a utilizar)
CUIDADO: perigoso
Reagente G. Anticorpo murino antidigoxigenina
3 ml, contendo BSA, tampão e azida sódica a 0,1% (pronto a utilizar)
CUIDADO: perigoso
Reagente H. Conjugado de polímero HRP e antimurino de cabra
3 ml, contendo estabilizador, tampão, sulfato de gentamicina a 0,005% e Proclin 300 a 0,1%, (pronto a
utilizar)
Reagente I1. Tampão de substrato DAB (20x)
1 ml, concentrado contendo tampão
Reagente I2. Solução de DAB, (20x)
1 ml, concentrado contendo metanol a 85% p/v
CUIDADO: inflamável e tóxico
Reagente I3. Peróxido de hidrogénio (20x)
1 ml, H2O2 a 0,6%
Reagente J. Hematoxicilina de Mayer
100 ml (pronto a utilizar)
Reagente K. HistomountTM Mounting Solution (solução de montagem)
4 ml (pronto a utilizar)
CUIDADO: altamente inflamável e perigoso
Lâmina de controlo L. Lâminas com células de controlo para o procedimento
2 lâminas, cada uma com duas (2) linhas celulares fixadas com formalina e incluídas em parafina (FFPE),
colocadas lado a lado:
A) HER2 não amplificado (MCF-7), e
B) HER2 amplificado (SK-OV-3)
[Recomendam-se as linhas celulares não amplificadas com resultados contabilizáveis para um controlo
óptimo do ensaio.]
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REAGENTES/MATERIAIS E EQUIPAMENTO NECESSÁRIOS MAS NÃO
FORNECIDOS
Reagentes/materiais auxiliares
Invitrogen Cat. n.°
1.
Lâminas SuperFrost Plus OU
Adesivo para lâminas HistogripTM
2. Controlo tecidular positivo: secção de tecido de carcinoma mamário
FFPE (ductal, tubular, lobular ou de tipo misto) com amplificação do
gene HER2 previamente confirmada com CISH ou FISH
3. Controlo tecidular negativo: secção de tecido de carcinoma mamário
FFPE (ductal, tubular, lobular ou de tipo misto) com amplificação do
gene HER2 previamente confirmada com CISH ou FISH
4. Água desionizada ou destilada (dH2O)
5. Xileno
6. Etanol (EtOH) a 70%, 85%, 95% e 100%
7. Lamelas, cola “rubber cement”, agulha de 18G ½” e seringa de 5 ml OU
8. Lamelas UnderCoverTM (18 x 18 mm)
9. Lamelas UnderCoverTM (22 x 22 mm)
10. Peróxido de hidrogénio a 30% (H2O2)
11. Metanol a 100%
00-8050
00-8403
00-8404
Equipamento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Temporizador
Pipeta (20 µl, 1000 µl)
Pontas de pipeta
Suporte para lâminas
Placa térmica, folha de alumínio e copo graduado de 1 l
Aquecedor de lâminas
Incubadora a 37 °C
Dispositivo para ciclos térmicos (“thermal cycler”) de PCR com um bloco para lâminas OU
Bloco de aquecimento com termómetro digital e incubadora a 37 °C (± 1 °C) e caixa para lâminas com
humidade
9. Banho de água (capaz de manter um intervalo de temperatura de 70-80 °C) com um termómetro calibrado
10. Copos de misturadora e copos de coloração
11. Microscópio de campo claro com objectivas de 20x e 40x
Precauções
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Para utilização de diagnóstico in vitro
Para utilizadores profissionais, com formação adequada.
Não utilize o conjunto após o prazo de validade impresso no rótulo.
Caso o produto seja conservado em condições diferentes das especificadas no folheto informativo, as
condições de conservação terão de ser verificadas pelo utilizador.
Não comer, fumar ou aplicar produtos cosméticos nos locais onde os materiais do conjunto estão a ser
manuseados. Devem observar-se as Boas Práticas Laboratoriais Universais.
Nenhum método de exame disponível pode oferecer uma garantia completa de eliminação do potencial
risco biológico. Manusear todos os materiais num nível 2 de Segurança Biológica, conforme recomendado
para qualquer material humano potencialmente infeccioso no manual dos centros para controlo de
doenças/institutos nacionais de saúde dos EUA (Centers for Disease Control/National Institutes for Health).
“Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,” 4a Edição, Abril de 1999.
Não pipetar reagentes com a boca e evitar o contacto da pele e das mucosas com as amostras e reagentes.
Caso os reagentes entrem em contacto com a pele ou as mucosas, enxaguar as áreas afectadas com água em
abundância.
Os reagentes B, F e G contêm azida sódica a 0,1%; o reagente H contém sulfato de gentamicina a 0,005% e
Proclin a 0,1%; o reagente I2 contém metanol a 85% p/v; e o reagente I3 contém peróxido de hidrogénio a
0,6%. Nas concentrações do produto, estes reagentes não exigem rotulagem quanto a riscos. Consulte a
MSDS específica para cada componente para obter informações adicionais.
O reagente B contém pepsina e esta enzima pode causar reacções alérgicas em contacto com a pele.
Utilize um banho de água de temperatura calibrada, bloco de aquecimento e forno de hibridação para obter
resultados óptimos.
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Alguns dos reagentes deste conjunto contêm azida sódica como conservante. A azida sódica pode reagir
com o chumbo ou com o cobre das canalizações para formar azidas metálicas explosivas, sobretudo se
acumulada. Ao eliminar reagentes com azida sódica, irrigue com grandes quantidades de água para evitar a
acumulação de riscos químicos na canalização.
Alguns reagentes deste conjunto contêm Proclin, azida sódica ou peróxido de hidrogénio. Estes reagentes
estão classificados como perigosos, uma vez que são irritantes para a pele e para as mucosas. Estas
substâncias são fornecidas na forma diluída para os componentes deste conjunto, o que pode, por
conseguinte, minimizar significativamente, embora não completamente, os riscos de exposição. Evite o
contacto com a pele, os olhos e o vestuário. Consulte a MSDS específica para cada componente para obter
informações adicionais.
O tetracloreto de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) pode ser perigoso se ingerido, inalado ou absorvido através
da pele, das mucosas e das vias aéreas superiores e pode ser irritante para os olhos, a pele, as membranas
mucosas e o tracto repiratório superior. O DAB tem suspeita de carcinogenicidade; consulte os
regulamentos federais, estaduais, e/ou os regulamentos locais quanto às recomendações para a respectiva
eliminação.
Evitar a evaporação do reagente I2. O metanol evapora-se facilmente. Tome medidas para evitar a
evaporação, tais como a vedação do recipiente e o fecho da tampa imediatamente após a utilização. A
evaporação do metanol pode causar a precipitação do DAB, podendo afectar os resultados da coloração.
Evitar a evaporação por a hibridação, garantindo que as lâminas se encontram adequadamente vedadas e
que existe humidade suficiente na câmara de hibridação.
O pré-tratamento enzimático pode variar, consoante a fixação e a espessura do tecido. Para a maioria das
secções de tecido (4–5 µm) fixados com formalina tamponizada neutra a 10%, o óptimo são 5 minutos de
pré-tratamento enzimático. Para tecidos com fixação desconhecida, deve realizar-se uma titulação
enzimática (por ex., 2 min., 5 min. e 10 min.), sendo o tempo óptimo de digestão ajustado com base nos
resultados iniciais.
Reagente C – A sonda HER2 marcada contém formamida, que é perigosa.
R21 – Perigoso em contacto com a pele
R22 – Perigoso se ingerido
R61 – Pode causar danos a fetos em desenvolvimento
S24 – Evitar o contacto com a pele
S36 – Utilizar vestuário de protecção adequado
S37 – Utilizar luvas adequadas
S39 – Utilizar protecção para os olhos/rosto
Reagente I2 – A solução de DAB contém metanol, que é inflamável e tóxico. Consulte a MSDS para obter
informações adicionais.
R10 – Inflamável
R23/24/25 – Tóxico por inalação, em contacto com a pele e se ingerido
S45 – Em caso de acidente, ou se não se sentir bem, procure auxílio médico imediatamente
S36 – Utilizar vestuário de protecção adequado
S37 – Utilizar luvas adequadas
Reagente K – A Histomount Mounting Solution contém tolueno, que é altamente inflamável e perigoso se
inalado. Consulte a MSDS para obter informações adicionais.
R11 – Altamente inflamável
R20 – Perigoso por inalação
S2 – Manter fora do alcance das crianças
S16 – Manter afastado de fontes de ignição – Não fumar
S25 – Evitar o contacto com os olhos
S29 – Não deitar para a canalização
S33 – Tomar medidas de precaução contra descargas estáticas
Todos os reagentes designados como estando prontos a utilizar foram diluídos para a concentração óptima.
A diluição adicional poderá afectar adversamente os resultados do ensaio.
Os tempos de incubação, reagentes e temperaturas foram optimizados. O uso de diferentes tempos de
incubação, reagentes ou temperaturas pode afectar adversamente os resultados do ensaio.
Não se recomenda o uso de fixadores ou espessuras diferentes para o tecido, pois tal poderia afectar
adversamente os resultados do ensaio.
Consultar os regulamentos locais quanto à eliminação de componentes potencialmente tóxicos.
Minimizar a contaminação microbiana para evitar a coloração não específica.
Utilizar precauções alargadas ao manusear reagentes. Utilizar luvas descartáveis, bata e óculos de
segurança ao manusear substâncias com suspeita de carcinogenicidade.
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Conservação de reagentes
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•
O conjunto SPOT-Light® HER2 CISH deve conservar-se a uma temperatura de 2-8 °C.
Conservar o reagente J à temperatura ambiente (15-30 °C).
Nota: o reagente B pode ser afectado adversamente se for exposto a temperaturas elevadas. Conservar este
reagente a 2-8 °C imediatamente após a utilização. Não conservar este reagente à temperatura ambiente.
Conservar o PBS com tampão Tween 20 em utilização à temperatura ambiente (15-30 °C) por um período
de até uma semana.
Não utilize o conjunto após o prazo de validade impresso no rótulo. Caso o produto seja conservado
em quaisquer condições que não as especificadas no folheto informativo, as condições de
conservação terão de ser verificadas pelo utilizador. Não existem sinais visíveis que indiquem a
instabilidade deste produto; portanto, é importante avaliar as lâminas de controlo. Contacte a
Assistência Técnica caso suspeite de algum problema com este conjunto.
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Instruções de utilização
A. Preparação das amostras
Secções de tecido incluídas em parafina:
• São adequados para utilização os tecidos fixados em formalina tamponada neutra por 6-48 horas antes da
inclusão em parafina.
• Os fixadores que não a formalina tamponada neutra a 10% não foram optimizados para este protocolo e não
são adequados para utilização.
• As secções de tecido (com 4-5 µm de espessura) têm de ser montadas em lâminas para microscópio
Superfrost Plus ou então tratadas com HistoGrip™. Sempre que possível, utilize secções de tecido de
espessura normalizada para assegurar a coloração uniforme da detecção através de CISH e dos reagentes de
contracoloração28.
• Secar as lâminas ao ar, ou secar a 37 °C, e em seguida colocar na estufa por 2-4 horas a 60 °C.
• Os tecidos adequadamente fixados e incluídos irão permanecer conservados indefinidamente antes do
seccionamento e montagem das lâminas, se conservados num local fresco e seco (15-30 °C)26,27.
• As secções de tecido com espessura de 2-3 µm poderão dar falsos resultados baixos relativamente às cópias
do gene.
B. Procedimento CISH normal para as secções de tecido FFPE
Notas relativas ao procedimento
•
Todos os reagentes, excepto o reagente C (sonda HER2) devem ser equilibrados à temperatura ambiente
(15-30 °C) antes da utilização. A sonda HER2 pode ser utilizada a frio, sem equilibrar à temperatura
ambiente. Cada incubação deve ser realizada à temperatura ambiente (15-30 °C), a menos que haja
indicação em contrário.
•
Ao longo de todo o processo, a menos que haja indicação em contrário, é importante que a secção de tecido
não seque entre os passos.
•
Ao longo do procedimento são necessárias múltiplas lavagens. Para cada lavagem tem de ser utilizada
solução fresca.
•
As lâminas de controlo devem ser executadas juntamente com cada execução das lâminas de exame do
doente e têm de ser tratadas da mesma forma que as amostras em exame para todos os passos.
•
A menos que haja indicação em contrário, todos os passos são executados à temperatura ambiente (15-30
°C).
•
Este procedimento precisa de mais de oito horas para completar: em seguida é apresentada uma divisão
prática, a começar no dia 1 com a desparafinização, passando pela desnaturação e hibridação (de um dia
para o outro), e prosseguindo no dia 2 com a lavagem adstringente e até à microscopia de campo claro.
•
Os reagentes Invitrogen fornecidos com o conjunto são necessários para o procedimento CISH. O uso de
outros reagentes pode resultar em valores elevados de fundo, ou numa diminuição ou perda do sinal CISH.
A substituição de qualquer dos reagentes fornecidos como componentes do conjunto pode tornar nulos os
resultados do ensaio.
Procedimento do dia 1
1.
Preparação dos reagentes
• Xileno (dois recipientes de lâminas), EtOH a 100% (três recipientes de lâminas)
o Cubra bem e conserve por um período de até uma semana à temperatura ambiente (15-30 °C) ou até
que tenham sido processadas cem lâminas.
•
Série de álcool etílico (EtOH)
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o
o
Prepare recipientes separados com EtOH a 70%, 85%, 95% e 100%.
Cubra bem e conserve por um período de até uma semana à temperatura ambiente (15-30°C) ou até
que tenham sido processadas cem lâminas.
Rotule adequadamente cada reagente de lavagem e anote a ordem de utilização no procedimento, mantendo
essa ordem.
2. Desparafinização
Nota: prepare reagentes suficientes para cada recipiente de lâminas necessário para a quantidade de lâminas na
execução. Cada lavagem necessita de um volume distinto de reagente. Se o passo seguinte não puder prosseguir
imediatamente, deixe as lâminas secarem ao ar após mergulhar em EtOH a 100% três vezes, em vez de lavar as
lâminas três vezes em dH2O.
a) Mergulhe em xileno
b) Mergulhe em EtOH a 100%
c) Lave em dH2O
2 vezes, 5 min. cada
3 vezes, 3 min. cada
3 vezes, 2 min. cada
A desparafinização completa é necessária para obter resultados óptimos e reproduzíveis.
3. Pré-tratamento a quente
Nota: as lâminas têm de ser fervidas ou aquecidas a uma temperatura ≥ 98°C por 15 min. na solução de prétratamento a quente (reagente A). As lâminas não devem ser sobreaquecidas, certificando-se de que a
temperatura permanece entre 98 °C e 100 °C. Recomendamos o uso da placa térmica para este passo. (Para
protocolos que utilizem um forno de pressão com um medidor de pressão e temperatura, ou um forno de
microondas com um medidor de temperatura, contacte a Assistência Técnica da Invitrogen através do endereço
electrónico [email protected]). A solução de pré-tratamento a quente (reagente A) pode ser
utilizada até duas vezes antes de ser eliminada.
a) Coloque as lâminas no suporte para lâminas.
b) Aqueça a solução de pré-tratamento a quente (reagente A) num copo graduado, numa placa térmica, até
que esteja a ferver regularmente e a temperatura registe ≥ 98 °C. Para evitar que o tampão evapore, o
copo graduado deve ser coberto com uma tampa de vidro ou folha de alumínio.
c) Coloque as lâminas na solução a ferver, cubra o copo graduado, comece a medição do tempo quando a
temperatura atingir os 98 °C ou quando aparecerem novamente as bolhas da fervura, e ferva por 15 min.
Certifique-se de que a temperatura permanece entre 98 °C e 100 oC.
d) Transfira as lâminas imediatamente para dH2O à temperatura ambiente (15-30 °C).
e) Lave três vezes em dH2O, 2 min. cada.
4. Digestão enzimática
Nota: para a maioria dos tecidos mamários, 5 min. de digestão enzimática à temperatura ambiente (15-30 °C)
irão produzir resultados óptimos de CISH. O tempo de digestão deve ser ajustado com base nos resultados
iniciais com 5 min. de tempo de digestão. Pode ser necessário um tempo de incubação enzimática diferente,
consoante a espessura do tecido e o método de fixação. Um estudo de digestão enzimática indicou que o tempo
de digestão enzimática pode variar entre 2-20 min. e irá produzir um sinal adequado de CISH para a avaliação
de HER2 num conjunto de amostras arquivadas de tecido mamário. Num estudo de concordância para suportar
o uso de CISH vs. FISH, que utilizou amostras de tecido de cancro da mama que tinham sido processadas nos
doze meses anteriores à data do estudo, o tempo de digestão enzimática de 5 min. produziu sinais CISH óptimos
para a avaliação do gene HER2(28).
a) Equilibre o reagente de pré-tratamento enzimático (reagente B) à temperatura ambiente (15-30 °C).
b) Adicione reagente B suficiente para cobrir a secção de tecido e incube por 5 min. à temperatura
ambiente (15-30 °C).
c) Lave em dH2O três vezes, 2 min. cada.
5. Desidratação em série graduada de etanol:
a)
b)
c)
d)
e)
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EtOH a 70%
EtOH a 85%
EtOH a 95%
EtOH a 100%
EtOH a 100%
2 min.
2 min.
2 min.
2 min.
2 min.
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6. Secar as lâminas ao ar ≥ 20 min ou até estarem secas. Rotule as lâminas com um lápis, se necessário.
7. Desnaturação e hibridação
Nota: use um dispositivo para PCR com ciclos térmicos, com um bloco para lâminas ou um bloco de
aquecimento com indicação de temperatura e uma câmara de humidade para as lâminas com uma incubadora a
37 °C, ou instrumentos semelhantes. Certifique-se de que a humidade das câmaras é mantida adequadamente. A
hibridação realizada por períodos temporais mais curtos pode resultar num sinal mais fraco. A desnaturação da
sonda a uma temperatura inferior à recomendada pode resultar num sinal CISH fraco ou ausente. A alteração
dos tempos de incubação pode resultar ou num sinal mais fraco ou em coloração de fundo.
a)
Adicione 15 µl de sonda HER2 (reagente C) ao centro da lamela de 22 x 22 mm. Dependendo da
dimensão do tecido, poderá ser necessária uma quantidade maior ou menor de sonda. Use o seguinte
volume de sonda, com base na dimensão da lamela:
•
18 mm x 18 mm
10 µl
•
22 mm x 22 mm
15 µl
•
24 mm x 30 mm
20 µl
b) Coloque a lamela, com o lado da sonda virado para baixo, na área apropriada da amostra de tecido sobre
a lâmina. Podem utilizar-se as lamelas CISH UnderCover™ Slips da Invitrogen, em vez de uma lamela
normal. Ao utilizar CISH UnderCover™ Slips, descole o revestimento de papel e coloque o lado com a
lamela exposta (de onde acabou de retirar o papel) sobre a área apropriada da lâmina, de modo a cobrir a
amostra de tecido. Devem premir-se os bordos da fita adesiva, de modo a vedar a lamela e evitar a
evaporação. NÃO EXERCER PRESSÃO SOBRE O CENTRO DA LAMELA.
c) Ao utilizar uma lamela normal, esta deve ser vedada de modo a evitar a evaporação por a incubação. A
vedação pode conseguir-se utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha de 18G ½”. Encha a seringa
com a cola “rubber cement” e aplique uma camada fina nos bordos da lamela, passando ligeiramente para
a lâmina.
d) Deixe a cola secar (~10 min.) para evitar que a lamela deslize para fora da lâmina.
e) A desnaturação e a hibridação podem ser realizadas utilizando um dispositivo de PCR com ciclos
térmicos com bloco para lâminas ou um bloco de aquecimento com indicação digital da temperatura,
juntamente com uma caixa com humidade para lâminas e uma incubadora a 37 °C.
1) Se utilizar um dispositivo de PCR com ciclos térmicos: desnature a 95 ºC (± 1 ºC) por 5 min.,
seguido de incubação de um dia para o outro (10-18 h) a 37 ºC (± 1 ºC).
2) Se utilizar um bloco de aquecimento e uma câmara de humidade com incubadora a 37 °C:
desnature a 95ºC (± 1 °C) por 5 min., seguido de incubação de um dia para o outro (10-18 h) a
37 ºC (± 1 °C) numa câmara de humidade.
Procedimento do dia 2
8. Preparação dos reagentes
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•
•
•
•
PBS (soro fisiológico tamponado com fosfato)
o Adicione uma embalagem de pó PBS (reagente E1) a 1 l de dH2O. Misture.
PBS/tampão Tween 20 (Tween a 0,01%)
o Adicione dez gotas de Tween 20 a 50% (reagente E2) a 1 l de PBS (da solução preparada tal como
indicado anteriormente). Misture.
o Conserve à temperatura ambiente (15-30 °C) por um período de até uma semana.
Solução cromogénica de substrato (DAB)
o Prepare esta solução imediatamente antes de utilizar.
o Adicione 1 gota de cada reagente (I1, I2, I3) a 1 ml de dH2O. Misture bem.
H2O2 a 3% em metanol absoluto
o Adicione 1 parte de H2O2 a 30% a 9 partes de metanol.
o Cubra bem e conserve por um período de até uma semana à temperatura ambiente (15-30 °C) ou até
que tenham sido processadas cem lâminas.
Xileno (2 suportes de lâminas)
o Cubra bem e conserve por até uma semana à temperatura ambiente (15-30 °C) ou até que tenham sido
processadas cem lâminas.
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9. Lavagem adstringente
Nota: a utilização de temperaturas superiores às recomendadas pelo procedimento poderá originar uma
diminuição ou perda completa do sinal CISH. As lavagens a uma temperatura demasiado baixa podem resultar
em elevado ruído de fundo. Tem de utilizar-se um termómetro calibrado para garantir que é atingida e mantida a
temperatura exacta do banho de água.
a) Ligue o banho de água a 70 ºC (±1 °C) e aqueça-o até à temperatura pretendida.
b) Prepare dois copos de misturadora contendo tampão SSC (reagente D), um à temperatura ambiente, o
outro aquecido a 70 °C.
c) Descole a cola da lamela UnderCover™ Slip. Não deixe a secção de tecido secar.
d) Para retirar a lamela sem rasgar o tecido: mergulhe previamente as lâminas em SSC à temperatura ambiente
por ~2-3 min., até que as lamelas deslizem facilmente. Em seguida, prossiga para o passo seguinte.
e) Enxagúe as lâminas brevemente no copo que contém SSC à temperatura ambiente (15-30 °C), e em seguida
mergulhe as lâminas por 5 min. no copo para misturadora que contém SSC no banho de água a 70 ºC
(±1 °C).
f) Lave as lâminas em dH2O 3 vezes, 2 min. cada.
10. Imunodetecção
a) Mergulhe as lâminas em H2O2 a 3% em metanol a 100% por 10 min.
b) Lave em PBS/Tween 20 (0,01%) 3 vezes, 2 min. cada.
c) Adicione CAS-BlockTM (reagente F): 2-3 gotas/lâmina, ou o suficiente para cobrir o tecido, e incubar por
10 min. à temperatura ambiente (15-30 °C).
d) Seque o reagente F com papel de laboratório. Não enxagúe.
e) Adicione anticorpo murino antidigoxigenina (reagente G): 2-3 gotas/lâmina, ou o suficiente para cobrir o
tecido, e incube por 30 min. à temperatura ambiente (15-30 °C).
f) Lave em PBS/Tween 20 (0,01%) 3 vezes, 2 min. cada.
g) Adicione conjugado de polímero HRP e antimurino de cabra (reagente H): 2-3 gotas/lâmina, ou o
suficiente para cobrir o tecido, e incube por 30 min. à temperatura ambiente (15-30 °C) numa câmara de
humidade.
h) Lave em PBS/Tween 20 (0,01%) 3 vezes, 2 min. cada.
i) Durante a lavagem, prepare a solução de cromogénio substrato: adicione uma gota de cada reagente
(reagentes I1, I2, I3) a 1 ml de dH2O.
j) Adicione solução de cromogénio substrato (DAB): 2-3 gotas/lâmina, ou o suficiente para cobrir o tecido, e
incube por 30 min. à temperatura ambiente (15-30 °C) numa câmara de humidade.
k) Coloque as lâminas no suporte para lâminas.
l) Lave com água corrente da torneira por 2 min.
11. Contra-coloração e montagem
Nota: faça a contracoloração brevemente, por 3-5 seg. e examine o tecido ao microscópio, sem a lamela. Faça a
contracoloração por mais 3-5 seg. se pretender uma coloração nuclear mais intensa. O tempo de contracoloração
depende dos tecidos utilizados. Não se recomenda uma contracoloração escura, uma vez que pode obscurecer
sinais positivos de coloração.
a) Faça a contracoloração do tecido com hematoxilina (reagente J): 3-5 seg.
b) Lave com água corrente da torneira por 2 min.
c) Desidrate numa série graduada de EtOH por 2 min. em cada graduação. (70%, 85%, 95%, 100%, 100%,
guardadas desde o dia 1 e utilizadas pela mesma ordem.)
d) Mergulhe em xileno: 2 vezes, 2 min. cada. Esta lavagem de xileno tem de ser diferente da utilizada no dia
1. Pode ser reutilizada neste passo por um período de uma semana, ou até cem lâminas.
e) Cubra com a lamela, utilizando a solução de montagem Histomount™ Mounting Solution (reagente K).
f) Conserve as lâminas à temperatura ambiente (15-30 °C) para análise futura dos resultados.
Limitações do procedimento
•
•
O conjunto SPOT-Light® HER2 CISH pode não detectar os 5%(10) registados de cancros da mama que são
positivos por imuno-histoquímica (immunohistochemistry, IHC) mas negativos para amplificação do gene
HER2.
CISH é um procedimento de múltiplos passos, que exige formação especializada quanto ao uso dos
reagentes apropriados, selecção do tecido, fixação, processamento, preparação da lâmina CISH e
interpretação dos resultados de coloração.
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•
•
•
•
A coloração do tecido depende do manuseamento e processamento da amostra de tecido antes da coloração.
A contracoloração excessiva ou incompleta pode comprometer a interpretação adequada dos resultados.
Qualquer desvio do procedimento de exame recomendado pode invalidar os resultados esperados
declarados; têm de ser empregues e documentados os controlos apropriados. Os utilizadores que se desviem
do procedimento de exame recomendado têm de aceitar a responsabilidade pela interpretação dos
resultados das amostras nessas circunstâncias.
O conjunto SPOT-Light® HER2 CISH foi optimizado apenas para a identificação e quantificação do gene
HER2/neu em núcleos interfásicos, em amostras de tecido de cancro da mama humano incluído em
parafina. Não foram validados outros tipos de amostras ou fixadores.
A interpretação clínica de quaisquer resultados do exame deve ser avaliada no contexto do historial médico
do doente e de outros resultados de exames laboratoriais de diagnóstico.
Controlo de qualidade
Controlos positivo e negativo numa única lâmina
Lâmina de controlo L.
A
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
B
Imagem 1. A lâmina de controlo L contém a linha
celular A, não amplificada (MCF-7) e a linha
celular B, amplificada (SK-OV-3). Nota: as linhas
celulares não estão desenhadas à escala e são mais
pequenas do que o indicado no diagrama.
O sinal CISH deve ser castanho, distinto e fácil de avaliar.
As lâminas de controlo incluídas (lâmina L) contêm duas secções de 4 µm, cortadas a partir de blocos de
células FFPE preparados a partir de duas linhas celulares diferentes. Estas lâminas devem ser utilizadas
como controlos para o procedimento. A linha celular A (MCF-7) é não amplificada e irá apresentar ≤ 5
sinais ou pontos por núcleo. A linha celular B (SK-OV-3) é amplificada e irá aparecer sob a forma de
agrupamentos pequenos a grandes de DAB no núcleo.
A lâmina de linha celular de controlo destina-se a ser executada juntamente com cada execução das lâminas
de exame da doente e deve ser tratada da mesma forma que as secções de tecido.
Se a lâmina de controlo (lâmina L) for negativa para ambas as linhas celulares, A e B, tal constitui uma
indicação de que ocorreu um erro por o procedimento CISH.
A linha celular de controlo positivo (B), conhecida para demonstrar amplificação de HER2, deve ser
examinada primeiro para verificar se todos os reagentes estão a funcionar adequadamente. A presença de
agrupamentos de genes, ou >5 sinais ou pontos individuais, no núcleo de uma única célula é indicador na
reactividade positiva esperada. Se o controlo positivo falhar em demonstrar a presença de agrupamentos ou
>5 sinais por núcleo numa maioria (>50%) de células de carcinoma, os resultados obtidos para as amostras
da doente devem ser considerados inválidos.
A linha celular de controlo negativo ou normal (A), conhecida para demonstrar não amplificação de HER2,
deve conter ≤ 5 pontos no núcleo de cada célula.
Se ocorrer coloração não específica nos núcleos do controlo normal (A), os resultados obtidos para as
amostras da doente devem ser considerados inválidos.
Se ocorrer coloração não específica, esta apresenta geralmente um aspecto de coloração difusa.
Ocasionalmente, pode observar-se coloração castanha fora dos núcleos em secções de tecido com excesso
de fixação em formalina. Nestes casos, os resultados devem ser interpretados cuidadosamente. A coloração
não específica não deve ser confundida com sinais CISH positivos.
Se utilizado, um controlo de tecido positivo, consistindo em tecido de cancro da mama conhecido para
demonstrar amplificação de HER2, deve mostrar a presença de agrupamentos de genes ou >5 sinais ou
pontos individuais por núcleo numa maioria (>50%) de células de carcinoma, o que indica a reactividade
positiva esperada. Se o controlo de tecido positivo falhar em demonstrar a presença de agrupamentos ou >5
sinais por núcleo em >50% de células tumorais, os resultados obtidos para as amostras da doente devem ser
considerados inválidos.
Se utilizado, um controlo de tecido negativo, consistindo em tecido de cancro da mama conhecido para
demonstrar não amplificação de HER2, deve conter <5 sinais por núcleo numa maioria (>50%) de células
de carcinoma.
Em geral, a presença de não mais de dois sinais ou pontos nos núcleos da parte de tecido normal (células
epiteliais normais ou células com estroma no tumor) do controlo positivo de tecido, confirma que a sonda e
os reagentes de imunodetecção não estão a fazer reacções cruzadas com os componentes celulares ou do
tecido. Se ocorrer coloração não específica nos núcleos da parte de tecido normal do controlo positivo de
tecido, os resultados obtidos para as amostras da doente devem ser considerados inválidos.
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•
A variação no processamento do tecido e os procedimentos técnicos no laboratório do utilizador tem de ser
validada, uma vez que pode produzir uma variabilidade significativa nos resultados, necessitando da
realização regular de controlos internos para além dos procedimentos seguintes.
Interpretação
Avaliação da adequabilidade das lâminas
Os pontos (sinais) de HER2 CISH devem ser pequenos mas claramente discerníveis, utilizando uma objectiva de
20x-40x. Os pontos irão parecer castanhos em contraste com a contracoloração.
Se não houver pontos aparentes na amostra, o ensaio tem de ser repetido. Contacte a Assistência Técnica da
Invitrogen através do número 1-800-955-6288 (apenas nos EUA ) para debater as possíveis causas do problema.
Aspecto do sinal CISH – consulte o anexo A, “Guia de interpretação do exame HER2 CISH”
Os pontos HER2 CISH irão aparecer sob a forma de:
• Um ponto isolado (figura G). Um ponto isolado tem um rebordo liso, arredondado, nas células
normais ou de carcinoma. Um ponto isolado representa uma única cópia do gene HER2.
• Uma parelha (figura H). Os pontos aparecem como “pares” e não representam um verdadeiro
agrupamento pequeno. Se dois sinais estiverem separados por uma distância inferior ao diâmetro de
um sinal, estes sinais devem ser contabilizados como um único ponto. A parelha é o resultado dos
cromossomas em divisão, estando cada um dos sinais localizado no par de cromatídeos irmãos29.
• Um agrupamento pequeno (figura E). Um agrupamento pequeno é um grupo de sinais, de forma
irregular, que tem 3-5 vezes o diâmetro de um ponto isolado. Pode ser utilizado como referência um
ponto isolado das células epiteliais normais ou do carcinoma.
• Um agrupamento grande (figura A). Um agrupamento grande é um grupo de sinais, de forma
irregular, que tem um diâmetro mais de cinco vezes superior ao de um ponto isolado. Deve ser
utilizado como referência um ponto isolado das células epiteliais normais ou do carcinoma.
Ampliação
10x
20x
40x
60x ou 100x
Sinal CISH
Os pontos isolados quase não se vêem e são facilmente
ignorados.
Os pontos isolados são pequenos mas claramente discerníveis.
Os pontos isolados são facilmente identificados.
Não é necessária esta ampliação.
Selecção dos campos-alvo para a enumeração do sinal HER2 CISH:
• Utilizando as objectivas de 4x-20x, esquadrinhe a amostra com coloração CISH para identificar as áreas
histopatologicamente mais representativas de carcinoma invasivo. Evite áreas de necrose, sobreposição de
sinais devido a sobreposição de núcleos e núcleos com uma fraca intensidade de sinal. Evite os
componentes de carcinoma intraductal (DCIS) nos carcinomas invasivos. Avalie a possível
heterogeneidade intratumoral no estado do gene HER2 antes da enumeração de CISH.
• Se a amostra for homogénea, seleccione uma área de tecido com sinais CISH intensos para a enumeração
de sinal. Prossiga para a enumeração de sinal.
• Se a amostra apresentar heterogeneidade intratumoral do estado do gene HER2 no componente de
carcinoma invasivo, seleccione as áreas que representam cada estado do gene HER2 para a enumeração de
sinal. Uma amostra de tecido é heterogénea se o estado do gene HER2 (células amplificadas e não
amplificadas) variar em áreas diferentes da mesma secção de um cancro da mama primário. É necessário
avaliar as células em cada área de heterogeneidade para determinar qual o estado de HER2 (amplificado ou
não amplificado) que predomina em mais de 50% da secção de tumor. Prossiga para a enumeração de sinal
da área onde o estado de HER2 é predominante para este tumor.
Enumeração de sinal
• Utilize uma objectiva de 40x. Pode ser utilizada uma objectiva de maior ampliação, se necessário, mas não
é preciso utilizar óleo de imersão.
• Consulte o anexo A, “Guia de interpretação do exame HER2 CISH”.
• Um gene HER2 individual apresenta-se sob a forma de um pequeno ponto isolado, redondo (figura G).
• Não conte os núcleos que se sobrepõem nem quaisquer áreas em que os núcleos não sejam visíveis. Conte
apenas o sinal CISH que se encontra no interior de um núcleo. Exclua os sinais esporádicos ocasionais, que
podem ser devidos a restos de derramamento de ADN HER2 provenientes da renovação das células
cancerígenas, fora dos núcleos.
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Não amplificação
o Definida como 1-5 pontos isolados na maioria (>50%) das células do carcinoma na área de tecido
seleccionada.
o Não é necessário contar os pontos em trinta células. Opcional: use a folha de trabalho do anexo B,
“Folha de marcação de HER2 CISH” para a contagem das células. Registe os resultados sob a forma
da média da contagem de trinta células, para obter um diagnóstico claro de não amplificação.
Amplificação
o Definida como:
o >5 pontos na maioria (>50%) das células de carcinoma na área de tecido seleccionada, ou
o Agrupamentos grandes na maioria (>50%) das células de carcinoma na área de tecido
seleccionada, ou
o Uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos grandes na maioria (>50%) das células de
carcinoma na área de tecido seleccionada, ou
o Uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos pequenos na maioria (>50%) das células de
carcinoma na área de tecido seleccionada, ou
o Agrupamentos pequenos na maioria (>50%) das células de carcinoma na área de tecido
seleccionada.
o Para qualquer dos casos descritos acima, não é necessário contar os pontos nas trinta células. Opcional:
use a folha de trabalho do anexo B, “Folha de marcação de HER2 CISH”, para a contagem das células.
Registe os resultados sob a forma da média da contagem de trinta células para obter um diagnóstico
claro de amplificação. Para efeitos de contagem, conte um agrupamento pequeno como 5 pontos e um
agrupamento grande como 10 pontos.
o Fundamentação: a atribuição de números específicos de pontos aos agrupamentos pequenos
ou grandes é arbitrária para efeitos de quantificação. As células normalmente têm duas cópias
do gene HER2. As células que replicaram o seu ADN mas ainda não se dividiram têm 4
cópias do gene. Portanto, um agrupamento pequeno constitui uma indicação de amplificação e
terá um número mínimo de 5 cópias do gene. Um agrupamento grande, com pelo menos o
dobro do tamanho de um agrupamento pequeno, terá um número mínimo de 10 cópias do
gene.
•
Casos pouco claros de amplificação ou não amplificação
Interprete com cuidado as amostras que não pertencem claramente às categorias de amplificação ou
não amplificação. Estas amostras apresentam 4-6 pontos na maioria (>50%) das células de carcinoma
no campo-alvo seleccionado. Quando o número médio de pontos se encontra entre os 4 e os 6 após a
contagem de trinta células de carcinoma, devem contar-se outras trinta células, ficando com um total
de sessenta células.
Se ainda assim persistirem dúvidas, o ensaio deve ser repetido com uma nova lâmina da amostra.
Registe os resultados utilizando a folha de trabalho do anexo B, “Folha de marcação de HER2 CISH”.
1. Conte os pontos em trinta células tumorais na área de tecido seleccionada. Se estiverem evidentes
agrupamentos pequenos, consulte o n.° 4, a seguir.
2. Faça a soma do número total de pontos nas trinta células e registe a média.
3. Registe o resultado com base na média de sessenta células.
4. Caso se observe uma mistura de pontos isolados e agrupamentos pequenos (devido ao
agrupamento de vários pontos isolados), ou caso se observem apenas agrupamentos pequenos:
• Conte um agrupamento pequeno como 5 pontos.
• Pode ser utilizado como referência um ponto isolado das células epiteliais normais ou do
carcinoma, da mesma lâmina, para a determinação do que representa um agrupamento
pequeno.
5. Registe os resultados sob a forma da média da contagem de sessenta células para obter um
diagnóstico de amplificação ou de não amplificação, de acordo com as “Orientações Invitrogen”.
•
Registo dos resultados
Os resultados podem ser registados utilizando a folha de trabalho do anexo B, “Folha de marcação de
HER2 CISH”. O registo do estado de HER2 tem de ser feito de acordo com as Orientações Invitrogen,
sobretudo para os casos pouco claros de amplificação ou não amplificação.
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Resumo de interpretação
Amplificação
>5 pontos, ou agrupamentos grandes, ou uma mistura de pontos múltiplos e
agrupamentos grandes, ou uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos pequenos, ou
agrupamentos pequenos do gene HER2 presentes por núcleo numa maioria (>50%) de
células de carcinoma na área de tecido seleccionada para enumeração. Veja as figuras A,
B, C, D e E do anexo A, “Guia de interpretação do exame HER2 CISH”.
Um agrupamento grande é um grupo de sinais, de forma irregular, que tem um diâmetro
mais de cinco vezes superior ao de um ponto isolado. Pode ser utilizado como referência
um ponto isolado das células epiteliais normais ou do carcinoma. Veja o anexo A, figura
A.
Um agrupamento pequeno é um grupo de sinais, de forma irregular, que tem 3-5 vezes o
diâmetro de um ponto isolado. Pode ser utilizado como referência um ponto isolado das
células epiteliais normais ou do carcinoma. Veja o anexo A, figura E.
Não
amplificação
1-5 pontos do gene HER2 presentes por núcleo numa maioria (>50%) de células de
carcinoma na área de tecido seleccionada para enumeração. Veja o anexo A, figura F,
figura G e figura H.
Um ponto isolado tem um rebordo liso, arredondado e está presente nas células normais e
de carcinoma.
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Valores esperados
A prevalência do gene HER2 amplificado na população de mulheres com cancro da mama em geral é de 18-30%(8, 9). Ao
comparar a amplificação do gene HER2 com a sobre-expressão da proteína HER2, os estudos mostraram que até 5%
das doentes com cancro da mama são positivas para sobre-expressão da proteína quando testadas através de imunohistoquímica (IHC) mas negativas quanto à amplificação do gene(10).
Características específicas de desempenho
Desempenho clínico
A segurança e eficácia do conjunto SPOT-Light® HER2 CISH foram avaliadas num estudo comparativo de três
exames: o conjunto SPOT-Light® HER2 CISH, PathVysion® FISH e HercepTest™. O estudo envolveu dois
conjuntos de casos: 226 casos consecutivos e sessenta casos suplementares. Os casos consecutivos foram
seleccionados a partir de casos consecutivos de cancro da mama invasivo examinados na prestação de cuidados a
doentes em dois centros (centros A e B). Os casos suplementares foram casos que tinham sido classificados como
2+ através de imuno-histoquímica (IHC) (utilizando o anticorpo AB8) por a prestação de cuidados a doentes no
centro A.
A. Casos consecutivos
A tabela seguinte resume a distribuição dos resultados de CISH e FISH em relação às classificações com o
HercepTest™. Os exames foram considerados válidos quando a lâmina corada resultante estava aceitável para
avaliação.
Tabela 1: Resultados de IHC, FISH e CISH
0
1
Expressão proteica, pontuação HercepTest™
Casos IHC
(N)
141
19
(%)1
63,8%
8,6%
Rácio de genes com estado FISH HER2
Número de casos FISH válidos2
140
19
N amplificados (%)3
1 (0,5)
0 (0,0)
N não amplificados (%)3
139 (63,8)
19 (8,7)
Cópias de genes com estado CISH HER2
Número de casos CISH válidos2
132
17
N amplificados (%)3
1 (0,5)
0 (0,0)
N não amplificados (%)3
131 (63,6)
17 (8,3)
1
% = N ÷ N Total × 100%.
2
Número de casos FISH (ou CISH) válidos, com a pontuação IHC correspondente.
3
% = n ÷ Número total de casos FISH (ou CISH) válidos × 100%.
2
3
Total
21
9,5%
40
18,1%
221
100%
21
5 (2,3)
16 (7,3)
38
31 (14,2)
7 (3,2)
218
37
181
19
3 (1,5)
16 (7,8)
38
32 (15,5)
6 (2,9)
206
36
170
Tabela 2: Concordância entre CISH e IHC
Resultados CISH
Resultados IHC
Positivos (3+)
Negativos (<3+)
Total
32
4
36
Amplificados
6
164
170
Não amplificados
38
168
206
Total
Vinte casos foram registados como resultados de exame IHC ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela.
Concordância positiva
Concordância negativa
Percentagem total de
concordância
=
=
=
32/38
164/168
(32+164)/206
= 84,2%
= 97,6%
= 95,1%
(IC a 95%: 68,8%, 94,0%)
(IC a 95%: 94,0%, 99,4%)
(IC a 95%: 91,3%, 97,7%)
Os resultados mostraram uma concordância de 95,1% (IC a 95%: 91,3% - 97,7%), indicando uma forte
concordância entre o conjunto SPOT-Light® HER2 CISH e o HerceptTest™.
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Tabela 3: Concordância entre CISH e FISH
Resultados CISH
Resultados FISH
Amplificados
Não amplificados
Total
34
0
34
Amplificados
2
169
171
Não amplificados
36
169
205
Total
Foram registados 21 casos como resultados de exame FISH ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela.
Concordância positiva
Concordância negativa
Percentagem total de
concordância
=
=
=
34/36
169/169
(34+169)/205
= 94,4%
= 100,0%
= 99,0%
(IC a 95%: 81,3%, 99,3%)
(IC a 95%: 97,8%, 100,0%)
(IC a 95%: 96,5%, 99,9%)
Os resultados mostraram uma concordância de 99,0% (IC a 95%: 96,5% - 99,9%), indicando uma forte
concordância entre o exame do conjunto SPOT-Light® HER2 CISH e o exame PathVysion® HER2. Portanto, a taxa
de concordância indicou que o exame do conjunto SPOT-Light® HER2 CISH originou resultados equivalentes aos
do exame PathVysion® HER2.
A seguir, apresenta-se um resumo dos dois casos discordantes entre o exame da sonda SPOT-Light® HER2 e o
exame da sonda PathVysion® HER2. Os dados CISH e FISH são apresentados sob a forma de média e intervalo, e a
coluna de IHC apresenta a pontuação do HercepTest™.
Tabela 4: Casos discordantes entre FISH e CISH
Número do
caso
1
HER2 CISH (Pos.)/FISH (Neg.)
CISH
FISH
IHC
Número do
caso
(2, 0,98%)1
A-095-01
B-008
HER2 CISH (Neg.)/FISH (Pos.)
CISH
FISH
4,07 (1,00 - 10,00)
2,77 (2,00 - 4,00)
IHC
2,81 (1,67 - 5,00)
2,65 (1,00 - 6,00)
2+
2+
% = número de casos discordantes divididos pelo número total de casos válidos com FISH e CISH do centro correspondente × 100%.
B. Casos 2+ suplementares com IHC
Foram fornecidos sessenta casos 2+ suplementares com IHC pelo centro de estudo A, que foram testados
nos centros de estudo A e B. Os resultados de cada centro de estudo demonstraram que o exame do
conjunto SPOT-Light® HER2 CISH originou resultados que foram equivalentes aos do exame PathVysion®
HER2. Os resultados de correlação encontram-se resumidos nas tabelas 5 e 6.
Tabela 5: Concordância entre CISH e FISH no centro de estudo A em Casos IHC 2+
Resultados CISH
Resultados FISH
Amplificados
Não amplificados
6
Amplificados
2
Não amplificados
8
Total
Cinco casos foram registados como ausentes ou inválidos.
Concordância positiva
Concordância negativa
Percentagem total de concordância
=
=
=
6/8
46/46
(6+46)/54
0
46
46
= 75,0%
= 100,0%
= 96,3%
Total
6
48
54
(IC a 95%: 34,9%, 96,8%)
(IC a 95%: 92,3%, 100,0%)
(IC a 95%: 87,3%, 99,6%)
Tabela 6: Concordância entre CISH e FISH no centro de estudo B em Casos IHC 2+
Resultados CISH
Resultados FISH
Amplificados
Não amplificados
7
Amplificados
2
Não amplificados
9
Total
Quatro casos foram registados como ausentes ou inválidos.
Concordância positiva
Concordância negativa
Percentagem total de concordância
PI84-0150
=
=
=
7/9
45/47
(7+45)/56
Rev 0.0
2
45
47
= 77,8%
= 95,7%
= 92,9%
Total
9
47
56
(IC a 95%: 40,0%, 97,2%)
(IC a 95%: 85,5%, 99,5%)
(IC a 95%: 82,7%, 98,0%)
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Tabela 7: Casos 2+ com IHC discordantes entre CISH e FISH
HER2 CISH (Neg.)/FISH (Pos.)
Número do
CISH
FISH
IHC
caso
Centro A (2, 3,70%)1
S-156-01
2,77 (1,00 -5,00)
2,48 (0,50 -5,00)
2+
S-173-01
3,67 (1,00 -7,00)
2,34 (0,50 -8,00)
2+
Centro B (4, 7,14%)1
S-171
5,20 (2,00 -8,00)
1,08 (0,50 -2,00)
3+
S-156
5,00 (1,00 -9,00)
2,23 (1,00 -5,00)
3+
S-178
20,00 (20,00 -20,00)
1,25 (0,50 -2,00)
0
S-183
4,13 (3,00 -6,00)
2,73 (1,00 -6,00)
0
1
% = número de casos discordantes divididos pelo número total de casos válidos com FISH e CISH do centro correspondente ×
100%.
Número
do caso
HER2 CISH (Pos.)/FISH (Neg.)
CISH
FISH
IHC
C. Casos 2+ com HercepTest
Todos os casos consecutivos e suplementares foram testados com HercepTest™. Os casos que produziram
pontuações 2+ com HercepTest™ foram combinados e testados em ambos os centros de estudo. Os
resultados de cada centro de estudo demonstraram que o conjunto SPOT-Light® HER2 CISH originou
resultados equivalentes aos do exame PathVysion® HER2. Os resultados de correlação encontram-se
resumidos nas tabelas 8 e 9.
Tabela 8: Concordância entre CISH e FISH nos casos 2+ com HercepTest no centro de estudo A
Resultados CISH
Resultados FISH
Amplificados
Não amplificados
Total
3
0
3
Amplificados
4
27
31
Não amplificados
7
27
34
Total
Dois casos foram registados como resultados de exame FISH ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela.
Concordância positiva
Concordância negativa
Percentagem total de concordância
=
=
=
3/7
27/27
(3+27)/34
= 42,9%
= 100,0%
= 88,2%
(IC a 95%: 9,9%, 81,6%)
(IC a 95%: 87,2%, 100,0%)
(IC a 95%: 72,6%, 96,7%)
Tabela 9: Concordância entre CISH e FISH nos Casos 2+ com HercepTest no centro de estudo B
Resultados CISH
Resultados FISH
Amplificados
Não amplificados
Total
4
1
5
Amplificados
1
35
36
Não amplificados
5
36
41
Total
Dois casos foram registados como resultados de exame FISH ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela.
Concordância positiva
Concordância negativa
Percentagem total de concordância
=
=
=
4/5
35/36
(4+35)/41
= 80,0%
= 97,2%
= 95,1%
(IC a 95%: 28,4%, 99,5%)
(IC a 95%: 85,5%, 99,9%)
(IC a 95%: 83,5%, 99,4%)
Tabela 10: Casos 2+ com HercepTest discordantes entre CISH e FISH
HER2 CISH (Neg.)/FISH (Pos.)
Número do
CISH
FISH
IHC
caso
Centro A (4, 11,76%)1
A-095-01
4,07 (1,00 - 10,00)
2,81 (1,67 - 5,00)
2+
B-008-08
1,77 (1,00 - 4,00)
2,45 (1,00 - 5,00)
2+
S-156-01
2,77 (1,00 - 5,00)
2,48 (0,50 - 5,00)
2+
S-173-01
3,67 (1,00 - 7,00)
2,34 (0,50 - 8,00)
2+
Centro B (2, 4,88%)1
A-023
5,20 (2,00 - 8,00)
1,49 (0,67 - 3,50)
2+
B-008
2,77 (2,00 - 4,00)
2,65 (1,00 - 6,00)
2+
1
% = número de casos discordantes divididos pelo número total de casos válidos com FISH e CISH do centro correspondente ×
100%.
Número
do caso
PI84-0150
HER2 CISH (Pos.)/FISH (Neg.)
CISH
FISH
IHC
Rev 0.0
Página 17 de 27
D. Casos de polissomia
Dois centros de estudo avaliaram os casos de polissomia com base nas respectivas práticas clínicas
institucionais. No centro A, a polissomia do cromossoma 17 foi definida como sendo a presença de ≥ 3
sinais CEP17 em pelo menos 10% das células tumorais, enquanto no centro B o critério era a presença de
≥ 3 sinais CEP17 em pelo menos 30% das células tumorais. A frequência dos tumores com polissomia do
cromossoma 17 foi de 18,68% no centro A e de 7,91% no centro B. A taxa de detecção de polissomia no
mesmo conjunto tumoral variou substancialmente entre os dois centros de exame, devido à diferença na
definição de polissomia utilizada em cada um deles. O nível de concordância obtido independentemente em
cada centro de estudo indicou que o conjunto SPOT-Light® HER2 CISH originou resultados que foram
equivalentes aos do exame PathVysion® HER2. Os resultados encontram-se resumidos nas tabelas 11 e 12.
Tabela 11: Concordância entre CISH e FISH nos Casos de Polissomia no centro de estudo A
Resultados CISH
Resultados FISH
Amplificados
Não amplificados
Total
12
0
12
Amplificados
2
34
36
Não amplificados
14
34
48
Total
Três casos foram registados como resultados de exame FISH ou CISH ausentes ou inválidos e excluídos da tabela.
Concordância positiva
Concordância negativa
Percentagem total de concordância
=
=
=
12/14
34/34
(12+34)/48
= 85,7%
= 100,0%
= 95,8%
(IC a 95%: 57,2%, 98,2%)
(IC a 95%: 89,7%, 100,0%)
(IC a 95%: 85,8%, 99,5%)
Tabela 12: Concordância entre CISH e FISH nos Casos de Polissomia no centro de estudo B
Resultados CISH
Resultados FISH
Amplificados
Não amplificados
Total
12
1
Amplificados
0
9
Não amplificados
12
10
Total
Nenhum caso foi registado como resultado de exame FISH ou CISH ausente ou inválido e excluído da tabela.
Concordância positiva
Concordância negativa
Percentagem total de concordância
=
=
=
12/12
9/10
(12+9)/22
= 100,0%
= 90,0%
= 95,5%
13
9
22
(IC a 95%: 73,5%, 100,0%)
(IC a 95%: 55,5%, 99,8%)
(IC a 95%: 77,2%, 99,9%)
Tabela 13: Casos de polissomia discordantes entre CISH e FISH
Núme
ro do
caso
HER2 CISH (Pos.)/FISH (Neg.)
CISH
FISH
IHC
Número do
caso
HER2 CISH (Neg.)/FISH (Pos.)
CISH
FISH
IHC
Centro A (2, 4,17%)1
A-095-01
4,07 (1,00 - 10,00)
2,81 (1,67 - 5,00)
2+
S-156-01
2,77 (1,00 - 5,00)
2,48 (0,50 - 5,00)
2+
Centro B (1, 4,55%)1
A-023
5,20 (2,00 -8,00)
1,49 (0,67 -3,50)
2+
1
% = número de casos discordantes divididos pelo número total de casos válidos com FISH e CISH do centro correspondente
× 100%.
PI84-0150
Rev 0.0
Página 18 de 27
E. Resumo dos resultados de comparação entre o conjunto SPOT-Light® HER2 CISH e o conjunto de
sonda de ADN PathVysion® HER2 DNA Probe Kit
Tabela 14: Resumo do conjunto SPOT-Light® HER2 CISH e PathVysion® HER2 DNA Probe Kit
Tipo de casos
Casos
consecutivos
Casos suplementares
Casos equívocos
Casos de polissomia
Centro A
Centro B
Centro A
Centro B
Centro A
Centro B
Número de
amostras
205
54
56
34
41
48
22
% de
concordância
positiva
94,4%
75,0%
77,8%
42,9%
80,0%
85,7%
100,0%
% de
concordância
negativa
100,0%
100,0%
95,7%
100,0%
97,2%
100,0%
90,0%
% total de
concordância
99,0%
96,3%
92,9%
88,2%
95,1%
95,8%
95,5%
Sensibilidade analítica
A sensibilidade do conjunto SPOT-Light® HER2 CISH foi testada utilizando secções de tecido de cancro da mama
FFPE com estado não amplificado e amplificado de HER2, bem como as linhas celulares FFPE utilizadas nas
lâminas de controlo. O gene HER2 foi detectado como sendo um ponto isolado na secção de tecido e na secção de
bloco celular com gene HER2 normal. Cada amostra amplificada e não amplificada demonstrou uma coloração de
intensidade 3+ e boa morfologia tecidular.
Eficiência de hibridação
A eficiência de hibridação foi estabelecida testando duas amostras de tecido (uma amplificada, uma não amplificada,
dez secções de cada) e quatro amostras de linha celular (duas amplificadas, duas não amplificadas). Cada amostra
foi analisada quanto ao número de células com sinais HER2 em relação ao número total de células analisadas (100300 células). A eficiência de hibridação foi estabelecida como sendo de 94,7-100%. Para a coloração CISH de 226
amostras clínicas, de três laboratórios, a taxa de insucesso em cada centro foi de 8,4% (19), 1,3% (3) e 0,9% (2)(28).
Especificidade analítica
Para determinar a especificidade, os estudos metafásicos foram realizados em lâminas preparadas citogeneticamente;
foi realizado PCR utilizando um par primer específico para o gene HER2 no modelo da sonda de ADN HER2, e a
sequenciação de ADN foi realizada para ambas as extremidades dos clones BAC utilizados na sonda de ADN
HER2.
A sonda SPOT-Light® CISH HER2 demonstrou ligar-se especificamente ao lócus genético HER2 na banda
cromossómica 17q11.2-21. A localização do cromossoma foi estabelecida através de FISH metafásico em linfócitos
normais; o exame PCR demonstrou a banda de ADN pretendida e a sequenciação de ADN demonstrou a localização
correcta do cromossoma e a cobertura do gene HER2.
Limites do procedimento
O procedimento SPOT-Light® HER2 CISH foi testado nos extremos de cada um dos seguintes parâmetros:
espessura do tecido, pré-tratamento, desnaturação, hibridação, lavagem adstringente, imunodetecção e
contracoloração. Não foram observadas diferenças significativas nos resultados CISH nas seguintes condições:
PI84-0150
Rev 0.0
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Tabela 15: Limites do procedimento
Intervalos aceitáveis para os parâmetros do ensaio
Espessura do tecido
4-6 µm
Pré-tratamento a
quente
99-100 °C
10-20 min.
4-14 min.
Digestão enzimática
93-98 °C
2-8 min.
Hibridação
30-39 °C
10-18 h
Lavagem
adstringente
60-78 °C
2-8 min.
Desnaturação
Imunodetecção
PCR com ciclos térmicos
Conjugado de polímero HRP
25v60 min.
Cromogénio DAB
15-60 min.
3-30 seg.
Contra-coloração
Reprodutibilidade
Foram testados três lotes distintos do conjunto SPOT-Light® HER2 CISH em três amostras de tecido de cancro da
mama e em quatro amostras de linhas celulares, com níveis diferentes do gene HER2. Não houve alteração no
desempenho do ensaio nos três lotes testados.
Reprodutibilidade inter-execuções (de dia para dia)
O estudo realizou a avaliação da reprodutibilidade inter-execuções de CISH em três dias diferentes, utilizando
amostras de cancro da mama com três tipos de estados de HER2 e com três amostras de cada tipo. O resumo é o
seguinte:
Tabela 16: Reprodutibilidade inter-execuções (de dia para dia)
Cópias do gene
N
Não amplificados
Média de N =
Desvio-padrão
CV
9
9
9
1,79
0,05
3%
Não amplificados,
polissomia
3,45
12
4%
Amplificados
20,22
1,72
8%
Estudo da reprodutibilidade de observador para observador
Três patologistas fizeram formação para a leitura de lâminas preparadas e coradas, utilizando o conjunto SPOTLight® HER2 CISH. Para validar a competência, foram entregues a cada patologista oito lâminas pré-coradas (seis
não amplificadas e duas amplificadas) fornecidas pela Invitrogen. Com ambos os tipos de casos (não amplificado e
amplificado), todas as amostras (100%) foram interpretadas com exactidão.
PI84-0150
Rev 0.0
Página 20 de 27
Tabela 17: Reprodutibilidade de observador para observador
ID da
lâmina
1
2
N.° da lâmina
Sinal CISH, média de pontos HER2 CISH por célula e estado do
gene HER2
Observador 1
Observador 2
Observador 3
Amostra 1
(NAM)
2 pontos
(NAM)
1-5 pontos
(NAM)
1-2
(NAM)
Amostra 2
(AM)
Agrupamento grande
+ pontos múltiplos
(AM)
Agrupamento grande
+ pontos
10
(AM)
3
Amostra 3
(NAM)
2-5
(NAM)
(AM)
1-5
(NAM)
4
Amostra 4
(NAM)
2-4
(NAM)
2,8
(NAM)
3-5
(NAM)
5
Amostra 5
(NAM)
2
(NAM)
1-5
(NAM)
1-2
(NAM)
6
Amostra 6
(NAM)
2-5
(NAM)
1-5
(NAM)
4
(NAM)
7
Amostra 7
(AM)
Agrupamento grande
+ pontos múltiplos
(AM)
Agrupamento grande
(AM)
Agrupamento grande
+ pontos múltiplos
(AM)
2-5
(NAM)
3,4
(NAM)
4,3
(NAM)
8
Amostra 8
(NAM)
3-5
(NAM)
Reprodutibilidade de centro para centro
O estudo de reprodutibilidade CISH de centro para centro baseou-se em 226 casos consecutivos, repetidos nos três
centros de estudo. As percentagens totais de concordância para a reprodutibilidade CISH utilizando >5 como o
limiar (“cutoff”) para a positividade foram de 99,0%, 98,6% e 98,1%, indicando uma reprodutibilidade robusta para
o exame com o conjunto SPOT-Light® HER2 CISH.
Tabela 18: Reprodutibilidade CISH para todos os casos consecutivos
examinados pelo centro A e centro B
Centro A
Centro B: Resultados CISH
Resultados CISH
Amplificados
Não amplificados
Total
Amplificados
34
0
34
Não amplificados
2
170
172
Total
36
170
206
Vinte casos foram registados como resultados de exame CISH ausentes ou inválidos e excluídos da
tabela.
Percentagem total de concordância
PI84-0150
= (34+170)/206 99,0%
Rev 0.0
(IC a 95%: 96,5%, 99,9%)
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Tabela 19: Reprodutibilidade CISH para todos os casos consecutivos
examinados pelo centro C e centro B
Centro C
Centro B: Resultados CISH
Resultados CISH
Amplificados
Não amplificados
Total
Amplificados
35
0
35
Não amplificados
3
184
187
Total
38
184
222
Quatro casos foram registados como resultados de exame CISH ausentes ou inválidos e excluídos da
tabela.
Percentagem total de concordância
= (35+184)/222 98,6%
(IC a 95%: 96,1%, 99,7%)
Tabela 20: Reprodutibilidade CISH para todos os casos consecutivos
examinados pelo centro C e centro A
Centro C
Centro A: Resultados CISH
Resultados CISH
Amplificados
Não amplificados
Total
Amplificados
32
1
33
Não amplificados
3
171
174
Total
35
172
207
Dezanove casos foram registados como resultados de exame CISH ausentes ou inválidos e excluídos
da tabela.
Percentagem total de concordância
= (32+171)/207
98,1%
(IC a 95%: 95,1%, 99,5%)
Estudos de repetibilidade e reprodutibilidade em secções de tecido consecutivas e em várias espessuras de
tecido
Os estudos de repetibilidade e reprodutibilidade foram conduzidos para avaliar a repetibilidade e reprodutibilidade
do conjunto SPOT-Light® HER2 CISH™ ao testar tecidos de cancro da mama consecutivos, amplificados e não
amplificados, de espessura variável.
As amostras a serem avaliadas incluíram lâminas de três blocos de tecido de cancro da mama: não amplificação de
HER2 (normal), amplificação limiar de HER2 e amplificação (elevada) de HER2. Foram processadas e testadas dez
amostras por bloco de secções consecutivas com 4 µm de espessura, de acordo com os procedimentos normalizados
(condição de controlo), e as amostras de diferentes espessuras (intervalo de 2-8 µm) de cada bloco foram
processadas de forma semelhante e testadas em duplicado de acordo com os procedimentos normalizados. Os
resultados destes exames encontram-se nas tabelas 21-23.
PI84-0150
Rev 0.0
Página 22 de 27
Tabela 21. Média de pontos HER2 CISH por célula em secções consecutivas de 4 µm
(cancro da mama com HER2 normal)
Número da secção
1
2
3
Média de pontos de HER2
1,8 2,0 1,9
CISH por núcleo
Média de HER2
Desvio-padrão
% CV
4
2,0
5
1,6
6
1,7
7
1,7
8
1,6
9
1,7
10
2,0
1,8
0,16
8,9
Tabela 22. Média de pontos HER2 CISH por célula em secções consecutivas de 4 µm
(cancro da mama com amplificação limiar de HER2)
Número da secção
1
2
3
4
5,4 5,5 5,3 5,8
Média de pontos de HER2
CISH por núcleo
Média de HER2
Desvio-padrão
% CV
5
5,2
6
6,2
7
5,7
8
5,4
9
5,5
10
5,8
5,6
0,30
5,4
Tabela 23. Média de pontos HER2 CISH por célula em secções consecutivas de 4 µm
(cancro da mama com amplificação de HER2)
Número da secção
1
2
3
4
BC BC BC BC
Média de pontos de HER2
CISH por núcleo
5
BC
6
7
BC BC
8
BC
9
BC
10
BC
Resolução de problemas
Problema
Causa possível
Acção sugerida
Sinal fraco ou
ausente
1. As instruções de pré-tratamento não foram
seguidas.
1. Certifique-se de que foram utilizadas as
condições correctas de pré-tratamento. Consulte o
procedimento.
a)
Condições de pré-tratamento a quente
incorrectas (tempo ou temperatura de
incubação)
b)
Condições de pré-tratamento enzimático
incorrectas (tempo ou temperatura)
c)
a)
Certifique-se de que foram utilizadas as
condições correctas de pré-tratamento a
quente: 15 minutos a 98-102 ºC.
b)
Certifique-se de que foram utilizadas as
condições correctas de pré-tratamento
enzimático (recomendam-se 5 min.,
intervalo de 2-20 min.). Certifique-se de
que a enzima fica à temperatura
ambiente (15-30 °C) antes da utilização.
c)
Dependendo da espessura do tecido (4-6
µm) e das condições de fixação, o
tempo óptimo de incubação do prétratamento enzimático pode precisar de
ser aumentado ou diminuído.
Secção de tecido mais espessa do que o
óptimo
2. Condições de desnaturação incorrectas
2. Certifique-se de que foram utilizadas as
condições correctas de desnaturação. Consulte o
procedimento.
a)
a) Temperatura de desnaturação incorrecta
PI84-0150
Rev 0.0
Certifique-se de que a temperatura de
desnaturação é de 95 °C (intervalo de
95-98 °C) para o dispositivo de PCR
com ciclos térmicos e bloco de
aquecimento, 90 °C (intervalo de 85-90
Página 23 de 27
°C).
b)
b) Tempo de desnaturação incorrecto
3. Condições de lavagem adstringente incorrectas
a)
b)
Fraca morfologia
tecidular
Coloração de fundo
PI84-0150
Temperatura de lavagem adstringente
incorrecta (acima dos 80 ºC)
Tempo de incubação da lavagem
adstringente incorrecto
4. Temperatura excessivamente elevada por a
conservação ou o transporte
1. Condições de pré-tratamento a quente incorrectas
(tempo ou temperatura)
Certifique-se de que o tempo de
desnaturação é de 5 min. para o
dispositivo de PCR com ciclos térmicos.
3. Certifique-se de que foram utilizadas as
condições correctas de lavagem adstringente.
Consulte o procedimento.
a) Certifique-se de que a lavagem
adstringente é efectuada a 70 ºC.
Recomenda-se um termómetro calibrado para
verificar a temperatura.
b) Certifique-se de que é feito o tempo
correcto de incubação na lavagem
adstringente (5 min.).
4. Verifique as condições de conservação. O
conjunto SPOT-Light® HER2 CISH deve
conservar-se a 2-8 °C. Conservar o reagente J à
temperatura ambiente (15-30 ºC).
1. Certifique-se de que foram utilizadas as
condições correctas de pré-tratamento a quente.
2. Condições de pré-tratamento enzimático
incorrectas (tempo ou temperatura)
2. Certifique-se de que foram utilizadas as
condições de digestão enzimática correctas. Para a
maioria dos tecidos mamários, 5 min. à
temperatura ambiente (15-30 ºC) é o óptimo.
Dependendo da espessura do tecido e do tempo de
fixação, o tempo óptimo de incubação para a
digestão pode precisar de ser aumentado ou
diminuído.
3. Condições de desnaturação incorrectas (tempo ou
temperatura)
3. Certifique-se de que foram utilizadas as
condições correctas de desnaturação. Consulte o
procedimento.
4. A remoção da lamela causou danos físicos ao
tecido
4. Não faça pressão sobre a lamela. Pré-mergulhe
as lâminas em tampão SSC à temperatura
ambiente (15-30 ºC) por 2-3 min. ou até as
lamelas deslizarem facilmente.
5. Deixou-se secar o tecido por o procedimento
CISH
5. A menos que tal seja especificamente
declarado, não deixe o tecido secar em nenhuma
altura do procedimento CISH.
6. Espessura do tecido incorrecta
6. Certifique-se de que o tecido tem 4-6 µm.
7. Tempo de fixação incorrecto
7. Certifique-se de que o tecido é fixado por 6-48
horas.
8. Fixador incorrecto
1. Temperatura de lavagem adstringente incorrecta
(<70 ºC)
8. Certifique-se de que o tecido é fixado em
formalina tamponada neutra a 10%.
1. Certifique-se de que é utilizada a temperatura
de lavagem adstringente correcta (70 °C).
2. Incubação excessiva com DAB
2. Certifique-se de que é utilizado o tempo de
incubação DAB correcto, de 30 min. à
temperatura ambiente (15-30 ºC).
3. Reagentes incorrectos utilizados como tampão de
lavagem
3. Tem de ser utilizado tampão de lavagem
(reagentes E1 + E2) por os passos de
imunodetecção.
Rev 0.0
Página 24 de 27
Sinais aparentes mas
difíceis de ver
1. Contra-coloração excessiva com hematoxilina
Áreas sem sinal
1. Formaram-se bolhas de ar sob a lamela ao
adicionar a sonda
2. Volume de sonda insuficiente para a dimensão do
tecido
1. Certifique-se de que é realizada a
contracoloração do tecido por
3-5 segundos. Se não tiver a certeza de qual o
tempo de coloração óptimo, faça a
contracoloração por 3 seg. e em seguida lave por 2
min. em água corrente da torneira. Verifique o
tecido com contracoloração ao microscópio. Se
ainda estiver demasiado claro, faça novamente a
contracoloração por mais 3-5 seg. antes de
prosseguir para a colocação da lamela.
1. Certifique-se de que não se formaram bolhas de
ar ao adicionar a sonda e a lamela.
2. Adicione ~15 µl para tecido que esteja
adequadamente coberto por uma lamela de
22 x 22 mm. Podem ser necessários uma
quantidade maior de sonda e uma lamela maior
para tecidos maiores (utilize 20 µl para um tecido
com uma lamela de 24 x 30 mm.).
NOTA: caso o problema não se encontrar listado acima, ou caso a acção sugerida não resolver o problema,
contacte a Assistência Técnica através do número 1-800-955-6288 (apenas nos EUA) ou envie uma mensagem
electrónica para [email protected].
PI84-0150
Rev 0.0
Página 25 de 27
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
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MARCAS COMERCIAIS
Clearmount™, HistoGrip™, Histomount™ e SPT™ são marcas comerciais da Invitrogen Corporation.
SPOT-Light® e Zymed® são marcas registadas da Invitrogen Corporation. Herceptin® é uma marca registada da
Genentech, Inc. HercepTest™ é uma marca comercial da Genentech, Inc. PathVysion® é uma marca registada da
Abbott Molecular, Inc.
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542 Flynn Road
Camarillo • CA 93012, EUA
Tel.: 1-800-955-6288
Para questões técnicas, envie um e-mail para: [email protected]
Para informações gerais acerca do conjunto SPOT-Light® HER2 CISH, envie um e-mail para:
[email protected]
URL: www.invitrogen.com/her2cish
Explicação dos símbolos
Número de catálogo
Número do lote
Limitação de temperatura
Fabricante
Contém material suficiente para <n>
exames
Representante autorizado na UE
Utilizar até
Diagnóstico in vitro
Consulte as instruções de utilização
Consulte os documentos inclusos
para IVDD 98/79/EC: Invitrogen Ltd., Inchinnan Business Park, 3 Fountain Drive, Paisley, PA4 9RF, Reino Unido
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Anexo A:
Guia de interpretação do exame HER2 CISH
Amplificação do gene HER2
Amplificação
Amplificação elevada: >10 pontos, ou agrupamentos grandes, ou
uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos grandes do
gene HER2 presentes por núcleo em >50% das células cancerosas. Veja as figuras A, B e C.
A. Agrupamentos grandes.
B. Pontos múltiplos (>10 pontos).
C. Agrupamentos grandes e pontos múltiplos.
D. >5 a 10 pontos.
Um agrupamento grande é um grupo de sinais, de forma irregular, que tem um diâmetro mais de cinco vezes superior ao de um
ponto isolado. Pode ser utilizado como referência um ponto isolado das células epiteliais normais ou tumorais. Veja a figura A.
Amplificação baixa: >5 pontos a 10 pontos, ou agrupamentos
pequenos, ou uma mistura de pontos múltiplos e agrupamentos pequenos do gene HER2 presentes por núcleo em >50% das
células cancerosas. Veja as figuras D e E.
Um agrupamento pequeno é um grupo de sinais, de forma
irregular, que tem 3-5 vezes o diâmetro de um ponto isolado.
Pode ser utilizado como referência um ponto isolado das células
epiteliais normais ou tumorais. Veja a figura E.
E. Agrupamentos pequenos.
Não amplificação do gene HER2
Não amplificação
Polissomia: 3-5 pontos do gene HER2 presentes por núcleo em
>50% das células cancerosas. Veja a figura F.
Um ponto isolado tem um rebordo liso, arredondado, nas células
normais ou tumorais. Veja a figura F.
F. Polissomia: 3-5 pontos.
G. Diplóide: 1-2 pontos.
Diploidia: 1-2 pontos do gene HER2 presentes por núcleo em >50%
das células cancerosas. Veja a figura G.
Um ponto isolado tem um rebordo liso, arredondado, nas células
normais ou tumorais. Veja a figura G.
Parelha
Se dois sinais estiverem separados por uma distância inferior ao
diâmetro de um ponto isolado, esses sinais devem ser contados
como um ponto isolado. As parelhas aparecem como um par e
H. Parelha = 1 ponto. Imagem gentilmente cedida pela Dr. Adrienne Morey.
não representam verdadeiros agrupamentos pequenos. Veja a
Figure H.
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©2008 Invitrogen Corporation. Todos os direitos reservados. Estes produtos podem estar cobertos por uma ou mais Licenças de Uso Limitado de Rótulo (Limited Use Label Licenses) (veja o catálogo Invitrogen ou
www.invitrogen.com). Ao utilizar estes produtos, está a aceitar os termos e condições de todas as Licenças de Uso Limitado de Rótulo aplicáveis. Não se destina a qualquer uso terapêutico ou diagnóstico, em animais
ou em seres humanos, salvo indicação em contrário. O-079226-r1 0808
Anexo B: Folha de marcação de HER2 CISH
Conjunto SPOT-Light HER2 CISH, Cat. n.° 84-0150
®
ID de registo da execução de coloração: ____________________________________________________________________________
Conjunto SPOT-Light® HER2 CISH (84-0150) Lote n.°: _ __________________________________________________________________
ID da amostra: _________________________________________________________________________________________________
Resultados CISH (registe o número de sinais HER2 por cada uma das células avaliadas):
Lista 1. Resultados CISH
N.° da célula
Pontos ou agrupamentos HER2
N.° da célula Pontos ou agrupamentos HER2 N.° da célula
1
11
21
2
12
22
3
13
23
4
14
24
5
15
25
6
16
26
7
17
27
8
18
28
9
19
29
10
20
30
Pontos ou agrupamentos HER2
Nota: Para os agrupamentos, indique, por favor, a melhor estimativa de cópias de pontos/genes (agrupamento pequeno = 5 pontos, agrupamento grande = 10 pontos).
Soma dos pontos em trinta células__________________________
Média de pontos em trinta células __________________________
Se a média estiver entre os 4 e 6 pontos, conte os pontos em outras trinta células, para ficar com um total de sessenta células, e registe
os resultados na Lista 2. Se a média for <4 ou >6, não é necessário contar outras trinta células e a amostra pode ser registada como não
amplificação ou amplificação.
Marcação CISH
Orientações da Invitrogen para a marcação HER2 CISH
• Não amplificação: 1-5 sinais/núcleo nas células tumorais
• Amplificação: >5 sinais/núcleo, ou agrupamento de sinais amplificados/núcleo, em >50% das células tumorais
Resultado:
 Não amplificação (≤5)
 Amplificação (>5)
Assinatura do técnico e data: _____________________________________________________________________________________
Assinatura do patologista e data: __________________________________________________________________________________
Lista 2 (resultados CISH). Se necessário, introduza o número de pontos no segundo conjunto de trinta células:
N.° da célula
Pontos ou agrupamentos HER2
N.° da célula Pontos ou agrupamentos HER2
N.° da célula Pontos ou agrupamentos HER2
1
11
21
2
12
22
3
13
23
4
14
24
5
15
25
6
16
26
7
17
27
8
18
28
9
19
29
10
20
30
Soma dos pontos nas células 31-60 _ ________________________
Soma dos pontos nas células 1-30 _ _________________________
Média de pontos em sessenta células _ ______________________
Marcação CISH
Orientações da Invitrogen para a marcação HER2 CISH
• Não amplificação: 1-5 sinais/núcleo nas células tumorais
• Amplificação: >5 sinais/núcleo, ou agrupamento de sinais amplificados/núcleo, em >50% das células tumorais
Resultado:
 Não amplificação (≤5)
 Amplificação (>5)
Assinatura do técnico e data: _____________________________________________________________________________________
Assinatura do patologista e data: __________________________________________________________________________________
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