Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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à dieta aproteica
1 Introdução
A evolução das ciências médicas fez o cirurgião adotar uma postura
holística, ao deixar de se preocupar apenas com o ato operatório em si, dirigindo sua
atenção também para outros aspectos que possam interferir e/ou influenciar nos
resultados do tratamento. Dentre esses, destaca-se o estado nutricional do paciente o
qual vai intervir na sua recuperação clínica e/ou no pós-operatório.
A desnutrição protéico-calórica ainda é uma das desordens que mais aflige o
cirurgião do aparelho digestivo em decorrência das inúmeras complicações que poderão
surgir no pós-operatório de pacientes que se encontram neste estado, considerando que,
normalmente, apresentam elevadas taxas de morbi-mortalidade (CORREIA, 2001).
Esta ocorrência também pode se manifestar por diversos fatores a começar
pela qualidade de vida, onde são identificadas as deficiências nutricionais prévias,
desencadeadas pela má-nutrição habitual ou pela precária condição sócio-econômica da
família e ainda em decorrência de doenças e problemas psicológicos. Já em paciente
hospitalizado pode ser ocasionada pelo tempo de permanência acamado, pelo longo
período de jejum para realização de procedimentos no tratamento, ou ainda, pela falta
de reconhecimento por parte da equipe médica responsável quanto a avaliação das
necessidades nutricionais e a real importância da terapia nutricional (CORREIA, 2001).
Uma das alterações metabólicas que a desnutrição pode provocar é o
estresse oxidativo o qual pode ser conceituado como condição biológica onde se
formam muitos radicais livres, que poderão ser lesivos ao organismo. Estes radicais
poderão comprometer a estrutura do DNA, dos carboidratos, das proteínas e lipídios.
Dentre os danos que poderão ocasionar destaca-se a peroxidação lipídica como principal
24
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Introdução
responsável pelas alterações da permeabilidade da membrana celular (PERCÁRIO et
al., 1994).
KERRIGAN em 1993, relatou vários fatores que poderão, sistematicamente,
prejudicar as anastomoses no tubo digestivo. Dentre estes se identificam como
extrínsecos a infecção, a hipotensão, a desnutrição e outros. Já como fatores intrínsecos
pode-se considerar a tensão na sutura, a trombose dos pedículos vasculares das alças
anastomosadas, a compressão e os hematomas. Todos estes são agressivos e acabam
gerando complicações ocasionadas pela intensa formação de radicais livres no local.
Além da avaliação do estado nutricional a utilização de uma técnica
cirúrgica adequada é necessária para prevenir a formação de fístulas e assegurar uma
cicatrização completa. Daí a necessidade do cirurgião ampliar o seu conhecimento na
biologia molecular para controlar todas as fases deste processo.
A preocupação com a fístula digestiva data de muitos anos e continua
repercutindo nos dias atuais, tanto que ainda é utilizado dreno temporário como
vigilante durante o processo cicatricial interno. Esta ainda é uma conduta preventiva
adotada pela maioria dos profissionais.
Atualmente, observa-se cada vez mais que, com os avanços da biologia
molecular, os radicais livres vêm sendo dosados pelas análises bioquímicas tanto para
pesquisa científica como também para fins terapêuticos (PERCÁRIO et al., 1994).
Portanto, decidiu-se estudar, experimentalmente, as repercussões do estresse
oxidativo pela dosagem do malondialdeido (MDA) em anastomose intestinal de animais
submetidos à dieta aproteica, para se poder avaliar o grau do comprometimento que
estes teriam durante o processo de cicatrização, trazendo, dessa forma, uma contribuição
futura para minimizar o aparecimento das possíveis fístulas na cirurgia digestiva.
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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à dieta aproteica
2 Revisão da literatura
2.1 Desnutrição
Diversos estudos experimentais como os realizados por IRVIN, em 1978 e
GREENHALGH et al. (1987), têm demonstrado o efeito da desnutrição protéicocalórica e suas conseqüências na cicatrização da ferida operatória. Entretanto a
preocupação com o envolvimento da desnutrição ao metabolismo oxidativo, foram
descritos em trabalhos experimentais realizados por PÉLISSIER et al. (1993) e
DARMON et al. no mesmo ano, onde relataram que o intestino delgado é o órgão mais
susceptível na ocorrência desses eventos diante da desnutrição protéico-calórica.
Outras pesquisas, como as de HUANG et al. (1993) evidenciam que os efeitos
da desnutrição protéica podem ocorrer em diversos graus, ou seja, quanto mais
acentuada a perda protéica maior é a elevação dos níveis de MDA dosados por meio das
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (thiobarbituric acid-reactive substances,
TBAR). Esta ocorrência foi confirmada pela diminuição acentuada das enzimas
antioxidantes provocada pela dieta pobre em proteínas.
DARMON no mesmo ano, também, descreve que a desnutrição provoca a
atrofia da mucosa intestinal, induzindo a redução da enzima antioxidante – glutationa
peroxidase – favorecendo cada vez mais à injúria oxidativa dos radicais livres no local,
além de contribuir para sua disfunção. Relatos dessa natureza também foram referidos,
por JONAS et al. no ano de 2000.
Mais recentemente, pesquisas realizadas em suínos, comprovaram que o
estresse oxidativo encontra-se elevado na mucosa jejunal, independente do tipo da
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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à dieta aproteica
Revisão da literatura
desnutrição e observaram elevação do MDA, também, dosado por meio do TBAR
(PÉLISSIER et al., 2002).
2.2 Radicais livres
Segundo HALLIWELL (1996), os radicais livres, são substâncias químicas
em que seus grupos de átomos ou moléculas apresentam um elétron solitário ou
desemparelhado em seu orbital mais externo (Figura 1).
+
–
Figura 1 – Átomo com elétron solitário ou desemparelhado na camada mais
externa.
Este elétron cria um campo magnético que o leva a instabilidade e meia vida
curta extremamente reativo, com potencialidade capaz de oxidar compostos orgânicos e
inorgânicos, como: proteínas, lipídios, carboidratos, as organelas citoplasmáticas e até
material genético, levando a sua destruição (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2000).
Os avanços do conhecimento da bioquímica e da biossíntese dos radicais
livres, assim como as suas relações com as variadas doenças orgânicas, principalmente
com as do tipo crônico-degenerativas, têm mostrado a necessidade de se implementar e
difundir as informações pertinentes a essas moléculas, assim como as suas repercussões
sistêmicas e aplicações no campo terapêutico (DASGUPTA et al., 1997; DRURY et
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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Revisão da literatura
al.,1998; JARENO et al., 1998; McLEMORE et al., 1998; NAGYOVÁ et al., 1998; CHILD
et al., 1999).
As alterações do metabolismo oxidativo têm merecido, por parte dos
pesquisadores, enorme interesse que se traduz pelo significativo aumento na produção
científica nos últimos anos com destaque para as situações orgânicas agudas conforme
referidas por CYMROT (1999); OKAMOTO (2001); BARROSO (2001); FREIRE (2002);
BOGACZ (2002); TARDINI, et al. (2003) e ABE et al. (2004).
RICHTER-LANDSBERG e VOLLGRAF (1998), assim como GATÉ et al.
(1999) e HALLIWELL e GUTTERIDGE (2000) evidenciaram que dentre os elementos
químicos conhecidos, o oxigênio (O2) é o gás que está presente em todos os seres vivos
aeróbicos, em permanente contato com células, tecidos, órgãos e sistemas, e que possui
a capacidade de oxidar vários componentes celulares.
Segundo BOVERIS e CHANCE, (1973) e outros autores como DEL
MAESTRO (1980) e FRIDOVICH (1983) o O2 é o maior responsável pela formação
dos radicais livres também conhecidos como espécie reativa tóxica de oxigênio
(ERTO), que pode sofrer uma rápida reação de óxido-redução.
DEL MAESTRO (1980) enfatizou que no interior da mitocôndria, o
processo de respiração celular por meio da fosforilação oxidativa requer O2 para
produção de adenosina trifosfato (Adenosine Triphosphate, ATP). Durante este
mecanismo fisiológico, ocorre a redução completa da molécula de O2 que necessita do
ganho de quatro elétrons – redução tetravalente – levando a formação de água (H2O)
como produto final (Figura 2).
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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Revisão da literatura
O2
+e
-
.-
O2
-
-e 2H+
H2O2
+e
-
.-
OH
+e
-
H2O
Figura 2 – Redução tetravalente do oxigênio no interior da mitocôndria.
HALLIWELL e GUTTERIDGE (2000) afirmaram que esta reação acontece
com 95% das moléculas de O2 e que chegam à mitocôndria pela fosforilação oxidativa.
Entretanto, BOVERIS e CHANCE (1973), reconhecem que algumas vezes poderá
ocorrer a desativação deste sistema provocando erros na redução do O2 o qual passa a
receber menos de quatro elétrons, formando compostos intermediários que são
.-
agressores ao próprio organismo. São eles o superóxido (O2 ) e peróxido de hidrogênio
(H2O2) respectivamente. O H2O2, também poderá ser reduzido com formação do radical
hidroxila (OH• –) como ilustrado na figura 2.
2.3 Estresse oxidativo
Estes compostos quando formados são muito reativos e podem agir de variadas
formas provocando alterações na função e estrutura celular levando ao sofrimento e/ou a
morte. Segundo FRIDOVICH (1975) a este fenômeno denomina-se estresse oxidativo.
E BAST et al. (1991) ressaltam ser este o responsável pela geração de mecanismos
patológicos.
Diversas situações que predispõem a formação de radicais livres e seus
efeitos na fisiopatologia das lesões celulares foram demonstradas em outras pesquisas
como pode ser observado a seguir.
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à dieta aproteica
Revisão da literatura
ANGEL et al. (1986); CINO e DEL MAESTRO (1989) e DOWNEY (1990)
relatam suas experiências relacionando os radicais com a isquemia e reperfusão. Ainda
em estudos similares CYMROT (1999); OKAMOTO, (2001); BOGACZ (2002) e
FREIRE (2002) enfatizam sua ação em retalhos cutâneos no dorso de ratos. Inúmeras
pesquisas experimentais vem sendo publicadas a respeito deste assunto nestes últimos
anos, conforme evidenciados nos trabalhos de TARDINI et al. (2003) e ABE et al.
(2004).
Quanto à desnutrição merecem destaque os trabalhos de GODIN e
WOHAIEB, em 1998 os quais evidenciaram que a deficiência nutricional reduz as
enzimas antioxidantes nos tecidos causando maior produção de radicais livres,
favorecendo cada vez mais o estresse oxidativo e o aparecimento de doenças.
PELISSIER et al. (1993), investigaram a influência da restrição protéica no
estresse oxidativo e no sistema de defesa antioxidante do intestino delgado e fígado de
ratos jovens e concluíram que o MDA dosado pelo TBAR foi mais elevado na mucosa
intestinal do que no tecido hepático.
DARMON et al. (1993), também, em estudos similares observaram que a
desnutrição induz a mucosa intestinal a maior agressão oxidativa, contribuindo para o
mal funcionamento do trato digestório. Estas mesmas observações foram feitas por
PÉLISSIER et al. (2002), nos estudos realizados em suínos.
Na seqüência desses registros são encontrados na literatura relatos como os
de HARMAN (1991) que associa o estresse ao envelhecimento e ainda CARVALHOGOMES et al. (1994) que destacam em suas pesquisas que o tabagismo também é um
outro fator que predispõe a formação de radicais.
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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Revisão da literatura
2.4 Peroxidação lipídica
Em condições normais a produção de radicais livres acaba sendo
compensada pelos agentes antioxidantes como as vitaminas A, E, C, riboflavinas,
betacarotenos e as enzimas endógenas: superóxido dismutase, catalase e glutationa
peroxidase. No entanto, quando ocorre o desequilíbrio no sistema antioxidante do
organismo, os radicais livres na tentativa de estabilização, roubam elétrons de outras
moléculas, desestruturando-as conforme descrito por HALLIWELL (1996).
ARUOMA (1994) relata que um dos alvos preferidos dos radicais livres é o
ácido graxo insaturado sendo encontrado na dupla camada lipídica da membrana celular
e vital para o bom funcionamento da célula.
Quando os radicais livres escapam do sistema antioxidante e atacam os
ácidos graxos insaturados na dupla ligação entre alguns átomos de carbono ocorre o
início de uma reação em cadeia que irá alterar a estrutura da membrana. A esta reação se
denomina peroxidação lipídica que segundo ARUOMA (1994) é intensamente deletéria
ao organismo.
A peroxidação lipídica é uma das reações mais utilizadas para a avaliação
do estresse oxidativo, sendo considerada como um indicador indireto da ação dos
radicais livres (GUTTERIDGE e HALLIWELL, 1990). De acordo com HERSHKO
(1989) sua complexidade desencadeia várias reações químicas secundárias e como
conseqüência ocorre a perda da seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo de
organelas – enzimas hidrolíticas dos lisossomas – e formação de produtos citotóxicos –
MDA – culminando com a morte celular.
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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Revisão da literatura
2.4.1 Técnicas de dosagem de MDA
Em 1978, UCHIYAMA e MIHARA afirmaram que estas dosagens
poderiam ser realizadas em soro, plasma, líquidos corporais, e homogeneizados do
tecido orgânico.
Os métodos mais utilizados para aferição do estresse oxidativo são os
espectrofotométricos e cromatométricos, que medem a atividade enzimática,
concentração de tripeptídeos e aldeídos (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
Para SLATER (1984) a quantificação da peroxidação lipídica pode ser feita
por meio da dosagem do MDA, que é um aldeído formado durante este processo. Já
PERCÁRIO et al. (1994) utilizaram o método indireto empregando o TBAR.
2.4.1.1 Ácido tiobarbitúrico
CYMROT (1999) e mais recentemente, HALLIWELL e GUTTERIDGE
(2000) e OKAMOTO (2001) relataram que de todos os produtos e subprodutos
intermediários, a dosagem do MDA por meio do TBAR é a mais antiga e utilizada
técnica de avaliação do processo metabólico que envolve a peroxidação lipídica,
principalmente nas ocorrências de isquemia e reperfusão.
Em estudos clínicos RAMOS et al. (2000) investigaram o nível de agressão
oxidativa no sangue de pacientes portadores de artrite reumatóide juvenil e concluíram
que a dosagem se mostrou elevada.
Na seqüência das pesquisas experimentais OKAMOTO (2001) evidenciou
que logo após a elevação do retalho cutâneo isquêmico o aumento do MDA no sangue
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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à dieta aproteica
Revisão da literatura
ocorreu aos 5 min, porém quanto às amostras teciduais observou que a elevação deste
nível foi imediata.1
E mais recentemente TARDINI et al. (2003) ao avaliarem dois modelos
experimentais realizados com isquemia e reperfusão cerebral, concluíram neste estudo
que o MDA não apresentou alterações significativas como marcadores de lesão cerebral.
Este método, embora simples, pode algumas vezes se tornar pouco
específico, levando a resultados díspares apesar de metodologias bem elaboradas.
2.4.1.2 Cromatografia líquida de alta precisão (HPLC)
Dentre outros métodos de dosagem do MDA mais diretos e específicos
destaca-se a HPLC que vem sendo utilizada com maior freqüência nos estudos de
tecidos e líquidos corporais, conforme descrito por diversos autores como
ESTERBAUER et al. (1984); TOMITA e OKUYAMA (1990), assim como por
GUTTERIDGE e HALLIWELL (1990); BEHRENS e MADÈRE (1991) e mais
recentemente WATERFALL et al., em 1996.
1
Corresponde ao período de 24h do pós-operatório (SANTOS, 2003).
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
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à dieta aproteica.
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Anexos
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Anexo A – Comitê de Ética em Pesquisa com animais do Instituto
Evandro Chagas - (IEC), Belém- Pa
87
88
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Anexo B – Informação nutricional das dietas
Quantidade por porção de 40g
Valor calórico
%VD*
180 Kcal
7%
34g
9%
Proteínas
–
–
Gorduras totais
5g
6%
Gorduras saturadas
–
–
5mg
2%
1g
3%
Cálcio
22,5mg
3%
Ferro
0,1mg
1%
Sódio
250mg
10%
Carboidratos
Colesterol
Fibra alimentar
Quadro 1 – Composição do biscoito de polvilho.
*VD − Valores diários de referência como base de uma dieta com 2500 kcals.
Distribuição dos macronutrientes da dieta normoproteica
Valor calórico total
3,2 Kcal/g
Carboidratos
63,4%
Proteína bruta
22%
Lipídios
11%
Fibra
8%
Quadro 2 – Composição da ração Nuvilab CR 1 de acordo com o fabricante.
89
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Anexo C – Preparação da Solução Tampão – fase móvel
Técnica de ESTERBAUER et al. (1984).
Por meio da diluição de 3,6 g do tampão TRIZMA-BASE (SIGMA) em 1 litro de água
bidestilada (milli-Q). Desta preparação, foi retirado 900ml e adicionado 100ml de
acetonitrila para cromatografia líquida de alta precisão (HPLC /UV), correspondendo uma
relação 9:1. Em seguida esta solução foi filtrada utilizando-se unidade filtrante 47mm e
0,45µm de poro (ZETAPOR). A solução permaneceu armazenada em frasco de vidro de 1
litro à temperatura ambiente validada até uma semana.
90
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Anexo D  Preparação da Solução Padrão / Curva de calibração
Em um frasco de vidro com 99ml de água deionizada (milli-Q), foi adicionado 1ml de
ácido sulfúrico a 1%. Em seguida, 239µl da solução de malondialdeído diacetal
(SIGMA).
O frasco foi envolvido com papel laminado e mantido em temperatura ambiental pelo
tempo de 2 horas, onde neste período foi agitada por 2 vezes e armazenada sobre
refrigeração com validação até uma semana.
Alíquotas desta solução foram diluídas para se construir uma curva de calibração entre
1µM e 200µM de malondialdeído. O coeficiente de correlação para a curva de
calibração foi de 0,99.
Gráfico 1 – Curva de calibração
91
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Anexo E – Preparação da solução de butil hidroxi tolueno (BHT)
Consistiu na diluição de 4mg de BHT em 2ml de etanol à 96%. Armazenada em frasco
de vidro e conservada em refrigeração com validação até uma semana.
Apêndice
93
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Apêndice
Peso 21dias Peso 25 dias Albuminemia MDA sangue
Subgrupos Rato
MDA / 1000
Peso do tecido
(g)
(g)
(g/dl)
(µM)
peso do tecido mg
(mg)
A
1
214,5
224
1,6
11,36
592,00
85
DA
1
95
96,5
1
6,07
357,26
84
A
2
216,5
2235
1,6
9,87
527,29
85
P
1
274
274
2
2,21
608,66
82
P
2
263,5
279
2
3,08
732,44
82
D
1
91
92,5
1,6
5,59
701,63
80
D
2
95,5
91,5
1,8
4,62
463,78
82
DC
1
89
105
2,1
15,01
517,35
83
A
3
227,5
261,5
1,8
2,56
853,53
85
DA
2
88
85
1,4
3,34
384,53
78
DAC
2
104
112,5
1,6
2,14
610,37
82
A
4
230
229
2,1
2,51
643,57
84
P
3
224
238,5
2,1
7,48
940,80
87
P
4
240,5
240,5
2,3
7,63
1083,10
84
D
3
91
89
1,8
2,38
478,50
80
D
4
115
118
2,5
2,79
757,90
81
DC
3
93
113,5
1,6
8,19
590,35
85
DC
4
103
122,5
2,1
4,26
413,07
88
A
5
290
305
3,9
9,46
1028,75
80
DA
3
95
120
2,7
3,69
353,57
84
DAC
3
109
101,5
1,8
4,27
156,34
82
A
6
198
207,5
2,7
6,44
635,48
84
(continua)
Quadro 1 – Registro das variáveis encontradas nos animais pesquisados.
94
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Peso 21dias Peso 25 dias Albuminemia MDA sangue
Subgrupos Rato
MDA /1000
Peso do tecido
(g)
(g)
(g/dl)
(µM)
peso do tecido mg
(mg)
P
5
272,5
290
3
5,25
972,05
83
P
6
236
251
2,7
4,76
998,86
88
D
5
95,5
100
1,8
0
837,01
87
D
6
105
114
2,3
3,1
578,35
85
DC
5
116
158
2,5
4,29
855,86
87
DC
6
114
153
2,8
0
1193,57
84
DA
4
108
104
1,2
0
652,03
79
DAC
4
100,5
114,5
1,9
7,43
748,40
81
DA
5
120,5
115
1,9
1,5
280,62
81
DA
6
124
115,5
2,1
8
591,92
78
DAC
5
116
128
2,1
0
1021,13
80
DA
7
110
166
1,9
3,24
825,93
81
DAC
7
128
139
2,3
9,02
1052,50
85
A
7
236
245
1,9
8,88
788,82
85
DC
7
118
116,5
2,3
2,73
1101,18
85
P
7
259
298
2,1
0
1283,72
85
P
8
234
260,5
2,3
0
766,71
85
D
9
143
143,5
1,8
0,45
506,05
81
DC
9
160
165,5
1,8
5,35
1820,98
82
A
8
217,5
214
1,9
0
368,59
85
D
10
153
154
2,8
2,98
1104,53
86
D
7
119
118,5
2,3
1,18
818,97
87
DC
10
153
154
2,7
0,96
1094,82
83
(continuação)
Quadro 1 – Registro das variáveis encontradas nos animais pesquisados.
95
Mauro Pantoja. Estresse oxidativo no sangue e na anastomose ileal de ratos submetidos
à dieta aproteica
Peso 21dias Peso 25 dias Albuminemia MDA sangue
MDA /1000
Peso do tecido
Subgrupos Rato
(g)
(g)
(g/dl)
(µM)
peso do tecido mg
(mg)
A
9
267,5
257
2,1
3,83
1187,83
83
A
10
296
267
2,1
2,17
975,98
87
DA
10
130,5
126,5
1,6
0,79
412,87
87
DC
2
150
156
1,8
0,77
829,29
85
DAC
9
120,5
141,5
3
6,66
765,75
87
DAC
10
106,5
115
2,7
1,01
1153,64
88
DAC
1
111,5
119
2,1
1,96
660,90
78
P
9
235
250
2,5
2,32
1187,90
81
P
10
250
272
2,3
1,32
1238,31
83
D
8
127
127,5
1,8
1,56
839,62
78
DC
8
124
126,5
1,8
2,05
648,86
88
DA
8
113
107,5
1,9
2,56
562,84
88
DA
9
150,5
117
1,9
3,25
921,38
80
DAC
6
115,5
118
3
0,33
870,73
82
DAC
8
107
120
2,3
2,56
946,93
88
(conclusão)
Quadro 1 – Registro das variáveis encontradas nos animais pesquisados.